FI82838C - Foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart insulinderivat. - Google Patents

Description

1 82838

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen insuliinijohdan-naisen valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti 5 käyttökelpoisen insuliinijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava I

AI | S— S η_A21

H~ Gly A-ketju_Asn -OH

10 SS

I I

s s B2_ B29 J Vai B-ketju Lys J -r30-r31 15 - jossa R1 on H tai H-Phe, R30 on Ala- tai Thr-tähde ja R31 on 1-3 a-aminohappoa ryhmästä Thr, Arg ja Lys, joissa mahdollisesti läsnäoleva päätekarboksiryhmä voi olla vapaana, 20 esteröityneenä, laktonina tai CH2OH:ksi pelkistettynä, ja jonka kaavan I mukaisen insuliinijohdannaisen isoelektri-nen piste on yli 5,8.

Insuliini-Arg31-0H, insuliini-Arg31-Arg32-OH sekä muut B-ketjun kohdalla C-terminaalisesti emäksisesti muunnetut 25 insuliinit osoittavat lääkeaineissa ilman erikoisia lisäyksiä, kuten Surfen®:a tai protamiinia, depot-luonnetta. Sellaisia insuliineja, menetelmää niiden valmistamiseksi, näitä sisältäviä lääkeaineita sekä niiden käyttöä on jo esitetty (saksalaiset patenttihakemukset P 33 26 472,4, 30 P 33 26 473,2, P 33 27 709,5 sekä P 33 27 928,4). Sellaisten hidastetusti vaikuttavien insuliinivalmisteiden edut perustuvat parempaan siedettävyyteen, ja insuliinilla suoritetusta pitkäaikaishoidosta puuttuu ennen kaikkea denot-apuaineiden immunogeenisuus.

35 Insuliinin biosynteesissä syntyy välittömästä esi- 2 82838 asteesta, yksiketjuisesta proinsuliinista, niin sanottujen yhdyspeptidien entsymaattisen pilkkoutumisen avulla kaksi-ketjuinen insuliini. Epätäydellisen valmistumisen yhteydessä on eristetystä raakainsuliinista löydettävissä niin 5 sanottujen välivaiheinsuliinien erittäin vähäisiä määriä. Nämä insuliinin biosynteesin välituotteet on selvitetty rakenteellisesti. Ne koostuvat pääasiallisesti B31-Arg- ja B31-32Arg-Arg-insuliinijohdannaisista.

Jos in vitro käsitellään naudan, sian tai ihmisen 10 proinsuliinia trypsiinillä (Chance, Excerpta Medica International Congress Series no 231, sivu 292 ja seur. sivut), niin syntyy vastaavien desoktapeptidi-B23-30-insuliinien rinnalla ennen kaikkea B31-Arg sekä B32-Arg-Arg-in-suliinien seos. Näiden tuotteiden varma erottaminen ja 15 perusteellinen puhdistus on erittäin työlästä ja edel lyttää moninkertaista ioninvaihtokromatografiaa, johon liittyy tappioita. Preparatiivisten määrien valmistusta raakainsuliinista terapiassa suoritettavaa käyttöä varten ei sen tähden ole mahdollista suorittaa. Sitä paitsi ei 20 ole käytettävissä humaani-insuliinia vastaavia tuotteita.

Eräs mahdollinen sellaisten johdannaisten valmistustapa perustuu siihen, että entsymaattisesti pilkotaan geeniteknologisesti valmistettua proinsuliinia tai sen analogeja. Kuten mainittiin, puhdistusmenetelmän yh-25 teydessä muodostuu tappiota.

Kyseessä olevan keksinnön kohteena on löytää menetelmä, jolla voidaan valmistaa yksinkertaisella tavalla uusien, galeenisten valmisteiden terapeuttista käyttöä varten tarvittavat määrät emäksisesti muunnettuja in-30 suliinijohdannaisia.

Seuraavassa kuvatussa, keksinnön mukaisessa menetelmässä tehtävä ratkaistaan muuttamalla halpa, biosyn- teettinen insuliini, kuten humaani-insuliini, sianin- suliini tai mahdollisesti niiden esiastet entsyymikatalyy-35 sin avulla sekä käyttämällä sopivia peptidijohdannaisia toivotuiksi tuotteiksi.

i 3 82838

Viime vuosina ovat monet erilaiset kemialliset ja entsymaattiset menetelmät tulleet tunnetuiksi (Biochem. J. 211 (1983) 671-676, US-patentti 3 902 068, 3 276 961, 4 320 197, GB-A-2069502, EP-A-56951 mm), joiden avulla 5 esim. sianinsuliini voidaan muuntaa. Edelleen on myös eh dotettu menetelmiä, jotka sallivat sopivien esi-proin-suliinijohdannaisten sekä välivaiheinsuliinien muuttamisen esimerkiksi humaani-insuliiniksi (DE-patenttiha-kemus P 32 09 184.2).

10 Nyt havaittiin yllättäen, että insuliinin lysiini- tähteessä, asemassa B29, tapahtuu selektiivinen trans-amidointi jopa peptidien kanssa, jotka sisältävät Arg tai Arg-Arg, ja huolimatta arginiinista insuliinin asemassa B22, suurin saannoin. Tämä koskee myös proinsuliineja 15 (Lys-Arg-A0) sekä analogeja.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) kaavan I mukainen insuliini, jossa R1 on H tai H-

Phe, 20 R30 on geneettisesti koodattavan L-aminohapon tähde ja R31 on OH tai karboksiryhmän suojaryhmä, tai

b) proinsuliini, jolla on kaava II

- C-ketju — 25 -—- AI | S-S-j A21

Y- Gly A-ketju Asn -OH II

I I

S S

30 ·

S S

B2 | B29 Z- Vai B-ketju Lys _χ 35 jossa 4 82838

C-ketju ja X yhdessä ovat geneettisesti koodattavien L-aminohappojen sekvenssi, Z on H- tai ryhmä H-(D)n-Y-(Phe)n-, m ja n ovat toisistaan riippumatta 0 tai 1, D on geneettisesti koodattava L-aminohappojen esisekvenssi ja 5 Y on Arg tai Lys, saatetaan reagoimaan peptidin kanssa, jolla on kaava III

H-R30-R31 III

10 jossa R30 on Ala- tai Thr-tähde ja R31 on 1 - 3 a-aminohap-poa ryhmästä Thr, Arg ja Lys, joissa mahdollisesti läsnäoleva päätekarboksiryhmä voi olla vapaana, esteröityneenä, amidina, laktonina tai CH20H:ksi pelkistettynä trypsiinin 15 tai trypsiinin kaltaisen endopeptidaasin läsnäollessa ve dessä, johon on mahdollisesti lisätty sopivaa orgaanista liuotinta, pH-arvossa, joka on insuliinin isoelektrisen pisteen alapuolella, ja mahdollisesti lisätyt suojaryhmät poistetaan.

20 X merkitsee ensi sijassa Ala, Thr tai Ser, mutta se merkitsee erityisesti Thr pH arvo on etupäässä pH 5,4:n alapuolella.

Erityisesti valmistetaan sellaisia kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R1 merkitsee H-Phe. Etupäässä val-25 mistetaan yhdisteitä, joissa A-ketjulla ja ketjulla (B2-30) on humaani-insuliinin sekvenssi.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä lähdetään edullisesti kaavan I mukaisista insuliineista. Edelleen ovat edullisia sellaiset kaavan III mukaiset lähtöyhdisteet, 30 joissa on sekvenssi H-R30 - (A )r- ( B )e- (C )t jossa 35 R30 merkitsee Ala tai Thr, A ja B ovat samanlaisia tai eri- 5 82838 laisia ja merkitsevät D-Arg, D-Lys, suojattua Arg tai suojattua Lys, C merkitsee D-Arg, D-Lys, suojattua Arg, suojattua Lys tai koliiniesteri-ryhmää, r, s ja t ovat samanlaisia tai erilaisia ja merkitsevät 0 5 tai 1, ja r+s+t>l, jolloin C-terminaaliset aminohapot voivat olla myös vastaaviksi aminohapoiksi pelkistettyjä.

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaan voidaan valmistaa:

Des-PheB1-sianinsuliini-ArgB31-OH 10 Des-PheB1-humaani-insuliini-ArgB31-0H Des-PheB1-sianinsuliini-ArgB31-Arg32-OH Des - PheB1 - humaani - insuliini - Arg831 - Arg®32 -OH Sianinsuliini-ArgB31-OCH3 Humaani-insuliini-Arg831-OCH3 15 Naudaninsuliini-ArgB31-OCH3

Sianinsuliini-ArgB31-ArgB32-OCH3 Humaani-insuliini-ArgB32-OCH3 Humaani-insuliini-LysB31-OH Humaani-insuliini-D-ArgB31-OH 20 Humaani-insuliini-D-ArgB31-ArgB32-OH

Humaani-insuliini-ArgB31-D-ArgB32-OH Humaani - insuliini - Lys831 - ArgB32-OH Humaani-insuliini-ArgB31-LysB32-OH Humaani-insuliini-Argininoli831 25 Humaani-insuliini-ArgB31-ArginioliB32

Humaani - insuliini - Lys831 - Arg832-ArgB33-OH

Humaani-insuliini-ArgB31-NH-y—~\ 0·^ 0 30 Humaani-insuliini-ArgB31-ArgB32-NHY^\ O J-O'

Des-ThrB30-humaani-insuliini-ArgB30-OH Des-ThrB30-humaani-insuliini-LysB30-OCH3 Des-ThrB30-humaani-insuliini-ArgB30-ArgB31-OH 35 mutta erikoisesti 6 82838

Humaani-insuliini-ArgB31-OH Humaani-insuliini-ArgB31-ArgB32-OH

Seuraavat L-aminohapot ovat geneettisesti koodattavissa: Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, 5 Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro (neutraalit aminohapot ovat alleviivatut).

Neutraalilla, luonnossa esiintyvällä aminohapolla tarkoitetaan erityisesti aminohappoja Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro tai Hyp. 10 Emäksisellä, luonnossa esiintyvällä aminohapolla tarkoitetaan erityisesti aminohappoja Arg, Lys, Hyi, Orn, Cit tai His.

Ryhmillä, jotka mahdollisesti salpaavat keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden C-terminaalisten 15 päiden vapaan karboksiryhmän, tarkoitetaan ennen kaikkea esteri- ja amidi-ryhmiä, etupäässä (C^C^-alkoksia, (C3-C6)-sykloalkoksia, NH2, (C^Cg )-alkyyliaminoa tai di-(^-C6)-alkyyliaminoa, tai emäksisiä ryhmiä, kuten amino-(Cj-C6)-alkoksia, (Cj-^ )-alkyyliamino-(C2-C6)-alkoksia, di-i^-20 C4)-alkyyliamino(C2-C6)-alkoksia, tri-(C1-C4)-ammonio-(C2- C6)-alkoksia, amino-(C2-C6)-alkyyliaminoa, [(C1-C4)-alkyyli-amino]-(C2-C6)-alkyyliamino, [di-C1-C4)-alkyyliamino]-(C2- C6)-alkyyliaminoa tai [tri-(C1-C4 )-alkyyliammonio]-(C2-C6)-alkyyliaminoa, erityisesti -0-[CH2]p-NR2, -0-[CH2]p-NR3, tai 25 -NH-[CH2]p-NRp, jossa p = 2-6 ja R on samanlainen tai eri lainen sekä merkitsee vetyä tai (C1-C4)-alkyyliä.

Insuliineina voidaan käyttää kaikkia luonnosta eristettyjä insuliineja, joissa on Lys (B29), edullista on kuitenkin käyttää insuliineja, jotka ovat peräisin siasta 30 tai ihmisestä; sama koskee proinsuliinia. Sopivina esipro- insuliineina tulevat ennen kaikkea kysymykseen sellaiset geeniteknologian avulla saadut esi-proinsuliinit, joissa vastaavan koodauksen kautta on esisekvenssissä asemassa BO emäksinen aminohappotähde, joka voidaan pilkkoa trypsii-35 nillä tai jollain trypsiinin kaltaisella, vapaalla tai 7 kantajaan kiinnitetyllä entsyymillä.

Keksinnön mukaisen menetelmän lähtöyhdisteistä Des-PheB1-insuliinit ovat tunnettuja esim. DE-PS 20 05 658:n tai EP-A- 46 979:n perusteella.

5 Geeniteknologisin menetelmin on sitä vastoin mah dollista hankkia lähtömateriaaleina humaani- tai kädellisten proinsuliinia. Mutta lisäksi voidaan rakentaa myös suhteellisen yksinkertaisia plasmideja, joista lohkaisemalla vastaavia esi-proinsuliini-johdannaisia saadaan 10 uusia insuliinijohdannaisia, koska ne luonnossa, kohdassa B31 ja B32 esiintyvien arginiinien tilalla, koodaavat muita neutraaleja tai emäksisiä aminohappoja.

Proinsuliinin valmistus käyttämällä yhdistelmä-DNA-metodiikkaa edellyttää DNA-sekvenssin muodostamista, joka 15 koodaa proinsuliinin aminohapposekvenssiä, joka voidaan saada aikaan joko eristyksen avulla, konstruoimalla tai molempien yhdistelmän avulla. Proinsuliini-DNA käytetään sitten lukuvaiheessa jossain sopivassa pesäke- ja ekspres--sionkantajassa. Kantaja käytetään jonkin sopivan mikro-20 organismin transformointiin, ja tällöin saatu transformoitu mikro-organismi kasvatetaan sitten käymisolosuhteis-sa, jotka johtavat proinsuliinia sisältävän vektorin lisä-kopioiden muodostumiseen sekä proinsuliinin, jonkin proin-suliinijohdannaisen tai proinsuliiniesiasteen (tai esi-25 proinsuliini-johdannaisen) ekpressioon.

Jos ekspressiotuotteena on kysymys proinsuliinin esiasteesta, sellainen tuote yleensä saa proinsuliiniami-nohapposekvenssin, joka pääteaminoryhmänsä kohdalla on sidottu proteiinin katkelmaan, joka normaalisti ilmentyy 30 geenisekvenssin kautta, jossa proinsuliini tai proin suliini johdannainen pannaan käyntiin.

Peptideinä tai aminohappojohdannaisinä, joita voidaan käyttää entsyymin katalysoimaan reaktioon, tulevat kysymykseen ennen kaikkea kaikki mahdollisesti sivuket-35 jussa ja karboksyylipäässä suojatut di-, tri- ja tetrapep- 8 82838 tidit, joiden N-päätteenä on Gly, L- tai D-aminohappo, paitsi sellaiset, joissa aminohapon karboksyylipää on emäksisenä amidi- tai juuri samanlaisena esterijohdan-naisena, edullisesti koliiniesterinä tai amidina jonkin 5 ylimääräisen kvaternäärisen ammoniumtähteen kanssa. Ole massa olevat vapaat COOH-, OH-, SH-, ω-ΝΗ2-, guanidino-ja/tai imidatsoliryhmät ovat tarvittaessa sinänsä tunnetulla tavalla suojattuina (vertaa esim. Bodantsky et ai., kirjassa Pentide Synthesis, toinen painos (1976), 10 John Wiley & Sons).

Lysiinin tai ornitiinin e-aminoryhmän uretaanisuo-jaryhmät ovat esimerkiksi Fmoc, Fcboc, Z, Boc, Ddz, Bpoc, Z (N02), Pyoc, Dobz, Moc, Mboc, Iboc, Adoc, Adpoc, Mac tai Pioc; edullisia ovat Z ja Boc. Näiden aminosuojaryhmien 15 poistaminen tapahtuu happojen emästen tai pelkisteiden kanssa (vrt. Kontakte Merck 3/79, s. 14 ja seuraavat sivut).

Arginiinin guanidino-ryhmän suojaryhmät ovat esim. Adoc, Tosyl, Boc, Z, mesityleeni-2-sulfonyyli (Mts) ym. 20 Lohkaiseminen voidaan suorittaa joko hydrolyyttisesti tai hydrogenolyyttisesti (vrt. Kontakte Merck 1/80, s. 23, 30).

Asp:n ja Glu:n COOH-sivuryhmät voidaan suojata al-kyyliesterinä, etupäässä metyyli-, etyyli- tai tert. bu-25 tyyliesterinä, tai bentsyyliesterinä tai muunnettuna bent-syyliesterinä (mm. p-N02, p-Cl, p-Br). Suojauksen poistaminen suoritetaan alkalisen tai happamen saippuoinnin tai hydrauksen avulla (vrt. Kontakte Merck 3/79, s. 14, 20).

30 Thr:n tai Ser:n OH- sivuryhmät voidaan tunnetulla tavalla suojata eetteri- tai asyyli-suojaryhmien, kuten esimerkiksi (C^-CgJ-alkyylin, etupäässä tert. butyylin tai (C^-C^-alkanoyylin avulla.

Suojaryhmän valinta sekä synteesin suoritustapa 35 määräytyy aminohappojen sekä C-terminaalisen, karbok- β 82838 siryhmän salpaavan ryhmän laadun perusteella.

Edullisina dipeptideinä voidaan käyttää sellaisia dipeptidejä, joissa N-terminaalinen alanyyli- tai treonyy-litähde, joka on sidottu L-/D-arginiini- tai L-/D-lysii-5 nitähteen kanssa, on suljettu sopivan, happamissa tai emäksisissä olosuhteissa lohkaistavan suojaryhmän avulla. L-/ tai D-Arg:n tai vastaavasti L-/ tai D-Lys:n irreversiibelinä karboksyyliryhmän suojaryhmänä voidaan peptidiin liittää myös emäksinen diamiini. Sellaiset dipeptidiyhdis-10 teet ovat edullisia ennen kaikkea silloin, kun aminohappotähteenä käytetään D-Arg tai D-pLys, koska steeriselek-tiivinen trypsiini tai esimerkiksi lysyyliendopeptidaasi-Lys-Ci ei voi tunnistaa näitä peptidijohdannaisia ja sen tähden muuntoreaktiota varten ei tarvita mitään sivuketjun 15 suojausta.

Amiinikomponenttina on myös mahdollinen jokin emäksinen aminohappo, edullisesti D-, L-arginiini ja D-, L-lysiini. Vastaavat tripeptidit täytyy karboksyyliryhmän lisäksi ainoastaan sivuketjussa sijaitsevien muunnosten 20 tapauksessa sulkea sopivien, happamissa tai emäksisissä olosuhteissa lohkaistavien suojaryhmien avulla. Mutta D-aminohappotähteiden sivuketjusuojaus voidaan valita myös reaktion jälkeisen puhdistusoperaation parantamiseksi.

Yllä mainitut peptidit tai aminohappojohdannaiset 25 syntetisoidaan standardimenetelmien mukaisesti, kuten esimerkiksi on kuvattu kirjassa "The Pentides Analysis,

Synthesis, Biology, osa 1 Major Methods of Peptide Bond Formation, osa A", julk. E. Gross, J. Meierhofer, Academic Press N.Y. (1979).

30 Trypsiinin ohella soveltuvat keksinnön mukaiseen menetelmään myös sellaiset endopeptidaasit, jotka kirjallisuuden perusteella tunnetaan trypsiinin kaltaisina, se on sellaiset, jotka spesifisesti lohkaisevat peptidisidok-sia emäksisten aminohappojen karboksipäässä (vrt. esim.

35 EP-A-17938).

ίο 82 838

Entsymaattiseen reaktioon käytettyjä aminohappoja tai peptidiyhdisteitä käytetään etupäässä 40 - 150 -kertaisena ylimääränä insuliinikomponentin suhteen. Entsyymi-substraatti -suhteena voidaan käyttää painosuhdetta, etu-5 päässä 1:5 - 1:20 erityisesti 1:10 entsyymiä insuliinikomponentin suhteen.

Jotta kuvatut aminohappo- ja peptidiyhdisteet, jotka liukenevat huonommin veteen, saadaan reagoimaan, voidaan muutoin vettä sisältävään reaktioliuokseen lisätä 10 jotain sopivaa, veden kanssa sekoittuvaa, orgaanista liuotinta, kuten esimerkiksi metanolia, dimetyyliformamidia tai dioksaania, kunnes muodostuu homogeeninen liuos.

Reaktioseoksen sisältämän veden määrän ei tulisi kuitenkaan laskea alle 50 %:n veden ja orgaanisen liuotti-15 men muodostamasta seoksesta, jotta vähennetään insuliini-komponentin ja/tai trypsiinin denaturoitumista, joka vähentää saantoa.

pH-arvot, joissa entsymaattinen reaktio suoritetaan, ovat tavallisesti 4-5 etupäässä noin pH 4,5. Kor-20 keammissa pH-arvoissa kuin annetulla alueella, asemassa Lys B29 tapahtuvien edullisten transamidointireaktioiden saannot vähenevät ArgB22:ssa tapahtuvan ei-toivotun proteo-lyyttisen pilkkoutumisen vuoksi.

Edullisia keksinnön mukaisesti valmistettuja joh-25 dannaisia ovat ne, joissa R1 merkitsee H-Phe ja/tai A-ketju sekä ketju (B2-29) ilmaisevat humaani-insuliinin sekvenssiä .

Kaikille näille insuliini-johdannaisille on yhteistä, että molekyylin pinnalla sijaitseva(t), yliraääräi-30 nen(set), positiivinen(set) varaus(varaukset) antaa (antavat) isoelektrisen pisteen, joka on neutraalilla alueella. Kustakin johdannaisesta riippuen saadaan isoelektri-sessä fokusoinnissa isoelektriset pisteet, jotka ovat 5,8 - noin 8,5, erityisesti 6,2 - 8,2. Johdannaiset ovat 35 siten neutraalialueella vähemmän liukoisia kuin natiivi li 82 838 insuliini tai proinsuliini, joiden isoelektrinen piste ja siten maksimaalisen liukenemattomuuden alue on pH:ssa 5,4, kun taas ne neutraalialueella ovat normaalisti liuenneina.

Insuliinin ja proinsuliinin liukoisuusominaisuuk-5 siin voidaan vaikuttaa isoelektrisen pisteen yläpuolella, t.s. terapeuttisesti erittäin mielenkiintoisella neutraalilla alueella, lisäämällä sinkki-ioneja. Sinkki vaikuttaa depot-periaatteen mukaisesti siten, että se stabiloi insuliinin heksameerista tilaa sekä sen kiteytymistaipumus-10 ta. Ihonalaisissa kudoksissa nämä agregaatit jälleen liukenevat .

Eräs muu sopiva depot-periaate on insuliinin tai proinsulinin kiteyttäminen kompleksina jonkin emäksisen proteiinin, esim, globiinin tai protamiinin kanssa.

15 Käytettäessä proinsuliinia liuoksessa tai jonkin kuvatun depot-periaatteen mukaisessa yhdisteessä tarvittiin lisäksi proteolyyttistä lohkomista natiivin, täysin tehokkaan insuliinin vapauttamiseksi. Koskemattomalla pro-insuliinilla on ainoastaan noin 1/8 insuliinin biologi-20 sesta tehosta, koska kuvitellaan, että osa biologisesti aktiivisesta pinta-alueesta, reseptorinsitoutumisalue, on proinsuliinissa olemassa olevan C-peptidin peittämänä. Proinsuliinina tulee epäilemättä diabetes-hoidon suhteen kysymykseen ainoastaan homologi, siis vain sellainen yh-25 diste, jolla on humaanisekvenssi (vert. esim. DE-A1- 32 32 036). Heterologisella proinsuliinilla on merkittävä immunogeenisuus. Tässä yhteydessä on huomioitava, että myös humaani-proinsuliinimuunnoksissa voi ilmetä C-pepti-diosa.

30 Havaittiin yllättäen, että insuliini-ArgB30-OH: 11a sekä muilla insuliini-johdannaisilla, joiden B-ketjussa on C-terminaalisesti orgaaninen ryhmä, joka on emäksinen luonteeltaan, erotuksena proinsuliiniin on lähes yhtä korkea biologinen aktiivisuus kuin natiivilla insuliinilla. 35 Diabetes mellituksen hoitoon voidaan käyttää lääke- i2 82838 ainetta, joka koostuu farmaseuttisesti turvallisesta kantaja-aineesta sekä vaikuttavasta aineesta, jona on jokin kaavan I mukainen insuliini-johdannainen.

Nämä lääkeaineet edustavat siten täydellisesti uu-5 siä hidastusmenetelmiä, jotka voivat saada aikaan vaikutuksen ilman depot-aineita, kuten sinkkiä tai protamiini-sulfaattia. Depot-vaikutus perustuu luontaiseen, proteii-nikemiasta riippuvaan fysikaaliseen periaatteeseen, in-suliinijohdannaisen vaikealiukoisuuteen isoelektrisessä 10 pisteessään. Sen uudelleenliukeneminen fysiologisissa olosuhteissa saadaan mahdollisesti aikaan lohkaisemalla ylimääräiset, emäksiset ryhmät, mikä suoritetaan kustakin johdannaisesta riippuen tryptisen tai trypsiinin kaltaisen ja/tai karboksipeptidaasi B- tai karboksipentidaasin B 15 kaltaisen ja/tai esteraasiaktiivisuuden avulla. Kulloinkin lohkaistut ryhmät ovat joko puhtaasti fysiologisia metabolia tte ja, kuten aminohappo, tai helposti metaboloituvia, fysiologisesti turvallisia aineita.

Insuliinijohdannaiset tämän uuden lääkeaineen vai-20 kuttavana aineena eivät säännöllisesti myöskään ole voimakkaammin immunogeenisia kuin vastaava insuliini itse, erotuksena kirjallisuudessa kuvattuihin väliasteisiin nähden, jotka vielä sisältävät heterologisen C-peptidin osia.

Kuvattu aine sisältää vaikuttavana aineena yhtä tai 25 useampaa kaavan I mukaista uutta insuliini-johdannaista.

Niiden pH-arvo on edullisesti 2,5 - 8,5, ja ne sisältävät sopivan isotonisuuden säilyttävän aineen, sopivan säilytysaineen ja mahdollisesti jonkin pH-alueelle 5,0 - 8,5 soveltuvan puskurin.

30 Kuvattujen johdannaisten tyypillistä käyttömuotoa edustavat valmisteet, jotka isoelektrisen pisteen alapuolella ovat liuoksina jossain fysiologisesti turvallisessa kantaja-aineessa. Tällöin liuoksen pH voi olla tyypillisesti 5,0, joka on siis selvästi korkeampi kuin hap-35 pamien, vanhojen insuliinivalmisteiden pH (tyypillisesti i3 82 838 pH = 3). Neutraalilla injektioliuoksella on tietyissä olosuhteissa selviä etuja niiden siedettävyyden suhteen.

Eräs uusi tyypillinen käyttömuoto ovat kuvattujen johdannaisten amorfisten tai kiteisten saostumien suspen-5 siot jossain fysiologisesti turvallisessa kantaja-aineessa, jolla on noin neutraali pH.

On kuitenkin myös mahdollista vahvistaa johdannaisten luontaista vaikealiukoisuutta fysiologisella pH-alu-eella ylimääräisten menettelytapojen avulla, kuten esimer-10 kiksi lisäämällä sinkkiä tai protamiinisulfaattia. Lisätyt sinkkimäärät voivat tällöin nousta aina 100 pg:aan Zn2t/100 insuliiniyksikköä, tyypillisesti noin 50 pg:aan

Zn2VlOO insuliiniyksikköä. Protamiinimäärät voivat olla 0,28-0,6 mg 100 yksikköä kohti (protamiinisulfaatin suh-15 teen). Tällä tavalla on valmistetavissa erityisen pitkävaikutteisia preparaatteja, joilla tulevaisuudessa on tähänastista laajempaa käyttöä, koska tämälleen perusmäärä insuliinia näyttää terapeuttisesti edulliselta. Tämä on jo nyt insuliiniannostuslaittein suoritetusta hoidosta saatu 20 käsitys.

Fysiologisesti turvallisena ja insuliinijohdannaisen kanssa soveltuvana kantaja-aineena käy steriili vesiliuos, joka tavanomaisella tavalla, esim. glyseriinin, keittosuolan tai glukoosin avulla tehdään isotoniseksi ja 25 joka tämän lisäksi sisältää vielä jotain tavallista säi löntäainetta, esim. fenolia, m-kresolia tai p-hydrok-sibentsoehappoesteriä. Kantaja-aine voi lisäksi sisältää puskuria, esim. natriumasetaattia, natriumsitraattia, nat-riumfosfaattia. pH:n säätämiseen käytetään laimennettuja 30 happoja (tyypillisesti HC1) tai emäksiä (tyypillisesti

NaOH).

Insuliinijohdannaisia voidaan yllä kuvatuissa lääkeaineissa käyttää myös alkali- tai ammoniumsuoloina. Mielivaltainen osa yhtä tai useampaa kaavan I mukaista 35 insuliini-johdannaista tai jokin kaavan I mukainen in- i4 82838 suliinijohdannainen voi olla näiden uusien insuliini-johdannaisten seoksessa toisistaan riippumatta joko liuotetussa, amorfisessa ja/tai kiteisessä muodossa.

Usein on edullista keksinnön mukaisessa valmistuk-5 sessa lisätä sopiva määrä jotain soveliasta stabilisaattoria, joka estää proteiinin saostumisen erilaisten materiaalien kanssa tapahtuvan kosketuksen aiheuttaman termomekaanisen kuormituksen seurauksena. Sellaiset stabilisaattorit ovat tunnettuja esimerkiksi EP-A-18609:n DE-A-10 32 40 177:n tai W0-83/00288:n perusteella.

Esillä olevissa lääkeaineissa, jotka voivat sisältää jonkin tunnetuista hidastustekijöistä, kuten vähän protamiinisulfaattia, globiinia tai sinkkiä sopivissa määrin, voidaan sellaista hidastustekijää soveltaa yhdis-15 telmänä koko vaikuttavan aineosan kanssa tai sen osien kanssa tai seoksena yhden tai useamman kaavan I mukaisen insuliini-johdannaisen kanssa. Lääkeaine voi sisältää kaavan I mukaisia, erilaisia insuliini-johdannaisia yhdistelmänä useampien erilaisten, hidastavasti vaikuttavien apu-20 aineiden kanssa.

Mainituilla terapeuttisilla lääkeaineilla on saavutettavissa myös selvästi runsaita erittäin hienosti säädettävissä olevia vaikutusominaisuuksia; täten tulisi alussa tehtyjen huomioiden mukaisesti edistysaskeleiden 25 erityisesti liittyä sokeritaudin myöhäiskomplikaatioihin.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 6 g sianinsuliinia liuotetaan 20 ml:ssa vettä ja 5 ml:ssa jääetikkaa yhdessä 37 g:n kanssa H-Thr-Arg( Adoc)2-30 0But*Hac:a, ja pH säädetään jääetikalla pH-arvoon 4,6.

0eC:seen suoritetun jäähdyttämisen jälkeen lisätään liuok seen 0,6 g trypsiiniä, joka on liuotettu 2 ml:aan vettä. Reaktioseos pidetään 24 tunnin ajan 4 - 10eC:ssa. Tämän jälkeen reaktiotuote humaani-insuliini-B31-Arg(Adoc)2-0But 35 seostetaan lisäämällä 200 ml metanolia tai asetonia sekä is 82838 poistetaan sentrifugoimalla. Kirkasta jäännöstä käsitellään dipeptidi-johdannaisen takaisin saamiseksi.

Saostuma pestään vielä kerran metanoli/eetteri-seoksella sekä kuivataan tyhjössä. HPLC:n avulla määrite-5 tään raakaseoksesta 47 % tuotetta. HI-Arg831 (Adoc)2-OBut:n puhdistus ja eristys suoritetaan piihappogeelillä, kuten on kuvattu saksalaisissa patenttihakemuksissa P3147845,5 -42.

HI-ArgB31OH saadaan yhden tunnin mittaisella tri-10 fluorietikkahapolla suoritetulla käsittelyllä sekä tämän jälkeen eetterillä suoritetun saostuksen avulla.

Esimerkki 2 600 mg sianinsuliinia liuotetaan 2 ml:aan H20, 0,8 ml:aan DMF sekä 0,5 ml:aan etikkahappoa yhdessä 12,6 g:n 15 kanssa HaoThr*Arg-(Adoc)2-Arg(Adoc)2*0But sekä jäähdytetään 0eC:seen. Seokseen lisätään 60 mg trypsiiniä, joka on liuotettu 0,2 ml:aan vettä. 24 tunnin kuluttua voidaan näytteessä määrittää HPLC:n avulla 40 % HI-Arg831- (Adoc)2-Arg832 (Adoc)2-0But.

20 Esimerkki 3 60 mg sianinsuliinia liuotetaan 0,5 ml:aan vettä, 0,2 ml:aan dimetyyliformamidia sekä 0,1 ml:aan etikkahappoa yhdessä 676 mg:n kanssa Hae*2 HCl+Thr(but)-D-Arg-(Adoc)2-0But. pH säädetään trietyyliamiinin avulla arvoon 25 5,0, ja lisätään 6 mg trypsiiniä, joka on liuotettu 0,1 ml:aan vettä. 24 tunnin kulutta voidaan HPLC:n avulla määrittää 34 % reaktiotuotteesta HI-(B30)-(But )-D-Arg831-Arg832-(Adoc) 2-0But.

Esimerkki 4 30 6 g humaani-insuliinia liuotetaan 20 ml:aan vettä ja 5 ml:aan etikkahappoa yhdessä 48 g:n kanssa HCl*Hac· Thr(But) *Arg(Adoc)2-0But, ja annetaan reagoida 0,6 g:n kanssa trypsiiniä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Reagoinut erä 16 tunnin kuluttua: 35 %.

35 ie 82838

Esimerkki 5 85 mg sian proinsuliinia liuotetaan 483 mg:n kanssa Hac*HCl*Thr(But)-Arg(Adoc)2-OBut 0,5 ml:aan vettä ja 0,3 ml:aan etikkahappoa. pH säädetään arvoon 5,0 ja lisätään 8 5 mg trypsiiniä, joka on liuotettu 0,1 ml:aan vettä. Reagoinut erä 24 tunnin kuluttua: 37 %.

Esimerkki 6 85 mg sian proinsuliinia reagoi 1,2 g:n kanssa Hae•Thr-ArgiAdoc)2-Arg(Adoc)2-0But esimerkissä 5 kuvatulla 10 tavalla. Reagoinut erä HPLC:n avulla määritettynä: 33 %.

Esimerkkien 1-6 analytiikkaa: HI (humaani-insuliini)-ArgB31-0H ja HI-ArgB31-ArgB32-OH identifioitiin aminohappoanalyysin avulla, kuten myös L-Arg-tähteen ollessa kyseessä, vapauttamalla C-terminaa-15 linen arginiini karboksipeptidaasi B:llä (= emäksisten aminohappojen eksopeptidaasi).

Yhdisteiden isoelektriset pisteet määritettiin iso-elektrisen fokusoinnin avulla pH:n ollessa 6,5 HI-ArgB31-0H analysoitaessa tai 7,0 HI-ArgB31-ArgB32-0H analysoitaessa. 20 Vastaavat retentioajat HPLC-systeemissä määritet tiin sen jälkeen, kun suojaryhmät oli lohkaistu CF3C00H:lla ja raaka-aine oli seostettu eetterillä. HPLC-systeemi: Waters Rad/Pak C18, 10 pm, 0,05 M tetraetyyliammoniumfos-faatti, 0,25M NaC104, 10 % CH3CN; pH 3 (puskuri A); 25 0,05 M tetraetyyliammoniumfosfaatti; 90 % CH3CN; pH 3 (puskuri B); 28 - 40 % B-gradientti, 1,5 ml/minuutti, huoneen lämpötilassa, 210 nm.

Retentioajat: sianinsuliini: t = 23 min.

HI-ArgB31-0H : t = 26 min 30 HI-ArgB31-ArgB32-OH : t = 28 min.

Esimerkki 7 600 mg Des-PheBl-sianinsuliinia liuotetaan 2 ml:aan H20, 0,8 ml:aan DMF ja 0,5 ml:aan etikkahappoa yhdessä 12,6 g:n kanssa Hac*Thr*Arg(Adoc)2-Arg(Adoc)2*0But ja jäähdyte-35 tään 0°C:ssa. 60 mg trypsiiniä liuotettuna 0,2 ml:aan vet- i i7 82 838 tä lisätään seokseen. 24 tunnin jälkeen voidaan näytteestä HPLC:n avulla määrittää 45 % Des-PheB1-HI-ArgB31(Adoc)2-Arg832 (Adoc) 2-OBut.

HPLC-kromatografia suoritettiin seuraavasti: 5 RPS-pylväs Waters RCCS, 10 pm, 8-10 mm; liikkuva faasi: 0,05 M tetraetyyliammoniumfosfaatti; 0,15 M NaC104; pH 3,0; lineaarinen 32 - 47 %:inen asetonitriiligradientti.

Esimerkki 8 450 mg sianinsuliinia (kiteistä) sekoitetaan 3,7 10 g:aan (tert.-butyyli)treonyyliarginiinia ja 1,5 ml:aan vettä ja suuriviskoosisen liuoksen pH:ta säädetään tri-etyyliaminilla arvoon 5,0, jolloin 0,1 ml liuosta laimennetaan 0,2 ml:11a vettä ja pH-arvo mitataan lasielektro-dilla. Reaktioseokseen lisätään 2 mg lysyyliendopeptidaa-15 sivalmistetta, jonka aktiivisuus on 10 yksikköä.

Reaktiota ylläpidetään 4 päivää huoneen lämpötilassa, kunnes HPLC:llä mitattu reagoinut erä on 72 %. Reak-tioseos laimennetaan sen jälkeen 50 ml:11a vettä ja saatu humaani-insuliini-(tert.-butyyli)-B-30-Arg-B31 yhdessä 20 reagoimattoman sianinsuliinin kanssa saostetaan lisäämällä 1 ml l-%:ista ZnCl2:n liuosta vedessä pH:ssa 6,3. Muodostunut sakka sentrifugoidaan talteen, pestään vähäisellä määrällä vettä ja kuivataan alipaineessa. Saanto 420 mg.

Eristetty tuote liuotetaan 2 ml:aan trifluorietik-25 kahappoa ja pidetään 45 minuuttia huoneen lämpötilassa B30-aseman treoniinitähteen tert.-butyylisuojaryhmän loh-kaisemiseksi. Insuliinin eristämiseksi liuokseen lisätään 10 ml di-isopropyylieetteriä. Muodostunut sakka sentrifugoidaan talteen, pestään di-isopropyylieetterillä ja kui-30 vataan. Saanto 417 mg. Arg-B31-humaani-insuliinista erotetaan reagoimaton sianinsuliini kationinvaihtajassa ja Arg-B31-humaani-insuliini eristetään sitä sisältävistä fraktioista tunnetulla kiteytysmenetelmällä. Kiteytymä kuivataan alipaineessa. Saanto 205 mg. Aminohappoanalyysi 35 vastaa teoreettisia arvoja, ts. ylimääräisen arginiiniryh- ie 82838 män sisältävän humaani-insuliinin aminohappokoostumusta.

Esimerkki 9 500 mg sianinsuliinia saatetaan reagoimaan esimerkissä 8 kuvatulla tavalla 9,2 g:n kanssa (tert.-butyyli)-5 treonyyliarginyyliarginiinia (Thr(But)-Arg-Arg) 5 ml:ssa vettä, jolloin lisätään 20 entsyymiyksikköä lysyyliendo-peptidaasia (eristetty Lysobacterium enzymogenes-kannasta) pH:n ollessa 5,1.

Kolmen päivän kuluttua voidaan tavanomaisella 10 HPLC-menetelmällä mitata 50 %:n reaktiosaanto. Reaktio lopetetaan kuten esimerkissä 1 ja tuote eristetään. Saanto 443 g.

Tert.-butyylisuojaryhmän lohkaisu ja Arg-B31-32-humaani-insuliinin puhdistus tapahtuu kuten esimerkissä 8. 15 Saanto: 186 mg haluttua tuotetta, jonka aminohappoanalyy-si vastaa teoreettista arvoa.

Esimerkki 10 5,0 g Thr-Arg saatetaan reagoimaan esimerkissä 8 kuvatulla tavalla 500 mg:n kanssa sianinsuliinia ja 10 20 entsyymiyksikön kanssa lysyyliendopeptidaasia 6 ml:ssa vettä pH:n ollessa 5. Jatkokäsittely ja puhdistus tapahtuu analogisesti edellisten esimerkkien kanssa. Pitkälle puhdistetun Arg-B31-humaani-insuliinin saanto on 215 mg, ja sen aminohappoanalyysi vastaa teoreettista arvoa.

Claims (4)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen insuliini johdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava I 5 AI |-S— Sq A21 H- Gly A-ketju Asn -OH I I S s I f SS 10 B2 B29 R1 Vai B-ketju Lys -R1-R2 3 4 5 6 jossa R1 on H tai H-Phe, R1 on Ala- tai Thr-tähde ja R2 on 1 - 3 15 α-aminohappoa ryhmästä Thr, Arg ja Lys, joissa mahdolli sesti läsnäoleva päätekarboksiryhmä voi olla vapaana, es-teröityneenä, laktonina tai CH2OH:ksi pelkistettynä, ja jonka kaavan I mukaisen insuliinijohdannaisen isoelektri-nen piste on yli 5,8, tunnettu siitä, että 20 a) kaavan I mukainen insuliini, jossa R1 on H tai H-Phe, R1 on geneettisesti koodattavan L-aminohapon tähde ja R2 on OH tai karboksiryhmän suojaryhmä, tai b) proinsuliini, jolla on kaava

25 II - C-ketju — A1 rs-~S~\ A21 2 Gly A-ketju Asn -OH II I t 3 S S 4 I t 5 S s 6 | B29 Z- Vai B-ketju Lys _X 20 82838 jossa C-ketju ja X yhdessä ovat geneettisesti koodattavien L-aminohappojen sekvenssi, Z on H- tai ryhmä H-iD^-Y-(Phe)n-, m ja n ovat toisistaan riippumatta 0 tai 1, D on 5 geneettisesti koodattava L-aminohappojen esisekvenssi ja Y on Arg tai Lys, saatetaan reagoimaan peptidin kanssa, jolla on kaava III H-R30-R31 III 10 jossa R30 on Ala- tai Thr-tähde ja R31 on 1 - 3 a-aminohap-poa ryhmästä Thr, Arg ja Lys, joissa mahdollisesti läsnäoleva päätekarboksiryhmä voi olla vapaana, esteröityneenä, 15 amidina, laktonina tai CH2 0H:ksi pelkistettynä trypsiinin tai trypsiinin kaltaisen endopeptidaasin läsnäollessa vedessä, johon on mahdollisesti lisätty sopivaa orgaanista liuotinta, pH-arvossa, joka on insuliinin isoelektrisen pisteen alapuolella, ja mahdollisesti lisätyt suojaryhmät 20 poistetaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen insuliinijohdannainen, jossa R1 on H-Phe.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukai nen insuliinijohdannainen, jossa A-ketjulla ja ketjulla (B2 - 30) on humaani-insuliinin sekvenssi.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan hu- 30 maani-insuliini-ArgB31-OH tai humaani-insuliini-Arg831- ArgB32-0H. 2i 82838