FI69095C

FI69095C - Foerfarande foer framstaellning av jaesta alkoholprodukter

Info

Publication number: FI69095C
Application number: FI821100A
Authority: FI
Inventors: Sven-Erik Godtfredsen; Martin Ottesen; Bent Ahrenst Larsen
Original assignee: Forenede Bryggerier As
Priority date: 1980-08-07
Filing date: 1982-03-30
Publication date: 1985-12-10
Also published as: FI821100L; PL232519A1; DK145502B; HK40387A; IL63431A; BR8108727A; FI69095B; CA1184135A; DE3162805D1; SG1787G; EP0046066B1; JPS57501114A; NZ197930A; ZA815065B; IL63431A0; PL128859B1; EP0046066A1; DK339880A; IE52093B1; PT73469B

Description

1 69095

Menetelmä käyneiden alkoholituotteiden valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää käyneiden, vähän diasetyyliä sisältävien alkoholituotteiden valmistamiseksi käyttämällä hiilihydraattipitoista substraattia mikro-organismilla.

Kun hiilihydraattipitoisia substraatteja, kuten vierrettä tai greippimehua, käytetään hiivalla tai muilla mikro-organismeilla alkoholikäymisen ohella tapahtuu erilaisia pro-10 sesseja, jotka saattavat synnyttää ei-toivottuja sivutuotteita. Esimerkkinä on diasetyylin muodostuminen, joka hyvinkin pieninä konsentraatioina on voimakkaan ja epämiellyttävän hajuinen.

Niinpä alkoholijuomissa, kuten oluessa tai viinissä, 15 voi olla häiritsevä aromi ja flavori, jos diasetyylipitoi-suus ylittää huomattavasti määrätyn rajan, joka oluella on n. 0,1 ppm.

Diasetyylin muodostuminen haittaa myös etanolin teollista valmistusta, koska diasetyylin erottaminen etano-20 lista tislaamalla on hankalaa. Erityisongelmana on absoluuttisen etanolin valmistus, jolloin vesi poistetaan etanolista tislaamalla atseotrooppisesti bentseenin kera. Atseotroop-pisen tislauksen aikana diasetyyli rikastuu bentseenifaa-siin ja tämä saattaa johtaa diasetyylin ja bentseenin seok-25 siin, jolloin atseotrooppisessa tislauksessa käytetyn bentseenin talteenotto vaikeutuu.

Pantaessa olutta tavalliseen tapaan vierre käytetään sopivalla hiivakannalla, kuten Saccharomyces cerevisiae tai Saccharomyces carlsbergensis.

30 Tavallisesti käyminen tapahtuu kahdessa vaiheessa, jotka ovat pääkäyminen, jonka normaalikesto on 7-10 vuorokautta sekä ns. kypsytys, jonka kesto on 3-12 viikkoa. Pää-käymisen aikana vierteen hiilihydraatit muuttuvat suurimmaksi osaksi etanoliksi ja hiilidioksidiksi. Kypsyminen 35 tapahtuu matalassa lämpötilassa hiivan pienen jäännösmää-rän läsnäollessa. Kypsymisen aikana mm. ei-toivotut, suu-rimolekyyliset yhdisteet saostuvat ja diasetyyli, 2,3-pen- 2 69095 taanidioni, Ot-asetolaktaatti ja OG-aseto-Cfc-hydroksibutyraat-ti muuttuvat yhdisteiksi, kuten dioleiksi, jotka eivät vaikuta flavoriin ja aromiin. Esim. butaanidioli, joka oluessa on Of-asetolaktaatin ja diasetyylin muuttumisen lopputuote, 5 ei vaikuta flavoriin ja aromiin konsentraation ollessa alle 500 mg/1.

Seuraava kaavio valaisee oluen diasetyylipitoisuuden kannalta tärkeitä entsymaattisia ja kemiallisia reaktioita.

10 H,C-C=0 ^

3 I

H-C-C-OH -> H-C-C=0 3 l \ 3 | COOK H^C-C^ (diasetyyli) (Ä-asetolaktaatti) (4) ^ (2) 15 (6>\?H3 ? H,C-C-OH HjC-C-OH (asetoiini) / C-0 HC-C=0 <5> / * I (3) (7j/ COOH i / («-keto-/3-hydroksi- ? (2,3-butaanidioU)

/ isovaleraatti) H-C-C-OH

20 / 3 I

V\L H,C-C-OH

3 I

CH- CH0 H

l 3 | 3

H-C-C-OH H-C-C-H

3 · (8) . 3 , H-C-OH---H-C-NH- I * I 2

COOH COOH

25 (0C,/3-dihydroksi- (väliini) isovaleraatti)

Diasetyylin prekursori Ä-asetolaktaatti syntyy käy-mishiivassa pyruvaatin ja asetaldehydin tiamiinipyrofosfaa-30 tin entsyymin katalysoiman kondensaation kautta ja se on välituote aminohapon valiinin biosynteesissä. Mutta 0£-ase-tolaktaatti voi myös hajota spontaanisti hapettavan dekar-boksylaation avulla diasetyyliksi /reaktio (DJ, jonka hiivasolujen reduktaasit, joita on läsnä oluen kypsymisproses-35 sin aikana, sitten pelkistävät. OG-asetolaktaatin dekarbok-sylaatio on lämpötilasta riippuva reaktio, joka tapahtuu suhteellisen hitaasti matalissa lämpötiloissa, mutta

II

3 69095 diasetyylin tämän jälkeinen muuttuminen asetoiiniksi ja 2,3-butaanidioliksi tapahtuu suhteellisen nopeasti. Siten tekijä, joka määrää ^asetolaktaatin ja diasetyylin poistono-peuden oluesta, on diasetyyliprekursorin dekarboksylaatio.

5 Aivan samalla tavoin 2,3-pentaanidioniprekursorin spontaani dekarboksylaatio määrää 2,3-pentaanidionin ja OG-aseto-OC-hydroksibutyraatin poistonopeuden.

Suurimolekyylisten aineiden maksimisaostumisen ja hyväksyttävälaatuisen oluen saavuttamiseksi kypsytys on 10 suoritettava mahdollisimman matalassa lämpötilassa, esim. n. 0°C:ssa. Tässä lämpötilassa saattaa kestää useita kuukausia, ennen kuin asetolaktaatti on poistunut täysin ja hiiva on pelkistänyt muodostuneen diasetyylin. Mutta kypsy-misaikaa voidaan lyhentää antamalla prosessin tapahtua kor-15 keammassa lämpötilassa, esim. yksi tai kaksi viikkoa 10°C:ssa, yksi tai kaksi viikkoa 5°C:ssa ja yksi tai kaksi viikkoa -l°C:ssa. Tällainen menettely nopeuttaa asetolak-taatin muuttumista diasetyyliksi.

Oluen nopeutettujen panoprosessien yhteydessä on eh-20 dotettu asetolaktaatin ja OC-aseto-Ofc-hydroksibutyraatin hajoamisen nopeuttamista kuumentamalla olutta lyhyesti 60°C:seen tai 80°C:seen, ks. J. Inst. Brew., Voi. 79, 1973, s. 43-44. Näissä lämpötiloissa reaktio (1) saadaan päättymään lähes täysin 4-15 minuutissa. Mutta tällainen kova kä-25 sittely pilaa jossain määrin flavorin ja aromin. Lämpökäsittely ei myöskään ole sovelias tavanomaisissa oluenpano-prosesseissa ja lisäksi on hankalaa ja epätaloudellista kuumentaa ja jälleen jäähdyttää suuria olutmääriä ja tämä siitäkin syystä, että hiiva on täysin poistettava ennen 30 lämpökäsittelyä ja uutta hiivaa on lisättävä lämpökäsittelyn ja jäähdyttämisen jälkeen diasetyylin muuttamiseksi bu-taanidioliksi.

Käsiteltävänä oleva keksintö perustuu siihen havaintoon, että asetolaktaatin hidas hajoaminen diasetyyliksi 35 eli kaaviossa reaktio (1) voidaan välttää käyttämällä entsyymejä asetolaktaatin hajottamiseksi. Periaatteessa tähän tarkoitukseen voidaan käyttää jokaista entsyymiä, joka 4 69095 aiheuttaa asetolaktaatin muuttumisen. Huomionarvoinen on asetolaktaatin dekarboksylaatio asetoiiniksi, ks. reaktio (4) yllä mainitussa kaaviossa.

Muita esimerkkejä ovat asetolaktaatin muuttuminen 5 oC-keto-fi-hydroksi-isovaleraatiksi isomeraasireaktion (6) avulla ja asetolaktaatin muuttuminen .X,-dihydroksi-iso-valeraatiksi reduktoisomeraasireaktion (5) avulla. Kummankin reaktion reaktiotuotteet ovat aminohapon valiinin pre-kursoreita.

10 Keksinnön menetelmälle on tunnusomaista, että käsi tellään käyvää tai käynyttä substraattia asetolaktaattia muuttavalla entsyymillä käymisen aikana tai sen jälkeen. Esimerkki tässä menetelmässä sopivasta entsyymistä on asetolak-taattidekarboksylaasi, joka voidaan eristää mikro-organismis-15 ta Aerobacter aerogenes. Tätä entsyymiä on kuvannut E. Juni, J. Biol. Chem., Voi. 195 (1952), s. 715-734. Ei kuitenkaan voitu päätellä, että entsyymiä voitaisiin menestyksellisesti käyttää käymisprosesseissa, kuten vierteen käyttämisessä vähän diasetyyliä sisältävän oluen panemiseksi.

20 Keksinnön menetelmän eräässä toteuttamismuodossa asetolaktaatti dekarboksyloidaan entsymaattisesti asetoiiniksi, jolloin voimakkaasti haisevan ja ei-toivotun diase-tyylin muodostuminen asetolaktaatista estyy. Samalla tavoin estetään muissa toteuttamismuodoissa ιχ,-asetolaktaatin ha-25 joaminen diasetyyliksi muuttamalla diasetyyliprekursori asetolaktaattireduktoisomeraasien tai -isomeraasien avulla (reaktio 5 ja 6).

Menetelmä voidaan toteuttaa tavanomaisen oluenpane-misen yhteydessä. Asetolaktaattidekarboksylaasi voidaan 30 esim. lisätä pääkäymisen tai kypsytyksen aikana. Tämän entsyymin käyttö mahdollistaa kypsytyksen merkittävän lyhentämisen, koska asetolaktaatti dekarboksyloituu nopeasti käymiskelpoiseksi asetoiiniksi ilman diasetyylin muodostumista. Keksinnön erityistoteuttamismuodon mukaan entsyymi 35 lisätään kypsytyksen aikana, jolloin asetolaktaatin muodostuminen on lähes täysin päättynyt pääkäymisen jälkeen. Mutta haluttaessa entsyymi voidaan lisätä ennen pääkäymistä

II

5 69095 tai sen aikana pääkäymisen pH:n ollessa suurempi kuin kyp-sytysvaiheessa.

Vapaassa tilassa olevan entsyymin käytön asemasta sitä voidaan käyttää immobilisoidussa tilassa, jolloin im-5 mobilisoitu entsyymi lisätään vierteeseen käymisen aikana tai sen jälkeen. Immobilisoitu entsyymi voi myös olla kolonnissa, jonka läpi käymisvierre tai olut valuu. Entsyymi voidaan immobilisoida erikseen tai voidaan käyttää kera-immobilisoituja hiivasoluja ja asetolaktaattidekarboksylaa-10 siä.

Immobilisoidun entsyymin käyttö mahdollistaa nopeutetun, jatkuvatoimisen oluenpanemisen, koska olut voidaan käyttää valuttamalla vierre immobilisoitua hiivaa ja immo-bilisoituja entsyymejä sisältävien kolonnien läpi, jolloin 15 immobilisointi tapahtuu valinnaisesti samanaikaisesti. Tällaisessa tapauksessa pääkäyminen ja kypsytys yhdistetään vierteen jatkuvatoimiseksi muuttumiseksi valmiiksi olueksi kapasiteetin riippuessa kolonnien tilavuudesta ja läpimitoista. Tällainen prosessi säästää työtä ja vähentää tuo-20 tantolaitoksen investointeja.

Keksinnön menetelmä ei ole käyttökelpoinen vain oluenpanon yhteydessä, vaan se sopii myös viinin valmistukseen, jossa saavutetaan samanlaisia etuja erityisesti kypsytys-ajan lyhenemisen ja prosessin yksinkertaistumisen muodossa.

25 Tässä yhteydessä erityisen mielenkiintoinen on asetolaktaat-tia muuttavien entsyymien käyttö ns. malonihappo-maitohappo-käymisessä. Tämä prosessi, joka tapahtuu mikro-organismien, kuten Leuconostoc-, Lactobacillus- tai Pediococcus-lajien vaikutuksesta, suoritetaan viinin pääkäymisen jälkeen tuot-30 teen pH-arvon nostamiseksi ja myös biologisen pysyvyyden parantamiseksi sekä viinin flavorin kehittämiseksi. Lisäksi on erittäin toivottavaa suorittaa mainittu käyminen, koska se mahdollistaa nopean punotuksen ja parantaa siten tuntuvasti viininvalmistamojen rahavirtaa. Mutta prosessissa 35 saattaa kuitenkin syntyä diasetyylistä johtuvia makuvirhei-tä, jota diasetyylin muodostumista voidaan vähentää aseto-laktaattia muuttavien entsyymien avulla. Lisäksi menetelmää 6 69095 voidaan edullisella tavalla käyttää etanolin teollisessa valmistuksessa, koska saadaan käymistuotteita, joissa ei ole lainkaan tai on hyvin vähän diasetyyliä. Tämä yksinkertaistaa tislausprosessia ja erityisesti atseotrooppista 5 tislausta absoluuttisen etanolin, so. puhtaan, vedettömän etanolin valmistamiseksi.

Kuten mainittiin, voidaan keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttää asetolaktaattidekarboksylaattia, joka esim. on eristetty Aerobacter aerogeneseksesta. Mutta voi-10 daan myös käyttää asetolaktaattia muuttavia entsyymejä, jotka ovat peräisin muista lähteistä, kuten Bacillus-, Enterobacter-, Klebsiella-, Leuconostoc-, Serratia- ja Streptococcus-kannoista ja eräistä Actinomycetes- ja sie-nikannoista.

15 Sopivia asetolaktaattireduktoisomeraaseja ja -iso- meraaseja voidaan eristää bakteereistä, kuten kannoista E. coli tai Aerobacter aerogenes tai Neurospora crassasta, hiivoista, Salmonellasta tai kasveista.

Koska ko. entsyymit ovat aminohappometaboliaan 20 liittyviä entsyymejä, voidaan olettaa niiden esiintyvän lähes kaikissa elävissä soluissa.

Koska monet alkoholikäymisprosessit tapahtuvat pH-arvossa 4-5 ja monien helposti saatavissa olevien, mikro-organismeista eristettyjen asetolaktaattidekarboksylaasien 25 optimistabiilisuus ja -aktiivisuus on pH-arvoissa yli 5, on keksinnön mukaisesti tarkoituksenmukaista käyttää aseto-laktaattidekarboksylaasia kemiallisesti muunnetussa muodossa hyvän stabiilisuuden ja/tai optimiaktiivisuuden saavuttamiseksi pH-alueella 4-5. Tällainen muuntaminen voi tapah-30 tua esim. Biochem., Voi. 11, nro 22, 1972 mukaan.

Seuraavassa keksintöä valaistaan muutamalla esimerkillä.

Esimerkki 1

Oluen panoksittain käyttäminen ja nopea kypsytys 35 asetolaktaattidekarboksylaasin avulla

Yhteen litraan steriiliä vierrettä, jonka vierre-pitoisuus oli 10,7°P, siirrostettiin panimohiivaa 7 69095 g (Saccharomyces carlsbergensis) määränä 20 x 10 solua/ml. Kuuden vuorokauden kuluttua 10°C:ssa pääkäyminen päättyi ja oluen laimentuminen (näennäinen ekstrakti) oli 2,0°P. Oluessa olevan vapaan ja sitoutuneen diasetyylin 5 (so. OC-asetolaktaatista johdetun diasetyylin) määräksi mitattiin vastaavasti 0,12 ppm ja 0,71 ppm (vrt. Haukeli A.D. ja Lie S., Journal of the Institute of Brewing 1971, 77, 538) .

Sitten olut erotettiin dekantoimalla saostuneesta 10 hiivasta ja siihen lisättiin 100 ml "Kreuzenia", so. nopeasti käynyttä olutta, joka oli valmistettu 48 tuntia aikaisemmin hiivalla siirrostetusta vierteestä. Tämän lisäksi lisättiin 25 mg asetolaktaattidekarboksylaasia, joka oli eristetty Aerobacter aerogeneseksestä European Journal of 15 Biochemistry'ssä 1970, 14, 133 kuvatulla tavalla. Kun toinen käyminen ja kypsyminen oli tapahtunut 24 tuntia 10°C:ssa oluen vapaan ja sitoutuneen diasetyylin määräksi mitattiin vastaavasti 0,05 ppm ja 0,10 ppm. Sitten olut jäähdytettiin -l°C:seen, seisotettiin vielä kaksi vuorokautta tässä läm-20 pötilassa ja lopuksi valmis olut suodatettiin.

Esimerkki 2

Oluen jatkuvatoiminen käyttäminen ja nopea kypsytys 350 g linkoamalla eristettyä panimohiivaa (Saccharomyces carlsbergensis) suspendoitiin 350 mitään 3-%:ista 25 steriiliä natriumalginaattiliuosta. Seos lisättiin tiputtaen 10 litraan 0,1 M steriiliä CaCl2“liuosta kalsiumalginaatin hyytelöimiseksi pyöreiksi, hiivaa sisältäviksi hiukkasiksi, joiden halkaisija oli n. 3 mm.

Hiukkasia seisotettiin kalsiumkloridiliuoksessa 12 30 tuntia 4°C:ssa ja pakattiin sitten kolonniin, jonka halkaisija oli 19 cm ja pituus 5 cm. Tämän reaktorin läpi pumpattiin 10°C:ssa steriiliä vierrettä nopeudella 0,15 1/h vierteen pitoisuuden ollessa 10,7°P. Reaktorista tulevan eluaa-tin laimentuminen oli 2,1°P ja kaasukromatografian mukaan 35 se sisälsi vapaata ja sitoutunutta diasetyyliä vastaavasti 0,15 ppm ja 2,21 ppm. Yhteen litraan reaktorista tulevaa olutta lisättiin 25 mg esimerkin 1 mukaan valmistettua 8 69095 asetolaktaattidekarboksylaasia. Olutta seisotettiin 24 tuntia 10°C:ssa ja pumpattiin sitten toisen iirunobilisoitua hiivaa sisältävän reaktorin läpi siten, että viipymisaika oli viisi tuntia. Eluaatin vapaan ja sitoutuneen diasetyylin 5 pitoisuudeksi määritettiin vastaavasti 0,05 ppm ja 0,10 ppm. Sitten lämpötila alennettiin -l°C:seen ja kun oli seisotettu kaksi vuorokautta tässä lämpötilassa, valmis olut erotettiin dekantoimalla saostuneesta aineksesta ja suodatettiin lopuksi.

10 Esimerkki 3

Oluen panoksittain käyttäminen ja nopea kypsytys asetolaktaattireduktoisomeraasin avulla

Yksi litra steriiliä vierrettä käytettiin Saccharo-myces carlsbergensiksellä, kuten esimerkissä 1 kuvattiin..

15 Kuuden vuorokauden pääkäymisen jälkeen oluen vapaan ja sitoutuneen diasetyylin pitoisuudeksi määritettiin vastaavasti 0,10 ppm ja 0,61 ppm. Sitten olut erotettiin dekantoimalla saostuneesta hiivasta ja lisättiin 100 ml esimerkissä 1 kuvattua "Kreuzenia" sekä 100 mg QC-asetolaktaatti-20 reduktoisomeraasia, joka saatiin E. colista H.E. Umbarger, B. Brown ja E.J. Eyring, Journal of Biological Chemistry, Voi. 235, s. 1425-1432 kuvaamalla tavalla. Sitten olutta seisotettiin vielä 24 tuntia 10°C:ssa ja tämän jälkeen sen vapaan ja sitoutuneen diasetyylin pitoisuudeksi määritet-25 tiin vastaavasti 0,03 ppm ja 0,09 ppm. Sitten olut jäähdytettiin -l°C:seen, seisotettiin vielä kaksi vuorokautta tässä lämpötilassa ja valmis olut suodatettiin.

Esimerkki 4

Asetolaktaattidekarboksylaasin käyttö viinin maloni-30 happo-maitohappokäymisessä 1 litraan tuotetta käynyttä viiniä lisättiin 10°C:ssa 1000 mg jäädytyskuivattua Leuconostoc citrivoru-viljelmää ja 50 mg jäädytyskuivattua asetolaktaattidekarboksylaasi-valmistetta, joka valmistettiin kuten esimerkissä 1 kuvat-35 tiin Enterobacter aerogenes'in suhteen. Välittömästi lisäyksen jälkeen viinin pH-arvoksi mitattiin 4,3 ja sen vapaan 9 69095 ja sitoutuneen diasetyylin pitoisuudeksi 0,2 ppm ja 2,0 ppm. Viini seisotettiin varovasti sekoittaen 10°C:ssa vielä 48 tuntia ja tämän jälkeen viinin pH-arvoksi määritettiin 4,8, ja sen vapaan ja sitoutuneen diasetyylin pitoisuudeksi vas-5 taavasti 0,05 ppm ja 0,35 ppm. Vastaavalla tavalla käsitellyn viinin, johon asetolaktaattidekarboksylaasia ei lisätty, pH oli 4,8 ja vapaan ja sitoutuneen diasetyylin pitoisuus 0,5 ppm ja 2,2 ppm.

Esimerkki 5 10 Muunnetun asetolaktaattidekarboksylaasin käyttö oluen nopeassa kypsytyksessä 10 g jäädytyskuivattua Enterobacter aerogenes-viljel-mää suspendoitiin seokseen, jossa oli 3 % kalsiumalginaat-tia ja 5 g Dowex-50 anionimuodossa. Suspensio lisättiin 15 tiputtaen 0,1 M CaCl2“liuokseen, jossa modifioitu entsyymi saostui helmenmuotoisina hiukkasina. Saadun entsyymin op-timi-pH oli alueella 4-5. Muunnettua entsyymiä käytettiin tämän jälkeen esimerkissä 1 kuvatulla tavalla oluen kypsy-tykseen.

Claims

69095 10

1. Menetelmä käyneiden, vähän diasetyyliä sisältävien alkoholituotteiden valmistamiseksi käyttämällä hiili- 5 hydraattipitoista substraattia mikro-organismilla, tunnettu siitä, että käsitellään käyvää tai käynyttä substraattia asetolaktaattia muuttavalla entsyymillä käymisen aikana tai sen jälkeen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että asetolaktaattia muuttava entsyymi on asetolaktaattidekarboksylaasi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään asetolaktaattide-karboksylaasia, joka on eristetty mikro-organismista

15 Aerobacter aerogenes.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asetolaktaattia muuttava entsyymi on isomeraasi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että asetolaktaattia muuttava entsyymi on reduktoisomeraasi.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, jossa käyminen jakaantuu pääkäymiseen ja kypsytysvai-heeseen, tunnettu siitä, että käsittely asetolak- 25 taattia muuttavalla entsyymillä suoritetaan kypsytysvai-heessa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatti on vierre.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä viinin 30 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kypsytysvai- he muodostuu malonihappo-maitohappokäymisestä, jonka aikana käsittely asetolaktaattia muuttavalla entsyymillä suoritetaan.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asetolaktaattia muuttavaa 35 entsyymiä käytetään immobilisoidussa tilassa. li 11 69095

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymiä käytetään keraimmo-bilisoituna hiivan kanssa.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että asetolaktaattidekarboksylaasia käytetään kemiallisesti muunnetussa muodossa suuremman stabiilisuuden ja/tai optimiaktiivisuuden saavuttamiseksi pH-alueella 4-5.

12 690 9 5 Patentkrav u s u y