FI120686B - Bentsopyraanit ja niiden käyttö terapeuttisina aineina - Google Patents

Description

Bentsopyraanit ja niiden käyttö terapeuttisina aineina Käsillä oleva keksintö kohdistuu uusiin yhdisteisiin, menetelmiin niiden valmistamiseksi ja niiden käyttöön 5 terapeuttisina aineina.

EP-patenttijulkaisussa 126 311 kuvataan substituoi-tuja bentsopyraaniyhdisteitä, kuten 6-asetyyli-trans-4-(4-fluoribentsoyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-olia, joilla on verenpainetta alentavaa ak~ 10 tiivisuutta.

Myös EP-patenttijulkaisuissa 376 524, 205 292, 250 077, 093 535, 150 202, 76 075 ja WO/89/05 808 (Beecham Group plc) kuvataan tiettyjä bentsopyraanijohdannaisia, joilla on verenpainetta alentavaa aktiivisuutta.

15 EP-patenttijulkaisuissa 350 805 (Biersdorf), 277 611, 277 612, 337 179 ja 355 565 (Hoechst Aktien- gesellschaft}, 466 131 (Nissan Chemical Industries Ltd) , 339 562 (Yoshitomi Pharmaceuticals), 415 065 (E. Merck), 450 415 (Squibb), 482 934, 296 975, JO-patenttijulkaisussa 20 2 004 791 ja WO/89/07 103 kuvataan myös tiettyjä bentsopy raanijohdannaisia, joilla uskotaan olevan verenpainetta alentavaa aktiivisuutta.

EP-patenttijulkaisuissa 430 621 ja 385 584 (Beecham Group plc) kuvataan tiettyjen, edellä mainituissa patentti-25 hakemuksissa kuvattujen yhdisteiden valmistuksessa hyödyl listen välituotteiden liukenemista.

EP-patenttijulkaisussa 139 992 (Beecham Group plc) kuvataan tiettyjä bentsopyraanijohdannaisia, joilla on cis-isomeriaa 3- ja 4-asemissa ja joiden kuvataan omaavan ve-30 renpainetta alentavaa aktiivisuutta.

Patenttijulkaisussa PCT/GB92/01 045 (SmithKline Beecham plc) kuvataan tiettyjä fluoribentsoyyliaminobentso-pyraaneja, pyranopyridiinejä ja tetrahydronaftaleenejä, joissa 3- ja 4-aseman substituentit ovat trans-muodossa 2 toisiinsa. Näiden yhdisteiden kuvataan omaavan muun muassa rauhoittavaa ja kouristuksia estävää aktiivisuutta.

Patenttijulkaisuissa PCT/GB93/02 512 ja PCT/GB93/ 02 513 kuvataan muita yhdisteryhmiä, joilla on muun muassa 5 kouristuksia estävää aktiivisuutta. Nämä patenttihakemukset eivät olleet julkisia käsillä olevan hakemuksen prio-riteettipäivänä.

Nyt on yllättäen havaittu, että tietyillä jäljempänä kuvatuilla yhdisteillä on kouristuksia estävää aktiivi-10 suutta ja tästä syystä johtuen ne ovat hyödyllisiä hoidettaessa epilepsiaa ja niillä uskotaan olevan käyttöä hoidettaessa tai ehkäistäessä tuskaisuutta, kiihkomielisyyttä, masentuneisuutta, lukinkalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, 15 Parkinsonin tautia, psykoosia, ennakko-oireista tai ennakko-oireetonta migreeniä, paikallista verettömyyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa, OCD:a eli pakonomaisten mielijohteiden noudattamishäiriöitä ja/tai paniikkihäiriötä ja/tai aggressiota.

20 Niinpä käsillä oleva keksintö antaa käyttöön seu- raavat yhdisteet: ci s-6-asetyyli-4S-(2,3-diklooribentsoyyliamino)- 3.4- dihydro-2H-l-bentsopyran-3S-oli , trans-6-asetyyli-4S- (2,3-dikloori-4-fluoribentsoyy-25 liamino}-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R- oli, trans-6-asetyyli-4S-(3,5-diklooribentsoyyliamino)- 3.4- dihydro-2,2-dimetyyli-2H-bentsopyran-3R-oli, trans~6-asetyyli-4S-(3,5-difluoribentsoyyliamino)-30 3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3R~Oli, trans-6-asetyyli-4- (2-tiofeenikarbonyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3-oli, trans-6-asetyyli-4S- (3-tiofeenikarbonyyliamino)- 3.4- dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, 3 trans-6-asetyyli-4S-(2,5-dikloori-3- tiofeenikarbo-nyyliamino) -3,4~dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, cis-6-asetyyli-4S- (2,5-dikloori-3-tiofeenikarbonyy-1iamino) - 3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3S-5 oli, trans-6-asetyyli-4S-(2,3,5-triklooribentsoyyliami-no)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H~l~bentsopyran-3R-oli, trans-6-asetyyli-4S~(2,3,4~trifluoribentsoyyliamino) -3,4-dihydro-2,2~dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, 10 trans-6~asetyyli-4S-bentsoyyliamino-3,4-dihydro- 2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, trans-6 -asetyyl i-4S-(3-j odibentsoyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-bentsopyran-2H-bentsopyran-3R-oli , 15 trans-6-asetyyli-4S-(5-fluori~2-metyylibentsoyy- liamino) -3,4-dihydro-2,2 -dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3R-oli, trans-6-asetyyli-4S-(5-kloori-2-metoksibentsoyy-liamino)-3,4~dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3R-20 oli, trans-6-asetyyli-4-(2,3-dimetyylibentsoyyliamino)- 3,4-dihydro-2,2 -dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-oli, cis-6-asetyyli-4S- (2,3-dikloori-4-fluoribentsoyyliamino) -3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-25 oli, cis-6 -asetyyli-4S-{3-kloori-4 -fluoribentsoyyliami-no}-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-oli, trans-6-asetyyli-4S- (2 -fluori -5-pyridiinikarbonyy-liamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3R- 30 oli, trans-6-asetyyli-4-(2-fenoksibentsoyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3-oli , trans-7-asetyyli-4-(4-fluoribentsoyyliamino)-3,4-dihydro~2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-oli, 4 trans-6-asetyyli~4S- (2-kloori-5-fluori-2-tiofeeni-karbonyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopy-ran-3R-oli, cis-6- asetyyli-4S- (2-kloori-5-fluori-2-tiofeenikar-5 bonyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-oli, ja cis-6-asetyyli-4S- (2,3,4-trifluoribentsoyyliamino)- 3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-oli, tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

10 Näistä yhdisteistä käytetään tästä eteenpäin nimi tystä kaavan (I) mukaiset yhdisteet.

On ymmärrettävä, että kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä voi olla kiraalihiiliatomeja 3- ja 4-asemissa ja siksi ne voivat esiintyä enantiomeereinä. Käsillä oleva 15 keksintö käsittää jokaisen enantiomeerin ja niiden seokset, kuten rasemaatit. Lisäksi on ymmärrettävä, että tietyt enantiomeeriset muodot ovat edullisia eri käytöissä, täten muissa käytöissä kuin lukinkalvon alaisessa verenvuodossa ja hermoshokissa ovat 3R,4S- ja 3S,4S-enantiomee-20 rit edullisia, mutta kuitenkin lukinkalvonalaisessa verenvuodossa tai hermoshokissa ovat 3S,4R- ja 3R,4R-enantio~ meerit edullisia.

On ymmärrettävä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola käsittää myös 25 tällaisten yhdisteiden solvaatit, kuten esimerkiksi hyd~ raatin.

Käsillä oleva keksintö antaa käyttöön lisäksi edellä määritellyn kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan, joka esiintyy enimmäk-30 seen 3S,4S- tai 3R,4S-enantiomeerisessa muodossa riippuen siitä onko yhdiste cis- vai trans-muodossa.

On ymmärrettävä, että esimerkiksi termi "esiintyy enimmäkseen 3S,4S-enantiomeerisessä muodossa" tarkoittaa, että enemmän kuin 50 % on 3S,4S~enantiomeerisessä muodossa 35 3R,4R-enantiomeeriseen muotoon verrattuna.

5 3S,4S-enantiomeeriä on edullisesti läsnä enemmän kuin 60 %, edullisemmin enemmän kuin 70 %, vieläkin edullisemmin enemmän kuin 80 % ja vieläkin edullisemmin enemmän kuin 90 %. Edullisimmin yhdisteessä on 3S,4S-enantio-5 meeriyhdistettä enemmän kuin 95 % 3R,4R-enantiomeerin suhteen .

Sama pätee 3R,4S-enantiomeerin tapauksessa.

Tällaisten yhdisteiden ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen uskotaan olevan uusia ja ne muo-10 dostavat käsillä olevan keksinnön edullisen aspektin.

Näitä yhdisteitä voidaan antaa nisäkkäälle oraalisesti, parenteraalisesti, sublingualisesti tai transder-maalisesti.

Edellä kuvattujen häiriöiden hoidossa tarvittava 15 tehokas määrä riippuu tavallisista tekijöistä, kuten hoidettavien häiriöiden luonteesta ja vakavuudesta ja nisäkkään painosta. Yksikköannos sisältää kuitenkin yleensä 1 -1 000 mg, sopivasti 1 - 500 mg, esimerkiksi 2 - 400 mg, kuten 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300 ja 400 mg 20 aktiivista yhdistettä. Yksikköannokset annetaan tavallisesti kerran tai useammin kuin kerran päivässä, esimerkiksi 1, 2, 3, 4, 5 tai 6 kertaa päivässä, tavallisemmin 1 -4 kertaa päivässä siten, että päivittäinen kokonaisannos on yleensä edellä esitetyllä annosvälillä, 70 kiloiselle 25 aikuiselle 1-1 000 mg, esimerkiksi 1 - 500 mg, joka on noin 0,01 - 15 mg painokiloa kohden päivässä, tavallisemmin 0,1 - 6 mg painokiloa kohden päivässä, esimerkiksi 1 -6 mg painokiloa kohden päivässä.

On erittäin edullista, että kaavan (I) mukainen 30 yhdiste annetaan yksikköannoskoostumuksen muodossa, kuten oraalisesti, kuten sublinguaalisesti, rektaalisesti, topi-kaalisesti tai parenteraalisesti (erityisesti intravenoo-sisesti) annettavan koostumuksen muodossa.

Tällaiset koostumukset valmistetaan seoksina ja ne 35 soveltuvat hyvin oraaliseen tai parenteraaliseen antoon ja 6 niitä voidaan antaa tablettien, kapseleiden, suun kautta annettavien nestemäisten valmisteiden, jauheiden, rakeit-ten, lääketablettien, veteen liuotettavien jauheiden, injektoitavien ja infusoitavien liuosten tai suspensioiden 5 tai peräpuikkojen muodossa. Suun kautta annettavat koostumukset ovat edullisia, erityisesti muotoillut suun kautta annettavat koostumukset, koska ne ovat miellyttävämpiä yleisessä käytössä.

Suun kautta annattavat tabletit ja kapselit anne-10 taan tavallisesti yksikköannoksena ja ne sisältävät tavanomaisia täyteaineita, kuten sidonta-aineita, täyteaineita, laimennosaineita, tabletointiaineita, liukastusai-neita, hajotusaineita, väriaineita, aromiaineita ja kostu-tusaineita. Tabletit voidaan päällystää sinänsä hyvin tun-15 netuilla menetelmillä.

Sopivia täyteaineita ovat selluloosa, mannitoli, laktoosi ja muuta samankaltaiset aineet. Sopivia hajotus-aineita ovat tärkkelys, polyvinyylipyrrolidoni ja tärkkelyksen johdannaiset, kuten tärkkelysnatriumglykolaatti. 20 Sopivia liukastusaineita on esimerkiksi magnesiumstearaat- ti . Sopivia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kostutusaineita on esimerkiksi natriumlauryylisulfaatti.

Nämä kiinteät oraaliset koostumukset voidaan valmistaa tavanomaisilla sekoitusmenetelmillä, täyttämismene-25 telmillä, tabletointimenetelmillä ja vastaavilla menetel millä. Toistettuja sekoitustoimintoja voidaan käyttää, jolloin aktiivinen aine saadaan jakautumaan tasaisesti sellaisissa koostumuksissa, joissa käytetään suuria määriä täyteaineita. Tällaiset toiminnot ovat tietenkin sinänsä 30 tunnettuja.

Suun kautta annettavat nestemäiset valmisteet voivat olla esimerkiksi vesi- tai öljysuspensioiden, liuosten, emulsioiden, siirappien tai eliksiirien muodossa tai ne voivat olla kuivatuotteina, joihin lisätään vettä tai 35 jotakin muuta sopivaa vehikkeliä ennen käyttöä. Tällaiset 7 nestevalmisteet voivat sisältää tavanomaisia lisäaineita, kuten suspendointiaineita, esimerkiksi sorbitolia, siirappia, metyyliselluloosaa, gelatiinia, hydroksietyylisellu-loosaa, karboksimetyyliselluloosaa, alumiinistearaattigee-5 liä tai hydrattuja syötäviä rasvoja, emulgointlaineita, esimerkiksi lesitiiniä, sorbitaanimono-oleaattia tai akaa-siaa, vedettömiä vehikkeleitä {joita ovat myös syötävät öljyt), esimerkiksi manteliöljyä, fraktioitua kookosöljyä, öljyestereitä, kuten glyseriinin, propyleeniglykolin tai 10 etyylialkoholin estereitä, säilöntäaineita, esimerkiksi metyyli- tai propyyli-p-hydroksibentsoaattia tai sorbiini-happoa, ja haluttaessa tavanomaisia aromi- ja väriaineita. Oraalisia formulaatioita ovat myös tavanomaiset hitaasti vapautuvat formulaatiot, kuten enterisen päällys-15 tyksen omaavat tabletit tai rakeet.

Parenteraalisesti annettavat nesteyksikköannosmuo-dot sisältävät yhdistettä ja steriiliä vehikkeliä. Yhdiste, vehikkelistä ja pitoisuudesta riippuen, voidaan joko suspentoida tai liuottaa. Parenteraaliset liuokset valmis-20 tetaan tavallisesti liuottamalla yhdiste vehikkeliin ja steriilisuodattaa ennen sopivaan lasipulloon tai ampullaan laittamista ja sinetöidä. Edullisesti myös adjuvantit, kuten paikallispuudute, säilöntäaineet ja puskurointlaineet liuotetaan vehikkeliin. Koostumuksen stabiilisuuden 25 parantamiseksi se voidaan jäädyttää sen jälkeen, kun se on laitettu lasipulloon ja vesi on poistettu tyhjössä.

Parenteraaliset suspensiot valmistetaan olennaisesti samalla tavalla paitsi, että yhdiste suspendoidaan vehikkeliin liuottamisen sijasta ja tämä steriloidaan sätei-30 lyttämällä etyleenioksidilla ennen suspendointia steriilissä vehikkelissä. Edullisesti koostumukseen lisätään pinta-aktiivista ainetta tai kostutusainetta käsillä olevan keksinnön mukaisen yhdisteen tasaisen jakautumisen helpottamiseksi.

8

Normaalin käytännön mukaisesti koostumusten mukana on tavallisesti kirjalliset tai painetut ohjeet lääkkeen käytöstä.

Käsillä oleva keksintö antaa käyttöön lisäksi far-5 maseuttisen koostumuksen, jota voidaan käyttää hoidettaessa ja/tai ennaltaehkäistäessä tuskaisuutta, kiihkomieli-syyttä, masentuneisuutta, lukinkalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, kuten kokaiinin, nikotiinin, alkoholin ja bentsodiat-10 sepiinien vierotusoireita, antikonvulsiivisilla aineilla hoidettavia tai ennaltaehkästäviä häiriöitä, kuten epilepsiaa, Parkinsonin tautia, psykoosia, migreeniä, paikallista verettömyyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa ja/tai aggressiota, joka sisältää kaavan (I) mukaista 15 yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.

Käsillä oleva keksintö antaa käyttöön myös menetelmän, jota voidaan käyttää hoidettaessa ja/tai ennaltaehkäistäessä tuskaisuutta, kiihkomielisyyttä, masentunei-20 suutta, lukinkalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, kuten kokaiinin, nikotiinin, alkoholin ja bentsodiatsepiinien vierotusoireita, antikonvulsiivisilla aineilla hoidettavia tai ennaltaehkästäviä häiriöitä, kuten epilepsiaa, Parkinsonin 25 tautia, psykoosia, migreeniä, paikallista verettömyyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa ja/tai aggressiota, jolloin hoidon tarpeessa olevalle potilaalle annetaan tehokas tai ennalta ehkäisevässä hoidossa riittävä määrä kaavan (I) mukaista yhdistettä tai sen farmaseutti-30 sesti hyväksyttävää suolaa.

Käsillä oleva keksintö kohdistuu lisäksi kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käyttöön sellaisen lääkkeen valmistuksessa, jota voidaan käyttää hoidettaessa ja/tai ennaltaehkäistäessä 35 tuskaisuutta, kiihkomielisyyttä, masentuneisuutta, lukin- 9 kalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, kuten kokaiinin, nikotiinin, alkoholin ja bentsodiatsepiinien vierotusoireita, antikon-vulsiivisilla aineilla hoidettavia tai ennaltaehkästäviä 5 häiriöitä, kuten epilepsiaa, Parkinsonin tautia, psykoosia, migreeniä, paikallista verettömyyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa ja/tai aggressiota.

Käsillä oleva keksintö antaa käyttöön lisäksi farmaseuttisen koostumuksen, joka sisältää kaavan (I) mukais-10 ta yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.

Lisäksi käsillä oleva keksintö kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käytön terapeuttisena aineena, jota käytetään erityisesti 15 hoidettaessa ja/tai ennaltaehkäistäessä tuskaisuutta, kii- hkomielisyyttä, masentuneisuutta, lukinkalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, kuten kokaiinin, nikotiinin, alkoholin ja bentsodiatsepiinien vierotusoireita, antikonvulsiivisilla 20 aineilla hoidettavia tai ennaltaehkästäviä häiriöitä, ku ten epilepsiaa, Parkinsonin tautia, psykoosia, migreeniä, paikallista verettömyyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa ja/tai aggressiota.

Tällaiset koostumukset voidaan valmistaa jäljempänä 25 kuvatulla tavalla.

Yleensä kaavan (I) mukaiset cis-yhdisteet voidaan valmistaa vastaavista trans-yhdisteistä ja näitä valmistusmenetelmiä on yleisesti kuvattu EP-patenttijulkaisuissa 126 311, 376 524, 205 292, 250 077, 93 535, 150 202, 30 76 075, WO/89/05 808, 350 805, 277 611, 277 612, 337 179, 339 562, 355 565, EP-hakemusjulkaisuissa 415 065 (E.

Merck), 450 415 (Squibb), 466 131, 482 934, 29 6975, JO- hakemusjulkaisussa 2 004-791 ja WO/89/07 103.

Kaavan (I) mukaisia cis-yhdisteitä voidaan valmis-35 taa menetelmillä, joita on yleisesti kuvattu tai jotka 10 ovat analogisia EP-hakemusjulkaisussa 139 992 kuvattujen menetelmien kanssa.

Kaavan (I) mukaisia cis-yhdisteitä voidaan valmistaa myös julkaisuissa G. Burrell et ai., Tetr. Letters 31 5 (1990) 3649 - 3652, tai U. Quast ja E. Villhauer, Eur. J.

Pharmacol, Molecular Pharmacology Section 245 (1993) 165 -171, kuvatuilla menetelmillä.

On ymmärrettävä, että kaavan (I) mukaiset rasemaa-tit voivat olla kaavan (I) mukaisten yhdisteiden hajotet-10 tuja tai puhdistettuja enantiomeerejä ja niitä voidaan valmistaa käyttämällä sinänsä tunnettuja menetelmiä ja käyttämällä erityisesti EP-patenttijulkaisuissa 430 631 ja 355 584 esitettyjä menetelmiä.

Lisäksi on ymmärrettävä olevan edullista, että kaa-15 van (I) mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa halutussa enantiomeerisessä muodossa muodostamalla kiraalisesti puhdasta epoksidia käyttämällä katalyyttejä ja olosuhteita, joita on yleisesti kuvattu patenttijulkaisuissa WO/91/ 14 694 tai WO/93/17 026, ja sen jälkeen konvertoimalla 20 epoksidit halutuksi kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi käyttämällä tässä esitettyjä menettelytapoja.

Kaavan (I) mukaisia trans-yhdisteitä voidaan valmistaa noudattamalla patenttijulkaisussa PCT/GB92/01 045 esitettyjä menettelytapoja, jotka liitetään käsillä ole-25 vaan hakemukseen viitteenä, tai kaavan (I) mukaisia trans-yhdisteitä voidaan valmistaa analogisilla tavoilla jossakin edellä mainitussa patentissa kuvattujen menetelmien mukaisesti.

Seuraavat yhdisteet valmistettiin vastaavilla, 30 edellä mainituissa patenttijulkaisuissa ja julkaisuissa kuvatuilla menetelmillä.

Seuraavat kuvaukset, esimerkit ja farmakologiset testitulokset kuvaavat käsillä olevaa keksintöä.

11

Kuvaus 1 2.3- dikloori-4-fluoribentsoehappo 2.3- dikloorifluoribentseeniä (5 g) , alumiinitriklo-ridia {6;91 g) ja asetyylikloridia (3,85 ml) lämmitettiin 5 130 °C:ssa 20 tuntia argonin alla. Musta jäännös kaadet tiin seokselle, jossa oli konsentroitua HCl-jäätä ja eetteriä. Kerrokset erotettiin ja orgaaninen faasi pestiin kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella ja suolavedellä ja kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla. 10 Suodattamisen ja haihduttamisen jälkeen saatiin mustaa jäännöstä, jota käsiteltiin n-heksaanilla. n-heksaaniliuos suodatettiin ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin 2,3-dikloori-4-fluoriasetofenonia (1,04 g).

Tätä raakamateriaalia (0,69 g), 5-prosenttista nat-15 riumhypokloriittiliuosta (23 ml) ja dioksaania (20 ml) refluksoitiin 16 tuntia. Liuos jäähdytettiin ja haihdutettiin ja tähän lisättiin vettä (20 ml) yhdessä konsentroidun HCl:n kanssa pH-arvoon 1 ja kiinteä saostuva aines suodatettiin pois ja uudelleenkiteytettiin asetoni-vedes-20 tä ja näin saatiin 2,3-dikloori-4-fluoribentsoehappoa (0,36 g).

Kuvaus 2 cis-8-asetyyli-2 -(3-kloori-4-fluorifenyyli)-3a,9b-dihydro-4,4-dimetyyli-4H-bentso[b]pyrano[4,3-d]oksatsoli 25 Liuosta, jossa oli trans-6-asetyyli-4S-(3-kloori- 4 - f luoribentsoyyliamino) -3,4-dihydro-2,2~dimetyyli-2H-ben-tso[b]pyran-3R-olia (esimerkki 62 patenttijulkaisussa WO/ 94/13 656) (3,37 g, 8,6 mmol) kuivassa dikloorimetaanissa (90 ml) ja DASTra (1,40 ml, 10,59 mmol) , pidettiin huo-30 neenlämmössä 2 päivää. Sen jälkeen, kun liuos oli haihdutettu tyhjössä ja jäännös kromatografoitu käyttämällä Kie-selgel 60:ä 25-prosenttisessa etylaatti/n-heksaanissa, saatiin otsikon mukaista oksatsoliinia värittömänä kumina (2,50 g, 78 %) .

12 ΧΗ NMR (CDC13) : δ 1,35 (3Η, s), 1,59 (3Η, s), 2,60 (3H, s), 4,80 (1H, d) , 5,35 (1H, d) , 6,90 (1H, d) , 7,15 (1H, t), 7,82 (1H, m), 8,00 (1H, dd), 8,10 (1H, d).

Esimerkki 1 5 cis-6-asetyyli-4S-(2,3-diklooribentsoyyliamino)- 3.4- dihydro-2H-l-bentsopyran-3S-oli trans~6-asetyyli-4S-(2,3-diklooribentsoyyliamino)- 3.4- dihydro-2H-l-bentsopyran-3R-olia (0,84 g) liuotettiin dikloorimetaaniin (50 ml) , Liuokseen lisättiin dietyyli- 10 aminorikkitrifluoridia (DAST) (0,325 ml) ja sitä sekoi tettiin yön yli. Seos haihdutettiin kuiviin ja kromatogra-foitiin Kieselgel 60:llä. Sen jälkeen, kun tätä oli eluoi-tu CH2Cl2-EtOAc:11a gradienttieluutiossa, saatiin vaalean keltaista kumia (0,71 g), jota pidettiin 2 päivää seokses-15 sa, jossa oli dioksaania (20 ml) ja vettä (6 ml), jossa oli 5 N H2S04:a (3 ml) . Seos tehtiin emäksiseksi kiinteällä natriumbikarbonaatilla, sitä sekoitettiin 2 tuntia ja se haihdutettiin kuiviin. Seos jaettiin etyyliasetaatin ja veden kesken ja orgaaninen kerros pestiin suolavedellä. 20 Orgaaninen kerros kuivattiin vedettömällä natriumsulfaa-tilla, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin vaalean keltaista kumia (0,639 g). Tästä reaktiosta ja edellisestä reaktiosta (0,3 g) saadut tuotteet yhdistettiin ja ne kromatografoitiin Kieselgel 60:llä. Eluutio suoritet-25 tiin seoksella, jossa oli dikloorimetaania ja 1 % metano-lia, ja näin saatiin valkoista kiinteää ainesta (0,47 g) ja etyyliasetaatti-heksaanista ja sitten asetoni-heksaa-nista suoritetun uudelleenkiteyttämisen jälkeen saatiin otsikon mukaista yhdistettä, jonka sulamispiste oli 104 -30 107 °C. [ce]D = -7,50 °C (MeOH, c = 1,0).

13

Esimerkki 2 trans-6-asetyyli-4S- (2,3-dikloori-4-fluoribentsoyy-liamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli 5 Tämän esimerkin yhdiste valmistettiin kytkemällä 2,3“dikloori-4-fluoribentsoehappo (kuvaus 1) trans-6-aee-tyyl i - 4 S - amino-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopy-ran-3R-olin D- (-) -mandelaattisuolan kanssa esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä. Otsikon mukainen yhdiste uudel-10 leenkiteytettiin asetoni-heksaanista kiteinä, joiden sulamispiste oli 205 - 206 °C. [a] 2°D - +17,6 °C (MeOH, c = 0,44) .

Esimerkki 3 trans-6-asetyyli-4S-(3,5-diklooribentsoyyliamino)-15 3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-bentsopyran-3R-oli

Sp. 220 °C; [u]2°d = +22,2 °C (MeOH, C = 1,18).

Esimerkki 4 trans-6-asetyyli-4S-(3,5-difluoribentsoyyliamino)- 3.4- dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3R-oli 20 Sp. 203 °C; [a]20p = +28,9 °C (MeOH, c = 1,0).

Esimerkki 5 trans-6-asetyyli-4- (2-tiofeenikarbonyyliamino) -3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-oli

Sp. 175,5 - 177 °C.

25 Esimerkki 6 trans-6-asetyyli-4S-(3 -tiofeenikarbonyyliamino)- 3.4- dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli

Sp. 211 - 213 °C.

Esimerkki 7 30 trans-6-asetyyli-4S-(2,5-dikloori-3 -tiofeenikarbo nyyliamino} - 3,4-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli

Sp. 194 °C; [q-]20p = -1,0 °C (MeOH, c = 1,03).

14

Esimerkki 8 ci s-6-asetyyli-4S-(2,5-dikloori~3-tiofeenikarbo-nyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-oli 5 Ruskeankeltainen vaahto. NMR {CDC13) ö: 1,40 (3H), 1,54 (3H) , 2,06 (1H, d) , 3,84 {1H, dd) , 5,60 (1H, dd) , 6,92 (1H, d), 7,22 (1H, laaja), 7,30 (1H), 7,85 (1H, dd), 7, 96 (1H) .

Esimerkki 9 10 trans-6-asetyyli-4S-(2,3,5-triklooribentsoyyliami- no)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3R-oli

Sp. 219 - 223 °C.

Esimerkki 10 trans-6-asetyyli-4S- (2,3,4-trifluoribentsoyyliami- 15 no) -3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli

Sp. 167 °C; [a]20D = +3,0 °C (MeOH, c = 0,945).

Esimerkki 11 trans-6-asetyyli-4S-bentsoyyliamino-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli 20 Sp. 188 - 191 °C.

Esimerkki 12 trans-6~asetyyli-4S- (3 -jodibentsoyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-bentsopyran-2H-bentsopyran-3R-oli 25 Sp. 171 - 173 °C; [a] 2°D - +15,5 °C (MeOH, c = 1,00).

Esimerkki 13 trans-6-asetyyli-4S-(5-fluori-2-metyylibentsoyyli-amino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3R-oli 30 Sp. 194 - 196 °C.

Esimerkki 14 trans-6-asetyyli-4S-(5-kloori-2-metoksibentsoyyli-amino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli

Sp. 191 - 194 °C.

15

Esimerkki 15 trans- 6-asetyyli-4 - (2,3 “dimetyylibentsoyyliairri.no) - 3,4-dihyd.ro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3 -oli

Sp. 188 - 189 °C.

5 Esimerkki 16 cis- 6-asetyyli-4S- (2,3-dikloori- 4 -fluoribentsoyy-li amino) -3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3 S - oli

Sp. 130 °C.

10 Esimerkki 17 cis-6-asetyyli-4S-(3-kloori-4 - fluoribentsoyyliamino) -3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3S-oli

Liuosta, jossa oli oksatsoliinia (D2) (2,5 g, 6,68 mmol) 1,4-dioksaanissa (45 ml), vettä (15 ml) ja 5 N 15 rikkihappoa (6 ml), pidettiin huoneenlämmössä 1 päivä.

Siihen lisättiin ylimäärä NaHC03:a ja tuloksena saatua suspensiota sekoitettiin huoneenlämmössä 2 tuntia. Seos konsentroitiin tyhjössä ja sitten se jaettiin etyyliasetaatin ja veden kesken. Orgaaninen kerros pestiin vedellä ja suo-20 lavedellä sekä kuivattiin (Na2S04) .

Tyhjössä haihduttamisen jälkeen saatiin vaalean keltaista kumia, joka kromatografoitiin Kieselgel 60:llä 25-prosenttisessa etyyliasetaatti/n-heksaanissa. Yhdistämällä sopivat fraktiot, jotka oli saatu uudelleenkiteytet~ 25 tämällä asetoni/n-heksaanista, saatiin otsikon mukaista yhdistettä valkoisina kiteinä (1,20 g, 46 %). Sp. 151 - 153 °C.

Analyysi yhdisteelle C2()H19ClFN04: Löydetty: C 61,04, H 4,91, N 3,86 %.

30 Laskettu: C 61,31, H 4,89, N 3,57 %.

Upsilon max (KBr) : 3 360, 3 310, 2 950, 1 680, 1 640, 1 260 ja 840 cm"1.

1H NMR (CDC13) : δ 1,40 (3H, s) , 1,56 (3H, s), 2,12 (1H, d, exö20), 2,50 (3H, s), 3,84 (1H, dd), 5,62 (1H, dd), 16 6,91 (1H, d) , 6,95 (1H, br, d) , 7,23 (1H, t) , 7,75 (1H, m), 7,83 (1H, dd), 7,92 (1H, d), 7,96 (1H, dd).

m/z: 391 (M+, 1%), 373 (4), 358 (88), 203 (50), 157 (100).

5 Esimerkki 18 cis~6-asetyyli-4-(2,3,4-trifluoribentsoyyliamino)- 3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-oli NMR (CDC13) : δ 1,41 (3H, s) , 1,55 (3H, s), 2,50 (3H, s) , 3,85 (1H, dd) , 5,67 (1H, dd) , 6,92 (1H, d) , 10 7,03 - 7,20 (1H, m), 7,78 - 7,90 (2H, m), 7,95 (1H, s).

Esimerkki 19 trans-7-asetyyli-4- (4-fluoribentsoyyliamino) -3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H~l-bentsopyran-3-oli Sp. 189 - 193 °C.

15 Esimerkki 20 trans-6 -asetyyli-4S-(2 - fluori-5-pyridiinikarbonyy-liamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli

Sp. 84 °C.

20 Esimerkki 21 trans-6-asetyyli-4-(2-fenoksibentsoyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-oli

Sp. 208 °C.

Seuraavat esimerkkiyhdisteet valmistetaan käyttä-25 mällä vastaavia menettelytapoja kuin edellä on kuvattu. Esimerkki 22 trans- 6 - asetyyli - 4 - (2 - kloori - 5 - fluori - 2 - tiof eeni -karbonyyliamino)-3,4-dihydro-2,2 -dimetyyli-2H-l-bentsopy-ran-3-oli 30 Esimerkki 23 cis-6-asetyyli-4-(2-kloori-5-fluori-2-tiofeenikar-bonyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-1-bentsopyran-3 -oli 17

Farmakologiset tiedot 1. Rotan sosiaalinen vuorovaikutustesti

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen terapeuttinen käyt-5 tökelpoisuus voidaan testata seuraavan menettelytavan mukaisesti :

Potentiaaliset anksiolyyttiset ominaisuudet arvioidaan käyttämällä rotan sosiaalista vuorovaikutustestiä, joka perustuu alunperin Filen (J. Neurosci. Methods 2 10 (1980) 219 - 238} kuvaamaan menettelytapaan. Tässä mallis sa rauhoittavat aineet lisäävät selektiivisesti sosiaalista vuorovaikutusta riippumatta mistään vaikutuksesta liikunnalliseen aktiivisuuteen.

Menetelmä 15 Urospuolisia Sprague-Dawley rottia (Charles River,

Iso-Britannia, 250 - 300 g) majoitetaan erikseen 3 päivää ennen testausta. Sitten testipäivänä eläimet jaetaan 8 -16 eläimen ryhmiin ja niille annostellaan suun kautta annostilavuus 1 ml/kg useilla annoksilla yhdistettä (1 - 300 20 mg/kg) tai vehikkeliä. 60 minuuttia annoksen antamisen jälkeen rotat laitetaan paino- ja hoitoyhteensopiviin urospareihin (kohtaavat ensimmäistä kertaa) sosiaaliseen vuorovaikutuslaatikkoon kirkkaasti valaistuissa, tuntemattomissa olosuhteissa. Laatikko on valmistettu valkoisesta 25 akryylimuovista (54 x 37 x 26 cm) ja sen etusivu on läpinäkyvää pleksilasia. Lattia on jaettu 24 yhtä suureen neliöön ja se on kirkkaasti valaistu (115 lux). Aika (sekun-tit) aktiivisessa sosiaalisessa vuorovaikutuksessa (nuuhkiminen, siistiminen, seurailu, nouseminen, kiipeily yli 3 0 tai ali, nyrkkeily, pureminen) on asteikossa 11 sokea" etäisseurannassa kuten on myös ylitettyjen neliöiden määrä (liikkumisen indeksinä).

Keskimääräinen ja keskivirhe sosiaalisessa vuorovaikutuksessa vietetyn ajan suhteen ja ylitettyjen neli-35 öiden määrä lasketaan jokaiselle hoitoryhmälle ja lääkkeen 18 aiheuttamat muutokset ilmaistaan prosentuaalisena kasvuna tai laskuna kontrolliarvoista. Statistiset vertailut tehdään vehikkelillä ja lääkkeellä hoidettujeni ryhmien välillä käyttämällä Dunnettin kerrannaisvertailumenetelmää, 5 joka seuraa merkitsevää yksisuuntaista varianssianalyysiä.

Lääkkeet on suspendoitu 1-prosenttiseen metyylisel-luloosaan.

2. MES-testi

Maksimaalinen sähköshokeilla aiheutetun kohtauksen 10 (MES) kynnystesti jyrsijöillä on erityisen herkkä potenti aalisten kouristuksia estävien ominaisuuksien havainnoimiseksi1. Tässä mallissa kouristusta estävät aineet kohottavat sähköisesti aiheutettujen kohtausten kynnystä, kun taas kohtauksia aiheuttavat aineet alentavat kohtauskyn-15 nystä.

Menetelmä

Hiiret (urospuolisia, Charles River, Iso-Britannia CD-I laji, 25 - 30 g) jaetaan satunnaisesti 10 - 20 eläimen ryhmiin ja niille annetaan suun kautta tai intra-20 peritoneaalisesti annostilavuus 10 ml/kg useilla annoksilla yhdistettä (0,3 - 300 mg/kg) tai vehikkeliä. Sitten 30 - 60 minuuttia annoksen antamisen jälkeen hiirille annetaan yksittäinen sähköshokki (0,1 sekuntia, 50 Hz, sini-aaltomuoto) sarveiskalvoelektrodeilla. Keskimääräinen säh-25 kövirta ja keskivirhe, joka tarvitaan aiheuttamaan kohtaus 50 prosentissa (CC5Q) hiiristä tietyssä hoitoryhmässä, määritetään Dixonin ja Moodin (1948) "up and down" -menetel-mällä . Statistiset vertailut vehikkelillä ja lääkkeellä hoidettujen ryhmien välillä tehdään käyttämällä Litch-

O

30 fieldin ja Wilcoxonin (1949) menetelmää .

Kontrollieläimillä CC5Q on tavallisesti 14 - 18 mA. Tästä syystä kontrolliryhmän ensimmäinen eläin laitetaan 16 mA:n sähkövirtaan. Mikäli tämä ei aiheuta yhtäjaksoista kouristuskohtausta, nostetaan sähkövirtaa seuraavan hiiren 35 kohdalla. Mikäli yhtäjaksoista kouristelua ilmenee, niin 19 sähkövirtaa pienennetään ja niin edelleen, kunnes ryhmän kaikki eläimet on testattu.

Prosentuaalinen CC5Q-arvon nousu tai lasku lasketaan jokaiselle ryhmälle kontrolliin verrattuna.

5 Tutkimukset suoritetaan käyttämällä Hugo Sachs Ele ctronic Constant Current Shock -generaattoria, jossa käytetään tavallisesti täysin säädettävää shokkikontrolli-tasoa 1 - 300 mA ja 2 mA:n vaiheita.

Lääkkeet on suspendoitu 1-prosenttiseen metyylisel-10 luloosaan.

Viitteet: 1. W. Loscher ja D. Schmidt, Epilepsy Res. 2 (1988) 145 - 181 2. W. J. Dixon ja A. M, Mood, J. Amer. Stat. Assn.

15 43 (1948) 109 - 126 3. J. T. Litchfield ja F. Wilcoxon, J. Pharmacol, exp. Ther. 96 (1949) 99 - 113.

Tulokset

Esimerkin 17 mukainen yhdiste paransi shokkikynnys-20 tä 105 % suun kautta annetulla annoksella 10 mg/kg.

3. X-sokkelo

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen terapeuttinen käyttökelpoisuus voidaan testata seuraavan menettelytavan mu- 25 kaisesti:

Johdanto

Ahdistusta mittaavassa X-sokkelotestissä (Handley ja Mithani, 1984) tutkitaan naiivien rottien tutkimusvas-tetta ympäristössä, jossa on sekä rauhoittavia (avoimia 30 haaroja) että suhteellisen ei-rauhoittavia (suljettuja haaroja) alueita. Tästä syystä oletetaan, että esilääkitystä seuraava selektiivinen kasvu avoimien haarojen tutkimuksessa osoittaa lääkkeen rauhoittavaa tehokkuutta.

20

Menetelmä X-sokkelo nostettiin 70 cm lattian yläpuolelle ja se koostui kahdesta suljetusta haarasta 45 cm (pituus) x 15 cm (leveys) x 10 cm (korkeus) sekä kahdesta avoimesta 5 haarasta 45 cm x 10 cm x 1 cm ja nämä oli järjestetty siten, että molemmat kummankin tyyppiset haarat olivat vastapäätä toisiaan. Molemmat haaratyypit merkitään kahteen yhtä pitkään osaan. Rotat laitetaan X-sokkelon keskelle ja niitä tarkkaillaan 10 minuuttia, jona aikana seuraavat 10 parametrit merkitään muistiin: 1) sisäänastumisten määrä ja vietetty aika (a) avoimissa haaroissa, (b) suljetuissa haaroissa, (c) avoimien haarojen päässä ja (d) suljettujen haarojen päässä, 2) ylitettyjen osa-alueiden määrä. Heräävä pelko avoimissa haaroissa on suurempi kuin suojetuissa 15 haaroissa ja tyypillisesti rotat suosivat selvästi suljettuja haaroja. Rauhoittavat lääkkeet lisäävät sisäänmenoa avoimien haarojen ulkopuoliskolle ja siellä vietettyä aikaa sekä myös kokonaisten avoimien haarojen sisäänmenojen prosentuaalista osuutta ja siellä vietettyä aikaa. Nämä 4 20 ahdistuksen mittaa ja myös ylitettyjen osa-alueiden kokonaismäärä laskettiin jokaiselle eläimelle. Lääkkeitä annettiin intraperitoneaalisesti tai oraalisesti 6-12 rotan ryhmille 30 - 60 minuuttia ennen testausta. Statistiset vertailut vehikkelillä ja lääkkeellä käsiteltyjen ryh-25 mien välillä tehtiin käyttämällä Mann-Whitneyn U-testiä (kaksitahoinen testi).

Viite: S. L. Handley ja S. Mithani, Arch. Pharmacol. 327 (1984) 1 - 5.

30 4. Sekarotuisten koirien viivästynyt aivoverisuo- nenkouristus

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen terapeuttinen käyttökelpoisuus voidaan testata seuraavan menettelytavan mu-35 kaisesti: 21 Näissä tutkimuksissa käytetään 25 sekarotuista koi-raurosta, jotka painoivat 9 - 12 kg. Eläimet majoitetaan ja niitä hoidetaan teoksessa Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [DHEW (DHHS) julkaisu no. (NIH) 85 -5 23, tarkastettu 1985] esitettyjen ohjeiden mukaisesti.

SmithKline Beecham Pharmaceutical-yhtiön oikeusjärjestystä valvova eläinten hoitoon ja käyttöön erikoistunut komitea on hyväksynyt kaikki menettelytavat, joissa käytetään koe-eläimiä. Jokainen eläin nukutetaan pentobarbitaalilla 10 {35 mg/kg, i.v.) ja laitetaan lämmitetylle operointipöy- dälle makuuasennossa. Sitten kaikkien eläinten henkitorvi avataan, lamautetaan (tubokurariini 0,1 mg/kg, i.v.) ja tuuletetaan keinotekoisesti huoneilmalla. Hengitysilman C02 (et C02) tarkastellaan jatkuvasti ja valtimoverikaasuana-15 lyysi suoritetaan määräajoin, jolla varmistetaan stabiili ja riittävä ilmankierto joka kokeessa. Polyetyleenikanyy-11t laitetaan vasempaan ulommaiseen kaulalaskimoon ja oikeaan reisivaltimoon ja -laskimoon lääkkeen antamista, valtimoverenpaineen mittaamista ja verinäytteiden ottamis-20 ta varten. Sitten suoritetaan vasemman nikamavaltimon transfemoraalinen katetrointi vasemman reisivaltimon kautta käyttämällä 5 ranskalaista Lehman dakronkatetria (Bard, Tewksbury MA). Anestesiaa lisätään tarvittaessa pentobarbitaalilla {5 mg/kg, i.v.) ennen koejaksoa.

25 Käsillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden vai kutuksia akuuttiin aivoverisuonenkouristukseen evaluoidaan 15 koiralla. Kaikkien eläinten kohdalla saadaan kontrolli digitaalinen subtraktiivinen angiogrammi etummaisesta sel-käydinvaltimosta ja tyvivaltimosta radiokontrastiaineen 30 (Omnipaque 300) intravertebraalisen annon jälkeen. Sitten jokaisesta koirasta poistetaan 4 ml aivo-selkäydinnestettä selänpuoleisesta säiliöstä niskapistolla membraanista ja 4 ml autologista laskimoverta injektoidaan. Tämän jälkeen angiogrammi toistetaan jokaisen koiran kohdalla 30 minuu-35 tin kuluttua veren intrakisternaalisen annon jälkeen ja 22 tyvivaltimon ja etummaisen selkäydinvaltimon akuutti va-sospasmi identifioidaan ja mitataan. 30 minuutin vehikke-li-infuusiolla (10 % polyetyleeniglykoli 200) ei ole vaikutusta akuuttiin vasospasmiin. Testiyhdisteiden 30 minuu-5 tin infuusioiden vaikutusta akuutin vasospasmin suunnanmuutokseen tarkkaillaan tyvivaltimossa ja etummaisessa selkäydinvaltimossa.

Käsillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden vaikutuksia viivästyneeseen aivoverisuonenkouristuksen kroo-10 nisessa koiramallissa (kahden verenvuodon aivoverisuonen-kouristusmalli). Tässä mallissa saadaan kontrolli nikama-angiogrammi ja autologista verta annetaan intrakisternaa-lisesti päivänä 1 (kuten edellä). Kolmantena päivänä veren intrakisternaalinen anto toistetaan ja vakavat viivästymi-15 set verisuonenkouristuksessa mitataan angiograafisesti seitsemäntenä päivänä kaikilla eläimillä. 60 minuutin ve-hikkeli-infuusiolla (10 % polyetyleeniglykoli 200) ei ole vaikutusta viivästyneeseen vasospasmiin, jota tarkkailtiin tyvivaltimossa ja etummaisessa selkäydinvaltimossa (n = 2 0 5) . Testiyhdisteiden infuusion vaikutus merkittävään vii- västyneisyyteen aivoverisuonenkouristuksen suunnanmuutokseen ilmaisee yhdisteen aktiivisuuden.

5. Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen terapeuttinen käyt-25 tökelpoisuus voidaan testata seuraavan menettelytavan mukaisesti : 1) Parkinsonin taudin vastainen aktiivisuus 6-hydroksidopamiini-vaurioisessa rottamallissa

Edellä mainittua testiä, jota U. Ungerstedt on ku-30 vannut julkaisuissa Acta Physiol. Scand. 367 (1971) 49 - 68 ja/tai Acta Physiol. Scand. 367 (1971) 69 - 93, voidaan käyttää määritettäessä kaavan (I) mukaisten yhdisteiden tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen Parkinsonin taudin vastaista aktiivisuutta.

23 2) Antipsykoottinen aktiivisuus

Amfetamiinilla aiheutettu rotan hyperliikkuvuus

Edellä mainittua testiä, jota L. Kokkindis ja M. Anisman ovat kuvanneet julkaisussa Psychological Bulletin 5 88 (1980) 551 ~ 579, voidaan käyttää määritettäessä kaavan (I) mukaisten yhdisteiden tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen antipsykoottista aktiivisuutta.

3) Migreenin vastainen aktiivisuus

Aivokuoren levittämä masentuneisuus ja migreeni 10 Edellä mainittua testiä, jota Wahl et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Brain Research 411 (1987) 72 - 80, voidaan käyttää määritettäessä kaavan (I) mukaisten yhdisteiden tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen migreenin vastaista aktiivisuutta.

15 Eläinpreparaatio

Kokeet suoritettiin naaras- tai uroskissoilla (2,5 - 3,0 kg), jotka olivat paastolla yön yli, mutta joilla oli vapaa pääsy vesiastialle. Anestesia saatiin aikaan 4 - 5-prosenttisella halotaanilla ja sitä ylläpi-20 dettiin lisäämällä intravenoosisesti a-kloraloosia (90 -110 mg/kg). Peräsuolen lämpötila ja happo-emästila pidettiin fysiologisella alueella. Oikea reisivaltimo ja -laskimot kanyloitiin verenpaineen mittaamista, valtimoveren näytteenottoa ja lääkkeen antamista varten. Myös pulssi 25 mitattiin verenpaineen perusteella ja merkittiin muistiin.

Vasemmanpuoleinen päälaenluu kraniotomia ja durektomia muodostettiin ja aivot päällystettiin kerroksella esiläm-mitettyä mineraaliöljyä 37 °C:ssa. Muutokset suonen halkaisijassa tutkittiin intravitaalisella videomikroskopial-30 la ja taltioitiin videonauhalle.

Aivokuoren levittämän masentuneisuuden (CSD) induktio CSD aiheutettiin antamalla pieni määrä (30 mg kiteitä) KCl:a aivopoimualueelle merkintäelektrodeista, ha-35 vainnointisuonista ja muista verisuonista. Kun aivot on 24 peitetty kerroksella lämmintä mineraaliöljyä, KCl:a liukenee hitaasti aivoihin 5 minuutin aikana antamisesta. Tämän ajan jälkeen jäljelle jäänyt KCl pestiin pois aivojen pinnalta suolaliuostupolla. Muutokset ekstrasellulaarisessa 5 tehossa ja valtimon ja suonten halkaisijassa merkittiin muistiin 120 minuutin ajanjakson.

Lääkehoito

Esimerkin 17 mukaista yhdistettä, suspensiota (10 mg/kg, i.p.) tai vehikkeliä (1 % labrasoli i.p.) an-10 nettiin 90 minuuttia ennen CDS~induktiota.

KCl-indusoituja toistettavia CSD-tapahtumia kont-rollieläimissä (n = 4) tarkkailtiin havainnointiajan. Esimerkin 17 mukaisella yhdisteellä hoidetuissa eläimissä (n = 3) havaittiin vain ensimmäisiä CSD-tapahtumia KCl:n 15 käytön suhteen. Kokonaismediaani (minimi - maksimi) CSD-tapahtumien määrät kontrolliryhmässä ja hoitoryhmässä olivat 5,5 (4 - 9) ja vastaavasti 2 (1-2). CSD:n kaltaisten tapahtumien kokonaiskesto oli 60,3 ± 6 minuuttia (n = 4) kontrolliryhmässä ja se lyheni merkitsevästi (p < 0,05) ja 20 kokonaiskesto oli 13,7 ± 0,3 minuuttia esimerkin 17 mukaisella yhdisteellä hoidetuilla eläimillä (n = 3).

4) Aivojen verettömyys a) Mongolian gerbiilitesti

In vivo -kokeet suoritetaan aikuisilla mongolian 25 gerbiileillä (Tumblebrook Farm (MA)), jotka painavat 60 -80 g. Ohimenevä etuaivojen verettömyys saadaan aikaan bilateraalisella yhteisen päänvaltimon suonensidonnalla anestesiassa, jossa on 2,5 % isofluoraania 100 % 02:ssa, ja jossa eläimet laitetaan lämpötyynylle, jotta kehonlämpö 30 pysyy 37 °C:ssa. Yhteiset päänvaltimot paljastetaan ja valtimon pullistumanipistimet laitetaan molempiin valtimoihin tietyksi ajanjaksoksi kuten kuvion selityksessä on esitetty. Liuosta, jossa oli PBN:a liuotettuna suolaliuokseen, annettiin intraperitoneaalisesti boluksena 30 mi-35 nuuttia ennen tukkeamista (esikäsittelyt) tai heti ja taas 25 6 tuntia reperfuusion jälkeen, ja sama annos annettiin 2 kertaa päivässä 2 päivän ajan (jälkihoito). CAl-neuronien määrän määrittämiseksi eläimet tapetaan 7 päivää verettö-myyden jälkeen ja kostutetaan puskuroidulla formaliinil-5 la. Aivot poistettiin, niitä säilytettiin formaliinissa 3 päivää, upotettiin paraffiiniin, leikattiin 7 mikrometriä paksuihin koronaaliosiin (1,5 - 1,9 mm taaemmasta päälaki-pisteestä ) ja värjättiin tioniinilla . Vahingoittumattomien neuronien määrä 750 μπι paksussa CAI-kerroksessa molem-10 missä aivoturson puoliskoissa 3 alueella lasketaan jokaisen eläimen kohdalla.

b) MCAO-menetelmä

Aikuisia urospuolisia rottia (SHR) on kaupallisesti saatavana 3 lajiketta (Taconic Farms, Germantown, NY; Ch-15 arles River, Danvers, MA; ja Charles River, Danvers, MA) 18 viikon ikäisinä (paino 250 - 300 g) ja niitä majoitetaan 2-4 viikkoa ennen näissä tutkimuksissa käyttöä. Sen varmistamiseksi, että tutkittavat eläinlajikkeet ovat todella hypertensiivisiä ja normotensiivisiä, nukutetaan 20 eläimiä kustakin lajikeryhmästä 2-prosenttisella isoflu-raanilla (Anaquest, Madison, WI) ja niitä valmistetaan jatkuvasti aseptisissa olosuhteissa verenpaineen merkitsemiseksi. Reisivaltimo kanyloidaan polyetyleeniputkella (PE60; Clay Adams, Parsippany, NJ) , joka ulottuu juuri 25 aortan alaosaan. Putki johdetaan subdermaalisesti valtimosta ja paljastetaan lapaluun välissä juuri niskan alla ja puhdistetaan/täytetään steriilillä isotonisella suolaliuoksella. Aukaisukohdat suljetaan käyttämällä 2-0 silkkiommelta ja niitä käsitellään 5-prosenttisella lido-30 kaiinivoiteella (Astra Pharmaceuticals, Westborough, MA).

Eläimet selviävät leikkauksesta/anestesiasta 5 minuutin sisällä. Keskimääräistä valtimoverenpainetta mitataan 4 -5 tuntia leikkauksen jälkeen 5 minuuttia rottaa kohden liittämällä paljastettu putki jokaisessa rotassa Statham-35 paineenmuuntimeen (P2.3Db; Statham Medical Instruments, 26

Los Angeles, CA), joka tulostuu polygrafiin (Malli R711; Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA).

Polttoväli haivausmenettelytapa MCAO tai näennäisleikkaus suoritetaan SHR, SD ro-5 tiliä natriumpentobarbitaalinukutuksessa (65 mg/kg, i.p., lisätään tarvittaessa). Kaikilla eläimillä on vapaa pääsy ruoka- ja vesiastioille ennen leikkausta ja sen jälkeen. Kehon lämpötila pidetään 37 °C:ssa käyttämällä lämpötyynyä leikkaustoimenpiteen ajan. Leikkaus suoritetaan samalla 10 tavoin kuin edellä on esitetty (2.4) . Oikea selänpuoleinen osa päästä ajetaan paljaaksi ja pannaan kuntoon providoni-jodidilla ja rotta laitetaan stereotaksiseen laitteeseen (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) siten, että pään leikkauspuoli (oikea) on ylempänä. 1-2 senttimetrin 15 avaus tehtiin silmäkuopan ja ulommaisen kuulokanavan välille. Temporaalilihas leikataan pääkallosta ja laitetaan takaisin vahingoittamatta poskiluusidettä tai alaleuanluun hermoa. 2-3 millimetrin kranitomia tehdään leikkausmikroskoopin alla ja suolaliuoshuuhtelulla suunpuolelle juuri 20 poskiluun pääkalloon ompeleella. Kovakalvo avataan valtimon päällä käyttämällä modifioitua 30 gaugen neulanpäätä. Pysyväksi oikeaksi MCAO:ksi käyttämällä elektrokoagulaatiota (Force 2 Electrosurgical Generator, Valley Lab Inc., Boulder, CO) , suljettiin valtimo stimuloiden ja leikattiin 25 selänpuoleiseen lateraaliseen hajuelimeen alemman aivosuo-nen tasolla. Sitten pieni osa steriilissä suolaliuoksessa liotettua Gelfoamia (Upjohn, Kalamazoo, MI) laitetaan kra-niotomian yli ja ohimolihas ja iho suljetaan kahdessa kerroksessa. Eläinten annetaan toipua nukutuksesta lämpölam-30 pun alla ja sitten ne palautetaan häkkeihinsä. Eläimet tapetaan 24 tunnin kuluttua MCAO-käsittelyn jälkeen ja aivot valmistellaan reaktiivisesta histologisesta tutkimuksesta .

27

Verettömyyden aiheuttaman vaurion mittaukset

Neurologisen arvioinnin jälkeen (24 tuntia leikkauksen jälkeen) rotat tapettiin natriumpentobarbitaalin yliannostuksella. 2-3 minuutissa aivot poistetaan ja 6 5 koronaalietuaivoviipaletta (paksuus 2 mm) tehdään hajueli-men tasosta pikkuaivojen kuoren liitokseen käyttämällä rotan aivojen viipaloijaa [(59); Zivic-Miller Laboratories Inc., Allison Park, PA]. Sitten nämä etuaivojen viipaleet upotetaan heti 1-prosenttiseen liuokseen, jossa on trife-10 nyylitetratsoliumkloridia (TTC) fosfaattipuskurissa, 37 °C:ssa 20 - 30 minuutiksi (€.78) . Sitten suodatetut kudokset preparoidaan suodattamalla 10-prosenttisessa fos-faattipuskuroidussa formaliinissa. Jokaisen TTC-suodatetun osan kaksi puolta värivalokuvakaan käyttäen polaroidkame-15 raa. Näistä valokuvista analysoidaan verettömyydestä johtuvan vaurion suuruus käyttämällä kuva-analyysisysteemiä (Amersham RAS 3000; Loats Associates, Inc.). Leikkausta seuraavat morfologiset muutokset evaluoidaan jokaisen eläimen koko etuaivojen alueella (yhteensä 11 planaari-20 pintaa). 11 planaarikuvaa saatiin jokaiselta puolelta kuuden 2 millimetrin paksuisesta osasta ja vastaavat noin 1 millimetrin leikkauspintaa välillä +5 - -5 mm päälakipis-teestä (97) ja käsittävät koko etuaivot. Nämä planaariku-vapinnat (valokuvista) digitalisoidaan ja niitä käytetään 25 kuva-analyysisysteemissä infarktin koon ja turpoamisen pinta-alan määrittämiseksi. Kaksi MCACnsta johtuvaa iskee-misen vaurion parametriä määritetään jokaiselle viipaleelle, kuten aiemmin on kuvattu (2, 4, 98, 122). "Aivopuoliskon turpoaminen" ilmaistaan samanpuoleisen (eli leikkauk-30 sen puoleisen) aivopuoliskon koon prosentuaalisena kasvuna vastakkaispuoleiseen (normaaliin) aivopuoliskoon nähden ja se lasketaan seuraavasti: 28

Leikkauksen Vastapuoleisen puoleisen aivo - aivopuoliskon Prosentuaalinen puoliskon alue alue aivopuoliskon = --------------------------------x 100 5 turpoaminen Vastapuoleinen aivopuoliskon alue "Infarktin koko", joka ilmaistaan prosentuaalisena infarktoituneena kudoksena verrattuna vastakkaispuoleiseen 10 (normaaliin) aivopuoliskoon, lasketaan seuraavasti:

Prosentuaalinen Infarktialue aivopuoliskon = ------------------------------ x 100 infarktin koko Vastapuoleisen aivopuoliskon alue 15

Turpoaminen ja infarktikoko ilmaistaan suhteessa vastakkaisen puoleiseen aivopuoliskoon (eli leikkauksen puoleinen iskeeminen vaurio vakioidaan normaaliin vastakkaisen puoleiseen aivopuoliskoon). Nämä parametrit määri-20 tetään jokaiselle viipaleelle koko etuaivojen alueella tapahtuneen vaurion profiilin (eli etuaivojen profiilin) evaluoimiseksi ja etuaivojen "kokonaismuutokset" määritetään käyttämällä kaikkien yksittäisten viipaleitten summaa näissä kaavoissa.

25 MCAO:n jälkeiseen aivopuoliskojen turpoamiseen liittyvän aivoödeeman ilmeneminen määritettiin vertaamalla märkä/kuivapainoa, kuten aiemmin on kuvattu (45, 118) .

Rotat tapettiin ylisuurella annoksella natriumpentobarbi-taala 24 tuntia näennäisleikkauksen tai MCAO-leikkauksen 30 jälkeen. Aivot poistetaan nopeasti, etuaivot erotetaan pikkuaivojen kuoren liitoksessa ja leikataan kahteen puoliskoon ja kumpikin osa mitataan Mettler tyypin H5 kemiallisella tasapainolaitteella (Mettler Instruments Corp., Hightstown, NJ) 2 minuutin kuluessa pään poistamisen jäl-35 keen. Kuivapaino mitattiin samalla skaalalla sen jälkeen, kun etuaivoja oli kuivattu 80 °C:ssa 48 - 72 tuntia. Jokaisen aivonpuoliskon vesipitoisuus laskettiin märkä- ja kuivapainon erotuksena prosentuaalisena fraktiona märkä- painosta: 29

Prosentuaalinen Märkäpaino - kuivapaino 5 vesipitoisuus = ----------------------- x 100 Märkäpaino

Claims (6)

1. Yhdiste, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: cis-6-asetyyli-4S-(2,3-diklooribentsoyyliamino)-5 3,4-dihydro-2H-l-bentsopyran-3S-oli, trans-6-asetyyli-4S-(2,3-dikloori-4~fluoribentsoyy-liamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli~2H-l”bentsopyran-3R-oli, trans-6~asetyyli-4S-(3,5-diklooribentsoyyliamino)- 3.4- dihydro-2,2-dimetyyli-2H-bentsopyran-3R-oli, 10 trans-6-asetyyli-4-(2-tiofeenikarbonyyliamino)-3,4- dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-oli, trans-6-asetyyli-4S-(3-tiofeenikarbonyyliamino)- 3.4- dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, trans-6-asetyyli-4S-(2,5-dikloori-3-tiofeenikarbo-15 nyyliamino)-3,4-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, cis-6-asetyyli-4S-(2,5-dikloori~3-tiofeenikarbonyy-liamino}-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-oli, trans-6-asetyyli~4S-{2,3,5-triklooribentsoyyli-amino}-3,4-dihyäro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, 20 trans-6-asetyyli-4S-bentsoyyliamino-3,4-dihydro- 2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3R-oli, trans-6-asetyyli-4S-{3-jodibentsoyyliamino}-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-bentsopyran-2H-bentsopyran~3R~oli, trans-6-asetyyli-4S-(5-kloori-2-metoksibentsoyyli-25 amino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l~bentsopyran-3R-oli, trans-6-asetyyli~4- (2,3-dimetyylibentsoyyliamino) - 3.4- dihydro-2,2-dimetyyli~2H-l-bentsopyran-3-oli, cis-6-asetyyli-4S-(2,3-dikloori-4-fluoribentsoyyli-amino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-oli, 30 cis-6-asetyyli-4S-(3-kloori-4-fluoribentsoyyliami- no)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3S-oli, trans-6-asetyyli-4S-(2-fluori-S-pyridiinikarbonyy-liamino) -3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran~-3R-~oli, trans-6-asetyyli-4-(2-fenoksibentsoyyliamino)-3,4-35 dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran-3-oli, tra n s-6-asetyyli-4S-(2-kloori-5-fluori-2-tiofeeni~ karbonyyliamino)-3,4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopy~ ran-3R-oli, cis-6-asetyyli-4S-{2-kloori~5~fluori-2-tiofeenikar-5 bonyyliami.no) -3, 4-dihydro-2,2-dimetyyli-2H-l-bentsopyran- 3S-oli, ja cis-6-asetyyli-4S-(2,3,4-trifluoribentsoyyliamino)-3, 4-dihydro-2, 2-dimetyyli~2H-l-bentsopyran-3S-oli, tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

2. Farmaseuttinen koostumus, jota voidaan käyttää hoidettaessa ja/tai ennaltaehkäistäessä tuskaisuutta, kiih-komielisyyttä, masentuneisuutta, lukinkalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, kuten kokaiinin, nikotiinin, alkoholin ja bent-15 sodiatsepiinien vierotusoireita, antikonvulsiivisilla ai neilla hoidettavia tai ennaltaehkästäviä häiriöitä, kuten epilepsiaa, Parkinsonin tautia, psykoosia, migreeniä, paikallista verettömyyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa ja/tai aggressiota, tunnettu siitä, että se 20 sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola käytettäväksi lääkeai- 25 neena.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käyttö sellaisen lääkkeen valmistuksessa, jota voidaan käyttää hoidettaessa ja/tai ennaltaehkäistäessä tuskaisuutta, kiihkomielisyyttä, 30 masentuneisuutta, lukinkalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, kuten kokaiinin, nikotiinin, alkoholin ja bentsodiatsepiinien vierotusoireita, antikonvulsiivisilla aineilla hoidettavia tai ennaltaehkästäviä häiriöitä, kuten epilepsiaa, Parkin-35 sonin tautia, psykoosia, migreeniä, paikallista verettö- myyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa ja/tai aggressiota.

5. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista yhdistettä 5 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola käytettäväksi terapeuttisena aineena erityisesti hoidettaessa ja/tai ennaltaeh- 10 käistäessä tuskaisuutta, kiihkomielisyyttä, masentuneisuutta, lukinkalvon alaiseen verenvuotoon tai hermoshokkiin liittyviä häiriöitä, vierotusoireita, kuten kokaiinin, nikotiinin, alkoholin ja bentsodiatsepiinien vierotusoireita, antikonvulsiivisilla aineilla hoidettavia tai ennaltaehkäs-15 täviä häiriöitä, kuten epilepsiaa, Parkinsonin tautia, psykoosia, migreeniä, paikallista verettömyyttä aivoissa, Alzheimerin tautia, skitsofreniaa ja/tai aggressiota.