FI115630B - Menetelmä 4-(3-syaanifenyyli)-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihapon valmistamiseksi - Google Patents

Description

115630

Menetelmä 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihapon valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorime- tyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihapon valmistamiseksi. Yhdiste on käyttökelpoinen valmistettaessa (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluori-metyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinolonia, jota voidaan käyttää nisäkkäiden (ihminen mukaan lukien) virtsainkontinenssin hoidossa.

10 Olemassa olevat virtsainkontinenssiin käytettävät hoidot ovat yleisesti huonoja ja ne pohjautuvat lääkeaineisiin, jotka alunperin on kehitetty muihin indikaatioihin. Eräs tällaisten lääkeaineiden ryhmä käsittää kalsiumkanavan salpaajat, kuten nifedipiinin, jotka alunperin kehitettiin sydänverisuonilääkkeiksi ja joita ensisijaisesti käytetään tässä tarkoituksessa.

15 Nifedipiini kuuluu rakenteellisesti yhdisteluokkaan, jotka yhdisteet tunnetaan dihydropyridiineinä. Tätä rakenneluokkaa on tutkittu laajasti, ja kal-siumsalpausvaikutukselle vaadittavat rakenneominaisuudet ovat nyt melko hyvin tunnettuja. Siten, kuten lääketieteellisen kemian oppikirjassa, Comprehensive Medicinal Chemistry, volyymi 3, toim. John C. Emmett ja julkaissut Pergamon 20 Press, 1990, kappaleessa 14.1 kuvataan, yhdisteissä on 1,4-dihydropyridiini-. . rengas, jossa on optimaalisesti aryyliryhmä 4-asemassa ja esteriryhmät 3- ja 5- '· ’· asemissa. Esteriryhmien poistaminen tai niiden korvaaminen asetyyli- tai syaani- ' ryhmillä johtaa vaikutuksen vähenemiseen. Tavallisesti yhdisteissä on metyyli- : .·’ ryhmät 2-ja 6-asemissa.

25 Grinshteins et ai., Khim. Geterotsikl. Soedin. (6), 1118-20, 1967, tuovat esille yhdisteet 3-syaani-4-fenyyli-2,7,7-trimetyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinoloni ja 3-etanoyyli-4-fenyyli-2,7,7-trimetyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinoloni. Vitolinya et ai., Khim.-Farm. Zh., 15(1), 39 -42, 1981, tuovat esille ΜΙ kimuksen, jossa useiden 4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinolonien, joissa on esteri- tai ,*·\ 30 syaaniryhmä 3-asemassa, vaikutusta sydänverisuonijärjestelmään ja suolen si- • · leään lihakseen on tutkittu. 3-syaani-4-fenyyli-2,7,7-trimetyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinolonin raportoidaan omaavan verenpainetta alentavia ominaisuuksia ja sen sanotaan pystyvän salpaamaan sekä asetyylikoliinin että bariumkloridin ; kouristusvaikutuksen suolen sileässä lihaksessa.

.··’ 35 Julkaisussa DE 2 003 148 tuodaan esille 1,4-dihydropyridiinijohdan- naisia, kuten tiettyjä 4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinoloneja, joissa on esteri- tai ke- 115630 2 toryhmä 3-asemassa ja joilla sanotaan olevan laaja farmakologinen vaikutuskir-jo. Yhdisteiden päävaikutuksiksi mainitaan voimakkaat lihaksen kouristusta estävät vaikutukset, jotka tulevat esiin maha-suolikanavan, urogenitaalikanavan ja hengitysteiden sileässä lihaksistossa. Muiden päävaikutusten ilmoitetaan koh-5 distuvan sydämeen ("sydäntä lievittävä" vaikutus) ja yhdisteiden sanotaan alentavan verenpainetta normaaliverenpaineisissa ja hypertonisissa eläimissä, joten niitä voidaan käyttää verenpainelääkkeinä.

Tiedetään, että rakkokudos on ärsykkeelle altista kudosta ja että virt-sainkontinenssi voi johtua kontrolloimattomista tai epästabiileista rakon supistu-10 misista. On löydetty yhdiste, joka yllättäen pystyy relaksoimaan rakon sileää lihasta ja estämään tai lievittämään näin kontrolloimattomia tai epästabiileja rakon supistumisia. Siten yhdiste voi olla käyttökelpoinen hoidettaessa pakkoin-kontinenssia, joka käsittää esimerkiksi detrusorlihaksen epästabiiliuden, joka voi johtua virtsarakontulehduksesta, virtsajohtimentulehduksesta, kasvaimista, kivis-15 tä, divertikuleista tai ulosvirtauksen tukkeumasta; ja rakkolihaksen yliaktiivisuu-den, joka voi olla seurauksena halvauksesta, dementiasta, parkinsonismista, suprasakraalisesta selkäydinvauriosta tai suprasakraalisesta selkäydinsairau-desta.

On myös yllättäen todettu, että yhdiste on kaliumkanavan avaaja.

20 Tiedetään, että kaliumkanavia avaamalla kaliumkanavia avaavat yhdisteet voivat toimia siten, että sileä lihas relaksoituu. Haluamatta sitoutua teoriaan, usko-\! taan, että yhdiste toimii siten, että se avaa kaliumkanavia rakon soluissa ja siten relaksoi rakon sileää lihaskudosta, ja näin estää tai lievittää kontrolloimattomia rakon supistuksia, jotka voivat aiheuttaa virtsainkontinenssia. Nurse, D.A., Res-25 torick, J.M. ja Mundy, A.R., British Journal of Urology (1991), 68, 27 - 31, tuovat ”esille, että kromakaliimi, joka on hyvin tunnettu kaliumkanavan avaaja, on todet-;;; tu tehokkaaksi alustavassa kliinisessä tutkimuksessa, jossa hoidettiin virtsain- ’*·" kontinenssia.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan yhdiste, ; : 30 joka on käyttökelpoinen valmistettaessa (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorime- ,,4: tyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinolonia ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Keksintö koskee menetelmää 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihapon valmistamiseksi. Mene-· 35 telmälle on tunnusomaista, että saatetaan (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2- ;, ’ ’: trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksy- 115630 3 laatti reagoimaan p-tolueenisulfonihapon ja olennaisesti vedettömän liuottimen läsnä ollessa.

Tulee ymmärtää, että yhdisteellä (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluori-metyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinoloni voi esiintyä polymorfiaa ja että se voi 5 muodostaa solvaatteja. Tulee ymmärtää, että esillä oleva keksintö käsittää kaikki polymorfiamuodot, tai solvaatit tai niiden seokset, jotka ovat käyttökelpoisia rakon sileän lihaksen relaksointiin, ja tunnetaan hyvin, kuinka määritetään yhdisteen kyky relaksoida rakon sileää lihasta tässä edempänä kuvattuja perustestejä käyttäen. Yhdisteen stereokemia todettiin aluksi (-)-muotoiseksi, ja absoluuttinen 10 stereokemia on sittemmin todettu (S)-muotoiseksi. Siten voi olla edullista käyttää yhdistettä muodossa, jonka on karakterisoitu sisältävän esimerkiksi vähintään 95, 98 tai 99 % enantiomeerisen ylimäärän (ee) (S)-(-)-muotoa.

Yhdiste voidaan valmistaa menetelmillä, jotka käsittävät kemiassa tunnettuja menetelmiä rakenteellisesti samankaltaisten yhdisteiden valmistami-15 seksi. Tällaisia menetelmiä (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinolonin valmistamiseksi valaistaan seuraavilla menetelmillä. Tällainen menetelmä voidaan suorittaa tavallisesti dekarboksyloimalla vastaava (S)-(-)-muotoinen karboksyylihappo, jonka kaava on II.

Dekarboksylaatioreaktio voidaan tarkoituksenmukaisesti suorittaa 20 kohotetussa lämpötilassa, esimerkiksi 50 - 250 °C:ssa, edullisesti 190- 220 °C:ssa ilman happokatalyyttiä, erityisesti 130- 185 °C:ssa (esimerkiksi käyt- täen kuumennusmanttelia), ja edullisesti 90- 120°C:ssa happokatalyytin kans- ; sa. Hapolla katalysoimaton dekarboksylaatioreaktio voidaan suorittaa pelkkänä ; sulatteena tai tehottomassa liuottimessa, jonka kiehumispiste on sopiva, kuten 25 difenyylieetterissä tai N-metyylipyrrolidin-2-onissa. Edullinen liuotin on N-metyyli- pyrrolidin-2-oni. Sopivia liuottimia happokatalysoituun dekarboksylaatioon ovat ·; ; alkoholit, esimerkiksi metanoli ja etanoli; dimetyylisulfoksidi; aromaattiset hiilive- • · '··* dyt, kuten tolueeni; eetterit, kuten 1,2-dimetoksietaani tai diglyymi; ja N-metyyli- pyrrolidin-2-oni. Väkevää rikkihappoa, fosforihappoa, kloorivetyhappoa, bromive-j 30 tyhappoa, jodivetyhappoa, vahvoja orgaanisia happoja, kuten trifluorietikkahap-poa, orgaanista sulfonihappoa, kuten metaanisulfonihapapoa tai p-tolueenisul-fonihappoa voidaan tarkoituksenmukaisesti käyttää happokatalyyttinä. Reaktio ‘i!: voidaan tarkoituksenmukaisesti suorittaa puhtaana lämpötilassa, joka on aineen ‘:' sulamispiste tai sen yläpuolella.

,· : 35 (S)-(-)-muotoinen karboksyylihappo, jonka kaava on II, valmistetaan tarkoituksenmukaisesti hajottamalla vastaava raseeminen karboksyylihappo, 115630 4 jonka kaava on II. Tarkoituksenmukainen menetelmä kaavan II mukaisen yhdisteen hajottamiseksi on muodostaa hapon hajotettu suola, esimerkiksi käyttäen S-(-)-a-metyylibentsyyliamiinia. Suola muodostetaan takaisin ja tehdään sitten happamaksi, jolloin hajotettu kaavan II mukainen karboksyylihappo vapautuu.

5 Uudelleenkiteytykset suoritetaan edullisesti lämpötilassa, joka on 75 °C tai alhaisempi, ja edullisesti sekoittamatta.

Vaihtoehtoisesti käsittelemätön kaavan I mukainen raseeminen yhdiste voidaan hajottaa käyttäen kiraalista kolonnia, jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on I.

10 Mikäli menetelmiin tarvittavia aineita ei ole kaupallisesti saatavissa, kuten aineita, jotka on kuvattu edempänä, ne voidaan valmistaa menetelmillä, jotka on valittu orgaanisen kemian perustekniikoista, jotka ovat vastaavia kuin tunnettujen, rakenteellisesti samanlaisten yhdisteiden valmistamiseen käytetyt menetelmät, tai tekniikoista, jotka ovat samanlaisia kuin edellä kuvattu mene-15 telmä tai menetelmät, jotka on kuvattu esimerkeissä.

Kaavan II mukainen välituote voidaan valmistaa reaktionkulkukaavi-ossa I kuvatulla tavalla saattamalla reagoimaan asetetikkahappoesteri, jonka kaava on III, tai sen hemiasetaalit, jossa ORa on alkoholitähde, ja joka muodostaa esterin, joka voidaan lohkaista lauhkeissa emäksisissä olosuhteissa, kuten 20 esimerkiksi 2-syaanietoksiesteri 3-syaanibentsaldehydin ja 1,3-sykloheksaani-dionin kanssa, jolloin saadaan alkoholi, jonka kaava on IVa. Dehydratoimalla al-*.: koholi saadaan esteri, jonka kaava on IV, josta voidaan muodostaa saippua, jol- : loin saadaan happoa, jonka kaava on II.

: v. Välituote, jonka kaava on II, voidaan vaihtoehtoisesti valmistaa reak- ’···. 25 tionkulkukaaviossa II kuvatulla tavalla saattamalla reagoimaan asetetikkahap- ‘ ! poesteri, jonka kaava on III, tai sen hemiasetaalit, jossa ORa on alkoholitähde, ;;; ja joka muodostaa esterin, joka voidaan helposti lohkaista hapolla, kuten esi- » » '···' merkiksi isobomyyliesteri 3-syaanibentsaldehydin ja 1,3-sykloheksaandionin kanssa, jolloin saadaan alkoholi, jonka kaava on IVa. i 30 Kaavan IVa mukaisen yhdisteen happokatalysoidusta dehydraatiosta ja hydrolyysistä, esimerkiksi esimerkeissä kuvatuissa olosuhteissa saadaan yhdiste, jonka kaava on II. Valmistettaessa yhdistettä, jonka kaava on IV yhdis-teestä, jonka kaava on IVa, happokatalyytti voi olla mikä tahansa tässä edellä mainituista katalyyteistä ja edullisesti se on p-tolueenisulfonihappo. Valmistetta-M \ 35 essa yhdistettä, jonka kaava on II, yhdisteestä, jonka kaava on IVa, happokata- lyytti on edullisesti p-tolueenisulfonihappo. Reaktio suoritetaan edullisesti tehot- 5

11563 O

toman liuottimen, kuten tolueenin tai etikkahapon läsnä ollessa. Dekarboksyloi-tumisen estämiseksi liuotin on edullisesti vedetöntä, esimerkiksi jääetikkahappoa.

Dekarboksyloitumisen minimoimiseksi edelleen reaktion lämpötila tulisi pitää korkeintaan 104°C:ssa, edullisesti 100 - 104 °C:ssa, erityisesti 102-5 104°C:ssa.

Isobomyyliesteri voidaan valmistaa suorittamalla esterinvaihdosreak-tio isobornyylille ja etyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaatille, ja 2-syaanietyyli-4,4,4-tri-fluoriasetasetaatin 2-syaanietyylihemiasetaatti suorittamalla esterinvaihdosreak-tio 3-hydroksipropionitriilille ja etyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaatille.

10 Menetelmät kaavan I mukaisen yhdisteen ja sen välituotteiden val mistamiseksi käsittävät edelleen keksinnön avulla saatavia näkökohtia.

Farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan saada käyttäen farmasiassa hyvin tunnettuja menetelmiä, esimerkiksi saattamalla yhdiste reagoimaan sopivan hapon tai emäksen kanssa, josta saadaan fysiologisesti hyväk-15 syttävä vastaioni.

Käytettäessä virtsainkontinenssin hoitoon yhdiste annostellaan tavallisesti sopivana lääkekoostumuksena, joka käsittää yhdisteen yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän laimentimen tai kantaja-aineen kanssa, ja koostumus on sovitettu nimenomaiseen valittuun antotapaan sopivaksi. Tällaiset koos-20 tumukset kuuluvat osana keksintöön.

Toisen näkökohdan mukaan esillä olevan keksinnön avulla saadaan siten lääkekoostumus, joka käsittää edellä määritellyn yhdisteen tai sen far-; maseuttisesti hyväksyttävän suolan sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää lai- j ’ V menninta tai kantaja-ainetta.

25 Koostumukset voidaan saada käyttäen tunnettuja menetelmiä ja ;* apuaineita ja sideaineita, ja ne voivat olla monessa eri lääkemuodossa. Esimer- • I · ; kiksi ne voivat olla tabletteja, kapseleita, liuoksia tai suspensioita, jotka annostel- laan suun kautta; ne voivat olla peräpuikkoja, jotka annostellaan peräsuoleen; steriilejä liuoksia tai suspensioita, jotka annostellaan suonensisäisesti, rakon-; : ; 30 sisäisesti, ihon alle tai lihakseen annettavana injektiona tai infuusiona; tai lääke- ; ’laastareita, joista lääke annostellaan ihon kautta.

\ Keksinnön avulla saadaan edelleen menetelmä virtsainkontinenssin ; ; hoitamiseksi, jossa menetelmässä annetaan nisäkkäälle, joka on tällaisen hoidon ’ ·; ·' tarpeessa, tehokas määrä yhdistetä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

; ; : 35 Hoito yhdistettä käyttäen voi olla parantavaa tai hoidollista, kuten yh- ; disteen annostelu virtsainkontinenssin puhjettua tai kehityttyä potilaassa. Hoito 115630 6 voi olla myös ennalta ehkäisevää tai ennakoivaa, annosteltaessa yhdistettä olettaen, että virtsainkontinenssi voi kehittyä, kuten potilaalla, joka on kärsinyt virt-sainkontinenssista aikaisemmin.

Lisänäkökohdan mukaisesti keksintö käsittää yhdisteen käytön val-5 niistettäessä lääkettä virtsainkontinenssin hoitoon.

Koska yhdiste toimii kaliumkanavia avaamalla, se voi olla käyttökelpoinen myös terapeuttisena aineena hoidettaessa muita tiloja tai sairauksia, jossa kaliumkanavia avaavan aineen toiminta on toivottavaa tai sen tiedetään lievittävän tilaa. Tällaisia tiloja tai sairauksia ovat verenpainetauti, astma, ääreisve-10 renkiertosairaus, sydämen oikeanpuolinen vajaatoiminta, verentungoksesta johtuva sydämen vajaatoiminta, sydänkipu, iskeeminen sydänsairaus, aivoverisuonisairaus, glaukooma, munuaiskoliikki häiriöt, joihin liittyvät munuaiskivet, ärtynyt paksusuolensyndrooma, miesten kaljuuntuminen, ennenaikainen synnytys ja ruoansulatuskanavan haavaumat.

15 Annosteltava annos yhdistettä vaihtelee hyvin tunnettujen pääsääntö jen mukaisesti ja siinä otetaan huomioon annostelutapa, inkontinenssitilan vakavuus sekä potilaan koko ja ikä. Yleisesti yhdiste annostellaan lämminveriselle eläimelle (kuten ihmisille) siten, että saadaan tehokas annos, tavallisesti päivittäinen annos, joka on yli 0,005, esimerkiksi noin 0,01 -10 mg/kg ruumiinpainoa 20 kohden. Edullisesti yhdiste annostellaan suun kautta näissä annosrajoissa.

Asiantuntijalle on selvää, että yhdiste voidaan antaa samanaikaisesti , j muiden terapeuttisten tai ennalta ehkäisevien aineiden ja/tai lääkkeiden kanssa, : , ·. jotka eivät ole yhteensopimattomia keskenään.

Yhdisteen vaikutukset sileää lihasta relaksoivana aineena, joka on 25 käyttökelpoinen aine virtsainkontinenssin hoidossa, koska se avaa kalium- *··;* kanavia ja hyperpolarisoi kalvopotentiaalia rakon sileässä detrusorlihaksessa, ··: voidaan osoittaa käyttäen sopivasti suunniteltuja in vitro -kokeita, kuten seuraa- vaksi kuvattua koetta. Yhdisteen ICso-arvo on 4,2 mikromoolia kokeessa. "IC50-arvo" on hyvin tunnettu termi ja se tarkoittaa koeyhdisteen konsentraatiota, joka vä-: 30 hentää 50 % rakkokudoksen supistumista in vitro seuraavassa kuvatussa kokeessa.

Albiinoja Hartley-urosmarsuja (450-500 g) lopetetaan tukehduttamalla hiilidioksidilla ja veri poistetaan niistä nopeasti. Alempi vatsaontelo ava-;;; taan ja virtsarakko eristetään. Rakko puhdistetaan ympäröivästä side-ja rasva- > kudoksesta, ja virtsajohtimen aukkojen yläpuolella oleva osa poistetaan ja pes- 35 tään Krebs-Henseleitin puskuriliuoksessa, jonka koostumus on seuraava ;···! (mM:na): NaCI 118,0, KCI 4,7, MgS04 1,2, KH2PO4 1,2, CaCI2 2,5, NaHC03 115630 7 25,0 ja d-glukoosi 11,1. Liuos lämmitetään 37 °C:seen ja siihen johdetaan 95 % 02'.ta ja 5 % CC>2:ta. Annettaessa kaasujen kuplia liuokseen voimakkaasti, liuoksen pH:n tulisi olla lähellä 7,4:ää.

Pestyn rakon kupuosa leikataan irti ja heitetään pois; jäljellä oleva 5 osa rakkoa laitetaan harsokankaalle petrimaljaan, jossa on puskuriliuosta. Avoimeen rakkoon tehdään keskivatsanpuoleinen, pitkittäinen leikkaus saksilla. Kupuosasta ja alareunalta leikatut leikkeet heitetään pois. Jäljellä oleva det-rusorlihaksen keskikappale leikataan kahteen vaakasuoraan leikkeeseen, joiden leveys on 2,0 mm. Nämä kaksi leikettä leikataan edelleen kahtia selänpuoleisen 10 keskikappaleen kohdalta, jolloin saadaan neljä samankokoista leikettä. Kukin leike sisältää näin sekä rakon selänpuoleisia että vatsanpuoleisia osia.

Kunkin yksittäisen leikkeen päät sidotaan lasisauvaan ja paineensiir-toanturiin (Grass malli FR03) siten, että toinen pää sidotaan lasisauvaan, toinen anturiin, käyttäen 4-0 mustaa punottua silkkiommelta.

15 Anturit kytketään polygrafiin (Grass malli 7E), joka on kalibroitu 5 mM/cm:ssä ja kalibroinnin lineaarisuus tarkastettu 5 ja 0,5 gramman painoilla. Polygrafista saadut analogiset sähköiset lähtösignaalit digitalisoidaan Modular Instrument Micro 5000 -signaalinkäsittelyjärjestelmällä, käyttäen Biowindows -tiedonhankintaohjelmaa, joka toimii Microsoft OS/2 -käyttöjärjestelmällä, IBM-20 yhteensopivassa tietokoneessa.

Lasisauvassa olevat detrusorleikkeet laitetaan 20 ml:n kudoshautee-: seen ja niiden annetaan tasapainottua aloitusjännityksessä, jonka suuruus on ‘ / 2 grammaa. Seuraavan 45-60 minuutin mittaisen tasapainottumisjakson aika- Y na kudosta pestään tuoreella puskuriliuoksella 15 min välein, ja jännitys sääde- *.;* 25 tään tarvittaessa arvoon 2 grammaa ennen pesua. Tasapainottumisjakson jäl- ··* keen lisätään aloitusannos, 15 mM KCI:a (kokonaiskonsentraatio hauteessa).

Kudosta pestään 10 min kuluttua ja se pestään kahdesti vielä 15 min välein, säätäen jännitys 2 grammaan ennen kutakin pesua.

Kun kudos relaksoituu vakaaseen tilaan lopullisen pesun jälkeen, li-: 30 sätään jälleen 15 mM KCI:a. Kun kudoksen myogeeninen aktiivisuus saavuttaa ;***. vakaan tilan, perustason tiedot saadaan Biowindows -tiedonhankintajärjestel- män kautta laskemalla keskiarvo 5 min:n myogeenisuustiedoille, jotka on saatu otettaessa näytteet 32 Hz:ssä. Kun perustaso on saatu, koeyhdiste annostellaan kumulatiivisesti puolilogaritmisin lisäyksin. Kontaktiaika kullekin annokselle on 10 : 35 min, josta viimeiset 5 minuuttia ovat ajanjakso, jolta annos-vastetiedot kerätään.

_·*. Mikäli 30 μΜ koeyhdistettä ei poista detrusorlihaksen mekaanista aktiivisuutta, 115630 8 lisätään 30 μΜ kromakaliimia, tyvitumakkeen kaliumkanavan avaajaa, maksimi-vasteen saamiseksi. Yhdisteen vaikutus kullakin annoksella ilmoitetan prosentteina maksimiestovasteesta, ja se normalisoidaan edelleen suhteessa yhdisteen vehiikkelikontrollilla saatuun vastaavaan vasteeseen. Normalisoitua vastetta 5 käytetään sitten johdettaessa ICso-arvoa yhdisteen relaksoivalle vaikutukselle, käyttäen Marquardtin epälineaarista iteratiivista käyräänsovitustekniikkaa standardille annos-vastefunktiolle.

Yhdisteen kykyä avata kaliumkanavia sileässä detrusorlihaksessa voidaan edelleen osoittaa toisella in vitro -kokeella. Tämä toinen in vitro -koe on 10 samanlainen edellä kuvattu koe kudospreparaatin ja tiedonkeruujärjestelmän suhteen. Seuraavat poikkeamat tulee kuitenkin huomata. Tässä toisessa kokeessa detrusorleikkeiden supistuminen aloituksen aikana ja tasapainottumis-jakson jälkeen saadaan aikaan 80mM:lla KCI:a 15mM:n sijaan (kokonaiskon-sentraatio hauteessa). Pitkitetty jännitys kudoksessa on selvä tällaisen suuren 15 KCI-ärsytyksen jälkeen, sillä jänniteherkät kalsiumkanavat ovat avautuneet ja saavat aikaan kalsiumin sisäänvirtauksen soluihin ja toonisen jännityksen kehittymisen. Tämä jännitys katoaa täydellisesti 300 pM:lla papaveriinia, jota siten käytetään maksimivasteen saamiseksi tässä kokeessa.

Tyypilliset kalsiumkanavan salpaajat, kuten nifedipiini, nimodipiini, is-20 radipiini ja verapamiili voivat relaksoida ja vähentää myogeenista aktiivisuutta marsun detrusorleikkeissä kummassakin kokeessa niiden kalsiumkanavia sal-. : paavan ominaisuutensa vuoksi. Kaikki edellä mainitut kalsiumkanavan salpaajat

,*[ ovat kuitenkin voimakkaampia jälkimmäisessä kokeessa käytettäessä 80 mM

KCI:a, kuin ensimmäisessä kokeessa, jossa käytettiin 15 mM KCI:a. Päinvastai-25 sesti, kun tyvitumakkeen kaliumkanavia avaavalla aineella, kromakaliimilla, on tehokas relaksoiva vaikutus ensimmäisessä kokeessa, ICso-arvon ollessa 0,6-0,9 μΜ, sillä saadaan merkityksetön relaksoiva vaikutus toisessa kokeessa kon-sensaatioina, jotka ovat niinkin suuria kuin 30 μΜ. Siten suurempi relaksoiva vaikutus ensimmäisessä kokeessa osoittaa, että yhdisteet toimivat kaliumkana-: : 30 via avaavina aineina. Yhdisteen ICso-arvo on 41,1 μΜ toisessa kokeessa.

”: Yhdisteen kykyä toimia kaliumkanavia avaavana aineena rakkokudok- sessa voidaan edelleen osoittaa peruskokeella, jossa mitataan koeyhdisteiden vai-; kutusta rubidiumin (^Rb) tai kaliumin (42K) ulosvirtausnopeuteen kudoksesta.

• ·* Asiantuntijat ymmärtävät edelleen, että yhdisteen tehokkuus voidaan ‘: 35 osoittaa standardeilla in vivo -kokeilla. Seuraavaksi kuvataan tällaista peruskoet- ta, jota voidaan käyttää vahvistamaan, onko koeyhdiste vaikuttava, ja lisäksi 115630 9 osoittamaan, onko koeyhdisteellä selektiivisyyttä rakkoon ilman merkittäviä sydänverisuoniin kohdistuvia vaikutuksia, kun yhdiste annetaan suun kautta.

Wistar-urosrottia (400 - 500 g) nukutetaan antamalla vatsaonteloon 50 mg/kg Nembutalia. Kunkin rotan vatsanpuoleiselta alueelta sekä kaulasta ja 5 niskasta ajetaan karvat ja iholle levitetään povidoni-jodia. Yhteisen päänvaltimon katetroimiseksi vasempaan päänvaltimoon tehdään pieni vatsanpuoleinen viilto. Esiin tuotu alue huuhdotaan 2 % lidokaiini-HCI-liuoksella verisuonen relaksoimi-seksi. Katetri, joka on täytetty 0,9 % suolaliuoksella, viedään noin 2,4 cm:n pituudelta valtimoon siten, että sen kärki on aortan kaaressa. Katetrin kauempana 10 oleva pää tuodaan ulos niskasta, se täytetään hepariinilla (1 000 yksikköä/ml) ja kuumasuljetaan. Rakon katetroimiseksi rakko paljastetaan tekemällä keskiviivaa pitkin viilto vatsaan. Troakaari laitetaan vatsalihaksen kautta noin 1 cm:n päähän viillon yläpäästä ja viedään sitten ihon alitse ja tuodaan ulos ihon läpi niskasta. Suolaliuoksella täytetty katetri viedään troakaarin läpi. Rakon kupuun tehdään 15 pieni aukko Accu-Temp -polttoraudan avulla. Katetri laitetaan rakkoon ja kiinnitetään 4-0 silkkilangalla. Katetria huuhdellaan suolaliuoksella ja se todetaan avoimeksi. Katetrin ulkopää kuumasuljetaan virtsan karkaamisen estämiseksi. Vatsalihakset ja iho ommellaan. Kummatkin katetrit pujotetaan ruostumattomasta teräksestä valmistetun ankkurinapin läpi (Instech), joka ommellaan sitten 20 ihonalaiseen lihakseen ulostulokohtaan. Iho ommellaan kiinni napin yläpuolelta. Eläinten annetaan toipua nukutuksesta.

24 -48 tuntia leikkauksen jälkeen kukin rotta laitetaan metaboliahäk- j : j kiin ja kytketään ankkurinapista Instechin jousivaijeri-ja niveljärjestelmään katet- ; ·’: rien rikkoutumisen estämiseksi ja jotta eläimet voivat liikkua häkissä vapaasti.

25 Päänvaltimokatetri kytketään Gould P23XL -paineanturiin verenpaineen mittaa-mistä varten. Rakkokatetri kytketään pumppuun, jolla infusoidaan suolaliuosta, \ sekä paineanturiin PE50-putkien ja 4-teisen sulkuhanan avulla. Kuormituksen vastapaino ja keräysastia laitetaan häkin alle ulos tulevan virtsamäärän mittaamiseksi.

> # 30 Rotat punnitaan, niille annetaan valeannos suun kautta (annoste- ;·* luneula laitetaan suuhun, mutta nestettä ei ruiskuteta), ja rakonsisäinen suola- :· liuosinfuusio (0,18 ml/min) aloitetaan ja sitä jatketaan koko kokeen ajan. Muu tokset verenpaineessa, sydämen lyöntinopeudessa, rakonsisäisessä paineessa

I I

ja ulostulevan virtsan määrässä tallennetaan joko Grass-polygrafilla tai Gould 35 TA4000 -tallennusjärjestelmällä. Eläinten annetaan tasapainottua, kunnes virt- sausmalli vakioituu (noin 45-90 min). Tässä vaiheessa kunkin koeparametrin 115630 10 perustaso tallennetaan ja rotille annetaan suun kautta ruiskulla sopiva annos yhdistettä (75 % PEG 400 -suolaliuosvehiikkelissä) konsentraatioina siten, että tilavuus on 1 ml/kg ruumiinpainoa kohden. Yhdisteiden vaikutuksia koeparamet-reihin seurataan viiden tunnin ajan annostelusta.

5 Koetulokset sekä supistusten väliselle ajanjaksolle kuin myös sydä men lyöntinopeuksille ilmoitetaan keskiarvona ± SEM (keskiarvon keskivirhe) prosentuaaliselle muutokselle lähtötasosta, kunkin eläimen toimiessa omana kontrollinaan. MAP ilmoitetaan keskiarvona ± SEM mmHg muutokselle lähtötasosta.

10 Keksinnön mukainen yhdiste on vaikuttava edellä kuvatuissa kokeis sa, ja se on vaikuttava ja selektiivinen rakolle ilman merkittäviä sydänverisuoni-vaikutuksia, kun se annostellaan suun kautta, esimerkiksi annoksena 3 mg/kg edellä olevassa in vivo -seulonnassa.

Keksintöä valaistaan nyt seuraavin ei-rajoittavin esimerkein, joissa, 15 ellei toisin ole mainittu: (i) lämpötilat annetaan Celsius-asteina (°C); työt suoritettiin huoneen-tai ympäristön lämpötilassa, joka on 18-25 °C; (ii) orgaaniset liuokset kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla; liuottimien haihduttaminen suoritettiin käyttäen pyöröhaihdutinta alennetussa 20 paineessa (600 - 4 000 pascalia; 4,5 - 30 mmHg), hauteen lämpötilan ollessa korkeintaan 60 °C; !,’*· (iii) kromatografointi tarkoittaa tasapainokromatografiaa; käänteis- : faasikromatografointi tarkoittaa tasapainokromatografointia oktadekyylisilaanilla I · ’: (ODS) päällystetyllä alustalla, jonka partikkelin halkaisija on 32 - 74 μ ja joka tun- ··. 25 netaan nimellä "PREP-40-ODS" (Art 731740-100, Bodman Chemicals, Aston, :. PA, USA). Ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin silikageelilevyillä; ·. (iv) yleisesti reaktioiden kulkua seurattiin TLC:llä ja reaktioajat anne taan ainoastaan valaisutarkoituksessa; , (v) sulamispisteet ovat korjaamattomia, ja (haj.) tarkoittaa hajoamista; : 30 annetut sulamispisteet ovat arvoja, jotka on saatu kuvatulla tavalla valmistetuille -·* aineille; polymorfian vuoksi eristettyjen aineiden sulamispisteet voivat olla erilai- :· siä joissakin valmistuksissa; ·. (vi) lopputuotteiden protoniydinmagneettiresonanssispektrit (NMR) olivat tyydyttäviä; 115630 11 (vii) saannot annetaan ainoastaan valaisutarkoituksessa eivätkä ne välttmättä ole saantoja, jotka voidaan saada menetelmän huolellisella kehittämisellä; valmistukset toistettiin, mikäli tarvittiin lisää materiaalia; (viii) kun NMR-tiedot annetaan, ne ovat delta-arvojen muodossa 5 diagnosoitaville pääprotoneille, ja ne annetaan miljoonasosina (ppm) suhteessa tetrametyylisilaaniin (TMS), joka on sisäinen standardi, määritettynä 300 MHz:ssa, käyttäen perdeuteriodimetyylisulfoksidia (DMSO-dö) liuottimena; käytetään tunnettuja lyhenteitä signaalimuodoille; kytkentävakiot (J) annetaan Hz:nä; Ar tarkoittaa aromaattista protonia, kun tällaista merkintää käytetään; 10 (ix) kemiallisilla symboleilla on niiden tavanomaiset merkityksensä; käytetään Sl-yksiköitä ja -symboleja; (x) alennetut paineet annetaan absoluuttisina paineina pascaleina (Pa); kohotetut paineet annetaan mittauspaineena baareina; (xi) liuotinsuhteet annetaan tilavuus:tilavuusmuodossa (v/v); ja 15 (xii) massaspektrit (MS) ajettiin elektronienergian ollessa 70 elektro- nivolttia kemiallisessa ionisaatiomuodossa (Cl), käyttäen suoraan altistettua koetinta; ionisaatio, milloin se on ilmoitettu, saatiin aikaan elektronitörmäyksellä (El) tai nopealla atomipommituksella (FAB); m/z-arvot annetaan; yleisesti vain ionit, jotka osoittavat kantamassan, raportoidaan.

20 Esimerkki 1 (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1 H)-kino-• Ioni

Sekoitettu liuos, jossa oli (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-;* okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihappoa (3,93 g, 10,85 mmol) ·’ 25 N-metyylipyrrolidin-2-onissa (24 ml), laitettiin esilämmitetylle öljyhauteelle 210°C:seen 20 minuutiksi. Jäähdytetty reaktioseos kaadettiin sitten veteen (200 ml) ja uutettiin kahdesti etyylieetterillä. Yhdistetyt eetteriuutteet pestiin kah-: desti vedellä, kuivattiin (MgSCU), suodatettiin ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin harmahtavan valkoista kiinteää ainetta. Kromatografoimalla (eluentti: metyleeni- 30 kloridi/eetteri 9:1) ja trituroimalla etyylieetteri/heksaanissa saatiin otsikon yhdiste ; (3,42 g, 79 %) valkoisena kiinteänä aineena, sp. 187-189 °C.

NMR: 1,88 -1,91 (m, 2H, CH2), 2,21 - 2,25 (m, 2H, CH2); 2,53 - 2,64 (m, 2H, CH2), 4,68 (d, 1H, J = 5,3 Hz, Ch), 5,61 (d, 1H, J = 5,3 Hz, CH), 7,40-;: 7,54 (m, 2H, Ar); 7,61 - 7,66 (m, 2H, Ar), 9,42 (s, 1 H, NH); MS: m/z = 319 (M+1); 115630 12 [gt]d23 = 608,8 °C (c = 0,665, metanoli). Analyysi Ci7Hi3F3N20:lle: Lasketut arvot: C, 64,14; H, 4,12; N, 8,80; Saadut arvot: C, 64,07; H, 4,24: N, 8,78.

Tälle yhdisteelle suoritettu F-NMR-analyysi kiraalisen siirtoreagens-sin, (B)-(-)-1-(9-antryyli)-2,2,2-trifluorietanoli-dii (CDCI3 -30 °C:ssa), läsnä olles-5 sa osoitti, että (S)-(-)-enantiomeeria oli mukana noin 99 % ee.

Välituote, (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso- 1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihappo valmistettiin seuraavalla tavalla.

a. (±)-isobornyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaatti 10 Sekoitettua seosta, jossa oli etyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaattia (160,28 g, 870 mmol) ja (±)-isoborneolia (86,81 g, 563 mmol), sekoitettiin 130°C:ssa (hauteen lämpötila) 18 tuntia 4 tuuman Vigeraux-kolonnin alla, jonka avulla etanoli tislautui pois. Flauteen lämpötila nostettiin sitten 150 °C:seen jäljellä olevan pois tislaamiseksi; yhteensä 29 ml (88 % teoreettisesta määrästä) kerättiin tails teen. Jäljellä oleva seos fraktioitiin sitten alennetussa paineessa, jolloin saatiin (±)-isobornyyli-4,4,4-trifluorimetyyliasetasetaattia värittömänä öljynä (124,6 g, 76 %); kp 84 - 92°/0,4 torr; NMR (CDCU3): 0,82 - ,17 (m, 11 H, CH3, CH2) 1,55 -1,84 (m, 5H, CH2, CH) 3,72 (s, diketomuoto CH2) 4,74-4,81 (m, 1H, -OCH) 5,59 (s, enolimuto CH) 11,97 (s, enolimuoto OH).

. 20 b. (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso- .' 1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaatti i V Sekoitettua seosta, jossa oli (±)-isobornyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaat- tia (82,6 g, 282,8 mmol), 1,3-sykloheksaanidionia (31,7 g, 282,8 mmol), 3-syaa-·;’ nibentsaldehydiä (37,1 g, 282,8 mmol) ja ammoniumasetaattia (54,4 g, : 25 706,3 mmol) etanolissa (2 070 ml), kuumennettiin palautusjäähdytyslämpötilas- sa neljä tuntia. Kun saostunut 9-(3-syaanifenyyli)-3,4,6,7,9,10-heksahydro-1,8-(2H,5H)-akridiinidioni oli poistettu suodattamalla, suodos väkevöitiin tyhjössä, i | Kromatografoimalla (eluentti: etyyliasetaatti/heksaani 7:3) saatiin (±)-isobornyyli- ': 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydro- y 30 kinoliini-3-karboksylaattia 92 g (63%) valkoisena kiinteänä aineena; s.p. 209-; 213 °C haj.; NMR: 0,63-0,73 (m, 9H, CH3), 0,86- 1,64 (m, 7H, CH2, CH), 1,84 -1,88 (m, 2H, CH2), 2,03 - 2,07 (m, 2H, CH2), 2.34 - 2,63 (m, 2H, CH2) 2,64 - 2,72 (m, 1H, CH), 3,29-3,96 (d, 1H, CH), 4,10-4,16 (m, 1H, CH), 7,22-7,25 (d, 35 1 H, OH), 7,39-7,45 (m, 2H, Ar), 7,49 (s, 1H, Ar), 7,57 - 7,61 (m, 1 H, Ar), 8,11 - 115630 13 8,13 (d, 1H, Ar); MS: m/z = 517 (M+1). Analyysi C28H3iF3N204.ile: Lasketutut arvot: C; 65,10; H; 6,05; N; 5,42; Saadut arvot: C; 64,93; H; 6,05; N; 5,22.

c. 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8,-heksahydro-kinoliini-3-karboksyylihappo 5 Sekoitettua seosta, jossa oli (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-tri- fluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaat-tia (8,5 g, 16,5 mmol), p-tolueenisulfonihappoa (1,05 g, 5,5 mmol) ja tolueenia (170 ml), kuumennettiin palautusjäähdytyslämpötilassa kolme tuntia. Reaktio-seos koostui liukenemattomasta kumista, joka sisälsi halutun hapon, sekä tolu-10 eeniliuoksesta. Dekarboksylaation estämiseksi käytettiin ainoastaan reaktio-seokselle riittävästi lämmitystä, jolloin seos kiehui rauhallisesti palautusjäähdytyslämpötilassa. Kun liuotin oli poistettu, jäännös jaettiin etyyliasetaatin ja veden kesken. Etyyliasetaatti pestiin vedellä, se erotettiin ja uutettiin kahdesti kylläisellä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella. Sekoitetut yhdistetyt natriumbikarbonaatti-15 uutteet jäähdytettiin jäähauteessa ja väkevää kloorivetyhappoa lisättiin tipoittain, kunnes liuos oli voimakkaasti hapan. Seos uutettiin eetterillä ja eetterikerros kuivattiin, suodatettiin ja väkevöitiin tyhjössä, jolloin saatiin keltaista öljymäistä kumia. Trituroimalla metyleenikloridi/heksaanissa saatiin karboksyylihappo (1,8 g, 31 %) harmahtavan valkoisena kiinteänä aineena. Aine identifioitiin NMR:llä ja 20 tiellä (silikageeli - 10 % metanoli kloroformissa, jossa oli muutama pisara etik-: kahappoa) aineeksi, joka on kuvattu ja karakterisoitu esimerkin kappaleessa i.

Etyyliasetaattikerros kuivattiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin epäpuh-·[ dasta (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso- 1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaattia, joka oli identtistä aikaisem-25 min valmistetun ja karakterisoidun näytteen kanssa; valkoista kiinteää ainetta; ;* sp 179- 180 °C; NMR: 0,61 -0,72 (m, 9H, CH3), 1,00-2,6 (m, 13H, CH2, CH), 4,45-4,57 (m, 1H, CH), 4,88-4,92 (d, 1H, CH), 7,46-7,55 (m, 3H, Ar), 7,65-7,69 (m, 1H, Ar), 9,70- 9,71 (d, 1H, NH), MS (Cl, CH4): 517 (m+1). Analyysi i C28H29F3N2C>4:lle: Lasketutarvot: C; 67,46; H; 5,86; N; 5,62; Saadut arvot: C; 30 67,29; H; 5,99; N; 5,71.

Talteen otettu (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaatti saatettiin olo-suhteisiin, jotka vastasivat esimerkissä 1, kohdassa c. kuvattuja olosuhteita, ja • näin saatiin lisää 1,1 g 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8,- *: 35 heksahydrokinoliini-3-karboksyylihappoa, jolloin kokonaissaanto oli 2,9 g (49 %).

115630 14 d. S-(-)-cr-metyylibentsyyliamiini-(S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorime-tyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihapposuola

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli raseemista 2-trifluorimetyyli-4-(3-syaanifenyyli)-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihappoa (28,2 5 g, 77,84 mmol) n-butanolissa (211 ml), lisättiin tolueenia (1 000 ml), sen jälkeen liuos, jossa oli S-(-)-a-metyylibentsyyliamiinia (9,4 g, 77,84 mmol) tolueenissa (198 ml). Kun oli seisotettu ympäristön lämpötilassa yön yli, syntynyt saostuma suodatettiin ja pestiin tolueenilla ja etyylieetterillä, jolloin saatiin 32 g valkoista suolaa. Uudelleenkiteyttämällä viidestä tolueeni/n-butanolista (3:1), kuumentaen 10 seosta, kunnes suola liukeni, saatiin suola valkoisena kiintenä aineena (7,77 g); sp. pehmenee ja muuttuu lasimaiseksi 112 -115 °C:ssa, neste sulaa 148-150 °C:ssa; NMR: 1,36- 1,38 (d, 3H, CH3), 1,75- 1,88 (m, 2H, CH2), 2,19-2,23 (m, 2H, CH2), 2,49 - 2,61 (m, 2H, CH2), 3,35 - 3,42 (m, vaihdettavissa oleva vesi) 4,24 - 4,26 (q, 1H, J = 6,8 Hz, Ch), 4,91 (s, 1H, CH), 7,16 - 7,60 (m, 9H, Ar); 15 MS: m/z = 363 (M+1); [a]D = -180° (c = 1,075, metanoli, 23 °C); 99 % ee 19F-NMR:llä CDCb.ssa. Analyysi C26H24F3N3O3-1.0 C4H9OH 0.5 H20:lla: Lasketut arvot: C, 63,59; H, 6,23; N, 7,42; Saadut arvot: C, 63,66; H, 6,15; N, 7,06.

Lisäkokeet osoittivat, että maksimilämpötilan uudelleenkiteytyksen aikana tulee olla korkeintaan 75 °C dekarboksylaation estämiseksi, ja uudel-20 leenkiteytyksen aikana ei tule sekoittaa, tai muuten enantiomeerinen voimistu-. minen on heikkoa.

e. (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trilfuorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahyd- : rokinoliini-3-karboksyylihappo : Jäähdytettyyn (jäähaude), sekoitettuun suspensioon, jossa oli S-(-)-o- :· 25 metyylibentsyyliamiinia (7,5 g, 15,5 mmol) vedessä (150 ml), lisättiin väkevää kloorivetyhappoa tipoittain, kunnes seos oli vahvasti hapan. Seos uutettiin kahdesti etyylieetterillä ja yhdistetty eetterikerros kuivattiin, suodatettiin ja liuotin : poistettiin, jolloin saatiin keltaista vaahtoa. Trituroimalla dikloorimetaanissa saa- 1 * * !'·’ tiin 4,9g (88%) karboksyylihappoa haalean keltaisena kiinteänä aineena; Sp.

30 206 - 208 °C; NMR: 1,74- 1,95 (m, 2H, CH2), 2,18-2,32 (m, 2H, CH2), 2,54- ,.:; * 2,73 (m, 2H, CH2), 4,92 (s, 1 H, CH), 7,47 - 7,52 (m, 3H, Ar), 7,46 - 7,68 (m, 1 H, O Ar), 9,60 (s, 1H, NH), 13,07 (s, 1H, COOH); MS: m/z = 363 (M+1).

; Välituote, 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-hek- >*.’ sahydrokinoliini-3-karboksyylihappo, joka on kuvattu esimerkissä 1.c., voidaan 35 vaihtoehtoisesti valmistaa esimerkissä 6 kuvatulia tavalla.

115630 15 f. 2-syaanietyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaatin 2-syaanietyylihemiasetaali

Seosta, jossa oli etyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaattia (30 ml, 205 mmol) ja 3-hydroksipropionitriiliä (7,11 g, 100 mmol), sekoitettiin 150°C:ssa (hauteen lämpötila) 18 tuntia 4 tuuman Vigreaux-kolonnin alla, jonka kautta etanoli tislau-5 tui pois. Jäljelle jäänyt seos fraktioitiin sitten ilmanpaineessa. Fraktion, joka tis-lautui 222 - 228 °C:ssa (11,71 g), määritettiin sisältävän noin 50 mooli-% ase-taattia NMR- ja massaspektrometrianalyysien perusteella; NMR (CDCb): 2,43 -2,65 (m, 2H) 2,76 - 2,99 (m, 4H) 3,78 - 3,82 (m, 1H) 4,13 - 4,15 (m, 1H) 4,33 -4,57 (m, 2H) 5,96 (s, 1H, OH).

10 g. 2-syaanietyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso- 1.2.3.4.5.6.7.8- oktahydrokinoliini-3-karboksylaatti

Sekoitettua seosta, jossa oli esimerkin 1.f. aine ja 3-syaanibentsalde-hydiä (7,34 g, 56 mmol), 1,3-sykloheksaanidionia (6,83 g, 56 mmol) ja ammoni-umasetaattia (13,10 g, 170 mmol) etanolissa (400 ml), sekoitettiin palautusjääh-15 dytyslämpötilassa 10 tuntia. Jäähdytetty liuos suodatettiin saostuneen 9-(3-syaanifenyyli)-3,4,6,7,9,10-heksahydro-1,8-(2H,5H)-akridiinidionin poistamiseksi. Jäähdytetty liuos haihdutettiin kuiviin ja jäännös kromatografoitiin (eluentti mety-leenikloridi, 1:1 etyyliasetaatti/metyleenikloridi ja etyyliasetaatti), jolloin saatiin 4,14 g 2-syaanietyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-20 1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaattia; NMR: 1,86-1,90 (m, 2H, i CH2) 1,94-2,18 (m, 2H,CH2) 2,31 -2,38 (m, 1H, alifaattinen 2,50 - 2,72 (m, 3H, : alifaattinen) 2,82 (d, 1H, alifaattinen, J = 11,9) 3,35 (br.s, 1H, alifaattinen) 3,94 - 4,02 (m, 2H, alifaattinen) 7,37 - 7,59 (m, 5H, Ar, OH) 8,16 (s, 1H, NH); MS: m/z 4 = 434 (M+1).

25 h. 2-syaanietyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso- 1.2.3.4.5.6.7.8- oktahydrokinoliini-3-karboksylaatti

Seosta, jossa oli 2-syaanietyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaattia (4,14g, 9,6 ;* mmol), p-tolueenisulfonihappoa (0,61 g, 3,2 mmol) ja tolueenia (100 ml), sekoi- 30 tettiin ja kuumennettiin palautusjäähdytyslämpötilassa Dean-Stark -laitteistossa : ’kaksi tuntia. Reaktioseos, joka käsitti tumman öljy- ja tolueenifaasit, jäähdytettiin ja kaadettiin 1,5 tuuman halkaisijaltaan olevaan kromatografointipylvääseen, jossa oli 90 g silikageeliä. Seos pestiin kolonnissa pienellä määrällä etyyliase-··’ taattia. Eluoimalla etyylieetterillä ja trituroimalla syntynyt kiinteä aine etyylieette- 35 rillä saatiin esteri keltaisenoranssina kiinteänä aineena (2,84 kg, 72 %); sp. 148 - 115630 16 151,5 °C; NMR: 1,79 - 1,99 (m, 2H,CH2) 2,19 - 2,33 (m, 2H, CH2) 2,50 - 2,74 (m, 2H, CH2) 2,85 (t, 2H, CH2) 4,15 - 4,27 (m, 2H, CH2) 4,94 (s, 1 H, CH) 7,47 - 7,63 (m, 3H, Ar) 7,65-7,67 (m, 1H, Ar) 9,84 (s, 1H, NH); MS: m/z = 416 (M+1). Analyysi C21 Hi6F3N303:lle: Lasketut arvot: C, 60,72; H, 3,88; N, 10,12; Saadut arvot: 5 C, 60,63; H, 3,80; N, 9,89.

i. 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokino- liini-3-karboksyylihappo Jäähdytettyyn (jäähaude), sekoitettuun suspensioon, jossa oli 2-syaanietyyli-2-trifluorimetyyli-4-(3-syaanifenyyli)-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydro-10 kinoliini-3-karboksylaattia (2,80 g, 6,74 mmol) 1,2-dimetoksietaanissa (8,5 ml), lisättiin tipoittain 10 minuutin aikana esijäähdytettyyn liuokseen, jossa oli natri-umhydroksidia (0,80 g, 20,0 mmol) vedessä (6,5 ml). Saatiin tummanruskea liuos, kun lähtöaine-esteri liukeni. Kun oli sekoitettu huoneenlämpötilassa kaksi tuntia, keltaisenruskea liuos laimennettiin vedellä (16 ml), se palautettiin jäähau-15 teelle ja sitä sekoitettiin samalla, kun seosta käsiteltiin väkevällä kloorivetyhapol-la (2 ml). Ruskea öljy saostui, ja se kiinteytyi sekoitettaessa kermanväriseksi kiinteäksi aineeksi. Kiinteä aine suodatettiin ja pestiin kylmällä vedellä. Ainetta kuivattiin 50 °C/0,1 tornssa yön yli, jolloin saatiin karboksyylihappo (2,33 g, 95 %); sp. 209 - 211 °C haj., ilmenee kaasun kehittymistä; NMR: 1,75 -1,88 (m, 20 1 H, CH2) 1,89- 1,95 (m, 1H, CH2) 2,18 - 2,32 (m, 2H, CH2) 2,54 - 2,73 (m, 2H, : CH2) 4,92 (s, 1 H, CH) 7,47 - 7,54 (m, 3H, Ar) 7,65 - 7,67 (m, 1 H, Ar) 9,62 (s, 1 H, NH) 13,10 (3, 1H, C02H); MS: m/z = 363 (M+1). Analyysi CieHisFa^Os'.Ha: Lasketut arvot: C, 59,67; H, 3,62; N, 7,73; Saadut arvot: C, 59,53; H, 3,84; N, 7,69.

1 · ! Esimerkki 2 25 (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kino-loni : : i Esimerkin 1 tuote valmistettiin suuremmassa mittakaavassa seuraa- vasti: ,·. Sekoitettua liuosta, jossa oli (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorime- 30 tyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihappoa (50,5g, 139,4 mmol) N-metyylipyrrolidin-2-onissa (325 ml), kuumennettiin nopeasti (kuumen-’ : nusmantteli) 20 minuuttia 180 °C:ssa (sisäinen lämpömittari), sitten sitä pidettiin , tässä lämpötilassa vielä 20 minuuttia. Jäähdytetty reaktioseos kaadettiin veteen (1 200 ml) ja uutettiin kahdesti etyyliasetaattiin. Yhdistetyt uutteet pestiin kah- 115630 17 desti vedellä, kuivattiin (MgSCU), suodatettiin ja liuotin poistettiin, jolloin saatiin harmahtavan valkoista kiinteää ainetta. Kromatografoimalla (eluentti: metyleeni-kloridϊ/etyyliasetaatti 85:15) ja uudelleenkiteyttämällä asetonitriilistä saatiin otsikon yhdiste (32,85 g, 74 %) valkoisena kiinteänä aineena, joka oli identtistä esi-5 merkin 1 tuotteen kanssa.

Esimerkki 3 Välituote, (±)-isobornyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaatti (esimerkistä 1a) valmistettiin suuremmassa mittakaavassa seuraavasti:

Sekoitettua seosta, jossa oli etyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaattia (2,75 10 kg, 14,91 mol) ja (±)-isoborneolia (1,53 kg, 9,93 mol), sekoitettiin 105 °C:ssa (sisäinen lämpömittari) 20 tuntia tislauspään alla, jonka kautta etanoli tislautui pois. Lämpötilaa nostettiin sitten vähitellen 10 tunnin aikana 155 °C:seen jäljellä olevan etanolin tislaamiseksi pois; yhteensä 650 ml (114 % teoreettisesta) kerättiin taiteen. Jäljellä ole seos fraktioitiin sitten alennetussa paineessa, jolloin saatiin 15 (±)-isobornyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaattia värittömänä öljynä (2,21 kg, 76 %), joka oli identtistä esimerkin 1a tuotteen kanssa.

Esimerkki 4 Välituote, (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso- 1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaatti (esimerkistä 1b) valmistettiin . j 20 suuremmassa mittakaavassa seuraavasti: sekoitettuun seokseen, jossa oli (±)-isobornyyli-4,4,4-trifluoriasetasetaattia (830,6 g, 2,86 mol), 1,3-sykloheksaani-dionia (320,7 g, 2,86 mol), 3-syaanibentsaldehydiä (375,0, 2,86 mol) ja ammo-. \ niumasetaattia (551,0 g, 7,15 mol) etanolissa (15,01), kuumennettiin palautus- jäähdytyslämpötilassa 8 tuntia. Jäähdytetty seos suodatettiin 9-(3-syaanifenyyli)-25 3,4,6,7,9,10-heksahydro-1,8-(2H,5H)-akridiinidionin poistamiseksi. Suodos vä- kevöitiin puoleen tilavuuteensa tyhjössä. Ensimmäinen erä haluttua tuotetta kerättiin talteen suodattamalla ja pesemällä etyylieetterillä (657,0 kg, 44,5 %).

: : Suodokset ja pesuvedet väkevöitiin, jolloin saatiin toinen erä tuotetta (225,0 g, 15,2 %). Tämä yhdistetty aine käytettiin puhdistamatta. Näyte puhdistettiin kro-·;· 30 matografoimalla (eluentti: etyyliasetaatti/heksaani 7:3), jolloin saatiin (±)-isobor- · . nyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-okta- hydrokinoliini-3-karboksylaattia valkoisena kiinteänä aineena, joka vastasi esi-·' : merkissä 1b saatua tuotetta.

115630 18

Esimerkki 5 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydro-kinoliini-3-karbksyylihappo (esimerkistä 1c) valmistettiin suuremmassa mittakaavassa seuraavasti: 5 Sekoitettua seosta, jossa oli (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2- trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksy-laattia (800,0 g, 1,55 mol), p-tolueenisulfonihappoa (148,0 g, 0,78 mol) ja jää-etikkahappoa (7,51), kuumennettiin (kuumennusmantteli) yksi tunti 15 min 100 °C:seen. Seos pidettiin 102- 104 °C:ssa kuusi tuntia, jossa vaiheessa TLC 10 (silikageeli-etyyliasetaatti/heksaani 6:4) osoitti, että reaktio oli päättynyt. Dekar-boksylaation minimoimiseksi käytettiin ainoastaan riittävästi lämpöä reak-tioseokselle, jota pidettiin maksimilämpötilassa 104 °C. Kun liuotin oli poistettu, jäännös jaettiin etyyliasetaatin ja veden kesken. Etyyliasetaatti pestiin vedellä, erotettiin ja uutettiin kolmesti kylläisellä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella. Se-15 koitetut yhdistetyt natriumbikarbonaattiuutteet jäähdytettiin jäähauteessa ja lisättiin väkevää kloorivetyhappoa tipoittain, kunnes liuos oli voimakkaasti hapan. Seos uutettiin etyylieetterillä ja yhdistetyt uutteet kuivattiin (MgSCU), suodatettiin ja väkevöitiin tyhjössä, jolloin saatiin keltaista vaahtoa. Trituroimalla metyleeni-kloridi/heksaanissa saatiin karboksyylihappo (289,0 g, 51,5 %) vaalean keltaise-20 na kiinteänä aineena. Aine oli identtistä NMR.n ja tlc:n mukaan (silikageeli -. 10% metanoli kloroformissa, jossa oli muutama pisara etikkahappoa) esimer kissä 1, kohdassa i. kuvatun ja karakterisoidun aineen kanssa.

: Etyyliasetaattikerros kuivattiin (MgS04), suodatettiin ja haihdutettiin • : tyhjössä, jolloin saatiin epäpuhdasta (±)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli- \ 25 4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinolonia (490 g) vahamaisena vaalean keltaisena kiin- ,, j* teänä aineena. Tähän aineeseen viitataan tästä eteenpäin rasemaattina.

Esimerkki 6 • ·( Välituote, (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso- 1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihappo (esimerkistä 1 e) valmistettiin ;'* 30 suuremmassa mittakaavassa seuraavasti: ,Jäähdytettyyn (jäähaude), sekoitettuun suspensioon, jossa oli (S)-(-)-: ’ ’ : a-metyylibentsyyliamiinia-(S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso- : 1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihappposuolaa (68,0 g, 140,6 mmol) ;,V vedessä (700 ml), lisättiin väkevää kloorivetyhappoa tipoittain, kunnes seos oli 35 vahvasti hapan. Seos uutettiin neljä kertaa etyylieetterillä, ja yhdistetyt uutteet 19 115630 kuivattiin (MgS04), suodatettiin ja liuotin poistettiin, jolloin saatiin keltaista vaahtoa (50,6 g, 99%). Trituroimalla metyleenikloridi/heksaanissa saatiin puhdas näyte karboksyylihappoa haalean keltaisena kiinteänä aineena, joka oli identtistä esimerkin 1 e tuotteen kanssa.

5 Esimerkki 7

Otsikon yhdiste, (S)-(-)-4-(3-syaanifenyyli)-2-trilfuorimetyyli-4,6,7,8-tetrahydro-5(1H)-kinoloni eristettiin puhdistetusta rasemaatista valmistavalla ki-raalisella kromatografialla.

Käsittelemätön rasemaatti (2,95 kg - aine yhdistetty kuudesta yhtälö suuresta erästä, jotka eristetty esimerkissä 5 kuvatulla tavalla) puhdistettiin kro-matografoimalla (eluentti: metyleenikloridi/etyyliasetaatti 85:15), jolloin saatiin puhdistettu rasemaatti (580,8 g), joka erotettiin alla kuvatulla tavalla. Tämän aineen talteenottoa alussa tapahtuvan puhdistuksen aikana ei ole optimoitu.

Puhdistetun rasemaatin (580,0 g) valmistava kiraalinen kromatogra-15 fointi suoritetiin CHIRALPACKrAD™ (tavaramerkki) -kolonnissa (amyloosi-kantaja-aine, 10x50 cm, eluentti: heksaani/etanoli 85:15). Näytteen kantaliuos valmistettiin liuottamalla aluksi yhdiste etanoliin, sitten laimentamalla liuos hek-saanilla, kunnes lopullinen liuostinkoostumus oli sama kuin saadun eluentin liuo-tinkoostumus. Kantaliuoksen lopullinen konsentraatio oli 6 g/litra. Kukin kroma-20 tografointikierros suoritettiin injisoimalla 500 ml kantaliuosta ja eluoiden virtaus-· nopeudella 200 ml/min. (S)-(-)-enantiomeeri (otsikoitu yhdiste) oli ensimmäiseksi kolonnista eluoitunut piikki, (+)-enantiomeeri eluoitui seuraavaksi. Haihduttamal-la eluaatti tyhjössä saatiin (S)-(-)-enantiomeeri (281,1 g, 99,7 % ee, 98,6 % ke- miallinen puhtaus) harmahtavan valkoisena kiinteänä aineena. Uudelleenkiteyt- 25 tämällä asetonitriilistä (1 000 ml) saatiin 261,7 g otsikon yhdistettä valkoisena ki-·. teisenä kiinteänä aineena, joka oli identtistä joka suhteessa esimerkissä 1 vai- mistetun aineen kanssa.

• ; Esimerkki 8 .Seuraavassa valaistaan lääkemuuotokoostumuksia, jotka sisältävät 30 yhdisteen (tästä eteenpäin "yhdiste X"), terapeuttiseen tai ennalta ehkäisevään käyttöön ihmisille: # 115630 20 (a) Tabletti mg/tabletti

Yhdiste X 50,0

Mannitoli, USP 223,75 5 Ristiinsidottu karmelloosinatrium 6,0

Maissitärkkelys 15,0

Hydroksipropyylimetyyliselluloosa (HPMC), USP 2,25

Magnesiumstearaatti 3,0 10 (b) Kapseli

Yhdiste X 10,0

Mannitoli, USP 488,5

Ristiinsidottu karmelloosinatrium 15,0

Magnesiumstearaatti 1,5 15

Edellä olevat formulaatiot voidaan saada farmasian teknologiassa tunnetuja menetelmiä käyttäen. Tabletit voidaan enteropäällystää tunnetuin tavoin, esimerkiksi selluloosa-asetaattiftalaattipäällysteellä.

} 21 I I ο ο ου

Kaavoja 0 N CFo Η 11 ^ν^/'^'·'·'· H CFn

H

IX

22 115630

Kaavio I

o

0 O CN

xx * fr + Q

CF3 ^ ^ ORa ^•''C)

III CHO

n/ o kJ o °Ra kklt|iA^CF3

H OH

IVa .: \/ :. ORa CF^ I 3

H

i iv * ;· \/ : “’ 11 ί j 23 1 1 5630 t

j Kaavio II

j

| 0 0 J

ί -ν'·-1? ά.

CHO

\/ ° 0 0Ra j I \ 3

H OH

IVa \/

II

»

Claims (4)

115630

1. Menetelmä 4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-5-okso-1,4,5,6,7,8-heksahydrokinoliini-3-karboksyylihapon valmistamiseksi, tunnettu siitä, et- 5 tä saatetaan (±)-isobornyyli-4-(3-syaanifenyyli)-2-trifluorimetyyli-2-hydroksi-5-okso-1,2,3,4,5,6,7,8-oktahydrokinoliini-3-karboksylaatti reagoimaan p-tolueeni-sulfonihapon ja olennaisesti vedettömän liuottimen läsnä ollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotin on jääetikkahappo.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan lämpötilassa 100-104 °C.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan lämpötilassa 102-104 °C. « k i · » » * I · » 115630