ES3045907T3 - Composition for preventing or treating neurotrophic keratitis which contains stabilized pacap peptide - Google Patents

Abstract

El propósito de la presente invención es proporcionar una composición para la prevención o el tratamiento de la queratitis neurotrófica. Se ha descubierto que el péptido PACAP previene el daño corneal en un modelo de queratitis neurotrófica y puede promover la extensión de neuritas en un modelo de células nerviosas cultivadas. Además, la estabilidad puede aumentarse significativamente sustituyendo un grupo carboxilo en un residuo de ácido aspártico ubicado en la posición 3 y/o 8 de la secuencia de PACAP por tetrazol. Se proporciona: una composición para la prevención o el tratamiento de la queratitis neurotrófica, que contiene péptido PACAP o péptido PACAP estabilizado; y un agente promotor de la extensión de neuritas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composición para prevenir o tratar la queratitis neurotrófica que contiene péptido de Pacap estabilizadoCampo técnico

[0003] La presente invención se refiere a un péptido como el reivindicado para prevenir o tratar la queratitis neurotrófica que comprende un péptido estabilizado con actividad fisiológica de PACAP.

[0004] Técnica anterior

[0005] La sensación corneal es importante para proporcionar prevención de daños por los reflejos de parpadeo y secreción lagrimal, y esta sensación está gobernada por el nervio corneal. El nervio corneal no sólo media la sensación, sino que también afecta al crecimiento de las células epiteliales corneales mediante la secreción de neurotransmisores liberados de las terminaciones nerviosas corneales en el epitelio corneal, y factores de crecimiento nervioso. Cuando el nervio corneal está dañado, el metabolismo de las células epiteliales corneales se altera y se pierde la capacidad proliferativa, y se sabe que esto causa úlceras tróficas. La queratitis neurotrófica y la queratopatía neuroparalítica son enfermedades corneales degenerativas que resultan del daño al nervio trigémino, y conducen al daño del epitelio corneal. El tipo más grave puede conducir a ulceración, fusión o perforación corneal, y pérdida de visión por el paciente. La queratitis neurotrófica puede resultar de una variedad de síntomas clínicos que incluyen infección vírica tal como herpes corneal, lesión ocular, cirugía corneal o afecciones sistémicas tales como diabetes. Se ha descrito que la infección por herpes, en particular, es responsable del 27% de los casos de queratitis neurotrófica. La queratitis neurotrófica se ha reconocido desde hace mucho tiempo, pero aún no se ha desarrollado ningún método de tratamiento eficaz.

[0006] Los avances en neurociencia han llevado al descubrimiento de numerosos factores neuroprotectores, y se espera que se desarrollen como agente preventivo o terapéutico para el trastorno nervioso. Se ha descubierto que los fármacos que reducen los radicales libres y los aminoácidos excitadores, que son causas de neurodegeneración, o que son capaces de proteger y/o reparar neuronas (por ejemplo, ligandos de inmunofilina tales como factores neurotróficos o agentes inmunosupresores) tienen acción neuroprotectora, y se ha demostrado que proteínasin vivotales como el polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP), CD44 y carboxipeptidasa B de cerebro humano (HBCPB) muestran acción neuroprotectora (PTL 1 y 2).

[0007] El polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP) es un neuropéptido descubierto originalmente en el extracto del hipotálamo de oveja. El PACAP puede exhibir actividad que estimula la formación de AMPc en células pituitarias anteriores. El PACAP incluye PACAP38 que consiste en 38 restos de aminoácidos, y PACAP27 que consiste en 27 restos de aminoácidos, ambos los cuales tienen actividad equivalente (BNRP 1 y 2). El PACAP pertenece a la superfamilia del polipéptido intestinal vasoactivo (VIP)/secretina/glucagón, y la secuencia de PACAP27 humano tiene 68% de identidad con el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP). El PACAP y VIP se unen ambos al receptor de PAC1 (PAC1R), al receptor de v Pa C1 (VPAC1R) y al receptor de VPAC2 (VPAC2R), pero difieren en sus afinidades por sus respectivos receptores. PAC1R se une a PACAP con alta selectividad, con una afinidad por PACAP que es más de 1000 veces mayor que su afinidad por VIP. Por otro lado, VPAC1R y VPAC2R, tienen ambos igual afinidad por PACAP y VIP. El PACAP tiene una variedad de efectos fisiológicos, siendo conocido que tiene actividad fisiológica como sustancia neuroprotectora, factor inmunosupresor, factor vasodilatador, secretagogo exocrino (PTL 3) y factor promotor de la formación de neuritas (PTL 4).

[0008] El fármaco médico se está desarrollando utilizando las diversas actividades fisiológicas de PACAP. Sin embargo, los péptidos relativamente cortos tales como PACAP son inestables en solución acuosa y están asociados con el problema de una corta semivida debido a la falta de resistencia a la proteasa.

[0009] [Lista de citas]

[0010] [Bibliografía de patentes]

[0011] [PTL 1] Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 2014-510101

[0012] [PTL 2] Publicación de Patente Japonesa No Examinada Núm. 2012-232952

[0013] [PTL 3] Publicación de Patente Japonesa No Examinada Núm. 2009-269818

[0014] [PTL 4] Publicación de patente internacional Núm. 2005/102375

[0015] [Bibliografía no relacionada con patentes]

[0016] [BNRP 1] S. Bourgault (2009) Current Medicinal Chemistry 16, 4462-4480

[0017] [BNRP 2] Louise Dickson (2009) Pharmacology & Therapeutics, 12, 294-316

[0018] [BNRP 3] Alessantro Lambiase (2012) Investigative Ophthalmology & Visual Science, vol. 53, No. 13, p.8280-8287

[0019] Compendio de la invención

[0020] [Problema técnico]

[0021] Es un objeto de la presente invención proporcionar un péptido como el reivindicado para prevenir o tratar la queratitis neurotrófica.

[0022] [Solución al problema]

[0023] Los autores de la presente invención han ideado esta invención tras encontrar que el péptido PACAP o su péptido estabilizado muestran un efecto inhibidor contra el daño corneal en un modelo de queratitis neurotrófica, y promueve la elongación de axón nervioso en un modelo de células nerviosas cultivadas. Se encontró adicionalmente que la estabilidad en soluciones acuosas puede aumentarse drásticamente reemplazando los grupos carboxilo del ácido aspártico en el péptido PACAP por tetrazol, convirtiéndolo en un péptido estabilizado. La presente invención se expone en las reivindicaciones.

[0024] [Efectos ventajosos de la invención]

[0025] Según la invención, el PACAP estabilizado se puede utilizar para prevenir o tratar la queratitis neurotrófica, o para promover la elongación de los axones nerviosos.

[0026] Breve descripción de los dibujos

[0027] La Fig. 1 muestra los efectos inductores de AMPc de diferentes péptidos (péptidos 1, 2 y 6 a 9) en una línea celular de alta expresión de PAC1R.

[0028] La Fig. 2 muestra los efectos inductores de AMPc de diferentes péptidos (péptidos 1, 2 y 6 a 9) en una línea celular de alta expresión de VPAC1R.

[0029] La Fig. 3 muestra los efectos promotores de la secreción lagrimal de diferentes péptidos (péptido 1 y péptido 9) en un modelo de rata de queratitis neurotrófica.

[0030] La Fig.4 muestra los cambios en las puntuaciones de queratitis puntiforme superficial (QPS) por diferentes péptidos (péptido 1 y péptido 9) en un modelo de rata de queratitis neurotrófica.

[0031] La Fig. 5 muestra la elongación axonal de nervios trigéminos cultivados mediante diferentes péptidos.

[0032] Descripción de realizaciones

[0033] La presente invención se refiere a un péptido PACAP estabilizado como se reivindica para el tratamiento o prevención de queratitis neurotrófica. Según otro aspecto, la invención se refiere a un método para promover la elongación de axón nerviosoin vitrocomo se reivindica, que comprende la aplicación de un péptido PACAP estabilizado. Un péptido de PACAP estabilizado es un péptido que tiene modificación de aminoácidos para aumentar la estabilidad, mientras mantiene la actividad fisiológica de PACAP. Específicamente, el péptido PACAP estabilizado que consiste en la secuencia de aminoácidos del péptido PACAP en donde los grupos carboxilo de los restos de ácido aspártico en la posición 3 y/o la posición 8 se han reemplazado por tetrazol, o su secuencia parcialmente modificada. El péptido PACAP estabilizado de la invención tiene afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R que es equivalente a la de PACAP. Afinidad equivalente significa que los valores de CE50 del péptido para cada uno de los receptores están en un rango de 10 veces, preferiblemente en un rango de 5 veces y más preferiblemente en un rango de 3 veces, los de PACAP. El PACAP puede ser PACAP38 que consiste en 38 restos, o PACAP27 que consiste en 27 restos. PACAP38 y PACAP27 tienen las siguientes secuencias:

[0034] [Fórmula Química 1]

[0035] PACAP38: HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1) PACAP27: HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2)

[0036] Según la invención, una "secuencia que está parcialmente modificada" es una secuencia en donde uno o más aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, eliminado o añadido. Más preferiblemente, una "secuencia que está parcialmente modificada" es una secuencia en donde uno o varios aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, eliminado o añadido.

[0037] La sustitución de aminoácidos puede estar en cualquier posición siempre que la afinidad del péptido que consiste en la secuencia que está parcialmente modificada, por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, no cambie. Desde el punto de vista del mantenimiento de la afinidad, la sustitución de aminoácidos en el péptido que consiste en la secuencia que está parcialmente modificada puede ser una sustitución de aminoácidos en cualquier posición entre la posición 2, la posición 9, la posición 11, la posición 15 a la posición 17, la posición 19 a la posición 21 y la posición 27 de PACAP27. Según un aspecto particularmente preferido, se pueden sustituir los aminoácidos en las posiciones X<1>en X<10>en la secuencia siguiente:

[0038] H-X<1>-D-G-I-F-T-D-X<2>-Y-X<3>-R-Y-R-X<4>-X<5>-X<6>-A-X<7>-X<8>-X<9>-Y-L-A-A-V-X<10>(SEQ ID NO: 3).

[0039] La sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de uno o más aminoácidos, pero desde el punto de vista de la actividad, se puede sustituir cualquier número de 1 a 10, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, aminoácidos. Se prefiere particularmente una sustitución de 1 a 4 aminoácidos, se prefiere más una sustitución de 3 aminoácidos, se prefiere incluso más una sustitución de dos aminoácidos y lo más preferido es una sustitución de un aminoácido.

[0040] Una deleción de aminoácido puede estar en cualquier posición siempre que la afinidad del péptido que consiste en la secuencia que está parcialmente modificada, por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, no cambie. El número de aminoácidos suprimidos se selecciona como cualquier número de 1 a 10, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Se prefiere particularmente una deleción de uno o dos aminoácidos desde el punto de vista de la no alteración de la afinidad. La deleción de aminoácidos puede ser una deleción en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la secuencia original, o una deleción dentro de la secuencia. Puesto que PACAP27 y PACAP38 tienen afinidad de unión equivalente por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, se cree que la deleción de los aminoácidos presentes en el extremo C-terminal de PACAP38 tiene poco efecto sobre la afinidad.

[0041] Una adición de aminoácidos puede estar en cualquier posición siempre que la afinidad del péptido que consiste en la secuencia que está parcialmente modificada, por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, no cambie. El número de aminoácidos añadidos se selecciona como cualquier número de 1 a 10, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Los aminoácidos se pueden añadir al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de la secuencia original, o se pueden añadir dentro de la secuencia. Puesto que PACAP27 y PACAP38 tienen afinidad de unión equivalente por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, se cree que la adición de cualquier aminoácido al extremo C-terminal de PACAP27 tiene poco efecto sobre la afinidad.

[0042] Un aspecto de la invención se refiere a un péptido como el reivindicado que consiste en la secuencia representada por: H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10 (SEQIDNO: 3){donde X<1>es un aminoácido neutro, X<2>es un aminoácido neutro, X<3>es un aminoácido neutro, X<4>es un aminoácido alcalino, X<5>es un aminoácido neutro o, egTz, X<6>es un aminoácido no polar, X<7>es un aminoácido no polar, X<8>es un aminoácido alcalino, X<9>es un aminoácido alcalino y X<10>es un aminoácido no polar}, con los grupos carboxilo de los restos de ácido aspártico en la posición 3 y/o la posición 8 reemplazados por tetrazol, o su secuencia modificada, y que tiene afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R.

[0043] Los aminoácidos representados por X<1>a X<10>pueden estar sustituidos conservativamente por aminoácidos con los mismos atributos. Como ejemplos, las sustituciones conservativas son sustituciones de aminoácidos dentro de los siguientes grupos:

[0044] 1. aminoácidos no polares Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle, Ala

[0045] 2. aminoácidos neutros: Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Gly

[0046] 3. aminoácidos básicos: Lys, Arg, His

[0047] 4. aminoácidos ácidos: Asp, Glu

[0048] Los aminoácidos neutros para X<1>, X<2>y X<3>son Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln o Gly, y más preferiblemente Ala o Ser.

[0049] Los aminoácidos alcalinos para X<4>, X<s>y X<9>son Lys, Arg o His, y más preferiblemente Lys o Arg.

[0050] Un aminoácido neutro para X<5>es Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln o Gly, y más preferiblemente Ala o Gln. X<5>puede ser también un aminoácido que tiene la amida de glutamina reemplazada por tetrazol (egTz).

[0051] Un aminoácido no polar para X<6>es Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle o Ala, y más preferiblemente Met, Nle, Leu o Ala.

[0052] Un aminoácido no polar para X<7>es Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle o Ala, y más preferiblemente Val o Ala.

[0053] Un aminoácido no polar para X<10>es Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle o Ala, y más preferiblemente Leu o Ala.

[0054] Según la invención, una "secuencia modificada" es una secuencia en donde uno o más aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, eliminado o añadido. Más preferiblemente, una "secuencia modificada" es una secuencia en donde uno o varios aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, eliminado o añadido.

[0055] Una secuencia modificada de la secuencia enumerada como SEQ ID NO: 3 en donde los grupos carboxilo de los restos de ácido aspártico en la posición 3 y/o la posición 8 se han reemplazado por tetrazol, es preferiblemente la secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3 con una deleción o adición de uno o más aminoácidos. Más preferiblemente, se pueden eliminar uno o dos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3, o se puede añadir la siguiente secuencia C-terminal a la secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3.

[0057] Aunque los autores de la presente invención no desean limitarse a ninguna teoría particular, pero dado que PACAP27 y PACAP38 tienen afinidad de unión equivalente por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, la adición de cualquier aminoácido en el extremo C-terminal de PACAP27 no afecta a la afinidad de unión por PAC1R. Por lo tanto, el PACAP27 estabilizado de la invención puede incluir adicionalmente una secuencia añadida C-terminal, o puede carecer de una secuencia añadida C-terminal. Una secuencia añadida C-terminal es una secuencia que comprende de 1 a 11 aminoácidos arbitrarios. La secuencia añadida C-terminal corresponde preferiblemente a los aminoácidos en la posición 28 a la posición 38 de PACAP38. Como secuencias C-terminales se mencionan, por lo tanto, las siguientes secuencias:

[0059] GKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 37);

[0060] GKRYKQRVKN (SEQ ID NO 38);

[0061] GKRYKQRVK (SEQ ID NO 39);

[0062] GKRYKQRV (SEQ ID NO: 40);

[0063] GKRYKQR (SEQ ID NO: 41);

[0064] GKRYKQ (SEQ ID NO: 42);

[0065] GKRYK (SEQ ID NO: 43);

[0066] GKRY (SEQ ID NO: 44)

[0067] GKR;

[0068] GRR;

[0069] GK;

[0070] GR; y

[0071] G.

[0073] El péptido de la invención puede utilizar la forma D o la forma L de aminoácidos, o las formas racémicas de aminoácidos, siempre que no se pierda afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R. El péptido de la invención también puede comprender aminoácidos no naturales tales como ácido 2-aminoisobutírico o ácido L-2-aminobutírico, y puede incluir derivados con modificación opcional de grupos amino N-terminales, grupos carboxilo C-terminales o grupos funcionales de cadena lateral de aminoácidos. Los ejemplos de modificaciones incluyen la adición de grupos protectores en el grupo amino (por ejemplo, acilación (formilación o acetilación), mesilación, ureación, carbamación, protección con Boc o protección con Fmoc) y esterificación (tal como etilación) del grupo carboxilo. También puede incluir modificación que puede tener lugar comúnmente en el organismo, tal como fosforilación, amidación, metilación, esterificación y acetilación, así como modificación que tiene lugar durante el proceso de síntesis o que se utiliza para facilitar la purificación, tal como biotinilación. También se puede llevar a cabo una modificación tal como PEGilación para prolongar la semividain vivodel péptido. Desde el punto de vista del aumento de la estabilidad, en particular, el grupo amino libre del aminoácido N-terminal puede protegerse con un grupo protector (tal como un grupo acilo). Por ejemplo, el grupo amino libre del aminoácido N-terminal puede estar acetilado o mesilado. En un péptido que comprende una secuencia en donde los grupos carboxilo de los restos de ácido aspártico en la posición 3 y/o la posición 8 de PACAP se reemplazan por tetrazol, la estabilidad se puede aumentar adicionalmente mediante acetilación o mesilación del extremo N-terminal. El extremo C puede ser un grupo carboxilo (-COOH), carboxilato (-COO-), amida (-CONH<2>-) o éster (-COOR), y también puede tener una adición de cadena de azúcar (véase el documento WO2017/027848, por ejemplo).

[0075] Según un aspecto específico, se describen péptidos 3 a 34 que tienen las secuencias enumeradas en la Tabla 1 a continuación, o sus secuencias modificadas:

[0076] [Tabla 1]

[0077] Tabla 1

[0078]

[0080] Un aminoácido en donde el grupo carboxilo del ácido aspártico se ha reemplazado por tetrazol tiene la siguiente estructura:

[0081]

[0084] A lo largo de la presente memoria descriptiva, "Tz" se utilizará como su símbolo en las secuencias.

[0086] Un aminoácido en donde la amida de glutamina se ha reemplazado por tetrazol tiene la siguiente estructura:

[0087] ¡Fórmula Química 3]

[0089]

[0092] A lo largo de la presente memoria descriptiva, "egTz" se utilizará como su símbolo en las secuencias.

[0094] El péptido de la invención se puede producir mediante cualquier método de producción. Por ejemplo, se puede producir mediante síntesis en fase sólida o síntesis en fase líquida utilizando el método Boc o Fmoc. También se puede producir mediante otros métodos, utilizando un método para transferir ácido nucleico que codifica el péptido de la invención a un gen, introducir el gen en células hospedadoras y sintetizar el péptido en las células anfitrionas. La purificación después de la expresión se puede realizar fácilmente mediante un diseño en donde se añade un péptido marcador tal como un marcador de polihistidina en los extremos del péptido.

[0096] El péptido de la invención también incluye sus sales médicamente aceptables. Las sales médicamente aceptables incluyen sales de ácidos inorgánicos (por ejemplo, hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos y fosfatos), sales de ácidos orgánicos (por ejemplo, metanosulfonatos, bencenosulfonatos, p-toluenosulfonatos, formiatos, acetatos, trifluoroacetatos, oxalatos, citratos, malonatos, fumaratos, maleatos, tartratos, succinatos y malatos), o sales con bases (por ejemplo, sales de amonio, sales de metilpiridinio y sales de acetilpiridinio). El péptido de la invención también incluye hidratos o solvatos.

[0098] La histidina mesilada en el extremo N-terminal se puede producir mediante el método ilustrado por la fórmula de reacción 1, o un método similar.

[0100]

[0103] {en donde Trt representa un grupo tritilo y Me representa un grupo metilo.}

[0105] En el método de la fórmula de reacción 1, un compuesto representado por el compuesto de fórmula general (I) se puede hacer reaccionar con cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base para producir el compuesto (II), después de lo cual el compuesto (II) se puede someter a hidrólisis utilizando una base en metanol, para producir el compuesto (III).

[0107] Para la producción del compuesto (II), la base se utiliza de 0,2 a 5 equivalentes y preferiblemente de 1 a 3 equivalentes con respecto al compuesto (I). La base utilizada puede ser trietilamina, N,N-diisopropiletilamina, piridina o 4-dimetilaminopiridina, prefiriéndose trietilamina. Se utilizan de 0,1 a 5 equivalentes de cloruro de metanosulfonilo y preferiblemente de 1 a 2 equivalentes. El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser tetrahidrofurano, diclorometano o tolueno, por ejemplo, prefiriéndose diclorometano. La temperatura de reacción será usualmente de 1°C a 30°C, y preferiblemente de 15°C a 25°C, mientras que el tiempo de reacción será usualmente de 0,5 horas a 12 horas, y preferiblemente de 0,5 horas a 2 horas.

[0109] Para la producción del compuesto (III), se utilizan de 0,1 a 10 equivalentes de la base y preferiblemente de 1 a 3 equivalentes con respecto al compuesto (II). Las bases incluyen hidróxido de litio, hidróxido sódico e hidróxido potásico, prefiriéndose el hidróxido potásico. El disolvente puede ser una mezcla disolvente de un disolvente orgánico (tal como metanol, etanol, isopropanol, acetonitrilo, 1,4-dioxano o tetrahidrofurano) y agua, y es preferiblemente una mezcla disolvente de metanol y agua. El tiempo de reacción diferirá dependiendo de los reactivos o el disolvente utilizados, pero usualmente será de 0,5 horas a 12 horas y preferiblemente de 0,5 horas a 3 horas. La temperatura de reacción también diferirá dependiendo de los reactivos o el disolvente, pero usualmente será de 0°C a 100°C y preferiblemente de 60°C a 100°C.

[0111] El péptido de la invención puede presentar una actividad fisiológica similar a la de PACAP, uniéndose a PAC1 R, VPAC1R y/o VPAC2R. Sin limitarse a ninguna teoría particular, se cree que la utilidad para prevenir o tratar la queratitis neurotrófica puede estar mediada por la unión a estos receptores. Más específicamente, el péptido de la invención puede inhibir la reducción del volumen del fluido lagrimal causada por la queratitis neurotrófica, y puede inhibir la queratitis puntiforme superficial. El péptido de la invención también puede promover la elongación de axón nervioso. El efecto de favorecimiento de la elongación axonal por el péptido de la invención permite tratar el daño del nervio trigémino o regenerar el nervio trigémino. El péptido de la invención también puede tratar o prevenir la queratitis neurotrófica mediante esta actividad. El péptido de la invención puede promover adicionalmente la elongación de axón nerviosoin vivoein vitro.Cuando se va a promover la elongación de axónin vitro,Las neuronas se cultivan en medio que contiene el péptido de la invención. El método de cultivo neuronal se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento que se conoce en el campo técnico, utilizando un medio de cultivo neuronal que se conoce ampliamente en el campo técnico.

[0113] La presente invención se refiere a un péptido como el reivindicado que se puede utilizar en una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de queratitis neurotrófica, que comprende una dosis terapéuticamente eficaz del péptido mencionado anteriormente. La composición farmacéutica puede tratar la queratitis neurotrófica mediante la acción fisiológica de PACAP, mediante la administración a un paciente, o puede prevenir la queratitis neurotrófica mediante administración a un paciente con el potencial de desarrollar la enfermedad. En este caso, "tratamiento" significa que después de la aparición de un trastorno o enfermedad, se previene el empeoramiento de la afección, se retrasa su progresión, o se mantiene, alivia o invierte la afección actual, mientras que "prevención" significa que la aparición de un trastorno o enfermedad se previene antes de la aparición. Un paciente con potencial para desarrollar queratitis neurotrófica puede ser, por ejemplo, un paciente que padece infección vírica por herpes corneal, lesión ocular, cirugía corneal o diabetes.

[0115] El péptido de la invención, o la composición farmacéutica que comprende el péptido, se pueden administrar a un paciente que se vaya a tratar mediante administración parenteral o administración oral. La administración oral puede ser administración sublingual, intraoral u oral. Los ejemplos de administración parenteral incluyen la administración por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, local, intraperitoneal, intramuscular, nasal, transdérmica, transmucosa, intrameníngea, perrectal, intramuscular, intracerebral, intrameníngea, subaracnoidea, intradural, epidural, colirio, gotas óticas, gotas nasales, o intraocular. Las vías intraoculares incluyen, más específicamente, las vías subconjuntival, sub-tenon e intravítrea. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de la invención se puede preparar en una forma de dosificación apropiada para la vía de administración, y puede ser un colirio, inyección, fármaco en polvo, preparación de infusión, gránulos, comprimidos o supositorios, por ejemplo, pero para administración parenteral es preferiblemente un colirio, inyectable, preparación de infusión o un fármaco en polvo para preparación antes de su uso. Una formulación para administración intraocular puede ser una inyección intravítrea, inyección subconjuntival o inyección sub-tenon, por ejemplo. Tales formulaciones también pueden contener diversos adyuvantes farmacéuticamente aceptables, es decir, aditivos tales como portadores u otros agentes auxiliares, que incluyen estabilizantes, agentes antisépticos, agentes calmantes y emulsionantes. También se pueden utilizar combinadas con otros fármacos que tienen efectos neuroprotectores, efectos supresores de la inflamación o efectos de secreción de glándula exocrina.

[0117] Se pretende que los ejemplos de la invención descritos a continuación sirvan simplemente como ilustración y no limiten el alcance técnico de la invención. El alcance técnico de la invención está limitado únicamente por las Reivindicaciones.

[0119] Ejemplos

[0121] Ejemplo 1: Síntesis de péptidos 1

[0123] Síntesis de Ms-His(Trt)-OMe

[0124] [Fórmula Química 5]

[0126]

[0129] Después de añadir cloruro de metanosulfonilo (314,7 mg, 2,7 mmoles) disuelto en N,N-diisopropiletilamina (1,0 ml, 5,7 mmoles) y diclorometano (2,0 ml), a una solución de hidrocloruro de éster metílico de N-im-tritil-L-histidina (2,02 g, 4,5 mmoles) en diclorometano (40 ml) y de reaccionar a 25°C durante 2 horas y 40 minutos, se le añadió adicionalmente cloruro de metanosulfonilo (174,7 mg, 1,5 mmoles) disuelto en diclorometano (1,0 ml) y la reacción se llevó a cabo a 25°C durante 1 hora. Después se añadió una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico para detener la reacción, la extracción se realizó con acetato de etilo, la capa orgánica obtenida se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10%, una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y salmuera, la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. Dado que la reacción no continuó hasta completarse, se añadió diclorometano (15 ml) al residuo obtenido, y después se añadió una solución de trietilamina (1,0 ml, 7,2 mmoles) y cloruro de metanosulfonilo (326,8 mg, 2,9 mmoles) en diclorometano (1,0 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después se añadió una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico para detener la reacción, la extracción se realizó con acetato de etilo, la capa orgánica obtenida se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10%, una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y salmuera, la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida para obtener un sólido de color amarillo pálido (2,35 g, >100%). El sólido obtenido se utilizó en la siguiente reacción sin purificación.

[0131] RMN 1H (400 MHz, CDCla) 57,38 (1H, d, J = 1,2 Hz), 7,34-7,31 (9H, m), 7,12-7,08 (6H, m), 6,57 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,30 (1H, d, J = 8,4 Hz), 4,40 (1H, dt, J = 8,4, 5,2 Hz), 3,65 (3H, s), 3,05 (2H, d, J = 5,2 Hz), 2,97 (3H, s).

[0132] Síntesis de Ms-His(Trt)-OH

[0134]

[0137] Se añadió una solución acuosa 1 M de hidróxido potásico (9,0 ml, 9,0 mmoles) a una solución de metanol (15 ml) que contenía Ms-His-OMe (2,21 g, 4,5 mmoles) y la mezcla se calentó a reflujo durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se aciduló a pH 5 con una solución acuosa de ácido cítrico al 10%, y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio y la solución se eliminó mediante destilación a presión reducida, después de lo cual se añadieron diclorometano y hexano al residuo para precipitar un sólido de color blanco, que se filtró (2,32 g, >100%).

[0139] RMN<1>H (400 MHz, CDCl<a>) 57,84 (1H, s), 7,31-7,33 (9H, m), 7,12-7,09 (6H, m), 6,82 (1H, s), 4,13 (1H, m), 3,34 (1H, dd, J = 14,8, 3,6 Hz), 3,17 (1H, dd, J = 14,8, 6,8 Hz), 2,90 (3H, s).

[0141] Ejemplo 2: Síntesis de péptidos 2

[0143] El péptido utilizado en el ensayo se sintetizó utilizando un sintetizador de péptidos (modelo: PSSM-8 de Shimadzu Corp.), utilizando síntesis en fase sólida mediante el método Fmoc. Los aminoácidos no naturales utilizados en la síntesis en fase sólida fueron Fmoc-TZ-OH, Fmoc-TZ (trt)-OH y Fmoc-eg TZ (trt)-OH, adquiridos de Astatech Inc. Se sintetizaron los péptidos 1 a 34 que tenían las siguientes secuencias, y los pesos moleculares de los péptidos sintéticos se sometieron a espectrometría de masas (MALDI TOF). Como se muestra en la Tabla 2, todos los valores medidos coincidían con valores teóricos.

[0144] [Tabla 2]

[0145] Tabla 2

[0146]

[0147]

[0150] Ejemplo 3: Prueba de estabilidad peptídica 1

[0152] [Preparación de la muestra de medición]

[0154] Los péptidos 1 y 3 a 5 sintetizados en el Ejemplo 2 se pesaron y disolvieron en tampón fosfato (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. Las soluciones peptídicas 1,0 mM se diluyeron después con tampón fosfato hasta 100 pM. Después de filtrar con Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 pm), cada producto filtrado se dispensó en un vial de LC (vial Waters Desactived Qsert). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante un mes o 2 meses en un baño termostático a 40°C para obtener muestras almacenadas. Se utilizó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra patrón (muestra inicial). La muestra patrón y las muestras almacenadas se almacenaron a -30°C hasta el análisis de las muestras.

[0156] [Permeabilidad a la humedad]

[0158] Utilizando el peso total de la solución peptídica acuosa y el recipiente de almacenamiento como el peso de la muestra, se registraron las mediciones como los pesos de la muestra antes del almacenamiento y los pesos de la muestra después del almacenamiento en diferentes condiciones de almacenamiento. También se midió el peso en vacío del recipiente de almacenamiento, y se determinó la permeabilidad a la humedad mediante la siguiente fórmula.

[0160] [Fórmula Matemática 1]

[0161] Peso del espécimen antesPeso del espécimen después

[0162] Permeabilidad a la humedad del almacenamiento {g) del almacenamente {g>

[0163] dlel recipiente {%) Res® del espécimen entes ----------------------------------------11--------------? íOO

[0164] Pese del recipiente de ¡Jmacenannento ¡g)

[0165] del almacenamiento (g)

[0167] Después de agitar la muestra patrón y las muestras almacenadas con un mezclador vorticial, cada solución peptídica se transfirió a un vial de HPLC (vial Deactivated Qsert de Waters Co.). Se realizó HPLC de fase inversa (sistema de HPLC: Prominence de Shimadzu Corp.) en las condiciones mostradas en la Tabla 3 a continuación para el análisis de las soluciones peptídicas, y se obtuvieron cromatogramas.

[0168] [Condiciones de análisis de HPLC 1]

[0169] Columna: XSelect CSH C18 de Waters Co., 5 gm, 4,6 x 250 mm

[0170] Columna de guarda: XSeasy CSH C18 de Waters Co., 5 |um, cartucho de guarda de 4,6 x 20 mm Longitud de onda de detección: 220 nm

[0171] Fase móvil A: solución acuosa de ácido fórmico al 0,1%

[0172] Fase móvil B: solución de formiato en acetonitrilo al 0,1%

[0173] Tiempo de medición: 30 minutos

[0174] Medición de la tasa de inyección de la muestra: 50 gl

[0175] Caudal: 1,0 ml/min

[0176] Enfriador de muestras: 4°C

[0177] Temperatura de la columna: 40°C

[0178] Suministro de fase móvil: La razón de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 3 para el control del gradiente de concentración lineal.

[0179] [Tabla 3]

[0180] Tabla 3

[0182]

[0185] Se calculó el valor del área del pico para el péptido en el cromatograma, y se calculó la tasa restante (tasa restante antes de la corrección para agua) utilizando la fórmula (2). La tasa restante después de la corrección para agua también se calculó a partir de la tasa restante antes de la corrección para agua utilizando la fórmula (3), teniendo en cuenta la permeabilidad a la humedad del recipiente.

[0186] [Fórmula Matemática 2]

[0187] Área del pico para el péptido de la muestra almacenada

[0188] Tasa restante antes de la corrección para agua (%) = ----------------------------------------------------------------------------- x 100 (2)

[0189] Área del pico del péptido de la muestra patrón

[0190] [Fórmula Matemática 3]

[0191] Tasa restante después de

[0192] Tasa restante después la corrección para agua (%) x (100 - permeabilidad al agua del recipiente (%)) de la corrección para agua (%) = --------------------------------------------------------------------------------------------------------- (3)

[0194] 100

[0195] La Tabla 4 muestra la tasa restante después de la corrección para agua para cada péptido entre las muestras almacenadas.

[0196] [Tabla 4]

[0197] Tabla 4

[0199]

[0201] El péptido 1 (PACAP) tenía baja estabilidad, a 37,4% después del almacenamiento a 40°C durante un mes y 21,3% después del almacenamiento a 40°C durante 2 meses. El péptido 3, que sólo tenía el grupo carboxilo de la cadena lateral de ácido aspártico en el 3er resto del péptido 1 reemplazado por tetrazol, mostró una estabilidad mayor que el péptido 1, mientras que el péptido 4, que sólo tenía el grupo carboxilo de la cadena lateral de ácido aspártico en el 8° resto reemplazado por tetrazol, también tenía un incremento de estabilidad en comparación con el péptido 1. Sin embargo, el péptido 5, que tenía los grupos carboxilo de las cadenas laterales de ácido aspártico de los restos 3° y 8° del péptido 1 reemplazados por tetrazol, tenía una estabilidad incrementada adicionalmente sobre el péptido 3 y el péptido 4, lo que demuestra que para un incremento de estabilidad de PACAP es más eficaz tener dos sustituciones de tetrazol que una única sustitución de tetrazol.

[0202] Ejemplo 4: Prueba de estabilidad del péptido 2

[0203] Los péptidos 1, 2 y 6 a 9 sintetizados en el Ejemplo 2 se pesaron y disolvieron en tampón Tris (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. Cada solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 pm). El producto filtrado se diluyó hasta 100 pM con tampón Tris (pH 7,0) y se dispensó a un tubo (Protein LoBind Tube de Eppendorf Co.). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante 1 semana o 2 semanas en un baño termostático a 60°C para obtener muestras almacenadas. Se utilizó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra patrón (muestra inicial). La muestra patrón y las muestras almacenadas se almacenaron a -30°C hasta el análisis de la muestra.

[0204] Cada muestra almacenada se midió en las siguientes condiciones de análisis de HPLC 2, y la tasa restante después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas se calculó de la misma manera que en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

[0205] [Condiciones de análisis de HPLC 2]

[0206] Columna: XSelect CSH C18 de Waters Co., 5 pm, 4,6 x 250 mm

[0207] Columna de guarda: XSeasy CSH C18 de Waters Co., 5 pm, cartucho de guarda de 4,6 x 20 mm Longitud de onda de detección: 220 nm

[0208] Fase móvil A: solución acuosa de ácido fórmico al 0,1%

[0209] Fase móvil B: solución de formiato de acetonitrilo al 0,1%

[0210] Tiempo de medición: 20 minutos

[0211] Medición de la tasa de inyección de la muestra: 50 pl

[0212] Caudal: 1,0 ml/min

[0213] Temperatura de la columna: 40°C

[0214] Enfriador de muestras: 25°C

[0215] Suministro de fase móvil: La razón de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 5 para el control del gradiente de concentración lineal.

[0216] [Tabla 5]

[0218] Tabla 5

[0220]

[0223] [Tabla 6]

[0225] Tabla 6

[0227]

[0230] El péptido 1 (PACAP) tenía muy poca estabilidad, a 26,6% después del almacenamiento durante 1 semana a 60°C y 15,8% después del almacenamiento durante 2 semanas, mientras que el péptido 2, que tenía el extremo N-terminal de PACAP acetilado, solo mostró estabilidad equivalente. Los péptidos 6 y 7, por otro lado, que tenían los grupos carboxilo de los ácidos aspárticos en la posición 3 y la posición 8 reemplazados por tetrazol (el péptido 6 que también tenía la metionina en la posición 17 reemplazada por norleucina (indicada como "Nl" en la secuencia) y el péptido 7 que además tenía la metionina en la posición 17 reemplazada por leucina), tuvieron un aumento drástico de estabilidad, a 91,3% y 91,7% después del almacenamiento durante 1 semana a 60°C, y 82,4% y 84,8% después del almacenamiento durante 2 semanas. Los péptidos 8 y 9, que tenían los extremos N-terminales de los péptidos 6 y 7 acetilados, tuvieron una estabilidad aún mayor, a 98,1% y 98,4% después del almacenamiento durante 1 semana a 60°C, y a 92,9% y 92,8% después del almacenamiento durante 2 semanas. Una prueba acelerada durante 1 semana y 2 semanas a 60°C corresponde respectivamente a aproximadamente 1 año y 2 años a temperatura ambiente (25°C). Por lo tanto, se espera que los péptidos 8 y 9 sean estables (tasa restante de 90% o superior) durante 2 años a temperatura ambiente.

[0232] Ejemplo 5: Prueba de estabilidad peptídica 3

[0234] Los péptidos 12 a 25, 27 y 28 sintetizados en el Ejemplo 2 se pesaron y disolvieron en tampón Tris (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. Cada solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 pm). El producto filtrado se diluyó hasta 100 pM con tampón Tris (pH 7,0) y se dispensó en un tubo (Protein LoBind Tube de Eppendorf Co.). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante una semana o 2 semanas en un baño termostático a 60°C para obtener muestras almacenadas. Se utilizó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra patrón (muestra inicial). La muestra patrón y las muestras almacenadas se almacenaron a -30°C hasta el análisis de la muestra.

[0235] La tasa restante después de la corrección para agua para cada péptido entre las muestras almacenadas se calculó de la misma manera que en el Ejemplo 4, y los resultados se muestran en la Tabla 7.

[0237] [Tabla 7]

[0239] Tabla 7

[0241]

[0242]

[0245] El péptido 12 (un péptido que tiene el grupo acetilo N-terminal del péptido 9 reemplazado por un grupo mesilo) mostró una estabilidad similar al péptido 9, y por lo tanto se mostró una alta estabilidad incluso con la sustitución del grupo mesilo N-terminal. El péptido 13 (un péptido que tiene la cadena lateral de glutamina del 16° resto del péptido 9 reemplazada por tetrazol) mostró una estabilidad similar al péptido 9, lo que indica que se mantiene una alta estabilidad incluso con un péptido que tiene la cadena lateral de glutamina reemplazada por tetrazol. También se mantuvo una alta estabilidad con los péptidos 14 a 25, el péptido 27 y el péptido 28, que tenían alanina o arginina sustituyendo o añadidos en restos arbitrarios del péptido 9.

[0247] Ejemplo 5-2: Prueba de estabilidad peptídica 3

[0249] Los péptidos 29 a 34 sintetizados en el Ejemplo 2 se pesaron y disolvieron en tampón Tris (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. Cada solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 gm). El producto filtrado se diluyó hasta 100 pM con tampón Tris (pH 7,0) y se dispensó en un tubo (Protein LoBind Tube de Eppendorf Co.). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante 2 semanas en un baño termostático a 60°C para obtener muestras almacenadas. Se utilizó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra patrón (muestra inicial). La muestra patrón y las muestras almacenadas se almacenaron a -30°C hasta el análisis de la muestra.

[0251] La tasa restante después de la corrección para agua para cada péptido entre las muestras almacenadas se calculó de la misma manera que en el Ejemplo 4, y los resultados se muestran en la Tabla 7-2.

[0253] [Tabla 7-2]

[0255] Tabla 7-2

[0258]

[0261] El péptido 29 (un péptido que tiene el grupo acetilo N-terminal del péptido 15 reemplazado por un grupo mesilo) mostró una estabilidad similar al péptido 15, y por lo tanto se mostró una alta estabilidad incluso con la sustitución del grupo mesilo N-terminal. El péptido 30 (un péptido que tiene el grupo acetilo N-terminal del péptido 23 reemplazado por un grupo mesilo) mostró una estabilidad similar al péptido 23, y por lo tanto se mostró una alta estabilidad incluso con la sustitución del grupo mesilo N-terminal. También se mantuvo una alta estabilidad con los péptidos 32 a 34, que tenían alanina sustituyendo en restos arbitrarios del péptido 9. El péptido 31 (un péptido que tiene el grupo acetilo N-terminal del péptido 32 reemplazado por un grupo mesilo) mostró una estabilidad similar al péptido 32.

[0262] Ejemplo 6: Ensayo de estabilidad peptídica 4

[0263] Los péptidos 10 y 11 sintetizados en el Ejemplo 2 se pesaron y disolvieron en tampón fosfato (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. Cada solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 pm). Cada producto filtrado se diluyó a 100 pM con tampón fosfato (pH 7,0) y se dispensó en un tubo (Protein LoBind Tube de Eppendorf Co.). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante un mes o 2 meses en un baño termostático a 40°C para obtener muestras almacenadas. Se utilizó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra patrón (muestra inicial). La muestra patrón y las muestras almacenadas se almacenaron a -30°C hasta el análisis de la muestra.

[0264] La tasa restante después de la corrección para agua para cada péptido entre las muestras almacenadas se midió de la misma manera que en el Ejemplo 4, y los resultados se muestran en la Tabla 8.

[0265] [Tabla 8]

[0266] Tabla 8

[0268]

[0271] Los resultados para el péptido 10 que tiene un grupo acetilo N-terminal y el péptido 11 que tiene un grupo N-mesilo demostraron que el péptido se estabiliza en el mismo grado si el sustituyente N-terminal es un grupo acetilo o un grupo N-mesilo.

[0272] Ejemplo 7: Prueba de estabilidad del péptido 5

[0273] El péptido 26 sintetizado en el Ejemplo 2 se pesó y se disolvió en tampón Tris (pH 7,0) para preparar una solución de péptido 1,0 mM. La solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 pm). El producto filtrado se diluyó hasta 100 pM con tampón Tris (pH 7,0) y se dispensó en un tubo (Protein LoBind Tube de Eppendorf Co.). La solución peptídica preparada se incubó durante una semana o 2 semanas en un baño termostático a 60°C para obtener muestras almacenadas. Se utilizó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra patrón (muestra inicial). La muestra patrón y la muestra almacenada se almacenaron a -30°C hasta el análisis de la muestra.

[0274] La muestra almacenada se midió en las siguientes condiciones de análisis de HPLC 3, y la tasa restante después de la corrección para el agua para el péptido en la muestra almacenada se calculó de la misma manera que en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

[0275] [Condiciones de análisis de HPLC 3]

[0276] Columna: XSelect CSH C18 de Waters Co., 5 pm, 4,6 x 250 mm

[0277] Columna de guarda: XSeasy CSH C18 de Waters Co., 5 pm, cartucho de guarda de 4,6 x 20 mm Longitud de onda de detección: 220 nm

[0278] Fase móvil A: solución acuosa de ácido fórmico al 0,1%

[0279] Fase móvil B: solución de formiato de acetonitrilo al 0,1%

[0280] Tiempo de medición: 20 minutos

[0281] Medición de la tasa de inyección de la muestra: 50 pl

[0282] Caudal: 1,0 ml/min

[0283] Temperatura de la columna: 40°C

[0284] Enfriador de muestras: 25°C

[0285] Suministro de fase móvil: La razón de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 9 para el control del gradiente de concentración lineal.

[0286] [Tabla 9]

[0287] Tabla 9

[0289]

[0291] [Tabla 10]

[0292] Tabla 10

[0294]

[0296] El péptido 26 mostró una alta estabilidad similar.

[0297] Ejemplo 7: Ensayo de AMPc de PACAP27 y su péptido estabilizado

[0298] [Cultivo celular]

[0299] Se prepararon células CHO-K1 (línea celular de alta expresión del receptor de PAC1 o VPAC1: adquiridas de DiscoveRx Co.) que se habían tratado con mitomicina y congelado con reactivo de cultivo en placa celular (producto de DiscoveRx) a 1,35 x 104 células/100 |jl/pocillo, y después se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante 18 a 24 horas a 37°C en una incubadora con CO<2>al 5%, adhiriendo las células a la placa.

[0300] [Preparación de reactivo]

[0301] Los polvos de los péptidos 1, 2 y 6 a 9 sintetizados en el Ejemplo 2 se disolvieron en agua hasta 0,1 mM, y después se diluyeron hasta 20 |uM con tampón de ensayo celular (DiscoveRx) (que contenía IBMX 0,5 mM y BSA al 0,001%). A continuación, se preparó una serie de diluciones 1:5 veces con el mismo tampón de ensayo celular y se utilizó en un ensayo.

[0302] [Ensayo de AMPc]

[0303] El ensayo de AMPc se llevó a cabo utilizando un kit Hit Hunter cAMP Assay for Biologics (producto de DiscoveRx, Núm. de Cat. 90-0075LM25), según las instrucciones incluidas en el kit. La solución de anticuerpo para AMPc y las soluciones de los péptidos 1, 2 y 6 a 9 diluidos a diferentes concentraciones se combinaron para preparar mezclas líquidas de péptido-anticuerpo para AMPc. A continuación, se retiró el medio de cultivo de la placa de cultivo celular CHO-K1, se realizó el lavado con PBS y se añadieron las mezclas líquidas de péptido-anticuerpo para AMPc a las células y se incubaron durante 30 minutos en una atmósfera con CO<2>al 5% a 37°C. Después se añadió una solución de detección de trabajo y la placa de cultivo se protegió de la luz con papel de aluminio y se incubó a 25°C durante 1 hora. Después de la incubación, se añadió la Solución A y la placa de cultivo se protegió de la luz con papel de aluminio y a continuación se incubó a 25°C durante 3 horas. Finalmente, se detectó la señal de quimioluminiscencia utilizando un detector GloMax (Promega) en condiciones de luminiscencia y un tiempo de integración de 1 segundo. El valor obtenido para la unidad de luminiscencia relativa (URL) se analizó con GraphPad Prism Ver 6.05 (producto de Graph Pad) y se calculó el valor de CE<50>para cada péptido. Los resultados del valor de CE<50>para determinar el efecto inductor de AMPc de cada péptido con la línea celular de alta expresión de PAC1R o VPAC1R se muestra en la Fig. 1, la Fig. 2 y la Tabla 11.

[0304] [Tabla 11]

[0305] Tabla 11

[0307]

[0309] Los péptidos sintetizados 1,2 y 6 a 9 exhibieron capacidad inductora de AMPc en las células de alta expresión de PAC1R y VPAC1R, y sus valores de CE<50>fueron aproximadamente los mismos que los del péptido nativo (péptido 1: PACAP27).

[0310] Para resumir los resultados en la Tabla 6 y la Tabla 11, los péptidos de la invención (péptidos 6 a 9) tienen una estabilidad extremadamente mejorada en solución acuosa en comparación con PACAP, a la vez que también mantienen una actividad fisiológica equivalente a la de PACAP. En particular, debido a que tienen una vida de almacenamiento superior a 2 años a temperatura ambiente, permiten desarrollar formulaciones líquidas como productos tales como viales, ampollas y gotas oculares.

[0311] Ejemplo 8: Ensayo 2 de AMPc peptídico estabilizado con PACAP27

[0312] [Preparación de reactivo]

[0313] Los polvos de los péptidos 3 a 5 y 10 a 28 sintetizados en el Ejemplo 2 se disolvieron en agua hasta 0,1 mM, y después se diluyeron hasta 20 pM con tampón de ensayo celular (DiscoveRx) (que contenía IBMX 0,5 mM y BSA al 0,001%). Se preparó después una serie de diluciones 1:5 con el mismo tampón de ensayo celular y se utilizó en un ensayo.

[0314] Los valores de CE<50>de los péptidos 3 a 5 y 10 a 28 se calcularon por el mismo método que en el Ejemplo 7. Los resultados del valor de CE<50>para determinar el efecto inductor de AMPc de cada péptido con la línea celular de alta expresión de PAC1 o VPAC1 se muestra en la Tabla 12.

[0315] [Tabla 12]

[0316] Tabla 12

[0318]

[0319]

[0321] Los péptidos de la invención (péptidos 3 a 5 y 10 a 28) tienen una estabilidad extremadamente mejorada en solución acuosa en comparación con PACAP, a la vez que también mantienen una actividad fisiológica equivalente a la de PACAP.

[0322] Ejemplo 8-2: Ensayo 2 de AMPc peptídico estabilizado con PACAP27

[0323] [Preparación de reactivo]

[0324] Los polvos de los péptidos 29 a 34 sintetizados en el Ejemplo 2 se disolvieron cada uno en agua hasta 0,1 mM, y después se diluyeron hasta 20 pM con tampón de ensayo celular (DiscoveRx) (que contenía IBMX 0,5 mM y BSA al 0,001%). Se preparó después una serie de diluciones de 5 veces con el mismo tampón de ensayo celular y se utilizó en un ensayo.

[0325] Los valores de CE<50>de los péptidos 29 a 34 se calcularon mediante el mismo método que en el Ejemplo 7. Los resultados del valor de CE<50>para determinar el efecto inductor de AMPc de cada péptido con la línea celular de alta expresión de PAC1 o VPAC1 se muestra en la Tabla 12-2.

[0326] Tabla 12-2]

[0329]

[0330]

[0332] Los péptidos de la invención (péptidos 29 a 34) tienen una estabilidad extremadamente mejorada en solución acuosa en comparación con PACAP, a la vez que también mantienen una actividad fisiológica equivalente a la de PACAP.

[0333] Ejemplo 9: Evaluación de PACAP27 y su péptido estabilizado en modelo de queratitis neurotrófica

[0334] Se preparó un modelo de rata, mediante administración subcutánea de capsaicina en la región dorsal de ratas, que provocó lesión del nervio corneal y una sensación corneal atenuada, conduciendo también a una disminución del volumen del fluido lagrimal y a una queratitis puntiforme superficial (QPS) (BNRP 3: Investigative Ophthalmology & Visual Science (2012), vol. 53, Núm. 13, pág. 8280-8287). Se administraron a las ratas PACAP27 y sus gotas oftálmicas de péptido estabilizado, y se examinó el efecto inhibidor sobre el daño corneal. El método experimental específico fue el siguiente.

[0335] [Administración de capsaicina]

[0336] Se disolvió capsaicina (producto de Sigma) en PBS que contenía EtOH al 10% y Tween80 al 10%, y se administró por vía subcutánea a la región dorsal de ratas Wistar/ST macho de 4 días de edad a una dosis de 50 mg/kgp.c.

[0337] [Preparación de colorio]

[0339] La base se preparó disolviendo 0,3 g de trishidroximetilaminometano (Nacalai Tesque, Inc.) y 4,4 g de D(-)-manitol (Nacalai Tesque, Inc.) en 100 ml de agua esterilizada, añadiendo HCl 1 N y ajustando el pH a 7. El péptido 1 y el péptido 9 se disolvieron en la base al 0,1%. Cada colirio se almacenó a temperatura ambiente. Cada colirio se administró inicialmente 3 semanas después de la administración de capsaicina, 3 veces al día, en una cantidad de 10 pl para cada ojo.

[0341] [Medición del volumen del fluido lagrimal]

[0343] El volumen de fluido lagrimal se midió insertando ZoneQuick (Ayumi Pharmaceutical Corp.) insertado en los párpados externos inferiores de ratas, y después de 20 segundos, midiendo la longitud de las porciones teñidas de rojo utilizando la escala incluida. El volumen de fluido lagrimal se midió 10 minutos y 5 minutos antes del goteo ocular del peptido, y el valor promedio se registró como el volumen de fluido lagrimal antes del goteo ocular. El volumen de fluido lagrimal 5 minutos después del colirio del peptido se determinó como la diferencia en el volumen de fluido lagrimal en comparación con el de antes de la adición del colirio. Los resultados se muestran en la Fig. 3.

[0344] En las ratas que habían desarrollado queratitis neurotrófica, la adición del colirio del péptido 1 y el péptido 9 produjo efectos de secreción lagrimal similares.

[0346] [Observación de QPS]

[0348] La QPS se evaluó 2 semanas después del inicio de la adición del colirio. Bajo anestesia por inhalación de isoflurano, se añadió gota a gota 1 pL de una solución acuosa de fluoresceína sódica al 1 % disuelta en PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) sobre la superficie del ojo, el ojo se cerró a la fuerza durante 1 minuto y después el exceso de solución de tinción con fluoresceína se lavó con solución salina fisiológica. La superficie del ojo se observó a continuación con un microscopio de lámpara de hendidura, y se evaluó el grado de daño corneal mediante el método de Murakami et al., Atarashii Ganka 21 (1): 87-90 (2004). Específicamente, la córnea se dividió en 3 regiones, parte superior, centro y parte inferior, y se asignó una puntuación a cada región en la siguiente escala, registrándose el valor del total de las puntuaciones de las 3 regiones como la puntuación QPS. <Escala> 0: Sin manchas punteadas, 1: Dispersas (manchas de fluoresceína punteadas separadas), 2: Intermedias (entre 1 y 3), 3: Densas (casi todas las manchas de fluoresceína punteadas adyacentes). Los resultados se muestran en la Fig. 4.

[0350] La adición del colirio del péptido 1 y el péptido 9 mejoró el incremento de puntuación QPS causado por la administración de capsaicina.

[0352] [Medición de la sensación corneal]

[0354] La sensación corneal se mide utilizando un medidor sensorial corneal Cochet-Bonet (Handaya Shoten). La longitud del filamento del medidor sensorial corneal se establece en 60 mm, y el filamento se pone en contacto verticalmente en el centro de la córnea para su estimulación. Se observa la respuesta del párpado, registrando la longitud del filamento al que se obtiene una respuesta. Cuando no se observa respuesta, se realiza la medición mientras se acorta la longitud en 5 mm cada vez. Este procedimiento se repite 3 veces, y el valor medio para las longitudes de filamento obtenidas se registra como el umbral de sensación corneal (CST) para ese individuo.

[0356] La adición del colirio del péptido 1 y el péptido 9 mejora la reducción en la sensación corneal causada por la administración de capsaicina.

[0358] [Tinción del nervio corneal]

[0360] Después de sacrificar las ratas, los bulbos oculares se extraen y sumergen en solución de Zamboni (producto de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y se dejan reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las córneas se recogen de los bulbos oculares y se vuelven a sumergir en solución de Zamboni, y después se dejan reposar durante 45 minutos a temperatura ambiente. La solución se reemplaza a continuación con tampón fosfato 0,1 M que contiene sacarosa al 30%. Después de confirmar el depósito de tejido corneal, se forma una hendidura utilizando tijeras y el tejido se sumerge en tampón fosfato 0,1 M (pH 5,3) que contiene EDTA 0,1% y hialuronidasa de tipo IV-S 0,01% (Sigma) y se deja reposar durante la noche a 37°C. Después de lavar con PBS-T que contiene TritonX-100 al 0,3%, se sumerge en PBS-T que contiene BSA al 1%, para el bloqueo a temperatura ambiente durante 2 horas. El anticuerpo anti-p-tubulina de ratón de unión a Alexa Fluor 488 de clase III (BD Co.) se hace reaccionar con éste durante una noche a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS-T, el tejido corneal se une a portaobjetos de vidrio y se encapsula en medio de montaje de equipo duro Vectashield. La muestra encapsulada se observa con un microscopio confocal y se toma una imagen del plexo subcorneal. La densidad nerviosa de la estructura de remolino en la capa nerviosa se cuantifica realizando un análisis de Sholl utilizando un programa de análisis de imágenes (Image J).

[0361] La adición del colirio del péptido 1 y el péptido 9 mejora la reducción de la densidad nerviosa causada por la administración de capsaicina.

[0362] Ejemplo 10: Evaluación del efecto de elongación axonal de PACAP27 y su péptido estabilizado en células nerviosas trigeminales de rata

[0363] [Aislamiento y cultivo del nervio trigémino]

[0364] Se sacrificaron ratas (Slc: Sprague-Dawley, de 17 días de edad, incluyendo hembras y machos) adquiridas de Japan SLC, Inc. mediante inhalación de gas dióxido de carbono y se recogió el ganglio trigémino. El ganglio trigémino recolectado se lavó con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y a continuación se trató con colagenasa A (Roche) durante 30 minutos a 37°C. Después se utilizó una dispersión de neuronas (Wako) según el protocolo para la dispersión de las células. Se utilizaron solución de eliminación de residuos (Miltenyi biotec) y cuentas de eliminación de Mielina II (Miltenyi biotec) según el protocolo para eliminar los residuos y la mielina. Después de suspender las células nerviosas trigeminales aisladas en solución de cultivo, se sembraron en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos recubierto con polilisina/laminina (Corning) a 2,5 x 103 células/pocillo. La solución de cultivo utilizada fue Neurobasal-A que contenía suplemento B27 (concentración final: 2%) y GlutaMAX (concentración final: 2 mM) y penicilina/estreptomicina (concentración final: 1%). Las condiciones de cultivo fueron una concentración de dióxido de carbono de 5%, una concentración de aire de 95%, una humedad de 100% y una temperatura de 37°C. La siembra fue seguida por el cultivo durante 24 horas, con reemplazo de la solución de cultivo que contenía el péptido 1, el péptido 9, el péptido 12, el péptido 18 o el péptido 31 a una concentración final 1 pM. El control se reemplazó con solución de cultivo libre de péptidos. La sustitución del medio de cultivo fue seguida por un cultivo adicional durante 24 horas.

[0365] 2. Tinción

[0366] El medio de cultivo se reemplazó por solución de cultivo que contenía péptido, y las células nerviosas trigeminales de rata cultivadas durante 24 horas se sumergieron en una solución de paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 20 minutos para la fijación. Las células se lavaron con PBS, y después se añadió albúmina de suero bovino al 2% que contenía TritonX-100 al 0,1% y la reacción se realizó durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, se hizo reaccionar con anticuerpo fosfo-neurofilamento H (Merck, MAB1592-C) reconociendo específicamente neurofilamentos que forman los cuerpos neuronales y neuritas, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la reacción durante 1 hora, se hizo reaccionar un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente (Invitrogen Corp., Núm. A-11031) a temperatura ambiente durante 1 hora para la tinción fluorescente de la muestra, y las células teñidas se observaron bajo un microscopio fluorescente. La imagen de células teñidas se capturó como una imagen del microscopio fluorescente y se cargó en un ordenador.

[0367] 3. Análisis de imágenes

[0368] Con el fin de evaluar el grado de formación de neuritas por las células nerviosas trigeminales de rata, se contaron las células con neuritas que tenían longitudes de al menos dos veces el diámetro del cuerpo celular en la imagen de células teñidas en el ordenador como células formadoras de neuritas, y se calculó el porcentaje (%) de este número de células sobre el recuento celular total (Otori Y, Wei JY, Barnstable CJ. Invest. Oftalmol Vis Sci (1998) 39, 972-981).). Los resultados se muestran en la Fig. 5 (N = 8). La diferencia significativa con respecto al control se determinó mediante la prueba de Dunnett (P <0,001).

[0369] El péptido 1, el péptido 9, el péptido 12, el péptido 18 y el péptido 31 exhibieron efectos promotores de la elongación del axón en las células nerviosas trigeminales.

[0370] Ejemplos de formulación

[0371] Se puede producir un medicamento que contiene un péptido de la invención como ingrediente activo mediante la siguiente formulación. El medicamento de la presente invención se ilustrará ahora adicionalmente mediante ejemplos de formulación, entendiéndose que la invención no se limita a los ejemplos de formulación.

[0372] 1. Cápsulas

[0375]

[0376] Después de mezclar las cantidades totales de (1), (2) y (3) y 1/2 de (4), la mezcla se granula. Se añade la cantidad restante de (4) y se encapsula toda la mezcla en cápsulas de gelatina.

[0377] Comprimidos

[0380]

[0383] Después de mezclar las cantidades totales de (1), (2) y (3), 2/3 de (4) y 1/2 de (5), la mezcla se granula. Las cantidades restantes de (4) y (5) se añaden a los gránulos, que después se moldean a presión en comprimidos.

[0384] 3. Inyección intravítrea

[0385] En 1 ml:

[0388]

[0390] Los componentes (1) a (6) se disuelven en el agua purificada esterilizada (7) para preparar una inyección intravítrea.

[0391] Fármaco oftálmico

[0392] En 100 ml:

[0395]

[0397] Los componentes (1) a (4) se disuelven en el agua purificada esterilizada (5) y el pH se ajusta para preparar gotas oculares.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

1. Un péptido para su uso en un método para prevenir o tratar queratitis neurotrófica, que consiste en una secuencia estabilizada de la secuencia representada por:

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 1) o HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2),

(A) en donde el péptido que consiste en la secuencia estabilizada tiene la secuencia enumerada como SEQ ID NO: 1 o 2 con los grupos carboxilo de los restos de ácido aspártico en la posición 3 y/o la posición 8 reemplazados por tetrazol, o su secuencia parcialmente modificada en donde la secuencia parcialmente modificada es una secuencia en donde se añaden aminoácidos al extremo N-terminal o al extremo C-terminal, y el péptido que consiste en la secuencia estabilizada tiene afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPACR2, o

(B) en donde el péptido que consiste en la secuencia estabilizada es un péptido con la secuencia representada por:

H-X<1>-D-G-<1>-F-T-D-X<2>-Y-X<3>-R-Y-R-X<4>-X<5>-X<6>-A-X<7>-X<8>-X<9>-Y-L-A-A-V-X<10>(SEQ ID NO: 3)

{donde X<1>es un aminoácido neutro, X<2>es un aminoácido neutro, X<3>es un aminoácido neutro, X<4>es un aminoácido alcalino, X<5>es un aminoácido neutro o, por ejemplo, Tz, X<6>es un aminoácido no polar, X<7>es un aminoácido no polar, X<8>es un aminoácido alcalino, X<9>es un aminoácido alcalino y X<10>es un aminoácido neutro},

con los grupos carboxilo de los restos de ácido aspártico en la posición 3 y/o la posición 8 reemplazados por tetrazol, o su secuencia modificada en donde la secuencia modificada es una secuencia con una adición de uno o más aminoácidos, y/o en donde se suprimen uno o dos aminoácidos,

en donde el péptido tiene afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPACR2, y la secuencia modificada es la secuencia enumerada como SEQ ID NO: 3 que tiene una deleción o adición de uno o más aminoácidos.

2. El péptido para su uso según la reivindicación 1 (B), en donde los aminoácidos neutros de X<1>, X<2>y X<3>son alanina o serina, y/o

en donde los aminoácidos alcalinos de X<4>, X<8>y X<9>son lisina o arginina, y/o

en donde X<5>es glutamina, alanina o egTz y/o

en donde X<6>es metionina, norleucina, alanina o leucina, y/o

en donde X<7>es valina o alanina, y/o

en donde X<10>es leucina o alanina.

3. El péptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 (B) o 2, en donde los grupos carboxilo de los ácidos aspárticos en la posición 3 y la posición 8 de la SEQ ID NO: 3 se reemplazan por tetrazol.

4. El péptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones (1B) o 2 a 3, en donde el extremo N-terminal del péptido está acetilado o mesilado.

5. El péptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones (1B) o 2 a 4, en donde el extremo N-terminal del péptido está acetilado.

6. El péptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones (1B) o 2 a 5, en donde se añade una secuencia seleccionada del grupo que consiste en lo siguiente:

GKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 37);

GKRYKQRVKN (SEQ ID NO 38);

GKRYKQRVK (SEQ ID NO 39);

GKRYKQRV (SEQ ID NO: 40);

GKRYKQR (SEQ ID NO: 41);

GKRYKQ (SEQ ID NO: 42);

GKRYK (SEQ ID NO: 43);

GKRY (SEQ ID NO: 44);

GKR;

GRR;

GK;

GR; y

G;

al extremo C-terminal del péptido.

7. Un péptido para su utilización in vivo en el tratamiento de los daños en el nervio trigémino o en la regeneración del nervio trigémino mediante la promoción de la elongación de los axones nerviosos, que consiste en una secuencia estabilizada de la secuencia representada por:

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 1) o HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2),

en donde los grupos carboxilo del ácido aspártico se reemplazan por tetrazol.

8. Un péptido que consiste en una secuencia estabilizada de la secuencia representada por:

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 1) o HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2),

en donde los grupos carboxilo del ácido aspártico se reemplazan por tetrazol,

para su uso en el tratamiento de queratitis neurotrófica o lesión nerviosa o para su uso en el tratamiento de regeneración nerviosa, promoviendo la elongación de axón nervioso.

9. Un método para promover la elongación de axón nerviosoin vitro,que comprende el cultivo de neuronas en medio de cultivo modificado por adición de un péptido que consiste en la secuencia estabilizada representada por:

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 1) o HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2),

en donde los grupos carboxilo del ácido aspártico en dichas secuencias se reemplazan por tetrazol.