FI75804C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktivt prolinderivat. - Google Patents

Description

1 75804

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten proliinijohdannaisten valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää proliinijoh-5 dannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava (I)

f»3 /—I

R-A-S-CH,CHCO-N (I) 10 \-

dooH

(jossa R on aminohapon Ä-aminoryhmään liittynyt syklohek-syylikarbonyyliryhmä; A on glysiini-, sarkosiini-, D-alanii-ni-, D-leusiini-, D-metioniini-, D-glutamiini-, D-fenyyli-15 alaniini-, D-tryptofaani- tai D-fenyyliglysiinitähde ja siinä on Λ-karbonyyliryhmä, joka muodostaa rikkiatomin kanssa tioliesterisidoksen) ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

Yhdisteitä, jotka ovat samankaltaisia kuin nämä kaa-20 van (I) esittämät yhdisteet, esimerkiksi yhdisteitä, joissa R on bentsoyyli-, asetyyli- tai t-butyylioksikarbonyyliryh-mä ja A on L-Λ"amino happo, on kuvattu GB-patenttihakemukses-sa nro 2 050 359A. Eurooppa-patenttihakemuksessa (EP) 9 898A1 kuvataan yhdisteitä, joissa R on bentsoyyli-, ase-25 tyyli-, t-butyylioksikarbonyyli-, syklopentyylikarbonyyli-ryhmä tai niiden kaltainen ja A on L-Λ-aminohappo. EP 35 383A1 kuvaa yhdisteitä, joissa R on bentsoyyliryhmä ja A on D-fenyylialanyyliryhmä. Ei kuitenkaan ole ennestään tunnettua kirjallisuusviitettä, joka erityisesti kuvaisi 30 kaavan (I) esittämiä yhdisteitä. Näin ollen ne ovat uusia yhdisteitä, joita ei ole kuvattu kirjallisuudessa, ja ne ovat käyttökelpoisia farmaseuttisina aineina kuten jäljempänä esitetään.

Rakennekaavan (I) ryhmässä : 35 fH3 : -CHjCHCO- 2 75804 on asymmetrinen hiiliatomi, joten tämä ryhmä voi olla D-muotona, L-muotona tai DL-muotona, so. D- ja L-muotojen seoksena. Jokainen muoto kuuluu esillä olevan keksinnön piiriin, ja D- ja DL-muodot ovat ensisijaisia biologisen aktii-5 visuutensa vuoksi.

Kaavassa (I) oleva proliiniryhmä 10

COOH

voi olla D-muotona, L-muotona tai DL-muotona ja jokainen muoto kuuluu esillä olevan keksinnön piiriin, jolloin L-ja DL-muodot ovat ensisijaisia biologisen aktiivisuutensa 15 vuoksi.

Valaisevia esimerkkejä kaavan (I) mukaisten proliini-johdannaisten farmaseuttisesti hyväksyttävistä suoloista ovat alkalimetallien kuten natriumin ja kaliumin kanssa muodostuneet suolat, maa-alkalimetallien kuten kalsiumin ja 20 magnesiumin kanssa muodostuneet suolat sekä emäksisten aminohappojen kuten argiinin ja lysiinin kanssa muodostuneet suolat. Kalsiumsuolat ja lysiinisuolat ovat edullisia.

Edellä määriteltyjä kaavan (I) mukaisia proliinijoh-dannaisia tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja 25 valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että a) saatetaan yhdiste, jolla on kaava (II) ΪΗ3 R-A'-S-CH2CHCOOH (II) 30 (jossa A' on edellä määritelty ryhmä A tai sen suojattu johdannainen; ja R tarkoittaa samaa kuin edellä on määritelty), karbodi-imidin läsnäollessa tai sen reaktiivinen amidi, hap-pohalogenidi, aktivoitu esteri tai seka-anhydridi reagoimaan 35 yhdisteen kanssa, jolla on kaava (III) 3 75804 HN (III) COOR' 5 (jossa R' on vetyatomi tai karboksyylin suojaryhmä) tai sen silyyliryhmän sisältävän johdannaisen kanssa inertissä orgaanisessa liuottimessa lämpötilavälillä -20°C:sta 10°C:seen ja poistetaan reaktiotuotteessa mahdollisesti olevat suoja- 10 ryhmät, tai b) saatetaan yhdiste, jolla on kaava (IV) R-A’-OH (IV) 15 (jossa A1 ja R tarkoittavat samaa kuin edellä on määritelty), karbodi-imidin läsnäollessa tai sen reaktiivinen amidi, hap-pohalogenidi, aktivoitu esteri tai seka-anhydridi reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava (V) 20 CHo j- I 3 / HS-CHoCHCO-N (V) v-i COOR' 25 (jossa R' on edellä määritelty) mukaisen yhdisteen kanssa intertissä orgaanisessa liuottimessa lämpötilavälillä -20°C:sta 10°C:seen, ja poistetaan reaktiotuotteessa mahdollisesti olevat suojaryhmät ja menetelmällä a) tai menetelmällä b) saatu tuote mahdollisesti muutetaan farmaseut- 30 tisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Jos kaavan (I) ryhmässä A on funktionaalinen ryhmä, joka ei saisi reagoida, kuten amino- tai karboksyyliryhmä, tarkoittaa kaavan (II) mukainen yhdiste johdannaista, jossa tällainen ryhmä voi olla suojattu.

4 75804

Mikä tahansa A':ssa oleva funktionaalinen ryhmä, joka ei saisi osallistua reaktioon, voidaan suojata ryhmillä, joita tavallisesti käytetään peptidisynteeseissä ja jotka voidaan poistaa suhteellisen lievissä olosuhteissa. Esimer-5 kiksi aminoryhmä voi olla suojattu t-butyylioksikarbonyyli-ryhmällä; karboksyyliryhmä voi olla suojattu t-butyyliryh-mällä. Nämä suojaryhmät voidaan poistaa käsittelemällä fluo-rivedyllä, trifluorietikkahapolla tai kloorivedyllä. Vaihtoehtoisesti karboksyyliryhmä on suojattu alemmalla alkyy-10 Iillä substituoidulla silyyliryhmällä kuten trimetyylisilyy-liryhmällä, joka poistetaan sitten käsittelemällä vedellä.

Kun R' kaavassa (III) on karboksyylin suojaryhmä, se voi olla t-butyyliryhmä tai alemmalla alkyylillä substituoitu silyyliryhmä ja se voidaan poistaa käsittelemällä fluorive-15 dyllä, trifluorietikkahapolla, kloorivedyllä tai vedellä.

Kaavan (II) mukaisen yhdisteen reaktiivinen johdannai-ne on sellainen, että reaktioon osallistuva karboksyyliryhmä on aktivoitunut. Karboksyyliryhmä voidaan aktivoida muuttamalla se miksi tahansa peptidisynteesien alalla tavalli-20 sesti käytetyksi muodoksi joita ovat esimerkiksi aktivoidut amidit, happohalogenidit, aktivoidut esterit ja happojen seka-anhydridit. Näistä muodoista ovat edullisia N-hydroksi-sukkinimidin kanssa muodostetut aktivoidut esterit, hapon seka-anhydridit hiilihapon monoesterien kanssa ja aktivoidut 25 amidit karbonyyli-di-imidatsolin kanssa. Karbo-di-imidejä kuten disykloheksyylikarbo-di-imidiä voidaan käyttää konden-sointiaineina muodostettaessa amidisidos karboksyyliryhmän ja iminoryhmän välille.

Kaavan (III) mukaisen yhdisteen reaktiivinen johdan-30 nainen on sellainen, että mainitun yhdisteen iminoryhmä on aktivoitunut. Iminoryhmä voidaan aktivoida millä tahansa menetelmällä, jota tavallisesti käytetään peptidisynteesien alalla, esimerkiksi menetelmällä, jossa liitetään silyyliryhmä kuten trimetyylisilyyliryhmä, "fosfatsomenetelmällä", 35 jossa käytetään fosforiyhdistettä kuten fosfotrikloridia /Ann. Chem. 572 96 (1951)71 menetelmällä, jossa käytetään 5 75804 fosforin happoesteriä kuten pyrofosforihapon tetraetyylies-teriä tai "N-karboksianhydridimenetelmällä" (NCA-menetelmä).

Reaktio voidaan saattaa tapahtumaan inertissä orgaanisessa liuottimessa kuten tetrahydrofuraanissa, dioksaanis-5 sa, dimetyyliformamidissa, heksametyylifosforiamidissa, kloroformissa, dikloorimetaanissa tai asetonitriilissä. Reaktio toteutetaan lämpötilavälillä -20°C:sta 10°C:seen. Reaktioaika vaihtelee riippuen lämpötilasta, reagoivista yhdisteistä ja liuottimesta ja on yleensä 0,5 tunnin ja 48 tunnin 10 välillä, edullisesti 1 tunnista 6 tuntiin.

Amidinmuodostusreaktion jälkeen reaktiotuotteessa mahdollisesti olevat suojaryhmät poistetaan millä tahansa, kulloinkin kyseessä olevalle suojaryhmälle spesifisellä menetelmällä, jotka on mainittu edellä.

15 Lopputuote voidaan eristää reaktioseoksesta ja puhdis taa millä tahansa tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi erilaisilla kromatografisilla menetelmillä käyttäen silika-geeliä, dekstraanin verkkopolymeeriä tai huokoisia polymeerejä kuten styreenidivinyylibentseeniä tai akryylihappo-20 estereitä. Sopiva eluointiliuotin voidaan valita seuraavis-ta: kloroformi, etyyliasetaatti, metanoli, etanoli, tetrahydrof uraani , bentseeni, vesi ja asetonitriili. Vaihtoehtoisesti voidaan lopputuote saada eristämällä reaktiotuote ensin orgaanisena suolana kuten disykloheksyyliamiinisuolana, 25 jota käsitellään sitten hapolla kuten esimerkiksi suolahapolla tai kaliumbisulfaatilla.

Menetelmävaihtoehdossa a) lähtöaineena käytettävä kaavan (II) mukainen yhdiste voidaan valmistaa helposti seuraa-valla menetelmällä: 30 Yhdiste, jonka kaava on (VI): R-OH (VI) (jossa R on sama kuin edellä on määritelty) tai sen karbok-syyliryhmän osalta reaktiivinen johdannainen saatetaan rea-35 goimaan aminohapon kanssa, jonka kaava on (VII): 6 75804 H2N-A"-COOR" (VII) (jossa A" on aminohappotähde, joka on sama kuin A' lukuun-5 ottamatta ryhmää NH tai C=0; R" on vetyatomi tai karboksyy-lin suojaryhmä) tai sen reaktiivisen johdannaisen kanssa, minkä jälkeen poistetaan R", mikäli se on suojaryhmä, jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on (VIII): 1Q R-NH-A”-COOH (VIII) (jossa R ja A” ovat samat kuin edellä on määritelty), tämän jälkeen kaavan (VIII) mukainen yhdiste tai sen reaktiivinen johdannainen saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on (IX): 15 CHo I 3 HS-CHjCHCOOR'" (IX) (jossa R'" on vetyatomi tai karboksyylin suojaryhmä) , minkä 20 jälkeen poistetaan R*1, jos se on suojaryhmä.

Esimerkkeihin kaavan (VI) mukaisen yhdisteen karbok-•j syyliryhmän osalta reaktiivisista johdannaisista kuuluvat peptidisynteesin alalla yleisesti käytetyt johdannaiset kuten aktivoidut amidit, happohalogenidit, aktivoidut esterit 25 ja happojen seka-anhydridit.

Jos R" kaavan (VII) mukaisessa aminohapossa on suoja-ryhmä, ovat tästä edullisia esimerkkejä t-butyyliryhmä (joka voidaan poistaa fluorivedyllä, trifluorietikkahapolla tai kloorivedyllä), bentsyyliryhmä (joka voidaan poistaa 30 pelkistämällä katalyyttisesti palladiumin tai sen kaltaisten avulla) ja alemmat alkyyliryhmät kuten metyyli ja etyyli (jotka voidaan poistaa hydrolysoimalla aikalisissä olosuhteissa) .

Kaavan (VII) mukaisen aminohapon reaktiivinen johdan-35 nainen on sellainen, että sen aminoryhmä on aktivoitu ja tällainen johdannainen valmistetaan millä tahansa aktivointi- 7 75804 menetelmällä, jota tavallisesti käytetään peptidisynteesien alalla, kuten liittämällä silyyliryhmä (esim. trimetyyli-silyyliryhmä), "fosfatsomenetelmällä", fosforihappoesteri-menetelmällä ja N-karboksianhydridimenetelmällä.

5 Karbodi-imidiä kuten esimerkiksi disykloheksyylikar- bo—di-imidiä voidaan käyttää kondensointiaineena muodostettaessa amidisidos kaavan (VI) mukaisen yhdisteen ja kaavan (VII) mukaisen aminohapon välille.

Reaktio voidaan saattaa tapahtumaan inertissä orgaa-10 nisessa liuottimessa kuten tetrahydrofuraanissa, dioksaanis-sa, dimetyyliformamidissa, heksametyylifosfotriamidissa, kloroformissa, dikloorimetaanissa tai asetonitriilissä. Reaktio toteutetaan yleensä jäähdyttäen tai huoneen lämpötilassa (-50°C:sta 20°C:een), edullisesti -30°C:sta 15 10°C:seen. Reaktioaika vaihtelee riippuen reaktiolämpöti-lasta, reagoivista yhdisteistä ja liuottimesta ja se on yleensä 0,5 tunnista 48 tuntiin, edullisesti välillä 1-6 tuntia.

Jos R" kaavassa (VII) on suojaryhmä, se voidaan pois-20 taa reaktiotuotteesta millä tahansa tavanomaisella, edellä kuvatulla menetelmällä.

Kaavan (VIII) mukainen yhdiste voidaan eristää reak-tioseoksesta ja puhdistaa millä tahansa tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi uudelleenkiteyttämällä etyyliasetaa-25 tista, n-heksaanista, asetonista tai vedestä tai eri tyyppisillä kromatografisilla menetelmillä kuten on kuvattu kaavan (I) mukaisen yhdisteen eristämisen ja puhdistamisen yhteydessä tai hajottamalla reaktiotuotteen orgaaninen suola hapon avulla.

30 Kaavan (VIII) mukainen yhdiste voidaan saattaa rea goimaan kaavan (IX) mukaisen yhdisteen kanssa reagoittamal-la ensin mainitun yhdisteen karboksyyliryhmä jälkimmäisen yhdisteen merkaptoryhmän kanssa kondensointiaineen (so. karbo-di--imidien kuten esimerkiksi disykloheksyylikarbo-di-35 imidin) läsnäollessa. Kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen reaktiivinen johdannainen voidaan saattaa reagoimaan kaavan (IX) 8 75804 mukaisen yhdisteen kanssa. Esimerkkejä kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen reaktiivisista johdannaisista ovat aktivoidut amidit, happohalogenidit, aktivoidut esterit ja happojen seka-anhydridit. Karbonyyli-di-imidatsolin kanssa muodos-5 tetut aktivoidut amidit ovat edullisia.

Kaavan (IX) mukaisen yhdisteen karboksyyliryhmä voi olla suojattu tai suojaamaton. Edullisia suojaryhmiä ovat t-butyyliryhmä ja muut ryhmät, jotka voidaan poistaa happa-missa olosuhteissa.

10 Reaktio, jossa muodostetaan tioliesteri, suoritetaan inertissä orgaanisessa liuottimessa kuten tetrahydrofuraa-nissa, dioksaanissa, dimetyyliformamidissa, heksametyyli-fosfotriamidissa, kloroformissa, dikloorimetaanissa tai asetonitriilissä. Reaktio toteutetaan yleensä jäähdyttäen 15 tai huoneen lämpötilassa (-50°C:sta 20°C:seen), edullisesti -30°C:n ja 10°C:n välillä silloin kun kaavan (VIII) mukaista yhdistettä käytetään sen aktivoituna amidina tai happo-halogenidina, ja -10°C:n ja 10°C:n välillä kun mainittua yhdistettä käytetään happoanhydridimuodossa. Reaktioaika 20 vaihtelee riippuen reaktiolämpötilasta, reagoivista yhdisteistä ja liuottimesta ja se on yleensä välillä 0,5-48 tuntia, edullisesti välillä 1-6 tuntia. Tioliesterin muodosta-misreaktion jälkeen poistetaan reaktiotuotteesta R"', jos se on suojaryhmä. Jos suojaryhmä on t-butyyliryhmä, se voi-25 daan poistaa tavanomaisella menetelmällä, so. reaktiolla fluorivedyn, trifluorietikkahapon tai kloorivedyn kanssa.

Lopputuote voidaan eristää reaktioseoksesta ja puhdistaa millä tahansa tavanomaisella menetelmällä kuten esimerkiksi uudelleenkiteyttämällä orgaanisesta liuottimesta 30 kuten etyyliasetaatista tai n-heksaanista, eri tyyppisillä kormatografisillä menetelmillä kuten on kuvattu kaavan (I) mukaisen yhdisteen eristämisen ja puhdistamisen yhteydessä tai hajottamalla reaktiotuotteen orgaaninen suola hapon avulla.

35 Keksinnön mukaisessa menetelmävaihtoehdossa b) saate taan kaavan (IV) mukainen yhdiste tai sen reaktiivinen joh- 9 75804 dannainen reagoimaan kaavan (V) mukaisen yhdisteen kanssa kuten edellä on esitetty.

Jos kaavan (I) ryhmässä A on vapaa funktionaalinen ryhmä, jonka ei tulisi osallistua reaktioon, kuten amino-5 tai karboksyyliryhmä, tarkoittaa kaavan (IV) mukainen yhdiste johdannaista, jossa tällainen ryhmä voi olla suojattu.

A':ssa mahdollisesti oleva funktionaalinen ryhmä, jonka ei tulisi osallistua reaktioon, suojataan ryhmillä, joita tavallisesti käytetään peptidisynteesien alalla ja 10 jotka voidaan poistaa suhteellisen lievissä olosuhteissa. Esimerkiksi aminoryhmä voidaan suojata t-butyylioksikarbo-nyyliryhmällä ja karboksyyliryhmä voidaan suojata t-butyyli-ryhmällä. Nämä ryhmät voidaan poistaa käsittelemällä fluori-vedyllä tai kloorivedyllä.

15 Vaihtoehtoisesti voidaan karboksyyliryhmä suojata alemmalla alkyylillä substituoidulla silyyliryhmällä kuten esimerkiksi trimetyylisilyyliryhmällä, joka poistetaan sitten käsittelemällä vedellä. Kun R' kaavassa (V) on karbok-syylin suojaryhmä, se voi olla t-butyyliryhmä tai alempi-20 alkyylisubstituoitu silyyliryhmä ja se voidaan poistaa käsittelemällä fluorivedyllä, trifluorietikkahapolla, kloori-vedyllä tai vedellä.

Kaavan (IV) mukaisen yhdisteen reaktiivinen johdannainen on sellainen, että reaktioon osallistuva karboksyy-25 liryhmä on aktivoitunut. Karboksyyliryhmä voidaan aktivoida sopivaksi muodoksi kuten aktivoiduiksi amideiksi, happohalo-genideiksi, aktivoiduiksi estereiksi tai happojen seka-an-hydrideiksi. Karbonyyli-di-imidatsolin kanssa muodostetut aktivoidut amidit ovat suositeltavia. Karbo-di-imidejä kuten 30 disykloheksyylikarbo-di-imidiä voidaan käyttää kondensointi-aineina muodostettaessa amidisidos karboksyyliryhmästä ja merkaptoryhmästä.

Kaavan (IV) mukaisen yhdisteen tai sen reaktiivisen johdannaisen ja kaavan (V) mukaisen yhdisteen välinen reak-35 tio saatetaan tapahtumaan inertissä orgaanisessa liuottimes-sa kuten tetrahydrofuraanissa, dioksaanissa, dimetyyliform- 10 75804 amidissa, heksametyylifosfotriamidissa, kloroformissa, di-kloorimetaanissa tai asetonitriilissä. Reaktio toteutetaan lämpötila-alueella -20°C:sta 10°C:seen, kun kaavan (IV) mukaista yhdistettä käytetään aktivoituna amidina tai happo-5 halogenidina, ja alueella -10°C:sta 10°C:seen kun mainittua yhdistettä käytetään happoanhydridinä. Reaktioaika vaih-telee riippuen reaktiolämpötilasta, reagoivista yhdisteistä ja liuottimesta ja se on yleensä 0,5 tunnista 48 tuntiin, edullisesti 1-6 tuntia.

10 Tioliesterin muodostumisreaktion jälkeen reaktiotuot teessa mahdollisesti olevat suojaryhmät poistetaan millä tahansa, vastaaville suojaryhmille spesifisellä menetelmällä.

Lopputuote voidaan eristää reaktioseoksesta ja puhdis-15 taa millä tahansa tavanomaisella menetelmällä, joita edellä on kuvattu, kuten esimerkiksi eri tyyppisillä kromatografisilla menetelmillä käyttäen silikageeliä, verkkoutunutta dekstraanipolyraeeriä ja huokoisia polymeerejä kuten styree-ni/divinyylibentseeniä tai akryylihappoestereitä. Sopiva 20 eluointiliuotin voidaan valita seuraavista: kloroformi, etyyliasetaatti, metanoli, etanoli, tetrahydrofuraani, bent-*: seeni, vesi ja asetonitriili. Vaihtoehtoisesti voidaan lop putuote saada eristämällä reaktiotuote ensin orgaanisena suolana kuten esimerkiksi disykloheksyyliamiinisuolana, jota : 25 sitten käsitellään hapolla kuten esimerkiksi suolahapolla ! tai kaliumbisulfaatilla.

Kaavan (I) mukaisessa yhdisteessä on karboksyyliryhmä liittyneenä pro1iiniryhmään, joten se voi muodostaa suoloja erilaisten emäksisten aineiden kanssa, mikäli näin halutaan. 30 Farmaseuttisesti hyväksyttävien emäksisten aineiden kanssa muodostetut suolat ovat erityisen tärkeitä. Tällaisia suoloja voidaan valmistaa tavanomaisella menetelmällä, so. kä-sittelemällä mainittua karboksyyliryhmää ekvimolaarisella määrällä jotakin yllä mainittua emästä (esim. alkalimetal-35 lit, maa-alkalimetallit ja emäksiset aminohapot).

11 75804

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut kaavan (I) mukaiset proliinijohdannaiset ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat estävät angiotensiini II:n muodostumisen angiotensiini (I):sta inhiboimalla angiotensiiniä 5 muuttavan entsyymin vaikutuksen. Tämän vuoksi ne ovat käyttökelpoisia angiotensiini II:n vaikutuksesta kohonneen verenpaineen hoidossa ja sydämen vajaatoiminnan hoidossa.

Muutamien esillä olevan keksinön mukaisten lopputuotteiden aktiivisuus angiotensiiniä muuttavan entsyymin inhi-10 biittoreina mitattiin.

1) Menetelmä

Angiotensiiniä muuttava entsyymi uutettiin kaniinin keuhkosta. Koeputkiin pantiin 0,111-molaarista boorihappo-Na2C03-puskuriliuosta (pH 8,3, 0,6 ml), 0,2 ml 0,111-molaa-15 rista boorihappo-Na2C03-puskuriliuosta (pH 8,3), joka sisälsi 25 mmol bentsoyyliglysyylihistidyylileusiinia (substraatti) , ja 0,1 ml 0,111-molaarista boorihappo-Na2CC>3-puskuri-liuosta (pH 8,3), joka sisälsi 10 °-10 moolia tutkittavia yhdisteitä (13 esillä olevan keksinnön mukaista lopputuo-20 tetta, jotka on esitetty taulukossa jäljempänä), ja esi- inkuboitiin 37°C:ssa 5-10 minuuttia. Sitten lisättiin kuhunkin koeputkeen 0,1 ml entsyymiliuosta (asetonijauho) ja kutakin seosta inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia. Entsyymin vaikutuksesta muodostunut bentsoyyliglysiini uutettiin etyy-25 liasetaattiin suolahapon läsnä ollessa ja sen määrä mitattiin UV-absorptiolla 228 nm:ssä. Määritettiin koeyhdistei-den läsnä ollessa esiintyvän entsyymiaktiivsuuden suhde entsyymiaktiivisuuteen ilman koeyhdisteitä (100). Kunkin koeyhdisteen pitoisuus, jolla entsyymin suhteellisen aktii-30 visuus oli 50 %, esitettiin kysymyksessä olevan koeyhdisteen aktiivisuutena inhiboida entsyymin toiminta ja ilmoitettiin 150-arvona.

12 75804 2) Tulokset --

Koeyhdiste I50

Yhdiste n:o 1 1,6 x 10”^ ^ Yhdiste n:o 2 1,3 x 10“^

Yhdiste n:o 3 4,0 x 10“^

Yhdiste n:o 4 1,0 x 10”^

Yhdiste n:o 5 1,5 x 10"?

Yhdiste n:o 6 1,7 x 10""7 10 Yhdiste n:o 7 4,8 x 10"8

Yhdiste n:o 8 1,7 x 10-*7

Yhdiste n:o 9 5,4 x 10”^ ^ Yhdiste n:o: 1. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliini 2. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyliglysyylitio)-2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliini 2Q 3. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-N-metyyliglysyyli- tio)-2-D-metyylipropanoyyl\7-L-proliini 4. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-tio)-2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliini 5. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-leusyylitio)-2- 25 D-metyylipropanoyyli7-L-proliini 6. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-tryptofyylitio)- 2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliini 7. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyyliglysyyli- tio) -2-D-metyylipropanoyyli7’*L”proliini 2q 8. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-metionyylitio)- 2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliini 9. N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-glutaminyylitio)-2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliini Esillä olevan keksinnön mukaisten lopputuotteiden 25 vaikutus kestää pitempään kuin samankaltaisen tehon omaa- vien tunnettujen yhdisteiden vaikutus, esimerkiksi 3-merkap- 13 75804 to-2-D-metyylipropanoyyli-L-proliinin (tavallisesti kutsuttu nimellä Captopril) vaikutus, niin että haluttu vaikutus verenpaineeseen voidaan saavuttaa harvemmin vuorokausiannoksin. Captopril ja muut tunnetut yhdisteet aiheuttavat veren-5 paineeseen äkillisen putoamisen antojakson alussa ja tämä voi kehittyä ortostaattiseksi hypotensiiviksi asteniaksi ^Lancet, voi. 1, nro 8, 115, p. 557 (10. maaliskuuta 1979).7, mutta esillä olevan keksinnön mukaisilla lopputuotteilla on vain lievä hypotensiivinen vaikutus antojakson alussa ja 10 ortostaattisen hypotensiivin astenian kehittyminen on hyvin vähän mahdollista. Captoprilin kaltaiset lääkeaineet, joissa on vapaa merkaptoryhmä, saavat aikaan erilaisia sivuvaikutuksia, joiden voidaan katsoa johtuvan merkaptoryhmästä. Muutamia mainitaksemme: häiriöitä makuaistissa, albumiinin 15 erittyminen virtsaan, agranulocytosis ja ihosairauksia, joihin liittyy kuume, on raportoitu julkaisuissa Lancet, voi.

1, nro 8160, p. 150 (19. tammikuuta 1980), Lancet, voi. 2, nro 8186, p. 129 (19. heinäkuuta 1980) ja South African Medical Journal, voi. 58, 172 (1980). Sitä vastoin esillä 20 olevan keksinnön mukaisten lopputuotteiden tioliesterisidos ei hydrolysoidu in vivo ja siten on epätodennäköistä, että muodostuisi merkaptoryhmä. Sen vuoksi on hyvin vähän mahdollista, että esillä olevan keksinnön mukaiset lopputuotteet aiheuttaisivat yllä mainittuja, merkaptoryhmästä johtuvik-25 si katsottavia sivuvaikutuksia.

Keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden aktiivisuuden vertailemiseksi rakenteeltaan läheisiin tunnettuihin yhdisteisiin suoritettiin vertailukokeet, joissa tunnettuina yhdisteinä käytettiin FI-patenttijulkaisusta 71749, 30 FI-patenttihakemuksista 810683, 810725 ja 810663 ja GB-ha-kemusjulkaisusta 2050359 tunnettuja yhdisteitä. Kokeissa määritettiin yhdisteiden angiotensiiniä muuttavaa entsyymiä inhiboiva aktiivisuus, hydrolyysi in vitro ja angiotensiini-I:n aiheuttamaa verenpainetta alentava vaikutus in vivo sekä 35 tämän kesto. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa I. Koetuloksista ilmenee, että keksinnön mukaisesti valmistettu 14 75804 yhdiste ei angiotensiiniä muuttavan entsyymin inhiboinnin osalta eroa oleellisesti ennestään tunnetuista. Muissa kahdessa kokeessa (hydrolyvsi, verenpainetta alentava aktiivisuus) keksinnön mukainen yhdiste sen sijaan on tunnettuihin 5 yhdisteisiin verrattuna ylivoimainen; sillä on merkittävästi vähemmän sivuvaikutuksia ja vaikutuksten kesto on paljon pitempi kuin tunnetuilla yhdisteillä.

is 75804 <0 — > c *h +j o e

c > rH

<U -H

rH > O <N (Τι VO

fQ 00 VO Γ0 fir-4 ^ (0 -H -

in (N

+J to o oo eg

<D rj tN in rH

C 3H

H (0 TJ- Γ~

<0 -Η ιΗ «H

Λ > O VO

C -H <Tv m 'T

d) -H (N ^ - 'T

U -P ιΗ II rn II O'

Jl O II <f C rH CH

> (0 VO C -vr *<#> κβ 0 u ~

UM C

+J :nJ -H

•H e & > m (0 * C > o i— ro ro (n ον o :(0 •H (U VO (Tv in <Tv Sh »H :(0 HO I *|0 « - c >,:(0 o oo vo Γ' m ·** σι fi

>,f-H co σ\ m in σι .X

H H fi 0 0) ^ Η -ι-ι .

Oho o r-ι oo m oo C

>i :n3 (—I o t— v—i >-h vo I (1) ffi -m iH 4-> ________ fi

•H

:(0

r-· i'- γ·- γ-- θ' I—I

o I I I I I (1)

m o o o o o I

H rH rH rH rH iH a) Θχ x x x x o

vo cn cn m ,X

%. ·* ·** 3 cn cm m co co 11 rH —....... ............ 1 ....... " " 1 1 ...... . . — 1 •H fi

-·(« X X X X X X

+J I I I I I I

- ^ (ö o a) a) <β o

0} I—I iH pfi pfi rH H

> C P4 Λ ·< Λ

I I I I I I

fi-P Q Q tfi fil P)

a) to I I I I I I

T3-H OOOO O O I-1 fi -o oouu u u rn ! 6 έώ ό ό * *

•H _ __. . _ ___ O

-P-- O

,X ^ I

(0 fi Ä K

(0 (Ö O— CJ

fi ·Η > I

HOJiddl σι σι σι cn

•O ^ rH n in ro roinin ro m m ro m m K

0-H rH 0 (Tv 00 (N VO (TiOOfMrO (TlOOCNirO (TiOOCNrO CJ

,¾¾ 3 in gnu r> vo vo ο ημο γό » id γό i X 4j .f-, :t0 3 o o o hoom r~ o o m r-oom to ^ tfl d) rHf: rH rH v—I rH rHrHiHO rH rH i—I O I—I rH v—I O |

r_| .,Η 4J rHd) Γ- 00 00 00 t^ 00 00 (N I— 00 OO (N Γ" 00 00 (N

fi Ό ·Η ·Η ,Χ

(13 x: -H to (0 HHH H HHHCQ HHHffl HHMCQ

fn >· > W ,C &η&ηΡη h , b h h U h Em En O Cm Eh Eh U X

16 75804

Kaavan (I) mukainen proliinijohdannainen ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat voidaan formuloida koostumuksiksi, jotka on tarkoitettu annettaviksi suun kautta, kuten tableteiksi, kapseleiksi, rakeiksi, jauheiksi, siira-5 peiksi ja eliksiireiksi, tai steriileiksi liuoksiksi tai suspensioiksi annettavaksi parenteraalisesti. Tätä tarkoitusta varten voidaan valmistaa farmaseuttisia koostumuksia yhdestä tai useammasta esillä olevan keksinnön mukaisesta lopputuotteesta (aktiiviaineosana) ja farmaseuttisesti hy-10 väksyttävistä apuaineista kuten täyteaineista, kantajista, sideaineista, stabilointiaineista ja makuaineista. Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden vuorokausiannos aikuisille on 0,5 mg - 2 g, edullisesti noin 1-500 mg annettuna oraalisti ja 0,1-600 mg, edullisesti noin 0,3-300 mg 15 annettuna parenteraalisti.

Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistusmenetelmää kuvataan nyt seuraavien esimerkkien avulla, joihin keksintö ei suinkaan rajoitu.

Esimerkki 1 20 N-bustituoitujen aminohappojen valmistus a) D-alaniini (4,5 g) liuotettiin 230 ml:aan Na2C03:n 1-normaalista vesiliuosta sekoittaen. Liuokseen lisättiin tipoittain 100 ml tetrahydrofuraania, joka sisälsi 9,0 g sykloheksyylikarbonyylikloridia, 5-10°C:ssa, jossa lämpöti-25 lassa seosta sekoitettiin 30 minuuttia, sen jälkeen sekoi- : tettiin huoneen lämpötilassa 1,5 tunnin ajan. Tämän jälkeen reaktioseokseen lisättiin 2N HC1 niin, että sen pH saatiin välille 1-2. Reaktioseosta uutettiin etyyliasetaatilla ja orgaaninen kerros pestiin kyllästetyllä NaCl-liuoksella ja 30 kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Suodos haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin raakatuote. Uudelleenkiteytys etyyli-asetaatti/n-heksaanista antoi 4,65 g N-sykloheksyylikarbonyy-li-D-alaniinia. ~ +26,6°.

.* Seuraavassa luetellut yhdisteet valmistettiin edellä 35 kuvatulla menetelmällä.

17 75804 h.

en en

H -H

I 3 3 •H Λ! Λί 3 πϊ ro e * M λ; 6 Λ E ^ E - -

O O ^0 ^ EK

o— O -— o ·—. LO .—. .—. -—. ·.·. · *· ΓΟ (N

+J ook cr se LO K » ® OK OK QK Q 5C —·—·

(D ^ O ^ O ^ O ro O rH O H O O H -—- O t—I

m oo qj eri qj o<i) ro φ * φ -O γο-η en rorH o lo

•H Hg Hg rH g Hg LO S3 D — - Q — OJ (N

rH I + | I I + U K U ' - 3 * V k v V —' LO CNI —' iJl O rf m 4J II O II O II O H O II O II O K--' K - ^ ]| «. - «. - *. - g (N g (N «. * •H Ό OH OH OH OH OH OH Z I LO Z | o ro

to β Γ", II r-. Il Il 4—, Il 1^ Il Il I CN σι | rH o rH

>1 3 U .¾ U Λ5 O «U U .¾1 U K * - K * * *

Puin "vJ —' '-ij'-r VJ — Vj — *<| — H HÖH Hroif

I I I I I I I I

3 3333333

H-) 4H m <4-1 4-1 m MH 4H UH

0)0 0 000000 ε u u u u u u u u •μ Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό 4-* >1 ^4 >1 >1 ^4 ^4 ^4 4-» ,β Λ Λ Λ Λ A Λ Λ 03 3 333333 β Μ Ρ-ι Μ Μ Μ )Η >Η >Η •μ 4-» 4J 4-) 4-) 4-» 4J 4-> 4-> rH 0) φ φ φ φ φ φ φ 0-Ρ 4-> 4J 4-» 4-» 4-> 4-> 4-> rl 4-) — -Η -· -Η — ·Η — -Η — -Η — ·Η — -Η -- -Η X -μ β ·Η e -Η β -Η β -Η β -rl β -Η β -rl β 3 33 33 33 33 33 33 33 33 φ φ 3 φ 3 0)3 0)3 (1)3 (1)3 0)3 (1)3 Κ > μ > μ > >Η > μ > )Η >)η >Μ > μ

I I I I I I

I I -rl I I ·Η I -rl I ·Η I -rl I ·Η

>1 I >1 rH >1 I >1 rH >1 rH >1Η >1 rH >1 rH

>1 >1 >4 >1 >4 >1 >4 >4 >1 >1 >1 >1 >4 >4 >1 >1 4.) 3 >1-H 3 >1 3 >1-<H 3>i 3 >4 3 >i 3>-i 3>i 3 Λί β Ό X C Λί fi Ό Λί β X β X C Λ( β Λί β > φ Ο -Η φ Ο -Η φ Ο -Η φ Ο -Η φ 0 Ή φ Ο Ή φ Ο -Η φ Ο -Η -Η -μ .C Λ μ .β Λ Ό Λ Λ μ ΚΙΛΌ ΛΛΌ ΛΛΌ ΛΛΌΛΛΌ 0 <d ojho ο)η·η oho ο μ -η ο μ -η ομ·η ο>η·ηο)η·η tr 0) '—13'—I ι—I 3 μ ι—I 3 ι—I <—I 3 Μ ι—13)-1 <—I 3 )Η I—I 3 μ '—13)-1 3 β Λί Λί Λί Λί Λ! 0 XXX XX 0 Λ! Λί 0 Λ! Λί 0 Λί Λί 0 Λί Λί Ο

φ -rl ^l-rl -rl >4 -rl rH >1-rl -r| >4-rl rH >4 -rl r-H >4-rl rH >4-rl rH >4-H rH

K 3 en ri rH en rH Λί w ri h 3 h en rH x en ri x μηλ: wha; i) & β r-H 3 3 3 3 3 3 33

S +* Il I

I >1 O -rl -rl I I ft >1 -rl I β -rl I I I -rl I I β I I >4 I I β I I -μ Ι Ι β Ι Ι -Η Ι Ι 3 +> Λί ο ο -η Λίθο Λί ο μ Λίοω-ΗΛίοα) ,ν ο >-η χο·η )(οο 1 Ο Ο) Λ UH β (1) Λ rH φΛ-μ ΦΛΉ β φ Λ S φ Λ tr Ο) Λ 3 ΦΛϋ -μ & Λ μ I 3 Λμΐ Λ μ I Λ M I -Η Λ M I A M I .β μ >4 ,β μ μ 4J -μ 3 Ο 3 Ο Η Ο 3 Q 03Q-rl 03Q-H 0 3 Ο 03Q-H O 3Η 033 3 β Λ rH ,lfi I 3 rH χ ι H K I fi H M I η H )( I HXI fi Λ Ό 0 Λί -H -H -H X -H -H -H Λί -H -H 3 Λί -H -H >4 Λί -H -r| -H X -H -μ -μ Λί -H -μ Λ! -μ -μ

β -μ β >4 rH ι—I rH >1 rl rl fi >4 rH rH 3 >4 rH rH rH >4 rH rH β >4 rH rH -μ >4 rH rH >4d H

30 -H 3 >4 >4 >4 3>4 >4-μ 3 >1 >(MH 3 >4 >4 tT 3 >4 >4-rt 0) >4 >1 g 3>i>i 3 >4 >4 I β ε I >1 >4 >4·μ I >4 >4·μ I >4 >1 O I >4 >4·Η I >4 >4-μ I >4 >4 3 I >1 >4 I >1 >4 μ Z -μ 3 Ζ 3 β β β Ζ 3 β 3 Ζ 3 β -μ Ζ 3 β Η ζ 3 β β Ζ 3 β -μ Ζ 3 β Ζ 3 β β is 75804

Esimerkki 2 a) 3- (N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)- 2-D-metyylipropaanihappo N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alaniini (5,97 g) liuo-5 tettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (100 ml). Liuokseen lisättiin karbonyyli-di-imidatsolia (5,84.g) -20°C:n ja -15°C:n välillä ja seosta sekoitettiin siinä lämpötilassa tunnin ajan. Sen jälkeen lisättiin 3-merkapto-2-D-metyyli-propaanihappoa (3,60 g) ja seosta sekoitettiin lämpötilassa 10 -15... -10°C tunnin ajan, sitten vielä huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Seos haihdutettiin tyhjössä liuottimen poistamiseksi. Jäännökseen lisättiin vettä (40 ml) ja 2N-HC1 lisättiin seokseen sen pH:n säätämiseksi välille 1-2. Seosta uutettiin etyyliasetaatilla ja orgaaninen kerros pestiin 15 kyllästetyllä NaCl-liuoksella kahdesti ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Suodos haihdutettiin tyhjössä raaka-tuotteen saamiseksi. Uudelleenkiteytys etyyliasetaatti/n-heksaanista antoi otsikkoyhdisteen värittöminä prisma-maisina kiteinä (7,50 g, 83 %). Sp. 149-152°C.

20 ÄZD - +46,4° (C=l, 07, MeOH) NMR (CD3OD, 6 ): 1,20 (3H, d), 1,35 (3H, d), 1,20-2,0 (UH, m), 2,40-2,80 (1H, m), 3,05 (2H, m), 4,50 (1H, m) b) 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyyliglysyyli-tio)-2-D-metyylipropaanihappo 25 Yllä kohdassa (a) esitetty menettely toistettiin käyttäen N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyyliglysiiniä (2,61 g), karbonyyli-di-imidatsolia (1,95 g) ja 3-merkapto-2-D-metyylipropaanihappoa (1,20 g). Saatiin otsikkoyhdiste keltaisena öljynä (2,07 g, 57 %).

30 Ä7d = -48,7° (C = 1,19, MeOH) NMR (CDC13, S ): 1,24 (3H, d) , 1,20-2,10 (UH, m), 2,40-2,80 (1H, m), 3,Ιο (2H, m), 5,75 (1H, d), 6,40-6,80 (lH,m), 7,30 (5H, S) , 8,90 (1H, S) .

c) 3- (N-sykloheksyylikarbonyyli-D-leusyylltio) -2-D- 35 metyylipropaanihappo

Kohdan (a) menettely toistettiin käyttäen N-sykloheks- 19 75804 yylikarbonyyli-D-leusiinia (2,41 g), karbonyyli-di-imidatso-lia (1,95 g) ja 3-merkapto-2-D-metyylipropaanihappoa (1,20 g). Saatiin otsikkoyhdiste öljynä (2,40 g, 70 %) .

Z&7d = +12,2° (C = 1,03, MeOH) 5 NMR (CDCI3, & ) : 0,95 (6H, d) , 1,28 (3H, d) , 1,20-2,10 (UH, m), 2,40-2,80 (1H, m), 3,10 (2H, m), 4,70 (1H, m), 6,00-6,30 (1H, m), 9,20 (1H, S).

d) 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-glutaminyylitio)-2-D-metyylipropaanihappo 10 Yllä kohdassa (a) esitetty menettely toistettiin käyt täen N-sykloheksyylikarbonyyli-D-glutamiinia (2,56 g), kar-bonyyli-di-imidatsolia (1,95 g) ja 3-merkapto-2-D-metyyli-propaanihappoa (1,20 g). Saatiin 0,70 g otsikkoyhdistettä (20 %). Sp. 146-149°C.

I5 £>7d = +10,8° (C = 1,05, MeOH) NMR (CD3OD, S ) i 1,20 (3H, d) , 1,20-2,10 (UH, m), 2,30 (4H, m), 2,40-2,80 (1H, m), 3,05 (2H, m), 4,50 (1H, m).

e) 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-tio)-2-D-metyylipropaanihappo 20 Yllä kohdassa (a) esitetty menettely toistettiin käyt täen N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyylialaniinia (1,37 g), karbonyyli-di-imidatsolia (1,0 g) ja 3-merkapto--2-D-metyyli-propaanihappoa (0,60 g). Saatiin otsikkoyhdiste öljynä (1,5 g, 79 %).

25 Zä7d = +13,9° (C = 1,02, MeOH) NMR (CDCI3, £): 1,25 (3H, d), 1,20-2,0 (10H, m), 2,1-3,0 (2H, m), 3,0-3,4 (4H, m), 4,95 (1H, t), 6,19 (1H, d), 7,24 (5H, S), 10,12 (1H, S).

f) 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-metionyylitio)- 20 2-D-metyylipropaanihappo

Kohdan (a) menettely toistettiin käyttäen N-syklohek-syylikarbonyyli-D-metioniinia (0,325 g), karbonyyli-di-imidatsolia (0,25 g) ja 3-merkapto-2-D-metyylipropaanihap-poa (0,15 g). Saatiin otsikkoyhdiste öljynä (0,29 g, 64 %).

35 &7d = -7,9° (C = 1,0, MeOH) 20 75804 NMR (CDC13,S): 1,26 (3H, d), 1,2-2,0 (10H, m), 2,09 (3H, S), 2,0-3,2 (8H, m), 4,5-5,0 (1H, m), 6,62 (1H, d), 10,07 (1H, S).

g) 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D—tryptofyylitio)-5 2-D-metyylipropaanihappo

Yllä kohdassa (a) esitetty menettely toistettiin käyttäen N-sykloheksyylikarbonyyli-D-tryptofaania (0,157 g), karbonyyli-di-imidatsolia (0,1 g) ja 3-merkapto-2-D-metyyli-propaanihappoa (0,06 g). Saatiin kumimainen erä otsikkoyh-10 distettä (0,17 g, 82 %).

Z£7d = -7,1° (C = 1,0, MeOH) NMR (CDC13, £): 1,26 (3H, d), 1,2-2,4 (11H, m), 2,5-2,9 (1H, m), 3,03-3,3 (2H, m), 3,35 (2H, d), 4,87 (1H, t), 6,4-6,9 (2H, broad S), 6,9-7,8 (5H, m), 10,5 (1H, S).

15 Esimerkki 3 a) Ν-/Γ3- (N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio) -2-P-metyylipropanoyyli7-L-proliini 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D-metyylipropaanihappo (1,51 g) liuotettiin kuivaan tetrahydrofu-20 raaniin (40 ml). Liuokseen lisättiin trietyyliamiinia (0,61 g) ja etyyliklooriformaattia (0,65 g) -5°C:ssa sekoittaen. Viiden minuutin kuluttua lisättiin liuos, jossa oli L-proliinia (0,58 g) ja trietyyliamiinia (0,61 g) liuotettuna veteen (5 ml), ja seosta sekoitettiin 0°C:ssa tunnin ajan, 25 sen jälkeen huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Seos haihdutettiin tyhjössä liuottimen poistamiseksi. Kun jäännökseen oli lisätty vettä, lisättiin seokseen 2N-HC1 sen pH:n säätä-I miseksi arvoon 1-2. Reaktioseosta uutettiin etyyliasetaa- : tiliä ja orgaaninen kerros pestiin kyllästetyllä NaCl-liuok- 30 sella kahdesti ja kuivattiin mangesiumsulfaatilla. Suodos väkevöitiin tyhjössä etyyliasetaatin poistamiseksi ja jäännös kromatografoitiin silikageelillä käyttäen eluenttina kloroformin ja metanolin seosta (100:1-100:2)., Lopputuotet-ta sisältävät fraktiot otettiin talteen ja haihdutettiin tyh-35 jössä, jolloin saatiin kumimainen erä otsikkoyhdistettä (0,3 g).

2i 75804 b) Sama yhdiste voitiin valmistaa seuraavalla menetelmällä : 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D-metyy-lipropaanihappoa (6,3 g) ja N-hydroksisukkinimidiä (2,3 g) 5 liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (50 ml). Liuokseen lisättiin disykloheksyylikarbo-di-imidiä (4,3 g) lämpötila-välillä 0-5°C ja seosta sekoitettiin tässä lämpötilassa yli yön. Reaktion jälkeen sakka suodatettiin pois ja liukenematon aines pestiin pienellä määrällä tetrahydrofuraania. Suo-10 dos ja pesunesteet yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä.

Jäännökseen lisättiin etyyliasetaattia ja seos suodatettiin. Etyyliasetaattiliuos pestiin 0,5-normaalise11a HClrlla, vedellä, Na2C03:n vesiliuoksella ja kyllästetyllä NaCl-liuok-sella esitetyssä järjestyksessä. Liuos kuivattiin magnesium-15 sulfaatilla, haihdutettiin tyhjössä ja jäännös kiinteytettiin lisäämällä etyyliasetaatin ja heksaanin seosta (1:10). Kiinteän tuotteen saanto oli 6,90 g (87 %). Sp. 113-116°C. D*Jo = +14,2° (C=l, 05, Me OH) NMR (CDC13,&): 1,38 (6H, d) , 1,20-2,20 (UH, m), 2,82 (4H, 20 S), 2,8-3,30 (3H, m), 4,75 (1H, m), 6,30 (1H, broad d).

Aktivoitu esteri (3,98 g) liuotettiin tetrahydrofuraaniin (40 ml). Liuokseen lisättiin vettä (5 ml), johon oli liuotettu L-proliinia (1,15 g), ja N-etyylimorfoliinia (1,26 ml) ja seosta sekoitettiin yli yön. Seos haihdutettiin 25 tyhjössä liuotinten poistamiseksi ja jäännökseen lisättiin vettä. Seokseen lisättiin 2-normaalista HC1 sen pH:n säätämiseksi välille 1-2. Reaktioseosta uutettiin etyyliasetaatilla ja orgaaninen kerros pestiin kyllästetyllä NaCl-liuok-sella ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Suodos haihdutet-30 tiin tyhjössä. Jäännös pylväskromatografoitiin silikageelil-lä käyttäen kloroformin ja metanolin seosta (100:1-100:2) eluenttina. Tuote (1,45 g), joka saatiin haihdutettaessa eluaatti tyhjössä, todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen - kanssa NMR-analyysillä.

35 c) Otsikkoyhdiste voitiin valmistaa myös seuraavalla menetelmällä: 22 7 5 80 4 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D-metyy-lipropaanihappoa (4,52 g) liuotettiin tionyylikloridiin (5 ml). Liuokseen lisättiin tippa dimetyyliformamidia ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yli yön. Seos haih-5 dutettiin tyhjössä liuotinten poistamiseksi ja jäännökseen lisättiin kuivaa tolueenia (2 ml), ja seos haihdutettiin uudelleen tyhjössä liuottimen poistamiseksi. Jäännökseen lisättiin kuivaa tetrahydrofuraania (10 ml) sekoittaen. Tet-rahydrofuraaniliuos, joka sisälsi happokloridin, lisättiin 10 tipoittain lämpötilassa 5-10°C samalla sekoittaen veteen (25 ml), johon oli liuotettu L-proliini (2,3 g) ja Na2C03 (2,5 g). Seosta sekoitettiin tässä lämpötilassa tunnin ajan ja huoneen lämpötilassa vielä kaksi tuntia. Reaktioseosta uutettiin kloroformilla. Vesipitoiseen kerrokseen lisättiin 15 2-normaalista HCl sen pH:n säätämiseksi välille 1-2. Kun liuos oli uutettu kloroformilla, pestiin kloroformikerros kyllästetyllä NaCl-liuoksella kahdesti ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Kun kloroformi oli poistettu, kromatogra-foitiin jäännös silikageelipylväässä käyttäen kloroformin ja 20 metanolin seosta (100:1-100:2) eluenttina. Kun seos haihdutettiin tyhjössä, saatiin kumimainen aine (1,6 g). Tämä aine todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen kanssa NMR-analyy-sillä.

: d) Otsikkoyhdiste voitiin valmistaa vielä menetelmäl- 25 lä, joka on kuvattu seuraavassa.

3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D-metyy-lipropaanihappoa (3,01 g) ja L-proliinin t-butyyliesteriä (1,71 g) liuotettiin kuivaan dikloorimetaaniin (50 ml) ja liuokseen lisättiin disykloheksyylikarbc-di-imidiä (2,15 g) 30 sekoittaen ja jäillä jäähdyttäen. Seosta sekoitettiin samassa lämpötilassa puolen tunnin ajan ja pidettiin 5°C:ssa yli yön. Reaktioseos suodatettiin ja liukenematon aines pestiin dikloorimetaanilla. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja pestiin 1-normaalisella HCl:11a, vedellä, 1-normaalisella 35 NaHCC^lla ja kyllästetyllä NaCl-liuoksella mainitussa järjestyksessä, kuivattiin MgS04:lla ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin kumimainen erä N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyy- 23 75804 li-D-alanyylitio)-2-D-metyylipropyyli7-L-proliinin t-butyy-liesteriä (4,3 g). 4,0 g tätä esteriä liuotettiin anisoliin (30 g) ja liuokseen lisättiin trifluorietikkahappoa (10 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan ja 5 haihdutettiin tyhjössä trifluorietikkahappoylimäärän poistamiseksi. Jäännös kromatografoitiin silikageelipylväässä (kolonni: 2 x 35 cm) käyttäen eluenttina metanolin ja kloroformin seosta (1:100-3:100). Lopputuotetta sisältävät fraktiot otettiin talteen ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin 10 saatiin kumimainen aine (3,4 g). Tämän aineen todettiin olevan identtinen otsikkoyhdisteen kanssa NMRilla ja ohutker-roskromatografiällä.

Reagoivat aineet, reaktioliuottimet ja menetelmät, joita käytettiin valmistettaessa esimerkin 3 otsikkoyhdis-15 tettä on lueteltu seuraavassa taulukossa yhdessä sen fysikaalisten ominaisuuksien kanssa. Muut yhdisteet valmistettiin käyttäen jotakin esimerkissä 3 kuvatuista menetelmistä (a)-(d), ja kulloinkin käytetyn menetelmän erityispiirteet on lueteltu seuraavassa taulukossa yhdessä lopputuotteiden 20 fysikaalisten ominaisuuksien kanssa. Taulukossa numerot, jotka seuraavat numeroja (1) ja (2) sarakkeessa "Rf-arvo", ilmoittavat Rf-arvot, jotka on saatu ohutkerroskromatogra-fialla käyttäen eluentteina vastaavasti CHC^/MeOH/AcOH (2:1:0,003) ja n-BuOH/AcOH/H20 (4:1:1).

2i 75804 L £ o oo ^ cn g *o vo to to <x> vL o o o o o o

* €D <3> <£$> <3> O CSD

^ - ' aa

*“ tN ' CM fN - Ίν Q

« ~ S -^B δ ""^-δ δ - - θρΓ*--r«_ δ~™»_' ΰ« π βθδδδϊ ·υ - S S δ ® τ> ° S δΊδ § 1 :jj

£ |δΒ.έΒΒέΕ8 3 -f? Ε ε®8":$ e'e Β Β s'S I

> ^*-88889" ·ι~885~“ .5888§“8 o SS -m m (Τι ο in 3 ίο ^ m σν '"Ί 5 i^Lnrnoocn^rScjv H cn »«*.»..«— —— ·*>,**«,«. —· „ Η Λ^«.ΛΓϊ4,Τ><Τ>ιΓ,νΡ, i flri'f i (n π μ ι/no rs n> o oo tn i i I I i t—i i—itniiiLn>—ioiiiiictii s Nnmoin^oon oi na n o mnimmoi— nim Ö ^ ' * " * * S»* *>'****» S***»,»*» z H h hoi oi n ^ io r r-i r-ι <n m -a* vo σν HHoin^inrr _ O vo Sd s o Q vo ος s o ~ ^ o ~

& rj" r? ^ o h 3 oo hS

*5 ΐ JS t &| ‘f ai

+» fe S , λ S

2* «1 |g *g Il 11 l"s p il il is af i§ ύ

Ä^tE-tmOOQ) 03Φ QE Q

•h lii -htI .’ 1 ägi t &$ h lv 5 +3 1 jj2

Il lii tilli t^ ^1¾ ti iUiiä ! Il II Iillä hl 311 II Iin : ^ »s ö 3s s 2 2 lii, ||λ|| |S|!i *i i!sliii tlisi, Ifist s llifil Alia* Aiaf* :-: i *s? s iffiAäi ±£&ss 75804 25 co en o r- oo (N m co 0 VO r» LD 00 » - > - - o o 1_| o o o o _ (¾ _ O <0 1 Ö O <0 Θ MH - - Q5 - . Ti — r» _ ro » cn (0 ro » cm ·—

ΓΜ » »-» X X 10 S3 — X

- X i« E EX CJ tNU » * * o P CJ cnU - -P

g CJ 2 χ t* Λ Λ Λ m X X ^ Ό » » » »X » » -» - O X X X X td - CJ X X <d e

T>XCO-PCJXX»XTJ CJ CJ CJ 2 - Ό CJ CJ 'EK

VO CN CN T} O - » X ' —''ON

tj h < ^ ' --- O Tl £ *· s ^ β H O£ n)-xx g »CJ td E E E E -- <o e G o 2 <d u — O ro in en h x o * - P.!·

t^rx » * »rt * P X » » » » X O PK

X » χ ro uo ^ en X^XXXXliooo i'fXX'OlJWM

«. MOOl^1 2 3 4 5 I I I—I 00 1—I I—I (N ·—· - H Φ H

ro » i Hinwnooi * » ^ —co »'—''—"'—' - - - ~ »h x m - v » » x x oi x x x x x

CJ ro » cn <N ro ro rr » rH oo en r~ cn Ί* » - X roincot-HHinH

Q »~rH - VO ^ »r--^» cn—1 » » ^ — m ....ro·»» n ro in « i · O <N ro ^r w ____ __ |__loi l i l |tT»4->0 ΟΟΙΙΙΓΜΓΟΓ'-Ο X cm ro (n ror» (n (m—, oo HromHi»o<j\ id Hninnioinrooi a »xxx »xxx » »»»»»»»id» »»»»»»»» 2 i-hcJCJCJcncJCJCJI" ηηιν^^όό g te HHN'tiniohoo

O

Q » ». ΙΠ » » ro o 0 o -—. » o —»

q .. »X oo »X o »X

r-^ i—I H O » H o LiOi—lO

.¾ oo il φ r» il ω i il ®

^ i CJ 2 ^ CJ 2 OS

•H ^ W

02 I <U C I

JJ | Q) Il O > -H O

Qj -p 5> ·Η *H P 3 P

I g -h ΗΌ Ό » ^ O -H C » >1·|Η >ι·Η >i-p h-Po-h >i e -cc e

Jj jj 4J rH -Pfl3 föfö ·Η rl (o (ö

O <D ·Η <Ι)β·Η PtÖ O H M fO

id § « -h e"» -pp ε ,¾ x p Q) -H < P -Η0Φ 0)3 (ÖT)(U3 PJH Q Ή > En MH 01 OJ E-· Ή-Ι

>i-h i -h LL

>iEJil E -r· $ M -rH O -H I p γ , m L p i -p · O ^ , -L -p J o P fl -P H P O-H I rH Ή lö X ( >i C Sh O H J ·Η>ιΟ > o O X-H £mh ·* -P rH -H >1 m H +j ΗΛΙΛ 4J-H-H "P J|J £ £ 0 0) Λί P 2 Λ5 3P-P <P3 >cH O cd t7> Φ Sh <d 3 X O -P >i E C In X Ό

me in X » m O O <d >iP O O

O) -H -H -H -H -H -H OT rH (0 -P O -H H « g

(>; Id QHT) KO ΗΛ E w p gn 5*5 -H

1 :id o) ε — C r-H _Q ^ a ^ rs a) o» —· id (d u Ό S -P w - — — i i 2

I I I I I 1101 III —» O

3 OOOOIO OO-PQII 0 S ° £

rH X -rl I id P H Λ Λ I Id O H Λ >rH ft I

,¾ m X CN CU Λ P >ι(Ί ft ii ΛίΡΐΚ-Ρ-HJ

4 >. id α> I o I >1 Id p I o a >i id m -h h i +j ny g» μ j tn4i+i/» μ I >,rv.

0) I H I O ft I I Ή I O (i j * ·Ρ JL ^ ^’'P

a) 2 (JQ-HHN 2CQ-H-HI 2 C Q >1-P rH c

-P -id I 4J H J - Id I 4JHN — Id I W φ >i-H

0) I Id ·Η ·Η >1 rH ·Η I Id ·Η -r| ^i-rH-rl I Ifl Ή C ΐ^ιΉ •H /n tn rH rH >, >1 C fi) UIHH >iH e “ί ^ il Λ 2 Tl T3 >t>i-P >ι·Ρ '-P-* >ι>ι·Ρ >i-P >iÖ*Q C p

X I I) >1 >1 dl O H I fl) >i >i <D >i-rl I Φ >ι·Ρ I g P

5 2 X C C ε C rH 2 X C MH g e rH 2 X C rH CM a a 75804

P ι-H ΓΟ VO CS <N CO

p VO Γ*- VO VO ^3* ^3* H · * · · · · <U o o o o o o ^ Θ Θ Θ Θ Θ Θ % <n| * *. k *» ^

Sl_^ a-61. . a-e1 .s1 suo'. 8 - |*ί8ΐΒ-«§ I ® e s e e rr\ ** M P"* ·**··» SÖ ** U S ^ Vj £C ** * *“ *·

,Η ΌΛΗΚΚ5ΒΗ10 Λ'ίίωκχω Λ 5 S S S K

Π ^'ttcncn^ iH^r 04 m »dSCLilS

R s k m m k a tn tn κ H von ·ηο\ο ·Η nvnnooH π in oi <n ouo ςγ> *>—’ ^-' (\| · · · VO * · · w · · w w>.....

g immini (Nm m ^ ^ ^ T ^ g n h o i i i in o h ι i m t i in g*,M i 1 Ä Nm^ismoh <n n tn m «h vo ··«····· ·«···«· ······ οΗΗίΝΠΝΜΠ^ h h oj m m n* HHfNmNMn O o o —* o o ^ ° ° ci O o~ · S Ί1 »a ^ · 5

x a öl s äI r öI

H ..j Ή in h] in a u r- t:* liila fi§ ι ii as m 1 g 3 I I ea

I I '4 , S-J d ^ I

u , ^ , t '0 M I t o ί i Id ii ib I: il s S* tl ι tipi ! tili I li «3 H*M H«s SiSiS ö Wlw

·’: |j $ .5. tS S

lii! il, f|$ssi ;: ι ilfäi alli him 27 7 5 8 0 4

Esimerkki 4

Esimerkeissä 3 ja 5 valmistetuista näytteistä N-/3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D-metyylipro-panoyyli7-L-proliinia muodostettiin erilaisia suoloja.

5 a) Ca-suola 3,98 g:n erä esimerkissä 3 tai 5 valmistettua yhdistettä liuotettiin metanoliin (40 ml). Liuokseen lisättiin kalsiumasetaattihydraattia (0,84 g) ja seosta kuumennettiin refluksoiden tunnin ajan. Liukenematon aines suo-10 datettiin pois ja suodos haihdutettiin tyhjössä. Jäännökseen lisättiin kloroformia ja seos suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännökseen lisättiin dietyylieetteriä ja seos suodatettiin ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin esimerkin 3 tai 5 yhdisteen kalsiumsuola (3,40 g). 7D= 15 -47° (C=1,0, MeOH).

b) Mg-suola

Kohdan (a) menettely toistettiin käyttäen 3,09 g esimerkissä 3 tai 5 valmistettua yhdistettä ja 0,772 g mag-nesiumasetaatin tetrahydraattia. Saatiin esimerkin 3 tai 5 20 yhdisteen magnesiumsuola (2,42 g). ^o£7D= -46,6° (C = 1,0,

MeOH).

c) Lysiinisuola 1,19 g esimerkissä 3 tai 5 valmistettua yhdistettä liuotettiin metanoliin (22 ml). Liuokseen lisättiin lysii-25 niä (0,416 g) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännökseen lisättiin kloroformia ja seos suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännökseen lisättiin dimetyylieetteriä ja tuote imu-suodatettiin, jolloin saatiin esimerkin 3 tai 5 yhdisteen 30 lysiinisuola (1,54 g). /D = -23,1° (C = 1,0, MeOH) .

(d) Na-suola 2,27 g:n erä esimerkissä 3 tai 5 valmistettua yhdistettä liuotettiin metanoliin (25 ml). Liuokseen lisättiin 0,514 g natriumasetaattia ja seosta sekoitettiin huo-35 neen lämpötilassa 30 minuuttia ja haihdutettiin tyhjössä.

28 7 5 8 0 4 Jäännökseen lisättiin 200 ml metanolin ja kloroformin seosta (3:100 tilavuussuhde) ja muodostunut seos suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin metanoliin ja liuos suodatettiin ja haihdutettiin tyh-5 jössä. Jäännökseen lisättiin etyyliasetaattia ja tuote suodatettiin imulla, jolloin saatiin esimerkin 3 tai 5 yhdisteen Na-suola (1,85 g). = -26,7° (C = 1,0, MeOH) .

e) Disykloheksyyliamiinisuola 13,1 g:n erä esimerkin 3 tai 5 yhdistettä liuo-10 tettiin 120 ml .-aan asetonitriiliä. Liuokseen lisättiin di-sykloheksyyliamiinia (6 ml) sekoittaen. Seosta sekoitettiin edelleen 30 minuuttia ja annettiin sitten seistä yli yön. Sakka suodatettiin imulla ja kuivattiin ilmassa. Saadut raakakiteet suspendoitiin 300 ml:aan asetonitriiliä ja 15 suspensiota kuumennettiin refluksoiden 30 minuutin ajan. Suspensio jäähdytettiin ja kiteet suodatettiin imulla ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin esimerkin 3 tai 5 yhdisteen disykloheksyyliamiinisuola (12,2 g). /o(7D = -24,5° (C = 1,0, MeOH).

20 Esimerkki 5 N-/3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio) -2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliini N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alaniini (5,98 g) liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (80 ml). Liuokseen lisättiin kar-25 bonyyli-di-imidatsolia (5,84 g) -18°C:ssa sekoittaen samalla kun seosta jäähdytettiin jäillä. Seosta sekoitettiin tässä lämpötilassa tunnin ajan ja sen jälkeen seokseen lisättiin N-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliinia (6,29 g), minkä jälkeen sekoitettiin -18°C:ssa 30 minuuttia, sitten 30 huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Kun reaktio oli mennyt loppuun, se haihdutettiin tyhjössä liuottimen poistamiseksi. Jäännökseen lisättiin vettä (50 ml) ja seokseen lisättiin 2-normaalista HC1 sen pH:n säätämiseksi välille 1-2. Seosta uutettiin etyyliasetaatilla ja etyyliasetaattikerros pes~ 35 tiin kyllästetyllä NaCl-liuoksella, kuivattiin MgSO^:lla ja 29 75804 haihdutettiin tyhjössä. Jäännökseen lisättiin asetonit-riiliä (120 ml), sen jälkeen lisättiin 6 ml disyklohek-syyliamiinia (DCHA). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Kun seos oli seissyt yli yön, suo-5 datettiin sakka ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin raaka DCHA-suola 14,35 g. Raakasuola suspendoitiin ase-tonitriiliin (300 ml) ja suspensiota kuumennettiin refluk-soiden 30 minuutin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen sakka otettiin talteen imusuodatuksellaja kuivattiin ilmassa, 10 jolloin saatiin valkea DCHA-suola (12,20 g). DCHA-suola (12,20 g) suspendoitiin etyyliasetaattiin (90 ml) ja suspensioon lisättiin 0,5N KHS04:n vesiliuosta (60 ml) ja seosta ravisteltiin. Orgaaninen kerros pestiin tislatulla vedellä, kuivattiin MgS04:lla ja haihdutettiin tyh-15 jössä, jolloin saatiin kumimainen aine (8,64 g). Tämän aineen todettiin olevan identtinen otsikkoyhdisteen kanssa NMR-analyysillä ja ohutkerroskromatografiällä. NMR (CDC13,6): 1,20 (3H, leveä, d, CH3), 1,38 (3H, d, CH3), l, 55-2,0 (10H, m, CH2) , 2,0-2,5 (4H, m, CH2) , 2,5-3,3~" 20 (4H, m, CH & CH2), 3,4-3,9 (2H, m, CH2), 4,0-5,0 (2H, m, CH), 6,0-6,5”(1Η, m, NH), 7,31 (1H, s, C02H). Rf: (1) 0,66; (2) 0,71.

Esimerkki 6 N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyliqlysyylitio)-2-D-25 metyy1ipropanoyy147-L-pro1i in i N-sykloheksyylikarbonyyliglysiini (1,02 g) liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (10 ml). Liuokseen lisättiin 20 ml kuivaa tetrahydrofuraania, joka sisälsi 1,07 g karbonyyli-di-imidatsolia, -20°C:ssa sekoittaen samalla kun 30 seosta jäähdytettiin jäillä. Seosta sekoitettiin tässä lämpötilassa tunnin ajan ja sen jälkeen lisättiin 6 ml kuivaa tetrahydrofuraania, joka sisälsi 1,09 g N-(3-mer-kapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliinia, minkä jälkeen sekoitettiin -20°C:ssa 30 minuuttia ja sitten huoneen 35 lämpötilassa tunnin ajan. Kun reaktio oli mennyt loppuun, seos haihdutettiin tyhjössä liuottimen poistamiseksi. Jään- 30 7 5 8 0 4 nös kromatografoitiin silikageelipylväässä (kolonni: 2 x 35 cm) käyttäen eluenttina metanolin ja kloroformin seosta (1:100-3:100). Lopputuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin kumi-5 mainen aine (1,16 g). Aine todettiin identtiseksi otsikko-yhdisteen kanssa NMR-analyysillä ja ohutkerroskromatogra-fiällä. NMR (CDC13,£): 1,21 (3H, leveä, d, CH3), 1,35-2,5 (14H; m, CH2), 2,6-3,3 (4H, m, CH & CH2), 3,4-1,9 (2H, m, CH2), 4,0-477 (3H, m, CH & CH2), 6,35-7,1 (1H, m, NH), 9,01 10 (1H, s, C02H). Rf: (1) 0,60; 72) 0,68.

Esimerkki 7 N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-N-metyyliglysyyli-tio)-2-D-metyylipropanoyyll7-L-proliini Esimerkin 6 menettely toistettiin paitsi että N-syklo-15 heksyylikarbonyyliglysiini korvattiin N-sykloheksyylikarbo-nyyli-N-metyyliglysiinillä (1,09 g), karbonyyli-di-imidatso-lilla (1,09 g) ja N-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliinilla (1,09 g). Muodostui kumimainen aine (0,76 g) ja se todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen kanssa NMR-ana-20 lyysillä ja ohutkerroskromatografilla.

NMR (CDC13,£): 1,21 (3H, leveä d, CH3), 1,3-2,4 (14H, m, CH2), 2,4-3,3 (4H, m, CH & CH2), 3,22~(3H, s, CH3), 3,3-3,8 (2H, m, CH2), 4,0-4,7 (3H, m,~CH & CH2), 9,75 (1H, s, C02H). Rf: (1) 0,?6; (2) 0,62.

25 Esimerkki 8 N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyylialanyylitio)- 2-D-metyylipropanoyylj7-L-proliini

Esimerkin 6 menettely toistettiin paitsi että N-syklo-heksyylikarbonyyliglysiinin sijasta käytettiin N-syklohek-30 syylikarbonyyli-D-fenyylialaniinia (1,54 g), karbonyyli-di-imidatsolia (1,09 g) ja N-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyy- li)-L-proliinia (1,09 g). Muodostui kumimainen aine (0,97 g) ja sen todettiin olevan identtinen otsikkoyhdisteen kanssa NMR-analyysillä ja ohutkerroskromatografisesti. NMR (CDCI3, 35 S): 1,20 (3H, leveä, d, CH3), 1,2-2,5 (14H, m, CH2, 2,5-3,3 (6H, m, CH & CH2), 3,3-3,8~(2H, m, OH2), 4,0-5,3 T2H, m, CH), 3i 75804 5,7-6,4 (1H, m, NH) , 7,29 (5H, s, aromaattinen) , 7,5-7,9 (1H, leveä s, C02H). Rf: (1) 0,64; (2) 0,82.

Esimerkki 9 Ν-ΖΓ3- (N-sykloheksyylikarbonyyli-D-leusyylitio) -2-D-5 metyylitiopropanoyyljJ-L-proliini

Esimerkin 6 menettely toistettiin paitsi että N-syklo-heksyylikarbonyyliglysiinin sijasta käytettiin N-syklohek-syylikarbonyyli-D-leusiinia (1,20 g), karbonyyli-di-imidat-solia (0,97 g) ja N-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-10 proliinia (0,98 g). Muodostui kumimainen aine (1,17 g) ja se todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen kanssa NMR-ana-lyysillä ja ohutkerroskromatografisesti.

NMR (CDÖI3,£ ) : 0,93 (6H, d, CH^) , 1,21 (3H, leveä d, CH3), 1,30-2,5 (17H, m, CH & CH2) , 2,5-3,3 (4H, m, CH & CH2) , 15 3,3-3,9 (2H, m, CH2), 4,0-5,0 (2H, m, CH), 5,95-6,5 (1H, m, NH), 7,30 (1H, s, C02H). Rf: (1) 0,61; (2) 0,73.

Esimerkki 10 N-Z3~(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-tryptofvylitio)-2-D- metyylipropanoyyli7-L-proliini 20 Esimerkin 6 menettely toistettiin paitsi että N-syklo- heksyylikarbonyyliglysiinin sijasta käytettiin N-syklohek-syylikarbonyyli-D-tryptofaania (1,75 g), karbonyyli-di-imidat-solia (1,09 g) ja N-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliinia (1,09 g). Muodostui kumimainen aine (0,8 g) ja se 25 todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen kanssa NMR-analyy-sillä ja ohutkerroskromatografisesti. NMR (CDCI3,& ): 1,15 (3H, leveää, CH3) , 1,3-2,4 (14H, m, CH2),2,5-3,9 (8H, m, CH & CH2), 4,1-477 (1H, m, CH), 4,7-5,2_(1H, M, CH), 6,0- 6,4 (2H, m, NH), 6,95-7,9 (5H, m, aromaattinen), 8,80 (1H, 30 leveä s, C02H). Rf: (1) 0,58; (2) 0,82.

Esimerkki 11 N-Z3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-fenyyliqlysyylitio)- 2-D-metyylipropanoyyli7~L-proliini

Esimerkin 6 menettely toistettiin paitsi että N-syklo-35 heksyylikarbonyyliglysiinin sijasta käytettiin N-syklohek-syylikarbonyyli-D-fenyyliglysiiniä (1,30 g), karbonyyli-di- 32 75804 imidatsolia (0,97 g) ja N-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyy-li)-L-proliinia (0,98 g). Muodostui kumimainen aine (0,35 g) ja se todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen kanssa NMR-analyysillä ja ohutkerroskromatografisesti. NMR (CDCl3,£): 5 1,18 (3H, leveä d, CH3), 1,3-2,5 (14H, m, CH2), 2,5-3,8 (6H, m, CH & CH2), 4,2-4,7 (1H, m, CH), 5,62~(1H, d, CH), 6,53 (1H, d, NH), 7,37 5H, s, aromaattinen), 8,90 (1H), s, C02H). Rf: (1) 0,58, (2) 0,83.

Esimerkki 12 10 N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-metionyylitio)-2-D- metyylipropanoyyli7-L-proliini

Esimerkin 6 menettely toistettiin paitsi että N-syklo-heksyylikarbonyyliglysiinin sijasta käytettiin N-syklohek-syylikarbonyyli-D-metioniinia (1,30 g), karbonyyli-di-imidat-15 solia (1,09 g) ja N-(merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliinia (1,09 g). Muodostui kumimainen aine (0,59 g) ja se todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen kanssa NMR-ana-lyysilla ja ohutkerroskromatografiseti. NMR (CDC13, &): 1,23 (3H, leveä d, CH3), 1,5-2,4 (16H, m, CH2), 2,10 (3H, s, 20 CH3), 2,59 (2H, t, CH2), 2,7-3,3 (4H, m, CH I CH2), 3,3-3,9 (2H, m, CH2), 4,0-5,1_(2H, m, CH), 6,49 (1H, d, NH), 7,81 (1H, s, C02H). Rf: (1) 0,60; (2) 0,77.

Esimerkki 13 N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-glutaminyylitio)-2-25 D-metyylipropanoyyljJ-L-proliini

Esimerkin 6 menettely toistettiin paitsi että N-syklo-heksyylikarbonyyliglysiinin sijasta käytettiin N-sykloheksyy-likarbonyyli-D-glutamiinia (0,5 g), karbonyyli-di-imidatso-lia (0,41 g) ja N-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-pro-30 liinia (0,41 g). Muodostui kumimainen aine (0,3 g) ja se todettiin identtiseksi otsikkoyhdisteen kanssa NMR-analyysil-lä ja ohutkerroskromatografisesti. NMR (CDC13, S): 1#20 (3H, leveä d, CH3), 1,3-2,5 (16H, m, CH2), 2,5-3,2 (6H, m, CH & CH2), 3,3-379 (2H, m, CH2), 4,1-4,9 (2H, m, CH); 5,6-35 7,6 (4h7 m, NH & C02H) . Rf: (I) 0,42; (2) 0,48.

33 75804

Esimerkki 14 N-£3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliinin disykloheksyyliamiini-suola 5 1) 3-(N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio)-2-D- metyylipropaanihappo (241 g) suspendoitiin kuivaan dikloori-metaaniin (1,3 litraa). Suspensioon lisättiin tipoittain trietyyliamiinia (117 ml) -15°C:ssa sekoittaen, sitten lisättiin tipoittain pivaloyylikloridia (104 ml) alle -5°C:n 10 lämpötilassa sekoittaen ja seosta sekoitettiin edelleen 30 minuuttia.

2) L-proliini (101 g) suspendoitiin kuivaan dikloori-metaaniin (1,2 litraa). Suspensioon lisättiin tipoittain trimetyylisilyylikloridia (112 ml) -15°C:ssa sekoittaen, 15 sen jälkeen lisättiin tipoittain trietyyliamiinia (122 ml) alle -5°C:n lämpötilassa sekoittaen ja seosta sekoitettiin vielä -15°C:ssa 30 minuuttia. Muodostuneeseen seokseen lisättiin kohdassa (1) valmistettu liuos ja seosta sekoitettiin jäähdyttäen 15 minuuttia, sitten huoneen lämpötilassa 20 tunnin ajan. Kun reaktio oli mennyt loppuun, lisättiin reak-tioseokseen kylmää tislattua vettä (1 litra) samalla jäähdyttäen ja sen jälkeen lisättiin väkevää suolahappoa (90 ml) tipoittain. Seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja orgaaninen kerros erotettiin, pestiin kyllästetyllä NaCl-liuoksella kah-25 desti ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Suodokseen lisättiin disykloheksyyliamiinia (326 ml) ja asetonitriiliä (800 ml) ja seosta sekoitettiin 30 minuuttia. Sen jälkeen lisättiin neljä 800 ml:n asetonitriilierää 10 minuutin välein ja saatu seos jätettiin yöksi 5°C:een. Sakka suodatettiin imul-30 la ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin otsikkoyhdiste raa-katuotteena. Raakatuote liuotettiin kuumaan dikloorimetaaniin (3 litraa) ja suodatettiin. Suodosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia ja lisättiin vielä neljä 750 ml:n asetonitriilierää 10 minuutin välein ja muodostunut seos 35 jätettiin seisomaan yöksi 5°C:een. Sakka suodatettiin ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin väritön erä otsikkoyhdistet-tä (404 g). Sp. 190-191°C, [cQD = -24,5° (C=1,0, MeOH) .

34 75804

Esimerkki 15 N~Z~3- (N-sykloheksyylikarbonyyli-D-alanyylitio) -2-D-metyylipropanoyyliJ-L-proliinin kalsiumsuola 404 g esimerkissä 14 valmistettua disykloheksyyliamii-5 nisuolaa suspendoitiin etyyliasetaattiin (2 litraa) ja suspensioon lisättiin 0,5N KHS04 (2,5 litraa) ja seosta sekoitettiin 10 minuuttia. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin tislatulla vedellä ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Suo-dos haihdutettiin tyhjössä ja jäännös liuotettiin asetoniin 10 (1,2 litraa). Asetoniliuokseen lisättiin tislattua vettä (1,2 litraa) ja kalsiumkarbonaattia (36,6 g) ja seosta sekoitettiin kiivaasti 40°C:ssa tunnin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen seos suodatettiin ja suodos haihdutettiin tyhjössä. Saatu siirappi suspendoitiin asetoniin (1 litra) ja liuosta 15 sekoitettiin 5 tuntia. Sakka suodatttiin imulla, kuivattiin ilmassa, sen jälkeen tyhjökuivattiin, jolloin saatiin otsik-koyhdiste valkoisena jauheena (212 g). Z^7D = -47,2° (C=1,0, MeOH).

Claims (3)

1. 35 7 5 8 0 4 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen proliinijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava (I) 5 CH-j ,_ I 3 / R-A-S-CH2CHCO-N (I) V“
2. 10 COOH (jossa R on aminohapon ίΧ-aminoryhmään liittynyt syklohek-syylikarbonyyliryhmä; A on glysiini-, sarkosiini-, D-ala-niini-, D-leusiini-, D-metioniini-, D-glutamiini-, D-fenyy-lialaniini-, D-tryptofaani- tai D-fenyyliglysiinitähde ja 15 siinä on oi-karbonyyliryhmä joka muodostaa rikkiatomin kanssa tioliesterisidoksen) tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) saatetaan yhdiste, jolla on kaava (II) 20 ?«3 R-A'-S-CH2CHCOOH (II) (jossa A' on edellä määritelty ryhmä A tai sen suojattu johdannainen; ja R tarkoittaa samaa kuin edellä on määri-25 telty), karbo-di-imidin läsnäollessa tai sen reaktiivinen amidi, happohalogenidi, aktivoitu esteri tai seka-anhydridi reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava (III) HN (IIIv 30 v_ UII) d00R' (jossa R' on vetyatomi tai karboksyylin suojaryhmä) tai sen silyyliryhmän sisältävän johdannaisen kanssa inertissä 35 orgaanisessa liuottimessa lämpötilavälillä -20°C:sta 10°C:seen ja poistetaan reaktiotuotteessa mahdollisesti ole- 36 75804 vat suojaryhmät, tai b) saatetaan yhdiste, jolla on kaava (IV) R-A'-OH (IV) 5 (jossa A' ja R tarkoittavat samaa kuin edellä on määritelty), karbodi-imidin läsnäollessa tai sen reaktiivinen amidi, hap-pohalogenidi, aktivoitu esteri tai seka-anhydridi reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava (V) 10 CHo /- I 3 / HS-CH2CHCO-N (V) 15 &Tr. (jossa R' on edellä määritelty) mukaisen yhdisteen kanssa inertissä orgaanisessa liuottimessa lämpötilavälillä -20°C:sta 10°C:seen, ja poistetaan reaktiotuotteessa mahdollisesti olevat suojaryhmät ja menetelmällä a) tai mene-20 telmällä b) saatu tuote mahdollisesti muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi. 37 75804 Förfarande för framställning av ett terapeutiskt ak-tivt prolinderivat med formeln (I) 5 CH-j ,_ I 3 / R-A-S-CH9CHCO-N (I) y COOH 10 (väri R är en vid aminosyrans ^-aminogrupp bunden cyklo-hexylkarbonylgrupp; A är en glycin-, sarkosin-, D-alanin-, D-leucin-, D-metionin-, D-glutamin-, D-fenylalanin-, D-tryp-tofan- eller D-fenylglycinrest och har en o(-karbonylgrupp, 15 vilken bildar en tiolesterbindning med svaveiatomen eller ett farmaceutiskt godtagbart sait därav, känneteck-n a t därav, att a) man omsätter en förening med formeln (II)
3. 20 CH3 I J R-A'-S-CH2CHCOOH (II) (väri A' är grupp A som ovan definierats eller en skyddad derivat därav och R har ovan angivna betydelse) i närvaro 25 av karbodiimid, eller en reaktiv amid, syrahalogenid, akti-verad ester eller blandad anhydrid därav med en förening med formeln (III) HN (III) 30 \_ CÖOR' (väri R' är en väteatom eller en skyddsgrupp för karboxyl) eller med dess derivat vilket innehäller en silylgrupp, i 35 ett inert organiskt lösningsmedel vid en temperatur mellan -20°C och 10°C och avlägsnar de eventuellt i reaktionspro-