FI111009B - Menetelmä streptogramiinien puhdistetun muodon valmistamiseksi - Google Patents

Description

111009

Menetelmä streptogramiinien puhdistetun muodon valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää streptogramiinien 5 puhdistetun muodon valmistamiseksi, joka sisältää ainakin yhtä streptogramiinien ryhmään B kuuluvaa komponenttia sekoitettuna ainakin yhteen A-ryhmän "vähäisempään" komponenttiin, joka määritellään jäljempänä yleisellä kaavalla (II) 10 Tunnetuista streptogramiineista eristettiin ensim mäisen kerran vuonna 1955 pristinamysiini (RP 7293), Streptomyces pristinaespiraliksen tuottama luonnollinen antibakteerinen aine. Pristinamysiini, jota myydään kaupallisesti nimellä PyostacineR, sisältää pääasiassa 15 pristinamysiini IA:ta ja pristinamysiini IIArta.

Toista streptogramiinien luokkaan kuuluvaa anti-bakteerista ainetta, virginamysiiniä, valmistetaan Streptomyces virginiaestä, ATCC 13161 [Antibiotics and Chemotherapy, 5, 632 (1955)]. Virginiamysiini (StaphylomycineR) 20 sisältää pääasiassa faktori S:ää ja faktori Mitä.

US-patentissa nro 3 325 359 on kuvattu farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät antibioottisia aineita, jotka ovat muodostuneet antibiootista 899: faktori S:stä ja faktori Ml:stä.

25 FR-patenttihakemuksessa nro 2 619 008 on kuvattu A-ryhmän ja B-ryhmän komponenttien käyttöä aknen hoitoon.

Streptogramiinien luokkaan kuuluvat antibakteeri-set aineet ovat muodostuneet 2 komponenttiryhmän seoksesta: B-ryhmän komponentista ja A-ryhmän komponentista, jon-30 ka kummallakin ryhmällä on oma antibakteerinen vaikutus.

.. On osoitettu, että näiden kahden ryhmän komponenttien se- * koitus aiheuttaa synergiaa, jonka seurauksena saadaan aikaan suurempi bakteriostaattinen ja bakterisidinen vaiku- * tus sekä vaikutuskirjon laajeneminen.

35 111009 2

Teoksissa Streptograminen als Modelsysteme fiir den Kationentransport durch Membranen, Dissertation zur Erlän-gung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaft-lichen Facultät der Georg-August Universität zu Göttingen, 5 Göttingen 1979, Antibiotics III, 521, (1975) ja Antibio tics of the virginiamycin family, Inhibitors, which contain synergistic components, C. Cocito, Microbiological Reviews, 145 - 98 (1979), on kuvattu streptogramiinien ryhmien A ja B komponentteja. J. Preud'Homme, P. Tarridec 10 ja A. Belloc, Bull. Soc. Chim. Fr., 2, 585 (1968) ovat myös kuvanneet luonnon pristinamysiiniä sekä sen sisältämiä erilaisia komponentteja.

Kaikkien puhtaiden streptogramiinien yhdistämisyrityksiä häiritsee systemaattisesti A-ryhmän [pristi-15 namysiini IIA (PIIA)] pääasiallinen komponentti, jota pidetään vaikutuksen ja synergiavaikutuksen aiheuttajana. Tutkimukset ovat siis osoittaneet tämän komponentin tärkeyden paremman synergian aiheuttajana: EP-patentti 506 561 (sivu 2).

20 Kuitenkaan nämä yritykset eivät ole olleet menes tyksellisiä, osaksi teollisen valmistamisen vaikeuksista johtuen ja ennen kaikkea koska puhdistettu pristinamysiini IIA on kiteinen yhdiste, jonka biologinen saatavuus on osoittautunut liian heikoksi, jotta sitä voitaisiin kuvi-25 telia käytettävän lääkkeen vaikuttavana aineena.

Tähän asti tällaisten yhdisteiden teollisen valmistuksen kannalta katsottuna käytetyillä tekniikoilla ei ole saatu preparatiivisessa skaalassa riittävän puhdasta muotoa eikä riittävän tasalaatuisia ja toistettavia eriä 30 tuotannossa, jotta se olisi täyttänyt eräiden maitten la-.. kien ja rekisteröintiasiakirjojen vaatimukset.

Esimerkiksi luonnon pristinamysiinin teolliset erät sisältävät puhdistuksen jälkeen epäpuhtauksia, joiden määrä voi nousta 20 %:iin. Suoritetut puhdistusyritykset 35 ovat tähän asti systemaattisesti epäonnistuneet ja vielä 111009 3 usein aiheuttaneet komponenttien ryhmien hajoamista, koska on kyse hyvin herkistä yhdisteistä, joille lukuisat * toimenpiteet aiheuttavat rengasrakenteen aukeamisen tai A- ryhmän komponenttien dehydratoitumisen. Tämän takia on c 5 monia vuosia ajateltu, että puhtausastetta ei voitaisi parantaa. Vuonna 1988 puhdistusta pidettiin vielä ongelmana: J. of Liq. Chromatography, 11, (11), 2367 (1988) . Samoin vuonna 1988 N. K. SHARMA ja M. J. 0. ANTEUNIS julistivat myös, että virginiamysiinin kompo-10 nenttien puhdistaminen ja erottaminen olisi mahdollista analyyttisessä mittakaavassa, mutta ei yhdisteiden tuotannossa, kun niissä kohdatut vaikeudet ottaa huomioon: Bull. Soc. Chim. Belg., 97 (3) 193 (1988).

Tämän tilanteen seurauksena pristinamysiinin 15 (PyostacineR:n) myynti on rajoittunut tiettyihin maihin kuten Ranskaan ja Belgiaan. Tilanne on ollut sama virginiamysiinin (StaphylomycineR:n) kohdalla, jota myydään vain tietyissä maissa ihmislääketieteeseen tarkoitettuna, sekä mikamysiinin kohdalla, jonka myynti (rajoitettu 20 Japaniin) on nyt keskeytetty. Tämä on siis johtanut monissa maissa hoidon puuttumiseen tietyissä gram-positiivisten kokkien aiheuttamissa vakavissa infektioissa (etenkin metisilliinille resistenteissä stafylokokki-infektioissa) tai sukupuolitaudeissa.

25 Antibakteeristen aineiden alalla tunnetaan tapauk sia, joissa voi syntyä allergioita tai resistenssiä tiettyjen antibioottien antamisen jälkeen [New England Journal of Medicine, 324 (9), 601 (1991)]. Sairaalaympäristössä tunnetaan etenkin lukuisat Staphylococcus aureuksen resis-30 tentit kannat. Siksi on äärimmäisen hyödyllistä, että lää-karilla on käytössään suuri, kemiallisesti erilaisista yhdisteistä koostuva valikoima sovellettavaksi kunkin yksittäisen taudin hoitoon. Tämän takia jonkun tietyn ryhmän 4 myynnin loppuminen voi olla hyvin vakavaa, jopa dramaat- 35 tista, koska se voi aiheuttaa hoitomahdollisuuden loppu- 111009 4 mistä sairailta, jotka eivät siedä muunlaisia antibiootteja.

Täten suoritetut puhdistuskokeet on aina suoritettu streptogramiinien vähäisempien komponenttien poista-5 miseksi, joita on pidetty tarpeettomina ja pikemminkin epäpuhtauksina.

Luonnollisten streptogramiinien A-ryhmän komponenttien joukosta pristinamysiini IIB (PIIB) on vähäisempi komponentti, jonka paino-osuus on alle 10 % luonnon pris- 10 tinamysiinissä ja usein luokkaa 8 % tai jopa luokaa 6 % virginiamysiinissä.

Nyt on keksitty, että seos, joka sisältää yhtä tai useampaa B-ryhmän komponenttia ja jonka kaava on: 15 (katso kaava (I) sivulla 4) Λ , MV., V" o

1 ,OH

30 jossa Ax on radikaali, jonka yleinen kaava on: • *1 _

35 0 N jp 0 NH OH

Y^nAq (Ia) (Ia,} o o 5 11loop jossa R' on vetyatomi tai hydroksiradikaali ja Y on vety-. atomi, metyyliaminoradikaali tai dimetyyliaminoradikaali, R on etyyliradikaali, kun R' esittää vetyatomia, 5 R voi myös esittää metyyliradikaalia ja Ri ja R2 esittävät vetyatomia, tai Ai on radikaali, jonka kaava on: 10 .CHo O CT 3 (Ib) CH3 0 CH3 15 R on isobutyyliradikaali ja

Ri hydroksiradikaali ja R2 on metyyliradikaali, ja yhtä tai useampaa A-ryhmän "vähäisempää" komponenttia, jonka yleinen kaava on: o

20 11 /V ^ >OH

γ. o“3 V » γγγν 25 »' jossa R" on vetyatomi tai metyyli- tai etyyliradikaali, on erityisen mielenkiintoinen in vivo aktiivisuutensa vuoksi.

Keksintö koskee siten menetelmää streptogra-miinien puhdistetun muodon valmistamiseksi, joka sisältää 30 seosta, joka sisältää yhtä tai useampaa B-ryhmän komponenttia, jolla on edellä mainittu kaava (I), ja yhtä * tai useampaa A-ryhmän "vähäisempää" komponenttia, jolla on edellä mainittu kaava (II), kerakiteytettynä, ' kerasaostettuna tai fysikaalisena jauheiden seoksena.

35 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että 111009 6 streptogramiinien A-ryhmän komponentti tai komponentit kerakiteytetään streptogramiinien B-ryhmän komponentin tai komponenttien kanssa, sitten tarvittaessa saatu keraki- ' teytetty yhdiste sekoitetaan sopivaan tai sopiviin A- tai 5 B-ryhmän komponenttiin tai komponentteihin seoksen valmistamiseksi halutuissa suhteissa, tai kerasaostetaan kaavan (I) ja (II) mukaisten komponenttien liuoksista, tai vaihtoehtoisesti kera-kiteytetyn seoksen liuoksesta ja toisesta kaavan (I) tai 10 (II) komponentista, metyyli-isobutyyliketonissa, aseto nissa tai metyleenikloridissa.

Itse asiassa keksinnön mukaisilla seoksilla on biologista aktiivisuutta in vivo selvästi enemmän kuin luonnontuotteella (esimerkiksi luonnon virginiamysiinilla 15 tai pristinamysiinillä) tai seoksilla, joissa pää asiallinen komponentti sattuu olemaan A-ryhmää, ja etenkin niiden biologinen saatavuus on aivan tyydyttävä. Lisäksi näitä seoksia voidaan valmistaa huomattavassa mittakaavassa. Näin on mahdollista saada puhdasta ja biologisesti 20 saatavilla olevaa, aktiivisuustasoltaan hyvää lop putuotetta, joka sisältää alle 6 % epäpuhtauksia.

Kaavan (II) mukainen yhdiste, jossa R" on etyyli-radikaali ja jota kutsutaan jäljempänä pristinamysiini IIF:ksi (PIIF) ja yleisen kaavan (II) mukainen yhdiste, 25 jossa R" on vetyatomi ja jota kutsutaan jäljempänä IIGrksi (PIIG), ovat uusia yhdisteitä, jotka sisältävät streptogramiinien hyvin vähäisiä komponentteja, joiden painosuhde on alle 0,5 % luonnontuotteesta valmistetuissa erissä.

Keksinnön mukaiset seokset valmistetaan edulli-30 sesti suhteissa 10/90 - 90/10 (painona) tai mieluiten .. suhteissa 20/80 - 80/20. Ne ovat fysikaalisina jauheseoksina mutta myös kerasaostettuina tai keraki-teytettynä, kuten jäljempänä kuvataan.

111009 7

Kerakiteyttäminen suoritetaan vakioisissa stökio-metrisissä suhteissa, 1 mooli yleisen kaavan (I) mukaista ‘ komponenttia ja 2 moolia yleisen kaavan (II) mukaisen A-ryhmän komponenttia tai komponentteja [tämä stökiometria 5 vastaa noin 43 - 44/57 - 56 suhteellista osuutta painona, kun komponentti A on yleisen kaavan (I) mukaista yhdistettä, jossa Ai:n rakenne on (Ia)].

Keksinnön mukaista kerakiteytettyä seosta voidaan käyttää joko puhdistettuna ja stabiilina antimikrobisena 10 aineena, jolla on myös parempi in vivo aktiivisuus ja jonka biologinen saatavuus on hyvä, tai yleistä kaavaa (II) vastaavien streptogramiinien vähäisemmän komponentin puhdistusaineena .

Itse asiassa koskaan ei ole ollut mahdollista puh-15 distaa yleisen kaavan (II) mukaisen A-ryhmän komponenttia kiteyttämällä; tämän takia tähän asti on tunnettu vain kromatografisia menetelmiä yleisen kaavan (II) mukaisen A-ryhmän puhdistetun yhdisteen valmistamiseksi, eikä mitään muuta puhdistustapaa ole tunnettu näiden yhdisteiden 20 eristämiseksi suurempina määrinä.

Nyt on osoitettu, että yleisen kaavan (II) mukaisen A-ryhmän komponenttia voidaan valmistaa puhtaana edellä määritellyn kerakiteytetyn seoksen välituotteen kautta. Raakaseoksesta, joka sisältää ainakin 30 % yleistä 25 kaavaa (II) vastaavan A-ryhmän vähäisempää komponenttia liuotettuna orgaaniseen liuottimeen, kuten ketoniin (esimerkiksi asetoniin, metyylietyyliketoniin, metyyli-isobutyyliketoniin), esteriin (esimerkiksi etyyliasetaattiin, isopropyyliasetaattiin, butyyliasetaattiin, isobu-30 tyyliasetaattiin), kloorattuun liuottimeen (esimerkiksi metyleenikloridiin, kloroformiin, 1,2-dikloorietaaniin) tai nitriiliin (esimerkiksi asetonitriiliin) ja lisäksi yleisen kaavan (I) määrittelemää B-ryhmän komponenttia, ’ saadaan kerakiteytettyä yhdistettä edellä määritellyissä 35 suhteissa. On selvää, että lisätyn yleisen kaavan (I) 111009 8 mukaisen yhdisteen määrä valitaan sopivasti niin, että tämän yhdisteen jäljelle jäänyt konsentraatio (kera-kiteyttämisen jälkeen) on pienempi kuin sen liukoisuus väliaineeseen. On myös selvää, että yleisen kaavan (II) 5 mukaisen yhdisteen ja yleisen kaavan (I) mukaisen yhdis teen vastaavien pitoisuuksien vaihtelut alkuperäisessä seoksessa eivät muuta saatua kerakiteytettyä yhdistettä. Liuottamalla näin saatu kerakiteytetty seos liuottimeen, kuten esimerkiksi metyyli-isobutyyliketoniin tai dikloo-10 rietaaniin ja käsittelemällä happamassa ympäristössä (esimerkiksi rikkihapossa, kloorivetyhapossa) voidaan valmistaa orgaanisessa faasissa liuottimena, kuten esimerkiksi heksaanilla suoritetun käsittelyn jälkeen A-ryhmän vähäisempää komponenttia puhdistettuna ja ilman B-15 ryhmän komponenttia.

Tällä kerakiteytetyllä seoksella on sitä paitsi se etu, että sen säilyvyys on selvästi parempi, sen puhtaus suurempi ja ennen kaikkea sen teollinen valmistaminen on helpompaa.

20 On selvää, että tätä menetelmää voidaan soveltaa ehkä myös streptogramiinien B-ryhmän luonnollisten komponenttien modifioitujen johdannaisten kerakiteytettyjen seosten valmistamiseen ja että nämä kerakiteytetyt seokset kuuluvat myös keksinnön piiriin; lisäksi yleisen kaavan 25 (II) mukaisten vähäisempien komponenttien puhdistetut muodot tällaisista kerakiteytetyistä seoksista kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin.

Eräs hyvä keksinnön toteutustapa koskee pris-tinamysiini IB:n seosta [kuten se edellä määriteltiin, kun 30 Ai esittää yleisen kaavan (Ia) mukaista radikaalia, jossa .. Y on metyyliaminoradikaali ja R' on vetyatomi ja R on etyyliradikaali] tai virginiamysiini Sl:n seosta [kuten se edellä määriteltiin, kun Ai esittää yleisen kaavan (Ia) mukaista radikaalia, jossa Y ja R' ovat vetyatomeita ja R 35 on etyyliradikaali] tai virginiamysiini Sl:n ja Virginia- 111009 9 mysiini S4:n seosta [kuten se edellä määriteltiin, kun Ai on sama kuin virginiamysiini Sl:ssä ja R on metyyliradi-kaali] pristinamysiini IIB:n kanssa [kuten se edellä määriteltiin yleisellä kaavalla (II), jossa R" on metyyli] ja 5 joka sisältää vähemmän kuin 6 % epäpuhtauksia ja mieluiten alle 3 % epäpuhtauksia.

Eräs keksinnön hyvä toteutustapa koskee myös puhdistettua streptogramiinia, joka sisältää yleisellä kaavalla (I) määriteltyä streptogramiinien B-ryhmän komponen-10 tin ja yleisen kaavan (II) A-ryhmän komponentin seosta, joka sisältää A- ja B-ryhmien komponentteja, joiden osuus on vakio molaarisissa suhteissa, joka on noin 1/2.

Keksinnön mukaan uudet seokset, joissa on ainakin yhtä yleisen kaavan (I) mukaisten streptogramiinien B-ryh-15 män komponenttia ja ainakin yhtä yleisen kaavan (II) mukaisen A-ryhmän komponenttia, voidaan tehdä esimerkiksi valmistamalla kerakiteytettyä yhdistettä kuten edellä määriteltiin. Kun halutaan valmistaa seosta erilaisissa suhteissa, näin valmistettu kerakiteytetty yhdiste voidaan 20 sekoittaa ainakin yhteen yleisen kaavan (I) mukaiseen komponenttiin tai ainakin yhteen yleisen kaavan (II) mukaiseen A-ryhmän komponenttiin, jotka on sitä ennen puhdistettu ja sopivina määrinä haluttujen suhteitten valmistamiseksi, tai vielä yleisen kaavan (II) A-ryhmän komponent-25 tia (tai niiden seoksia) voidaan puhdistaa kerakiteytetys-tä seoksesta, sekoittamalla sitten halutuissa suhteissa yhden tai useamman yleisen kaavan (I) mukaisen B-ryhmän komponentin kanssa. Vaihtoehtoisesti keksinnön mukaisia seoksia voidaan valmistaa B-ryhmän komponent(t)i (e)n ja 30 yleisen kaavan (II) mukaisen A-ryhmän komponentin eristämisen jälkeen vastaavista luonnollisista streptogramii-neista puhdistamalla kumpikin näistä komponenteista, sekoittamalla sitten puhdistetut komponentit halutuissa suh-* teissä kuten edellä määriteltiin.

35 111009 10

Keksinnön mukaiset seokset voidaan myös kerasa-ostaa toivotuissa suhteissa yleisen kaavan (I) ja (II) mukaisten komponenttien liuoksista [tai vaihtoehtoisesti kerakiteytetyn seoksen liuoksesta ja toisesta yleisen 5 kaavan (I) tai (II) komponentista] metyyli-isobutyy-liketonissa, asetonissa tai metyleenikloridissa, kaatamalla heksaaniin, sykloheksaaniin tai veteen.

A- ja B-ryhmien komponenttien valmistus ja erottaminen suoritetaan fermentoimalla ja eristämällä komponen-10 tit fermentaatiomäskistä analogisesti menetelmille, joita on kuvattu julkaisuissa J. Preud'homme et ai., Bull. Soc. Chim. Fr., 2, 585 (1968), Antibiot. & Chemother., 5, 632 (1955) tai 7, 606 (1957), Chromatog. Sym., 2° Bruxelles 181 (1962), Antibiot. Ann., 728 784 (1954 - 1955), US-pa-15 tentissä nro 3 299 047 tai julkaisussa Streptograminen als

Modelsysteme fiir den Kationentransport durch Membranen, Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathema-tisch-Naturwissenschaftlichen Facultät der Georg-August Universität zu Gottingen, Gottingen 1979 tai kuten jäljem-20 pänä esimerkeissä kuvataan. Etenkin pristinamysiinien koh dalla A- ja B-ryhmien komponenttien erottaminen suoritetaan suspendoimalla raakastreptogramiini orgaaniseen liuottimeen, kuten asetaattiin (esimerkiksi etyyliasetaattiin) , jonka jälkeen ryhmä Ä:n raakakomponentti suodate-e 25 taan tai sentrifugoidaan ja B-ryhmän komponentti uutetaan happamassa ympäristössä, jonka jälkeen se uutetaan uudelleen metyleenikloridiin. A- ja B-ryhmien komponenttien erottaminen voidaan suorittaa myös happamalla uutolla streptogramiinien raakaliuoksesta metyyli-isobutyyliketo-30 niin, eristämällä sitten B-ryhmän komponentti vesifaasista ja eristämällä A-ryhmän komponentti saostamalla orgaani- « sesta faasista.

Erottamisen jälkeen streptogramiinien B-ryhmän komponenttien puhdistus voidaan suorittaa kiteyttämällä 35 alkoholista, kuten etanolista, metanolista tai isopropa- 111009 11 nolista, asetaatista (esimerkiksi isopropyyli- tai butyyliasetaatista), ketonista (esimerkiksi metyylietyy-. liketonista) tai asetonitriilistä tai kromatogra-fiällä.

Yleisen kaavan (II) mukaisen A-ryhmän komponent-tien 5 puhdistus voidaan suorittaa kromatografiällä eluoimalla asetonitriili-vesi-seoksesta.

Vaihtoehtoisesti vastaavasti yleisen kaavan (II) ja (I) mukaisten A- ja B-ryhmien komponenttien valmistus suoritetaan kuten FR-patenttihakemuksessa nro 2 689 518 10 kuvataan erillisellä fermentoinnilla seuraavien vaiheiden mukaisesti: - ensimmäinen vaihe (ei pakollinen), epäselektii-vinen mutageneesi streptogramiineja tuottavalla mikro-organismilla, ja 15 - toinen vaihe, selektiivisten mikro-organismien selektio.

Epäselektiiviset mikro-organismit ovat yleensä Actinomyceteksiä tai sieniä. Menetelmässä käyttökelpoisia mikro-organismeja ovat etenkin epäselektiiviset mikro-or-20 ganismit, jotka tuottavat streptogramiineja, joiksi valitaan pristinamysiini, virginiamysiini, mikamysiini, ost-reogrysiini, viridogriseiini, vernamysiini ja etamysiini. Esimerkkeinä epäselektiivisistä mikro-organismeista, joita voidaan käyttää, on mainittu alla olevassa taulukossa.

25 MIKRO-ORGANISMI ANTIBIOOTTI

t <

SIENET

Microspora sp. vernamysiini

STREPTOMYCES

S.alborectus virginiamysiini 30 S.griseus (NRRL2426) viridogriseiini S.lavendulae etamysiini S.loidensis (ATCC11415) vernamysiini S.mitakaensis (ATCC15297) mikamysiini • S.osteogriseus (ATCC27455) ostreogrysiini 35 S.pristinaespiralis (ATCC25486) pristinamysiini 111009 12 S.virginiae (ATCC13161) virginiamysiini

ACTINOMYCES

A.daghestanicus etamysiini

Aivan erityisesti valmistus suoritetaan mikro-or-5 ganismeista, joiksi on valittu Streptomyces alborectus, Streptomyces mitakaensis, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces ostreogriseus ja Streptomyces virginiae.

Ensimmäisessä valmistusvaiheessa epäselektiivisiä mikro-organismeja muunnellaan niin, että sen antibioottien 10 tuotannon kokonaiskapasiteetti nousee ja/tai niin, että se syntetisoi vain 2 streptogramiinien komponenttia. Tämä voidaan tehdä geneettisellä muuntelulla (mutaatio entsyymien rakennegeenien tasolla, joita käytetään biosynteesi-reitillä, tai sekvenssitasolla, jossa esimerkiksi tällais-15 ten geenien ekspressio voi tapahtua) tai biokemiallisesti (posttranslatorisen mekanismin modifikaatio, retroinhibi-tiomekanismin muutos jne...). Käytetään erilaisia mutage-neesiä aiheuttavia välineitä: - fysikaalisia aineet: rtg-säteet, ultravioletti- 20 säteet; tai kemialliset aineet: alkyloivat aineet, kuten etyylimetaanisulfonaatti (EMS), , N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiini (Delic et ai., Mutation Res. 9 (1970) 167 - 182), tai 4-nitrokinolin-l-oksidi (NQO); bialky- 25 loivat aineet; konjugoivat aineet; tai < - mikä tahansa DNA:hän insertoimalla mutaation aiheuttava systeemi ja erityisesti transposonit, integroituvat plasmidit, faagit tai profaagit, tai vielä - protoplastien fuusio (Cohen, Nature 268 (1977) 30 171 - 174).

Välineitä (yksin tai yhdessä) voidaan soveltaa epäselektiivisiin mikro-organismeihin itiöinä, alkioina tai vielä itämisen aikana tai rihmastoihin. Valmistukseen voidaan käyttää myös toimenpiteitä (tahattomia tai 35 tahallisia), joiden avulla saadaan mikro-organismeja, 111009 13 jotka voivat tuottaa selektiivisesti streptogramiinien komponentteja epäselektiivisistä mikro-organismeista. Toi- * nen valmistusvaihe koskee selektiivisten mikro-organismien identifiointia ja eristämistä. Tämä vaihe voidaan toteut- 5 taa etenkin herkkyystestillä jollekin bakteerille. On olemassa erilaisia bakteereita, jotka ovat herkkiä spesifisesti streptogramiinien A-ryhmän tai B-ryhmän komponenteille: esimerkiksi Bacillus subtilis (ATCC6633),

Bacillus circulans, Bacillus cereus (Watanabe, J. Antibio. 10 Ser. A XIII (1) (1960) 62) tai C.xerosis (edellä mainittu

Watanabe), jotka ovat herkkiä spesifisesti B-ryhmän komponenteille; Streptococcus agalactiae B96 (Antimicrob. Agents Chemother. 10(5) (1976) 795), Micrococcus luteus (edellä mainittu Prikrylova) tai Sareina lutea (ATCC9341), 15 jotka ovat herkkiä spesifisesti A-ryhmän komponenteille. On myös mahdollista valmistaa keinotekoisesti bakteereita, jotka ovat herkkiä streptogramiinien jollekin komponentille insertoimalla 2:lie streptogramiinien komponentille herkkään bakteeriin jommallekummalle resistentti geeni. 20 Tietyt näistä geeneistä on kloonattu (Le Goffic et ai., J. Antibio. XXX(8), 665 (1977); Le Goffic et ai., Ann. Microbiol. Inst. Pasteur 128B, 471 (1977); Solh et ai., Path. Biol. 32(5), 362 (1984), tällaisia geenejä on liitetty tiettyihin bakteereihin klassisilla molekyylibiologian 25 tekniikoilla. Selektiovaihe voidaan suorittaa myös ELISA-testillä komponenteille A tai B spesifisten vasta-aineiden avulla tai vielä analyyttisillä menetelmillä, kuten kroma-tografialla (nestekromatografia, ohutkerroskromatografia, jne.). Bakteerin herkkyystestin ollessa kysessä on lisäksi 30 suotavaa varmistaa selektio kromatografisella määrityksellä .

» « I b Täten keksinnön mukaan on nyt mahdollista valmistaa teollisessa mittakaavassa uutta puhdistettua strepto- * gramiinimuotoa, jonka epäpuhtauksien määrä, koostumuksen 35 määrittely ja tasalaatuisuus täyttävät rekisteröintiin Π1009 14 liittyvien lakien vaatimukset ja jolla on suurempi aktiivisuus in vivo ja jonka biologinen saatavuus on parempi sekä jonka toksisuus on vähäisempi. Uusi seos voi siis korvata hoidon puutteen tämänlaatuisilla antibak-5 teerisilla aineilla useissa maissa.

Uudella yleisen kaavan (I) mukaisten strepto-gramiinien B-ryhmän komponentin ja yleisen kaavan (II) mukaisten streptogramiinien A-ryhmän mukaisen komponentin seoksella on erityisen kiinnostava vaikutus in vivo 10 etenkin Gram-positiivisiin bakteereihin. In vivo hiirellä sen on osoitettu vaikuttavan Staphylococcus aureus IP 8203:een annoksilla 30 - 50 mg/kg oraalisesti.

Esimerkkinä useista yleisen kaavan (I) ja (II) mu kaisten komponenttien seosten CD50 arvoista oraalisesti 15 hiiren kokeellisessa Staphylococcus aureus IP 8203 -infektiossa annetaan alla olevassa taulukossa.

Alla olevassa taulukossa I tutkitut seokset valmistetaan kerasaostuksella heksaanista yleisen kaavan (I) ja (II) mukaisten komponenttien liuoksesta metyyli- 20 isobutyyliketonissa tai asetonissa:

Taulukko I

Yhdiste (I)/yhdiste (II)-seos CD50 (mg/kg) p.o.

PI (esimerkki 1)/PIIB (esimerkki 18) 10/90 44 25 20/80 32 30/70 30 70/30 30 80/20 30 90/10 50 30 Alla olevassa taulukossa II annetut seokset ovat kerakiteytettyjä yhdisteitä, jotka on valmistettu esimerkeissä kuvatulla tavalla.

111009 15

Taulukko II

Kerakiteytetty . yhdiste (I)/yhdiste (II) seos CD50 (mg/kg) p.o.

PI/PIIB (esimerkki 9) 38 5 PIA/PIIB (esimerkki 11) 28 PIB/PIIB (esimerkki 12) 32 PIC/PIIB (esimerkki 13) 36 PID/PIIB (esimerkki 14) 50

Faktori S/PIIB (esimerkki 15) 32 10 Faktori Sl/PIIB (esimerkki 16) 50

Faktori S/PIIF (esimerkki 17) 50

Alla olevassa taulukossa III kuvattu seos on valmistettu jauheiden fysikaalisena seoksena.

15 Taulukko III

Yhdiste (I)/yhdiste (II) -seos CD50 (mg/kg) p.o.

PIA (esimerkki 1)/PIIB

(esimerkki 18) 30/70 36

PIA (esimerkki 1)/PIIB

20 (esimerkki 18) 50/50 40

Faktori S (esimerkki 5)/PUB

(esimerkki 18) 30/70 44

Uusin seos ei ole lainkaan toksinen: minkäänlaista toksisuusilmiötä ei havaita hiirellä annoksella 150 mg/kg 25 oraalisesti (2 annosta).

( ·

Keksinnön mukaan, kun kerakiteytettyä seosta käytetään yleisen kaavan (II) mukaisen komponentin puhdistamistapana, se voidaan valmistaa happamalla uutolla kera-kiteytetyn yhdisteen liuoksesta ketonissa (esimerkiksi 30 metyyli-isobutyyliketoni) , sitten eristetään A-ryhmän komponentti uuttamalla saostaen orgaanisesta faasista.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä sitä mitenkään rajoittamatta.

* Seuraavissa esimerkeissä on selvää, että pitoisuu- 35 det on annettu painoprosentteina.

111009 16 B-ryhmän komponentin erottaminen ja puhdistaminen:

Esimerkki 1

30 kg raakapristinamysiiniä [pristinamysiini IA (PIA): 20,7 %, pristinamysiini IB (PIB): 3,9 %, pristina-5 mysiini C (PIC): 0,6 %, pristinamysiini ID (PID): 0,3 %, pristinamysiini IIB (PUB) : 8 %, pristinamysiini IIA

(PIIA): 45 %, pristinamysiini IIF (PIIF): < 0,5 % (ei määritetty), pristinamysiini IIG (PIIG): < 0,5 % (ei määritetty)] suspendoidaan 210 l:aan etyyliasetaattia ja sekoi-10 tetaan 15 tuntia huoneenlämpötilassa. Suspensio suodatetaan ja kerätty etyyliasetaattisuodos uutetaan kaksi kertaa 20 litralla 1 N rikkihappoa, sitten 20 litralla tislattua vettä. Yhdistetyt vesifaasit pestään 6 kertaa 15 litralla etyyliasetaattia, sitten pH säädetään 7:ään li-15 säämällä 30 litraa 10 % natriumbikarbonaattiliuosta ja uutetaan 3 kertaa 30 litralla metyleenikloridia. Metylee-nikloridifaasit yhdistetään ja pestään 10 litralla tislattua vettä. Metyleenikloridi tislataan sitten ja korvataan 50 litralla etanolia. Sitten seosta käsitellään kiehumis-20 pisteessä 0,8 kg:11a L3S hiiltä 30 minuutin ajan. Suodattamisen ja 2 kertaa 5 litralla etanolia suoritetun pesun jälkeen seos jäähdytetään 10 °C:seen 15 tunnin aikana. Kun suspensiota on pidetty tunnin ajan 10 °C:ssa, se suodatetaan ja pestään 3 kertaa 7 litralla etanolia. Kiinteän 25 aineen 40 °C:ssa alennetussa paineessa suoritetun kuivauk-

< I

sen jälkeen saadaan 5,7 kg puhdistettua pristinamysiini I (kutsutaan jäljempänä Piiksi).

Pitoisuus: 96,8 % (PIA: 81,1 %, PIB: 12 %, PIC: 2,6 %, PID: 1,1 %); 30 PIA:n saanto: 74 %.

1 500 g puhdistettua PI:tä liuotetaan 9 litraan 1,2-dikloorietaania, sitten lisätään 1,5 ekvivalenttia meripihkahappoanhydridiä ja 0,015 ekvivalenttia dimetyy-liaminopyridiiniä. Liuosta pidetään 1 viikko 20 °C:ssa, 35 sitten pannaan 10 kg silikageeliä (20 - 45 pm) sisältävään 111009 17 pylvääseen [pylvään korkeus: 1' m; halkaisija: 20 cm] .

Eluutio suoritetaan 1,2-dikloorietaani/metanolisuodatuk- * sella nopeudella 18 litraa/tunti 6 tunnin ajan; metanolin (5 % vesipitoisuus) osuutta nostetaan 0:sta 4 %:iin kroma- 5 tografian aikana. Otetaan talteen 47. fraktiota, joiden tilavuus on 2,4 litraa.

Fraktiot 5-15 yhdistetään, 1,2-dikloorietaani haihdutetaan ja korvataan 5 litralla etanolia. Kiteyttämi-sen jälkeen saadaan 365 g PIA:ta, jonka pitoisuus on 10 99,8 %.

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 kuvatun kromatografian fraktiot 36 -39 yhdistetään ja 1,2-dikloorietaani tislataan; näin saadaan 210 g kiinteää ainetta. 40 g tästä kiinteästä ainees-15 ta liuotetaan 8 litraan vettä, johon on lisätty 8 cm3 10 N kloorivetyhappoa. 3 tunnin seisottamisen jälkeen 90 °C:ssa liuos neutraloidaan pH 6,5:een natriumvetykarbonaatilla. Liuos uutetaan 3 kertaa 1 litralla etyyliasetaattia ja uutos pestään 2 kertaa 0,2 litralla vettä. Hiilikäsittelyn 20 jälkeen etyyliasetaatti haihdutetaan ja korvataan 600 o cm :llä etanolia. Uudelleenkiteyttämisen jälkeen saadaan 20 g PIB:tä, jonka pitoisuus on 97 %.

Esimerkki 3

Esimerkissä 1 kuvatun kromatografian fraktiot 22 -25 26 yhdistetään ja 1,2-dikloorietaani tislataan, näin saa- « daan 139 g kiinteää ainetta. Tämä kiinteä aine liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään 1,2-dikloorietaania ja pannaan silikageelipylvääseen. Eluutio suoritetaan 1,2-di-kloorietaani/metanoli-suodatuksella nopeudella 18 litraa/-30 tunti 6 tunnin ajan; metanolin (5 % vesipitoisuus) osuutta nostetaan 0:sta 5 %:iin kromatografian aikana. Otetaan talteen 48 fraktiota, joiden tilavuus on 2,4 litraa. Fraktiot 38 - 43 haihdutetaan ja kiinteä aine liuotetaan * 300 cm3:iin etanolia. Uudelleenkiteyttämisen jälkeen saa-35 daan 22 g PI:ä, jossa on 40 % PIC:ä. Peräkkäisillä silika- 111009 18 geelikromatografioilla (20 - 45 μπι) eluoimalla metyleeni-kloridi/metanoli (98/2 tilavuuksina) suodatuksella voidaan saada 5 g kiinteää ainetta, joka metyyli-isobutyyliketo-niin vatkaamisen ja etanolista uudelleenkiteyttämisen jäl-5 keen sisältää 95 % PIC:ä.

Esimerkki 4 1000 g PI:tä, jota on valmistettu kuten esimerkissä 1 kuvattiin, suspendoidaan mahdollisimman pieneen määrään kloroformia ja puhdistetaan peräkkäisillä frakti-10 oinneilla silikageelipylväästä (20 - 45 pm) . Kun on elu-oitu kloroformilla, joka sisältää 2 - 5 % metanolia, saadaan yhdistettä, joka konsentroidaan kuiviin. Sitten tämä yhdiste puhdistetaan 2 peräkkäisellä DiaionR-hartsia sisältävällä pylväällä, joiden suodatus suoritetaan 15 asetonitriili/vesi-seoksella (60/40 tilavuuksina). Fraktiot tutkitaan kromatografiällä. PID:tä sisältävät fraktiot yhdistetään ja konsentroidaan kuiviin. Näin saadaan noin 3 g yhdistettä, jonka PID pitoisuus on 60 %.

Täydennyspuhdistus suoritetaan vastavirtakromatografiällä 20 käyttämällä liuotinseosta metyyli-isobutyyliketoni/ase-toni/muurahaishappo (40/2/40 tilavuuksina). PID:tä sisältävien fraktioiden konsentroinnilla saadaan 1 g kiinteää ainetta, joka sisältää on 95 % PID:tä.

Esimerkki 5 25 400 g StaphylomysiiniR:ää (tabletteina - koostumus alussa: virginiamysiini SI (SI): 3,4 %, virginiamysiini S4 (S4): 0,9 %) pannaan 4 litraan vettä.

Tabletit hajotetaan sekoittamalla 15 minuuttia 20 °C:ssa. Lisätään 1 litra metyleenikloridia ja sekoitus-30 ta jatketaan 1 tunti. Sitten metyleenikloridifaasi dekan-toidaan ja suodatetaan, kaadetaan sitten 30 minuutin aikana 5 litran tilavuuteen heksaania sekoittaen. 1 tunnin sekoittamisen jälkeen suspensio suodatetaan ja kiinteä aine pestään 3 kertaa 250 cm3:llä heksaania. Kuivauksen 35 jälkeen otetaan talteen 52 g kiinteää ainetta, joka sus- 111009 19 pendoidaan 370 cm3:iin etyyliasetaattia. Suoritetaan 2 peräkkäistä vatkausta 20 °C:ssa 18 tunnin ajan. Kutakin vat-kausta vastaava suodos haihdutetaan kuiviin, liuotetaan sitten 850 cm3:iin kiehumispisteessä olevaa metanolia. Kun 5 lämpötila on laskenut asteittain -20 °C:seen 16 tunnin aikana, kiinteä aine kerätään suodattamalla ja pestään pienellä määrällä metanolia. Kun kiinteä aine on kuivattu 35 °C:ssa alennetussa paineessa, saadaan 9 g faktori S:ä (virginiamysiini S:ä).

10 Pitoisuus: 96 % (SI: 75,4 %, S4 : 20,6 %) .

Faktori SI:n saanto (virginiamysiini SI): 50 %.

Esimerkki 6 1 g edellisen esimerkin 5 mukaan valmistettua faktori S:ää, joka on liuotettu asetonitriiliin 125 mg/cm3, 15 puhdistetaan 4 kromatografiavaiheella Nucleosil5C8R-pyl-väässä (korkeus 25 cm, ulkohalkaisija 2,54 cm) injektoi- o maila 2 cm :n tilavuus ja eluoimalla vesi/asetonitriili -60/40- seoksella (tilauvuuksina). Kullakin kerralla kerätään 120 cm3:n tilavuus, joka sisältää faktori Sl:ä, eli 20 kaikkiaan 480 cm3. Kromatografia toistetaan 4 kertaa kaikkiaan 1 g: n faktori S: n käsittelemiseksi. Näin saadaan talteen noin 500 cm3: n tilavuus, joka sisältää faktori Sl:ä. Asetonitriili poistetaan pyöröhaihduttajalla. Vesi-faasi uutetaan 3 kertaa 50 cm3:llä dikloorimetaania. Mety-25 leenikloridifaasit yhdistetään, pestään 50 cm3:llä tislat- 1 - tua vettä, kuivataan natriumsulfaatin päällä ja suodatetaan. Dikloorimetaani poistetaan pyöröhaihduttajalla alennetussa paineessa [667 Pa (5 mm Hg)] . Näin saadaan 0,67 g faktori Sl:ä, jonka pitoisuus on 99,6 %.

30 A-ryhmän raakakomponenttien valmistus:

Esimerkki 7 • · · 500 g raakapristinamysiiniä [pristinamysiini IA (PIA): 20,7 %, pristinamysiini IB (PIB): 3,9 %, pristina-* . mysiini IC (PIC): 0,6 %, pristinamysiini ID (PID): 0,3 %,

35 pristinamysiini IIB (PUB): 8 %, pristinamysiini IIA

111009 20 (PIIA): 45 %] suspendoidaan 50 litraan metyyli-isobutyyli-ketonia. Tämä liuos uutetaan 5 kertaa vesifaasilla, joka sisältää 2,5 litraa vettä ja 2,5 litraa 1 N rikkihappoa, pestään sitten 3 kertaa 10 litralla vettä. Metyyli-isobu-5 tyyliketonia käsitellään sitten 7,5 litralla natriumvety-karbonaatin vesiliuoksella 35 g/1, pestään sitten 5 litralla vettä. Kullakin kerralla vesifaasi sekoitetaan orgaaniseen faasiin, dekantoidaan ja erotetaan.

Saatu orgaaninen faasi saatetaan kosketuksiin 10 750 g:n kanssa alumiinioksidia, suodatetaan, konsentroi daan, kunnes tilavuus on noin 4 litraa ja liuotetaan 5 tilavuuteen heksaania. Saatu sakka suodatetaan ja kuivataan. Näin saadaan 300 g yhdistettä, joka suspendoidaan 1 litraan isopropanolia. 55 °C:ssa tapahtuneen 45 minuutin 15 sekoittamisen jälkeen suodatetaan 4 °C:ssa. Suodoksen emä-liuokset konsentroidaan kuiviin, liuotetaan 500 cm3:iin metyyli-isobutyyliketonia, johon kaadetaan 5 tilavuutta heksaania. Sakka suodatetaan, pestään heksaanilla ja kuivataan 40 °C:ssa alennetussa paineessa. Näin saadaan 69 g 20 PIIB:tä raakatuotteena, joka sisältää 36 % PIIBttä, 6 % PIIArta eikä sisällä enää PIA:ta.

Esimerkki 8 60 g PUB raakatuotetta, joka on valmistettu esimerkin 7 mukaan, puhdistetaan useilla toimenpiteillä, , 25 Nucleosil5C8R -pylväskromatografiällä (pylvään halkaisija 5 cm, korkeus 30 cm), jolla suodatetaan eluoimalla vesi/-asetonitriilillä 60/40. Näin saadaan 250 mg pristinamysii-ni IIF:ä (PIIF).

Kerakiteytetyn yhdisteen valmistus 30 Seuraavissa esimerkeissä on osoitettu, että kera kiteytetyn yhdisteen röntgendiffraktiospektri on erilainen kuin kiteytetyn B-ryhmän komponentin spektri yksin samassa liuottimessa, jos sellainen komponentti on.

111009 21

Esimerkki 9

Edellä esimerkissä 7 saatu PUB raakatuote liuote-» taan 190 cm3: iin asetonia. Lisätään 33 g puhdistettua PI:tä (PIA: 81,1 %, PIB: 12 %, PIC: 2,6 %, PID: 1,1%). 17 . 5 tunnin sekoittamisen jälkeen 20 °C:ssa saadaan suspensio, joka suodatetaan 4 °C:ssa. Yhdiste pestään ja kuivataan. Uudelleenkiteyttämisen jälkeen konsentraatiossa 100 g/1 asetonia saadaan 10 g valkoisia kiteitä, joiden PIIB+PIIF-+PIIGpitoisuus on 55 % ja PIA+PIB+PIC+PID-pitoisuus on 43 10 %.

Esimerkki 10 250 mg puhdistettua PIIB:tä, joka saatiin kuten esimerkissä 18 kuvattiin, suspendoidaan 17 cm3:iin etyyliasetaattia. Lisätään 300 mg puhdistettua PI:tä (PIA: 15 81,1 %, PIB: 12 %, PIC: 2,6 %, PID: 1,1 %) . 20 tunnin 20 °C:ssa tapahtuneen sekoittamisen, pesun ja kuivauksen jälkeen saadaan 125 mg valkoisia kiteitä. PIIB+PIIF+PIIG-pitoisuus: 56 %, jonka PIIB-pitoisuus on 54 %.

20 PIA+PIB+PIC+PID-pitoisuus: 43 %.

Esimerkki 11 560 mg puhdasta PIIB:tä, jota valmistettiin kuten myöhemmin esimerkissä 18 kuvataan, liuotetaan 5 cm3: iin asetonia. Lisätään 480 mg PIA:ta (pitoisuus 99,8 %) . Se-, 25 koitetaan 20 tuntia 20 °C:ssa ja suspensio suodatetaan.

1 cm3:llä asetonia suoritetun pesun ja 30 tuntia 40 °C:ssa alennetussa paineessa (<1 kPa) tapahtuneen kuivauksen jälkeen saadaan 590 mg valkoisia kiteitä.

PIIB+PIIF+PIIG-pitoisuus: 56 %; jonka PIIB-pitoisuus on 30 54 % PIA-pitoisuus: 43 %

Edellisen kiteyttämisen emäliuokset otetaan uudelleen käsittelyyn ja siihen lisätään uudelleen 560 mg * PIIB:tä. PIIB/PIA-massasuhde on siis noin 4. 20 tunnin 35 sekoittamisen, suodattamisen, pesun ja kuivauksen jälkeen 22 111009 saadaan 195 mg kiteitä, jotka puhtaudeltaan ja koostumukseltaan ovat samanlaisia kuin 1. erässä saadut kiteet.

Esimerkki 12

Tekemällä kuten esimerkissä 11 edellä kuvattiin, 5 mutta korvaamalla PIA 480 mg:11a PIB:tä (pitoisuus 97 %) saadaan 820 mg valkoisia kiteitä, joiden PIIB+PIIF+PIIG-pitoisuus on 56 % (jonka PIIB-pitoisuus on 54 %) ja PIB-pitoisuus on 43 %.

Esimerkki 13 10 Tekemällä kuten edellä olleessa esimerkissä 11 ku vattiin, mutta käyttämällä 680 mg PIIB:ä ja 580 mg PIC:ä (pitoisuus 95 %) 4 cm3:ssä asetonia, saadaan 315 mg valkoisia kiteitä, joiden PIIB+PIIF+PIIG-pitoisuus on 57 % (jonka PIIB-pitoisuus on 55 %) ja PI-pitoisuus on 42 % 15 (jonka PIC-pitoisuus on 37 %).

Esimerkki 14

Tekemällä kuten esimerkissä 11 edellä kuvattiin, mutta korvaamalla PIA 480 mg:11a PID:tä (pitoisuus 95 %) saadaan 475 mg valkoisia kiteitä, joiden PIIB+PIIF+PIIG- 20 pitoisuus on 55 % (jonka PIIB-pitoisuus on 53 %) ja PID-pitoisuus on 39 %.

Esimerkki 15

Tekemällä kuten esimerkissä 11 edellä kuvattiin, mutta käyttämällä 450 mg PIIB:ä ja 380 mg faktori S:ää . 25 (SI: 75,4 %, S4: 20,6 %) 4 cm3:ssä asetonia, saadaan 550 mg valkoisia kiteitä, joiden PIIB+PIIF+PIIG-pitoisuus on 58 % (jonka PIIB-pitoisuus on 56 %) ja faktori S -pitoisuus on 41 % (jonka Sl-pitoisuus on 37 %).

Esimerkki 16 30 Tekemällä kuten edellä esimerkissä 11 kuvattiin, φΓ mutta korvaamalla PIA 480 mg:11a faktori Sl:ä, saadaan < 750 mg valkoisia kiteitä, joiden PIIB+PIIF+PIIG-pitoisuus on 58 % (jonka PIIB-pitoisuus on 54 %) ja faktori SI -pitoisuus on 41 %.

35 111009 23

Esimerkki 17

Tekemällä kuten edellä esimerkissä 11 kuvattiin, mutta käyttämällä 224 mg PIIF:ä ja 192 mg faktori S:ää o 2 cm :ssä asetonia, saadaan 220 mg valkoisia kiteitä, joi-5 den PIIF-pitoisuus on 55 % ja faktori S-pitoisuus 39 % (jonka faktori SI -pitoisuus: 31 %, faktori S4 -pitoisuus: 5 %) .

Esimerkkien 9-17 yhdisteiden röntgendiffraktio-diagrammit: 10 Alla olevassa taulukossa IV annetaan pääasi allisten piikkien suhteelliset intensiteetit. Röntgen-diffraktiodiagrammit saatiin Phillips PW1700 diffrakto-metrillä, jossa on koboltti antikatodina. Referenssinä 100 on 15,8 Ä:n piikki. Suhteelliset arvot on laskettu piikin 15 korkeutena pohjaviivaa jatkuvasti vähentäen.

Taulukko IV

Piikkien Esimerkin yhdiste etäisyys (A) Es.9 Es.11 Es.12 Es.13 Es.14 Es.15 Es.16 Es.17 20 15,8 100 100 100 100 100 100 100 100 11,8 40 34 35 32 43 28 36 21 10,3 69 .52 63 65 50 70 80 87 9.7 38 45 47 44 43 40 49 45 6,4 44 41 51 41 37 40 51 39 25 6,1 38 41 40 38 43 30 40 35 C i 5,9 75 64 70 63 67 74 89 71 5.8 38 39 47 49 50 44 54 35 5,2 92 75 79 71 70 70 91 81 5,0 67 59 60 60 57 54 69 52 30 4,7 50 43 53 49 47 50 40 42 Röntgendiffraktiodiagrammit ovat samanlaisia olipa kerakiteytetty yhdiste mikä tahansa (pääasiallisten piikkien väliset etäisyydet eivät merkittävästi eroa toisis-* taan).

35 24 111009 A-ryhmän yhden komponentin puhdistus:

Esimerkki 18 9,3 g esimerkissä 9 saatua yhdistettä liuotetaan 490 cm3:iin metyyli-isobutyyliketonia. Tämä liuos uutetaan 5 kaksi kertaa 370 cm3:llä 0,5 N rikkihapon vesiliuosta, pestään sitten kaksi kertaa 150 cm3:llä vettä. Orgaaninen faasi konsentroidaan sitten, kunnes tilavuus on noin 80 cm3, joka sitten kaadetaan 5 tilavuuteen heksaania. Saatu sakka pestään, suodatetaan ja kuivataan. Metyyli-isobutyy-10 liketonin poistamiseksi se liuotetaan sitten konsentraa-tiossa 100 g/1 asetoniin, kaadetaan 10 tilavuuteen heksaania, pestään ja kuivataan. Näin saadaan 3,5 g yhdistettä, joka sisältää puhdistettua PIIB:tä eikä sisällä enää PI:-tä.

15 PIIB+PIIF+PIIG-pitoisuus: noin 95 %, jonka PIIB-pitoisuus on 92 %.

Farmaseuttiset valmisteet, jotka sisältävät vaikuttavana aineena uutta puhdistettua streptogramii-niseosta, joka sisältää ainakin yhtä streptogramiinien B-20 ryhmän komponenttia sekoitettuna yleisen kaavan (II) mukaiseen A-ryhmän komponenttiin, puhtaana tai yhden tai useamman yhteensopivan ja farmaseuttisesti hyväksyttävän laimentimen tai lisäaineen kanssa, ovat käyttökelpoisia ihmis- ja eläinlääketieteessä. Näitä valmisteita voidaan 25 käyttää oraalisesti tai ulkoisesti. Ne voivat sisältää t keksinnön mukaisia seoksia puhtaana tai jauheiden fysikaalisena seoksena, kerasaostettuna tai kerakitey-tettynä.

Oraalisen annostukseen käytettävinä valmisteina 30 voidaan käyttää tabletteja, gelatiinikapseleita, pillereitä, lyofilisoituja jauheita tai rakeita. Näissä valmisteissa keksinnön mukainen vaikuttava aine on sekoitettu yhteen tai useampaan inerttiin laimentimeen tai lisäaineeseen, kuten sakkaroosiin, laktoosiin tai tärkkelykseen.

35 111009 25 Nämä valmisteet voivat myös sisältää muitakin aineita kuin laimentimia, esimerkiksi liukastusaineita, kuten magne-* siumstearaattia.

Ulkoisesti annosteltavia valmisteita ovat esimer- 5 kiksi salvat, voiteet tai lotionit.

Ihmis- ja eläinlääketieteessä keksinnön mukaiset valmisteet ovat erityisen hyödyllisiä hoidettaessa bakteeriperäisiä infektioita, etenkin vakavia Gram-positiivisten kokkien aiheuttamia infektioita: stafylokokki-infektioita 10 (etenkin metisilliinille resistenttejä stafylokokki-infektioita) , streptokokki-infektioita (etenkin penisilliinille ja makrolideille resistenttejä pneumokokki-infektioita); ne ovat myös erityisen hyödyllisiä hoidettaessa Hemophilus-, Moraxella catarrhalis-, Neisseria gonorrhoeae-, 15 Chlamydia trachomatis-, Mycoplasma hominis-, Mycoplasma pneumoniae-, Ureaplasma urealyticum- infektioita.

Keksinnön mukaisia valmisteita voidaan käyttää etenkin hoidettaessa ylempien ja alempien hengitysteiden infektioita (esimerkiksi hoidettaessa keuhkoinfektioita), 20 hoidettaessa ihonalaisia infektioita, hoidettaessa pitkäaikaisia luu- ja nivelinfektioita, hoidettaessa tai ehkäistäessä endokardiittia hammas- ja virtsatiekirurgiassa, hoidettaessa sukupuolitauteja sekä hoidettaessa AIDSissa ilmeneviä opportunistisia bakteeri- ja loisinfektioita ja , 25 stafylokokkiriskien profylaksiassa immunosuppressiotilois- c < sa.

Yleensä lääkäri määrää sopivaksi katsomansa annostuksen hoidettavan iän, painon, infektioasteen ja muiden asiaan vaikuttavien seikkojen perusteella. Yleensä annok-30 set ovat 0,4 - 3,5 g vaikuttavaa ainetta 2 tai 3 annoksena päivässä oraalisesti aikuisilla.

* Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön mukaisia yhdisteitä niitä mitenkään rajoittamatta: 111009 26

Esimerkki A

Valmistetaan tavanomaisilla tekniikoilla himmeitä gelatiinikapseleita, joissa on 250 mg kerakiteytettyä PIB/PIIB-seosta.

5 Esimerkki B

Valmistetaan tavanomaisilla tekniikoilla himmeitä gelatiinikapseleita, joissa on 250 mg kerakiteytettyä faktori S/PIIB-seosta.

Esimerkki C

10 Valmistetaan tavanomaisilla tekniikoilla tablette ja, joissa on 384 mg vaikuttavaa ainetta ja joiden koostumus on seuraava: - PIB/PIIB (45%/55%).............................384 mg - hydroksipropyylimetyyliselluloosaa..............25 mg 15 - magnesiumstearaattia............................35 mg - kolloidista silikaa.............................14 mg - tärkkelystä ad.................................700 mg

Esimerkki D

Valmistetaan tavanomaisilla tekniikoilla tablette-20 ja, joissa on 384 mg vaikuttavaa ainetta ja joiden koostumus on seuraava: - faktori S/PIIB (45 %/55 %).....................384 mg - hydroksipropyylimetyyliselluloosaa..............25 mg - magnesiumstearaattia............................35 mg , 25 - kolloidista silikaa.............................14 mg t < - tärkkelystä ad.................................700 mg U · ( (

Claims (7)

111009 27 ‘ 1. Menetelmä streptogramiinien puhdistetun muodon valmistamiseksi, joka sisältää seosta, joka sisältää yhtä 5 tai useampaa streptogramiinien B-ryhmän komponenttia, jonka kaava on: A , 10 °^Y'N-Nf-Λ J—R ° \ «H CH3 0 A, (I) 15. fl) 2 |V“ ^ 20 jossa Αχ on radikaali, jonka yleinen kaava on: γ-Η0^ ^ < 25 /s. o ^nh oh γΑΑ, yU. O O 30 jossa R' on vetyatomi tai hydroksiradikaali ja Y on vety-atomi, metyyliaminoradikaali tai dimetyyliaminoradikaali, R on etyyliradikaali, kun R' esittää vetyatomia, R voi myös esittää metyyliradikaalia ja • Ri ja R2 esittävät vetyatomia, tai

35 Ai on radikaali, jonka kaava on: 111009 28 ,-CH, o o N 3 5 ch3 o ch3 R on isobutyyliradikaali ja Ri hydroksiradikaali ja R2 on metyyliradikaali, 10 ja yhtä tai useampaa streptogramiinien A-ryhmän "vähäisempää" komponenttia, jonka yleinen kaava on: O Ληη^^υ*υ°η

15 H3Cn J CH3 A/rv R" J-O 20 jossa R" on vetyatomi tai metyyli- tai etyyliradikaali, ke-rakiteytettynä, kerasaostettuna tai fysikaalisena jauheiden seoksena, tunnettu siitä, että streptogramiinien A-ryhmän komponentti tai komponentit kerakiteytetään streptogra-25 miinien B-ryhmän komponentin tai komponenttien kanssa, sitten tarvittaessa saatu kerakiteytetty yhdiste sekoitetaan sopivaan tai sopiviin A- tai B-ryhmän komponenttiin tai komponentteihin seoksen valmistamiseksi halutuissa suhteissa, tai 30 kerasaostetaan kaavan (I) ja (II) mukaisten kompo- ·; nenttien liuoksista, tai vaihtoehtoisesti kerakiteytetyn seoksen liuoksesta ja toisesta kaavan (I) tai (II) komponentista, metyyli-isobutyyliketonissa, asetonissa tai metyleenikloridissa. 29 111009

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu muoto sisältää al- 1 le 6 % epäpuhtauksia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että puhdistettu muoto sisältää seoksen, jossa on painosuhteissa 10/90 - 90/10 vastaavasti yhtä tai useampaa steptogramiinien B-ryhmän komponenttia ja yhtä tai useampaa streptogramiinien A-ryhmän vähäisempää komponenttia, kerasaostettuna tai jauheiden fysikaalisena 10 seoksena.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu muoto sisältää seoksen, jossa on 20/80 - 80/20 painosuhteissa vastaavasti yhtä tai useampaa streptogramiinien B-ryhmän 15 komponenttia ja yhtä tai useampaa streptogramiinien A-ryhmän vähäisempää komponenttia, kerasaostettuna tai jauheiden fysikaalisena seoksena.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyse on yhden tai useamman 20 streptogramiinien B-ryhmän komponentin ja yhden tai useamman streptogramiinien A-ryhmän vähäisemmän komponentin ke-rakiteytetystä yhdisteestä molaarisessa suhteessa, joka on luokkaa 1/2.

6. Menetelmä patenttivaatimuksessa 1 määriteltyjen 25 streptogramiinien A-ryhmän vähäisempien komponenttien puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että tästä komponentista valmistetaan kerakiteytetty yhdiste streptogramiinien B-ryhmän yhden tai useamman komponentin kanssa, sitten B-ryhmän komponentti tai komponentit poistetaan kä- 30 sittelemällä happamassa ympäristössä. ··; 7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- li nen menetelmä, tunnettu siitä, että streptogramiinien A-ryhmän komponentilla on yleinen kaava 4 35 111009 30 O Λ^^γγ“

5 S3C'f O O C"3 Y »3c^AoA__nA^O I H . I R" ky -0 10 jossa R" on vetyatomi tai etyyliradikaali. « » . 31 111009 t