FI116660B - Veren triglyseriditason kohoamista estävä peptidi ja mainittua peptidiä aktiivisena aineosana sisältävä veren triglyseriditason kohoamisen estäjä - Google Patents

Description

116660

Veren triglyseriditason kohoamista estävä peptidi ja mainittua peptidiä aktiivisena aineosana sisältävä veren triglyseriditason kohoamisen estäjä

Tekninen alue 5 Tämä keksintö koskee uudenlaista peptidiä, joka estää veren tri glyseriditason kohoamista, ainetta veren triglyseriditason kohoamisen estämiseksi, joka käsittää kyseistä peptidiä aktiivisena komponenttina, määriteltyyn terveyskäyttöön tarkoitettua elintarviketta (niin kutsuttua fysiologisesti funktionaalista elintarviketta), joka toimii veren triglyseriditason kohoamista estävästi, 10 ja rehua, joka toimii veren triglyseriditason kohoamista estävästi.

Antamalla keksinnön mukaista veren triglyseriditason kohoamista estävää ainetta rasvaisen veren puhdistamiseksi sitä kautta käy mahdolliseksi ehkäistä tai hoitaa ihmisten ja eläinten liikalihavuutta ja hyperlipemiaa samoin kuin niihin liittyviä sydän-verisuonisairauksia, kuten kohonnutta verenpainetta 15 ja arterioskleroosia. Lisäksi käy mahdolliseksi parantaa kaljan ja viljelykalan lihan laatua.

Tausta

Rasvan ja sokerin liiallisen saannin tiedetään aiheuttavan liikalihavuutta, hyperlipemiaa yms. Veren triglyseriditason (jäljempänä käytetään jos-·: : 20 kus ilmausta "TG-taso") kohoamisen hyperlipemiassa sanotaan olevan häiriöi- den, kuten kohonneen verenpaineen ja arterioskleroosin, aiheuttaja. Siksi on ; tehty joukko yrityksiä veren TG-tason kohoamisen estämiseksi tarkoituksena :. liikalihavuuden ja hyperlipemian parantaminen, j- Nykyisin veren TG-tason kohoamisen estämiseksi rajoitetaan ruo- V Λ 25 kavaliota, nautitaan dieettielintarvikkeita (kuten kuituja) ja annetaan erilaisia * lääkkeitä. Mainitunlaisina lääkkeinä käytetään dekstraanisulfaattia, joka edis tää lipoproteiinilipaasiaktiivisuutta veressä, nikomolia, joka estää lipidien » ♦ · : imeytymistä, klofibraattia ja pravastatiinia, jotka ovat lipidimetaboliaa paranta- via aineita, yms.

; · · j 30 Ruokavalion rajoittaminen on kuitenkin tuskallista sitä harjoittavalle, ja edellä mainittujen lääkkeiden annon aiheuttamia sivuvaikutuksia pelätään myös. Niinpä on toivottavaa kehittää aine veren TG-tason kohoamisen estä 116660 2 miseksi, jolla on voimakkaampi veren TG-tason kohoamista estävä vaikutus ja jonka yhteydessä ei ole pelkoa sivuvaikutusten aiheuttamisesta.

Nykyisin annetaan toisaalta väkirehuja karjalle ja viljelykaloille niiden kasvun edistämiseksi. Tämän seurauksena karjassa ja viljelykaloissa 5 esiintyy rasvametaboliapoikkeavuuksia, ja niiden veren TG-tasolla on taipumus kohota. Tämän veren TG-tason kohoamisen vuoksi rasvasisältö kasvaa liian suureksi karjassa ja viljelykaloissa. Mainitunlaisen karjan tai kalan nauttiminen johtaa siten liialliseen rasvansaantiin. Mainitunlainen karja ja kala on lisäksi vähitellen lakannut täyttämästä kuluttajien makumieltymyksiä. Edellä kuvattu 10 rasvasisällön kasvu on lisäksi vakava ongelma rehujen hukkakäytön suhteen ja myös ruhoihin kiinnittyneestä rasvasta huolehtimisen suhteen. Niinpä on olemassa suuri tarve estää veren TG-tason kohoamista, erityisesti Japanin karjankasvatus- ja kalanviljelyteollisuudessa.

Jokin aika sitten on jätetty patenttihakemus, joka koskee oligopepti-15 dipitoista materiaalia, jonka ovat kehittäneet muutamat tutkijat tämän keksinnön tekijät mukaan luettuina (kansainvälinen julkaisu nro WO89/06 970), ja tämänkaltainen tekniikka esitetään julkaisussa Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-154 693.

On myös selvitetty, että määrätyillä oligopeptideillä on lipidimetabo-20 liaa parantavia vaikutuksia, mukaan luettuna veren TG-tason kohoamisen estäminen [Kyoichi Kagawa, Food Chemical Monthly 6 (1990) 80; Chizuko Fu-/ kuhama ei ai., FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA 97 (1991) 38].

Keksinnön sisältö i · Edellä mainitussa patenttijulkaisussa jne. esitetyt oligopeptidipitoiset • (> 25 materiaalit ovat proteolysaattiseoksia, eikä niiden varsinaisesti aktiivisten kom- ponenttien (ts. niiden aktiivisina komponentteina olevien peptidien) aminohapposekvenssejä ole vielä selvitetty.

. . Tämä viittaa siihen, että edellä mainitut peptidipitoiset materiaalit ovat lääkkeiksi puhtausasteeltaan alhaisia. Kun mainitunlaista materiaalia yh-’ 30 distetään elintarvikkeen kanssa, on lisäksi vaikea määrittää kvantitatiivisesti tä- ·:··: mä materiaali erillään elintarvikkeen sisältämistä muista peptideistä, ja siten •: · i esiintyy laadunvalvontaongelmia.

3 116660

Siksi on välttämätöntä määrittää edellä mainituissa peptidipitoisissa materiaaleissa olevat varsinaisesti aktiiviset komponentit, ts. aktiivisina komponentteina toimivat veren TG-tason kohoamista estävät peptidit.

Tämän keksinnön yhtenä päämääränä on analysoida edellä kuvat-5 tuja, aktiivisina komponentteina toimivien peptidien aminohapposekvenssit. Tämän keksinnön yhtenä toisena päämääränä on tarjota käyttöön aine veren triglyseriditason kohoamisen estämiseksi, joka käsittää yhtä tai useampaa edellä mainittua peptidiä aktiivisena komponenttina, fysiologisesti funktionaalinen elintarvike, joka toimii veren triglyseriditason kohoamista estävästi, ja rehu, 10 joka toimii veren triglyseriditason kohoamista estävästi.

Seurauksena edellä mainittujen tehtävien ratkaisuun tähtäävistä intensiivivistä ja laajoista tutkimuksista tämän keksinnön tekijät ovat havainneet, että edellä mainitut tehtävät voidaan ratkaista seuraavassa kuvattavalla keksinnöllä.

15 Tämän keksinnön sisältö on seuraava: (1) peptidi, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohappo- sekvenssi; (2) aine veren triglyseriditason kohoamisen estämiseksi, joka käsittää peptidiä, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposekvenssi, 20 ja/tai peptidiä Val-Tyr-Pro ja/tai peptidiä Val-Thr-Leu aktiivisena komponenttina; (3) määriteltyyn terveyskäyttöön tarkoitettu elintarvike, joka toimii :· veren triglyseriditason kohoamista estävästi sitä kautta, että se käsittää pepti- ·’. .·* diä, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposekvenssi, tai main- 25 ittua peptidiä yhdistettynä peptidiin Val-Tyr-Pro ja/tai peptidiin Val-Thr-Leu ak-:' ·.. tiivisena komponenttina; :' *': (4) rehu, joka toimii veren triglyseriditason kohoamista estävästi sitä kautta, että se käsittää peptidiä, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty ami-: nohapposekvenssi, tai mainittua peptidiä yhdistettynä peptidiin Val-Tyr-Pro ’". * 30 ja/tai peptidiin Val-Thr-Leu aktiivisena komponenttina.

': Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti tätä keksintöä.

: Keksinnön mukainen peptidi, jolla on sekvenssissä numero 1 esi- ’: “ tetty aminohapposekvenssi ja peptidit Val-Tyr-Pro ja Val-Thr-Leu, joita keksin- .V, nön mukainen aine, joka estää veren triglyseriditason kohoamista, voi sisältää 35 aktiivisena komponenttina (jäljempänä käytetään ilmausta "yksi tai useampi » | 116660 4 keksinnön mukainen peptidi"), voidaan erottaa puhdistaa luonnossa esiintyvistä proteiineista. Niitä voidaan vaihtoehtoisesti syntetisoida suoraan kemiallisesti tavanomaisin menetelmin. On myös mahdollista valmistaa keksinnön mukainen peptidi muodostamalla geeniteknisin menetelmin geeni, jolla on edellä 5 mainittua peptidisekvenssiä vastaava emässekvenssi, insertoimalla kyseinen geeni sopivaan ilmentämisvektoriin ja saattamalla geeni ilmentymään sopivassa isännässä.

A. Seuraavassa kuvataan menetelmää edellä mainittujen peptidien erottamiseksi ja puhdistamiseksi luonnossa esiintyvistä proteiineista.

10 Lähtömateriaalina yhden tai useamman keksinnön mukaisen pepti din valmistamiseksi voidaan käyttää monia erilaisia proteiineja. Voidaan käyttää esimerkiksi eläinproteiinia, kuten kalanlihaproteiinia, kalajauhoa, globiinia jne., tai kasviproteiinia, kuten vehnägluteenia, soijapapukaseiinia jne.

Näistä proteiineista ovat erityisen edullisia globiiniproteiinit, kuten 15 hemoglobiini ja myoglobiini, koska ne voivat saada voimakkaasti aikaan veren TG-tason kohoamisen toivotun estovaikutuksen.

Se, millainen eläin on mainitunlaisen globiiniproteiinin lähteenä, ei oli erityisesti rajoitettua. Voidaan käyttää esimerkiksi naudan, sian, lampaan, ihmisen, hevosen jne. verta.

20 Edellä mainittu proteiini tulisi sitten hydrolysoida. Nämä hydrolyysi- toimenpiteet tehdään menetelmällä, jota kuvataan kansainvälisessä julkaisussa numero WO89/06 970, supra. Hydrolysointiin käytettävänä hydrolaasina voidaan käyttää yhtä tai useampaa happamien proteaasien, neutraalien prote-*\ ΐ,; aasien tai aikalisien proteaasien joukosta valittavaa hydrolaasia.

25 Seuraavassa kuvataan globiiniproteiinin hydrolyysissä käytettäviä olosuhteita jne.

Globiiniproteiinia sisältävä materiaali dispergoidaan ensin veteen, niin että kiintoainepitoisuudeksi tulee 5 - 30 paino-%. Sitten tämän seoksen pH ; säädetään hapolla tai emäksellä, niin että saadaan aikaan proteaasi(e)n kan- ,···! 30 naita optimaalinen pH. Sen jälkeen proteaasi(t) lisätään tähän seokseen ker- • ‘ ralla tai asteittain ja annetaan niiden reagoida 3- 48 tuntia lämpötilassa ’ : 20-70 °C, niin että saadaan aikaan hydrolyysi.

Seuraavaksi tuloksena oleva proteolysaatti kuivataan ja saatetaan kakun muotoon sellaisenaan tai sen jälkeen, kun siihen on lisätty sopiva mää 116660 5 rä täyteainetta, kuten karboksimetyyliselluloosaa tai dekstriiniä. Siten voidaan valmistaa proteolysaatti, jolla on veren TG-tason kohoamista estävä vaikutus.

Tämä proteolysaatti sisältää vähintään 0,1 paino-% yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä.

5 Sitten keksinnön mukainen entsyymikäsitelty proteolysaatti puhdis tetaan. Mainitunlaiseen puhdistukseen voidaan käyttää tavanomaisia puhdistusmenetelmiä.

Voidaan esimerkiksi yhdistää ioninvaihto, ultrasuodatus, käänteis-faasikromatografia jne. sopivalla tavalla toivottua peptidiä sisältävien fraktioi-10 den puhdistamiseksi.

Vaikka ioninvaihto- tai ultrasuodatustoimenpiteet eivät ole ehdottoman välttämättömiä, on edullista sisällyttää ne erotus- ja puhdistusmenette-lyyn, koska ne voivat parantaa erottumis- ja puhdistumisastetta.

Kyseiset fraktiot voidaan erottaa ja puhdistaa yhdistämällä happa-15 missä olosuhteissa ja neutraaleissa olosuhteissa tehtävä käänteisfaasikroma-tografia. Toivotun peptidin määrä jossakin fraktiossa voidaan määrittää tunnetuin proteiinimääritysmenetelmin, esimerkiksi ninhydriinimenetelmällä.

Siten valitun fraktion aminohapposekvenssi voidaan identifioida tunnetuin menetelmin ja vahvistaa siten yhden tai useamman keksinnön mu-20 kaisen peptidin läsnäolo.

Siten erotetusta fraktiosta peräisin olevaa yhtä tai useampaa peptidiä voidaan käyttää veren TG-tason kohoamisen estoon tarkoitetun aineen ak-: : tiivisena komponenttina.

: Myös itse fraktiota voidaan käyttää suoraan edellä mainitun aineen ,.;; * 25 aktiivisena komponenttina.

Yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä voidaan syntetisoi-da kemiallisesti tavanomaisin peptidisynteesimenetelmin. Voidaan käyttää esimerkiksi atsidimenetelmää, happokloridimenetelmää, happoanhydridime-: netelmää, happoseka-anhydridimenetelmää, DCC-menetelmää, aktiivinen es- 30 teri -menetelmää, karboimidatsolimenetelmää, hapetus-pelkistysmenetelmää, DCC-lisäaine (HOMB, HOBt, HOSu) -menetelmää (katso esimerkiksi Shreder ; & Luhke, The Peptide, voi. 1, Academic Press, New York, USA 1966; Izumiya •”'i et ai., Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. 1975) yms.

, v. Edellä luetelluissa peptidisynteesimenetelmissä voidaan käyttää jo- f i - 35 ko kiinteäfaasisynteesiä tai nestefaasisynteesiä.

• t 116660 6

Mainituissa peptidisynteesimenetelmissä on edullista suojata sivu-ketjussaan funktionaalisen ryhmän sisältävien aminohappojen, kuten tyrosiinin ja treoniinin, sivuketjujen funktionaaliset ryhmät. Suojausryhmänä voidaan käyttää tunnettuja suojausryhmiä, kuten bentsyylioksikarbonyyliryhmää (Cbz-), 5 t-butoksikarbonyyliryhmää (Boc-), bentsyyliryhmää (Bz-) jne.

Mainitunlaisen suojausryhmän poisto voidaan tehdä yhden tai useamman tämän keksinnön mukaisen peptidin syntetisointimenettelyn aikana tavanomaisin menetelmin.

B. Aine veren TG-tason kohoamisen estämiseksi voidaan valmistaa 10 käyttämällä aktiivisena komponenttina yhtä tai useampaa tämän keksinnön mukaista peptidiä.

Kantajana aineelle veren TG-tason kohoamisen estämiseksi voidaan käyttää formuloiden valmistukseen tavanomaisesti käytettäviä aineita (kuten täyteaineita, jatkeaineita, sideaineita, kostutteita, hajoamista edistäviä 15 aineita, pinta-aktiivisuusaineita) tai laimennusaineita formulan käyttömuodon mukaan. Formulan muoto ei ole erityisesti rajoitettu, kunhan formula sisältää tehokkaalla tavalla yhtä tai useampaa tämän keksinnön mukaista peptidiä. Formula voi olla esimerkiksi kiinteän aineen, kuten tablettien, jauheen, rakeiden tai pillerien, muodossa tai injektioaineen, kuten liuosten, suspensioiden tai 20 emulsioiden, muodossa. Keksinnön mukainen aine voi vaihtoehtoisesti olla kuivana tuotteena, joka voidaan saattaa nesteen muotoon lisäämällä asianmukaista kantajaa ennen käyttöä. Mikä tahansa näistä muodoista voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin.

Siten saadun, veren TG-tason kohoamisen estoon tarkoitetun ai-: · 25 neen annos valitaan sopivasti formulan antomenetelmän ja -muodon, formulaa : ’ .. saavan potilaan tilan jne. mukaan.

.; Yleensä valmistetaan formula, joka sisältää noin 0,001 - 80 paino-% yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä ja formulaa annetaan edulli- ; sesti siten, että annettavan yhden tai useamman keksinnön mukaisen peptidin > * · 30 määrä on noin 1 -100 mg vuorokaudessa aikuiselle. Anto ei tapahdu välttä-': ’ mättä kerran vuorokaudessa. Se voidaan tehdä 3-4 kertaa vuorokaudessa.

:'Edellä kuvatuissa erilaisissa muodoissa olevat farmaseuttiset for-·; ! mulat voidaan antaa käyttämällä sopivaa antoreittiä muodon mukaan. Injektio- X aineen muodossa oleva formula voidaan antaa esimerkiksi laskimonsisäisesti, 35 lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, ihonsisäisesti, vatsaontelonsisäisesti jne. ja 116660 7 kiinteän aineen muodossa oleva farmaseuttinen formula voidaan antaa suun kautta jne.

C. Määriteltyyn terveyskäyttöön tarkoitettu elintarvike (niin kutsuttu fysiologisesti funktionaalinen elintarvike), joka toimii veren TG-tason kohoamis- 5 ta estävästi, voidaan valmistaa käyttämällä yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä aktiivisena komponenttina. Keksinnön mukaista peptidiä voidaan käyttää myös yleisten elintarvikkeiden lisäaineena.

Edellä mainittujen elintarvikkeiden laji ei ole erityisesti rajoitettu. Tämä terveyselintarvike voi olla sovellettavissa maitoon, vanukkaaseen, curryyn, 10 hakkelukseen, muhennokseen, lihakastikkeeseen, kinkkuun, kakkuun, suklaa-seen yms.

Maito on erityisesti edullista, sillä se voi helpottaa sellaisen yhden tai useamman keksinnön mukaisen peptidin nauttimista, joka on lapsille makunsa vuoksi vaikea nauttia suoraan. Myös yhden tai useamman keksinnön 15 mukaisen peptidin lisääminen elintarvikkeisiin, kuten kakkuun ja suklaaseen, jotka itse asiassa edistävät liikalihavuutta, on toivottavaa siltä kannalta, että voidaan estää edellä mainittujen elintarvikkeiden nauttimisen aiheuttamaa liikalihavuutta.

Fysiologisesti funktionaaliseen elintarvikkeeseen lisättävä määrä 20 yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä valitaan asianmukaisesti elintarvikkeen lajin, lisäyksen tarkoituksen, elintarvikkeen nauttimisen odotetun * vaikutuksen jne. mukaan.

Yleisesti ottaen on edullista antaa elintarvikkeen sisältää yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä siten, että yhtä ateriaa kohden voi- 25 daan ottaa noin 0,1 - 4 mg yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä.

D. Rehu, joka toimii karjan jne. veren TG-tason kohoamista estä- ;·. västi, voidaan valmistaa yhdistämällä rehuun yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä aktiiviseksi komponentiksi.

: Rehu, johon yhdistetään yhtä tai useampaa keksinnön mukaista / 30 peptidiä, voi olla joko karjalle, kuten lehmille, sioille, kanoille jne., tai viljelyka- loille, kuten hammasahvenelle, nuorille piikkimakrilleille jne., tarkoitettu rehu.

•' ; Rehuun yhdistettävä määrä yhtä tai useampaa keksinnön mukaista : ’1: peptidiä valitaan rehun lajin, rehun nauttimisen odotetun vaikutuksen jne. mu- kaan.

I » 116660 8

Yleisesti ottaen on edullista yhdistää rehuun 0,1-4 paino-% yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on globiiniproteolysaatin geelikromatogrammi.

5 Kuvio 2 on esimerkissä 1 määritetty käänteisfaasikromatogrammi (hapan).

Kuvio 3 on esimerkissä 1 määritetty käänteisfaasikromatogrammi (neutraali).

Paras tapa keksinnön toteuttamiseksi 10 Keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavin esimerkein jne., joita ei tulisi ymmärtää keksinnön teknistä suoja-alaa rajoittaviksi.

Referenssiesimerkki Globiiniproteolysaatin valmistus

Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti menetelmää globiinipro-15 teolysaatin valmistamiseksi käyttämällä naudan erytrosyyttejä. Tuloksena olevan globiiniproteolysaatin molekyylimassajakautumaa tutkittiin geelisuoda-tuskromatografialla (kuvio 1).

Geelisuodatuskromatografia toteutettiin seuraavissa olosuhteissa.

j Laitteisto: suurtehonestekromatografi (SHIMADZU CORP.; Malli 20 LC-6A) :. Kolonni: PolyHYDROXYETHYL A, 5 pm, 9,4 x 200 mm (PolyC Inc.)

Liikkuva faasi: Muurahaishappo, 50 mmol/l Virtausnopeus; 0,5 ml/min Detektointi; UV-absorptio (221 nm).

25 Lyhyesti esitettynä lisättiin 250 I vettä 100kg:aan tuoreita naudan erytrosyyttejä riittävän hemolyysin mahdollistamiseksi. Kun pH oli säädettiin t i arvoon 2,8 fosforihapolla, lisättiin liuokseen 2,6-107 yksikköä Aspergillus niger -peräistä hapanta proteaasia ja annettiin seoksen reagoida 3 tuntia lämpötilas-: sa 50 °C.

30 Edellä mainitun reaktion jälkeen reaktioliuosta pidettiin 30 minuuttia lämpötilassa 80 °C reaktion keskeyttämiseksi. Sen jälkeen reaktioliuokseen li-: sättiin vesipitoista kalsiumhydroksidisuspensiota pH:n säätämiseksi arvoon 116660 9 6,5. Sitten lisättiin 10 kg piimaata ja suodatettiin suodatuspuristimella. Tuloksena oleva suodos suihkukuivattiin, jolloin saatiin 23 kg jauhemuodossa olevaa globiiniproteolysaattia.

Esimerkki 1 5 Peptidien fraktiointi ja puhdistus Veren TG-tason kohoamisen esto

Yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä saatiin seuraavilla menettelyillä; (1) ioninvaihto, (2) ultrasuodatus, (3) erotus käänteisfaasikro-matografialla happamissa olosuhteissa ja (4) erotus käänteisfaasikromatogra-10 fialla neutraaleissa olosuhteissa.

Taulukossa 1 esitetään talteensaantiasteet näiden menettelyjen jälkeen. Proteiinimäärät määritettiin ninhydriinimenetelmällä.

Taulukko 1

Adiposyyttien erilaistumista estävien peptidien talteensaantiaste globii-15 niproteolysaatista

Fraktio Proteii- Saanto Kvantitatiivinen määritysmenetelmä nin mää- (%) rä (g)

Globiiniproteolysaatti 13,7 100 Ninhydriinimenetelmä happohydrolyy- sin jälkeen t

Ioninvaihto + ultrasuodatus 4,24 30,9 Käänteisfaasikromatografia • (hapan) i _ .* (1) Fraktio A 0,039 0,28 Aminohappoanalyysi happohydrolyysin jälkeen . (2) Fraktio A’ 0,0005 0,004 , Käänteisfaasikoromatogaria (neutraali) : (3) Val-Thr-Leu (Fraktio B) 0,009 0,06 : (4) Val-Tyr-Pro (Fraktio C) 0,006 0,04 116660 10 (1) Ioninvaihto

Lisättiin vesipitoinen liuos, joka sisälsi 10 paino-% proteolysaattia, heikosti happamaan kationinvaihtohartsiin (Amberlite IRC10, H+-muoto; Organo) ja sekoitettiin 1 tunti, jotta adsorptio pääsi tapahtumaan. Otettiin sitten 5 talteen adsorboitumaton fraktio.

(2) Ultrasuodatus

Ioninvaihdossa saatu adsorboitumaton fraktio ultrasuodatettiin käyttämällä sekoitustyyppistä ultrasuodatuslaitteistoa (Advantec; Malli YHP 90K) ja ultrasuodatuskalvoa (Advantec; UIIH-1; fraktion molekyylimassa 1 000) ja otet-10 tiin suodos talteen.

(3) Käänteisfaasikromatografia (hapan) (kuvio 2)

Laitteisto: suurtehonestekromatografi (SHIMADZU CORP.; Malli LC-10A)

Kolonni: SuperPac Pep-S, 15 pm, 22,5 x 250 mm (PHARMACIA K.

15 K.)

Liikkuva faasi: 0,1 % trifluorietikkahappoa sisältävä vesipitoinen asetonitriililiuos; lineaarinen asetonitriilipitoisuusgradientti 2-35 %; asetonitrii-lipitoisuutta muutettiin nopeudella 1 %/min.

Virtausnopeus: 5 ml/min 20 Lämpötila: 40 °C

Detektointi: UV-absorptio, 220 nm Preparatiivinen viipymisaika: fraktio A: 39,9 - 40,9 min , ’ fraktio A' (sekvenssi numero 1): 53,8 - 54,5 min : · 25 (4) Käänteisfaasikromatografia (neutraali) (kuvio 3) ,, Laitteisto: suurtehonestekromatografi (SHIMADZU CORP.; Malli ·. LC-10A)

Kolonni: SuperPac Pep-S, 15 pm, 22,5 x 250 mm (PHARMACIA K.

K) 30 Liikkuva faasi: vesipitoinen asetonitriililiuos, joka sisältää 20 mmol/l ammoniumasetaattipuskuria (pH 6,5); lineaarinen asetonitriilipitoisuusgradientti : 0 - 25 %; asetonitriilipitoisuutta muutettiin nopeudella 0,5 %/min.

: Virtausnopeus: 5 ml/min

Lämpötila: 40 °C

35 Detektointi: UV-absorptio, 220 nm > » 11

Preparatiivinen viipymisaika: fraktio B: 41,7 - 43,2 min (Val-Thr-Leu) fraktio C: 45,8 - 51,0 min (Val-Tyr-Pro).

Esimerkki 2 5 Veren TG-tason kohoamista estävien peptidien kvantitatiivinen määrittäminen

Referenssiesimerkissä saadun globiiniproteolysaatin sisältämien sellaisten peptidifraktioiden kvantitatiivinen määrittäminen, joilla on veren TG-tason kohoamista estävä aktiivisuus, toteutettiin noudattamalla esimerkissä 1 10 kuvattua vaikuttavien peptidien puhdistusmenettelyä.

Happohydrolyysi

Lisättiin 1 ml HCI-liuosta (loppupitoisuus 6 ekv/l) 3-5 mg:aan proteiinia koeputkessa, joka suljettiin normaalipaineen alaisena ninhydriinimene-telmän ollessa kyseessä ja alipaineisena aminohappoanalyysiä varten. Putkea 15 kuumennettiin sitten 22 tuntia lämpötilassa 110 °C.

Ninhydriinimenetelmä Näytteen pH säädettiin hydrolysoinnin jälkeen arvoon 5,0 nat-riumhydroksidilla ja näytteen annettiin sitten reagoida sitraattipuskuriin (0,2 : mol/l, pH 5,0) liuotetun ninhydriinireagenssin kanssa 15 min lämpötilassa : 20 110 °C. Mitattiin absorbanssi allonpituudella 570 nm. Toteutettiin erikseen nin- hydriinireaktio standardiliuoksina toimiville vesipitoisille L-leusiiniliuoksille (0,75, 150, 225 ja 300 nmol/ml). Muodostettiin kai i b roi nti käy rät mitatuista absorbans-siarvoista ja laskettiin näytteessä olevien aminoryhmien määrä L-leusii-niekvivalentteina.

25 Peptidikartta ; Laitteisto: suurtehonestekromatografi (SHIMADZU CORP.; Malli : LC-6A)

Kolonni: Shim-pack ISC-07/S1504 Na, 7 pm, 4,0 x 150 mm (SHIMADZU CORP.)

30 Eluointiliuote: Amino Acid Mobile Phase Kit (Na-tyyppi) (SHIMADZU

: CORP.) 116660 12

Virtausnopeus: 0,3 ml/min Lämpötila: 55 °C

Reaktioliuos 1: Analysis Kit Opa Reagent (SHIMADZU CORP.) Detektointi: Fluoresenssiabsorptio (eksitaatio 348 nm, emissio 5 450 nm).

Standardiliuos

Standardiliuoksena käytetty Amino Acid Mixed Standard Solution Included 18 Components H-type (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) laimennettiin suhteessa 1:25 sitraattipuskurilla (0,2 mol/l, pH 2,20) ja käytettiin 10 10 μΙ tätä liuosta (kutakin aminohappoa 1 nmol/10 μΙ).

Näyteliuos

Happohydrolysoitu liuos konsentroitiin, kuivattiin ja saatettiin kakun muotoon käyttämällä pyöröhaihdutinta ja kuivattiin edelleen alipaineessa yli 12 tuntia HCI:n poistamiseksi siten täydellisesti. Tuloksena oleva kakku liuotettiin 15 sitten sitraattipuskuriin (0,2 mol/l, pH 2,20), niin että kunkin aminohapon pitoisuudeksi tuli noin 100 nmol/ml. Aminohappojen identifiointi ja huippujen alle jäävien pinta-alojen laskeminen tehtiin Chromatopack C-R4A:lla (SHIMADZU CORP.). Aminohapon määrä määritettiin vertaamalla standardiliuokseen. Aminohappokoostumus laskettiin yksittäisten aminohappojen suhteesta saatuun • 20 kokonaisaminohapposisältöön.

Tulokset esitetään saantoina edellä olevassa taulukossa 1.

Esimerkki 3 H-Val-Thr-Leu-OH:n valmistus kemiallisella synteesillä H-Val-Thr-Leu-OH syntetisoitiin SAM2-peptidisynteesilaitteella (Bio-' 25 search) kyseisen laitteen käyttöohjeiden mukaisesti. Lyhyesti esitettynä edellä mainitun peptidisynteesilaitteen reaktoriin laitettiin 2 g asyylioksimetyylihartsia, : johon oli kytketty 0,3 mol/g kolmatta suojattua aminohappo Boc-Leu-OH, ja saatettiin se kosketukseen suojauksenpoistoliuoksen kanssa, joka sisälsi 45 i tilavuus-% trifluorietikkahappoa (TFA), 2,5 tilavuus-% anisolia ja 52,5 tila- 30 vuus-% dikloorimetaania (DCM), 20 min:n ajaksi Boc-ryhmän poistamiseksi. DCM:lla tehdyn pesun jälkeen hartsi neutraloitiin DCM:lla, joka sisälsi 10 tila-: vuus-% di-isopropyylietyleeniamiinia, ja pestiin uudelleen DCM:lla. Sen jälkeen 116660 13 hartsin annettiin reagoida 2 tuntia huoneenlämpötilassa 20 ml:n kanssa sekoituksen alaisena olevaa DCM-liuosta, joka sisälsi 4,0 mmol sekä Boc-Thr(Bz)-OH:a, di-isopropyylikarbodi-imidiä (6,7 kertaa teoreettinen ekvivalenttimäärä kumpaakin) että dimetyyliformamidia (DMF). Sitten hartsia pestiin vuorotellen 5 DMF:lla ja DCM:lla, jolloin saatiin Boc-Thr(Bz)-Leu-PAM-hartsi.

Boc-Val-OH kytkettiin noudattamalla samanlaista menettelyä.

Siten kytketyn suojatun peptidihartsin annettiin reagoida 1 tuntia lämpötilassa 0 °C vedettömässä vetyfluoridissa, joka sisälsi 10 tilavuus-% ani-solia. Sitten vetyfluoridi poistettiin tislaamalla ja hartsi pestiin eetterillä. Tulok-10 sena olevasta peptidien ja hartsin seoksesta uutettiin peptidit 50-prosenttisella etikkahapolla ja kylmäkuivattiin ne, jolloin saatiin noin 250 mg raakapeptidejä.

Raakapeptidit liuotettiin 0,1-prosettiseen TFA-liuokseen ja syötettiin sitten Octadecyl Silica (ODS) -kolonnille (Cosmosil 5C18, 250 x 20 mm; Nacalai Tesque) käyttämällä lineaarista asetonitriilipitoisuusgradienttia, jossa TFA-15 pitoisuus oli 0,1 % (20 - 70 %/50 min, 10 ml/min). Kiinnostuksen kohteena oleva peptidi eluoitui suunnilleen asetonitriilipitoisuudella 50 %.

Esimerkki 4

Aminohapposekvenssiltään sekvenssiä numero 1 vastaavan peptidin valmistus kemiallisella synteesillä 20 Peptidi, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposek- : venssi, syntetisoitiin edellä kuvatulla SAM2-peptidisynteesilaitteella (Βίοι search) kyseisen laitteen käyttöohjeiden mukaisesti. Lyhyesti esitettynä edellä ; mainitun peptidisynteesilaitteen reaktoriin laitettiin 2 g asyylioksimetyylihartsia, johon oli kytketty 0,3 mol/g seitsemättä suojattua aminohappo Boc-Thr(Bz)-25 OH, ja saatettiin se kosketukseen suojauksenpoistoliuoksen kanssa, joka sisälsi 45 tilavuus-% trifluorietikkahappoa (TFA), 2,5 tilavuus-% anisolia ja 52,5 tilavuus-% dikloorimetaania (DCM), 20 min:n ajaksi Boc-ryhmän poistamiseksi. DCM.IIa tehdyn pesun jälkeen hartsi neutraloitiin DCM:lla, joka sisälsi 10 tila-,: vuus-% di-isopropyylietyleeniamiinia, ja pestiin uudelleen DCM:lla. Sen jälkeen 30 hartsin annettiin reagoida 2 tuntia huoneenlämpötilassa 20 ml:n kanssa sekoituksen alaisena olevaa DCM-liuosta, joka sisälsi 4,0 mmol sekä Boc-Trp-OH:a, di-isopropyylikarbodi-imidiä (6,7 kertaa teoreettinen ekvivalenttimäärä kumpaakin) että DMF:a. Sitten hartsia pestiin vuorotellen DMF:lla ja DCM:lla, jolloin saatiin Boc-Trp-Thr(Bz)-PAM-hartsi.

116660 14

Boc-Pro-OH, Boc-Tyr(Brz)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Val-OH ja Boc-Leu-OH kytkettiin tässä järjestyksessä noudattamalla samanlaisia menettelyjä.

Sitten peptidit uutettiin edellä esimerkissä 3 kuvatulla tavalla ja kylmäkuivatuin, jolloin saatiin noin 500 mg raakapeptidejä. Nämä raakapeptidit 5 käsiteltiin ODS-kolonnissa edellä esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Kiinnostuksen kohteena oleva peptidi eluoitui suunnilleen asetonitriilipitoisuudella 30 %.

Esimerkki 5

Keksinnön mukaisia peptidejä sisältävien elintarvikkeiden valmistus 10 (1) Maitojauheen valmistus i. Lisättiin 100 g:aan pikkulapsille tarkoitettua maitojauhetta 0,1 g edellä esimerkissä 3 syntetisoitua peptidiä H-Val-Thr-Leu-OH ja valmistettiin siten maitojauhe, joka toimii veren TG-tasoa kohoamista estävästi.

ii. Lisättiin 100 g:aan pikkulapsille tarkoitettua maitojauhetta 0,1 g 15 edellä esimerkissä 4 syntetisoitua peptidiä, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposekvenssi, ja valmistettiin siten maitojauhe, joka toimii veren TG-tasoa kohoamista estävästi.

(2) Suklaan valmistus i. Lisättiin 100 g:aan suklaata 0,5 g edellä esimerkissä 3 syntetisoi-20 tua peptidiä H-Val-Thr-Leu-OH ja valmistettiin siten suklaa, joka toimii veren ’ ' TG-tasoa kohoamista estävästi.

ii. Lisättiin 100 g:aan suklaata 0,5 g edellä esimerkissä 4 synteti- \, ·’ soitua peptidiä, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposekvenssi, ;* ja valmistettiin siten suklaa, joka toimii veren TG-tasoa kohoamista estävästi.

25 Esimerkki 6

Yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä sisältävän rehun valmistus [''·[ Esimerkissä 3 syntetisoitua peptidiä H-Val-Thr-Leu-OH ja peptidiä, Ί’ jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposekvenssi, lisättiin yksi- 30 telien 1 % esiseokseen, joka sisälsi vitamiineja, kivennäisaineita jne. Kutakin tuloksena olevaa esiseosta lisättiin 10 paino-% kaupalliseen viljelykaloille tar-„ v. koitettuun rehuun ja valmistettiin siten viljelykaloille tarkoitettu rehu, joka toimii '. _ veren TG-tasoa kohoamista estävästi.

116660 15

Testiesimerkki 1

Veren TG-tasoa kohoamisen estoon tarkoitettujen syntetisoitujen aineiden vaikutus (in vivo)

Tutkittiin seerumin TG-tason kohoamista estävää vaikutusta in vivo 5 -lipidikuormituksen aikana käyttämällä kolmea keksinnön mukaista veren TG-tasoa kohoamista estävää peptidiä (ts. peptidiä, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposekvenssi, ja peptidejä Val-Thr-Leu ja Val-Tyr-Pro, jotka oli syntetisoitu esimerkissä 4 kuvatulla menetelmällä). Tässä kokeessa käytettiin terveitä albiinohiiriä (ikä 5-10 viikkoa; paino noin 20 - 30 g). Kullekin hii-10 relle annettiin suun kautta 250 mg oliiviöljyä ja edellä mainitun peptidin vesiliuosta. Kolmen tunnin kuluttua otettiin talteen verta hiiren ollessa nembutaali-anestesian alaisena. Kun verelle oli tehty erotus, määritettiin veren TG-taso. Tulokset esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2 15 Veren TG-tason määritys

Annos Veren TG-taso alenemisaste (%) (mg/hiiri) Proteo- Val-Tyr-Pro Val-Thr-Leu Sekvenssi lysaatti numero 1 20 MÖ* 14 MO-4 33 ·:·: 4-1 O'4 33 MO'3 65 v.: 0,1 39 30 25 0,2 50 33 1,0 50 73 2,5 69 76 " ' 5,0 79 79 : ·* 20 40 30 40 55 60 82 80 86 28 Ö34 Ö43 5,6-10"1 35 Ominais- ; ‘ aktiivisuus 1 82 65 50000 » [ Annos (mg/hiiri), jolla esto on 50 %.

! s : I > 16 116660

Tulokseksi saatiin, että kaikki keksinnön mukaiset peptidit estivät veren TG-tason kohoamista. Erityisesti peptidillä, jolla on sekvenssissä numero 1 esitetty aminohapposekvenssi, oli 50000-kertainen ominaisaktiivisuus proteolysaattipeptidiin nähden. Vaikka kahden muun peptidin ominaisaktiivi-5 suus oli noin 1/100 sekvessiä numero 1 vastaavan peptidin ominaisaktiivisuu-desta, niiden ominaisaktiivisuus oli toisaalta yli 50-kertainen proteolysaattipeptidiin nähden.

Testiesimerkki 2

Keksinnön mukaisten peptidien turvallisuuden testaus 10 Keksinnön mukaisia peptidejä (ts. peptidiä, jolla on sekvenssin nu mero 1 mukainen aminohapposekvenssi, ja peptidejä Val-Thr-Leu ja Val-Tyr-Pro) annettiin suun kautta ICR-uros-ja -naarashiirille vähintään 10 g/painokilo (suurin mahdollinen annos) erilaisissa suhteissa (0:1, 1:1, 1:0). Yhtään kuolemantapausta ei ilmennyt tämän seurauksena.

15 Teollinen käyttökelpoisuus Tämän keksinnön mukaisesti saadaan peptidi, joka estää veren triglyseriditason kohoamista, aine veren triglyseriditason kohoamisen estämiseksi, joka käsittää kyseistä peptidiä aktiivisena komponenttina, määriteltyyn terveyskäy-ttöön tarkoitettu elintarvike (niin kutsuttu fysiologisesti funktionaali-‘:···' 20 nen elintarvike), joka toimii veren triglyseriditason kohoamista estävästi, ja re- ,, ’: hu, joka toimii veren triglyseriditason kohoamista estävästi.

Tämän keksinnön mukaisesti tulee mahdolliseksi ehkäistä tai hoi-taa ihmisen tai eläimen liikalihavuutta ja hyperlipemiaa ja niihin liittyviä sy-. t dän-verisuonisairauksia, kuten kohonnutta verenpainetta ja arterioskleroosia.

. : ·. 25 Lisäksi tulee mahdolliseksi parantaa karjan ja viljelykalojen lihan laatua.

» 116660 17

Sekvenssilistaus SEKVENSSI NRO 1: SEKVENSSIN PITUUS: 7 SEKVENSSIN TYYPPI: aminohappo TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: peptidi SEKVENSSIN KUVAUS:

Leu Vai Vai Tyr Pro Trp Thr 1 5

Claims (10)

18 116660

1. Peptidin, jonka aminohapposekvenssi on Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, ja/tai peptidin Val-Tyr-Pro ja/tai peptidin Val-Thr-Leu käyttö aineen valmis- 5 tamiseksi, joka aine on tarkoitettu käytettäväksi veren triglyseridipitoisuuksien kohoamisen estämiseksi.

2. Peptidin, jonka aminohapposekvenssi on Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, käyttö yhdessä peptidin Val-Tyr-Pro ja/tai peptidin Val-Thr-Leu kanssa aineen valmistamiseksi, joka aine on tarkoitettu käytettäväksi veren triglyseridipi- 10 toisuuksien kohoamisen estämiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että aine käsittää peptidin, jonka aminohapposekvenssi on Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että aine on tarkoitettu käytettäväksi liikalihavuuden, hyperlipidemian tai näihin liitty- 15 vän sydänverisuonitaudin hoitoon.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että sydänverisuonitauti on verenpainetauti tai arterioskleroosi.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että aine on terveyselintarvike tai eläimen rehu.

7. Terveyselintarvike, joka pystyy estämään veren triglyseridipitoi- suuksen kohoamista, tunnettu siitä, että se käsittää peptidiä, jonka amino-i happosekvenssi on Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, tai mainittua peptidiä yhdistel- : ': mänä peptidin Val-Tyr-Pro ja/tai peptidin Val-Thr-Leu.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen terveysruoka, tunnettu sii- :. 25 tä, että se on maito, vanukas, curry, hakkelus, muhennos, lihakastike, kinkku, kakku tai suklaa.

9. Eläimen rehu, joka pystyy estämään veren triglyseridipitoisuuksen kohoamista, tunnettu siitä, että se käsittää peptidiä, jonka aminohapposekvenssi on Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, tai mainittua peptidiä yhdistelmänä pep- ; : 30 tidin Val-Tyr-Pro ja/tai peptidin Val-Thr-Leu.

.·’ 10. Ei-terapeuttinen menetelmä karjan tai viljelykalojen lihan laadun . ..: parantamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä karjalle tai kaloille syöte- .,,,; tään patenttivaatimuksen 9 mukaista eläimen rehua. * » 116660 19