KR20050099746A

KR20050099746A - 가자미 프레임으로부터 분리한 가수분해물 및 이를함유하는 항고혈압 조성물

Info

Publication number: KR20050099746A
Application number: KR1020040024925A
Authority: KR
Inventors: 김세권; 정원교; 제재영; 김형진; 최양규
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2004-04-12
Filing date: 2004-04-12
Publication date: 2005-10-17
Also published as: KR100600578B1

Abstract

본 발명은 가자미 프레임으로부터 분리한 항고혈압 활성을 가지는 펩티드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 가자미 프레임으로부터 혈압조절에 관여하고 있는 인자 중의 하나인 ACE 활성을 저해하는 항고혈압 활성을 가지는 펩티드를 분리하고 이를 유효성분으로 함유하는 항고혈압 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 항고혈압 활성을 가지는 펩티드를 함유하는 기능성 조미료에 관한 것이다.

Description

가자미 프레임으로부터 분리한 가수분해물 및 이를 함유하는 항고혈압 조성물{Composition for anti-hypertension containing hydrolysates from Yellowfin sole}

해양생물은 종의 다양성과 더불어 진화과정의 독자성 및 서식환경의 특이성이라는 요인에 의하여 기존의 육상생물이 보유·생산할 수 없는 화학물질 및 생체 분자들을 함유하고 있으며, 이들의 생합성·분해에 관여하는 특이한 신종효소(novel enzyme)와 보조인자(cofactor)들도 존재하고 있어서 신약물질과 새로운 생리기능성 물질의 소재로서 관심이 집중되고 있다. 더욱이 육상생물을 대상으로 활발히 진행되어 왔던 선도물질의 탐색 및 개발이 한계에 이르기 시작함에 따라 자연히 관심대상이 해양생물로 전환되었다. 미국, 일본, 호주, 영국, 프랑스, 독일 등과 같은 해양 선진국들에 의해서 현재까지 밝혀진 해양생물 유래의 항암, 항산화성, 항곰팡이성, 항균성, 항종양성, 항바이러스성, 항염증을 나타내는 약리활성 물질들이 이미 다수 보고되어져 있다.

또한 해양생물자원으로부터 식량자원의 생산에 관한 연구의 중요성도 점점 증가하고 있다. 특히, 수산가공식품의 소비가 증가함에 따라 어류가공의 부산물로 발생되는 어뼈, 어피, 어두(魚頭), 내장, 비늘 등과 같은 비가식부도 현저하게 증가되고 있다. 이들 어류가공잔사 부위는 전체 어체의 약 40∼70%를 차지하고 있다. 따라서, 어뼈는 칼슘원으로서, 어피는 단백질원으로서, 그리고 내장은 산업용 효소로서 활용하기 위한 고부가가치화 연구가 이루어지고 있다.

특히 최근에는 동식물 단백질을 각종 효소를 이용하여 가수분해시킨 가수분해물의 올리고펩티드를 분리정제하여 이들의 생리활성 검토에 관한 연구가 진행되고 있다. 이들 올리고펩티드는 혈압강하작용이 있는 것으로 밝혀지면서 피부노화방지 및 고혈압 등의 성인병 예방치료제로서 이용도 가능하다는 결과가 보고되고 있다. 현대인의 성인병으로서 가장 문제가 되고 있는 고혈압은 뇌졸중, 심근경색, 심부전증을 초래할 뿐만 아니라 동맥경화도 일으킨다(Jeong, 1994).

따라서, 고혈압 자체가 직접적인 증상을 나타내지는 않지만 혈압을 정상적으로 유지시키는 일은 성인병의 발병을 방지하는데 매우 중요한 일이다. 고혈압은 발병과 혈압의 유지에 많은 인자가 관여하기 때문에 지금까지 수많은 연구에도 불구하고 아직 그 기전이 완전하게 밝혀져 있지 않지만, 도 1과 같이 인체에서 혈압을 조절하는 기구인 레닌-안지오텐신계(Renin-angiotensin system, RAS)와 칼리크레인-키닌계(kallikrein-kinin system)의 항상성이 유지되지 않을 때 혈압조절에 문제가 생기는 것으로 알려져 있다(Saxena, 1992). 혈압이 낮아지거나 혈액 중의 Na⁺ 농도가 저하될 때에 신장으로부터 방출되는 레닌은 간장에서 생합성되어 혈중으로 방출되는 분자량 55∼60 kDa의 혈장 당단백질로 α-글로블린 분획인 레닌 기질(angiotensinogen)에 작용하여 데카펩티드(decapeptide)인 안지오텐신 Ⅰ(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)을 생성시킨다. 안지오텐신 Ⅰ은 생리활성을 가지지 않지만 주로 폐나 신장에 존재하는 분자량 150∼200 kDa인 안지오텐신 Ⅰ 전환 효소(angiotensin Ⅰ converting enzyme, ACE; peptidyldipeptide hydrolase, EC 3. 4. 15. 1)에 의하여 C-말단의 디펩티드(-His-Leu)가 절단되어 옥타펩티드(octapeptide)인 안지오텐신 Ⅱ(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)로 된다. 이 안지오텐신 Ⅱ는 강력한 혈관수축작용을 가지며, 부신피질(adrenal cortex)에서 알도스테론(aldosterone)의 분비를 촉진함으로써 물과 Na⁺의 배설을 억제시킨다.

이와 같이, 혈압조절에 관여하고 있는 인자 중의 하나인 ACE는 활성발현에 Zn²⁺과 Cl^-를 필요로 하는 메탈로펩티다아제(metallopeptidase ; Tadasa 등, 1990)로서 안지오텐신 I을 혈관수축 작용과 부신피질에서의 알도스테론 분비를 촉진시키는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시키는 과정에 관여할 뿐만 아니라, 혈관확장 작용을 갖는 브래디키닌(bradykinin)을 불활성화시켜 혈압을 상승시키는 역할을 한다(Ohkubo, 1991).

따라서, 고혈압의 원인 중의 하나인 ACE 활성을 저해하는 저해제의 탐색과 응용에 대한 연구가 진행되어, 1965년 브라질의 Ferreira(Ferreira, 1965)는 대형 독사(Bothrops jararaca)의 독액 중에 브래디키닌의 활성을 강화시키는 물질이 존재한다고 보고하였고, 1968년에는 동일한 독액의 추출물에서 ACE를 저해시키는 물질이 영국의 Vane에 의해 확인되었다(Bakhles, 1968). 그 당시 ACE 저해활성 펩티드와 브래디키닌의 활성을 강화시키는 펩티드가 동일한 물질이라는 사실을 밝히지 못한 것은 ACE와 브래디키닌의 분해효소인 키니나아제 Ⅱ(kininase Ⅱ)가 다르다고 생각했기 때문이었다. 그 후 뱀독을 재료로 하여 브래디키닌의 활성을 강화시키는 펩티드(Ferreira, 1970)와 ACE 저해활성 펩티드를 분리하여 구조결정(Ondetti, 1971)에 성공함으로써 동일한 펩티드인 테트로티드(tetrotide)가 얻어졌다. 뱀독으로 부터 분리한 테트로티드가 고레닌(renin)증 고혈압 환자뿐만 아니라 정상인에서도 현저한 혈압강하 작용이 밝혀짐으로써 ACE 저해제들이 고혈압 치료제로서의 개발 가능성이 제시되었다.

한편, Ondetti 등(1977)은 종래에 혈압강하제로 많이 사용된 강력한 경구용 ACE 저해제인 캡토프릴(Captopril; D-3-mercapto-2-methylpropanoyl-L-proline)을 개발하였다. 캡토프릴은 종래의 혈압강하제로는 치료되지 않던 심한 고혈압증에도 좋은 효과를 보였으며, 중추신경 또는 교감신경계에 작용하는 종래의 혈압강하제에서 문제가 되었던 여러가지 부작용이 발견되지 않았다. 그러나 단백뇨증 (proteinuria) 또는 무과립구증(agranulocytosis) 등의 치명적인 부작용이 문제점으로 대두되었으며, 이들 부작용들은 캡토프릴의 설프히드릴(sulfhydryl)기에 기인하는 것으로 추정되었다(Atkinson 등, 1980). 설프히드릴기를 갖지 않고 ACE 저해작용이 강력하면서 지속성이 뛰어난 에날라프릴(enalapril)이 합성되어 1984년에 미국에서 시판되었고, 이들 이외에도 알라세프릴(alacepril), 리시노프릴(lisinopril) 및 델라프릴(delapril) 등이 개발되었다. 그러나 이들 대부분은 부작용이 야기되어 이를 완전히 극복하기 위하여 캡토프릴 및 이들 유도체와 다른 구조를 갖는 ACE 저해물질을 단백질의 효소적 가수분해물로 부터 탐색하려는 연구가 일본을 비롯한 선진국에서 1990년대부터 활발히 이루어지고 있다.

ACE 저해활성 물질의 탐색에 있어서 단백질의 효소적 가수분해물로부터 분리한 펩티드류의 연구로서는 카제인(casein) 분해물(Maruyama 등, 1987), zein(Yano, 1996), 무화과 유액(Maruyama 등, 1989), 대두(Okamoto 등, 1995), 정어리육(Matsufuji 등, 1994), 가다랑어육(Kohama 등, 1991)과 내장(Fujii 등, 1993) 등이 있으며, 이들 가수분해물로부터 ACE 저해 펩티드를 분리하여 아미노산 배열을 밝히고, 이를 기초로 펩티드를 화학적으로 합성하여 ACE 저해효과에 미치는 펩티드들의 C-말단 및 N-말단 아미노산의 영향에 대하여 검토된 바 있다. 여러가지 디펩티드를 합성하여 ACE 저해효과에 미치는 펩티드들의 C-말단 및 N-말단 아미노산 잔기의 영향은 C-말단 아미노산 잔기로서 Try, Phe, Tyr 및 Pro을, N-말단 아미노산 잔기로서는 Val과 Ile을 가지는 펩티드가 높은 ACE 저해효과를 나타내었으며, 저해활성을 발현하는데는 방향족 및 소수성 아미노산 잔기가 매우 중요한 것으로 밝혀졌다(Cheung 등, 1980).

이에 본 발명자들은 수산가공공장에서 어육을 얻기 위해 필렛 작업 (filleting) 후 발생되는 가자미 프레임(Yellowfin sole frame)을 막효소반응기에서 각종 단백질 가수분해효소로 가수분해하여 분자량별로 대량 분획하였으며, 이들로부터 ACE 저해활성이 높은 펩티드를 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여 아미노산 배열을 결정함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 수산가공부산물인 가자미 프레임으로부터 분리한 항고혈압 활성을 가지는 펩티드를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 항고혈압 활성을 가지는 펩티드를 함유하는 기능성 천연조미료를 제공하는 것이다.

본 발명은 수산물가공부산물인 가자미 프레임으로부터 분리한 항고혈압 활성을 가지는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명에 의한 펩티드는 하기 (1) 내지 (5)의 특징을 가진다:

(1) 최적온도 45∼55℃;

(2) 최적 pH 9.0∼10.0;

(3) 온도 50℃ 및 pH 10.0 에서 12시간 이상 안정;

(4) 등전점 pI 7.8;

(5) 분자량 1,000∼3,000 Da.

또 본 발명은 상기 (1) 내지 (5)의 특징을 가지면서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성을 가지는 펩티드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 항고혈압 활성을 가지는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항고혈압 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균 상태의, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태 등의 피부 외용제 또는 경구용 제형으로 제형화할 수도 있고, 피하주사, 정맥주사 또는 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수도 있다.

경구용 제형의 경우는 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 부형제(forming agent)를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산 가능한 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태의 경구형 제형으로 제제화될 수 있으며, 이는 단위 투여량, 형태 등에 따라 알맞게 제조될 수 있다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용 가능한 희석제 (diluent)나 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매로는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있으며, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터 또는 폴리에틸렌글리콜 등과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.

본 발명에 의한 기능성 조미료는 상기 펩티드를 조미료 총 중량에 대하여 10∼40 중량% 양으로 함유한다. 상기 펩티드의 함유량은 조미료의 맛과 향에 따라 조절가능하다.

본 발명에 의한 기능성 조미료는 통상적인 천연 조미료의 제조방법을 통해 제조할 수 있으며, 맛과 향을 위해 홍합 발효조미액을 함께 첨가하여 제조할 수 있다.

[실시예 1] 가자미 프레임 단백질에 대한 최적 가수분해조건 검토

1. 일반성분 분석

일반성분은 상법에 따라 측정하였다. 즉, 수분은 상압 가열건조법, 조지방은 Soxhlet법, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법, 조회분은 건식회화법으로 측정하였다.

각 시료를 회수한 다음, 가자미 프레임의 육 부분을 대상으로 일반성분 분석한 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 수분, 단백질, 지질 및 회분의 함량이 가자미 프레임 육의 경우가 각각 75.91% (w/w), 17.22%, 4.97% 및 1.94%로 나타났다. 일반적으로 생선의 전체 수분함량이 약 70∼80% 가량으로 알려져 있다.

구성성분	함량 (%, w/w)
수분	75.91 ( - )
단백질	17.22 (71.36)
지방	4.97 (20.60)
Ash	1.94 ( 8.04)

( ), percentage on dry basis.

2. 가수분해도 측정

참치내장유래 조효소(TICE)를 이용한 가자미 프레임의 가수분해도(degree of hydrolysis: DH)는 각 프레임 1g을 완충용액 100 ml에 분산시켜 1% 기질용액으로 하여 기질 대 효소비가 100: 1이 되도록 한 후 40℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 종료되면 반응혼합물에서 2ml를 취하고, 여기에 20% TCA 용액을 동량 첨가하여 원심분리(2,370×g, 5min)한 다음, 상층액의 일정량을 취하여 Lowry 법으로 10% TCA 가용성 질소량을 측정한 후 그 가수분해도를 계산하였다.

여러 효소에 대한 가자미 프레임 단백질의 가수분해도를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. α-키모트립신(α-chymotrypsin)으로 가수분해하였을 때 가장 높은 65% 정도의 가수분해도를 나타내었으며, TICE과 트립신으로 가수분해시켰을 때 약 60%의 가수분해도를 나타내었다. 반면 펩신(pepsin), 뉴트라아제(neutrase)를 사용하여 가수분해시켰을 때에는 낮은 가수분해 효율을 나타내었다. 참치 내장으로부터 분리된 TICE는 상업용 효소에 비하여 경제성 및 효율성 면에서 충분한 활용가치를 가지고 있으므로 TICE를 이용하여 가자미 프레임 단백질의 가수분해에 대한 최적 조건을 검토하였다.

3. pH 효과

가자미 프레임 가수분해도에 대한 pH 효과는 0.1 M 글리신-HCl 완충액(pH 3.0-4.0), 0.1 M 소듐 아세테이트-아세트산 완충액(pH 5.0-6.0), 0.1 M 다이소듐 하이드로젠포스페이트-소듐 다이하이드로젠 포스페이트(disodium hydrogenphosphate-sodium dihydrogen phosphate) 완충액(pH 7.0), 0.1 M Tris-HCl 완충액(pH 8.0-9.0) 및 0.1 M 소듐 카보네이트-소듐 비카보네이트(sodium carbonate-sodium bicarbonate) 완충액(pH 10.0-12.0)을 사용하여 pH 효과를 검토하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 가자미 단백질의 가수분해율은 pH 9.0과 10.0 부근에서 활성이 높게 나타났으며, 특히 pH 10.0에서 약 60%로 가장 효율이 높았다. 이것은 Kim 등 (1997)이 참치유문수에서 추출한 조효소의 최적 pH 범위와 유사하였으며, 알칼리 영역인 pH 9.0에서 높은 효율을 나타내었다.

또한, Murakami와 Noda(1981)는 정어리의 유문수에서 추출한 알칼리 프로테나아제가 pH 10.0에서, 그리고 Kim 등(1993)은 고등어와 정어리의 내장 조직중에 분포하는 단백질 분해효소의 최적 pH는 췌장 유래에서는 각각 9.0과 9.8, 그리고 유문수 유래에서는 9.4와 10.0이었다고 보고하였다. 그러나 어류의 근육에서 추출한 알칼리 프로테나아제의 최적 pH를 보면, 잉어와 새우 모두 pH 8.0에서 최대활성을 보였다고 보고한 바 있다. 이러한 결과로 볼 때, 어류의 근육에서 추출한 단백질 분해효소의 최적 pH는 대개 8.0 부근이지만, 내장(유문수나 췌장)에서 추출한 단백질 분해효소는 주로 10.0 부근에서 활성이 가장 높다는 것을 알 수 있다.

4. 온도에 대한 효과

가자미 프레임의 가수분해도에 대한 최적 pH 조건하에서 온도를 30-70℃까지 변화시키면서 이들의 최적 온도조건을 검토하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

가자미 프레임 단백질의 가수분해에 대한 온도의 효과는 도 4에서와 같이 50℃에서 최대활성을 나타내었으며, 그 이후부터 급격하게 감소하는 것을 알 수 있었다. Pyeun과 Kim (1986)은 참치 유문수에서 추출한 조효소는 45℃에서 최대활성을 보이다가 50℃ 이후에 급격하게 감소하여 70℃에서는 거의 불활성화된다고 보고하였다.

그러나, 고등어 유문수 유래의 정제 프로테나아제(Ooshiro, 1971)와 대구 유문수 유래의 정제 트립신(Simpson 등, 1990)의 온도 효과를 보면, 둘다 40℃ 부근에서 최대활성을 보이다가 그 이후 50℃에서는 활성이 각각 75%와 60%로 감소하였다고 보고하였다. 이러한 사실은 유문수 유래의 프로테나아제는 정제되었을 경우보다는 조효소 상태일 때가 높은 온도에서 더 효과적인 것으로 나타났다.

한편, Doke와 Ninjoor (1987)는 새우 근육에서 유래한 알칼리 프로테나아제는 60℃에서 최대활성을 나타낸다고 보고하였고, Iwata 등 (1974)은 해산 어류 21종류와 담수산 어류 4종류의 근육에서 유래된 알칼리 프로테나아제는 대개 60∼65℃에서 최대활성을 보인다고 보고하였다. 따라서 내장과 근육에서 유래한 알칼리 프로테나아제의 활성을 비교해 보면, 내장에서는 약 40∼50℃로 근육의 60∼65℃보다 대개 낮은 온도에서 최대활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.

5. 기질농도에 대한 효과

가자미 프레임의 가수분해도에 대한 최적 pH 및 온도 조건하에서 기질농도를 0.2-3%까지 변화시키면서 가수분해에 대한 최적의 기질농도 효과를 검토하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

가자미 가공잔사 단백질에 대한 가수분해에서의 기질농도 효과는 도 5에서와 같이 4%의 기질농도에서 가장 효율이 높은 것으로 나타났다. 이 때의 가수분해율은 약 65%였다. 일반적으로 단백질의 가수분해반응에서의 기질농도는 1∼5% 정도인데, 본 실험에서도 기질농도에 대한 최적효과는 4%였으며, 기질농도가 낮을수록 가수분해율은 떨어지는 경향을 나타내었다.

6. 기질 대 효소비에 대한 효과

가자미 프레임의 가수분해도에 대한 최적 pH, 온도 및 기질농도 조건하에서 기질 대 효소비를 변화시키면서 그 가수분해도를 검토하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

또한, 기질 대 효소비에 대한 가수분해 효과는 도 6과 같이 기질 대 효소비가 200:1에서부터 증가하여 50:1에서 거의 최고 효율을 나타내었다. 따라서, 효소첨가량에 따른 가수분해물의 생산성을 감안해 본 결과, 최적의 기질 대 효소비를 50:1로 결정하였다.

7. 반응시간에 대한 효과

TICE를 사용하여 가자미 프레임의 가수분해도에 대한 최적 pH, 온도, 기질 농도 및 기질 대 효소비 조건하에서 반응시간을 1, 4, 8, 12 및 24시간 동안 반응시킨 후 그들의 가수분해도를 검토하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

TICE의 가자미 프레임 단백질에 대한 가수분해도가 반응시간이 8시간까지 뚜렷하게 증가하다가 그 이후로는 완만한 상승곡선을 나타내었다. 10시간까지 약 70%의 가수분해율을 보였으며, 그 이후로 약 73%까지 증가하였다.

Ramakrishna 등 (1987)은 어류 키모트립신과 소의 키모트립신을 시간경과에 따른 활성을 비교한 실험에서, 콜라겐(collagen) 기질을 사용하여 35℃에서 8시간 반응시켰을 경우와 어류의 불용성 단백질부분을 기질로 사용하여 37℃에서 5시간 반응시켰을 경우 모두 어류 키모트립신이 약 2배 가량 활성이 더 높았다고 보고하였다. 이러한 결과들로 미루어 볼 때, 육식어류의 내장에서 존재하는 프로테나아제가 육상동물이 가지는 소화효소보다 가자미와 같은 어육 단백질을 가수분해하기 위해서 더욱 효과적이며, 이는 생물종에 따른 기질의 특이성에 기인하는 것으로 생각된다. 따라서 어류 유래의 효소를 이용하는 것이 보다 효율적일 것으로 판단된다.

8. 가자미 프레임 단백질 가수분해물의 분자량별 분획

가자미 프레임을 해동한 후, 육부분을 분리하여 육 100g(건조중량)에 가수분해 최적 조건하에서 가수분해하였다. 가수분해 반응 후, 100℃에서 효소를 불활성화시키고, 추출액을 원심분리(4,650×g)하여 한외여과막 장치(ultrafiltration membrane system)를 이용하여 분자량 한계(molecular weight cut-off : MWCO) 범위가 각각 30, 10, 5, 3, 1 kDa인 막을 차례로 통과시켜 각각 분획하여 동결건조한 후 생리활성 물질의 시료로 사용하였다.

[실시예 2] 가자미 프레임 단백질로부터 항고혈압 펩티드 분리

효소적 수식을 통한 항고혈압 펩티드의 생산을 유도하였으며 internal, C말단 및 N말단의 활성부위를 노출, 변화시켜 항고혈압을 도출시켰다. 가자미 프레임으로부터 항고혈압 펩티드를 분리·정제한 순서는 도 9에서 나타내었다.

< 가자미 프레임으로부터 항고혈압활성 가수분해물 제조 >

가자미 프레임을 효소별로 최적조건에서 가수분해시킨 후, 가수분해물의 항고혈압활성을 측정하기 위하여 ACE 저해활성을 예비 검토한 결과(도 10), α-키모트립신에 의해 가수분해된 펩티드가 가장 높게 나타났다. 따라서 α-키모트립신에 의해 가수분해시켜 회수한 획분을 대상으로 한외여과막을 이용하여 분자량별로 분리하였다.

< 한외여과막 반응기를 이용한 ACE 저해활성 펩티드의 분자량별 분리 >

α-키모트립신에 의해 분해된 가자미 프레임 가수분해물을 앞에서 설명한 방법으로 한외여과막을 이용하여 분자량별로 분리한 다음, 각 획분의 ACE 저해활성을 측정한 결과를 표 2에 나타내었다. 또한 MALDI-TOF mass 분석을 통해 분획한 획분의 분자량 분포를 확인해 본 결과 도 11과 같이 대부분 1,000 - 3,000 Da의 펩티드로 확인되었다.

막을 이용하여 분획한 획분의 ACE 저해활성은 대체로 저분자 펩티드에서 나타났으며, 분자량 1,000 - 3,000 Da의 분획에서 가장 높게 나타났다. 따라서 본 실험에서 ACE 저해활성이 높은 펩티드는 저분자량의 펩티드라는 것을 예측할 수 있었으며, ACE 저해활성 펩티드의 분리정제용 시료로 분자량 1,000 - 3,000 Da의 가수분해물을 선정하였다.

단편 (MWCO)	ACE 억제 활성 (IC₅₀ μg/ml)
YFP V (1 kDa >)	1348.10
YFP IV (1 - 3 kDa)	880.00
YFP III (3 - 5 kDa)	1005.21
YFP II (5 - 10 kDa)	-*
YFP I (10 - 30 kDa)	-*

*- IC₅₀value, 2.0mg/ml <

< 가수분해물로부터 ACE 저해 펩티드 분리 및 정제 >

스크리닝을 통하여 항고혈압 활성을 나타내는 분자량별로 분획된 가수분해물의 특성을 파악하기 위하여 생리활성 물질의 분리 및 정제를 수행하였다. 즉, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 HPLC 등을 이용하여 각 정제 단계마다 생리활성을 측정하여 가장 활성이 높은 획분에서 기능성 물질을 분리 정제한 후, 생리기능성 물질의 생리화학적인 특성, 구조 및 기능을 파악하는 시료로서 이용하였다.

1. 이온교환 크로마토그래피

미리 평형화시킨 SP-Sephadex C-25 컬럼(φ2.5×45 ㎝)에 가수분해 시료를 주입하고, 동일한 완충용액 250 ml로 비흡착부분을 용출시킨 후, 흡착된 부분은 완충용액과 1M NaCl용액을 사용하여 선형상 농도구배법으로 분별용출시켰다. 단백질 함량은 Lowry법으로 측정하였으며, 분획별 단백질 함량이 동일하도록 희석하여 상기와 같은 방법으로 각 분획물의 항고혈압 활성을 측정하여 비교하였다. 용출된 획분 중 활성이 가장 높은 획분을 계속 정제하였다.

SP-Sephadex C-25를 충진시킨 컬럼에서 분리한 획분 중에서 각 활성이 높은 분획물을 완충용액으로 평형화시킨 Sephadex G-25 컬럼(φ2.5×98 cm)에 주입하고, 탈이온수로 용출시켰다. 각 분획물을 280 nm 및 220 nm에서 흡광도를 측정한 후, 동결건조한 후, 정평하여 각 분획물의 항고혈압 활성을 측정하였다. 용출된 획분 중 활성이 가장 높은 획분을 계속 정제하였다.

분자량 1,000 - 3,000 Da의 가수분해물 중에서 ACE 저해활성 펩티드는 먼저 양이온 교환수지인 SP-Sephadex C-25에서 분리를 수행하였다. 즉, 분자량 1,000Da 이하의 가수분해액을 20mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.0)으로 평형화시킨 SP-Sephadex C-25 양이온 교환수지에 넣어 30분간 반응시킨 후, 비흡착부분을 용출시키고 수지에 흡착된 부분은 0.25M, 0.5M, 1.0M 및 2.0M NaCl 용액 500ml를 순차적으로 각각 용출하여 비흡착부분, 0∼0.25M, 0.25∼0.5M 및 0.5∼1.0M, 1.0∼2.0M NaCl 분획물의 9개의 획분으로 분리하였다(도 12). 이들 각 분획물을 동결건조하여 일정량을 정평하고 ACE 저해활성을 측정한 결과를 표 3에 나타내었다. 9개의 획분 중에서 ACE 저해활성이 가장 우수한 획분은 1.0∼2.0M NaCl 농도범위에서 용출된 획분으로 나타났다.

단편	IC₅₀(㎍/ml)
C-A	-*
B	-*
C	-*
D	1,333
E	1,000
F	800
G	667
H	550
I	645

*- IC₅₀value, 2.0mg/ml <

2. HPLC를 이용한 생리활성물질의 최종 분리 및 정제

양이온 교환수지인 SP-Sephadex C-25에서 분리한 획분 중에서 ACE 저해활성이 높은 펩티드를 포함하고 있는 C-H 획분을 GF-250 HPLC 컬럼 상에서 분리하였다.

겔 크로마토그래피를 이용하여 분리된 분획물 중에서 항고혈압 활성이 가장 높은 획분의 동결건조물을 0.1% 트리플루오로 아세트산(trifloroacetic acid) 용액에 녹여 HPLC에 주입하였다. HPLC (Dionex Co.)에서 ODS 역상 컬럼(reverse-phase column ; Shodex Co.)을 사용하였으며, 이동상은 0.1% TFA/H₂O와 0.1% TFA/아세토니트릴로 하여 선형상 농도구배법(0∼50% acetonitrile, 40 min)으로 용출시킨 다음, 각 획분을 분리하였다. 분리된 획분을 대상으로 항고혈압 활성을 측정한 후 용출된 획분 중 활성이 가장 높은 획분을 대상으로 다음의 분석들을 실시하였다.

각 획분은 220nm에서 흡광도를 측정하여 도 13에 나타내었으며, 이들 획분의 ACE 저해활성은 표 4에 나타내었다.

이들 획분의 ACE 저해활성은 획분 H-3에서 IC₅₀값이 0.26mg/ml로 가장 우수하였다.

Fraction	IC₅₀(㎍/ml)
H-1	500
2	385
3	200
4	300

3. HPLC를 이용한 역상 크로마토그래피

Sephadex G-15에서 분리한 획분중에서 ACE 저해활성이 가장 우수한 획분 H-3를 동결건조한 후, ODS 컬럼으로 장치된 HPLC를 이용하여 0.1% TFA/H₂O와 0.1% TFA/아세토니트릴(acetonitrile) 용액으로 선형상 농도구배법(0∼20% acetonitrile, 30 min)으로 용출(2 ml/min)시켜 정제한 결과와 그 활성을 도 14 및 표 5에서 나타내었다. 최종정제를 위해 역상 크로마토그래피를 이용하여 단일 피크(peak)를 확인한 결과는 도 15와 표 6에 나타내었다.

단편	IC₅₀(㎍/ml)
H-3a	80
3b	35

단편	IC₅₀(㎍/ml)
P	28.79

4. MALDI-TOF mass를 이용한 분자량 측정 및 정제도 확인

정제된 ACE 저해 펩티드의 분자량과 정제도를 측정하기 위하여 고분자 단백질, 당 등의 생체고분자를 대상으로 mass의 정보를 검토할 수 있는 Amersham Pharmicia사의 MALDI-TOF mass(PE Biosystems Voyager System 1000)를 이용한 고분자 질량분석법을 통해 10kDa 이상과 이하의 분자를 대상으로 매트릭스(matrix)를 사용하여 분석하였으며, 그 결과는 도 16에 나타내었다. 도 16에서 알 수 있듯이, ACE 저해 펩티드가 1,940 부근에서 강한 피크를 보임으로써 한외여과막의 해당 분자량 범위를 가지는 정제된 물질임을 알 수 있었다.

5. ACE 저해활성 펩티드의 아미노산 서열결정

가자미 가수분해물로부터 정제된 펩티드의 아미노산 서열은 ACE 저해활성이 가장 높은 획분만을 결정하였다.

아미노산 분석은 시료 50 mg을 앰플(ampoule)에 넣고 6N HCl 2 ml를 가하여 밀봉한 후 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 분해액을 여과하고 감압건조하여 염산을 제거한 후 소듐 로딩 완충액(sodium loading buffer; pH 2.2)로 25 ml가 되게 정용하여 이 중 일부를 아미노산 자동분석기에 주입하여 정량하였다.

아미노산 서열은 N-말단으로부터 아미노산을 절단하는 Edman법으로 분해한 후, 기체상 자동서열분석기(Perkin Elmer, New Jersey, U.S.A.)로 분석하였다. 즉, 염기 조건하에서 해리를 억제시킨 아미노산을 PICT(phenylisothiocyanate)에 부착시켜 PTC(phenylthiocarbamyl) 펩티드로 과잉시약과 반응 유도체물을 제거한 후, 산성 조건하에서 절단하여 ATZ(anilinothiozoline) 유도체로 변환시키고, 더 안정한 유도체인 PTH(phenylthiohydantoin) 아미노산으로 변형시켜 동정하였다. 남은 펩티드의 N-말단에 대해서 위의 과정을 반복하여 서열을 결정하였다.

그 결과, ACE 저해 활성이 가장 높은 획분의 펩티드는 서열번호 1로 표현되는 Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys-Gly-Tyr-His-Ala-Arg-Leu-Ala-Pro (Mw. 1939 Da)으로 구성된 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 질량분석기에 의해 측정한 결과(도 16)와 유사한 분자량을 가지는 펩티드임을 확인하였다.

ACE의 활성부위를 저해하는데는 C-말단의 아미노산 조성에 따라 매우 큰 영향을 받는 것으로 알려져 있는데 대부분 C-말단의 아미노산이 이미노산(imino acid)과 방향족 아미노산 등의 잔기로 구성되어 있는 펩티드가 ACE 저해활성이 매우 양호한 것으로 보고되어 있다(Cheung 등, 1980). 특히 C-말단의 다이펩티드(dipeptide) 아미노산 잔기에 의해 가장 큰 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 또한 Cheung 등 (1980) N-말단의 다이펩티드가 지방족 아미노산으로 된 펩티드는 ACE의 활성부위와 효과적으로 결합하여 저해하였다고 보고하였다.

해양생물로부터 분리한 ACE 저해 펩티드의 예를 살펴보면, Matsumura 등 (1993)은 가다랑어 내장 자가소화물로부터 6개의 ACE 저해활성 펩티드를 분리정제한 결과, 트리펩티드이면서 C-말단에 프롤린 잔기로 구성되어 있는 Leu-Arg-Pro의 ACE 저해활성이 가장 높았다고 하였으며, Miyoshi 등 (1991)도 α-zein 가수분해물에서 Leu-Arg-Pro, Leu-Ser-Pro, Leu-Gln-Pro 등의 트리펩티드의 ACE 저해활성을 보고하였다.

한편, Cheung 등 (1980)은 프롤린 잔기가 C-말단 잔기로 구성되어 있으면 저해활성이 높지만 N-말단에 아미노산 잔기로서는 저해효과가 있다고 보고하였다. 역시 Yokoyama 등이 가다랑어의 효소적 가수분해물로부터 ACE 저해활성이 높은 펩티드의 서열은 ILe-Lys-Pro-Leu-Asn-Tyr (IC₅₀=43.0μM) 및 Asp-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Pro (IC₅₀=62.0μM)였다고 보고하였으며, 이들을 부분적으로 절단된 형태인 Ile-Lys-Pro, Leu-Asn-Tyr, Asp-Tyr-Gly 및 Leu-Tyr-Pro의 ACE 저해활성은 각각 1.7μM, 81μM, 2700μM 및 6.6μM이었다고 보고하였다.

또한, Kawakami 등은 Leu-Lys-Tyr (IC₅₀=9.78μM)과 유사한 트리펩티드를 합성하여 ACE 저해활성을 측정한 결과, Leu-Lys-Pro (IC₅₀=2.8μM) 및 Val-Lys-Pro (IC₅₀=2.6μM)이었다고 보고하였다. 또한 Maruyama 등 (1985, 1987)은 오징어 간과 몸통육을 자가분해시켜 얻은 추출물로부터 ACE 저해활성이 높은 펩티드를 분리 정제하여 아미노산 서열을 결정한 결과, Try-Ala-Leu-Pro-His-Ala (IC₅₀=9.8μM) 및 Gly-Tyr-Ala-Leu-Pro-His-Ala (IC₅₀=27.3μM)였다고 보고하였으며, casein의 효소적 가수분해물로부터 ACE 저해활성이 높은 펩티드의 아미노산 서열은 Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys (IC₅₀=77.0μM), Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg (IC₅₀=15.0μM) 및 Phe-Phe-Val-Ala-Pro (IC₅₀=6.0μM)이었다고 보고한 바 있다.

이상의 결과를 살펴볼 때 ACE 저해활성을 나타내는 펩티드의 구조는 과거 강력한 ACE 저해제로 알려져 있는 뱀독 유래 펩티드의 C-말단 부분인 Pro-Pro 및 Ala-Pro과 깊은 관계가 있는 것으로 생각되어 왔으나, 최근에는 α-zein (Leu-Arg-Pro, IC₅₀=0.27μM)과 같이 다른 조합의 아미노산에서도 강한 ACE 저해활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 뿐만 아니라 펩티드의 길이 역시 저해활성에 중요한 영향요인이 될 수 있을 것으로 판단된다.

따라서, 펩티드의 ACE 저해활성은 구성 아미노산의 조성에 따라 다소 영향을 받을 것으로 생각되지만, 그 구성 펩티드의 종류와 아미노산의 서열에 의해 더 큰 영향을 받을 것으로 생각된다. ACE를 저해하는 생리활성을 갖는 작은 펩티드들은 특정 아미노산 배열을 가지고 있는 천연 단백질이 풍부하게 존재하고, 인체내 소화효소에 의해 영향을 많이 받지 않으며, 분자크기가 작기 때문에 경구투여 후에 체내에 흡수가 용이하다는 잇점을 가지고 있다.

본 연구에서 분리정제된 ACE 저해활성 펩티드는 C-말단에 -Leu-Ala-Pro으로 구성되어 있는 ACE 저해 펩티드의 전형적인 2차 구조를 가지고 있었다. 이러한 구조분석은 통해 ACE 유발 항고혈압제제 개발의 기초자료로서 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

[시험예 1] 항고혈압 활성 측정

1. ACE 저해활성을 통한 항고혈압활성 측정

ACE 저해활성은 Cushman와 Cheung(1971)의 방법에 따라 측정하였다. 일정량의 가수분해물을 0.1 M 소듐 보레이트(sodium borate) 완충액(pH 8.3, 300 mM NaCl 함유)에 녹인 가수분해액 100 μl에 25 mU/ml ACE 용액 100 μl를 가한 후, 37℃에서 30분간 항온처리하였다. 여기에 25 mM Hip-His-Leu (107.4 mg/10 ml 소듐 보레이트 완충액) 50 μl를 넣고 37℃에서 60분간 반응시킨 후, 1N HCl 용액 0.5 ml를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응용액에 에틸 아세테이트 1.5 ml를 가하여 교반한 다음, 원심분리(2,500×g, 5 min)시켜 상층액 1 ml를 분취하였다. 이 상층액을 완전히 건조시킨 다음 증류수 1 ml를 가하여 용해시키고, 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. ACE 저해제의 농도는 ACE의 저해활성을 50% 저해시키는데 필요한 가수분해물의 농도를 계산하여 IC₅₀ (mg/ml)으로 정의하였다(도 8).

< ACE 저해활성 펩티드의 in vivo 에서 혈압강하 활성측정 >

선천적으로 고혈압을 유발시킨 Spontaneous Hypertension Rat (SHR, 체중 180-220 g, female, 6-8주령)를 대상으로 ACE 억제 펩티드를 10 mg/kg (SHR body weight)되게 경구투여하여 안지오텐신 I의 승압에 대한 억제효과를 도 17에 나타내었다. 시판용 혈압강하제인 캡토프릴의 효과보다는 다소 낮으나 투여한 후 1시간 이내에 SBP를 약 30 mmHg 이상 강하시키는 것으로 보아 체내에서도 유용한 항 고혈압 활성을 보이는 것으로 알 수 있었다.

< 펩티드의 ACE 저해작용 기작 >

가자미 프레임 가수분해물로부터 분리·정제된 펩티드 중에서 ACE 저해활성이 가장 높은 서열번호 1의 펩티드(Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys-Gly-Tyr-His-Ala-Arg-Leu-Ala-Pro)의 C-말단의 구조는 Kim 등 (2001)이 보고한 트리펩티드인 Gly-Pro-Leu의 활성을 강화하기 위해 합성된 Leu-Gly-Pro의 구조와 유사하였다. 단 Gly 위치에 유사한 구조의 Ala이 치환된 구조로써, Leu-Gly-Pro은 C-말단의 프롤린(proline) 잔기의 penta ring이 존재함에 따라서 중간에 Pro이 위치해있는 천연의 Gly-Pro-Leu 보다 훨씬 높은 활성을 나타내는 것으로 보고하였다. 이들 ACE 저해펩티드와 ACE와의 반응기작을 확인하기 위하여 Ondetti와 Cushman (1982)이 제시한 기질과 ACE와의 반응기작을 기초모델로 하여 ACE 저해 펩티드와 ACE와의 상호작용을 구조적인 관점에서 다음과 같이 비교, 서술하였다(도 18).

ACE는 Zn²⁺에 의해 활성이 증강되어 기질의 C-말단에서 다이펩티드를 절단하는 exo형 메탈로프로테아제로 활성중심에는 활성부위(active site)와 활성증강 작용부위(subsite)가 존재하는데 이들의 효과적인 작용에 의해 기질은 가수분해된다 (Ondetti와 Cushman, 1982). Cheung (1980)은 기질의 C-말단 카르복실기가 ACE의 활성부위와 가장 중요한 작용을 하였으며, C-말단 부근의 R기들은 ACE의 소수성 부위 S₁, S₁' 및 S₂'에 효과적으로 상호작용을 하여 ACE의 활성부위의 작용을 높인다고 하였다. 종래에 혈압강하제로 사용되고 있는 캡토프릴은 ACE의 활성중심에서 C-말단의 카르복실기가 활성을 갖는 양전하 부위와 이온결합을 하고 sulfhydryl기는 ACE의 Zn²⁺과 강력하게 결합하며, 저해제의 소수성 기들은 ACE의 소수성 부위와 결합하여 강력한 저해작용을 갖는 것으로 추정하였다(Ondetti 등, 1977 ; Cushman 등, 1977, 1979). 따라서, ACE의 활성중심에서 활성부위의 작용을 증강시키는 ACE의 소수성 부위와 상호작용이 용이한 소수성 R기를 가진 펩티드가 ACE 저해활성을 높인다는 것을 알 수 있었다.

그리고 본 연구에서 분리한 가자미 프레임 ACE 저해 펩티드는 C-말단에 Kim 등 (2000)이 분리하여 합성한 트리펩티드와 거의 유사한 2차 구조를 가짐에도 불구하고 합성된 트리펩티드 보다 활성이 떨어지는 이유는 중간의 Ala의 치환과 10개 이상의 아미노산으로 구성된 고분자 펩티드가 소수성 상호작용으로 접힘(folding)으로 3차 구조를 가질 수 있기 때문이라고 판단된다. 각 펩티드의 특성은 아미노산 잔기 중의 소수성기의 위치에 따른 구조와 펩티드를 구성하고 있는 아미노산의 수에 따른 3차 구조 또한 중요한 요소임을 알 수 있었다.

이상의 결과로부터 수산폐기물인 가자미 프레임 가수분해물로부터 ACE 저해활성이 높은 펩티드를 확인하였으며, 탐색된 ACE 저해 펩티드는 항고혈압 제제 및 건강보조식품 등의 소재로써 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

2. In vivo에 의한 혈압강하활성 측정

선천적으로 고혈압을 유발시킨 SHR(spontaneous hypertension rat; 체중 180-220 kg, female, 6-8주령)을 대상으로 ACE I 억제 펩티드를 10 mg/kg (SHR body weight)되게 경구투여하여 안지오텐신 I의 승압에 대한 피험액의 억제효과를 검토하였다. 생리식염수에 용해한 피시험액 0.45 ml (투여한 후 세정에 사용한 생리식염수를 포함)로 하였다. 혈압은 경시적으로 비관혈식혈압측정장치로 꼬리혈압을 측정하였으며 대조구로써 시판용 혈압강하제인 캡토프릴을 사용하였다. 이때 최고혈관압력, 즉 SBP을 기준으로 비교하였다.

[제형예 1] 홍합 발효조미액 (FMS)의 제조

삼천포 어패류시장에서 구입한 진주담치(홍합, Mytilus coruscus)를 수회 수세한 후 30분 정도 물을 뺀 다음, 무게를 측정하여 소금을 25% (w/w)되게 첨가한 후 20℃에서 숙성시킨 후 월별로 달여서 발효조미액을 만들어 시료로 사용하였다.

막반응기에서 얻어진 가수분해물로부터 펩티드를 정제하기 위하여 사용된 Sephadex G-15 및 SP-Sephadex C-25 등의 펩티드 정제용 수지는 Sigma사, HPLC (Thermo Separation Products사, Model Spectra System P2000)로 펩티드를 분리·정제하는데 필요한 HPLC용 acetonitrile, ethanol 및 water 등은 Fisher Scientific사에서 구입하여 사용하였다. HPLC에서 최종적으로 분리·정제된 펩티드를 확인하기 위한 MALDI-TOF mass (Voyager system 1000)는 PE Biosystems 사의 것을 사용하였다.

단백질 가수분해물의 경우 맛과 향이 없으므로 홍합을 숙성시켜 발효조미액을 제조하여 맛과, 향이 우수한 성분을 첨가하였다. 먼저, 홍합을 수회 수세한 후 30분 정도 물을 뺀 다음, 무게를 측정하여 소금을 25%(w/w)되게 첨가한 후 20℃에서 숙성시킨 후 월별로 달여서 발효조미액을 제조하였다.

[제형예 2] 가자미로부터 분리한 항고혈압 활성을 가지는 펩티드를 함유하는 기능성 조미료의 제조

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 항고혈압 펩티드 획분을 이용하여 홍합 발효조미액(FMS)과 함께 배합하여 복합조미료를 제조하기로 하였다. 복합조미료의 제조는 예비실험을 통하여 설정된 조건에 따라 다음과 같이 제조하였다. 즉, 제형예 1에서 제조한 홍합발효조미액(FMS)과 가자미 프레임으로부터 분리한 항고혈압 활성을 가지는 펩티드 (YFPIV)를 맛과 향에 따라 배합한 30g을 식염 20g, 핵산 [명신화성 (주) 제품] 5g, 포도당 [명신화성 (주) 제품] 10g, 고추분말 [태경농산 (주) 제품] 5g, 된장분말 [명신화성 (주) 제품] 3g, 양파분말 [명신화성 (주) 제품] 1g, 생강분말[명신화성 (주) 제품] 0.5g, 마늘분말 [명신화성 (주) 제품] 2g과 잘 혼합하여 마쇄한 것을 가수분해물의 복합조미료로 사용하였다.

[시험예 2] 복합조미료의 관능검사

가수분해물을 이용하여 제조한 복합조미료에 대한 관능검사는 대조구로서 시판 복합조미료 즉, 멸치복합조미료(anchovy complex seasoning, ACS), 조개복합조미료(shellfish complex seasoning, SCS) 및 쇠고기복합조미료(beef complex seasoning, BCS)와 함께 위의 방법과 동일하게 관능평가를 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

시판 복합조미료와 비교해 볼 때, 맛, 냄새, 색의 평가에서 YFP IV의 복합조미료는 ACS와는 5% 유의차가 인정되었으나, SCS 및 BCS에서는 유의차가 인정되지 않았다.

단백질을 프로테아제(protease)로 가수분해하면 쓴맛이 나는 것으로 알려져 있다. 그 예로 대두 단백질을 펩신 분해물에서 많은 쓴맛 펩티드가 분리되었고, 카제인의 트립신 분해물에서도 비교적 긴사슬의 쓴맛 펩티드가 분리되었다. 가수분해물도 평가점수에서 분자량이 적은 획분에서 비교적 높은 점수를 얻었다. Alder-Nissen (1986)은 단백질 가수분해물의 쓴맛은 사용한 효소보다는 단백질을 구성하는 소수성 아미노산의 함량과 관계가 있다고 보고한 바 있다.

복합 조미료	Total score	Mean score^**
복합 조미료	Total score	Taste	Odor	Color
YFP IV	3.60ㅁ0.22 ^b	3.50ㅁ0.41 ^b	3.60ㅁ0.56 ^a	3.50ㅁ0.34 ^b
ACS	3.00ㅁ0.26^d	3.10ㅁ0.18^b	3.00ㅁ0.26^c	2.70ㅁ0.21^b
SCS	3.80ㅁ0.13^ab	4.00ㅁ0.33^a	3.80ㅁ0.20^a	3.50ㅁ0.22^뮤
BCS	3.90ㅁ0.23^a	3.70ㅁ0.30^뮤	4.10ㅁ0.31^a	3.70ㅁ0.26^a

^**Means within each column followed by the same letter are not signigicantly different (P<0.05), 5 points scale (1: undesirable, 2:slightly undesirable, 3:slightly desirable, 4:desirable, 5:very desirable)

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 가자미 프레임으로부터 추출한 펩티드는 항고혈압 활성을 가지며, 이러한 펩티드를 항고혈압 조성물 또는 기능성 조미료 등에 유효성분으로 함유할 수 있다.

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15. Matsufuji H., T. Matsui, E. Seki, K. Osajima, M. Nakashima, and Y. Osajima (1994) : Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in an alkaline protease hydrolyzate derived from sardine muscle. Biosci. Biotech. Biochem., 58(12), 2244∼2245.

16. Kohama, Y., H. Oka, Y. Kayamori, K. Tsujikawa, T. Mimura, Y. Nagase and M. Satake (1991) : Potent synthetic analogues of angiotensin-converting enzyme inhibitor derived from muscle. Agric. Biol. Chem., 55(8), 2169∼2170.

17. Fujii, M., N. Matsumura, K. Mito, T. Shimizu, M. Kuwahara, S. Sugano and H. Karaki (1993) : Antihypertensive effects of peptides in autolysate of bonoto bowels on spontaneously hypertensive rats. Biosci. Biotech. Biochem., 57(12), 2186∼2188.

18. Cheung, H. S., F. L. Wang, M. A. Ondetti, E. F. Sabo and D. W. Cushman (1980) : Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence. J. Biol. Chem., 255(2), 401∼407.

19. Matsumura, N., M. Fujii, Y. Takeda and T. Shimizu (1993a) : Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from bonito bowels. Biosci. Biotech. Biochem., 57(10), 1743∼1744.

20. Miyoshi, S., H. Ishikawa, T. Kaneko, F. Fukui, H. Tanaka and s. Maruyama (1991a) : Structures activity of angiotensin-converting enzyme inhibitors in an α-zein hydrolysate. Agric. Biol. Chem., 55(5), 1313∼1318.

21. Miyoshi, S., T. Kaneko, Y. Yoshizawa, F. Fukui, H. Tanaka and S. Maruyma (1991b) : Hypertensive activity of enzyme hydrolysate. Agric. Biol. Chem., 55(5), 1407∼1408.

22. Maruyama, S., H. Suzuki and N. Tomizuka (1985a) : Effects of zinc ion on inhibition by angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from casein. Agric. Biol. Chem., 49(9), 2809∼2810.

23. Maruyama, S., K. Nakagomi, N. Tomizuka and H. Suzuki (1985b) : Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of casein. Ⅱ. Isolation and bradykinin-potentiating activity on the uterus and the ileum of rats. Agric. Biol. Chem., 49(5), 1405∼1409.

24. Cushman, D. W. and H. S. Cheung (1971) : Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung. Biochemical Pharmacology, 20, 1637∼1648.

25. Ondetti, M. A. and D. W. Cushman (1982) : Enzyme of the renin-angiotensin system and their inhibitors. Ann. Rev. Biochem., 51, 283∼308.

26. Alder-Nissen J. (1986) Enzymatic Hydrolysis of Proteins. Elsevier, London.

도 1은 레닌-안지오텐신계(Renin-angiotensin system, RAS) 및 칼리크레인-키닌계(kallikrein-kinin system)를 보여주는 모식도이다.

도 2는 안지오텐신 Ⅰ 전환 효소의 구조 도메인을 보여주는 모식도이다.

도 3은 TICE와 다른 효소들간의 단백질 분해 활성을 비교 측정한 그래프이다 (기질(가자미 프레임 단백질) 농도 = 4%(w/v), S/E=50(w/w), 배양시간 8시간) (A: α-키모트립신, B: TICE, C: 트립신, D: 알칼라아제, E: 파파인, F: 프로나제 E, G: 펩신, H: 뉴트라아제).

도 4는 TICE에 의한 가자미 프레임 단백질의 가수분해에 미치는 pH의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 TICE에 의한 가자미 프레임 단백질의 가수분해에 미치는 온도의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 TICE에 의한 가자미 프레임 단백질의 가수분해에 미치는 기질 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 TICE에 의한 가자미 프레임 단백질의 가수분해에 미치는 기질과 효소의 비율의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 8은 TICE에 의한 가자미 프레임 단백질의 가수분해에 미치는 배양시간의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 9는 가자미 프레임 단백질로부터 분리한 여러 가지 효소의 가수분해물의 ACE 저해 활성을 보여주는 그래프이다.

(A: α-키모트립신, B: TICE, C: 트립신, D: 알칼라아제, E: 파파인, F: 프로나제 E, G: 펩신, H: 뉴트라아제).

도 10은 가자미 프레임 단백질로부터 ACE 억제 펩티드를 정제 및 특정화하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 11은 가자미 프레임 단편으로부터 가수분해된 ACE 억제 펩티드를 MALDI-TOP과 함께 한외여과막(1-3kDa)으로 분리한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 12는 SP-Sephadex C-25에서 가자미 프레임 단백질로부터 ACE 억제 펩티드를 분리한 결과를 보여준다.

도 13은 GF-250 HPLC 컬럼에서 가자미 프레임 단백질로부터 ACE 억제 펩티드를 분리한 결과를 보여준다.

도 14는 Nucleosil 100-7 C18 컬럼에서 가자미 프레임 단백질로부터 ACE 억제 펩티드를 분리한 결과를 보여준다.

도 15는 Zorbax SB C18 컬럼을 사용한 RP-HPLC 크로마토그래피에서 가자미 프레임 단백질로부터 ACE 억제 펩티드를 분리한 결과를 보여준다.

도 16은 가자미 프레임 가수분해물로부터 ACE 억제 펩티드를 정제하고 분자량을 확인한 그래프이다.

도 17은 ACE 억제 펩티드를 투여하여 SHR의 수축기혈압 변화를 측정한 결과를 보여준다.

도 18은 Ondetti 및 Cushman(1984)에 의한 ACE의 활성 부위 모델을 기초로 한 상호작용 기질(Leu-Gly-Pro)의 결합을 보여주는 모식도이다.

<110> KIM, Se Kwon <120> Composition for anti-hypertension containing hydrolysates from Yellowfin sole <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Yellowfin sole <400> 1 Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Gly Tyr His Ala Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15

Claims

가자미 프레임으로부터 추출되고, 하기 (1) 내지 (5)의 특징을 가지는 항고혈압 활성을 가지는 펩티드:

(1) 최적온도 45∼55℃;

(2) 최적 pH 9.0∼10.0;

(3) 온도 50℃ 및 pH 10.0 에서 12시간 이상 안정;

(4) 등전점 pI 7.8;

(5) 분자량 1,000∼3,000 Da.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것임을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항 또는 제 2항에 의한 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항고혈압 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 의한 펩티드를 함유하는 기능성 조미료.
제 4항에 있어서, 상기 펩티드의 함유량이 조미료 총 중량에 대하여 10∼40 중량% 임을 특징으로 하는 기능성 조미료.