SI8111916A8 - Postopek za proizvodnjo fermentiranih alkoholnih proizvodov - Google Patents

Description

Postopek za proizvodnjo fermentiranih alkoholnih proizvodov

Tehnično področje izuma

C 12C 11/00

Predloženi izum se nanaša na področje biotehnologije, specifično na nov postopek za proizvodnjo fermentiranih alkoholnih proizvodov z nizko vsebnostjo diacetila, s fermentacijo substrata, ki vsebuje ogljikov hidrat, z mikroorganizmom.

Tehnični problem

Obstajala je potreba po ugotovitvi novega, tehnološko naprednega postopka za proizvodnjo fermentiranih alkoholnih proizvodov z nizko vsebnostjo diacetila, ki ima močan in nepri jeten vonj celo v zelo nizkih koncentracijah, zaradi česar ima jo dobljeni produkti nesprejemljivo aromo in okus, diacetil pa je težavno ločiti od etanola z destilacijo.

Stanje tehnike

Kadar substrate, ki vsebujejo ogljikov hidrat, kot sladni ali grozdni sok, fermentirajo s kvasom ali drugimi mikroorganizmi, se vršijo razni postopki pleg fermentacije

- 2 alkohola, ki lahko izzovejo nastajanje nezaželnih stranskih proizvodov. Primer je tvorba diacetila, ki ima močan in neprijeten vonj celo v zelo nizkih koncentracijah.

Alokoholne pijače^,\kot pivo ali vino, imajo tako lahko nesprejemljivo aromo in okus, če vsebnost diacetila znatno presega določene meje, ki so-pri pivu okoli 0,1 ppm.

u’

Tvorba diacetila je tudi neprikladna pri industrijski proizvodnji etanola, ker je težavno ločiti diacetil od etanola z destilacijo. Poseben problem se pojavlja pri pripravi absolutnega etanola, kjer etanol dehidrirajo z azeotropno destilacijo z benzenom. Diacetil se bo kopičil v benzenski fazi med azeotropno destilacijo, kar bo lahko izzvalo nastajanje zmesi diacetila in benzena, iz katerih je težavno pridobiti benzen, uporabljen za azeotropno destilacijo.

Običajno varjenje piva obsega fermentiranje sladu s primerno vrsto kvasovke, kot Saccharomyces cerevisiae ali Saccharomyces carlsbergensis.

Fermentacijo vršijo običajno v dveh stopnjah, namreč v glavni fermentaciji, ki traja normalno 7 do 10 dni, ter v sekundarni fermentaciji - tako imenovanem·postopku zorjenja ki lahko traja 3 do 12 tednov. Med glavno fermentacijo se večina ogljikovih hidratov v sladu pretvori v etanol in ogljikov dioksid. Zorjenje dosežejo pri nizki temperaturi v prisotnosti majhne preostale količine kvasa. Nameni zorenja so med drugim: oborjenje nezaželenih spojin z visoko molekulsko maso ter

- 5 pretvorba diacetila, 2,3-pcntandionai _;Ja-acetolaktata in aaceto-a-hidroksibutirata v spojine, kot diole, ki ne prizadenejo okusa in arome. Tako npr. butandiol, ki je končni proizvod pretvorbe α-acetolaktata in diacetila v pivu, ne prizadene okusa in arome v koncentracijah pod 5θ0 rog na liter

Encimatske in kemične reakcije, ki so pomembne za vsebnost diacetila v pivu, so prikazane v naslednji shemi

(diacetil) (acetoin) (2,3-butandi Ol) ’ (ot, β-dihidroksi (val in);

izovalerat)

Predhodnik diacetila, namreč α-acetolaktat, se proizvaja v fermentni kvasovki z encimatsko katalizirano kondenzacijo piruvata in tiamin-pirofosfata acetaldehida ter je intermediat v biosintezi amino kisline valina. a-acetolaktat pa se da tudi spontano razgraditi z oksidativnim de- 4 karboksiliranjem, da dobimo diacetil [reakcija (4)], katerega zatem reduciramo z reduktazami v celicah kvasovk, prisotnih med procesom zorjenja piva. Dekarboksiliranje a-acetolaktata je temperaturno odvisna reakcija, ki poteka sorazmerno počasi pri nizkih temperaturah, medtem ko poteka sledeča pretvorba diacetila do acetoina in 2,3-butandiola sorazmerno hitro., zaradi česar je dekarboksiliranje diacetilnega predhodnika tista stopnja pri odstranjevanju α-acetolaktata in diacetila iz piva, ki določa hitrost reakcije. Popolnoma podobno je stopnja, ki določa hitrost pri odstranjevanju 2,3-pentandiona in α-aceto-a-hidroksi-butirata spontano dekarboksiliranje predhodnika 2,3-pentandiona.

Da dosežejo maksimalno obarjanje snovi z visoko molekulsko maso ter pivo z zadovoljivo kakovostjo, mora potekati zorjenje pri temperaturi, ki naj bo kolikor mogoče nizka, kot okoli 0°C. Pri tej temperaturi pa lahko traja nekaj mesecevjpreden se acetolaktat popolnoma odstrani in nastali diacetil reducira s kvasom. Čas zorjenja pa se da zmanjšati, če pustijo potekati postopek pri višjih temperaturah, npr. 4 ali 2 tedna pri 40°C, 4 ali 2 tedna pri 5°C in 4 ali 2 tedna pri -4°G. Tak postopek bo pospešil pretvorbo acetolaktata do diacetila.

V zvezi s pospešenimi postopki varjenja piva pa so predlagali, da bi pospešili razgradnjo acetolaktata in α-aceto-a-hidroksi-butirata s kratkotrajnim segrevanjem piva na 60 ali 80°C, pri J. Inst. Brew., zvez. 79, 4973? str. 43-44.

- 5 Reakcija (1) je lahko v bistvu dokončana v teku 4 do 15 minut pri teh temperaturah. Vendar pa bosta okus in aroma v določeni meri prizadeta zaradi take grobe obdelave. Toplotna obdelava tudi ni primerna za običajne postopke varjenja piva, poleg tega pa je neprikladno in ekonomsko pomanjkljivo ogrevati in ponovno hladiti velike količine piva med glavno fermentacijo in zorenjem, saj je treba ves kvas odstraniti pred toplotno obdelavo in dodajati svež kvas po toplotni obdelavi in hlajenju, da pretvorijo diacetil v butandiol.

Predloženi izum sloni na spoznanju, da se da* počasni razgradnji acetolaktata do diacetila, prikazani v reakciji (1) sheme, izogniti z uporabo encimov-ζθ razgradnjo acetoi laktata. Načelno se da uporabiti v ta namen vsak encim, ki izzove pretvorbo acetolaktata. Tak primer je dekarboksiliranje acetolaktata do acetoina; glej reakcijo (4) v zgoraj omenjeni shemi.

Drugi primeri so pretvorba acetolaktata do a-ketoβ-hidroksi izovalerata z reakcijo izomeraze (6) ali pretvorba acetolaktata do α,β-dihidroksi izoValerata z redukto-izomeraznc reakcijo (5). Reakcijski proizvodi v obeh reakcijah so predhodniki za amino kislino valin.

Opis rešitve tehničnega problema z izvedbenimi primeri

Postopek v smislu izuma torej poteka tako, da obdelamo substrat z encimom, ki pretvori acetolaktat, med ali v nadaljevanju fermentacije. Primer za prikladen encim za namene predloženega postopka je acetolaktat dekarboksilaza, katero lahko pridobimo iz mikroorganizma Aerobacter aerogenes.

- 6 Ta encim je opisal E. Juni v J. Biol. Chem., zv. 195 (1952), str. 715-734. Vendar pa se ni dalo predvideti, da je možno encim prikladno uporabiti pri postopkih fermentacije, kot fermentaciji sladu, za varjenje piva z nizko vsebnostjo diacetila.

Pri izvedbi postopka v smislu,.izuma acetolaktat encimatsko dekarboksiliramo do acetoina,, s čimer se izognemo tvorbi nezaželenega diacetila z močnim vonjem iz acetolaktata. Podobno se pri drugih izvedbah izognemo razgradnji a-acetolaktata do diacetila s pretvorbo diacetilnega predhodnika s pomočjo acetolaktat redukto-izomeraz ali izomeraz (reakciji 5 in 6).

Postopek lahko izvedemo v zvezi z običajnim varjenjem piva. Tako npr. se da acetolaktat dekarboksilazo dodajati med glavno fermentacijo ali med postopkom zorjenja.

Uporaba tega encima omogoči znatno skrajšanje postopka zorjenja, saj se acetolaktat hitro dekarboksilira do acetoina, ki se da fermentirati, brez tvorbe diacetila. V skladu s specifično izvedbo izuma dodajamo encim med postopkom zorjenja, pri čemer je tvorba acetolaktata v bistvu zaključena po glavni fermentaciji. Vendar po želji lahko dodamo encim pred ali med glavno fermentacijo, kadar je pH višji kot med postopkom zorjenja.

Namesto uporabe encima v prostem stanju ga lahko uporabimo v imobiliziranem stanju, pri čemer dodajamo imobili- 7 zirani encim k sladu med ali v nadaljevanju fermentacije. Itnobilizirani encim pa lahko tudi vzdržujemo v koloni, skozi katero prehaja fermentirani slad ali pivo. Encim lahko ločeno imobiliziramo ali pa lahko uporabimo ko-imobilizirane kvasne celice in acetolaktat dekarboksilazo.

Uporaba imobiliziranega encima omogoči pospešeno kontinuirno varjenje pivaj ker se da fermentacijo piva doseči s prehajanjem sladu dcozi kolone, ki vsebujejo imobiliziran kvas in imobilizirane encime, v danem primeru v ko-imobiliziranem stanju. V takem primeru sta glavna fermentacija in postopek zorjenja kombinirana v kontinuirno pretvorbo sladu do gotovega piva, pri čemer je kapaciteta odvisna od volumna in premerov kolon. Tak postopek prihrani trud in zmanjša invensticije v proizvodno napravo.

, Postopka v smislu izuma se ne da^uporabljati- le v zvezi z varjenjem piva, ampak je prikladen tudi'za proizvodnjo vina, kjer dosežemo podobne prednosti, zlasti zmanjšanje obdobja zorjenja in poenostavitev postopka. V tej zvezi je posebno zanimiva uporaba encimov za pretvorbo acetolaktata v kombinaciji s tako imenovano malo-laktično fermentacijo.

Ta postopek, ki ga dosežemo z mikroorganizmi vrste Leuconostoc Lactobacillus ali Pediococcus,izvedemo po glavni fermentaciji vina, da povečamo pH proizvoda kot tudi njegovo biološko stabilnost in razvijemo okus vina. Vendar pa je močno zaželeno da izvedemo fermentacijo, ker omogoči hitro stekleničenje in

-δε. tem v znatni meri izboljša prihodke vinarjev. Na žalost pa postopek lahko izzove priokuse zaradi diacetila, katerega tvorbo pa se da zmanjšati s pomočjo encimov za pretvorbo aceto laktata. Nadalje se da postopek uporabljati prikladno za industrijsko proizvodnjo etanola, saj dobimo fermentacijske proizvode z, brez ali praktično brez vsebnosti diacetila, kar poenostavi destilacijski postopek, zlasti pri azeotropni destilaciji pri pripravi absolutnega etanola, t.j. čistega brezvodnega etanola.

Kot smo omenili) se da pri predloženem postopku uporabiti acetolaktat dekarboksilazo, katero smo npr. izolirali iz Aerobacter aerogenes. Vendar pa se da uporabiti tudi encime, ki pretvarjajo acetolaktat, iz drugih virov, npr. vrst Bacillus, Enterobacter, Klebsiella, Leuconostoc, Serratia in Streptococcus, in nekatere vrste Actinomycetes in glivic.

Primerne acetolaktat redukto-izomeraze in izomeraze se da izolirati iz bakterij, kot vrst E. coli ali Aerobacter aerogenes, ali iz Neurospora Crassa, kvasovk, Salmonella ali rastlin. Ker so obravnavani encimi taki, da učinkujejo pri metabolizmu amino kislin, lahko pričakujemo, da se pojavljajo v skoraj vseh živih celicah.

Ker postopki fermentacije alkohola pogosto potekajo pri vrednosti pH od 4 do 5 in ima mnogo zlahka dostopnih acetolaktat dekarboksilaz, pridobljenih iz mikroorganizmov, optimalno stabilnost in aktivnosti pri vrednosti pH nad 5,

- 9 je priporočijivo;da v smislu izuma uporabimo &cetoXaktat dekarboksilazo v kemično modificiranem stanju, aa dosežemo veliko stabilnost in/ali optimalno aktivnost v območju pH med 4 in 5· Take modifikacije se da dobiti npj?. kdt je označeno v Biochem., zv. 11, št. 22, 1972.

Postopek v smislu izuma ponazarjamo v hfldaljevanju s pomočjo nekaterih primerov.

PRIMER 1 ?

Saržna fermentacija in hitro zorjenje piva ob uporabi acetolaktat dekarboksilaze liter stenilbego Pladu Iz jakostjo sladu 10.7 P inokuliramo s pivovarniškim kvasom (Saccharomyces carlsbergensis) v količini 20 χ 10θ celic na ml. Po 6 dneh pri 10°C je glavna fermentacija končana, jakost (navidezni ekstrakt piva pa znaša 2.0°P. Izmerjena vsebnost prostega in vezanega diacetila (t.j.diacetila, izvedenega iz α-acetolaktata) v pivu znaša 0,12 ppm oz. 0,71 ppm (prim. Haukeli, A.D. in Lie

S.: Journal of the Institute of Brewing 1971, 22» 558).

Pivo nato dekantiramo od oborjenega kvasa in mu primešamo 100 ml Kreuzen, t.j. močno fermentiranega piva, proizvedenega iz sladu, inokuliranega s kvasom pred 48 urami. Vrhu tega dodamo 25 mg acetolaktat dekarboksilaze, izolirane iz Aerobacter aerogenes, kot je opisano v European Journal of Biochemistry 1970, 14, 133- Po 24 urnem stanju pri 10°C za sekundarno fermentacijo in zorjenje piva določimo vsebnost prostega in vezanega diacetila kot 0,05 ppm oz. 0,10 ppm.

Fivo nato ohladimo na -1°C in pustimo stati nadaljnja 2 dni pri tej temperaturi, nakar gotovo pivo filtriramo.'

PRIMER 2

Kontinuirna fermentacija in hitro zorjenje piva

350 g pivovarniškega kvasa (Saccharomyces carlsbergensis))izoliranega s centrifugiranjem, suspendiramo v 350 ml 3 %-ne sterilne raztopine natrijevega alginata. Zmes

- 11 • i) dokapavamo k 10 litrom sterilnega CO^ljmCaC^, da želatiniziram< kalcijev;' alginat in tvorimo kroglaste delce s premerom okoli 3 mm, ki vsebujejo kvas.

Te pustimo stati v raztopini kalcijevega klorida ur pri 4°C in jih nato polnimo v kolono s premerom 19 cm

_.........................j -.......

in višino 5 ^cm· Sterilni slad črpamo skozi ta reaktor pri 10°C s hitrostjo 0,15 litrov na uro, pri čemer je jakost sladu 10.7°P. Razredčenje v eluatu iz reaktorja znaša 2.1°P, plinska kromatografija pa pokaže vsebnost prostega in vezanega diacetila 0,15 ppm. oz. 2,21 ppm.K enemu litru piva iz reaktorja dodamo 25 mg acetolaktat dekarboksilaze, proizvedene tako, kot je opisano v primeru 1. Pivo pustimo stati 24 ur pri 10°C in ga nato črpamo skozi drugi reaktor z imobilizira'I . ‘ nim kvasom, tako da je zadrževalni čas 5 ur. Ugotovimo, da je vsebnost prostega in vezanega diacetila v eluatu 0,05 ppm oz. 0,10 ppm. Temperaturo nato žnižago na -1°C in po dvodnevnem stanju pri tej temperaturi gotovo pivo dekantiramo od oborjenega materiala in končno filtriramo.

PRIMER 3

Šaržna fermentacija in hitro zorjenje piva ob uporabi acetolaktat redukto-izomeraze liter sterilnega sladu fermentiramo s Saccharomyces carlsbergensis, kot je opisano v primeru 1. Po 6 dnevni glavni fermentaciji izmerimo vsebnost prostega in vezanega diacetila v pivu kot 0,10 ppm oz. 0,61 ppm. Pivo nato dekantiramo od oborjenega kvasa ter dodamo 100 ml Kreuzen, kot je opisano v primeru 1, skupaj s 100 mg α-acetolaktat redukto izomeraze, ki jo proizvaja E. coli, kot so opisali H.E. Umbarger, B. Brown in E.J. Eyring v Journal of Biological Chemistry, zv. 235, str. 1425-1432. Nato pivo pustimo stati nadaljnjih 24 ur pri 10°C, nakar določimo vsebnost prostega in vezanega diacetila kot 0,03 ppm. oz. 0,09 ppm. Pivo nato ohladimo na-1 C in stoji nadaljnja 2 dni pri Jtej temperaturi, nakar gotovo pivo filtriramo.

-K

Navedba o najboljši, prijaviteljici znani izvedbi za gospodarsko'izkoriščanje izuma

Saržna fermentacija in hitro zorjenje piva ob uporabi acetolaktat dekarboksilaze liter sterilnega sladu z jakostjo sladu 10.7°P inokuliramo s pivovarniškim kvasom (Saccharomyces carlsbergensis) v količini 20 χ 10θ celic na ml. Po 6 dneh pri 10°C je glavna fermentacija končana, jakost (navidezni ekstrakt piva pa znaša 2.0°P. Izmerjena vsebnost prostega in vezanega diacetila (t.j.diacetila, izvedenega iz α-acetolaktata) v pivu znaša 0,12 ppm oz. 0,71 ppm (prim. Haukeli, A.L. in Lie

S.: Journal of the Institute of Brewing 1971, 77¾ 53θ)·

Pivo nato dekantiramo od oborjenega kvasa in mu primešamo 100 ml Kreuzen, t.j. močno fermentiranega piva, proizvedenega iz sladu, inokuliranega s kvasom pred 48 urami. Vrhu tega dodamo 25 mg acetolaktat dekarboksilaze, izolirane iz Aerobacter aerogenes, kot je opisano v European Journal of Biochemistry 1970, 14; 133. Po '24 urnem stanju pri 10°C za sekundarno fermentacijo in zorjenje piva določimo vsebnost prostega in vezanega diacetila kot 0,05 ppm oz. 0,10 ppm.

Pivo nato ohladimo na -1°C in pustimo stati nadaljnja 2 dni pri tej temperaturi, nakar gotovo pivo filtriramo. ·

Claims (5)

1. Postopek za proizvodnjo fermentiranih alkoholnih proizvodov z nizko vsebnostjo diacetila s fermentacijo ogljikov hidrat vsebujočega substrata z mikroorganizmom, označen s tem, da obdelamo substrat kot slad, med ali po fermentaciji z encimom, ki pretvarja acetolaktat, kot acetolaktd; dekarboksilazo ali'redukto-izomerazo, pri čemer lahko podvržemo substrat glavni fermentaciji in zorjenju.

2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da encim acetolaktat dekarboksilazo, ki pretvarja acetolaktat, pridobimo iz mikroorganizma Aerobacter aerogenes.

3. Postopek po zahtevku 1·, označen s tem, da postopek zorjenja obsega malo'- laktično fermentacijo, med katero izvedemo obdelavo z encimom, ki pretvarja acetolaktat.

4. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3,označen s tem, da encim, ki pretvarja acetolaktat, uporabimo v imobiliziranem stanju.

5. Postopek po zahtevku 4, označen s tem, da uporabimo encim v obliki ko-imobilizata s kvasom.