CN116406301A - 可用于治疗癌症的sn38肽缀合物 - Google Patents
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Abstract
SN38的肽缀合物、所述肽缀合物的制备方法、包含所述肽缀合物的药物组合物和所述肽缀合物作为抗癌药物的治疗适应症。
Description
本申请要求2020年9月28日提交的欧洲专利申请EP20382854.6的权益。
技术领域
本发明涉及抗癌药物SN38的递送系统、其制备方法及其治疗适应症的领域。
背景技术
癌症是一种特征为肿瘤细胞聚集的异质性疾病，其可导致动物和人死亡。癌症还是导致儿童和青少年疾病死亡的主要原因之一。尽管在过去的五十年内，在治疗若干类型的癌症(尤其是儿童癌症)方面取得了实质性进展，但是针对其他类型的癌症的治疗进展有限。儿童肿瘤的年发病率在每百万人100-160例之间。每年每500名15岁以下儿童中有1名具有风险。这种发病率在工业化国家中略低。脑和脊髓肿瘤占所有赘瘤的25％(占所有小儿实体瘤的40-50％)。尽管取得了进展，但是这些患者的存活率数据仍然很低，为约55％。这与近年来在其他类型的患者(诸如受白血病或颅外肿瘤影响的那些)中看到的显著的存活率提高形成对比。
治疗癌症的常规方法包括手术治疗、施用化学治疗剂和最近的涉及施用可以与治疗部分缀合的抗体或抗体片段的基于免疫反应的疗法。然而，迄今为止，此类治疗取得的成功有限。
喜树碱是植物来源的抗癌化合物的四个主要结构分类之一，是一种细胞毒性生物碱，由含有吡咯(3,4β)喹啉部分的五环结构、S-构型的内酯形式和羧酸盐形式组成。伊立替康由存在于中国观赏树喜树(Camptotheca acuminata)中的天然喜树碱制成。曾经用伊立替康治疗若干类型的癌症，其中有就成人而言的多形性胶质母细胞瘤(GBM)以及就儿童而言的弥漫内生性脑桥胶质瘤(DIPG)、小儿胶质母细胞瘤(pGBM)、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤和视网膜母细胞瘤。
神经胶质瘤是一组在脑或脊的神经胶质细胞中开始的肿瘤，占所有脑肿瘤和中枢神经系统肿瘤的约30％以及所有恶性脑肿瘤的80％。通常，脑神经胶质瘤的治疗是一种使用手术、辐射疗法和化学疗法的合并方法。DIPG主要影响儿童，通常是5至7岁的儿童。不幸的是，这是脑干肿瘤中的大多数，占60-70％，并且是所有肿瘤中预后最差的。没有任何治疗被证明是有效的，并且平均存活为9个月。辐射和施用类固醇是唯一具有缓解作用并且在学术上提高存活率的方法。到目前为止，没有有用的化学疗法，并且已经进行了多项临床试验，但没有有利的结果。小儿胶质母细胞瘤是另一组肿瘤，占半球肿瘤的三分之一。小儿胶质母细胞瘤的发病率高峰在8岁和12岁。成胶质细胞瘤也影响成人患者，每100.000人群中约有2-3例。
尤文肉瘤是儿童和青少年恶性骨肿瘤的第二大病因。年发病率为每百万居民0.6例。该病在5岁以前罕见，并且发病率高峰在10至15岁，影响男孩多于女孩，但这种在性别方面中的关系根据年龄范围而不同。尤文肉瘤最常见的起点是骨盆(髋)骨、胸壁(诸如肋骨或肩胛骨)或腿骨中间。在不存在骨损伤的情况下，尤文肉瘤也可能呈现为骨骼外病变。在这种变型中，淋巴蔓延的风险很高，并且治疗通常类似于横纹肌肉瘤。
软组织肉瘤分为横纹肌肉瘤和非横纹肌肉瘤。横纹肌肉瘤占儿童所有软组织肉瘤的50％。横纹肌肉瘤是继神经母细胞瘤和威耳姆氏肿瘤(Wilms'tumor)之后频率第三高的颅外实体瘤。年龄高峰是双峰的，第一个高峰在2到5岁，并且第二高峰在青春期，在15到19岁。虽然成人的肉瘤主要发生在四肢，但在儿童中它们可能起源于身体的任何位置，包括骨骼肌和软组织。儿童受影响最严重的区域是头颈部和泌尿生殖道。20％的患者的四肢受到影响。总体存活率很低，除非肿瘤存在于可以完全切除的位置，有时需要截肢或排泄。取决于位置，存活率为7-70％不等。
神经母细胞瘤为儿童时期最常见的颅外实体瘤。由于其胚胎起源，神经母细胞瘤实际上可能存在于交感神经系统的任何部分中，但局部区域疾病最常见的位置是在肾上腺(44％)上。诊断时1.5-6岁的儿童仍然可能利用常规治疗来治愈，但当他们被诊断患有转移性疾病(4期神经母细胞瘤)时，他们的生存概率降低。约50％的新诊断患者已经呈现骨(60％)、骨髓(50％)、淋巴结(42％)和/或肝(15％)转移并且需要加强的化疗治疗、手术和放疗，但他们的存活率仍然很差并且在过去几十年内几乎没有取得进展。
最后，视网膜母细胞瘤是儿童眼部肿瘤的最常见原因，全球发病率为20,000活产中有1例。视网膜母细胞瘤通常发生在生命的前2年。30-40％是双侧的，在这些情况下总是有阳性家族史。在单侧的情况下，10％具有位于13号染色体上的Rb基因的种系突变。如果及早发现，他们的存活率为95％。在世界某些地区，当诊断较晚时，存活率急剧下降，低于20％。治疗取决于实现的肿瘤控制。当化疗和近距放射治疗无法控制肿瘤消退时，建议进行摘除术。即使进行了摘除术，在一些情况下也会有肿瘤侵袭到视神经中，这将迫使额外的化疗治疗。
伊立替康的疗效已被证明受到其肝激活的限制，肝激活导致转化率低、患者间变异性高和剂量限制性胃肠道毒性。
SN38是伊立替康的活性代谢物并且经由肝羧酸酯酶水解伊立替康而形成且经由UGT1A1的葡萄糖醛酸化来代谢。SN38具有下式
自发现以来，SN38以其强大的抗肿瘤作用引起了所有科学家的关注。SN38的活性是伊立替康本身的1000倍，并且可用于治疗与伊立替康相同类型的癌症。体外细胞毒性测定显示，SN38的效力相对于伊立替康为2到2000倍不等。即便如此，SN38在化学、药理学和毒性水平上也有显著的局限性。在化学水平上，与易溶于水的伊立替康不同，SN38几乎不溶于水，并且不溶于大多数溶剂和油，所以向患者施用SN38是不可行的。已对许多溶剂进行了测试，并且只可能用二甲基亚砜、甲酸和
HP以及用NaOH 0.1M溶解0.5％的SN38，但这种NaOH 0.1M水溶液的碱性pH使SN38失活。该药物的高亲脂性及其在水溶液中的不稳定性，使得必须用极性非质子溶剂进行施用，这带来了所有的不便。此外，第二个问题是末端内酯环的存在，末端内酯环使得该药物在水溶液中不稳定，产生非酶促和pH依赖性水解，形成羟基羧酸环，这对拓扑异构酶的抑制作用不强。因此，在中性或碱性pH下，平衡向活性较低的种类转移，而在较高酸性pH下，内酯的形成是有利的，具有更大的抑制能力。该药物还在第20位包含一个不对称碳，S形式是药理活性构型。
鉴于该药物的不利特征，一些研究已引导将SN38配制成前药，以解决不溶性问题，并且因此利用强大的作用机制。几种缀合策略已应用于SN38以释放药物而不是使用前药。
其中一些缀合策略是基于SN38从可溶性缀合物的缓慢释放，例如US8299089B2提出将聚(乙二醇)与多臂PEG缀合以提高溶解度，并且由于酯水解而释放SN38。然而，这些缀合物必须以高水平施用才能有效。
WO2015/051307A1公开了一些缀合物，这些缀合物通过β-消除机制以缓慢的速率从聚乙二醇释放SN38，以实现低剂量和长期暴露的方案。
F.Koizumi等人在“Novel SN38-incorporating polymeric micelles,NK012,eradicate vascular endothelial growth factor-secreting bulky tumors”,CancerRes2006,第66(20)卷,第10048-56页中公开了与来自自组装纳米颗粒(NP)的SN38化学缀合的聚(乙二醇)-聚(谷氨酸)嵌段共聚物，其在临床前研究中优于伊立替康。
其他缀合物策略是例如基于使用肽缀合物来绕过肝激活，因此与伊立替康相比降低胃肠道毒性和患者间变异性。
因此，F Meyer-Losic等人在“DTS-108,A novel Peptidic prodrug of SN38:Invivo Efficacy and Toxicokinetic Studies”,Clinical Cancer Research 2008,第14卷,第7期,第2145-2153页中提出经由酯酶可切割接头将SN38与阳离子肽(Vectocell)缀合，以递送比伊立替康显著更高水平的SN38，而没有伊立替康的相关毒性，导致临床前模型中DTS-108的治疗窗口增加。
WO2007/113687A2公开了通过接头，借助于硫醚键制备喜树碱-细胞穿透肽缀合物，诸如缀合物DPV1047-MIC-SN38(DPV-1047是肽VKRGLKLRHVRPRVTRMDV；MIC是6-马来酰亚胺己酸残基；SN38是7-乙基-10-羟基喜树碱)，其已显示对人HCT-116细胞系具有显著的抗肿瘤活性。
最后，WO2018/064683A1公开了靶向肿瘤血管的抗肿瘤剂IF7-SN38的合成，其中抗肿瘤剂包含具有序列IFLLWQR(IF7)的膜联蛋白-1结合肽与抗癌药物(SN38)通过接头4-{4-[(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酰胺基]甲基}环己烷-1-羧酸的缀合物。此化合物靶向脑肿瘤并且通过被动转胞吞作用机制克服血脑屏障。
尽管努力提供SN38的缀合物以允许SN38的充分施用和生物利用度以治疗癌症，但仍然存在寻找改进的系统以有效施用SN38的未满足的医学需求。
发明内容
本发明人开发了一种SN38与一组特定肽的缀合物，所述肽通过特定类型的接头连接到SN38，并且维持针对来自脑和颅外癌症的几种细胞系的抗肿瘤活性，类似于SN38。SN38的新缀合物在水中具有高溶解度并且与几乎不溶的SN38不同，由于这种溶解度，SN38的新缀合物可以施用于患者。在体外，SN38的新缀合物的活性远高于伊立替康的活性。有利地，它们在体外人血清中表现出良好的稳定性。
形成缀合物的一部分的肽是已知的，并且先前在WO2015/001015A1中有所描述。此文件公开了，这些肽具有穿过血脑屏障(BBB)的能力，并且具有运输自身不能穿过BBB的物体(特别是诸如蛋白质和抗体的大物体)的能力。它们使用主动运输机制穿过BBB。B.Oller等人在“MiniAp-4:A Venom-Inspired Peptidomimetic for Brain Delivery”,AngewChem Int Ed 2016,第55卷,第572-575页中重点介绍了肽DapKAPETALD，并且公开了，它对蛋白酶具有抗性并且能够在基于人细胞的模型中以及在体内将物体有效地递送穿过血脑屏障。
本发明人已经发现，对于SN38的情况，通过其与WO2015/001015A1中公开的那些中的某些肽和比前述文件中公开的接头更大的特定大小的接头缀合，获得了良好的抗肿瘤活性结果。这些缀合物相对于其他缀合物是有利的，因为它们允许维持类似于SN38的抗肿瘤活性并且比伊立替康的体外活性高出100倍。
实验部分中提供的对比数据表明，当SN38通过相同的接头与另一肽(THRre)缀合时，部分/全部抗肿瘤活性损失(本发明实施例7和对比例1)，并且如果还使用与本发明的接头不同的接头，则结果甚至更糟(比较例2)。
因此，本发明的第一方面涉及一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐，
(Z)-(L)-P-(W)s-(Y)(I)
其中：
Z为药物活性成分SN38或其药学上可接受的盐的自由基(radical)，其中所述药物活性成分SN38具有式(II)，并且其中Z通过所述药学活性成分的两个羟基(a)或(b)中的仅一个独立地连接至接头L；
L为接头，其为由2至8个双自由基L'构成的双自由基并且具有下式：-L'a-(L'b)n-L'c；
La'为选自由以下组成的组的双自由基：-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-；-C(＝O)-(CH2)r-NH-；-C(＝O)-(CH2)r-S-；-C(＝O)-(CH2)r-O-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-NH-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-S-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-O-；-(CH2)r-C(＝O)-；-(CH2)r-NH-；-(CH2)r-S-；-(CH2)r-O-；-Si(R1)(R2)-(CH2)r-NH-；-Si(R1)(R2)-(CH2)r-C(＝O)-；-Si(R1)(R2)-(CH2)rO-；-Si(R1)(R2)-(CH2)r-S-；-SO2-(CH2)r-NH-；-SO2-(CH2)r-C(＝O)-；-SO2-(CH2)r-O-；-SO2-(CH2)r-S-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-NH-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-C(＝O)-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-O-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-S-；-CH(OH)-(CH2)r-NH-；-CH(OH)-(CH2)r-C(＝O)-；-CH(OH)-(CH2)r-O-；-CH(OH)-(CH2)r-S-；
L8-L11中的任一个中的取代处于环的任一位置；
Lb'为独立地选自由以下组成的组的双自由基：-NH-(CH2)r-C(＝O)-；-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-；-S-(CH2)r-C(＝O)-；-O-(CH2)r-C(＝O)-；-NH-(CH2)r-；-C(＝O)-(CH2)r-；-S-(CH2)r-；-O-(CH2)r-；-NH-CH-((CH2)rNH2)-C(＝O)-；-S-CH2-CH(NH2)-C(＝O)-；-(CH2)r-C(＝O)-；-(CH2)r-O-；-(CH2)r-NH-；-(CH2)r-S-；-C(＝O)-(CH2)r-NH-；-C(＝O)-(CH2)r-O-；-C(＝O)-(CH2)r-S-；-NH-(CH2)r-O-；-NH-(CH2)r-NH-；-NH-(CH2)r-S-；L1；L2；L3；L4；及其组合；
Lc'为选自由以下组成的组的双自由基：-NH-(CH2)r-C(＝O)-；-NH-CH-((CH2)r-NH2)-C(＝O)-；-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-；-S-(CH2)r-C(＝O)-；-S-CH2-CH(NH2)-C(＝O)-；-O-(CH2)r-C(＝O)-；-(CH2)r-C(＝O)-；L1；L2；L3；L4；
P为选自由以下组成的组的肽的双自由基：(a)包含氨基酸序列X1KAPETALX2的肽，在X1与X2之间有肽内键，所述肽内键为酰胺键；其中X1选自由Dap(2,3-二氨基丙酸)和Dab(2,4-二氨基丁酸)组成的组；并且X2选自由D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)组成的组；即
对于氨基酸Dap，本文等同地使用代码Dap和Dpr；
(b)长度为12-20个氨基酸残基的肽，其具有至少一个肽内键，所述肽内键为二硫键或二硒键，并且包含氨基酸序列X3KAPETALX4AAA；其在X3与X4之间具有至少一个肽内二硫键或二硒键，其中X3和X4等同并且选自由C(半胱氨酸)、Sec(硒代半胱氨酸)和Pen(青霉胺)组成的组；即
(c)长度为9-11个氨基酸残基的肽，其具有至少一个肽内键，所述肽内键为二硫键或二硒键，并且其由选自由在X5与X6之间具有至少一个肽内二硫键或二硒键的X5KAPETALX6、X5KAPETALX6A和X5KAPETALX6AA组成的组的氨基酸序列组成；其中X5和X6等同并且选自由C(半胱氨酸)、Sec(硒代半胱氨酸)和Pen(青霉胺)组成的组，即
(d)具有16个氨基酸残基并且包含在X7与X9之间以及在X8与X10之间有肽内二硫键或二硒键的氨基酸序列X7NX8KAPETALX9AAAX10H的肽；其中X7-X10独立地选自由C(半胱氨酸)、Sec(硒代半胱氨酸)和Pen(青霉胺)组成的组；前提是X7和X9等同并且X8-X10等同；即
以及(e)包含氨基酸序列X1KAPETALX2的肽，其中X1选自由Dap和Dab组成的组；并且X2选自由D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)组成的组(SEQ ID NO:7)，即线性肽；
W为选自由–NH-(CH2)r-C(＝O)-和–NH-CH((CH2)rNH2)-C(＝O)-组成的组的双自由基；Y为选自由-NH2、-OH、-OR3和-NHR3组成的组的自由基；
s为独立地选自0至1的整数；n为0至6的整数；r为独立地选自1至5的整数；k为5至8的整数；R1和R2独立地选自(C1-C6)-烷基；并且R3为选自由(C1-C6)-烷基组成的组的自由基；
La'通过选自由酯键、醚键、氨基甲酸酯键、甲硅烷基醚键、磺酸酯键、磷酸酯键、缩酮键、半缩酮键、碳酸酯键和氨基甲酸酯键组成的组的键连接至自由基Z，所述键在画出的La'式左侧的C＝O、SO2、Si、P、CH或CH2基团与所述SN38的羟基中的一个羟基之间形成；
当n＝0时，La'通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键连接至自由基Lc'，所述键在画出的La'式右侧的官能团与Lc'式左侧的官能团之间形成；
当n＝1时，La'通过选自选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键连接至自由基Lb'，所述键在画出的La'式右侧的官能团与Lb'式左侧的官能团之间形成；并且Lb'通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键连接至自由基Lc'，所述键在画出的Lb'式右侧的官能团与画出的Lc'式左侧的官能团之间形成；
当n大于1时，Lb'等同或不同并且通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键在它们之间连接；一个Lb'通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键在末端连接至La'，所述键在画出的La'式右侧的官能团与画出的Lb'式左侧的官能团之间形成；并且另一个Lb'通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键在末端连接至Lc'，所述键在画出的Lb'式右侧的官能团与画出的Lc'式左侧的官能团之间形成；
Lc'通过用画出的Lc'式右侧的羰基和肽序列P的第一个氨基酸的氨基形成的酰胺键连接至双自由基P；
当s＝0时，P通过酰胺键、羧酸键或酯键直接连接至Y，所述键在序列P的最后一个氨基酸的C末端的C＝O与自由基Y之间形成，所述自由基Y为-NH2、-OH、-OR3或-NHR3；并且
当s＝1时，P通过用序列P的最后一个氨基酸的C末端的C＝O形成的酰胺键连接至自由基W，所述键在画出的W式左侧的官能团与画出的序列右侧的序列P的最后一个氨基酸的C末端的官能团(C＝O)之间形成；并且W如下连接至Y：-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-Y或-C(＝O)-NH-CH((CH2)rNH2)-C(＝O)-Y。
上文或下文序列的两个氨基酸之间的线表示两个氨基酸的侧链之间的肽内键。在一个特定实施方案中，上文或下文序列的两个氨基酸之间的线表示两个氨基酸的侧链之间的肽内键。
本发明的第二方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上文所定义的化合物以及适当量的药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明的第三方面涉及如上文所定义的化合物，其用途为用作药物。
本发明的第四方面涉及如上文的化合物，其用途为用于治疗哺乳动物、包括人的癌症。
本发明的第五方面涉及一种式(I)化合物，其用途为用于治疗癌症，其中式(I)化合物用于与化疗剂和/或与羧酸酯酶抑制剂组合的组合疗法。
附图说明
化合物(Ia)还被命名为G2B-001或SN38-接头A-MiniAp4。这些名称在本文中等同地使用。化合物(Ib)还被命名为G2B-001线状。化合物(Ic)还被命名为G2B-003。化合物(Id)还被命名为G2B-004。化合物(Ie)还被命名为G2B-005。
图1显示化合物(Ia)(在本文中也称为G2B-001或SN38-接头A-MiniAp4)(实施例7)和相关化合物SN38及伊立替康针对成人神经胶质瘤U87的癌细胞系的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。MiniAp4是在Dap与D之间有酰胺内肽键的DapKAPETALD。
图2显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对成人神经胶质瘤U373的癌细胞系的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图3显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对DIPG细胞模型HSJD-DIPG-007的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图4显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对DIPG模型HSJD-DIPG-011的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图5显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对小儿高级神经胶质瘤模型HSJD-GBM-001的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图6显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对视网膜母细胞瘤细胞模型HSJD-RBT-5的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图7显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对视网膜母细胞瘤细胞模型HSJD-RBT-7的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图8显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对视网膜母细胞瘤细胞模型HSJD-RBT-14的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图9显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对尤文肉瘤细胞系A673的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图10显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对横纹肌肉瘤细胞系Rd的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图11显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对横纹肌肉瘤细胞系RH4的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图12显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对神经母细胞瘤细胞系LAN-1的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图13显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对神经母细胞瘤细胞系Sk-N-JD的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图14显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对神经母细胞瘤细胞模型HSJD-NB-004的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图15显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对神经母细胞瘤细胞模型HSJD-NB-005的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图16显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和相关化合物SN38及伊立替康针对神经母细胞瘤细胞模型HSJD-NB-016的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图17显示培养物之间的抑制50％肿瘤细胞增殖的SN38-接头A-MiniAp4(Ia)药物浓度(IC50值)的比较。呈现了单个数据(点)。统计值：重复测量(配对)双向ANOVA，使用Tukey多重比较检验。
图18显示第0天用MTD为200mg/kg单次i.v.注射的SN38-接头A-MiniAp4化合物(Ia)治疗的3只小鼠(治疗组)与第0天用生理盐水i.v.注射的2只对照小鼠(对照组)的单独体重曲线。
图19显示用伊立替康、SN38-接头A-MiniAp4(Ia)或生理盐水(对照)治疗的小鼠的平均体重变化，表示为自单独体重最大值的体重减轻百分比，如实施例10中详述。呈现了平均数据(点)和SD(条)。
图20显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和比较例2(SN38-接头B-THRre)针对细胞系HSJD-DIPG-007的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下六次重复的平均值和SD。
图21显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和比较例2(SN38-接头B-THRre)针对细胞系HSJD-GBM-001的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下六次重复的平均值和SD。
图22显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)、比较例1(SN38-接头A-THRre)和比较例2(SN38-接头B-THRre)针对细胞系HSJD-DIPG-007的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下六次重复的平均值和SD。
图23显示SN38-接头A-MiniAp4(Ia)、比较例1(SN38-接头A-THRre)和比较例2(SN38-接头B-THRre)针对细胞系HSJD-GBM-001的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下六次重复的平均值和SD。
图24显示在体外在37℃下人血清中的SN38-接头A-MiniAp4(Ia)相对于时间的稳定性。
图25显示在体外在37℃下大鼠、小鼠、狗和人血浆中的SN38-接头A-MiniAp4(Ia)相对于时间的稳定性。
图26显示在体外在37℃下人血清中的G2B-001线状(Ib)相对于时间的稳定性。
图27显示G2B-001线状(Ib)、G2B-001(Ia)和相关化合物SN38针对DIPG细胞模型HSJD-DIPG-007的比较抗增殖活性。值表示为对照未处理细胞的被认为是100％的MTS信号的百分比。以点的形式的值意指在化合物浓度下三至六次重复的平均值和SD。
图28显示用伊立替康(黑点)、G2B-003(Ic)(实线)或生理盐水对照(虚线)治疗的三只小鼠的皮下神经母细胞瘤肿瘤体积(两个肿瘤的平均值和SD)。肿瘤模型是患者来源的异种移植物，命名为HSJD-NB-013。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文所指的氨基酸均为L-氨基酸。1字母代码和3字母代码被模糊使用。对于以下氨基酸，使用了以下缩写：二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)、硒代半胱氨酸(Sec)和青霉胺(Pen)。在本发明的上下文中，青霉胺仅涵盖D-青霉胺。
上文所述的本发明化合物可以是药学上可接受的盐的形式。本文所用的术语“药学上可接受的盐”涵盖由药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机或有机酸或碱)形成的任何盐。对于盐没有限制，除了如果用于治疗目的，它们必须是药学上可接受的。
由于一些式(I)化合物是碱性化合物，所以盐可以由药学上可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。此类酸包括例如氢氯酸、乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对-甲苯磺酸等。
在一个具体实施方案中，式(I)化合物是Z通过药物活性成分的羟基(b)连接至接头L的那些化合物。
在另一个具体实施方案中，式(I)化合物是Z通过药物活性成分的羟基(a)连接至接头L的那些化合物。
在另一个具体实施方案中，式(I)化合物是P为选自由以下组成的组的肽的双自由基：(a)包含氨基酸序列DapKAPETALD的肽，其中在Dap与D之间有肽内键，所述肽内键为酰胺键，即
(b)长度为9-20个氨基酸残基的肽，其具有至少一个肽内键，所述肽内键为二硫键，并且其包含以下氨基酸序列：CKAPETALCAAA；在半胱氨酸1与9之间具有至少一个肽内二硫键，即
(c)长度为9-11个氨基酸残基的肽，其至少具有一个肽内键，所述肽内键为二硫键，并且其由选自由在半胱氨酸1与9之间具有至少一个肽内二硫键的CKAPETALC、CKAPETALCA和CKAPETALCAA组成的组的氨基酸序列组成，即
(d)具有16个氨基酸残基并且包含氨基酸序列CNCKAPETALCAAACH的肽，其在作为半胱氨酸1和11的第一半胱氨酸与第三半胱氨酸之间以及在作为半胱氨酸3和15的第二半胱氨酸与第四半胱氨酸之间具有肽内二硫键，即
在已经选择了X1-X10的特定氨基酸的序列SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:13中，在序列中画出了特定肽内键。
在另一具体实施方案中，本发明肽中的至少一个肽内键为一个肽内键。在另一具体实施方案中，本发明肽中的至少一个肽内键是指两个肽内键。
在另一具体实施方案中，式(I)化合物是其中P为肽DapKAPETALD(SEQ ID NO:14)、即线性肽的双自由基的那些化合物。
在一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是其中P为选自由以下组成的组的肽的双自由基的那些化合物：(a)包含氨基酸序列DapKAPETALD的肽，其在Dap与D之间具有肽内键，所述肽内键为酰胺键(也命名为MiniAp4)(SEQ ID NO:8)；和(b)CKAPETALC，其在位置1与9的半胱氨酸之间具有至少一个肽内二硫键(SEQ ID NO:10)。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中P为肽DapKAPETALD的双自由基，其在Dap与D之间具有肽内键，所述肽内键为酰胺键(SEQ ID NO:8)。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是其中La'为选自由以下组成的组的双自由基的那些化合物：-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2)r-NH-、-C(＝O)-(CH2)r-S-、-C(＝O)-(CH2)r-O-、-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L12。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是其中La'为选自由以下组成的组的双自由基的那些化合物：-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2)r-NH-、-C(＝O)-(CH2)r-S-、-C(＝O)-(CH2)r-O-、L1、L2、L3、L4、L5、L6和L7。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中L为接头，所述接头为由3至8个双自由基构成的双自由基，并且n为1至6的整数。在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中L为接头，所述接头为由5至8个双自由基构成的双自由基。在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中L为接头，所述接头为由6至8个双自由基构成的双自由基。在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中L为接头，所述接头为由6至7个双自由基构成的双自由基。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中L为接头，所述接头为由6个双自由基构成的双自由基。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中La'为L3并且Lc'为-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-。在另一具体实施方案中，式(I)化合物为以下那些化合物，其中La'为L3；Lb'选自由-NH-(CH2)r-O-、-(CH2)r-O-和-(CH2)r-NH-及其组合组成的组；Lc'为-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中L为接头，所述接头为由2个双自由基构成的双自由基，并且n＝0。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中La'为L12并且Lc'为L13。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中La'为-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-并且Lc'为L15。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中La'通过作为与画出的La'式左侧的C＝O基团形成的酯键的键连接至自由基Z，并且通过与画出的式右侧的官能团形成的化学上可行的键连接至自由基Lb'，所述化学上可行的键选择由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中La'通过为与画出的La'式左侧的C＝O基团形成的酯键的键连接至自由基Z，并且通过与画出的式右侧的官能团形成的化学上可行的键连接至自由基Lb'，所述化学上可行的键为酰胺键。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中La'通过作为与画出的La'式左侧的C＝O基团形成的碳酸酯键或氨基甲酸酯键的键连接至自由基Z，并且通过与画出的式右侧的官能团形成的化学上可行的键连接至自由基Lb'，所述化学上可行的键为酰胺键(NH-CO或CO-NH)。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物为以下那些化合物，其中Lb'以画出的Lb'式左侧的官能团与自由基La'形成化学上可行的键；并且Lb'通过以画出的Lb'式右侧的官能团形成的化学上可行的键连接至自由基Lc'，所述化学上可行的键选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组；其中当n大于1时，Lb'等同或不同并且通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键在它们之间连接；一个Lb'在末端连接至La'并且另一个Lb'在末端连接至Lc'。
在另一具体实施方案中，结合上文或下文的任何具体实施方案，式(I)化合物是以下那些化合物，其中Lc'通过以画出的Lc'式右侧的羰基和肽序列P的第一个氨基酸的氨基形成的酰胺键连接至双自由基P，并且通过与画出的式左侧的官能团形成的化学上可行的键连接至自由基Lb'，所述化学上可行的键选择由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组。
在另一具体实施方案中，式(I)化合物是下式(Ia)化合物或其药学上可接受的盐，其中在式(I)中，P是MiniAp4＝DapKAPETALD，其在Dap与D之间具有肽内键，Y＝CONH2，W＝0，接头为以下接头A，并且SN38通过羟基(b)连接至接头。
(Ia)。
此化合物还被命名为SN38-接头A-MiniAp4。
在另一具体实施方案中，式(I)化合物是下式(Ib)化合物或其药学上可接受的盐，其中在式(I)中，P是MiniAp4＝DapKAPETALD线状，其在Dap与D之间不具有肽内键，Y＝CONH2，W＝0，接头为以下接头A，并且SN38通过羟基(b)连接至接头。
此化合物在本文中还被命名为G2B-001线状。
在另一具体实施方案中，式(I)化合物是下式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐，其中在式(I)中，P是MiniAp4＝DapKAPETALD，其在Dap与D之间具有肽内键，Y＝CONH2，W＝0，接头为以下接头A，并且SN38通过羟基(a)连接至接头。
(Ic)。
此化合物在本文中还被命名为G2B-003。
接头A通过以下形成：
La':L3，其中r＝4(右)和3(左)：
Lb':1个单位的双自由基-NH-(CH2)3-O-、2个单位的双自由基-(CH2)2-O-和1个单位的双自由基-(CH2)3-NH-；并且Lc'：-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-；并且双自由基如在以下对应于接头A的图式那样连接：
在另一具体实施方案中，式(I)化合物是下式(Id)化合物或其药学上可接受的盐，其中在式(I)中，P是MiniAp4＝DapKAPETALD，其在Dap与D之间具有肽内键，Y＝CONH2，W＝0，接头为以下接头C，并且SN38通过羟基(a)连接至接头。
此化合物在本文中还被命名为G2B-004。接头C通过以下形成：La':L12和Lc':L13，并且n＝0。
在另一具体实施方案中，式(I)化合物是下式(Ie)化合物或其药学上可接受的盐，其中在式(I)中，P是MiniAp4＝DapKAPETALD，其在Dap与D之间具有肽内键，Y＝CONH2，W＝0，接头为以下接头D，并且SN38通过羟基(a)连接至接头。
(Ie)。
此化合物在本文中还被命名为G2B-005。接头D通过以下形成：La':-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-，其中r＝1；Lb':L15，并且n＝0。
式(I)化合物可以全部或部分地通过化学合成来生成。制备式(I)化合物所需的氨基酸是可商购获得的。式(I)化合物可以很容易地制备，例如通过液相合成，或者优选地通过固相肽合成，为此已经公开了许多方法(参见M.Amblard等人,“Methods and protocolsof modern solid-phase peptide synthesis”.Molecular Biotechnology 2006,第33卷,第239-254页)。式(I)化合物还可以通过液相合成和/或固相合成的任何组合来制备。例如，通过固相合成来合成肽P的主体，然后去除溶液中的保护基。SN-38与接头L和肽P的结合可以在固相或溶液中进行。接头L的构造还可以通过液相合成和/或固相合成的任何组合来制备。
本发明肽还可以通过生成DNA模板并亚克隆到表达载体中来获得(参见J.H.Lee等人,Eur.J.30Biochem.2001.第268卷,第2004-2012页)。
式(Ia)化合物SN38-接头A-MiniAp4可以通过包括使式(III)化合物与式(IV)化合物如上所述反应以产生式(Ia)化合物的方法来制备。
式(I)化合物的药学上可接受的盐的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，它们可以通过常规化学方法，从含有碱性或酸性部分的母体化合物制备。通常，此类盐例如通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当的药学上可接受的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在其混合物中反应来制备。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上文所定义的式(I)化合物以及适当量的药学上可接受的载剂或赋形剂。如本文所用的术语“治疗有效量”是指当施用时，足以预防或在某种程度上减轻所治疗疾病的一种或多种症状的发展的药物的量。根据本发明施用的化合物的具体剂量当然将由围绕病例的具体情况来确定，所述具体情况包括施用的化合物、施用的途径、所治疗的具体病状和类似的考虑。
术语“药物组合物”是指本文所述的化合物与其他化学组分、诸如稀释剂或载剂的混合物。药物组合物有助于将化合物施用至生物体。术语“药学上可接受的赋形剂或载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物。在与药物组合物的其他成分相容的意义上，每种组分必须是药学上可接受的。每种组分还必须适用于与人和动物的组织或器官接触，而没有过量毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或与效/险比相称的其他问题或并发症。
本发明组合物可以适于注射、输注或植入体内的肠胃外形式施用。
本发明化合物的重要特征在于其抑制所测试的肿瘤细胞系的细胞生长的生物活性。如实施例中所示，本发明化合物在几种癌细胞系中显示出抗肿瘤特性。
如已经解释的那样，实验部分中提供的比较数据表明，当SN38通过相同的接头(接头A)与下式的另一肽(THRre)缀合时，部分/所有抗肿瘤活性损失，并且如果还使用与本发明的接头不同的接头(接头B)，则结果甚至更糟。接头B为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-。THRre具有下式：H-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-CONH2。然而，本发明的示例性化合物出乎意料地维持了针对来自脑和颅外癌症的几种细胞系的抗肿瘤活性，类似于SN38，其远高于伊立替康，且在体外人血清中具有良好的稳定性。
因此，本发明涉及如上所定义的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用作药物。
本发明还涉及如上所定义的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗哺乳动物(包括人)的癌症，因为它们在所测试的所有类型的癌症中均具有活性。此方面还可以表述为如上所定义的式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的癌症的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗患有癌症或易患癌症的哺乳动物(包括人)的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如上所定义的式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂或载剂。
在一具体实施方案中，式(I)化合物用于如上所定义的用途，其中所述癌症治疗包括治疗选自由颅外实体瘤、眼肿瘤和CNS肿瘤组成的组的肿瘤。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中癌症选自由以下组成的组：成人神经胶质瘤、小儿神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、尤文肉瘤、DIPG、神经母细胞瘤和横纹肌肉瘤。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中小儿神经胶质瘤选自由弥漫内生性脑桥胶质瘤(DIPG)和小儿高级神经胶质瘤组成的组。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中癌症是弥漫内生性脑桥胶质瘤。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中癌症是视网膜母细胞瘤。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中癌症是尤文肉瘤。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中癌症是神经母细胞瘤。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中癌症是横纹肌肉瘤。在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中癌症是成人神经胶质瘤。
在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中化合物针对选自由以下组成的组的癌细胞系具有活性：A673、HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-011、HSJD-GBM-001、Rd、RH4、HSJD-RBT-5、HSJD-RBT-7、HSJD-RBT-14、U373、U87、LAN-1、SK-N-JD、HSJD-NB-004、HSJD-NB-005、HSJD-NB-013和HSJD-NB-016。
在另一具体实施方案中，化合物用于如上所定义的用途，其中式(I)化合物通过静脉推注和/或静脉输注来施用。
本发明化合物可以与其他已知化学治疗剂相同的方式使用，即同时或顺序地与其他治疗组合使用，这取决于待治疗的病状。本发明化合物可以单独使用或与其他合适的生物活性化合物组合使用。因此，本发明式(I)化合物用于在与化学治疗剂的组合疗法中治疗哺乳动物(包括人)的癌症。另外，本发明式(I)化合物用于与酯稳定剂组合来治疗哺乳动物(包括人)的癌症。合适的酯稳定剂是羧酸酯酶抑制剂。羧酸酯酶抑制剂的实例可见于M.J.Hatfield和P.M.Potter,Exp.Opin.Ther.Pat.2011,第21(8)卷,第1159-1171页。
在一具体实施方案中，式(I)化合物与羧酸酯酶抑制剂组合施用。在另一具体实施方案中，式(I)化合物与羧酸酯酶抑制剂同时施用。在另一具体实施方案中，式(I)化合物在治疗有效间隔内以任何次序分开施用。
在一具体实施方案中，式(I)化合物与另一种化疗剂组合施用。在另一具体实施方案中，式(I)化合物与另一种化疗剂同时施用。在另一具体实施方案中，式(I)化合物在治疗有效间隔内以任何次序分开施用。
在另一具体实施方案中，式(I)化合物与另一种化疗剂和羧酸酯酶抑制剂组合施用。在另一具体实施方案中，式(I)化合物与另一种化疗剂和羧酸酯酶抑制剂同时施用。在另一具体实施方案中，式(I)化合物在治疗有效间隔内以任何次序与另一种化疗剂和羧酸酯酶抑制剂分开施用。
在整个说明书和权利要求中，词语“包含”及其变型并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包含”涵盖“由……组成”的情况。本发明的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员在调查说明书后将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践获知。以下实施例和附图以说明的方式提供，并且它们不旨在限制本发明。与附图相关并且置于权利要求书中的括号中的附图标记仅旨在增加权利要求书的可理解性，并且不应被解释为限制权利要求书的范围。此外，本发明涵盖本文所述的具体和优选实施方案的所有可能组合。
实施例
受保护的氨基酸、柄部和树脂由以下供应：Luxembourg Industries(以色列特拉维夫)、Neosystem(法国斯特拉斯堡)、CalbiochemNovabiochem AG(Laufelfingen,瑞士)、Bachem AG(瑞士布本多夫)或Iris Biotech(Marktredwitz,德国)。使用的其他试剂和溶剂汇总于表1中。表1商业供应商和使用的试剂。DCM通过Al2O3柱。DMF储存在
分子筛上，并且通入氮气以消除挥发剂。
关于手动合成的一般考量：固相肽伸长和其他固相操作是在配有聚乙烯多孔盘的聚丙烯注射器中手动进行的。通过抽吸去除溶剂和可溶性试剂。不同合成步骤之间的洗涤是使用二甲基甲酰胺(DMF)(5x 30s)和二氯甲烷(DCM)(5x 30s)进行的，每次使用10mL溶剂/g树脂。
关于微波辅助合成的一般考量：微波辅助固相肽合成是在Liberty Blue自动微波肽合成仪上，使用H-Rink amide Protide树脂(加载量：0.56mmol/g)进行的。线性肽是使用相对于树脂过量5倍的Fmoc-氨基酸(0.2M)，以0.5mmol规模合成的。
鉴定测试：用于鉴定和控制合成的测试如下：A)Kaiser比色测定，用于检测固相结合的伯胺(E.Kaiser等人,Anal.Biochem.1970,第34卷,第595-598页)；B)对硝基苯酯测试，用于与固相结合的仲胺(A.Madder等人,Eur.J.Org.Chem.1999,第2787-2791页)。
在化合物的手动合成期间使用的方案：使用以下方法和方案以100μmol的规模合成化合物：根据自由基Y选择用于手动合成的树脂：如果Y是OH，则末端将为COOH，将在其他可用树脂中选择2-chlorotrytil chloride树脂。如果Y是NH2，则末端将为CONH2，将在其他可用树脂中选择Rink amide MBHA树脂。
树脂初始处理：通过用MeOH(5x 30s)、DMF(5x 30s)、DCM(5x 30s)、含1％ TFA的DCM(1x 30s和2x 10min)、DCM(5×30s)、DMF(5×30s)、DCM(5x 30s)、含5％ DIEA的DCM(1x30s，2x 10min)、DCM(5x 30s)、DMF(5x 30s)处理树脂。
Fmoc基团去除：使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)(2×5min)额外处理两次，以确保从仲胺(脯氨酸)中去除Fmoc基团。
针对100 μmol规模描述的偶联方法：
偶联方法1：将保护的氨基酸(4当量，400μmol)、溶解在DMF(1-3mL/g树脂)中的TBTU(4当量，400μmol，128mg)依次添加到树脂中，随后添加DIEA(8当量，800μmol，136μl)。使混合物在间歇手动搅拌下反应1h。通过抽吸去除溶剂并且用DMF(5x 30s)和DCM(5x 30s)洗涤树脂。通过Kaiser比色测定检查偶联程度。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。如果要脱保护的氨基酸是脯氨酸，则使用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)进行额外处理(2×5min)，以确保去除Fmoc基团。
偶联方法2：将保护的氨基酸(4当量，400μmol)、PyBOP(4当量，400μmol，208mg)、溶解在DMF(1-3mL/g树脂)中的HOAt(12当量，1.2mmol，163mg)依次添加到树脂中，随后添加DIEA(12当量，1.2mmol，204μL)。使混合物在间歇手动搅拌下反应1h。通过抽吸去除溶剂并且用DMF(5x 30s)和DCM(5x 30s)洗涤树脂。偶联反应在相同条件下进行两次。通过Kaiser比色测定检查偶联程度。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。如果要脱保护的氨基酸是脯氨酸，则使用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)进行额外处理(2×5min)，以确保去除Fmoc基团。
偶联方法3：将保护的氨基酸(4当量，400μmol)、PyBOP(4当量，400μmol，208mg)、溶解在DMF(1-3mL/g树脂)中的HOBt(12当量，1.2mmol，162mg)依次添加到树脂中，随后添加DIEA(12当量，1.2mmol，204μL)。使混合物在间歇手动搅拌下反应1h。通过抽吸去除溶剂并且用DMF(5x 30s)和DCM(5x 30s)洗涤树脂。偶联反应在相同条件下进行两次。通过Kaiser比色测定检查偶联程度。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。如果要脱保护的氨基酸是脯氨酸，则使用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)进行额外处理(2×5min)，以确保去除Fmoc基团。
偶联方法4，规模100μmol：保护的氨基酸(3当量，300μmol)、DIC(3当量，300μmol，46μL)和Oxyma(3当量，300μmol，43mg)在DCM/DMF(1:1)中。使混合物在间歇手动搅拌下反应45min。通过抽吸去除溶剂并且用DMF(5x 30s)和DCM(5x 30s)洗涤树脂。通过Kaiser比色测定检查偶联程度。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。如果要脱保护的氨基酸是脯氨酸，则使用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)进行额外处理(2×5min)，以确保去除Fmoc基团。
偶联方法5，规模100μmol：保护的氨基酸(3当量，300μmol)、DIC(3当量，300μmol，46μL)和HOBt(3当量，300μmol，41mg)在DCM/DMF(1:1)中。使混合物在间歇手动搅拌下反应45min。通过抽吸去除溶剂并且用DMF(5x 30s)和DCM(5x 30s)洗涤树脂。通过Kaiser比色测定检查偶联程度。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。如果要脱保护的氨基酸是脯氨酸，则使用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)进行额外处理(2×5min)，以确保去除Fmoc基团。
微波辅助自动合成期间使用的方案：使用以下方法和方案以500μmol的规模合成化合物：根据自由基Y选择用于微波辅助自动合成的树脂：如果Y是OH，则末端将为COOH，将在其他可用树脂中选择Cl-TCP(Cl)ProTide树脂。如果Y是NH2，则末端将为CONH2，将在其他可用树脂中选择Rink amide ProTide树脂。
树脂初始处理：通过用MeOH(5x 30s)、DMF(5x 30s)、DCM(5x 30s)、含1％ TFA的DCM(1x 30s和2x 10min)、DCM(5×30s)、DMF(5×30s)、DCM(5x 30s)、含5％ DIEA的DCM(1x30s，2x 10min)、DCM(5x 30s)、DMF(5x 30s)处理树脂。
微波辅助自动肽合成的偶联和脱保护条件：
偶联条件：
脱保护条件：
| CEM偏好 | 脱保护混合物 | 微波法 |
| 1 | 10％(w/v)哌嗪，10:90(EtOH/NMP) | 标准 |
| 2 | 含20％哌啶(v/v)的DMF或NMP | 标准 |
| 方法 | 斜坡时间 | 总时间 | 最高温度 |
| 标准脱保护 | 20-30s | 1:05 | 90℃ |
肽序列P的环化方法：
环化方法1：二硫键或二硒键：在溶液中在从树脂切割之后或者在树脂上在Cys、Sec或Pen残基的选择性脱保护之后进行环化。将肽以100μM的浓度溶解在10mM并且pH 8.0的碳酸氢铵水性缓冲液中。将溶液在室温下强烈搅拌24h。之后，将产物用TFA酸化至pH 2-3，冷冻并冻干。
环化方法2：酰胺键：在树脂上进行环化。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。使用Boc2O(3当量，1000μmol，56mg)和DIEA(30当量，3000μmol，240μL)，用Boc保护基保护N-末端胺。OAl和Alloc基团首先通过添加在DCM中的四(三苯基膦)钯(0)(0.1当量，10μM，12mg)，苯基硅烷(10当量，1000μmol，123mg)来脱保护(3x 15min)。树脂用含0.02M二乙基氨基甲酸钠的DCM洗涤(3x 5min)。然后通过添加PyBOP(4当量，400μmol，208mg)、HOAt(12当量，1.2mmol，163mg)、DMF(1-3mL/g树脂)和DIEA(12当量，1.2mmol，204μL)实现Dap的氨基和天冬氨酸的羧酸酯基的偶联。偶联进行1.5h并重复过夜。
环化方法3：酰胺键：在树脂上进行环化。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。使用Boc2O(3当量，1000μmol，56mg)和DIEA(30当量，3000μmol，240μL)，用Boc保护基保护N-末端胺。OAl和Alloc基团首先通过添加在DCM中的四(三苯基膦)钯(0)(0.1当量，10μM，12mg)，苯基硅烷(10当量，1000μmol，123mg)来脱保护(3x 15min)。树脂用含0.02M二乙基二硫代氨基甲酸钠的DCM洗涤(3x 5min)。然后通过4当量的Oxyma(400μmol，57mg)和4当量的N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)(400μmol，61μL)的2个30min循环实现Dap的氨基和天冬氨酸的羧酸酯基的偶联。
环化方法4：酰胺键：在树脂上进行环化。使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。使用Boc2O(3当量，1000μmol，56mg)和DIEA(30当量，3000μmol，240μL)，用Boc保护基保护N-末端胺。OAl和Alloc基团首先通过添加在DCM中的四(三苯基膦)钯(0)(0.1当量，10μM，12mg)，苯基硅烷(10当量，1000μmol，123mg)来脱保护(3x 15min)。树脂用含0.02M二乙基二硫代氨基甲酸钠的DCM洗涤(3x 5min)。然后通过4当量的DIC(400μmol，61μL)和4当量的HOBt(400μmol，54mg)的2个1小时循环实现Dap的氨基和天冬氨酸的羧酸酯基的偶联。
构建接头L的一般方法：
形成二硫键的一般方法：二硫键可以通过两个硫醇的反应来完成。将硫醇以100μM的浓度溶解在10mM并且pH 8.0的碳酸氢铵水性缓冲液中，并且将溶液在室温下剧烈搅拌24h。之后，将溶液用TFA酸化至pH 2-3，冷冻并冻干。
形成硫醚的一般方法：硫醚键是通过N-末端溴乙酰基与半胱氨酸硫醇的反应完成的，如P.L.Barker等人.J.Med.Chem.1992.第35卷.第2040-2048页中所述。
形成醚的一般方法：醚形成可以通过羟基与卤代烷基化合物的反应来完成，优选地在碱性条件下进行，如Greene's Protective Groups in Organic Synthesis,第五版.Peter G.M.Wuts.2014John Wiley&Sons,Inc.第26-29页中所述。
形成酯的一般方法：酯形成可以通过羟基和羧酸的反应，使用典型的酯化条件反应，诸如在存在酸催化的情况下的Fischer酯化，或替代地羟基与对应的酰氯的反应来完成，如Greene's Protective Groups in Organic Synthesis,第五版.PeterG.M.Wuts.2014John Wiley&Sons,Inc.第271-279页中所述。
形成硫酯的一般方法：硫酯键是通过硫醇与羧酸的反应实现的，如M.Kazemi等人,Journal of Sulfur Chemistry,2015,第36:6卷,第613-623页中所述。
形成氨基甲酸酯的一般方法：羟基与异氰酸酯的反应可产生对应的氨基甲酸酯，如此处M.T.Nguyen等人,J.Org.Chem.1998,63,第20卷,第6878-6885页所述。
形成甲基硅烷基醚的一般方法：羟基与卤代三烷基甲硅烷基的反应产生对应的甲基硅烷基醚。通常需要酸清除剂，如Greene's Protective Groups in OrganicSynthesis,第五版.Peter G.M.Wuts.2014John Wiley&Sons,Inc.第456-463页中所述。
形成磺酸酯的一般方法：羟基与烷基或芳基磺酰卤的反应产生对应的磺酸酯，如F.David等人,Org.Process Res.Dev.2010,14,4,999-1007中所述。
形成磷酸酯的一般方法：羟基与具有一个羟基的二烷基或二芳基磷酸酯在脱水条件下或使用Mitsunobu反应条件的反应可以形成对应的磷酸酯，其中取代基之一是与羟基连接的链。
形成缩酮的一般方法：缩酮可以通过羟基与卤代亚甲基氧基烷基化合物的反应，或者通过在酸性条件下将羟基加成到取代的二氢吡喃或二氢呋喃来形成，如Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis,第五版.Peter G.M.Wuts.2014John Wiley&Sons,Inc.第69-77页中所述。
形成半缩酮的一般方法：羟基与醛的接触可以形成对应的半缩酮，如此处https://www.cliffsnotes.com/study-guides/chemistry/organic-chemistry-ii/aldehydes-and-ketones/reactions-of-aldehydes-and-ketones所述。
形成氨基甲酸酯的一般方法：氨基甲酸酯可以通过羟基与卤代甲酸酯或异氰酸酯的反应形成，如Greene's Protective Groups in Organic Synthesis,第五版.PeterG.M.Wuts.2014John Wiley&Sons,Inc.第371-374页中所述。
形成碳酸酯的一般方法：碳酸酯可以通过SN38与PNPC(如Eur J Pharm Biopharm,2017,第115卷,第149-158页中所述)或三光气(如J.Med.Chem.2008,第51卷,第6916-6926页中所述)的反应形成。
Fmoc-TTDS-OH的偶联：Fmoc-TTDS-OH(2当量)的偶联是通过在DMF中的4当量的oxyma和4当量的N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)的2个30min循环或者在DCM中的4当量的DIC和4当量的HOBt 2h来实现。之后使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。
5-己炔酸的偶联：5-己炔酸(2当量，200μmol，23mg)的偶联是通过在DMF:DCM(1:1)中的4当量的Oxyma(400μmol，57mg)和4当量的N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)(400μmol，61μL)的2个30min循环，或在DMF:DCM 1:1中的4当量DIC(400μmols，61μL)和4当量的HOBt(400μmol，54mg)4h，或在DMF:DCM 1:1中的2当量的PyBOP(400μmol，208mg)、在DMF中的6当量的HOAt(600μmol，81.5mg)和6当量的DIEA(600μmol，102μL)1.5h来实现的。通过抽吸去除溶剂，用DMF(5x 30s)和DCM(5x 30s)洗涤树脂。在相同条件下重复偶联。使用Kaiser比色测定监测偶联程度。
偶联二甘醇酐：二甘醇酐(10当量，1000μmol，116mg)的偶联是通过在DMF中的10当量的DIEA(1000μmol，174μL)的2个60min循环来实现的。通过抽吸去除溶剂，用DMF(5x 30s)和DCM(5x 30s)洗涤树脂。在相同条件下重复偶联。使用Kaiser比色测定监测偶联程度。
从树脂切割的一般方法：树脂的最终裂解和侧链脱保护：通过用TFA(95％)、H2O(2.5％)和TIS(2.5％)处理树脂(2h)来进行。将叔丁基甲基醚添加到获得的产物中并将混合物离心(3x 8min)。弃去上清液，并且将沉淀重悬于H2O、MeCN和TFA(1000:1000:1)的混合物中。过滤出产物并冷冻。
表征化合物的一般方法：这些化合物通过UPLC(Acquity high-class系统(PDA检测器、样品管理器FNT和四元溶剂管理器、Acquity BEH C18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％TFA)用作溶剂。在所有情况下，都使用2min线性梯度和UPLC-MS光谱法(Waters high class(PDA检测器、样品管理器FNT和四元溶剂管理器)，其联接到电喷雾离子源ESI-MS Micromass ZQ并使用MassLynx 4.1软件(Waters，Milford，MA)。使用BEH C18色谱柱(50x 2.1mm x 1.7μm，Waters)。流速为0.6mL/min，并且将MeCN(0.07％甲酸)和H2O(0.1％甲酸)用作溶剂。用正电离分析样品：离子喷射电压为30V，并且毛细管温度为1kV)进行表征。通过质谱仪获得精确质量：LTQ-FT Ultra(ThermoScientific)，以直接注入(自动纳米电喷雾)的方式引入样品。NanoMate(AdvionBioSciences,Ithaca,NY,USA)使用一次性导电吸头从384孔板(蛋白质Lobind)吸取样品，并且通过nanoESI芯片(由400个喷嘴组成，呈20x 20阵列)注入质谱仪。喷射电压为1.70kV，并且递送压力为0.50psi；电离是NanoESI，正电离。
NMR实验在配备有TCI冷冻探针的Bruker Avance III 600MHz光谱仪上进行。通过将化合物以3-4mM溶解在90％ H2O/10％ D2O中来制备，并将pH调节至2-3。化学位移参照内部3-(三甲基甲硅烷基)丙磺酸钠(DSS)。水信号的抑制是通过激发塑型实现的。从2D总相关光谱(TOCSY)和相关光谱(COSY)实验中获得残基特定分配，而2D核Overhauser效应光谱(NOESY)允许序列特定分配。13C共振是从2D 1H13C HSQC光谱中分配的。除了在278K下获得的NOESY光谱外，所有实验均在298K下进行。酰胺质子温度系数是根据在278与308K之间获得的一系列一维光谱确定的。TOCSY和NOESY混合时间分别为70和250ms。
实施例1.(S)-(4,11-二乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并
[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸叔丁酯的制备
向250ml烧瓶中，将1.5g 7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)、1.3当量的二碳酸二叔丁酯(1.15mL)和过量的无水吡啶(9mL)添加到150ml无水DCM中。将混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物用HCl(0,5N)x3、饱和NaHCO3 x1和盐水洗涤。有机层用MgSO4干燥并在真空下除去溶剂。不进行进一步纯化。反相UPLC-PDA：线性梯度为在2分钟内从0至100％MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.89min。产率：96％，[M+H]exp +：493.5Da。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.81(d,J＝9.2Hz,1H),7.45(d,J＝2.5Hz,1H),7.25-7.20(m,1H),6.91-6.85(m,1H),5.32(d,J＝16.3,1H),4.86(d,J＝1Hz,6H),3.85(s,1H),2.73(q,J＝7.7Hz,2H),1.60(s,1H),1.57-1.41(m,3H),1,21(s,10H),0.99(t,J＝7.7Hz,3H),0.61(t,J＝7.3Hz,3H)。
实施例2.(S)-9-((叔丁氧基羰基)氧基)-4,11-二乙基-3,14-二氧代-3,4,12,14-
四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基5-叠氮戊酸酯的制备
在圆底烧瓶中，用N2吹扫400mg(S)-(4,11-二乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸叔丁酯(实施例1)、1.6当量的5-叠氮基-戊酸(193mg)，之后将其溶解于无水DCM中。将混合物冷却至0℃。然后添加1.4当量的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(218mg)，并且将混合物在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。混合物用饱和NaHCO3 x3、HCl(0,1N)x2和盐水洗涤。然后将有机层用MgSO4干燥并在真空下除去。化合物未经进一步纯化即使用。[M+H]exp +：618.36Da。
实施例3.(S)-4,11-二乙基-9-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并
[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基5-叠氮基戊酸酯的制备(用叠氮化物修饰SN38，作
为实施例1-3的结果)
在圆底烧瓶中，将1.5g(S)-9-((叔丁氧基羰基)氧基)-4,11-二乙基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基5-叠氮基戊酸酯(实施例2)在50ml HCl(4N，在二氧六环中)中在室温下搅拌2小时。然后，在真空下除去溶剂，并且用二氧化硅，使用(DCM/MeOH(10％))纯化粗混合物，纯度高于95％。实施例1的总产率：8％，[M+H]+：518.58Da。反相UPLC-PDA：线性梯度为在2min内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.819min。[M+H]exp +：518.58Da。1H-NMR(400MHz,氯仿-d)δ1.00(t,3H),1.38(t,3H),1.65(m,2H),1.69(m,2H),2.20(m,2H),2.56(m,2H),3.13(q,3H),3.27(td,2H),5.20(s,2H),5.39-5.72(dd,2H),7.42(d,1H),7.48(s,1H),7.62(dd,1H),8.45(d,1H)。
实施例4.(S)-9-((叔丁氧基羰基)氧基)-4,11-二乙基-3,14-二氧代-3,4,12,14-
四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基叔丁基琥珀酸酯的制备
将1mmol来自实施例1的(S)-叔丁基(4,11-二乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)和1.5当量的琥珀酸单叔丁酯添加到圆底烧瓶中并用N2吹扫。将试剂溶解在20ml无水DCM中并在0℃下冷却。然后添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，并且将混合物在0℃下搅拌1小时，并且在室温下搅拌过夜。反应混合物用饱和NaHCO3 x3、HCl(0,1N)x2和盐水洗涤。然后用MgSO4干燥，蒸发挥发物并干燥。化合物未经进一步纯化即使用。产率72％。1H-NMR(400MHz,氯仿-d)δ0.92(t,3H),1.30(s,9H),1.33(m,3H),1.38(q,2H),1.42(s,2H),1.55(s,9H),2.14(ddq,2H),2.49(td,2H),2.69(m,2H),2.86(dd,2H),3.09(m,2H),5.20(s,2H),5.32(d,2H),5.61(d,2H)。
实施例5：(S)-4-((4,11-二乙基-9-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃
并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)氧基)-4-氧代丁酸的制备(用琥珀酸修饰
SN38，作为实施例4和5的结果)
在圆底烧瓶中，将(S)-9-((叔丁氧基羰基)氧基)-4,11-二乙基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基叔丁基琥珀酸酯(实施例4)在20ml HCl(4N，在二氧六环中)中在室温下搅拌2小时。然后，蒸发溶剂并用梯度0-50的Teledyne-ISCO纯化粗混合物。获得产率32％并且纯度高于95％的所需化合物。产率32％。反相UPLC-PDA：线性梯度为在2分钟内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEHC18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.498min。[M+H]exp +：491.27Da.1H-NMR(400MHz,氯仿-d)δ1.02(t,3H),1.39(t,3H),2.22(m,2H),2.61(t,2H),2.84(m,2H),3.16(q,2H),5.27(s,2H),5.45(d,2H),5.60(d,2H),7.33(s,1H),7.42(dq,1H),8.03(d,1H)。
炔-叠氮化物环加成的方法：使用S.F.M.van Dongen等人.；BioconjugateChem.2009,第20卷,第20-23页中所述的方案，在溶液中进行炔-叠氮化物环加成(Click反应)偶联。
此反应是遵循lumiprobe(https://www.lumiprobe.com/protocols/click-chemistry-dna-labeling)中所述的程序，在没有微波的情况下进行的。但是，此反应需要约2天才完成。Cu与配体THTPA一起使用。由于SN38-N3不溶于H2O，因此仅使用DMF而不是缓冲液和DMSO进行反应，因为它不溶于水，甚至不溶于混合物(水/DMSO)。
替代地，炔-TTDS-DapKAPETALD与SN38-N3的炔-叠氮化物环加成(Click反应)使用微波进行：向微波小瓶中添加10ml SN38-N3(1.5当量)、炔-TTDS-DapKAPETALD(1当量)、CuTHTPA(0.15当量)和抗坏血酸钠(0.3当量)并将其溶解在3ml DMF中。在整个反应期间，将混合物在MW(Discover SP MW)辅助的情况下，在30℃下搅拌2至4小时。用半制备型HPLC(C18)纯化粗混合物。
炔-叠氮化物环加成的试剂的制备(Click化学)：在55％ DMSO中的100mM酮(II)-THPTA储备液：将50mg硫酸铜(II)五水合物溶解在1mL蒸馏水中，并将116mg三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)配体溶解在1.1mL DMSO中。然后，将两种溶液混合。5mM抗坏血酸储备液：将18mg抗坏血酸溶解在20mL蒸馏水中。
产品的纯化和表征的一般方法：粗品通过半制备型规模的RP-HPLC纯化，并且通过UPLC(Acquity high-class系统(PDA测器、样品管理器FNT和四元溶剂管理器、Acquity BEHC18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂。在所有情况下，都使用2min线性梯度)和UPLC-MS光谱法(Waters high class(PDA检测器、样品管理器FNT和四元溶剂管理器)，其联接到电喷雾离子源ESI-MS Micromass ZQ并使用MassLynx 4.1软件(Waters，Milford，MA)。使用BEH C18色谱柱(50x 2.1mm x 1.7μm，Waters)。流速为0.6mL/min，并且将MeCN(0.07％甲酸)和H2O(0.1％甲酸)用作溶剂。用正电离分析样品：离子喷射电压为30V，并且毛细管温度为1kV)来表征。通过质谱仪获得精确质量：LTQ-FT Ultra(Thermo Scientific)，以直接注入(自动纳米电喷雾)的方式引入样品。NanoMate(Advion BioSciences,Ithaca,NY,USA)使用一次性导电吸头从384孔板(蛋白质Lobind)吸取样品，并且通过nanoESI芯片(由400个喷嘴组成，呈20x 20阵列)注入质谱仪。喷射电压为1.70kV，并且递送压力为0.50psi；电离是NanoESI，正电离。所有肽均以高于95％的纯度获得。
实施例6.在Dap侧链氨基与Asp侧链羧酸之间具有酰胺键的己炔酸-TTDS-Dap-
Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH2(己炔酸-TTDS-SEQ ID NO:7)的制备。
对于第一个保护的氨基酸与树脂的手动偶联，使用Fmoc-Asp(OAl)-OH(118.5mg)应用偶联方法4。使用偶联方法4如下顺序地偶联后续氨基酸：
在DMF/DCM(1:1)中使用46μL DIC和43mg Oxyma。使混合物在间歇手动搅拌下反应45min。每次偶联之后，使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)(2×5min)额外处理两次，以确保从仲胺(脯氨酸)中去除Fmoc基团。遵循环化方法2在树脂上进行环化：使用30s处理和两次10分钟的处理，用20％哌啶的DMF溶液(v/v)去除Fmoc基团。使用Boc2O(3当量，1000μmol，56mg)和DIEA(30当量，3000μmol，240μL)，用Boc保护基保护N-末端胺。OAl和Alloc基团首先通过添加在DCM中的四(三苯基膦)钯(0)(0.1当量，10μM，12mg)，苯基硅烷(10当量，1000μmol，123mg)来脱保护(3x 15min)。树脂用含0.02M二乙基氨基甲酸钠的DCM洗涤(3x 5min)。然后通过添加PyBOP(4当量，400μmol，208mg)、HOAt(12当量，1.2mmol，163mg)、DMF(1-3mL/g树脂)和DIEA(12当量，1.2mmol，204μL)实现Dap的氨基和天冬氨酸的羧酸酯基的偶联。偶联进行1.5h并重复过夜。
Fmoc-TTDS-OH的偶联：Fmoc-TTDS-OH(2当量，200μmol，108.53mg)的偶联是通过在DCM中的4当量的DIC(400μmol，61μL)和4当量的HOBt(400μmol，54mg)在2h内实现的。之后使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。
5-己炔酸的偶联：为了将5-己炔酸与固定在树脂上的肽偶联，使用了以下方案：将在DMF(1-3mL/g树脂)中的己炔酸(4当量，400μmol，45mg)，PyBOP(4当量，400μmol，208mg)和HOAt(12当量，1.2mmol，163mg)顺序添加到树脂中，然后添加12当量的DIEA(1.2mmol，204μL)。使混合物在间歇手动搅拌下反应1.5h。通过抽吸去除溶剂，用DMF(5x 30s)和DCM(5x30s)洗涤树脂。在相同条件下重复偶联。使用Kaiser比色测定监测偶联程度。
然后将肽切割并冻干。产物表征。反相UPLC：线性梯度为在2min内从20至60％MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：0.939min。UPLC-MS[M+H]exp +：1308.15Da；产率(合成和纯化)：7.5％。
实施例7：式(Ia)化合物SN38-接头A-MiniAp4的制备
从如实施例6中所制备的己炔酸-TTDS-MiniAp4开始，并且使用如实施例3中所制备的SN38-N3，遵循以下方案以获得式(Ia)化合物，其还命名为SN38-接头A-MiniAp4：
向微波小瓶中添加10ml 1.5当量的(S)-4,11-二乙基-9-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基5-叠氮基戊酸酯、1当量的炔-TTDS-DapKAPETALD、0.15当量的CuTHPTA和0.3当量的抗坏血酸钠，并将其溶解在3mlDMF中。在整个反应期间，将混合物在MW(CEM discover SP MW)辅助的情况下，在30℃下搅拌2至4小时。通过半制备型规模的RP-HPLC纯化粗品。获得纯度高于95％的化合物。产物表征：反相UPLC-PDA：线性梯度为在2分钟内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEHC18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.462min。UPLC-MS[M+H]exp +：1824.76Da；产率(合成和纯化)：30％。
比较例1：SN38-接头A-THRre
在此比较例中，使用的氨基酸全部为D-氨基酸。对于第一个保护的氨基酸与树脂的手动偶联，使用Fmoc-D-Thr(tBu)-OH(159mg)应用偶联方法4。使用偶联方法4如下顺序地偶联后续氨基酸：
在DMF/DCM(1:1)中使用46μL DIC和43mg Oxyma。使混合物在间歇手动搅拌下反应45min。每次偶联之后，使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)(2×5min)额外处理两次，以确保从仲胺(脯氨酸)中去除Fmoc基团。
Fmoc-TTDS-OH的偶联：Fmoc-TTDS-OH(2当量，200μmol，108.53mg)的偶联是通过在DCM中的4当量的DIC(400μmol，61μL)和4当量的HOBt(400μmol，54mg)在2h内实现的。之后使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。
5-己炔酸的偶联：为了将5-己炔酸与固定在树脂上的肽偶联，使用了以下方案：将在DMF(1-3mL/g树脂)中的己炔酸(4当量，400μmol，45mg)，PyBOP(4当量，400μmol，208mg)和HOAt(12当量，1.2mmol，163mg)顺序添加到树脂中，然后添加12当量的DIEA(1.2mmol，204μL)。使混合物在间歇手动搅拌下反应1.5h。通过抽吸去除溶剂，用DMF(5x 30s)和DCM(5x30s)洗涤树脂。在相同条件下重复偶联。使用Kaiser比色测定监测偶联程度。然后将肽切割并冻干。
使用此己炔酸-TTDS-THRre，并且使用如实施例3中所制备的SN38-N3，遵循以下方案以获得SN38-接头A-THRre：向微波小瓶中添加10ml 1.5当量的(S)-4,11-二乙基-9-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基5-叠氮基戊酸酯、1当量的炔-TTDS-THRre、0.15当量的CuTHPTA和0.3当量的抗坏血酸钠，并将其溶解在3ml DMF中。在整个反应期间，将混合物在MW(CEM discover SP MW)辅助的情况下，在30℃下搅拌2至4小时。通过半制备型规模的RP-HPLC纯化粗品。获得纯度高于95％的化合物。产物表征：反相UPLC-PDA：线性梯度为在2分钟内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.597min。UPLC-MS[M+H]exp +：2403.86Da。
比较例2：SN38-接头B–THRre
在此比较例中，使用的氨基酸全部为D-氨基酸。对于第一个保护的氨基酸与树脂的手动偶联，使用Fmoc-D-Thr(tBu)-OH(159mg)应用偶联方法4。使用偶联方法4如下顺序地偶联后续氨基酸：
在DMF/DCM(1:1)中使用46μL DIC和43mg Oxyma。使混合物在间歇手动搅拌下反应45min。每次偶联之后，使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)(2×5min)额外处理两次，以确保从仲胺(脯氨酸)中去除Fmoc基团。
然后将肽切割并冻干。使用此THRre，并且使用如实施例5中所制备的SN38-琥珀酸，遵循以下方案以获得SN38-接头B-THRre：在圆底烧瓶中，在N2气氛和0℃下，添加1.5当量的(S)-4-((4,11-二乙基-9-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)氧基)-4-氧代丁酸、1.2当量的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和1.2当量的N-羟基苯并三唑(HOBt)，然后添加无水DMF，并且搅拌10min。然后添加THRre，并且在室温下反应过夜。通过半制备型规模的RP-HPLC纯化粗品。获得纯度高于95％的化合物。产物表征：反相UPLC-PDA：线性梯度为在2分钟内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.543min。UPLC-MS[M+2H]exp +2：982.32Da。
实施例8a：水中溶解度的评估。
将25mg SN38-接头A-MiniAp4溶解在H2O中，显示出完全透明的溶液。这意味着，SN38-接头A-MiniAp4在水中的溶解度高于5mg/mL，大于针对SN38描述的水中溶解度的400倍(Mol.Pharmaceutics,2016,13,379-390)。
G2B-001线状(Ib)、G2B-003(Ic)、G2B-004(Id)和G2B-005(Ie)在1mg/mL下显示良好的水中溶解度。
实施例8b：SN38-接头A-MiniAp4的比浊溶解度的评估。
将SN38-接头A-MiniAp4化合物(10mM，在DMSO中)连续稀释以提供在DMSO中的0.1、0.3、1和3mM的溶液。然后将每种测试化合物浓度在缓冲液(0.01M磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)中进一步以1:100稀释，使得最终DMSO浓度为1％，并且最终测试化合物浓度为1、3、10、30和100μM。实验在37℃下进行，并且每个浓度在7个重复孔中孵育。将板在37℃下孵育2h，之后在620nm处测量吸光度。将尼卡地平和芘纳入作为对照化合物。尼卡地平的溶解度是pH依赖性的，而芘的溶解度与pH无关。根据使吸光度增加到高于载体对照(缓冲液中的1％ DMSO)的测试化合物的浓度来估计溶解度。参见表2。
表2.比浊法水性溶解度数据。
正如预期的那样，在高达100微摩尔的G2B-001中没有发现溶解度问题。
实施例9.化合物(Ia)的抗肿瘤活性：SN38-接头A-MiniAp4(也称为G2B-001)针对
抗癌细胞系：弥漫内生性脑桥胶质瘤、成人神经胶质瘤和小儿实体瘤视网膜母细胞瘤、尤文
肉瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤。
本发明人将新化合物(Ia)SN38-接头A-MIniAp4(也称为G2B-001)的活性与密切相关的药物之一SN38和伊立替康进行了比较。
癌细胞系获自在Hospital Sant Joan de Deu(Barcelona,Spain)保藏的资源库。这些实验中使用的癌细胞系包括以下癌症类型：成人神经胶质瘤(U373和U87细胞系)、包括弥漫内生性脑桥胶质瘤(HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-011)和小儿高级神经胶质瘤(HSJD-GBM-001)的小儿神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤(HSJD-RBT-5、HSJD-RBT-7和HSJD-RBT-14)、尤文肉瘤(A673)、横纹肌肉瘤(Rd和RH4)和神经母细胞瘤(LAN-1和SK-N-JD细胞系和HSJD-NB-004、HSJD-NB-005和HSJD-NB-016患者来源的细胞模型)。简而言之，在96孔板中培养了3000至30,000个癌细胞，并且24h后将细胞暴露于化合物SN38-接头A-MiniAp4(Ia)(浓度范围1-0.00000001μM)、SN38(浓度范围1-0.00000001μM)或伊立替康(浓度范围100-0.000001μM)。为了将药物添加到培养的细胞中，从在水中浓度为1mg/mL的储备溶液制备在培养基中的SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和伊立替康。从在DMSO中浓度为1mg/mL的储备溶液制备在培养基中的SN38。使用四唑化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑](MTS测定；Promega,Fitchburg,WI)以在与药物一起孵育72h后确定细胞活力。使用Graphpad Prism 8软件(La Jolla,CA)计算导致细胞增殖减少50％(IC50和95％置信区间)所需的药物浓度。建立以下的活性曲线：成人神经胶质瘤细胞系U87(图1)和U373(图2)；小儿神经胶质瘤，包括DIPG模型HSJD-DIPG-007(图3)和HSJD-DIPG-011(图4)；以及小儿高级神经胶质瘤模型HSJD-GBM-001(图5)；视网膜母细胞瘤模型HSJD-RBT-5(图6)、HSJD-RBT-7(图7)和HSJD-RBT-14(图8)；尤文肉瘤细胞系A673(图9)；横纹肌肉瘤细胞系Rd(图10)和RH4(图11)；神经母细胞瘤细胞系LAN-1(图12)和SK-N-JD(图13)；和神经母细胞瘤患者来源的细胞模型HSJD-NB-004(图14)、HSJD-NB-005(图15)和HSJD-NB-016(图16)。
确定的IC50值在表3中。
表3.化合物SN38-接头A-MiniAp4(Ia)、SN38和伊立替康针对癌细胞系的IC50值。
针对SN38-接头A-MiniAp4(Ia)获得的IC50值显著低于药物伊立替康(P<0.0001；配对ANOVA检验)，如图17所示。
实施例10.SN38-接头A-MiniAp4(Ia)在单次和重复静脉注射中的体内耐受性。
为了评估伊立替康和SN38-接头A-MiniAp4(Ia)(也称为G2B-001)在无胸腺裸小鼠(10周龄；每组8只小鼠)中的毒性，首先评估通过静脉内注射研究了SN38-接头A-MiniAp4(Ia)的最大耐受剂量(MTD)。以200、500和1000mg/kg的剂量水平注射三只小鼠，并在接下来的14天期间观察包括死亡或体重减轻在内的症状。MTD确定为200mg/kg。与未治疗的对照动物相比，在此剂量水平下，小鼠存活下来并且在接下来的14天期间没有表现出即刻痛苦症状或显著的体重减轻(图18)。
在单次静脉内注射确定SN38-接头A-MiniAp4(Ia)的MTD后，我们比较了在临床相关的多剂量方案下用伊立替康以及在等摩尔剂量下的SN38-接头A-MiniAp4(Ia)治疗的小鼠的平均体重。简言之，通过腹膜内(i.p.)途径用伊立替康10mg/kg(15剂，在第1-5、8-12和29-33天)或静脉注射(i.v.)用SN38-接头A-MiniAp4(Ia)30mg/kg(9剂，第1、3、5、8、10、12、29、31、33天)治疗小鼠。此方案被认为是在小鼠中i.v.注射的最大可行次数。对照小鼠在第1-5、8-12和29-33天用生理盐水i.p.治疗。
测量小鼠体重直到第40天，并且在图19中表示每组的平均值和SD值。与对照相比，作为SN38-接头A-MiniAp4(Ia)治疗的结果，小鼠没有显著的体重减轻。SN38-接头A-MiniAp4(Ia)治疗的小鼠的体重与用临床相关剂量的伊立替康治疗的小鼠的体重相似。
实施例11：SN38、SN38与MiniAp4(SN38-接头A-MiniAp4，实施例7)和SN38-接头B-
THRre(比较例2)的缀合物的比较活性。
本发明人比较了新化合物SN38与MiniAp4的缀合物(SN38-接头A-MiniAp4，实施例7，也称为G2B-001)和SN38-接头B-THRre(比较例2)的活性。原始化合物SN38用作参考。这些实验中所用的癌细胞系是小儿神经胶质瘤、包括弥漫内生性脑桥胶质瘤HSJD-DIPG-007和小儿高级神经胶质瘤HSJD-GBM-001。简言之，在96孔板中培养了3000个癌细胞，并且24h后将细胞暴露于化合物(Ia)(浓度范围1-0.00000001μM)、SN38-接头B-THRre(浓度范围1-0.00000001μM)和SN38(浓度范围1-0.00000001μM)。为了将药物添加到培养的细胞中，从在水中浓度为1mg/mL的储备溶液制备在培养基中的SN38-接头A-MiniAp4(Ia)和SN38-接头B-THRre。从在DMSO中浓度为1mg/mL的储备溶液制备在培养基中的SN38。使用MTS测定来确定与药物一起孵育72h后的细胞活力。使用Graphpad Prism 8软件(La Jolla,CA)计算导致细胞增殖减少50％(IC50和95％置信区间)所需的药物浓度。建立细胞HSJD-DIPG-007(图20)和HSJD-GBM-001(图21)的活性曲线。确定的IC50值在表4中。如可以观察到的那样，SN38与THRre的缀合导致活性低于与MiniAp4的缀合。
表4.化合物的IC50值
实施例12.化合物SN38-接头A-MiniAp4(Ia)、比较例1(SN38-接头A-THRre)和比较
例2(SN38-接头B-THRre)的比较活性(肽以及肽和接头二者的影响)。
由于在前面的实施例11中，化合物(Ia)和比较例2(SN38-接头B-THRre)由不同大小的接头构成，所以本发明人将这两种化合物的活性与具有化合物(Ia)和比较例1相同接头的比较例1(SN38-接头A-THRre)的那一种化合物进行比较。
这些实验中所用的癌细胞系是小儿神经胶质瘤、包括弥漫内生性脑桥胶质瘤HSJD-DIPG-007和小儿高级神经胶质瘤HSJD-GBM-001。简言之，在96孔板中培养了3000个癌细胞，并且24h后将细胞暴露于化合物(Ia)、比较例1和比较例2(它们各自的浓度范围1-0.001μM)。所有化合物均是在培养基中，从在水中浓度为1mg/mL的储备溶液制备。使用MTS测定来确定与药物一起孵育72h后的细胞活力。使用Graphpad Prism 8软件(La Jolla,CA)计算导致细胞增殖减少50％(IC50和95％置信区间)所需的药物浓度。建立细胞HSJD-DIPG-007(图22)和HSJD-GBM-001(图23)的活性曲线。比较例1(SN38-接头A-THRre)和比较例2(SN38-接头B-THRre)呈现出低于化合物(Ia)的活性。因此，与比较例1和比较例2相比，化合物(Ia)的惊人活性归因于肽MiniAp4，但也归因于空间接头。确定的IC50值在表5中。
表5.化合物(Ia)、比较例3和比较例4针对癌细胞系的IC50值(μM)。
实施例13.SN38-接头A-MiniAp4在体外在37℃下人血清中相对于时间的稳定性。
关于SN38-接头A-MiniAp4(Ia)(实施例7)在人血清中的稳定性，将其以在缓冲液HBSS中的浓度200μM，在37℃下，在存在90％人血清的情况下孵育。在一定时间范围内，收集100μL等分试样，向其中添加400μL冷甲醇以使血清蛋白沉淀。将样品在4℃下以3000rpm离心30min，过滤，并通过UPLC-PDA和UPLC-MS进行分析以确定SN38-接头A-MiniAp4(Ia)的降解程度。在24h内没有观察到显著的降解，这意味着半衰期比这个时间范围更长(图24)。
实施例14：SN38-接头A-MiniAp4(G2B-001)(Ia)在体外在37℃下大鼠、小鼠、狗和
人血浆中相对于时间的稳定性。
为了评估SN38-接头A-MiniAp4(Ia)(实施例7)在37℃下在人、小鼠、狗和大鼠血浆中的稳定性，对于每个物种，在每个时间点(0h、1h、4h、8h和24h)一式三份地以200μM在血浆样品中制备化合物。一旦孵育完成，立即通过添加冷甲醇(比率4:1，甲醇:血浆)使血浆蛋白沉淀，并将管震荡几秒钟(涡流)。将样品在4℃下以3,000rpm离心30分钟，收集上清液，转移至进样板并注入LC-MS系统中。
通过比较加标有分析物并且处理的生物样品中的分析物响应与加标有分析物并且处理的甲醇样品中的响应来确定化合物回收率。
使用来自未处理的志愿者/动物的空白血浆进行血浆稳定性测定。将K2-EDTA用作抗凝剂。所用的人空白血浆获自Hospital Sant Pau，所用的小鼠空白血浆获自Janvier，所用的狗空白血浆获自Isoquimen，并且所用的大鼠空白血浆获自Draconis Pharma。
在人、小鼠、狗和大鼠血浆中的200μM的G2B-001的半衰期高于24小时，但化合物G2B-001在小鼠和狗血浆中的半衰期为8-24h。(图25)。
表6.在人、小鼠、狗和大鼠血浆中24h之后G2B-001的回收率百分比。
实施例15.在Dap侧链氨基与Asp侧链羧酸之间不具有酰胺键的己炔酸-TTDS-Dap- Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH2(己炔酸-TTDS-SEQ ID NO:14)线状的制备。 DapKAPETALD(SEQ ID NO:14)，即线性肽。
对于第一个保护的氨基酸与树脂的手动偶联，使用Fmoc-Asp(OAl)-OH(118.5mg)应用偶联方法4。使用偶联方法4如下顺序地偶联后续氨基酸：
在DMF/DCM(1:1)中使用46μL DIC和43mg Oxyma。使混合物在间歇手动搅拌下反应45min。每次偶联之后，使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。用DBU、甲苯、哌啶、DMF(5％、5％、20％、70％)(2×5min)额外处理两次，以确保从仲胺(脯氨酸)中去除Fmoc基团。
Fmoc-TTDS-OH的偶联：Fmoc-TTDS-OH(2当量，200μmol，108.53mg)的偶联是通过在DCM中的4当量的DIC(400μmol，61μL)和4当量的HOBt(400μmol，54mg)在2h内实现的。之后使用含20％(v/v)哌啶的DMF，处理30s，然后进行两次处理，每次10分钟来去除9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。
5-己炔酸的偶联：为了将5-己炔酸与固定在树脂上的肽偶联，使用了以下方案：将在DMF(1-3mL/g树脂)中的己炔酸(4当量，400μmol，45mg)，PyBOP(4当量，400μmol，208mg)和HOAt(12当量，1.2mmol，163mg)顺序添加到树脂中，然后添加12当量的DIEA(1.2mmol，204μL)。使混合物在间歇手动搅拌下反应1.5h。通过抽吸去除溶剂，用DMF(5x 30s)和DCM(5x30s)洗涤树脂。在相同条件下重复偶联。使用Kaiser比色测定监测偶联程度。
OAl和Alloc基团通过添加在DCM中的四(三苯基膦)钯(0)(0.1当量，10μM，12mg)、苯基硅烷(10当量，1000μmol，123mg)来脱保护(3x 15min)。树脂用含0.02M二乙基氨基甲酸钠的DCM洗涤(3x 5min)。
然后将肽切割并冻干。产物表征。反相HPLC：线性梯度为在30min内从10至60％MeCN的H2O溶液，使用Xbridge 25cm 3.5μm柱，1mL/min，并且将MeCN(0.1％ TFA)和H2O(0.1％ TFA)用作溶剂；保留时间：11.526min。产率(合成和纯化)：9％。
实施例16：在Dap侧链氨基与Asp侧链羧酸之间没有酰胺键的式(Ib)化合物G2B-
001线状的制备。
从如实施例15中所制备的己炔酸-TTDS-MiniAp4线状开始，并且使用如实施例3中所制备的SN38-N3，遵循以下方案以获得式(Ib)化合物，其还命名为G2B-001线状：
向微波小瓶中添加10ml 1.5当量的(S)-4,11-二乙基-9-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基5-叠氮基戊酸酯、1当量的炔-TTDS-DapKAPETALD线状、0.15当量的CuTHPTA和0.3当量的抗坏血酸钠，并将其溶解在3ml DMF中。在整个反应期间，将混合物在MW(CEM discover SP MW)辅助的情况下，在30℃下搅拌2至4小时。通过半制备型规模的RP-HPLC纯化粗品。获得纯度高于95％的化合物。产物表征：反相HPLC-MS：线性梯度为在7分钟内从0至80％ MeCN的H2O溶液，使用Luna 3μmC18(2)100A 50x 2.1mm柱，0.85mL/min，并且将MeCN(0.1％甲酸)和H2O(0.1％甲酸)用作溶剂；保留时间：5.08min。UPLC-MS[M+H]exp +：1845.10Da；产率(合成和纯化)：22％。
实施例17.N3-Pen-SN38的制备
在双颈圆底烧瓶中，添加1当量的SN-38(600mg)并且以100ml/g溶解于无水DCM(60ml)中。观察到混浊溶液。将此反应混合物冷却至0-2℃，并且添加6当量DIEA(2ml)并搅拌15分钟。15min之后，分批添加3当量的N3-Pen-Cl(700mg)[溶解于500μL无水DCM中]。冷却15min，然后在室温下继续搅拌。通过HPLC检查反应进程。当起始材料低于3％时，将反应进行后处理。
反应混合物的初始体积为约45ml，使用无水DCM进一步补充至300ml。用蒸馏水(反应混合物最终体积的20体积％)3×3min×60ml萃取三次。使用硫酸钠(Na2SO4)干燥DCM层30min并在旋转蒸发器上蒸发。将获得的固体用80:20己烷:乙醚处理两次并在干燥器中保持干燥。处理后的产量，730mg。产物表征。反相HPLC：线性梯度为在30min内从10至90％MeCN的H2O溶液，使用填充有用于色谱法R的C-18硅胶(5μm)的SS柱250×4.6mm，1mL/min，并且将MeCN(0.1％ TFA)和H2O(0.1％ TFA)用作溶剂；保留时间：19.730min。
观察到的质量＝518.20Da，计算出的质量＝517.19Da。
实施例18.式(Ic)化合物G2B-003的制备
从如实施例6中所制备的己炔酸-TTDS-MiniAp4开始，并且使用如实施例17中所制备的N3-Pen-SN38，遵循以下方案以获得式(Ic)化合物，其还命名为G2B-003。
向小瓶中添加10ml 1.5当量的N3-Pen-SN38、1当量的己炔酸-TTDS-MiniAp4、0.15当量的CuTHPTA和0.3当量的抗坏血酸钠，并将其溶解在3ml DMF中。
在整个反应期间，将混合物在微波(CEM discover SP MW)辅助的情况下，在30℃下搅拌2至4小时。通过半制备型规模的RP-HPLC纯化粗品。获得纯度高于95％的化合物。产物表征：反相HPLC：线性梯度为在30分钟从20至70％MeCN的H2O溶液，使用Xbridge 25cm3.5μm柱，1mL/min，并且将MeCN(0.1％TFA)和H2O(0.1％ TFA)用作溶剂；保留时间：12.00min。UPLC-MS[M+H]exp +：1826.15Da；产率(合成和纯化)：17％。
实施例19.SN38-O-CO-NH-Gly-COOH的制备
将甘氨酸-COOBut(1当量)和DMAP(2当量)在无水DCM(15mL)中的溶液滴加到双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.3当量)在无水DCM(15mL)中的溶液中，并且将所得溶液在50℃下搅拌过夜。然后将反应混合物稀释在DCM(150mL)中，并用0.5N HCl(100mL)洗涤。水层用DCM(5×100mL)洗涤，并且收集所有的有机级分，经MgSO4干燥并过滤。减压蒸发溶剂，并且通过快速色谱法(己烷:DCM:Et2O：5:4:1)纯化残余物。
将所得PNP-Gly-COOBut(1当量)与SN38(1.2当量)在存在DMAP(2当量)的情况下于无水DCM中反应。将反应在50℃下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且通过快速色谱法纯化残余物。
通过用TFA:DCM:TIS(40:40:20)处理SN38-O-CO-NH-Gly-COOBut 6h来去除叔丁酯基团。之后蒸发溶剂。添加甲苯两次以去除痕量的TFA。不进行进一步纯化。
实施例20.Boc-Val-Cit-PAB-SN38的制备
在圆底烧瓶中，将1当量的7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)、1当量的Boc-Val-Cit-PAB-PNP(来自iris biotech)、2当量的DIEA和催化性DMAP在室温下于无水DMF中搅拌16h。然后，反应混合物用AcOEt稀释并用HCl(0.5M)(×3)和盐水(×4)洗涤。然后将其用MgSO4干燥，蒸发挥发物，粗混合物通过二氧化硅色谱法(AcOEt:MeOH；20:1；15:1:9:1)进行纯化。获得产率为52％并且纯度高于90％的所需化合物。产率52％。反相UPLC-PDA：线性梯度为在2分钟内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50x 2mm x 1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.42min。[M+H]exp +：898.4Da。
实施例21.H2N-Val-Cit.PAB-SN38的制备
在圆底烧瓶中，将1当量的如实施例20中所制备的Boc-Val-Cit-PAB-SN38在DCM:TFA:H20(44.75:49.75:0.5)的混合物中搅拌5分钟。之后蒸发溶剂。添加甲苯两次以去除痕量的TFA。不进行进一步纯化。
实施例22.G2B-004(Id)的制备
从二甘醇酸-MiniAp4(使用上述标准方法偶联方法4制备)和2当量的H2N-Val-Cit-PAB-SN38(如实施例21中所制备)开始，使用溶解于DMF(1-3mL/g树脂)中的PyBOP(4当量)、HOAt(12当量)，然后添加DIEA(12当量)来制备G2B-004。使混合物在间歇手动搅拌下反应1h。通过抽吸去除溶剂并且用DMF(5×30s)和DCM(5×30s)洗涤树脂。偶联反应进行两次(1h和过夜)。
然后将G2B-004切割并冻干。产物表征。反相UPLC：线性梯度为在2min内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50×2mm×1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.17min。UPLC-MS[M+H]exp +：1807.84Da。产率(合成和纯化)：21％。
实施例23.G2B-005(Ie)的制备
Nval-Pro-Gly-MiniAp4使用上述标准方法(偶联方法4)制备。
从Nval-Pro-Gly-MiniAp4和2当量的SN38-O-CO-NH-Gly-OH(如实施例19中所制备)开始，使用溶解于DMF(1-3mL/g树脂)中的PyBOP(4当量)、HOAt(12当量)，然后添加DIEA(12当量)来制备G2B-005。使混合物在间歇手动搅拌下反应1h。通过抽吸去除溶剂并且用DMF(5×30s)和DCM(5×30s)洗涤树脂。偶联反应进行两次(1h和过夜)。
然后将G2B-005切割并冻干。产物表征。反相UPLC：线性梯度为在2min内从0至100％ MeCN的H2O溶液，使用Acquity BEH C18(50×2mm×1.7μm)柱，0.61mL/min，并且将MeCN(0.036％ TFA)和H2O(0.045％ TFA)用作溶剂；保留时间：1.51min。UPLC-MS[M+H]exp +：1640.77Da。产率(合成和纯化)：18％。
实施例24.G2B-001线状(Ib)在体外在37℃下人血浆中相对于时间的稳定性
为了评估G2B-001线状(Ib)(实施例16)在37℃下在人血浆中的稳定性，在每个时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h)一式三份地以200μM在血浆样品中制备化合物。一旦孵育完成，立即通过添加冷甲醇(比率4:1，甲醇:血浆)使血浆蛋白沉淀，并将管震荡几秒钟(涡流)。将样品在4℃下以3,000rpm离心30分钟，收集上清液，转移至进样板并注入LC-MS系统中。通过比较加标有分析物并且处理的生物样品中的分析物响应与加标有分析物并且处理的甲醇样品中的响应来确定化合物回收率。
使用来自未处理的志愿者的空白血浆进行血浆稳定性测定。将K2-EDTA用作抗凝剂。所用的人空白血浆获自Hospital Sant Pau。
以200μM在人中的G2B-001线状(Ib)的半衰期高于24小时。
(图26)。
表7.在人血浆中24h之后G2B-001线状(Ib)的回收率百分比。
| G2B001线状 | ％回收率 |
| 人 | 69.9 |
实施例25.命名为G2B-001线状的新化合物(Ib)针对癌细胞系弥漫内生性脑桥胶
质瘤的抗肿瘤活性
本发明人将新化合物(Ib)G2B-001线状(实施例16)的活性与密切相关的药物之一G2B-001(Ia)和SN38进行了比较。
这些实验中使用的癌细胞系是HSJD-DIPG-007。简言之，在96孔板中培养了3000个癌细胞，并且24h后将细胞暴露于化合物G2B-001(Ia)、化合物G2B-001线状(Ib)和SN-38(它们各自的浓度范围1-0.001μM)。使用MTS测定来确定与药物一起孵育72h后的细胞活力。G2B-001(Ia)和G2B-001线状(Ib)显示出相似的活性(图27)。因此，在对化合物G2B-001(Ib)进行化学修饰之后，化合物G2B-001(Ia)的体外活性得以保持。作为实验的内部参考，SN-38显示出与实施例9中报告的活性类似的活性。确定的IC50值在表8中。
表8.化合物G2B-001(Ia)、G2B-001线状(Ib)和SN38的IC50值(μM)。
| 细胞系 | G2B-001(Ia) | G2B-001(Ib) | SN-38 |
| HSJD-DIPG-007 | 0.0278 | 0.0368 | 0.000739 |
实施例26.G2B-003(Ic)和伊立替康在来源于患者的神经母细胞瘤异种移植物中
的抗肿瘤活性比较。肿瘤模型为HSJD-NB-013。
我们在三只无胸腺裸小鼠的两个侧腹中皮下插入新鲜切除的肿瘤(从一只小鼠获得)。植入后(肿瘤体积范围为100-500mm3)，用通过静脉注射的伊立替康、G2B-003(Ib)或生理盐水溶液(对照)治疗小鼠。一只小鼠在第1、2、3、4、5、8、9、10、11和12天接受10剂10mg/kg的伊立替康。一只小鼠在第1、2、3、4、5和8天接受6剂100mg/kg的G2B-003(Ib)。一只小鼠使用与伊立替康相同的方案接受生理盐水。测量肿瘤体积直到第44天或体积大于1500mm3。伊立替康和G2B-003治疗实现了可测量且持久的抗肿瘤反应(图28)，而对照肿瘤则生长得较快。因此，在此肿瘤模型中，伊立替康和G2B-003(Ic)的体内活性相似。
引用文献列表
专利文献
US8299089B2
WO2015/051307A1
WO2017/113687A2
WO2018/064683A1
WO2015/001015A1
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序列表
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巴塞罗那大学
圣胡安德申医院
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<130> P5482EP00
<150> EP20382854.6
<151> 2020-09-28
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
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<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自由Dpr和Dbu组成的组，并且其通过肽内酰胺键结合至第9位的氨基酸
<220>
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Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Xaa
1 5
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<223> 肽
<220>
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<223> Xaa为与第9位的氨基酸相同的氨基酸，并且其选自半胱氨酸、硒代半胱氨酸和青霉胺
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> 其通过肽内二硫键或二硒键结合至第9位的氨基酸
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为与第15位的氨基酸相同的氨基酸，并且其选自由半胱氨酸、硒代半胱氨酸和青霉胺组成的组
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 其通过肽内二硫键或二硒键结合至第15位的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为与第1位的氨基酸相同的氨基酸，并且其选自由半胱氨酸、硒代半胱氨酸和青霉胺组成的组
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 其通过肽内二硫键或二硒键连接至第1位的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa为与第3位的氨基酸相同的氨基酸，并且其选自由半胱氨酸、硒代半胱氨酸和青霉胺组成的组
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 其通过肽内二硫键或二硒键连接至第3位的氨基酸
<400> 6
Xaa Asn Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Xaa Ala Ala Ala Xaa His
1 5 10 15
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Dpr和Dpu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa选自Glu和Asp
<400> 7
Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Xaa
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa表示Dap，并且其通过肽内酰胺键连接至第9位的氨基酸
<400> 8
Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(9)
<400> 9
Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(9)
<400> 10
Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(9)
<400> 11
Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(9)
<400> 12
Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(11)
<220>
<221> 二硫化物
<222> (3)..(15)
<400> 13
Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Ala Ala Cys His
1 5 10 15
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa意指Dpr
<400> 14
Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp
1 5
Claims (22)
1.一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐，
(Z)-(L)-P-(W)s-(Y)
(I)
其中：
Z为药物活性成分SN38或其药学上可接受的盐的自由基，其中所述药物活性成分SN38具有式(II)，并且其中Z通过所述药学活性成分的两个羟基(a)或(b)中的仅一个独立地连接至接头L；
(a)
L为接头，其为由2至8个双自由基L’构成的双自由基且具有下式：-L’a-(L’b)n-L’c-；
La’为选自由以下组成的组的双自由基：-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-；-C(＝O)-(CH2)r-NH-；-C(＝O)-(CH2)r-S-；-C(＝O)-(CH2)r-O-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-NH-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-S-；-C(＝O)-NH-(CH2)r-O-；-(CH2)r-C(＝O)-；-(CH2)r-NH-；-(CH2)r-S-；-(CH2)r-O-；-Si(R1)(R2)-(CH2)r-NH-；-Si(R1)(R2)-(CH2)r-C(＝O)-；-Si(R1)(R2)-(CH2)r-O-；-Si(R1)(R2)-(CH2)r-S-；-SO2-(CH2)r-NH-；-SO2-(CH2)r-C(＝O)-；-SO2-(CH2)r-O-；-SO2-(CH2)r-S-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-NH-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-C(＝O)-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-O-；-P(＝O)(OR1)-O-(CH2)r-S-；-CH(OH)-(CH2)r-NH-；-CH(OH)-(CH2)r-C(＝O)-；-CH(OH)-(CH2)r-O-；-CH(OH)-(CH2)r-S-；
L8-L11中的任一者中的取代可以处于环的任一位置；
Lb’为独立地选自由以下组成的组的双自由基：-NH-(CH2)r-C(＝O)-；-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-；-S-(CH2)r-C(＝O)-；-O-(CH2)r-C(＝O)-；-NH-(CH2)r-；-C(＝O)-(CH2)r-；-S-(CH2)r-；-O-(CH2)r-；-NH-CH-((CH2)rNH2)-C(＝O)-；-S-CH2-CH(NH2)-C(＝O)-；-(CH2)r-C(＝O)-；-(CH2)r-O-；-(CH2)r-NH-；-(CH2)r-S-；-C(＝O)-(CH2)r-NH-；-C(＝O)-(CH2)r-O-；-C(＝O)-(CH2)r-S-；-NH-(CH2)r-O-；-NH-(CH2)r-NH-；-NH-(CH2)r-S-；及其组合；
Lc’为选自由以下组成的组的双自由基：-NH-(CH2)r-C(＝O)-；-NH-CH-((CH2)rNH2)-C(＝O)-；-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-；-S-(CH2)r-C(＝O)-；-S-CH2-CH(NH2)-C(＝O)-；-O-(CH2)r-C(＝O)-；-(CH2)r-C(＝O)-；
P为选自由以下组成的组的肽的双自由基：
(a)包含氨基酸序列X1KAPETALX2的肽，在X1与X2之间有肽内键，所述肽内键为酰胺键；其中X1选自由Dap和Dab组成的组；并且X2选自由D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)组成的组；即
SEQ ID NO：
(b)长度为12-20个氨基酸残基的肽，其具有至少一个肽内键，所述肽内键为二硫键或二硒键，并且其包含氨基酸序列X3KAPETALX4AAA；在X3与X4之间具有至少一个肽内二硫键或二硒键，其中X3和X4等同并且选自由C(半胱氨酸)、Sec(硒代半胱氨酸)和Pen(青霉胺)组成的组；
SEQ ID NO：2：
(c)长度为9-11个氨基酸残基的肽，其具有至少一个肽内键，所述肽内键为二硫键或二硒键，并且其由选自由在X5与X6之间具有至少一个肽内二硫键或二硒键的X5KAPETALX6、X5KAPETALX6A和X5KAPETALX6AA组成的组的氨基酸序列组成；其中X5和X6等同并且选自由C(半胱氨酸)、Sec(硒代半胱氨酸)和Pen(青霉胺)组成的组；即
SEQ ID NO：3：
SEQ ID NO：4：
SEQ ID NO：5：
(d)具有16个氨基酸残基并且包含在X7与X9之间以及在X8与X10之间有肽内二硫键或二硒键的氨基酸序列X7NX8KAPETALX9AAAX1oH的肽；其中X7-X1o独立地选自由C(半胱氨酸)、Sec(硒代半胱氨酸)和Pen(青霉胺)组成的组；前提是X7和X9等同并且X8-X10等同；即
SEQ ID NO：6：
以及(e)包含氨基酸序列X1KAPETALX2的肽，其中X1选自由Dap和Dab组成的组；并且X2选自由D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)组成的组(SEQ ID NO：7)；
W为选自由-NH-(CH2)r-C(＝O)-和-NH-CH((CH2)rNH2)-C(＝O)-组成的组的双自由基；
Y为选自由-NH2、-OH、-OR3和-NHR3组成的组的自由基；
s为独立地选自0至1的整数；
n为0至6的整数；
r为独立地选自1至5的整数；
k为5至8的整数；
R1和R2独立地选自(C1-C6)-烷基；
R3为选自由（C1-C6)-烷基组成的组的自由基；
La’通过选自由酯键、醚键、氨基甲酸酯键、甲硅烷基醚键、磺酸酯键、磷酸酯键、缩酮键、半缩酮键、碳酸酯键和氨基甲酸酯键组成的组的键连接至自由基Z，所述键在所画出的La’式的左侧的C＝O、SO2、Si、P、CH或CH2基团与所述SN38的羟基中的一个羟基之间形成；
当n＝0时，La’通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键连接至自由基Lc’，所述键在所画出的La’式的右侧的官能团与Lc’式的左侧的官能团之间形成；
当n＝1时，La’通过选自选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键连接至自由基Lb’，所述键在所画出的La’式的右侧的官能团与Lb’式的左侧的官能团之间形成；并且Lb’通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键连接至自由基Lc’，所述键在所画出的Lb’式的右侧的官能团与所画出的Lc’式的左侧的官能团之间形成；
当n大于1时，Lb’等同或不同并且通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键在其之间连接；一个Lb’通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键在末端连接至La’，所述键在所画出的La’式的右侧的官能团与所画出的Lb’式的左侧的官能团之间形成；并且另一个Lb’通过选自由胺键、酰胺键、醚键、硫醚键、二硫键、酯键和硫酯键组成的组的化学上可行的键在末端连接至Lc’，所述键在所画出的Lb’式的右侧的官能团与所画出的Lc’式的左侧的官能团之间形成；
Lc’通过酰胺键连接至双自由基P，所述酰胺键用所画出的Lc’式的右侧的羰基和肽序列P的第一个氨基酸的氨基来形成；
当s＝0时，P通过酰胺键、羧酸键或酯键直接连接至Y，所述键在序列P的最后一个氨基酸的C末端的C＝O与自由基Y之间形成，所述自由基Y为-NH2、-OH、-OR3或-NHR3；并且
当s＝1时，P通过用序列P的最后一个氨基酸的C末端的C＝O形成的酰胺键连接至自由基W，所述键在所画出的W式的左侧的官能团与所画出的序列右侧的序列P的最后一个氨基酸的C末端的官能团(C＝O)之间形成；并且W如下连接至Y：-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-Y或-C(＝O)-NH-CH((CH2)rNH2)-C(＝O)-Y。
2.如权利要求1所述的式(I)化合物，其中Z通过所述药物活性成分的羟基(b)连接至接头L。
3.如权利要求1所述的式(I)化合物，其中Z通过所述药物活性成分的羟基(a)连接至接头L。
4.如权利要求1-3中任一项所述的式(I)化合物，其中P为选自由以下组成的组的肽的双自由基：
(a)包含氨基酸序列DapKAPETALD的肽，其中在Dap与D之间有肽内键，所述肽内键为酰胺键，所述肽为SEQ ID NO:8：
(b)长度为9-20个氨基酸残基的肽，其具有至少一个肽内键，所述肽内键为二硫键，并且其包含以下氨基酸序列：
CKAPETALCAAA，在半胱氨酸1与9之间具有至少一个肽内二硫键，所述肽为SEQ ID NO：9：
(c)长度为9-11个氨基酸残基的肽，其至少具有一个肽内键，所述肽内键为二硫键，并且其由选自由在半胱氨酸1与9之间具有至少一个肽内二硫键的CKAPETALC、CKAPETALCA和CKAPETALCAA组成的组的氨基酸序列组成，所述肽为
SEQ ID NO：10：
SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：12)
以及
(d)具有16个氨基酸残基并且包含氨基酸序列CNCKAPETALCAAACH的肽，在作为半胱氨酸1和11的第一半胱氨酸与第三半胱氨酸之间以及在作为半胱氨酸3和15的第二半胱氨酸与第四半胱氨酸之间具有肽内二硫键，所述肽为
SEQ ID NO：13：
(e)包含氨基酸序列DapKAPETALD(SEQ ID NO：14)的肽。
5.如权利要求4所述的式(I)化合物，其中P为选自由以下组成的组的肽的双自由基：
(a)具有氨基酸序列DapKAPETALD的肽，其中在Dap与D之间有肽内键，所述肽内键为酰胺键(SEQ ID NO：7)；
(b)具有氨基酸序列CKAPETALC的肽，其在位置1与9的半胱氨酸之间具有至少一个肽内二硫键(SEQ ID NO：10)；
(c)具有氨基酸序列DapKAPETALD(SEQ ID NO：14)的肽。
6.如权利要求5所述的式(I)化合物，其中P为肽DapKAPETALD的双自由基，其在Dap与D之间具有肽内键，所述肽内键为酰胺键(SEQ ID NO:7)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的式(I)化合物，其中
La’为选自由以下组成的组的双自由基：-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2)r-NH-、-C(＝O)-(CH2)r-S-、-C(＝O)-(CH2)r-O-、-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L12。
8.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中L为接头，其为由3至8个双自由基构成的双自由基，并且n为1至6的整数。
9.如权利要求8所述的化合物，其中La’为下式的L3，并且Lc’为-C(＝O)-(CH2)r-C(＝O)-，
10.如权利要求9所述的化合物，其中Lb’选自由以下组成的组：-NH-(CH2)r-O-、-(CH2)r-O-和-(CH2)r-NH-及其组合。
11.如权利要求1-6中任一项所述的式(I)化合物，其中L为接头，其为由2个双自由基构成的双自由基，n＝0，La’为L12，并且Lc’为L13。
12.如权利要求1-6中任一项所述的式(I)化合物，其中L为接头，其为由2个双自由基构成的双自由基，n＝0，La’为-C(＝O)-NH-(CH2)r-C(＝O)-，并且Lc’为L15。
13.如权利要求1所述的化合物，其具有式(Ia)：
14.如权利要求1所述的化合物，其具有式(Ib)：
15.如权利要求1所述的化合物，其具有式(Ic)：
16.如权利要求1所述的化合物，其具有式(Id)：
17.如权利要求1所述的化合物，其具有式(Ie)：
18.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1-17中任一项所述的化合物以及适当量的药学上可接受的载剂或赋形剂。
19.如权利要求1-17中任一项所述的化合物，其用途为用作药物。
20.如权利要求1-17中任一项所述的化合物，其用途为用于治疗包括人的哺乳动物的癌症。
21.如权利要求20所述的用于所述用途的化合物，其中治疗癌症包括治疗选自由颅外实体瘤、眼肿瘤和CNS肿瘤组成的组的肿瘤。
22.如权利要求20-21中任一项所述的用于所述用途的化合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：成人神经胶质瘤、小儿神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、尤文肉瘤、DIPG、神经母细胞瘤和横纹肌肉瘤。
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