KR19990028359A

KR19990028359A - 혈중 트리글리세리드의 농도상승을 억제하는 펩티드 및 활성성분으로서 펩티드를 함유한 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제제

Info

Publication number: KR19990028359A
Application number: KR1019970709674A
Authority: KR
Inventors: 교이찌 까가와; 찌주꼬 후꾸하마; 히사꼬 마쓰타까; 토요오 나까무라; 마사히로 누마타; 시게아끼 와타나베; 까주히사 혼다
Original assignee: 이또 겐이찌; 이또함 가부시키가이샤; 오자끼 겐따로; 한뀨 교에이 부싼 가부시끼가이샤
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1999-04-15
Also published as: FI974601A; FI974601A0; ES2238682T3; DK0838474T3; EP0838474A1; EP0838474B1; AU2753295A; EP0838474A4; AU708938B2; ATE292142T1; WO1997000890A1; KR100262468B1; FI116660B

Abstract

본 발명은 서열 목록에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 활성성분으로서 상기 펩티드, 펩티드 Val-Thr-Leu 및/또는 펩티드 Val-Thr-Pro를 함유한 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제제; 활성성분으로서 이들 펩티드를 함유함으로써 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제기능이 부여된 특정 건강식품; 활성성분으로서 이들 펩티드를 함유함으로써 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제기능이 부여된 사료에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 사람 및 동물의 비만이나 및 고지방혈증과 고혈압이나 그와 관련된 동맥경화증과 같은 심장혈관성 질환을 방지 또는 치료할 수 있다. 또한 가축 및 부화 어류의 육질을 개선할 수 있다.

Description

혈중 트리글리세리드의 농도상승을 억제하는 펩티드 및 활성성분으로서 펩티드를 함유한 혈중 트리글리세리드의 농동상승 억제제

지방이나 설탕을 과도하게 섭취하면 비만, 고지방혈증 등을 일으키는 원인이 됨은 알려져 있는 사실이다. 고지방혈중의 트리글리세리드(이하, "TG"라 하 하기도 한다) 온도상승은 고혈압 및 동맥경화증과 같은 장애를 가져오는 원인이 된다고 한다. 따라서 비만이나 고지방혈을 개선하기 위해 혈중 TG농도의 상승을 억제하기 위한 많은 시도가 있었다.

현재, 혈중 TG의 농도상승을 억제하기 위해서 식이요법, 식이식품(식이섬유등)의 섭취 및 각종 약품의 투여가 실행되고 있다. 그와 같은 약품으로서는, 혈중의 리포단백질 리파제활성을 촉진시키는 덱스트란 설페이트, 지질 흡수를 억제하는 니코몰, 지질대사 개선제인 클로피브레이트 및 프라바스타틴 등이 사용되고 있다.

그러나 식이요법은 이를 실시하는 사람들에게 고통을 주며, 상기 약품의 투여에 의해 생기는 부작용도 또한 염려된다. 따라서 혈중 TG의 농도상승을 억제하는 것 보다 강한 효과를 가지며, 부작용을 일으킬 염려가 없는 혈중 TG 농도상승 억제제의 개발이 요구되고 있다.

한편 현재로서는, 가축이나 부화 어류의 성장을 촉진하기 위해서 농축 사료 등을 투여하고 있다. 그 결과, 이와 같은 가축이나 어류에는 지질대사의 이상이 생겨서, 그 혈중 TG의 농도가 상승하는 경향이 있다. 이와 같은 혈중 TG 농도의 상승때문에, 가죽이나 부화 어류의 지방 함유량이 많아진다. 따라서 그러한 가축이나 어류를 먹으면 지방을 과도하게 섭취하게 된다. 더욱이 그러한 가축이나 어류는 소비자의 미각을 만족시키기가 점점 어렵게 된다. 또한 상기한 지방의 함유량 증가는 사료의 낭비문제와 관계가 있고, 또한 도살체에 붙여있는 지방의 처리문제와 관계가 있는 심각한 쟁점이 된다. 따라서 혈중 TG의 농도상승 억제는 시급한 과제이며, 특히 일본의 목축업 및 어업계에서 그렇다.

최근에 와서, 본 발명자들중의 한 사람을 포함한 몇몇 연구자들이 개발한 올리고펩티드 함유물질을 특허출원하였으며(국제공개 No. WO89/06970), 또 이와 유사한 기술이 일본국 특허출원 공개공보 평2-154693호에 개시되어 있다.

또한 특정 올리고펩티드는 혈중 TG 농도상승의 억제를 포함한 지질대사의 개선효과를 갖는다는 것이 명백해졌다(Kyoichi Kagawa, Food Chemical Monthly, 6:80(1990); Chizuko Fukuhama et al., FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, 97:38(1991)).

본 발명은 혈중 트리글리세리드의 농도상승을 억제하는 신규의 펩티드; 활성 성분으로서 펩티드를 함유한 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제제; 혈중 트리글리세리드 농도상승 억제기능이 부여된 특정 건강식(소위 생리학적 기능식); 및 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제기능이 부여된 사료(feed)에 관한 것이다.

본 발명의 혈중 트리글리세리드 농도상승을 억제제를 투여하여 지방혈을 정화함으로써, 고혈압이나 그와 관련된 동맥경화증과 같은 심장혈관성 질환뿐만 아니라 사람 및 동물의 비만 및 고지방혈증을 방지 또는 치료할 수 있다. 또한 가축 및 부화 어류의 육질을 개선할 수 있다.

도 1은 글로빈 프로테올리세이트의 겔 크로마토그램.

도 2는 실시예 1의 역상(산성) 크로마토그램.

도 3는 실시예 1의 역상(중성) 크로마토그램.

상기 특허 공보 등에 개시되어 있는 올리고펩티드 함유물질은 프로테올리세이트의 혼합물이지만, 그 정확한 활성성분의 아미노산 서열(즉 그 활성성분인 펩티드)은 아직 밝혀진 바가 없다.

이는 상기 펩티드 함유물질이 약품으로서는 순도가 낮다는 것을 의미한다. 또한 이와 같은 물질이 식품에 배합되면, 이 물질의 양을 식품에 함유된 다른 펩티드의 양과 구별하여 구하기가 어려워짐으로써, 품질관리에 대한 문제가 발생한다.

따라서 상기 펩티드 함유물질의 정확한 활성성분, 즉 혈중 TG의 농도상승을 억제하는 활성성분인 펩티드를 규명할 필요가 생긴다.

본 발명의 목적은 활성성분인 상기 펩티드의 아미노산 서열을 분석하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 활성성분으로서 상기 펩티드로 된 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제제; 혈중 트리글리세리드 농도상승을 억제기능이 부여된 생리학적 기능식품; 및 혈중 트리글리세리드 농도상승의 억제기능이 부여된 사료를 제공하는 데 있다.

상기 과제의 해결책에 대한 집중적이고 광범위한 연구의 결과, 본 발명자 등은 상기 과제가 하기와 같은 발명에 의해 해결될 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 대상물은 다음과 같다.

(1) SEQ ID NO:1로 나타낸 아미노산 서열의 펩티드.

(2) 활성성분으로서 SEQ ID NO:1로 나타낸 아미노산 서열의 펩티드 및/또는 펩티드 Val-Tyr-Pro 및/또는 펩티드 Val-Thr-Leu를 함유한 혈중 트리글리세리드 농도상승 억제제.

(3) 활성성분으로서 SEQ ID NO:1로 나타낸 아미노산 서열의 펩티드 및/또는 펩티드 Val-Tyr-Pro 및/또는 펩티드 Val-Thr-Leu가 배합된 상기 펩티드를 함유함으로써, 혈중 트리글리세리드의 농도상승을 억제하는 기능이 부여된 특정 건강식품.

(4) 활성성분으로서 SEQ ID NO:1로 나타낸 아미노산 서열의 펩티드 또는 펩티드 Val-Tyr-Pro 및/또는 펩티드 Val-Thr-Leu가 배합된 상기 펩티드를 함유함으로써, 혈중 트리글리세리드의 농도상승을 억제하는 기능이 부여된 사료.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

활성성분으로서 SEQ ID NO:1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 펩티드와 본 발명의 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제제에 함유되어 있는 펩티드 Val-Tyr-Pro 및 Var-Thr-Leu(이하, "본 발명의 펩티드"라 한다)는 자연발생의 단백질로부터 분리, 정제할 수 있다. 상기 대신에 종래의 방법에 의해 직접 화학적으로 합성할 수 도 있다. 또한 상기 펩티드 서열에 대응하는 염기 서열의 유전자를 처리하고, 이 유전자를 적절한 형질발현 벡터(expression vector)에 주입하여, 이 유전자를 적당한 숙주내에 발현시킴으로써 본 발명의 펩티드를 제조할 수도 있다.

A. 이하, 자연발생의 단백질로부터 상기 펩티드를 분리, 정제하는 방법을 설명한다.

본 발명의 펩티드를 제조하기 위한 개시물질로서는 광범위한 종류의 단백질을 사용할 수가 있다. 예를 들어 어육 단백질, 어류 분말, 글로빈 등의 동물성 단백질 또는 맥아 글루텐, 콩 카제인 등의 식물성 단백질을 사용할 수가 있다.

이들 단백질 중에서도 헤모글로빈, 미오글로빈 등의 글로빈 단백질이 혈중 TG의 농도상승 억제효과를 강력하게 발현할 수 있는 점에서, 특히 바람직하다.

그와 같은 글로빈 단백질의 원천이 되는 동물의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 소, 돼지, 양, 인간, 말 등의 혈액을 사용할 수가 있다.

다음에 상술한 단백질을 가수분해한다. 이 가수분해 처리는 상기 국제공개 No. WO89/06970에 기재된 방법에 따라 행한다. 가수분해용의 가수분해 효소로서는 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 또는 알카리성 프로테아제 중에서 선택한 하나 이상의 가수분해효소를 사용할 수가 있다.

글로빈 단백질의 가수분해에서 채책할 조건 등을 다음에 설명한다.

먼저 글로빈 단백질 함유물질을 고체 함량이 5∼30중량%가 되도록 물에 분산한다. 다음에 이 혼합물의 pH를 산 또는 알칼리로 조정하여, 프로테아제에 최적의 pH가 되도록 한다. 그 후에 프로테아제를 이 혼합물에 한꺼번에 또는 점차로 첨가하여 20∼70℃에서 3∼48시간 반응시킴으로써 가수분해를 설시한다.

이어서 생성된 단백질 가수분해물(protelysate)을 그대로 또는 카르복시메틸셀루로즈 또는 덱스트린 등의 충전제의 적량을 첨가한 후에 건조, 응결시킨다. 이렇게 하여 혈중 TG의 농도상승 억제효과를 갖는 단백질 가수분해물을 얻을 수가 있다.

이 단백질 가수분해물은 본 발명의 펩티드를 적어도 0.1중량% 함유한다.

이어서 본 발명의 효소처리된 단백질 가수분해물을 정제한다. 이와 같은 정제에는 종래의 정제방법을 채택할 수가 있다.

예를 들어 이온교환, 한외여과, 역상 크로마토그래피 등을 적절히 조합하여, 원하는 펩티드를 함유한 유분을 정제한다.

이온교환 또는 한외여과에 의한 처리는 반드시 필수적인 것은 아니지만, 이것들은 분리 및 정제의 정도를 향상시키기 때문에, 분리 및 정제공정에 도입하는 것이 바람직하다.

유분은 산성 조건하에서의 역상 크로마토그래피와 중성 조건하에서 역상 크로마토그래피를 조합함으로써 분리 및 정제할 수가 있다. 유분 중의 원하는 펩티드 양은 단백질 함량을 구하는 공지의 방법, 예를 들어 닌하이드린 방법에 의해 구할 수가 있다.

이렇게 선택된 유분의 아미노산 서열은 공지의 방법에 의해 동정할 수 있으므로, 본 발명의 펩티드의 존재를 확인할 수가 있다.

이렇게 분리된 유분으로부터 유도된 본 발명의 펩티드는 혈중 TG의 농도상승 억제제의 활성성분으로서 사용할 수가 있다.

또한, 유분 그 자체는 상기 억제제의 활성성분으로서 직접 사용할 수가 있다.

본 발명의 펩티드는 종래의 펩티드 합성방법에 의해 화학적으로 합성할 수가 있다. 예를 들어 아지드 방법, 산 염화물 방법, 산 무수물 방법, 혼합 산 무수물 방법, DCC 방법, 활성 에스테르 방법, 카르보미다졸 방법, 산화-환원 방법, DCC-첨가(HOMB, HOBt, HOSu) 방법(예를 들어, Schreder & Luhke, The Pepeide, Vol. 1(1966), Academic Press, New York, USA; 또는 Izumiya et al., Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975) 참조)) 등을 들 수가 있다.

상기에 열거한 펩티드 합성방법에서는 고상 합성 또는 액상 합성의 어느 것이든 채택할 수가 있다.

이와 같은 펩티드 합성방법 중에서는 티로신, 트레오닌 등의 측쇄 기능기를 갖는 아미노산이 그 측쇄 기능기의 보호면에서 바람직하다. 보호기로서는 벤질록시카르보닐기(Cbz-), t-부톡시카르보닐기(Boc-), 벤질기(Bz-), 등의 공지의 보호기를 사용할 수가 있다.

이와 같은 보호기의 탈블록킹(deblocking)은 본 발명의 펩티드 합성공정중 종래의 방법에 의해 실시할 수가 있다.

B. 혈중 TG의 농도상승 억제제는 본 발명의 펩티드를 활성성분으로서 사용하여 제조할 수가 있다.

혈중 TG의 농도상승 억제제의 담체로서는 제제의 사용형태에 따라 제제를 제조할 때 종래로부터 사용되어 온 부형제(충전제, 증량제, 결합제, 가습제, 붕괴제, 계면활성제 등) 또는 희석제를 사용할 수가 있다. 제제의 형태는 제제가 본 발명의 펩티드를 효과적으로 함유하는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 정제, 분말, 미립, 환약 등의 고형제와 같은 제제이거나; 또는 용액, 현탁액, 유제 등의 주사제와 같은 제제이어도 된다. 상기 대신에 본 발명의 제제는 사용전에 적절한 담체를 첨가함으로써 액체 형태로 할 수 있는 건조물의 형태를 취할 수도 있다. 이러한 형태 중의 어느 것이든 종래의 방법에 따라 제조할 수가 있다.

이렇게 하여 얻어진 혈중 TG의 농도상승 억제제의 투여량은 제제 투여의 방법 및 형태, 피투여 환자의 상태 등에 따라 적당히 선택한다.

일반적으로 본 발명의 펩티드를 약 0.001∼80중량% 함유한 제제를 제조하여, 본 발명의 펩티드량이 성인 한 사람당 하루 약 1∼100mg이 되도록 제제를 투여하는 것이 바람직하다. 반드시 하루에 한번 투여할 필요는 없으며, 하루에 3∼4회 투여할 수도 있다.

상술한 바와 같은 여러가지 형태의 제제약품은 형태에 따라 적장한 투여경로를 통해 투여할 수가 있다. 예를 들어 주사제 형태의 제제는 정맥, 근육, 피하, 피내 또는 복막 등을 통해 투여할 수 있고, 고형제 형태의 제제약품은 구강 등을 통해 투여할 수가 있다.

C. 혈중 TG의 농도상승 억제기능이 부여된 특정 건강식(소위 생리학적 기능식)은 활성성분으로서 본 발명의 펩티드를 사용하여 제조할 수 있다. 또 본 발명의 펩티드는 일반식품의 식품 첨가물로서 사용할 수가 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강식은 우유, 푸딩, 카레, 해시, 스튜, 미트소스, 햄, 케이크, 초콜릿 등에 첨가할 수가 있다.

특히 본 발명의 펩티드의 맛은 유아가 직접 먹기에는 힘드므로, 우유를 사용해서 펩티드의 섭취를 용이하게 하는 것이 바람직하다. 또한 본질적으로 비만을 촉진시키는 케이크, 초콜릿 등의 식품에 본 발명의 펩티드를 첨가하면, 상기 음식을 섭취함으로써 생기는 비만을 방지할 수 있다는 점에서 바람직하다.

생리학적 기능식에 첨가하는 본 발명의 펩티드량은 식품의 종류, 첨가의 목적, 식품의 섭취로 인해 생길 효과 등에 따라 적절히 선택한다.

일반적으로 본 발명의 펩티드 약 0.1∼4mg가 한 식사때 마다 섭취될 수 있도록, 본 발명의 펩티드를 식품에 포함시키는 것이 바람직하다.

D. 가축 등의 혈중 TG의 농도상승 억제기능이 부여된 사료는 활성성분으로서 본 발명의 펩티드를 사료와 배합하여 제조할 수가 있다.

본 발명의 펩티드가 배합된 사료는 소, 돼지, 닭 등의 가축용 사료 또는 시브림(sea bream), 노란꼬리 새끼(young yellowtails) 등의 부화어용 사료로 사용할 수가 있다.

사료와 배합된 본 발명의 펩티드량은 사료의 종류, 사료의 섭취로 인해 생길 효과 등에 따라 적당히 선택한다.

일반적으로 본 발명의 펩티드는 사료당 0.1∼4중량%의 비율로 사료와 배합하는 것이 바람직하다.

다음에 본 발명을 하기 실시예 등을 참조하여 구체적으로 설명하거니와, 이들이 본 발명의 기술적 범위를 제한하는 것으로 해석되는 것은 아니다.

참고예

글로빈 프로테올리세이트의 제조

하기에 소의 적혈구를 사용하여 글로빈 프로테올리세이트의 제조 방법을 상세히 설명한다. 글로빈 프로테올리세이트 생성물의 분자량 분포를 겔여과 크로마토그래피(도 1)로 검사하였다.

겔 여과 크로마토그래피는 하기 각 조건하에서 실시하였다.

장치: 고성능 액체 크로마토그래피(SHIMADZU CORP.; Model LC-6A)

컬럼: PolyHYDROXYETHYL A, 5㎛, 9.4×200mm(polyC Inc.)

이동상: 50mM 포름산

유속: 0.5㎖/분

검출: UV 흡수(221nm)

소의 신선한 적혈구 100kg에 물 250리터를 첨가하여 충분히 용혈하였다. 인산으로 pH를 2.8로 조정한 후, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)로부터 산프로테아제 2.6×10⁷단위를 용액에 첨가하고, 50℃에서 3시간 반응시켰다.

상기 반응후에, 반응액을 80℃에서 30분간 가열하여 반응을 종료하였다. 그 후에 수산화칼슘의 수성 현탁액을 반응액에 첨가하여 pH를 6.5로 조정하였다. 다음에 규조토 10kg을 첨가하여, 필터 프레스로 여과하였다. 생성한 여액을 분무건조하여 글로빈 프로테올리세이트 23kg을 분말형태로 얻었다.

실시예 1

혈중 TG의 농도상승 억제 펩티드의 분류 및 정제

본 발명의 펩타이드를 (1) 이온교환, (2) 한외여과, (3) 산성 조건하의 역상 크로마토그래피에 의해 분리 및 (4) 중성 조건하의 역상 크로마토그래피에 의한 분리 등의 공정에 의해 얻었다.

이들 공정후의 회수율을 표 1에 나타낸다. 단백질의 양은 난히드린 방법에 의해 구하였다.

[표 1]

글로빈 프로테올리세이트로부터의 에디포사이트 분화 억제 펩티드의 회수율

(1) 이온교환

글로빈 프로테올리세이트의 수용액 10중량%를 약산성 양이온 교환수지(Amberlite IRC50, H⁺형태: 유기)에 첨가하고, 1시간동안 교반하여 흡착시켰다. 그 후에 비흡착 유분을 얻었다.

(2) 한외여과

상기 이온교환에 의해 얻어진 비흡착 유분을 교반형 한외여과장치(Advantec; Model UHP 90K)와 한외여과막(Advantec; UIIH-1; 유분 분자량: 1000)을 사용하여 한외여과하여, 여액을 수집하였다.

(3) 역상(산성) 크로마토그래피(도 2)

장치: 고성능 액체 크로마토그래프(SHIMADZU CORP.; Model LC-10A)

컬럼: SuperPac Pep-S, 15㎛, 22.5×250mm(PHARMACIA k.k.)

이동상: 트리플루오로아세트산 0.1% 함유의 수성 아세토니트릴액; 선형 농도구배 2∼35% 아세토니트릴; 아세토니트릴 농도는 1%/분의 속도로 변경하였다.

유속: 5㎖/분

온도: 40℃

검출: UV 흡수 220nm

제조시간: 유분 A: 39.9∼40.9분

유분 A'(SEQ ID NO: 1); 53.8∼54.5분

(4) 역상(중성) 크로마토그래피(도 3)

장치: 고성능 액체 크로마토그래프(SHIMADZU CORP.; Model LC-10A)

컬럼: SuperPac Pep-S, 15㎛, 22.5×250mm(PHARMACIA k.k.)

이동상: 20mM 암모늄 아세테이트 버퍼(pH6.5) 함유의 수성 아세토니트릴액; 선형 농도구배 2∼35% 아세토니트릴; 아세토니트릴 농도는 0.58%/분의 속도로 변경하였다.

유속: 5㎖/분

온도: 40℃

검출: UV 흡수 (220nm)

제조시간: 유분 B: 41.7∼43.2분(Val-Thr-Leu)

유분 C: 45.8∼51.0분(Val-Tyr-Pro)

실시예 2

혈중 TG의 농도상승 억제 펩티드의 정량 결정

참고예에서 얻은 글로빈 프로테올리세이트내의 혈중 TG의 농도상승을 억제하는 활성을 갖는 펩티드 유분의 정량 결정은 실시예 1의 활성 펩티드의 정제방법에 따라 실시하였다.

산 가수분해

최종 농도를 6 N HCl의 1 밀리미터 시험관 내의 단백질 3∼5mg을 첨가하고, 닌히드린 방법의 대기압하 및 아미노산 분석 목적을 위한 감압하에서 밀봉하였다. 그 후에 시험관을 110℃에서 22시간 가열하였다.

닌히드린 방법

가수 분해 후에 시료의 pH를 가성 소다로 5.0으로 조정하고 나서, 시료를 110℃에서 15분동안 0.2M 구연산염 버퍼(pH 5.0)에 용해된 니히드린 시약과 반응시켰다. 570nm에서 흡수율을 측정하였다. 별도로 수성 L-로이신액(0.75, 150, 225, 300nmol/ml)을 표준액으로 하여 닌히드린 반응시켰다. 측정한 흡수율로부터 교정 곡선을 얻어서, L-로이신과 당량인 시료내의 아미노기의 양을 산축하였다.

펩티드 맵

장치: 고성능 액체 크로마토그래프(SHIMADZU CORP.; Model LC-6A)

컬럼: Shim-pack ISC-07/SI504 Na, 7㎛, 4.0×150mm(SHIMADZU CORP.)

용출용제: SHIMADZU CORP.제, 아미노산 이동상 키트(Na 형)

유속: 0.3㎖/분

온도: 55℃

반응액 1: SHIMADZU CORP.제, 분석 키트 OPA 시약

검출: 형광 흡수(Ex 348nm, Em 450nm)

표준액

표준액인 18성분 H형이 포함된 아미노산 혼합 표준액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 0.2M 시트레이트 버퍼(pH 2.20)로 1:25로 희석하고, 이 희석액 10μl을 공급하였다(각 아미노산: 1nmol/10μl).

시료 용액

산 가수분해된 용액을 로터리 증발기를 사용하여 농축, 건조 및 응결하고, 감압하에서 12시간 이상 더 건조하여 HCl을 완전히 제거하였다. 그 후에 생성한 응결물을 0.2M 시트레이트 버퍼(pH 2.20)에 용해하여 각 아미노산의 함유량이 약 100nmol/ml이 되도록 하였다. 아미노산의 동정 및 피크 영역의 산출은 Chromatopack C-R4A(SHIMADZU CORP.)으로 실시하였다. 아미노산의 양은 표준액의 양과 비교하여 구하였다. 아미노산의 조성은 얻어진 총 아미노산의 함유량에 대한 개별 아미노산의 비율로부터 산출하였다.

그 결과를 상기 표 1에서 수율로서 나타냈다.

실시예 3

화학 합성에 의한 H-Val-Thr-Leu-OH의 제조

H-Val-Thr-Leu-OH를 SMA2 펩티드 합성제(Biosearch)와, 이 합성제의 포로토콜에 따라 합성하였다. 그램당 제3아미노산 보호된 Boc-Leu-OH 0.3mmol이 결합된 아실록시메틸 수지 2g을 상기 펩티드 합성제의 반응기에 재치하고, 45%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA), 2.5%(v/v) 아니솔 및 52.5%(v/v) 메틸렌 클로라이드(DCM)를 함유한 탈블록킹 용액과 20분간 접촉시켜서, Boc기를 제거하였다. DCM으로 세정한 후에, 수지를 10%(v/v) 디이소프로필에틸렌아민을 함유한 DCM으로 중화하고 나서, DCM으로 더 세정하였다. 그 후에 수지를 Boc-Thr(Bz)-OH 및 디이소프로필카르보디아미드(각각 이론 당량의 6.7배) 각각 4.0mmol을 함유한 DCM 20ml와 디메틸 포르마미드(DMF)의 혼합액 내중 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후에 수지를 DMF와 DCM로 교대로 세정하여 Boc-Thr(Bz)-Leu-PAM 수지를 얻었다.

마찬가지 방법에 의해 Boc-Val-OH를 결합하였다.

이렇게 결합된 보호 펩티드수지를 10%(v/v) 아니솔 함유의 무수 불화수소 내에서 0℃로 1시간 반응시켰다. 다음에 불화수소를 유거하고, 수지를 에테르로 세정하였다. 펩티드와 수지의 생성 혼합물로부터 펩티드를 50% 초산으로 추출하고, 동결건조하여 조제 펩티드 약 250mg을 얻었다. 이 조제 펩티드를 0.1% TFA에 용해시킨 후에, 0.1 TFA를 함유한 아세토니트릴의 선형 농도구배로 옥타데실 실리카(ODS) 칼럼(Cosmosil, 5C₁₈, 250×20mm: Nacalai Tesuqe)에 공급하였다(20∼70%/50분, 10ml/분). 목적하는 펩티트는 아세토니트릴 농도 약 50%에서 용출하였다.

실시예 4

화학 합성에 의한 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 제조

SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 상기 SAM2 펩티드 합성제와, 이 합성제의 포로토콜에 따라 합성하였다. 그램당 제7아미노산 보호된 Boc-Thr(Bz)-OH 0.3mmol이 결합된 아실록시메틸 수지 2g을 상기 펩티드 합성제의 반응기에 재치하고, 45%(v/v) 트리플루오로아세틱산(TFA), 2.5%(v/v) 아니솔 및 52.5%(v/v) 메틸렌 클로라이드(DCM)를 함유한 탈블록킹 용액과 20분간 접촉시켜서, Boc기를 제거하였다. DCM으로 세정한 후에, 수지를 10%(v/v) 디이소프로필에틸렌 아민을 함유한 DCM으로 중화하고 나서, DCM으로 더 세정하였다. 그 후에 수지를 Boc-Thr-OH 및 디이소프로필카르보디이미드(각각 이론 당량의 6.7배) 각각 4.0mmol을 함유한 DCM 20ml와 디메틸 포르마미드(DMF)의 혼합액중 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후에 수지를 DMF와 DCM로 교대로 세정하여 Boc-TrP-Thr(Bz)-PAM 수지를 얻었다.

마찬가지 방법에 의해 Boc-Pro-OH, Boc-Tyr(BrZ)-OH, Boc-Val-OH 및 Boc-Leu-OH를 상기 순서대로 결합하였다.

이어서 펩티드를 상기 실시예 3에서 설명한 것과 마찬가지로 추출하고, 동결 건조하여 조제 펩티드 약 500mg을 얻었다. 이 조제 펩티드를 상기 실시예 3에서 설명한 것과 같이 ODS 칼럼에서 처리하였다. 목적하는 펩티드는 아세토니트릴 농도 약 30%에서 용출하였다.

실시예 5

본 발명의 펩티드를 함유한 식품의 제조

(1) 분말우유의 제조

i. 유아용 분말우유 100g에 상기 실시예 3에서 합성한 펩티드 H-Val-Thr-Leu-OH 0.1g을 첨가하여, 혈중 TG의 농도상승 억제기능을 갖는 분말우유를 제조하였다.

ii. 유아용 분말우유 100g에 상기 실시예 4에서 합성한 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 0.1g을 첨가하여, 혈중 TG의 농도상승 억제기능을 갖는 분말우유를 제조하였다.

(2) 초콜릿의 제조

i. 초콜릿 100g에 상기 실시예 3에서 합성한 펩티드 H-Val-Thr-Leu-OH 0.5g을 첨가하여, 혈중 TG의 농도상승 억제기능을 갖는 초콜릿을 제조하였다.

ii. 초콜릿 100g에 상기 실시예 4에서 합성한 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 0.5g을 첨가하여, 혈중 TG의 농도상승 억제기능을 갖는 초콜릿을 제조하였다.

실시예 6

본 발명의 펩티드를 함유한 사료의 제조

실시예 3에서 합성한 펩티드 H-Val-Thr-Leu-OH와 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 비타민, 미너럴 등을 함유한 예비 혼합물에 1중량%의 비율로 독립적으로 첨가하였다. 생성된 각 예비 혼합물을 부화 어류의 시판 사료품에 10중량%의 비율로 첨가하여 혈중 TG의 농도상승 억제기능을 갖는 사료를 제조하였다.

시험례 1

혈중 TG의 농도상승 억제 화학 합성제의 효과(생체 내의)

생체 내 지질 주입시의 혈장 TG의 상승 억제활성을, 혈중 TG의 농도상승을 억제하는 본 발명의 3종의 펩티드(즉 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 실시예 4에서 설명한 방법에 의해 합성한 펩티드 Val-Thr-Leu와 Val-Thr-Pro)에 대해 조사하였다. 이 실험에서는 건강한 백색 쥐(5∼10주령; 체중: 약 20∼30g)를 사용하였다. 각 쥐에게는 올리브유와 상기 펩티드의 수용액을 구강을 통해 투여하였다. 3시간 후에 마취하에 넴부탈(Nembutal)로 형액을 수집하였다. 혈액을 분리한 후에 혈중 TG의 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

결과로서 본 발명의 3종의 펩티드의 모두가 혈중 TG의 농도상승을 억제하였다. 특히 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 프로테올리세이트의 경우에 비해 50000배나 높은 특정 활성을 실현하였다. 한편 다른 2종의 펩티드의 특정 활성은 SEQ ID NO: 1의 펩티드에 비해 약 1/100배이었지만, 프로테올리세이트의 경우에 비해서는 50배 이상의 특정 활성을 가졌다.

시험례 2

본 발명 펩티드의 안전성 시험

본 발명의 펩티드(즉 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 펩티드 Val-Thr-Leu와 Val-Thr-Pro)를 여러 가지 비율(0:1, 1:1, 1:0)로 ICR 숫컷과 암컷의 쥐에 10g/kg체중 이상(최대 가능 투여량) 투여하였으나, 죽은 것이 없었다.

본 발명에 의하면, 혈중 트리글리세리드의 농도상승을 억제하는 펩티드; 활성성분으로서 펩티드를 함유한 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제제; 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제기능이 부여된 특정 건강식(소위 생리학적 기능식); 및 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제기능이 부여된 사료가 얻어진다.

본 발명에 의하면, 사람 및 동물의 비만이나 및 고지방혈증과 고혈압이나 그와 관련된 동맥결화증과 같은 심장혈관성 질환을 방지 또는 치료할 수 있다. 또한 가축 및 부화 어류의 육질을 개선할 수 있다.

서열 목록

SEQ ID: 1

서열 길이: 7

서열 종류: 아미노산

토폴로지: 선형

분자 종류: 펩티드

서열 분류: Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr

1 5

Claims

활성성분으로서 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 펩티드 Val-Thr-Leu 및/또는 펩티드 Val-Thr-Pro를 함유한 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제제.
활성성분으로서 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 펩티드와 펩티드 Val-Thr-Leu 및/또는 펩티드 Val-Thr-Pro를 배합한 것을 함유하는 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제기능이 부여된 건강식용 식품.
활성성분으로서 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 펩티드와 펩티드 Val-Thr-Leu 및/또는 펩티드 Val-Thr-Pro를 배합한 것을 함유하는 혈중 트리글리세리드의 농도상승 억제기능이 부여된 사료.