ES3055110T3 - Liposome composition and pharmaceutical composition - Google Patents

Abstract

La presente invención aborda el problema de proporcionar una composición liposomal y una composición farmacéutica con un AUC elevado. La presente invención proporciona: una composición liposomal que contiene, como componentes de la membrana liposomal, una diacilfosfatidiletanolamina modificada con un polímero hidrófilo, una dihidroesfingomielina y colesteroles; y una composición farmacéutica que contiene la composición liposomal, donde la composición liposomal encapsula un fármaco, su fase acuosa interna contiene sulfato de amonio, y la relación molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con el fármaco en toda la fase acuosa es igual o superior a 0,36. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composición de liposomas y composición farmacéutica

[0003] Antecedentes de la invención

[0004] Campo de la invención

[0005] La presente invención se refiere a una composición de liposomas y a una composición farmacéutica, que presentan una alta retención en sangre.

[0006] Descripción de la técnica relacionada

[0007] A menudo se estudia que un fármaco se acumula en un sitio de enfermedad, tal como el cáncer, y permanece expuesto allí durante un largo periodo de tiempo mediante una composición de liposomas. En una composición de liposomas como una composición farmacéutica, un fármaco se encapsula en un liposoma constituido por una membrana lipídica.

[0008] El documento de patente 1 y el documento no de patente 1 describen un liposoma en el que está encapsulado topotecán en un liposoma que contiene esfingomielina y colesterol.

[0009] El documento de patente 2 da a conocer un liposoma en el que está encapsulado topotecán en un liposoma que contiene dihidroesfingomielina y colesterol.

[0010] El documento de patente 3 da a conocer una formulación de camptotecina liposómica adaptada para potenciar la estabilidad de la camptotecina, que incluye (a) camptotecina encapsulada en un liposoma, (b) una primera disolución que es externa al liposoma y tiene un pH de 4,5 o menos de 4,5, y (c) una segunda disolución que es interna al liposoma. También se da a conocer que el liposoma contiene dihidroesfingomielina y colesterol.

[0011] El documento de patente 4 da a conocer un sistema para cargar eficazmente un fármaco anfifílico en un liposoma, que incluye ajustar una suspensión de liposomas en presencia de un compuesto de amonio o sal de amonio, diluir la suspensión con un tampón o sal y proporcionar un gradiente de amonio desde el interior hacia el exterior entre una fase acuosa interna y una fase acuosa externa y un gradiente de pH, de modo que el pH del interior del liposoma sea más ácido que el pH del exterior del liposoma.

[0012] El documento de patente 5 da a conocer un liposoma en el que está encapsulado topotecán en presencia de sulfato de amonio en un liposoma que contiene esfingomielina o fosfolípido de soja hidrogenado purificado, colesterol y un lípido derivado de polímero hidrófilo. A. Fritze et al., Biochimica et Biophysica Acta 1758 (2006) 1633 describe un método para la carga remota de doxorubicina en liposomas. El documento WO 2013/059922 A1 se refiere a una nanopartícula lipídica de tamaño límite en la que la nanopartícula lipídica tiene un diámetro de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nm. G. Haran et al., Biochimica et Biophysica Acta 1151 (1993) 201 describe la obtención de carga de bases débiles anfipáticas en el compartimento acuoso de liposomas usando gradientes de sulfato de amonio en liposomas [(NH<4>)<2>SO<4>]<lip>. > [(NH<4>)<2>SO<4>]<med>. C.O. Noble et al., Cancer Chemother. Parmacol.64 (2009) 741 describe la preparación de formulaciones de liposomas e inmunoliposomas de dos alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina, utilizando octasulfato de sacarosa de trietilamonio intraliposómico. J.A. Zasadzinski et al., Current Opinion in Colloid & Interfaz Science 16 (2011) 203 describe métodos de autoensamblaje de estructuras lipídicas de múltiples compartimentos que proporcionan una retención de fármacos potenciada en entornos fisiológicos y métodos de direccionamiento externo y activación de la liberación de fármacos a través del calentamiento en el infrarrojo cercano de nanocubiertas de oro unidas a o encapsuladas dentro de vesículas bicapa. M.J.W. Johnson et al., Biochimica et Biophysica Acta 1768 (2007) 1121 describe las propiedades de retención de fármacos y vida útil de circulación de nanopartículas liposómicas que contienen dihidroesfingomielina.

[0013] Documentos de la técnica anterior

[0014] Documentos de patente

[0015] Documento de patente 1: US7060828B2

[0016] Documento de patente 2: US7811602B2

[0017] Documento de patente 3: JP2008-519045A

[0018] Documento de patente 4: JP1990-196713A (JP-H02-196713A)

[0019] Documento de patente 5: US6355268B2

[0020] Documento no de patente 1: AACR-EORTC International Conference, San Francisco, California, 22-26 de octubre de 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni et al.

[0021] Sumario de la invención

[0022] Los documentos de patente 1, 2 y 3 y el documento no de patente 1 mencionados anteriormente dan a conocer que la eficacia del fármaco se mejora encapsulando topotecán en un liposoma que contiene esfingomielina o dihidroesfingomielina para suprimir la fuga de topotecán en la sangre y mejorar el área bajo la curva de concentración en sangre-tiempo (AUC). Sin embargo, dado que la composición de lípidos que constituyen el liposoma y la composición de las sales que precipitan topotecán no se han optimizado, la mejora en el AUC no es suficiente y, por tanto, se requiere una mejora adicional para el AUC.

[0023] Además, en el caso de que el topotecán se filtre desde la fase acuosa interna del liposoma a la fase acuosa externa y luego se exponga a condiciones neutras, el topotecán se convierte en análogos del mismo. Específicamente, un aducto N-N bis con solubilidad extremadamente baja (dímero de amina de topotecán) o similar puede precipitar como cristales. En última instancia, se forman muchos materiales particulados insolubles que se desvían de los criterios de seguridad y calidad definidos por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos, la Agencia de Productos Farmacéuticos y Dispositivos Médicos (PMDA) de Japón y la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA), lo que por tanto no es deseable. Con el fin de suprimir la formación de tales materiales particulados insolubles, en el documento de patente 3 se ajusta el pH de la fase acuosa externa en condiciones ácidas. Sin embargo, en el caso de que la fase acuosa externa esté en condiciones ácidas, se promueve la descomposición de los lípidos que constituyen el liposoma, lo que es desventajoso para la estabilización del liposoma. En el liposoma del documento de patente, dado que es necesario acidificar la fase acuosa externa, es difícil añadir diacilfosfatidiletanolamina modificada con metoxipolietilenglicol hidrolizable con ácido para mejorar la retención en sangre.

[0024] Un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición de liposomas y una composición farmacéutica, que presenten un AUC alto.

[0025] Como resultado de amplios estudios para lograr el objeto anterior, los presentes inventores han encontrado que es posible proporcionar una composición de liposomas que logra el objeto anterior mediante una configuración en la que se usan como componentes de la membrana del liposoma una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, una dihidroesfingomielina y colesteroles, conteniendo la fase acuosa interna de la misma sulfato de amonio, y estableciéndose la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa en 0,36 o más. La presente invención se ha completado basándose en estos hallazgos. Es decir, la presente invención se expone en el juego adjunto de reivindicaciones.

[0026] Breve descripción de los dibujos

[0027] La figura 1 muestra los resultados de medición del peso corporal en una prueba de eficacia de fármaco usando un modelo de ratón con trasplante subcutáneo A549.

[0028] La figura 2 muestra los resultados de medición del peso corporal en una prueba de eficacia de fármaco usando un modelo de ratón con trasplante subcutáneo A549.

[0029] La figura 3 muestra los resultados de medición del volumen tumoral en una prueba de eficacia de fármaco usando un modelo de ratón con trasplante subcutáneo A549.

[0030] La figura 4 muestra los resultados de medición del volumen tumoral en una prueba de eficacia de fármaco usando un modelo de ratón con trasplante subcutáneo A549.

[0031] La figura 5 muestra el valor de AUC para cada cantidad de colesterol.

[0032] La figura 6 muestra los resultados de medición de la dependencia de iones de amonio de la tasa de liberación.

[0033] Descripción de las realizaciones preferidas

[0034] El intervalo numérico indicado mediante el uso de "a" en la presente memoria descriptiva significa un intervalo que incluye los valores numéricos descritos antes y después de "a" como el valor mínimo y el valor máximo, respectivamente.

[0035] Cuando en el presente documento se hace referencia a un contenido de un componente en una composición, en el caso de que existan varias sustancias correspondientes a un componente en la composición, el contenido significa, a menos que se especifique lo contrario, la cantidad total de las varias sustancias existentes en la composición.

[0036] El término "retención en sangre" significa una propiedad en la que un fármaco en un estado de encapsulación en un liposoma está presente en la sangre en un sujeto al que se ha administrado una composición de liposomas. El "tamaño de partícula promedio del liposoma" significa un tamaño de partícula promedio acumulado medido usando un método de dispersión de luz dinámica, a menos que se especifique lo contrario. Los ejemplos de dispositivos de medición disponibles comercialmente que utilizan dispersión de luz dinámica incluyen un analizador de tamaño de partícula de sistema concentrado FPAR-1000 (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.), un dispositivo NANOTRAC UPA (fabricado por Nikkiso Co., Ltd.) y un dispositivo NANOSIZER (fabricado por Malvern Panalytical Ltd.). También es posible calcular un tamaño de partícula promedio en volumen y un tamaño de partícula promedio en número del liposoma mediante la ecuación de conversión específica para el dispositivo de medición de cada fabricante.

[0037] Con el fin de medir partículas en las proximidades de 100 nm, la distribución de las partículas no puede capturarse con precisión mediante un método de dispersión de luz estática o similar, y es preferible la medición mediante el método de dispersión de luz dinámica.

[0038] El término "materiales particulados insolubles" es un elemento establecido por las autoridades reguladoras tales como PMDA, FDA y EMEA como criterios de seguridad y calidad en composiciones medicinales para administración sistémica, tales como las formulaciones de inyección intravenosa. Por ejemplo, en el caso de evaluar una composición farmacéutica mediante el primer método (método de recuento de partículas de protección frente a la luz) del método de prueba de material particulado insoluble de la Farmacopea Japonesa <6.07> Inyecciones en Japón, se requiere que el número de materiales particulados insolubles que tienen un tamaño de partícula de 10 µm o más contenidas en un vial de fármaco de un producto que tiene un volumen de visualización de menos de 100 ml sea de 6.000 o menos y que el número de materiales particulados insolubles que tienen un tamaño de partícula de 25 µm o más sea de 600 o menos. Además, en el caso de evaluar una composición farmacéutica mediante el segundo método (método de recuento de partículas microscópicas), se requiere que el número de materiales particulados insolubles que tienen un tamaño de partícula de 10 µm o más sea de 6.000 o menos y que el número de materiales particulados insolubles que tienen un tamaño de partícula de 25 µm o más sea de 600 o menos.

[0039] Los materiales particulados insolubles se definen solo por el tamaño de las partículas, independientemente de los componentes de las partículas. Por ejemplo, en la composición de liposomas, los materiales particulados insolubles pueden ser agregados de los propios liposomas, agregados y precipitados de los componentes del fármaco filtrados desde el interior de los liposomas, o agregados y precipitados de componentes de la fase acuosa externa del liposoma. En particular, según la descripción del documento JP2008-519045A y similares, se sabe que el liposoma con topotecán encapsulado en la presente invención es un precipitado que se genera a través de la fuga del topotecán encapsulado al exterior del liposoma, seguido de la descomposición en un degradante menos soluble.

[0040] Como método de medición de materiales particulados insolubles, existen, por ejemplo, un método de recuento de partículas de protección frente a la luz que lleva a cabo la detección óptica de materiales particulados insolubles (se usa un dispositivo de recuento de partículas, por ejemplo, HIAC 9703+ de Beckman Coulter, Inc. o Accusizer A2000 USP de Particle Sizing Systems, Inc.), y un método de recuento de partículas microscópicas que observa visualmente una imagen ampliada con un microscopio y cuenta los materiales particulados insolubles.

[0041] En el caso de una composición farmacéutica de liposomas, particularmente en el caso de una formulación inyectable, es preferible que, tal como se define en el Método de prueba de material particulado insoluble de la Farmacopea Japonesa <6.07> Inyecciones, el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 10 µm, que están contenidas en la composición farmacéutica en el momento de su uso, sea de 6000 o menos y que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 25 µm sea de 600 o menos.

[0042] En la formulación inyectable de la composición farmacéutica de liposomas, se considera que la causa de la formación de los materiales particulados insolubles es atribuible principalmente a la agregación, la coalescencia y la degradación de los componentes de partículas de liposomas que se producen durante el almacenamiento, pero no se limita a ello. Los materiales particulados insolubles tienden a generarse dependiendo de la cantidad de lípido, que es el material principal que constituye el liposoma. Por ejemplo, en el caso de considerar una composición farmacéutica que contiene 2 ml de una composición de liposomas que tiene una concentración de lípidos de 20 mmol/l y luego en el caso en el que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 10 µm es de 150 o menos y el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 25 µm es de 15 o menos por 1 µmol de lípido, es posible satisfacer la condición de que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 10 µm, que están contenidas en la composición farmacéutica, es de 6000 o menos y que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 25 µm es 600 o menos, que es el criterio definido en el método de prueba de material particulado insoluble de la Farmacopea Japonesa <6.07> Inyecciones.

[0043] También en la composición de liposomas según la realización de la presente invención, es preferible que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 10 µm sea de 150 o menos y que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 25 µm sea de 15 o menos por 1 µmol de lípido después del almacenamiento durante 1 mes a 5 °C. Es más preferible que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 10 µm sea de 75 o menos y que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 25 µm sea de 7,5 o menos por 1 µmol de lípido después del almacenamiento durante 1 mes a 5 °C. Todavía es más preferible que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 10 µm sea de 25 o menos y que el número de partículas que tienen un tamaño de partícula de más de 25 µm sea de 2,5 o menos por 1 µmol de lípido después del almacenamiento durante 1 mes a 5 °C.

[0044] Además, las partículas gruesas que tienen un tamaño de partícula de más de 10 µm a menudo aumentan debido al deterioro con el tiempo durante el almacenamiento, y es preferible satisfacer el número de partículas anterior incluso después del almacenamiento durante 3 meses y es más preferible satisfacer el número de partículas anterior incluso después del almacenamiento durante 1 año.

[0045] El "sujeto" es un mamífero tal como un ser humano, un ratón, un mono o un animal doméstico que necesita la prevención o el tratamiento de una enfermedad o similar, y preferiblemente es un ser humano que necesita la prevención o el tratamiento de una enfermedad o similar.

[0046] A continuación en el presente documento se describirá en detalle la presente invención.

[0047] La composición de liposomas según la primera realización de la presente invención es una composición de liposomas que comprende liposomas, cada uno de los cuales tiene una fase acuosa interna y una disolución acuosa que constituye una fase acuosa externa y en la que se dispersan los liposomas, en la que el liposoma comprende una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, una dihidroesfingomielina y colesteroles, en la que cada uno de los liposomas encapsula un fármaco, en la que la fase acuosa interna contiene sulfato de amonio, y una razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en la fase acuosa completa es de 0,36 o más.

[0048] Además, la composición de liposomas según la segunda realización de la presente invención es una composición de liposomas que incluye una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, una dihidroesfingomielina y colesteroles como componentes de la membrana del liposomas, en la que la composición de liposomas encapsula un fármaco, una fase acuosa interna de la misma contiene sulfato de amonio y la dihidroesfingomielina es una dihidroesfingomielina que contiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene 18 átomos de carbono.

[0049] En la presente invención, la retención del liposoma en la sangre se mejora mediante el uso de una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, una dihidroesfingomielina y colesteroles como componentes de la membrana del liposoma. Además, la inclusión de sulfato de amonio en la fase acuosa interna suprime la fuga del fármaco del liposoma en la sangre y, por tanto, mejora el AUC. Además, al establecer la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa para que sea de 0,36 o más, se suprime adicionalmente la fuga del fármaco desde el liposoma en la sangre y, por tanto, se logra un AUC más alto.

[0050] Como resultado de lo anterior, la fuga del fármaco desde la fase acuosa interna a la fase acuosa externa puede suprimirse incluso durante el almacenamiento en frío, y la generación de materiales particulados insolubles puede suprimirse incluso en condiciones neutras. Es decir, en la composición de liposomas según la realización de la presente invención, el pH de la fase acuosa externa puede ajustarse hasta casi la neutralidad (pH 7,4), y se hizo posible usar la "diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo" que se hidroliza en condiciones ácidas para mejorar la retención de los liposomas en sangre.

[0051] Liposoma

[0052] El liposoma es un cuerpo vesicular cerrado formado por una membrana de bicapa lipídica que utiliza lípidos, y tiene una fase acuosa (fase acuosa interna) dentro del espacio de la vesícula cerrada. La fase acuosa interna contiene agua y similares. El liposoma habitualmente está presente en un estado de dispersión en una disolución acuosa (fase acuosa externa) fuera de la vesícula cerrada. El liposoma puede ser laminar individual (que también se denomina laminar monocapa o unilaminar, y es una estructura que tiene una única membrana bicapa) o laminar multicapa (que también se denomina multilaminar y es una estructura similar a una cebolla que tiene múltiples membranas bicapa donde las capas individuales están compartimentadas por capas acuosas). En la presente invención, se prefiere un único liposoma laminar desde el punto de vista de la seguridad y la estabilidad en aplicaciones farmacéuticas.

[0053] El liposoma no está limitado particularmente en lo que se refiere a la forma del mismo siempre que sea un liposoma capaz de encapsular un fármaco. El término "encapsular" significa adoptar una forma en la que un fármaco está contenido en una fase acuosa interna y en la propia membrana con respecto al liposoma. Por ejemplo, el liposoma puede ser una forma en la que un fármaco está encapsulado dentro de un espacio cerrado formado por una membrana, una forma en la que un fármaco está encapsulado en la propia membrana, o una combinación de las mismas.

[0054] El tamaño de partícula promedio del liposoma es generalmente de 10 nm a 1000 nm, preferiblemente de 20 nm a 500 nm, más preferiblemente de 30 a 300 nm, todavía más preferiblemente de 30 nm a 200 nm, incluso más preferiblemente de 150 nm o menos, por ejemplo, de 30 nm a 150 nm, y de manera particularmente preferible de 70 a 150 nm.

[0055] El liposoma tiene preferiblemente una forma esférica o una morfología cercana a la misma.

[0056] Los componentes que constituyen la bicapa lipídica del liposoma se seleccionan a partir de lípidos. Como lípidos, pueden usarse aquellos que pueden disolverse en un disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster.

[0057] El liposoma en la presente invención contiene una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, dihidroesfingomielina y colesteroles tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0058] El liposoma es un cuerpo vesicular cerrado formado por una membrana de bicapa lipídica usando los lípidos tal como se describió anteriormente y, en general, los lípidos como material de base para formar la membrana de bicapa lipídica incluyen fosfolípidos que tienen dos cadenas de acilo, por ejemplo, fosfolípidos naturales o sintéticos tales como fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina y cardiolipina, y productos hidrogenados de los mismos (por ejemplo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)).

[0059] En la presente invención, la dihidroesfingomielina, que es un fosfolípido que tiene dos cadenas de acilo, se usa como un lípido para ser un material de base para formar una membrana de bicapa lipídica.

[0060] Mediante el uso de dihidroesfingomielina, puede mejorarse la retención de liposomas en la sangre.

[0061] Mediante el uso de dihidroesfingomielina como material de base de la membrana del liposoma, es posible mejorar las propiedades de reparto de la membrana del liposoma para evitar la fuga del fármaco encapsulado. Se especula que esto se debe a que los enlaces amida de la dihidroesfingomielina tienen una fuerte capacidad de formación de enlaces de hidrógeno y pueden formar una membrana fuerte y de alto reparto al interactuar fuertemente entre sí. Además, los enlaces amida de la dihidroesfingomielina interaccionan fuertemente con los grupos hidroxilo de colesterol usado simultáneamente en la presente invención, por lo que puede formarse una membrana que tiene altas propiedades de reparto. Esta es una función que no puede lograrse con los lípidos usados habitualmente tales como HSPC y lecitina que tienen enlaces éster.

[0062] Además, dado que la dihidroesfingomielina completamente saturada tiene un punto de fusión más alto y una movilidad más baja de la membrana formada con respecto a la esfingomielina que tiene enlaces amida pero que tiene enlaces insaturados en la cadena de acilo, se especula que la dihidroesfingomielina puede formar una membrana con propiedades de reparto más altas con respecto a la esfingomielina.

[0063] La dihidroesfingomielina generalmente tiene dos grupos alquilo de cadena larga en la molécula y los ejemplos de la dihidroesfingomielina que tiene dos grupos alquilo de cadena larga incluyen dihidroesfingomielina que tiene dos grupos alquilo de cadena larga que tienen 16 átomos de carbono, dihidroesfingomielina que tiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene 18 átomos de carbono, y dihidroesfingomielina que tiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene de 20 a 24 átomos de carbono.

[0064] Como dihidroesfingomielina, es preferible usar el siguiente compuesto que tiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene 18 átomos de carbono, en lo que se refiere a la prevención de la fuga de fármacos de los liposomas. Esto se debe a que el punto de fusión se vuelve más alto a medida que el número de átomos de carbono es mayor y, por tanto, puede formarse una membrana de liposoma que tiene altas propiedades de reparto.

[0067]

[0068] Como dihidroesfingomielina, por ejemplo, puede usarse dihidroesfingomielina obtenida reduciendo la esfingomielina de origen natural mediante un método general, o puede usarse dihidroesfingomielina obtenida mediante síntesis.

[0069] Generalmente, dado que la mayoría de las dihidroesfingomielinas derivadas de productos naturales tales como huevos de gallina generalmente tienen dos grupos alquilo de cadena larga que tienen 16 átomos de carbono, es preferible usar dihidroesfingomielina obtenida mediante síntesis química, desde el punto de vista de que la dihidroesfingomielina que tiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene 18 átomos de carbono puede obtenerse con alta pureza.

[0070] El porcentaje de dihidroesfingomielina en los componentes de la membrana del liposoma (los lípidos totales que constituyen el liposoma) es preferiblemente del 30 al 80 % en moles, más preferiblemente del 40 al 70 % en moles, y aún más preferiblemente del 50 al 60 % en moles.

[0071] Los ejemplos del polímero hidrófilo en la diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo incluyen polietilenglicoles, poliglicerinas, polipropilenglicoles, poli(alcoholes vinílicos), copolímeros alternantes de estirenoanhídrido de ácido maleico, polivinilpirrolidonas y poliaminoácidos sintéticos. Los polímeros hidrófilos mencionados anteriormente pueden usarse solos o en combinación de dos o más de los mismos.

[0072] Entre estos, desde el punto de vista de la retención en sangre de una composición, son preferibles polietilenglicoles, poliglicerinas y polipropilenglicoles, y son más preferibles polietilenglicol (PEG), poliglicerina (PG), polipropilenglicol (PPG) y derivados de los mismos.

[0073] El polietilenglicol (PEG) y derivados de los mismos son todavía más preferibles desde el punto de vista de la versatilidad y la retención en sangre.

[0074] Los ejemplos de derivados de polietilenglicol (PEG) incluyen metoxipolietilenglicoles sin limitación particular. El peso molecular de los polietilenglicoles no está limitado particularmente, pero es de 500 a 10.000 daltons, preferiblemente de 1.000 a 7.000 daltons, y más preferiblemente de 2.000 a 5.000 daltons.

[0075] El número de átomos de carbono en el resto acilo de la diacilfosfatidiletanolamina es preferiblemente de 16 o más, por ejemplo, preferiblemente de 16 o más y 30 o menos, más preferiblemente de 16 o más y 24 o menos, y aún más preferiblemente de 20.

[0076] Los ejemplos de la diacilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol incluyen 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicoles tales como 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG5000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) y diestearoil-glicerol-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.).

[0077] El porcentaje de la diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo en los componentes de la membrana del liposoma (los lípidos totales que constituyen el liposoma) es preferiblemente del 1 al 15 % en moles y más preferiblemente del 2 al 10 % en moles.

[0078] Los ejemplos de colesteroles incluyen colesterol que contiene ciclopentahidrofenantreno como esqueleto básico y en el que los átomos de carbono están parcial o completamente hidrogenados y derivados de los mismos. Por ejemplo, es preferible el colesterol. En el caso en el que el tamaño de partícula promedio del liposoma disminuye a 100 nm o menos, la curvatura de la membrana lipídica se hace mayor. La deformación de la membrana dispuesta en el liposoma también se hace mayor. Resulta eficaz añadir colesterol o similares para rellenar la deformación de la membrana provocada por lípidos (efecto de estabilización de la membrana).

[0079] En relación con el liposoma, se espera que la adición de colesterol disminuya la fluidez de la membrana del liposoma, por ejemplo, llenando los huecos en la membrana del liposoma.

[0080] El porcentaje de colesterol en los componentes de la membrana del liposoma (lípidos que constituyen el liposoma) es preferiblemente del 20 % en moles al 50 % en moles, más preferiblemente del 30 % en moles al 45 % en moles, y aún más preferiblemente del 35 % en moles al 43 % en moles.

[0081] Además de los componentes anteriores, puede añadirse al liposoma un polímero hidrófilo o similar para mejorar la retención en la sangre, un ácido graso, fosfato de diacetilo o similar como estabilizador de la estructura de membrana, o α-tocoferol o similar como antioxidante. En la presente invención, es preferible no usar un aditivo tal como un adyuvante de dispersión, que no esté reconocido para su uso en inyección intravenosa en el uso médico, por ejemplo, un tensioactivo.

[0082] Fármaco

[0083] La composición de liposomas según la realización de la presente invención contiene un fármaco.

[0084] El tipo de fármaco no está limitado particularmente, pero pueden usarse los agentes anticancerosos ejemplificados a continuación. Los ejemplos específicos del agente anticanceroso incluyen:

[0085] agentes anticancerosos a base de antraciclina tales como doxorubicina, daunorubicina y epirubicina; agentes anticancerosos a base de cisplatino tales como cisplatino y oxaliplatino;

[0086] agentes anticancerosos a base de taxanos tales como paclitaxel y docetaxel;

[0087] agentes anticancerosos a base de alcaloides de la vinca tales como vincristina y vinblastina;

[0088] agentes anticancerosos a base de bleomicina tales como bleomicina;

[0089] agentes anticancerosos a base de sirólimus tales como sirólimus;

[0090] agentes anticancerosos a base de camptotecina tales como topotecán (también denominado nogitecán), irinotecán, karenitecina (marca comercial registrada) (también denominado BNP1350), exatecán, lurtotecán, gimatecán (también denominado ST1481) y verotecán (también denominado CKD602);

[0091] antagonistas metabólicos tales como metotrexato, fluorouracilo, gemcitabina, citarabina y pemetrexed; y fármacos dirigidos molecularmente tales como imatinib (Gleevec (marca comercial registrada)), everólimus (Afinitol (R)), erlotinib (Tarceva (marca comercial registrada)), gefitinib (Iressa (marca comercial registrada)), sunitinib (Sutent (marca comercial registrada)), sorafenib (Nexavar (marca comercial registrada)), dasatinib (Splicel (marca comercial registrada)), tamivaroteno (Amnolake (marca comercial registrada)), tretinoína (Besanoid (marca comercial registrada)), bortezomib (Velcade (marca comercial registrada)) y lapatinib (Tykerb (marca comercial registrada)).

[0092] Entre los fármacos anteriores, es preferible el topotecán (también denominado nogitecán), la doxorubicina, el irinotecán o el sunitinib, y es más preferible el topotecán.

[0093] El fármaco puede usarse en forma de una sal.

[0094] Los ejemplos de la sal del fármaco incluyen sales en un grupo básico tal como un grupo amino, un grupo hidroxilo y un grupo ácido tal como un grupo carboxilo, que se conocen comúnmente en la técnica.

[0095] Los ejemplos de la sal en un grupo básico incluyen sales con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido nítrico y ácido sulfúrico; sales con ácidos carboxílicos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido aspártico, ácido tricloroacético y ácido trifluoroacético; y sales con ácidos sulfónicos tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido mesitilenosulfónico y ácido naftalenosulfónico.

[0096] Los ejemplos de la sal en un grupo ácido incluyen sales con metales alcalinos tales como sodio y potasio; sales con metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio; sales de amonio; y sales con bases orgánicas que contienen nitrógeno tales como trimetilamina, trietilamina, tributilamina, piridina, N, N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, dietilamina, diciclohexilamina, procaína, dibencilamina, N-bencil-β-fenetilamina, 1-efenamina y N,N'-dibenciletilendiamina.

[0097] El contenido del fármaco en la composición de liposomas no está limitado particularmente, pero es preferiblemente de 0,025 a 20 mg/ml y más preferiblemente de 0,25 a 10 mg/ml con respecto a la composición de liposomas. La cantidad de fármaco encapsulado en liposomas en relación con el lípido formador de membrana del liposoma está en una razón molar preferiblemente de 0,1 a 1,5 y más preferiblemente de 0,2 a 0,3 desde el punto de vista de la tasa de liberación desde el liposoma, la presión osmótica dentro del liposoma y la forma del liposoma determinada por el fármaco precipitado.

[0098] En el caso de que la razón molar de la cantidad de fármaco con respecto al lípido sea demasiado baja, aumenta el área de la membrana del liposoma con respecto a la cantidad unitaria de fármaco, aumenta la tasa de liberación del fármaco desde el liposoma y, por tanto, se ve afectada la función de mejora de la retención en sangre. Por otro lado, en el caso de que la razón molar de la cantidad de fármaco con respecto al lípido sea demasiado alta, la presión osmótica dentro del liposoma aumenta con una mayor cantidad del fármaco disuelto, dando como resultado la destrucción del liposoma, o en el caso de que el fármaco se precipite dentro del liposoma, el sólido precipitado crece, dando como resulta la deformación de la forma del liposoma.

[0099] Sulfato de amonio en la fase acuosa interna

[0100] La fase acuosa interna del liposoma en la presente invención contiene sulfato de amonio. En la composición de liposomas que es la primera realización de la presente invención, la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa es de 0,36 o más y preferiblemente de 0,4 o más. La razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa es más preferiblemente de 0,4 o más y de 1,8 o menos y aún más preferiblemente de 0,6 o más y de 1,8 o menos. Al establecer la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa tal como se describió anteriormente, es posible suprimir la fuga del fármaco del liposoma en sangre. En el caso de que la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa sea demasiado baja, esto conduce a la formación incompleta de un sólido del fármaco debido al sulfato, un a aumento de la concentración del fármaco en estado disuelto, lo que da como resultado un aumento de la permeabilidad de la membrana del liposoma en el liposoma y una fácil fuga del fármaco desde el liposoma, de modo que se ve afectado el efecto de mejorar la retención en la sangre. Además, en el caso de que la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa sea demasiado alta, la presión osmótica dentro del liposoma será alta, dando como resultado la destrucción de la estructura del liposoma, por lo que es probable que el fármaco se fugue fuera del liposoma y, por tanto, que se vea afectado el efecto de mejora de la retención en sangre.

[0101] Además, en la presente invención, el porcentaje de iones sulfato contenidos en la fase acuosa interna del liposoma con respecto a los iones sulfato en toda la composición de liposomas (razón de iones sulfato en la fase acuosa interna) es preferiblemente de al menos el 80 % y más preferiblemente del 90 % o más, y simultáneamente el porcentaje del fármaco contenido en la fase acuosa interna del liposoma con respecto al fármaco en toda la composición de liposomas (razón de fármaco en la fase acuosa interna) es preferiblemente de al menos el 80 % y más preferiblemente del 90 % o más.

[0102] La concentración de fármaco en el liposoma puede medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos/detección de absorbancia ultravioleta-visible. Además, la concentración de iones sulfato en la fase acuosa interna del liposoma puede medirse, por ejemplo, mediante cromatografía iónica.

[0103] pH de la fase acuosa externa

[0104] La composición de liposomas según la realización de la presente invención puede incluir un liposoma que encapsula un fármaco y un disolvente acuoso (fase acuosa externa) en el que se dispersa el liposoma. La fase acuosa externa tiene preferiblemente un pH neutro y específicamente un pH de aproximadamente 5,5 a 8,5. En el caso de que se suprima extremadamente la fuga de fármaco, también puede suprimirse la fuga de fármaco en el área afectada, particularmente en el sitio del tumor, y por tanto puede no obtenerse la eficacia deseada. La composición de liposomas según la realización de la presente invención tiene un mecanismo sorprendente para suprimir la fuga de fármaco en sangre, administrar una cantidad suficiente de fármaco al sitio del tumor y liberar rápidamente el fármaco en el sitio del tumor.

[0105] El sitio del tumor tiene la propiedad de que su concentración de amonio es mayor que la de otros órganos tales como la sangre (artículo citado: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 1841-1850). La composición de liposomas según la realización de la presente invención presenta una liberación de fármaco muy aumentada en un entorno en el que la degradación de glutamina está potenciada y, por tanto, la concentración de amonio es alta (5 mmol/l), como en un tumor.

[0106] La composición de liposomas según la realización de la presente invención tiene una tasa de liberación de fármaco del 20 %/24 horas o menos a 37 °C desde los liposomas en plasma que tienen una concentración de amonio de 1 mmol/l o menos y una tasa de liberación de fármaco del 60 %/24 horas o más a 37 °C desde los liposomas en plasma que tienen una concentración de amonio de 4 a 6 mmol/l; y más preferiblemente una tasa de liberación de fármaco del 15 %/24 horas o menos a 37 °C desde los liposomas en plasma que tienen una concentración de amonio de 1 mmol/l o menos y una tasa de liberación de fármaco del 70 %/24 horas o más a 37 °C desde los liposomas en plasma que tienen una concentración de amonio de 4 a 6 mmol/l.

[0107] Método para producir la composición de liposomas

[0108] El método para producir la composición de liposomas según la realización de la presente invención no está limitado particularmente. Por ejemplo, la composición de liposomas según la realización de la presente invención puede producirse mediante las siguientes etapas:

[0109] (a) preparación de una fase oleosa;

[0110] (b) preparación de una fase acuosa;

[0111] (c) formación de partículas de liposomas mediante emulsificación;

[0112] (d) regulación del tamaño de partícula mediante extrusora;

[0113] (e) reemplazo del líquido de la fase acuosa externa del liposoma mediante diálisis;

[0114] (f) encapsulación del fármaco en partículas de liposomas mediante carga remota; y

[0115] (g) retirada del fármaco de la fase acuosa externa mediante diálisis.

[0116] La regulación del tamaño de partícula mediante extrusora (d) puede llevarse a cabo o no.

[0117] (a) Preparación de la fase oleosa

[0118] (a) En la preparación de una fase oleosa, se mezclan los componentes individuales (diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, dihidroesfingomielina y colesteroles) que constituyen el liposoma y un disolvente orgánico, y la mezcla se calienta para disolver los componentes mencionados anteriormente, mediante lo cual puede producirse una fase oleosa.

[0119] Aunque el disolvente orgánico usado en la fase oleosa no está limitado particularmente, por ejemplo, puede usarse un disolvente orgánico soluble en agua que se mezcla opcionalmente con agua.

[0120] Los ejemplos del disolvente orgánico soluble en agua incluyen alcoholes tales como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol y t-butanol; glicoles tales como glicerina, etilenglicol y propilenglicol; y polialquilenglicoles tales como polietilenglicol. Entre estos, se prefieren los alcoholes. El alcohol es preferiblemente al menos uno seleccionado de etanol, metanol, 2-propanol o t-butanol, más preferiblemente al menos uno seleccionado de etanol, 2-propanol o t-butanol, y aún más preferiblemente etanol.

[0121] La concentración de cada componente que constituye el liposoma no está limitada particularmente y puede ajustarse adecuadamente.

[0122] (b) Preparación de la fase acuosa

[0123] Como fase acuosa puede usarse agua (agua destilada, agua para inyección, o similares), solución salina fisiológica, diversas disoluciones tampón o disoluciones acuosas de azúcares (sacarosa o similares), o mezclas de los mismos (disolvente acuoso). En la presente invención, es preferible usar una disolución acuosa de sulfato de amonio como fase acuosa, en el caso de que se encapsule un fármaco en partículas de liposomas mediante carga remota que se describirá más adelante.

[0124] La disolución tampón no se limita a disoluciones tampón orgánicas e inorgánicas, y se usa adecuadamente una disolución tampón que tiene una acción tampón en las proximidades de un pH cercano al del fluido corporal y ejemplos de la misma incluyen una disolución tampón de fosfato, una disolución tampón de Tris, una disolución tampón de citrato, una disolución tampón de acetato y una disolución tampón de Good. La fase acuosa interna del liposoma puede ser una disolución acuosa en la que se dispersan los liposomas en el caso de la producción de liposomas, o puede ser agua, solución salina fisiológica, una disolución acuosa de diversas disoluciones tampón o azúcares, o una mezcla de las mismas que se añada posteriormente. El agua utilizada como fase acuosa externa o fase acuosa interna preferiblemente está libre de impurezas (polvo, productos químicos o similares).

[0125] La solución salina fisiológica se refiere a una solución salina inorgánica ajustada para que sea isotónica con el fluido corporal humano, y puede tener además una función tamponante. Los ejemplos de la solución salina fisiológica incluyen solución salina que contiene el 0,9 % p/v (porcentaje en masa/volumen) de cloruro de sodio, PBS y solución salina fisiológica tamponada con Tris.

[0126] En la presente invención, la fase acuosa incluye tanto una fase acuosa externa como una fase acuosa interna. La fase acuosa externa en la presente invención significa una disolución acuosa en la que se dispersan liposomas. Por ejemplo, en el caso de una inyección, una disolución que ocupa el exterior del liposoma de un líquido de dispersión de liposomas envasado y almacenado en un vial o jeringa precargada se convierte en una fase acuosa externa. Además, de manera similar, para un líquido que va a dispersarse en el momento de su uso, en el caso de administrarse por medio de una disolución de dispersión adjunta u otras disoluciones, la disolución que ocupa el exterior del liposoma de un líquido de dispersión de liposomas se convierte en una fase acuosa externa.

[0127] La fase acuosa interna en la presente invención se refiere a una fase acuosa en vesículas cerradas separadas por membranas de bicapa lipídica de los liposomas.

[0128] (c) Formación de partículas de liposomas mediante emulsificación

[0129] En la etapa de emulsión, se mezclan una fase oleosa y una fase acuosa para preparar una disolución acuosa que contiene lípidos, que luego puede emulsionarse con agitación. Una fase oleosa donde el lípido se ha disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa se mezclan, se agitan y se emulsionan para preparar así una emulsión donde la fase oleosa y la fase acuosa se emulsionan en un tipo O/W (tipo de aceite en agua). Después del mezclado, se forman liposomas eliminando una porción o la totalidad del disolvente orgánico derivado de la fase oleosa mediante evaporación. Alternativamente, se evapora una porción o la totalidad del disolvente orgánico en la fase oleosa en el transcurso de la agitación-emulsificación para formar liposomas.

[0130] Como método de agitación, se utilizan ondas ultrasónicas o cizallamiento mecánico para la miniaturización de partículas. Además, para lograr la uniformidad de los tamaños de partícula puede llevarse a cabo procesamiento en extrusora o procesamiento en microfluidizador, permitiendo el paso a través de un filtro que tiene un tamaño de poro determinado. El uso de una extrusora o similar puede dar como resultado la descomposición de liposomas multivesiculares formados de manera secundaria para dar liposomas univesiculares.

[0131] La etapa de emulsión no está limitada siempre que sea una etapa de emulsificación, pero es preferiblemente una etapa de aplicación un alto cizallamiento y de realización de la microparticulación con una etapa de emulsión que incluye un disolvente orgánico. La alta velocidad de cizallamiento se define en lo que se refiere a la velocidad periférica de una paleta de agitación de una máquina de emulsificación y es preferiblemente de 5 m/s a 32 m/s y de manera particularmente preferible de 20 m/s a 30 m/s. Si es necesario, puede llevarse a cabo evaporación (desolvatación) del disolvente orgánico usado en la etapa de emulsión para formar liposomas.

[0132] La temperatura del líquido en la etapa de emulsión en el caso de la producción de liposomas puede ajustarse adecuadamente, pero la temperatura del líquido en el momento de mezclar una fase oleosa y una fase acuosa preferiblemente es mayor que o igual a la temperatura de transición de fase del lípido que va a usarse. Por ejemplo, en el caso de que se use un lípido que tiene una temperatura de transición de fase de 35 °C a 40 °C, la temperatura del líquido se ajusta preferiblemente a de 35 °C a 70 °C.

[0133] En la etapa de emulsión, el disolvente orgánico y el agua pueden evaporarse de la disolución acuosa que contiene liposomas. En cuanto a la evaporación a la que se hace referencia en el presente documento, una porción o la totalidad del disolvente orgánico derivado de la fase oleosa y el agua derivada de la fase acuosa pueden retirarse a la fuerza como una etapa de evaporación, o una porción o la totalidad del disolvente orgánico derivado de la fase oleosa y el agua derivada de la fase acuosa pueden evaporarse de manera natural durante el transcurso de la agitación-emulsificación.

[0134] El método de evaporación no está limitado particularmente. Por ejemplo, puede llevarse a cabo al menos una de una etapa de calentamiento para evaporar un disolvente orgánico y agua, una etapa de continuación del reposo o de agitación lenta después de la emulsificación, o una etapa de llevar a cabo la desgasificación al vacío.

[0135] (d) Regulación del tamaño de partícula mediante extrusora

[0136] Los liposomas obtenidos pueden hacerse uniformes en cuanto al tamaño de partícula mediante el uso de diálisis, filtración, procesamiento por extrusión o similares.

[0137] El procesamiento por extrusión significa una etapa de hacer pasar liposomas a través de un filtro que tiene un poro fino para aplicar un cizallamiento físico, llevando a cabo así la microparticulación de los liposomas. En el caso de que se hagan pasar los liposomas, puede lograrse la microparticulación rápida de los mismos incubando el líquido de dispersión de liposomas y el filtro a una temperatura mayor que o igual a la temperatura de transición de fase de la membrana que constituye el liposoma.

[0138] Además, la regulación del tamaño de partícula mediante una extrusora puede llevarse a cabo o no.

[0139] (e) Reemplazo del líquido de la fase acuosa externa del liposoma mediante diálisis

[0140] En la presente invención, en el caso en el que el fármaco se encapsule en las partículas de liposomas mediante carga remota, el líquido de la fase acuosa externa del liposoma puede reemplazarse mediante diálisis. Puede usarse una disolución acuosa del 0,05 % al 5 % en masa de NaCl como líquido de diálisis, lo que no está limitado particularmente. La diálisis del líquido de liposoma utilizando el líquido de diálisis mencionado anteriormente puede proporcionar liposomas en los que se retira el sulfato de amonio presente en la fase acuosa externa y la fase acuosa externa se reemplaza con el líquido de diálisis.

[0141] (f) Encapsulación de fármaco en partículas de liposomas mediante el método de carga remota

[0142] En la presente invención, es preferible encapsular un fármaco en partículas de liposomas mediante un método de carga remota.

[0143] En la presente invención, el método de carga remota se refiere a un método para producir un liposoma vacío en el que no está encapsulado un fármaco y luego añadir el fármaco al líquido externo del liposoma para introducir el fármaco en el liposoma. El método de carga remota no está limitado particularmente, pero es preferible un método usando una sal de amonio y es más preferible un método usando sulfato de amonio.

[0144] En el método de carga remota, el fármaco añadido al líquido externo se transfiere activamente a los liposomas y se incorpora en los liposomas. Se usa un gradiente de solubilidad, un gradiente iónico, un gradiente de pH o similar como fuerza impulsora. Por ejemplo, existe un método para introducir un fármaco en liposomas usando un gradiente iónico formado a través de una membrana de liposoma. Por ejemplo, existe una técnica de adición de un fármaco en liposomas preformados mediante el método de carga remota utilizando un gradiente de concentración de Na<+>/K<+>.

[0145] Entre los gradientes iónicos, se usa generalmente un gradiente de concentración de protones. Por ejemplo, hay un aspecto en el que el pH interno (fase acuosa interna) de la membrana de liposoma tiene un gradiente de pH inferior al pH externo (fase acuosa externa). El gradiente de pH puede formarse específicamente mediante un gradiente de concentración de gradiente de iones amonio o similar.

[0146] (g) Retirada del fármaco de la fase acuosa externa mediante diálisis

[0147] El líquido de liposomas con fármaco encapsulado puede someterse a diálisis para retirar el fármaco no contenido en los liposomas. Por ejemplo, sometiendo el líquido liposómico con fármaco encapsulado a diálisis, usando una concentración predeterminada de tampón de sacarosa/histidina como líquido de diálisis, el fármaco presente en la fase acuosa externa puede retirarse para obtener una composición de liposomas en la que la fase acuosa externa se reemplaza con el líquido de diálisis.

[0148] Filtración estéril

[0149] La composición de liposomas obtenida anteriormente se somete preferiblemente a filtración estéril. Con respecto al método de filtración, es posible retirar los materiales no deseados de una disolución acuosa que contiene liposomas mediante el uso de una membrana de fibra hueca, una membrana de ósmosis inversa, un filtro de membrana, o similares. En la presente invención, es preferible filtrar la composición de liposomas a través de un filtro que tenga un tamaño de poro esterilizable (preferiblemente un filtro de esterilización por filtración de 0,2 µm). Para evitar que la deformación de los liposomas afecte al tamaño de partícula promedio, la etapa de filtración estéril y la etapa de llenado aséptico descrita a continuación se llevan a cabo preferiblemente a una temperatura inferior o igual a la temperatura de transición de fase del lípido que constituye el liposoma. Por ejemplo, en el caso en el que la temperatura de transición de fase del lípido es de alrededor de 50 °C, la etapa de filtración estéril y la etapa de llenado aséptico descrita a continuación se llevan a cabo a una temperatura de preferiblemente alrededor de 0 °C a 40 °C, y más específicamente alrededor de 5 °C a 30 °C.

[0150] Llenado aséptico

[0151] La composición de liposomas obtenida después de la filtración estéril se llena preferiblemente de manera aséptica para aplicaciones médicas. Pueden aplicarse métodos conocidos para el llenado aséptico. Una composición de liposomas adecuada para aplicaciones médicas puede prepararse llenando de manera aséptica la composición de liposomas en un recipiente.

[0152] Composición farmacéutica

[0153] En relación con la vía de administración, la composición de liposomas según la realización de la presente invención también puede contener al menos uno de un agente de tonicidad, un estabilizador, un antioxidante o un agente de ajuste del pH que sea farmacéuticamente aceptable. Es decir, la composición de liposomas según la realización de la presente invención puede proporcionarse como una composición farmacéutica.

[0154] El agente de tonicidad no está limitado particularmente y los ejemplos del mismo incluyen sales inorgánicas tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, hidrogenofosfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de potasio; polioles tales como glicerol, manitol y sorbitol; y azúcares tales como glucosa, fructosa, lactosa y sacarosa.

[0155] El estabilizador no está limitado particularmente y los ejemplos del mismo incluyen azúcares tales como glicerol, manitol, sorbitol, lactosa y sacarosa.

[0156] El antioxidante no está limitado particularmente y los ejemplos del mismo incluyen ácido ascórbico, ácido úrico, homólogos de tocoferol (por ejemplo, vitamina E, cuatro isómeros de tocoferol α, β, γ y δ), cisteína y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Los estabilizadores y los antioxidantes pueden usarse respectivamente solos o en combinación de dos o más de los mismos.

[0157] Los ejemplos del agente de ajuste del pH incluyen hidróxido de sodio, ácido cítrico, ácido acético, trietanolamina, hidrogenofosfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de potasio.

[0158] La composición de liposomas según la realización de la presente invención puede contener un disolvente orgánico, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetilalmidón de sodio, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma xantana, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerol, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, solución salina tamponada con fosfato (PBS), cloruro de sodio, azúcares, un polímero biodegradable, un medio sin suero, cada uno de los cuales es farmacéuticamente aceptable, o un aditivo que es aceptable como aditivo farmacéutico.

[0159] El recipiente en el que se llena la composición de liposomas según la realización de la presente invención no está limitado particularmente, y está hecho preferiblemente de un material que tiene baja permeabilidad al oxígeno. Los ejemplos del recipiente incluyen un recipiente de plástico, un recipiente de vidrio y una bolsa fabricada de una película laminada que tiene una lámina de aluminio, una película con aluminio depositado, una película con óxido de aluminio depositado, una película con óxido de silicio depositado, un poli(alcohol vinílico), un copolímero de etileno-alcohol vinílico, un poli(tereftalato de etileno), un poli(naftalato de etileno), un poli(cloruro de vinilideno) o similares como capa de barrera de gas. Si es necesario, la luz puede bloquearse adoptando una bolsa o similar usando un vidrio coloreado, una lámina de aluminio, una película con aluminio depositado o similar.

[0160] En el recipiente en el que se llena la composición de liposomas, con el fin de impedir la oxidación por el oxígeno presente en el espacio del recipiente, es preferible reemplazar los gases en el espacio del recipiente y la disolución de fármaco por gases inertes tales como nitrógeno. Por ejemplo, se burbujea nitrógeno en una disolución de inyección, por lo que el llenado de la disolución de inyección en un recipiente puede llevarse a cabo en una atmósfera de nitrógeno.

[0161] La vía de administración de la composición farmacéutica según la realización de la presente invención es preferiblemente la administración parenteral. Los ejemplos de la administración parenteral incluyen inyección intravenosa tal como goteo intravenoso, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intraocular e inyección intratecal. El método de administración de la composición farmacéutica puede ser, por ejemplo, administración mediante jeringa o goteo intravenoso.

[0162] La dosificación y la frecuencia de administración de la composición farmacéutica según la realización de la presente invención pueden ajustarse de manera apropiada dependiendo del tipo de fármaco, la afección del paciente y similares. La dosis de la composición farmacéutica puede ajustarse generalmente en el intervalo de 0,01 mg/kg/día a 100 mg/kg/día en lo que se refiere a la cantidad de fármaco que es un principio activo. La dosis de la composición farmacéutica puede fijarse en el intervalo de 2 mg a 10 mg por dosis en lo que se refiere a la cantidad de fármaco que es un principio activo, pero no se limita a estas dosificaciones.

[0163] La composición farmacéutica según la realización de la presente invención puede usarse preferiblemente como un agente anticanceroso.

[0164] El tipo de cáncer al que se aplica la composición farmacéutica según la realización de la presente invención no está limitado particularmente, y los ejemplos del mismo incluyen cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de ovario, tumor sólido pediátrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de endometrio, cáncer gástrico (adenocarcinoma gástrico), cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, carcinoma de células escamosas de cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de colon, cáncer de células renales, linfoma no Hodgkin, cáncer urotelial, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia de células T adultas, cáncer metastásico de médula ósea, sarcoma, tumor de tejidos blandos, leucemia mielomonocítica crónica, linfoma de Hodgkin y linfoma cutáneo de células T.

[0165] Ejemplos

[0166] A continuación en el presente documento se describirá en detalle la presente invención con referencia a los ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a los ejemplos.

[0167] SM representa esfingomielina (COATSOME NM-10, fabricada por NOF Corporation).

[0168] DHSM derivada de huevo de gallina representa dihidroesfingomielina obtenida mediante la hidrogenación de SM derivada de huevo de gallina (producto sintético obtenido mediante la hidrogenación de COATSOME NM-10 (fabricado por NOF Corporation)). Esta DHSM derivada de huevo de gallina es una mezcla que contiene DHSM que tiene dos cadenas de alquilo que tienen 16 átomos de carbono, que representa del 70 % al 80 % del total de la DHSM derivada de huevo de gallina, y DHSM que tiene diferentes longitudes de cadena de alquilo, que constituye el resto.

[0169] La DHSM totalmente sintética representa dihidroesfingomielina producida mediante síntesis química para contener el 98 % o más del siguiente compuesto que tiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene 18 átomos de carbono.

[0172]

[0174] Se usó SUNBRIGHT DSPE-020CN (denominado a continuación en el presente documento DSPE-PEG, fabricado por NOF Corporation) como PEG-fosfolípido (indicado como PEG en la tabla).

[0175] Se usó colesterol HP (fabricado por Nippon Fine Chemical Co., Ltd.) como colesterol (indicado como Col en la tabla).

[0176] Ejemplos comparativos 1 a 10

[0177] (a) Preparación de la fase oleosa

[0178] Para el ejemplo comparativo 1, se pesaron 11,52 g de SM, 4,32 g de PEG-fosfolípido y 4,32 g de colesterol, respectivamente. Para los ejemplos comparativos 2 a 10, las cantidades de SM o DHSM derivada de huevo de gallina, PEG-fosfolípido y colesterol se cambiaron a las razones descritas en la tabla 1. El lípido se mezcló con 381 ml de etanol y se disolvió a 65 °C para preparar una fase oleosa.

[0179] (b 1) Preparación de la fase acuosa 1

[0180] Se disolvieron 25,2 g de sulfato de amonio en 1118,5 g de agua para preparar la fase acuosa 1.

[0181] (b2) Preparación de la fase acuosa 2

[0182] Se disolvieron 5,04 g de sulfato de amonio en 223,7 g de agua para preparar la fase acuosa 2.

[0183] (c) Formación de partículas de liposomas mediante emulsificación

[0184] La fase acuosa 1 preparada en (b1) se calentó hasta 65 °C, se añadió a la misma la totalidad de la fase oleosa preparada en (a), y después se mezclaron estas fases con un dispersador de emulsificación de precisión a una velocidad periférica de 26 m/s durante 60 minutos. Posteriormente, se añadió la fase acuosa 2 a temperatura ambiente a la misma, continuando con la agitación a una velocidad periférica de 0,1 m/s mientras se calentaba a 65 °C para evaporar el disolvente orgánico y el agua. En el caso de que el líquido se concentrara hasta 600 ml, se detuvieron el calentamiento y la agitación y, por tanto, se terminó la evaporación.

[0185] (e) Reemplazo del líquido de la fase acuosa externa del liposoma mediante diálisis

[0186] Se usó una disolución acuosa de NaCl al 3,15 % en masa como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (c) se sometió a filtración de flujo cruzado a temperatura ambiente para retirar el sulfato de amonio presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.

[0187] (f) Encapsulación de topotecán en partículas de liposomas mediante carga remota

[0188] Se añadió agua para inyección a clorhidrato de topotecán (fabricado por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg/ml. Además, mientras se agitaba bien el líquido, se añadió una disolución de HCl 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el topotecán. Se añadieron liposomas a la disolución de topotecán resultante a una razón en volumen de 1/1, seguido de calentamiento a 60 °C durante 60 minutos.

[0189] (g) Retirada del topotecán de la fase acuosa externa mediante diálisis

[0190] Se preparó un tampón de sacarosa/histidina que consistía en sacarosa al 9,4 % en masa e histidina 10 mmol/l como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (f) se sometió a filtración de flujo cruzado a temperatura ambiente para retirar el topotecán presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas que contienen topotecán en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.Ejemplos comparativos 11 y 12

[0191] (a) Preparación de la fase oleosa

[0192] Para el ejemplo comparativo 11, se pesaron 0,517 g de DHSM derivada de huevo de gallina y 0,233 g de colesterol, respectivamente. Para el ejemplo comparativo 12, las cantidades de SM y colesterol se cambiaron a las razones descritas en la tabla 1. Con el fin de marcar los liposomas con DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3' ,3'-tetrametilindocarbocianina), se pesó una cantidad de Dil, que era del 0,2 % en moles con respecto a los lípidos totales, y se disolvió en etanol. Se añadió etanol a la disolución de etanol-DiI para obtener un volumen total de 1,5 ml. El lípido pesado y este disolvente orgánico se mezclaron y se calentaron hasta 65 °C para disolver el lípido, preparando así una fase oleosa.

[0193] b) Preparación de la fase acuosa

[0194] Se disolvieron 0,9 g de sulfato de amonio y 2,16 g de sacarosa en 13,5 g de agua para preparar una fase acuosa.

[0195] (c) Formación de partículas de liposomas mezclando la fase oleosa y la fase acuosa

[0196] Se calentó la fase acuosa preparada en (b) hasta 65 °C y se agitó con un agitador magnético (3000 rpm). Se calentó toda la fase oleosa preparada en (a) hasta 65 °C con una placa caliente, y se succionó toda la fase oleosa con una jeringa y se calentó durante 5 minutos con una placa caliente. La fase oleosa se añadió gota a gota durante 30 segundos a la fase acuosa calentada.

[0197] (d) Regulación del tamaño de partícula mediante extrusora

[0198] El líquido obtenido en (c) se sometió a la regulación del tamaño de partícula haciéndolo pasar secuencialmente a través de un filtro usando una extrusora (Mini Extruder, fabricada por Avanti Polar Lipids, Inc.) con calentamiento a 70 °C.

[0199] (e) Reemplazo del líquido de la fase acuosa externa del liposoma mediante diálisis

[0200] Se usó una disolución acuosa de NaCl al 0,09 % en masa como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (c) o (d) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para retirar el sulfato de amonio presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.

[0201] (f) Encapsulación de topotecán en partículas de liposomas mediante carga remota

[0202] Se añadió agua para inyección a clorhidrato de topotecán (fabricado por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg/ml. Además, mientras se agitaba bien el líquido, se añadió una disolución de HCl 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el topotecán. Se añadieron liposomas a la disolución de topotecán resultante a una razón en volumen de 1/1, seguido de calentamiento a 60 °C durante 120 minutos.

[0203] (g) Retirada del topotecán de la fase acuosa externa mediante diálisis

[0204] Se preparó un tampón de sacarosa/histidina que consistía en sacarosa al 9,4 % en masa e histidina 10 mmol/l como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (f) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para retirar el topotecán presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas que contienen topotecán en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.

[0205] Ejemplos 1 a 8

[0206] (a) Preparación de la fase oleosa

[0207] Para el ejemplo 1, se pesaron respectivamente 11,52 g de DHSM derivada de huevo de gallina, 4,32 g de PEG-fosfolípido (SUNBRIGHT DSPE-020CN, fabricado por NOF Corporation, denominado a continuación en el presente documento DSPE-PEG) y 4,32 g de colesterol. Para los ejemplos 2 a 8, las cantidades de DHSM, DSPE-PEG y colesterol se cambiaron a las razones descritas en la tabla 2. El lípido se mezcló con 381 ml de etanol y se disolvió a 65 °C para preparar una fase oleosa.

[0208] (b1) Preparación de la fase acuosa 1

[0209] Se disolvieron 25,2 g de sulfato de amonio en 1118,5 g de agua para preparar la fase acuosa 1.

[0210] (b2) Preparación de la fase acuosa 2

[0211] Se disolvieron 5,04 g de sulfato de amonio en 223,7 g de agua para preparar la fase acuosa 2.

[0212] (c) Formación de partículas de liposomas mediante emulsificación

[0213] La fase acuosa 1 preparada en (b1) se calentó hasta 65 °C, se añadió a la misma la totalidad de la fase oleosa preparada en (a), y después se mezclaron estas fases con un dispersador de emulsificación de precisión a una velocidad periférica de 26 m/s durante 60 minutos. Posteriormente, se añadió la fase acuosa 2 a temperatura ambiente a la misma, continuando con la agitación a una velocidad periférica de 0,1 m/s mientras se calentaba a 65 °C para evaporar el disolvente orgánico y el agua. El calentamiento y la agitación se detuvieron en el caso en el que el líquido se concentrara a 600 ml y, por tanto, se detuvo la evaporación.

[0214] (e) Reemplazo del líquido de la fase acuosa externa del liposoma mediante diálisis

[0215] Se usó una disolución acuosa de NaCl al 3,15 % en masa como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (c) se sometió a filtración de flujo cruzado a temperatura ambiente para retirar el sulfato de amonio presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.

[0216] (f) Encapsulación de topotecán en partículas de liposomas mediante carga remota

[0217] Se añadió agua para inyección a clorhidrato de topotecán (fabricado por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg/ml. Además, mientras se agitaba bien el líquido, se añadió una disolución de HCl 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el topotecán. Se añadieron liposomas a la disolución de topotecán resultante a una razón en volumen de 1/1, seguido de calentamiento a 60 °C durante 60 minutos.

[0218] (g) Retirada del topotecán de la fase acuosa externa mediante diálisis

[0219] Se preparó un tampón de sacarosa/histidina que consistía en sacarosa al 9,4 % en masa e histidina 10 mmol/l como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (f) se sometió a filtración de flujo cruzado a temperatura ambiente para retirar el topotecán presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas que contienen topotecán en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.Ejemplos 9 y 10

[0220] (a) Preparación de la fase oleosa

[0221] Para el ejemplo 9, se pesaron 0,412 g de DHSM derivada de huevo de gallina, 0,153 g de DSPE-PEG y 0,153 g de colesterol, respectivamente. Para el ejemplo 10, las cantidades de DHSM derivada de huevo de gallina DSPE-PEG y colesterol se cambiaron a las razones descritas en la tabla 2. Con el fin de marcar los liposomas con DiI, se pesó una cantidad de DiI, que era del 0,2 % en moles con respecto a los lípidos totales, y se disolvió en etanol. Se añadió etanol a la disolución de etanol-DiI resultante para obtener un volumen total de 11,25 ml, y se añadieron adicionalmente 3,75 ml de acetato de etilo a la misma. El lípido pesado y este disolvente orgánico se mezclaron y se calentaron hasta 60 °C para disolver el lípido, preparando así una fase oleosa.

[0222] b) Preparación de la fase acuosa

[0223] Se disolvieron 0,9 g de sulfato de amonio en 40 g de agua para preparar una fase acuosa.

[0224] (c) Formación de partículas de liposomas mediante emulsificación

[0225] La fase acuosa preparada en (b) se calentó hasta 70 °C, se añadió toda la fase oleosa preparada en (a) (razón en volumen: fase acuosa/fase oleosa = 8/3) y luego estas fases se mezclaron usando una máquina de emulsificación (homogeneizador Excel Auto ED-3, fabricado por Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) a 3000 rpm (rotación por minuto: 1/60s<-1>) durante 30 minutos. A continuación, se continuó con la agitación a 300 rpm mientras se calentaba a 65 °C para evaporar el disolvente orgánico y el agua. En el caso de que el líquido se concentrara hasta 15 g, se detuvieron el calentamiento y la agitación y, por tanto, se terminó la evaporación.

[0226] (d) Regulación del tamaño de partícula mediante extrusora

[0227] El líquido obtenido en (c) se sometió a la regulación del tamaño de partícula haciéndolo pasar secuencialmente a través de un filtro usando una extrusora (Mini Extruder, fabricada por Avanti Polar Lipids, Inc.) con calentamiento a 70 °C.

[0228] (e) Reemplazo del líquido de la fase acuosa externa del liposoma mediante diálisis

[0229] Se usó una disolución acuosa de NaCl al 0,09 % en masa como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (c) o (d) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para retirar el sulfato de amonio presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.

[0230] (f) Encapsulación de topotecán en partículas de liposomas mediante carga remota

[0231] Se añadió agua para inyección a clorhidrato de topotecán (fabricado por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg/ml. Además, mientras se agitaba bien el líquido, se añadió una disolución de HCl 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el topotecán. Se añadieron liposomas a la disolución de topotecán resultante a una razón en volumen de 1/1, seguido de calentamiento a 60 °C durante 120 minutos.

[0232] (g) Retirada del topotecán de la fase acuosa externa mediante diálisis

[0233] Se preparó un tampón de sacarosa/histidina que consistía en sacarosa al 9,4 % en masa e histidina 10 mmol/l como líquido de diálisis. Usando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (f) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para retirar el topotecán presente en la fase acuosa externa para obtener liposomas que contienen topotecán en los que la fase acuosa externa se reemplazó por el líquido de diálisis.

[0234] Medición y evaluación de las propiedades físicas

[0235] Tamaño de partícula promedio

[0236] En la presente invención, el tamaño de partícula promedio se refiere a un tamaño de partícula promedio acumulado medido mediante un método de dispersión de luz dinámica. El tamaño de partícula promedio en cada uno de los ejemplos y ejemplos comparativos descritos en la tabla es un tamaño de partícula promedio acumulado medido mediante un método de dispersión de luz dinámica usando un analizador de tamaño de partícula de sistema concentrado FPAR-1000AS (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.) con un muestreador automático.

[0237] Los resultados de medición se muestran en las tablas 1 y 2.

[0238] Medición de la concentración de topotecán

[0239] La muestra se midió con un aparato de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) Nexera-i LC-2040C (fabricado por Shimadzu Corporation) para cuantificar la concentración de topotecán. Los resultados se muestran en las tablas 1 y 2. El método de medición específico es el siguiente.

[0240] En los liposomas de las tablas 1 y 2, el porcentaje del fármaco contenido en la fase acuosa interna del liposoma con respecto al fármaco en toda la composición de liposomas fue de al menos el 95 %, excepto para el ejemplo comparativo 10 en el que el porcentaje del fármaco contenido en la fase acuosa interna del liposoma con respecto al fármaco en toda la composición de liposomas fue del 59 %.

[0241] Medición de la cantidad de topotecán en la formulación de liposomas

[0242] El líquido de liposomas preparado se disolvió en metanol y se filtró para obtener una disolución de muestra. Se diluyó clorhidrato de topotecán para preparar una disolución patrón de la curva de calibración. Usando la disolución de muestra y la disolución patrón de la curva de calibración así preparada, se midió la cantidad de topotecán en la formulación de liposomas mediante cromatografía de líquidos/detección de absorbancia ultravioleta-visible. La concentración de topotecán en la fase acuosa interna se calculó restando la concentración de topotecán en la fase acuosa externa de la concentración de topotecán en toda la fase acuosa. La concentración de topotecán en cada fase acuosa se midió de la siguiente manera.

[0243] Concentración de topotecán en toda la fase acuosa

[0244] Se midieron 50 µl del líquido de dispersión de liposomas y se añadieron 950 µl de metanol al mismo, seguido de agitación con un vórtice durante 1 minuto. Se midieron 100 µl del líquido y se añadieron 900 µl de agua Milli-Q al mismo, seguido de agitación con un vórtice durante 1 minuto para preparar una muestra de análisis de HPLC.Concentración de topotecán en la fase acuosa externa

[0245] Se midieron 50 µl del líquido de dispersión de liposomas y luego se diluyeron mediante la adición de 450 µl de una disolución acuosa de sacarosa al 9,4 % en peso/histidina 10 mM. Se añadieron 200 µl de PBS a 100 µl del líquido diluido que luego se mezclaron por inversión. El líquido de dispersión se sometió a ultracentrifugación (200.000 g, 20 °C, 60 minutos), y el sobrenadante se usó como muestra de análisis de HPLC. La ultracentrifugación se llevó a cabo usando un dispositivo Hitachi himac CP80WX.

[0246] a) Preparación de la disolución patrón de la curva de calibración

[0247] Se pesaron aproximadamente 20 mg de clorhidrato de topotecán y se disolvieron en 20 ml de disolución acuosa de metanol al 10 % en masa. Se añadió agua Milli-Q a este líquido para preparar una disolución que tenía una concentración de clorhidrato de topotecán de 0,1, 1,0, 5,0, 10,0, 20,0, 50,0 o 100,0 ppm, que después se usó como disolución patrón de la curva de calibración.

[0248] b) Preparación de la disolución de muestra

[0249] (1) Se pesaron aproximadamente 50 µl de una muestra (disolución de formulación de liposomas) mediante el dispositivo MICROMAN (marca comercial registrada), y se añadieron aproximadamente 950 µl de metanol pesado mediante el dispositivo MICROMAN a la misma. Después de agitar durante aproximadamente 1 minuto, se confirmó visualmente que la disolución se volvía transparente.

[0250] (2) Se pesaron 100 µl de la disolución del anterior (1) mediante el dispositivo MICROMAN, y se añadieron a la misma aproximadamente 900 µl de agua Milli-Q pesada mediante una micropipeta. Este líquido se agitó durante aproximadamente 1 minuto, se sonicó durante aproximadamente 1 minuto y se agitó adicionalmente durante aproximadamente 10 segundos.

[0251] (3) La disolución obtenida filtrando la disolución de lo anterior (2) a través de un filtro DISMIC (marca comercial registrada) (diámetro de poro: 0,45 µm) como disolución de muestra.

[0252] c) Medición

[0253] La medición se llevó a cabo en las siguientes condiciones mediante cromatografía de líquidos/detección de absorbancia UV-vis.

[0254] Longitud de onda de medición: 382 nm, columna: Shiseido CAPCELLPAK C18 ACR 3 µm_3.0 mm*75 mm Temperatura de la columna: temperatura constante de alrededor de 40 °C;[0255] Ambas fases móviles A y B son una mezcla de agua/metanol/ácido trifluoroacético, y la alimentación de las fases móviles se llevó a cabo cambiando la razón de mezclado de las fases móviles A y B para controlar el gradiente de concentración.;[0256] Velocidad de flujo: 1,0 ml/minuto, volumen de inyección: 10 µl, temperatura del muestreador automático: temperatura constante de alrededor de 25 °C.;[0257] Medición de la concentración de iones sulfato;[0258] La muestra se midió con un aparato de cromatografía iónica 883 Basic IC plus (fabricado por Metrohm AG) para cuantificar la concentración de iones sulfato. Los resultados de la medición de la razón molar de iones sulfato con respecto a topotecán se muestran en las tablas 1 y 2. En los liposomas de las tablas 1 y 2, el porcentaje de iones sulfato contenidos en la fase acuosa interna del liposoma con respecto a los iones sulfato en toda la composición de liposomas fue de al menos el 90 %.;[0259] La concentración de iones sulfato en la fase acuosa interna se calculó restando la concentración de los iones sulfato en la fase acuosa externa de la concentración de iones sulfato en toda la fase acuosa.;[0260] La concentración de iones sulfato en cada fase acuosa se midió de la siguiente manera.;[0261] Concentración de iones sulfato en toda la fase acuosa;[0262] Se midieron 50 µl del líquido de dispersión de liposomas y se añadieron 950 µl de metanol al mismo, seguido de mezclado con ultrasonicación durante 15 segundos. Se midieron 90 µl del líquido y se añadieron 810 µl de agua para inyección (fabricada por Hikari Pharmaceutical Co., Ltd.) al mismo, seguido de mezclado con ultrasonicación durante 30 segundos. Se añadieron 900 µl de acetato de etilo a la disolución resultante que después se agitó bien para extraer los lípidos en una fase de acetato de etilo. Se midió una cantidad apropiada del líquido de la fase acuosa y se usó para el análisis de cromatografía iónica.;[0263] Concentración de iones sulfato en la fase acuosa externa;[0264] Se midieron 100 µl del líquido de dispersión de liposomas y luego se diluyeron añadiendo 900 µl de disolución de glucosa al 5 % (fabricada por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). Se trataron 450 µl del líquido resultante mediante ultrafiltración y el filtrado se usó como muestra de análisis de cromatografía iónica.;[0265] Las condiciones de centrifugación fueron 7400 g, 5 °C y 30 minutos. La centrífuga utilizada fue Hitachi himac CF15RXII.;[0266] Medición del AUC;[0267] A los ratones a los que se administraron los liposomas preparados que contenían topotecán (dosis: 1 mg/kg en lo que se refiere a la cantidad de fármaco) se les extrajo sangre a las 0.25, 2, 6 y 24 horas después de la administración. La sangre se centrifugó a 800×g durante 10 minutos para recuperar el plasma. Se cuantificó la concentración de topotecán para el plasma recogido usando cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (CL/EM/EM). Usando el software de análisis farmacocinético WinNonlin (marca comercial registrada) (disponible de Certara, L.P.), se calculó el área bajo la curva de la concentración en sangretiempo (AUC) hasta un tiempo infinito después de una única administración a partir de la transición de la concentración de topotecán así obtenida. La unidad de AUC es tiempo×ng/ml (expresado como h*ng/ml en la tabla). Además, el AUC del liposoma descrito en [AACR-EORTC International Conference, San Francisco, California, 22-26 de octubre de 2007, n.º C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni et al.] se calcula en 68152 horas×ng/ml.

[0268] Tal como puede observarse a partir de los resultados en las tablas 1 y 2, en los ejemplos 1 a 10 de la composición de liposomas que incluye una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, una dihidroesfingomielina y colesterol como componentes de una membrana de liposomas, en la que una fase acuosa interna contiene sulfato de amonio y la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa es de 0,36 o más, se demostró que el valor medido de AUC es de 200.000 o más y, por tanto, puede lograrse una alta retención en sangre. Por otro lado, en los ejemplos comparativos 1 a 8 en los que no se usa dihidroesfingomielina, los ejemplos comparativos 9 y 10 en los que la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa es inferior a 0,36, y los ejemplos comparativos 11 y 12 en los que no se usa diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo, se demostró que el valor medido de AUC es inferior a 200.000, que es inferior a los ejemplos 1 a 10.

[0269] Prueba de eficacia de fármaco usando un modelo de ratón con trasplante subcutáneo A549

[0270] Se trasplantaron por vía subcutánea 1×10<7>células A549, una línea celular de cáncer de pulmón humano, en el costado derecho de ratones Balb/c/nu/nu (hembras, 6 semanas de edad). A partir del día 15 después del trasplante, a los animales se les administraron los liposomas que contenían topotecán preparados en el ejemplo 10 (4 mg/kg y 2 mg/kg en lo que se refiere a la cantidad de fármaco, dos veces por semana) y los liposomas que contenían topotecán preparados en el ejemplo comparativo 12 (4 mg/kg y 2 mg/kg en lo que se refiere a la cantidad de fármaco, dos veces por semana). Además, a los animales se les administró solución salina fisiológica como control negativo. Además, a los animales se les administró una disolución acuosa de topotecán (2 mg/kg en lo que se refiere a la cantidad de fármaco) como control comparativo. El peso corporal y el volumen tumoral de los animales se midieron dos veces por semana desde el inicio de la dosificación. Los resultados de medición del peso corporal se muestran en las figuras 1 y 2, y los resultados de medición del volumen tumoral se muestran en las figuras 3 y 4.

[0271] A partir de los resultados de las figuras 3 y 4, se demostró que el liposoma que contenía topotecán preparado en el ejemplo 10 presenta mayor eficacia de fármaco en comparación con la disolución de topotecán preparada en el ejemplo comparativo 12, y el efecto es dependiente de la dosis.

[0272] Ejemplos 11 a 16 y ejemplos comparativos 13 a 16

[0273] Se prepararon liposomas que contenían topotecán de la misma manera que en el ejemplo 1, excepto en que, para los ejemplos 11 a 16, las cantidades de DHSM, DSPE-PEG y colesterol se cambiaron de modo que la cantidad de adición de colesterol y la cantidad de adición de DHSM derivada de huevo de gallina en el ajuste de la fase oleosa se convirtieron en las razones descritas en la tabla 3. Por ejemplo, para el ejemplo 11, se produjeron liposomas que contenían topotecán de la misma manera que en el ejemplo 1, excepto en que la cantidad de adición de colesterol y la cantidad de adición de DHSM derivada de huevo de gallina en el ajuste de la fase oleosa se cambiaron a 3,6 g de colesterol y 12,9 g de DHSM derivada de huevo de gallina.

[0274] Para los ejemplos comparativos 13 a 16, las cantidades de SM, DSPE-PEG y colesterol se cambiaron a las razones descritas en la tabla 3.

[0275] De manera similar, en la tabla 3 se muestran los resultados de la medición del tamaño de partícula, la concentración de topotecán en toda la fase acuosa, la concentración de iones sulfato en la fase acuosa interna y el AUC. Además, en la figura 5 se muestra el valor de AUC para cada cantidad de colesterol.

[0276] En los liposomas de la tabla 3, el porcentaje del fármaco contenido en la fase acuosa interna del liposoma con respecto al fármaco en toda la composición de liposomas fue de al menos el 98 %, excepto para el ejemplo comparativo 13 en el que el porcentaje del fármaco contenido en la fase acuosa interna del liposoma con respecto al fármaco en toda la composición de liposomas fue del 68 %.

[0277] En los liposomas de la tabla 3, el porcentaje de los iones sulfato contenidos en la fase acuosa interna del liposoma con respecto a los iones sulfato en toda la composición de liposomas fue de al menos el 90 %, excepto para el ejemplo comparativo 13 en el que el porcentaje de iones sulfato contenidos en la fase acuosa interna del liposoma con respecto a los iones sulfato en toda la composición de liposomas fue del 71 %.

[0278] A partir de los resultados de los ejemplos 11 a 16 y los ejemplos comparativos 1, 2, 4, 7 y 13 a 16, puede observarse que la presente invención logra un AUC satisfactoria para liposomas con DHSM derivada de huevo de gallina a un porcentaje de carga de colesterol más amplio que los liposomas de SM. Además, en el liposoma de DHSM derivada de huevo de gallina de la presente invención, puede observarse que el AUC es más satisfactorio, en particular, en el caso de que el porcentaje de colesterol esté en el intervalo del 35 al 43 % en moles.

[0279] Ejemplos 17 a 24 y ejemplos comparativos 17 a 24

[0280] Preparación de líquido de dispersión de liposomas

[0281] Se prepararon liposomas que contenían topotecán de la misma manera que en el ejemplo 1, excepto en que, para los ejemplos 17 a 24 y los ejemplos comparativos 17 a 24, la cantidad de adición de cada lípido en el ajuste de la fase oleosa se estableció tal como se muestra en la tabla 4, el fármaco que iba a encapsularse en las partículas de liposomas mediante carga remota se estableció tal como se muestra en la tabla 4, y los fármacos distintos de topotecán se encapsularon mediante el método descrito en la sección Encapsulación de cada fármaco anticanceroso en partículas de liposomas mediante carga remota descrita a continuación. Además, en la tabla 5 se muestra la razón de la composición lipídica en cada uno de los ejemplos 17 a 24 y los ejemplos comparativos 17 a 24.

[0282] Tabla 4

[0284]

[0286] Tabla 5

[0288]

[0289]

[0291] Encapsulación de cada agente anticanceroso en partículas de liposomas mediante carga remotaEncapsulación de doxorubicina (ejemplos 19 y 20 y ejemplos comparativos 19 y 20): Se añadió agua para inyección a clorhidrato de doxorubicina (fabricado por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a 4 mg/ml. Además, mientras se agitaba bien el líquido, se añadió una disolución de HCl 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el clorhidrato de doxorubicina. Se añadieron liposomas a la disolución de doxorubicina resultante a una razón en volumen de 1/1, y después el líquido de dispersión ajustado a pH 7,0 se calentó a 62 °C durante 60 minutos.

[0292] Encapsulación de sunitinib (ejemplos 21 y 22 y ejemplos comparativos 21 y 22): Se añadió agua para inyección a malato de sunitinib (fabricado por Toronto Research Chemicals Inc.) a 5 mg/ml. Además, mientras se agitaba bien el líquido, se añadió una disolución de HCl 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el malato de sunitinib. Se añadieron liposomas a la disolución de sunitinib resultante a una razón en volumen de 1/1, seguido de calentamiento a 62 °C durante 60 minutos.

[0293] Encapsulación de irinotecán (ejemplos 23 y 24, y ejemplos comparativos 23 y 24): Se añadió agua para inyección a clorhidrato de irinotecán (fabricado por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a 4 mg/ml. Además, mientras se agitaba bien el líquido, se añadió una disolución de HCl 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el clorhidrato de irinotecán. Se añadieron liposomas a la disolución de irinotecán resultante a una razón en volumen de 1/1, seguido de calentamiento a 62 °C durante 60 minutos.

[0294] Se midió el AUC en los ejemplos 17 a 22 y los ejemplos comparativos 17 a 22 de la misma manera que la descrita anteriormente en los presentes ejemplos. Los resultados se muestran en la tabla 6.

[0295] Tabla 6

[0297]

[0299] A partir de los resultados de los ejemplos 17 a 22 y los ejemplos comparativos 17 a 22, incluso en el caso en el que se usó cualquier fármaco de topotecán o sunitinib, los liposomas que usaron DHSM mostraron una retención mejorada en sangre en comparación con los liposomas de SM y los liposomas de HSPC. Además, se encontró que los liposomas que usaron DHSM totalmente sintética que tenía una pureza del 98 % o más de DHSM que tiene una cadena de alquilo que tiene 16 átomos de carbono y una cadena de alquilo que tiene 18 átomos de carbono como DHSM, pueden mejorar la retención en sangre en comparación con los liposomas que usaron DHSM derivada de huevo de gallina.

[0300] Se midieron el tamaño de partícula, la concentración de topotecán, la concentración de iones sulfato y la tasa de liberación en los ejemplos 17 a 24 y los ejemplos comparativos 17 a 18 y 21 a 24. Los resultados se muestran en la tabla 7. Se midieron el tamaño de partícula, la concentración de topotecán y la concentración de iones sulfato de la misma manera que la descrita anteriormente en los presentes ejemplos.

[0301] En los liposomas de la tabla 7, el porcentaje del fármaco contenido en la fase acuosa interna de los liposomas con respecto al fármaco de toda la composición de liposomas fue de al menos el 95 %.

[0302] En los liposomas de la tabla 7, el porcentaje de iones sulfato contenidos en la fase acuosa interna del liposoma con respecto a los iones sulfato en toda la composición de liposomas fue de al menos el 95 %.

[0303] La formulación de liposomas se diluyó 20 veces en cada concentración de tampón PBS que contenía cloruro de amonio, y se midió la tasa de liberación de la misma después de la incubación durante 4 horas. La tasa de liberación se define como el porcentaje de la concentración de API que se fuga a la fase acuosa externa dividido entre la concentración inicial de API en toda la fase acuosa.

[0304] Para cada concentración de tampón PBS que contenía cloruro de amonio,

[0305] en los ejemplos 17 y 18 y los ejemplos comparativos 17 y 18 (evaluación de liposomas con topotecán encapsulado), se usó un tampón PBS en el que se disolvieron 4,8 mmol/l de cloruro de amonio,

[0306] en los ejemplos 19 y 20 y los ejemplos comparativos 19 y 20 (evaluación de liposomas con doxorubicina encapsulada), se usó un tampón PBS en el que se disolvieron 200 mmol/l de cloruro de amonio,

[0307] en los ejemplos 21 y 22 y los ejemplos comparativos 21 y 22 (evaluación de liposomas con sunitinib encapsulado), se usó un tampón PBS en el que se disolvieron 100 mmol/l de cloruro de amonio, y

[0308] en los ejemplos 23 y 24 y los ejemplos comparativos 23 y 24 (evaluación de liposomas con irinotecán encapsulado), se usó un tampón PBS en el que se disolvieron 4,8 mmol/l de cloruro de amonio.

[0309] Tabla 7

[0311]

[0312]

[0315] Según los resultados de los ejemplos 17 a 24 y los ejemplos comparativos 17, 18 y 21 a 24, la tasa de liberación de los liposomas usando DHSM es menor que la de los liposomas de SM y los liposomas de HSPC, independientemente de qué agente se use, de lo que puede esperarse una mejora de la retención en sangre. Además, en el caso de que la DHSM sea una DHSM totalmente sintética que tiene una pureza del 98 % o más con una cadena de alquilo que tiene 16 átomos de carbono y una cadena de alquilo que tiene 18 átomos de carbono, la tasa de liberación se reduce en gran medida en el liposoma con topotecán encapsulado, el liposoma con doxorubicina encapsulada y el liposoma con irinotecán encapsulado, y por tanto se ha encontrado que el uso de tal DHSM totalmente sintética es más preferible para suprimir la fuga del fármaco en sangre.

[0316] Medición de materiales particulados insolubles

[0317] Para cada uno de los ejemplos 2, 3 y 4, se midieron las muestras un mes después del almacenamiento a 5 °C en un contador de partículas sumergidas (HACH ULTRA), y se midió el número de partículas de más de 10 µm y el número de partículas de más de 25 µm contenidas por formulación de vial (2 ml) (a continuación en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, las partículas de más de 10 µm se refieren a partículas de más de 10 µm de tamaño de partícula, y las partículas de más de 25 µm se refieren a partículas de más de 25 µm de tamaño de partícula). La concentración de lípidos en los ejemplos 2, 3 y 4 fue de 23 mmol/l, y el número de partículas por 1 µmol de lípido para las partículas de más de 10 µm fue de 0,7 para el ejemplo 2, de 1,1 para el ejemplo 3 y de 0,3 para el ejemplo 4. Además, el número de partículas por 1 µmol de lípido para las partículas de más de 25 µm fue de 0,09 para el ejemplo 2, de 0,5 para el ejemplo 3 y de 0 para el ejemplo 4. Se sabe que los liposomas con topotecán encapsulado se descomponen en dímeros de baja solubilidad cuando se fugan y se exponen a un entorno neutro, convirtiéndose así en materiales particulados insolubles. Este es un resultado sorprendente de que la generación de materiales particulados insolubles también se ha reducido, porque la fuga se suprime extremadamente bien mediante la presente invención.

[0318] Para el ejemplo comparativo 8, también se midieron los materiales particulados insolubles en la formulación de 1 vial (2 ml) en la muestra un mes después a 5 °C. En lo que se refiere al número de partículas por 1 µmol de lípido, el número de partículas de más de 10 µm fue de 251, superando por tanto en gran medida los 150, y el número de partículas de más de 25 µm fue de 17, superando por tanto en gran medida los 15.

[0319] Dependencia del ion amonio de la tasa de liberación

[0320] La tasa de liberación se calculó como el porcentaje de la concentración de fármaco fugado (concentración de fármaco en la fase acuosa externa) con respecto a la concentración de fármaco en toda la fase acuosa. Para los liposomas de DHSM con topotecán encapsulado preparados en el ejemplo 17, y los liposomas de HSPC con doxorubicina encapsulada (Doxil (marca comercial registrada) 20 MG, disponible de Janssen Pharma, Inc.), la tasa de liberación de los liposomas se midió en plasma sin adición de cloruro de amonio (fabricado por LAMPIRE Biological Laboratories, Inc., plasma de ratón, nombre del producto: Control and Donor Mouse Plasma in Na Hep (plasma de ratón de control y donante en Na Hep), n.º de catálogo 7315511) y plasma en el que se disolvieron 5 mmol/l de cloruro de amonio. Los resultados se muestran en la figura 6. En el entorno tumoral, la degradación de glutamina está potenciada, y como resultado, se genera una gran cantidad de amonio, para lo que se ha notificado la aparición de aproximadamente 5 mmol/l de amonio (artículo citado: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 1841-1850).

[0321] Doxil (marca comercial registrada) 20 MG es un liposoma con doxorubicina encapsulada compuesto de HSPC. Doxil (marca comercial registrada) muestra muy poca fuga en un entorno que imita la sangre, pero se ha encontrado que prácticamente no se liberad incluso en un entorno con alto contenido de amonio que imita el entorno tumoral.

[0322] Por otro lado, el liposoma que contiene topotecán, que se describe en el ejemplo 17 de la presente invención, muestra una fuga muy baja en un entorno que imita la sangre, lo que da como resultado de ese modo una alta retención en la sangre, mientras que muestra una liberación muy alta del 86 % en un entorno con alto contenido de amonio que imita el entorno tumoral y no se fuga en la sangre, lo que conduce al resultado esperado de que el liposoma suministre una gran cantidad del fármaco al tumor y que el fármaco transportado por el liposoma se libere en grandes cantidades en el tumor. Los resultados se muestran en la figura 6.

[0323] Además, se recogió un tumor obtenido trasplantando realmente una línea celular de cáncer de ovario humano ES-2 por vía subcutánea en un ratón desnudo BALB/c y se colocó en un filtro centrífugo de tamaño de poro de 5 µm, seguido de centrifugación a 400 g durante 10 minutos para obtener un fluido intersticial tumoral. Los liposomas de topotecán (30 ng en lo que se refiere a la cantidad de fármaco) de la presente invención preparados en el ejemplo 17 y los liposomas de HSPC con doxorubicina encapsulada (Doxil (marca comercial registrada) 20 MG, disponible de Janssen Pharma, Inc.) (30 ng en lo que se refiere a la cantidad de fármaco) se añadieron respectivamente a 30 µl del fluido intersticial tumoral, seguido de incubación. La tasa de liberación en el caso de incubación a 37 °C durante 24 horas fue del 85 % en el ejemplo 17 y del 6 % en liposomas de HSPC con doxorubicina encapsulada, mostrando así que se observó una diferencia en la liberación tal como se esperaba en el fluido intersticial tumoral recogido del entorno tumoral real.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

1. Composición de liposomas que comprende: liposomas, cada uno de los cuales tiene una fase acuosa interna y una disolución acuosa que constituye una fase acuosa externa y en la que se dispersan los liposomas,

en la que el liposoma comprende

una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo;

una dihidroesfingomielina; y

colesteroles;

en la que cada uno de los liposomas encapsula un fármaco,

en la que la fase acuosa interna contiene sulfato de amonio,

y una razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco en toda la fase acuosa es de 0,36 o más.

2. Composición de liposomas según la reivindicación 1,

en la que el fármaco es un fármaco anticanceroso.

3. Composición de liposomas según la reivindicación 1 o 2,

en la que el fármaco es un agente anticanceroso a base de antraciclina, un agente anticanceroso a base de cisplatino, un agente anticanceroso a base de taxano, un agente anticanceroso a base de alcaloides de la vinca, un agente anticanceroso a base de bleomicina, un agente anticanceroso a base de sirólimus, un agente anticanceroso a base de camptotecina, un antagonista metabólico o un fármaco dirigido molecularmente.

4. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

en la que el fármaco es topotecán o una sal del mismo, doxorubicina o una sal de la misma, irinotecán o una sal del mismo, o sunitinib o una sal del mismo.

5. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

en la que la razón molar de iones sulfato en la fase acuosa interna con respecto al fármaco contenido en toda la fase acuosa es de 0,6 o más y de 1,8 o menos.

6. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,

en la que la diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo es una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol o metoxipolietilenglicol.

7. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

en la que el porcentaje de la diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo en los componentes del liposoma es del 2 al 10 % en moles.

8. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

en la que el porcentaje de colesteroles en los componentes del liposoma es del 35 al 43 % en moles.

9. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el liposoma tiene un tamaño de partícula de 30 nm a 150 nm,

medido mediante un método de dispersión de luz dinámica.

10. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,

en la que la fase acuosa externa tiene un pH de 5,5 a 8,5.

11. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,

en la que la dihidroesfingomielina es una dihidroesfingomielina que contiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene 18 átomos de carbono, y el fármaco es topotecán o una sal del mismo.

12. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,

en la que el porcentaje de los iones sulfato contenidos en la fase acuosa interna del liposoma con respecto a los iones sulfato en toda la composición de liposomas es de al menos el 80 %, y el porcentaje del fármaco contenido en la fase acuosa interna del liposoma con respecto al fármaco en toda la composición de liposomas es de al menos el 80 %.

13. Composición de liposomas según la reivindicación 11,

en la que la tasa de liberación del fármaco desde el liposoma en plasma que tiene una concentración de amonio de 1 mmol/l o menos es del 20 %/24 horas o menos a 37 °C, y la tasa de liberación del fármaco desde el liposoma en plasma que tiene una concentración de amonio de 4 a 6 mmol/l es del 60 %/24 horas o más a 37 °C.

14. Composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,

en la que el número de partículas insolubles de más de 10 µm contenidas en 1 µmol de lípido de la composición de liposomas después del almacenamiento durante 1 mes a 5 °C es de 150 o menos, y el número de partículas insolubles de más de 25 µm contenidas en 1 µmol de lípido de la composición de liposomas es de 15 o menos.

15. Composición farmacéutica, que comprende:

la composición de liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 14.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 15 para su uso como agente anticanceroso.

17. Composición de liposomas que comprende: liposomas, cada uno de los cuales tiene una fase acuosa interna y una disolución acuosa que constituye una fase acuosa externa y en la que se dispersan los liposomas,

en la que el liposoma comprende

una diacilfosfatidiletanolamina modificada con polímero hidrófilo;

una dihidroesfingomielina; y

colesteroles;

en la que cada uno de los liposomas encapsula un fármaco,

en la que la fase acuosa interna de la misma contiene sulfato de amonio,

y la dihidroesfingomielina es una dihidroesfingomielina que contiene un grupo alquilo de cadena larga que tiene 16 átomos de carbono y un grupo alquilo de cadena larga que tiene 18 átomos de carbono.

18. Composición de liposomas según la reivindicación 17,

en la que el porcentaje de la dihidroesfingomielina en los componentes del liposoma es del 40 al 70 % en moles.

19. Composición farmacéutica, que comprende:

la composición de liposomas según la reivindicación 17 o 18.