ES2969440T3 - Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso - Google Patents

Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso Download PDF

Info

Publication number
ES2969440T3
ES2969440T3 ES16875755T ES16875755T ES2969440T3 ES 2969440 T3 ES2969440 T3 ES 2969440T3 ES 16875755 T ES16875755 T ES 16875755T ES 16875755 T ES16875755 T ES 16875755T ES 2969440 T3 ES2969440 T3 ES 2969440T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
antibodies
human
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16875755T
Other languages
English (en)
Inventor
Zenjiro Sampei
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2969440T3 publication Critical patent/ES2969440T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-C5 y métodos para utilizarlos. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo anti-C5 de la presente invención. La invención también proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula huésped de la presente invención para que se produzca el anticuerpo. La invención proporciona además un método para producir un anticuerpo anti-C5 que comprende inmunizar a un animal contra un polipéptido que comprende el dominio MG1-MG2 de la cadena beta de C5. Los anticuerpos anti-C5 de la presente invención pueden usarse como medicamento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-C5 y a métodos de uso de los mismos. La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
[Antecedentes de la técnica]
El sistema del complemento desempeña un papel central en el aclaramiento de complejos inmunitarios y en respuestas inmunitarias frente a agentes infecciosos, antígenos foráneos, células infectadas por virus y células tumorales. Hay aproximadamente 25-30 proteínas del complemento, que se encuentran como una compleja colección de proteínas de plasma y cofactores de membrana. Los componentes del complemento realizan sus funciones defensivas inmunitarias interaccionando en una serie de intricadas escisiones enzimáticas y acontecimientos de unión a membrana. Las cascadas de complemento resultantes conducen a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunorreguladoras y líticas.
Actualmente, se acepta ampliamente que el sistema del complemento puede activarse mediante tres rutas diferenciadas: la ruta clásica, la ruta de la lectina y la ruta alternativa. Estas rutas comparten muchos componentes y, aunque difieren en cuanto a sus etapas iniciales, convergen y comparten los mismos componentes del complemento terminales (C5 a C9) responsables de la activación y destrucción de células diana.
La ruta clásica se activa normalmente mediante la formación de complejos de antígeno-anticuerpo. De manera independiente, la primera etapa en activación de la ruta de la lectina es la unión de lectinas específicas tales como lectina de unión a manano (MBL), H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina y lectina de tipo C CL-11. En cambio, la ruta alternativa experimenta de manera espontánea un bajo nivel de activación de renovación, que puede amplificarse fácilmente sobre superficies foráneas u otras superficies anómalas (bacterias, levadura, células infectadas por virus o tejido dañado). Estas rutas convergen en un punto en el que el componente del complemento C3 se escinde mediante una proteasa activa para proporcionar C3a y C3b.
C3a es una anafilotoxina. C3b se une a células bacterianas y otras, así como a determinados virus y complejos inmunitarios, y los etiqueta para su eliminación a partir de la circulación (el papel conocido como opsonina). C3b también forma un complejo con otros componentes para formar C5 convertasa, que escinden C5 para dar C5a y C5b.
C5 es una proteína de 190 kDa encontrada en suero normal a aproximadamente 80 microg/ml (0,4 microM). C5 está glicosilada atribuyéndose aproximadamente el 1,5-3% de su masa a hidrato de carbono. La C5 madura es un heterodímero de cadena alfa de 115 kDa que está unida por enlaces disulfuro a una cadena beta de 75 kDa. C5 se sintetiza como una proteína precursora de cadena sencilla (precursor pro-C5) de 1676 aminoácidos (véanse, por ejemplo, los documentos PTL 1 y PTL 2). El precursor pro-C5 se escinde para proporcionar la cadena beta como fragmento amino-terminal y la cadena alfa como fragmento carboxi-terminal. Los fragmentos de polipéptido de cadena alfa y de cadena beta están conectados entre sí mediante un enlace disulfuro y constituyen la proteína C5 madura.
La C5 madura se escinde para dar los fragmentos C5a y C5b durante la activación de las rutas del complemento. C5a se escinde a partir de la cadena alfa de C5 mediante C5 convertasa como fragmento amino-terminal que comprende los primeros 74 aminoácidos de la cadena alfa. La porción restante de C5 madura es el fragmento C5b, que contiene el resto de la cadena alfa unida por enlaces disulfuro a la cadena beta. Aproximadamente el 20% de la masa de 11 kDa de C5a se atribuye a hidratos de carbono.
C5a es otra anafilotoxina. C5b se combina con C6, C7, C8 y C9 para formar el complejo de ataque a la membrana (MAC, C5b-9, complejo de complemento terminal (TCC)) en la superficie de la célula diana. Cuando se inserta un número suficiente de MAC en membranas de célula diana, se forman poros de MAC para mediar en una rápida lisis osmótica de las células diana.
Tal como se mencionó anteriormente, C3a y C5a son anafilotoxinas. Pueden activar la desgranulación de mastocitos, que libera histamina y otros mediadores de la inflamación, dando como resultado la contracción del músculo liso, aumento de la permeabilidad vascular, activación de leucocitos y otros fenómenos inflamatorios incluyendo proliferación celular dando como resultado hipercelularidad. C5a también funciona como péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos tales como neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos al sitio de activación del complemento.
La actividad de C5a se regula mediante la enzima plasmática carboxipeptidasa N que elimina la arginina carboxiterminal a partir de C5a formando el derivado C5a-des-Arg. C5a-des-Arg muestra tan sólo el 1% de la actividad anafiláctica y actividad quimiotáctica polimorfonuclear de C5a sin modificar.
Aunque un sistema del complemento que funciona de manera apropiada proporciona una robusta defensa contra microbios infecciosos, una regulación o activación inapropiada del complemento se ha implicado en la patogénesis de una variedad de trastornos incluyendo, por ejemplo, artritis reumatoide (RA); nefritis lúpica; lesión por isquemiareperfusión; hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH); síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS); enfermedad por depósitos densos (DDD); degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD)); síndrome de hemolisis, nivel elevado de enzimas hepáticas y nivel bajo de plaquetas (HELLP); púrpura trombocitopénica trombótica (TTP); muerte fetal espontánea; vasculitis pauciinmunitaria; epidermólisis ampollosa; muerte fetal recurrente; esclerosis múltiple (MS); lesión cerebral por traumatismo; y lesión resultante de infarto de miocardio, circulación extracorporal y hemodiálisis (véase, por ejemplo, el documento NPL 1). Por tanto, la inhibición de activaciones excesivas o no controladas de la cascada del complemento puede proporcionar beneficios clínicos para pacientes con tales trastornos.
Hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) es un trastorno de la sangre poco frecuente, en el que los glóbulos rojos se ven comprometidos y, por tanto, se destruyen más rápidamente que glóbulos rojos normales. PNH resulta de la expansión clonal de células madre hematopoyéticas con mutaciones somáticas en el gen de PIG-A (fosfatidilinositol glicano de clase A) que está ubicado en el cromosoma X. Las mutaciones en PIG-A conducen a un bloqueo temprano en la síntesis de glicosilfosfatidilinositol (GPI), una molécula que se requiere para el anclaje de muchas proteínas a superficies celulares. Por consiguiente, las células sanguíneas de PNH son deficientes en cuanto a proteínas ancladas a GPI, que incluyen proteínas reguladoras del complemento CD55 y CD59. En circunstancias normales, estas proteínas reguladoras del complemento bloquean la formación de MAC sobre superficies celulares, evitando de ese modo la lisis de eritrocitos. La ausencia de las proteínas ancladas a GPI provoca hemolisis mediada por complemento en PNH.
PNH está caracterizada por anemia hemolítica (un número reducido de glóbulos rojos), hemoglobinuria (la presencia de hemoglobina en la orina, particularmente evidente después de dormir) y hemoglobinemia (la presencia de hemoglobina en el torrente sanguíneo). Se sabe que los individuos afectados por PNH tienen paroxismos, que se definen en este caso como incidencias de orina de color oscuro. La anemia hemolítica se debe a la destrucción intravascular de glóbulos rojos mediante componentes del complemento. Otros síntomas conocidos incluyen disfasia, fatiga, disfunción eréctil, trombosis y dolor abdominal recurrente.
Eculizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la proteína del complemento C5, y la primera terapia aprobada para el tratamiento de hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) y síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS) (véase, por ejemplo, el documento NPL 2). Eculizumab inhibe la escisión de C5 para dar C5a y C5b mediante C5 convertasa, lo cual evita la generación del complejo de complemento terminal C5b-9. Tanto C5a como C5b-9 provocan los acontecimientos mediados por el complemento terminales que son característicos de PNH y aHUS (véanse también los documentos PTL 3, PTL 4, PTL 5 y PTL 6).
Varios informes han descrito anticuerpos anti-C5. Por ejemplo, el documento PTL 7 describió un anticuerpo anti-C5 que se une a la cadena alfa de C5 pero no se une a C5a, y bloquea la activación de C5, mientras que el documento PTL 8 describió un anticuerpo monoclonal anti-C5 que inhibe la formación de C5a. Por otro lado, el documento PTL 9 describió un anticuerpo anti-C5 que reconoce el sitio proteolítico para C5 convertasa en la cadena alfa de C5 e inhibe la conversión de C5 para dar C5a y C5b. El documento PTL 10 describió un anticuerpo anti-C5 que tiene una constante de afinidad de al menos 1 x 107 M-1.
Los anticuerpos (IgG) se unen a receptor de Fc neonatal (FcRn) y tienen tiempos de retención en plasma prolongados. La unión de IgG a FcRn se observa normalmente en condiciones ácidas (por ejemplo, pH 6,0) y se observa con poca frecuencia en condiciones neutras (por ejemplo, pH 7,4). Normalmente, las IgG se incorporan de manera no específica en células mediante endocitosis y vuelven a las superficies celulares mediante unión a FcRn endosómico en las condiciones ácidas en los endosomas. Después, las IgG se disocian a partir de FcRn en las condiciones neutras en plasma. Las IgG que no han logrado unirse a FcRn se degradan en lisosomas. Cuando se elimina la capacidad de unión a FcRn de una IgG en condiciones ácidas mediante introducción de mutaciones en su región de Fc, la IgG no se recicla desde los endosomas al plasma, conduciendo a una alteración marcada de la retención en plasma de la IgG. Para mejorar la retención en plasma de las IgG, se ha notificado un método que potencia su unión a FcRn en condiciones ácidas. Cuando se mejora la unión a FcRn de una IgG en condiciones ácidas mediante introducción de una sustitución de aminoácido en su región de Fc, la IgG se recicla más eficazmente desde los endosomas al plasma, y de ese modo muestra una retención en plasma mejorada. Mientras tanto, se ha notificado que una IgG con una unión a FcRn potenciada en condiciones neutras no se disocia a partir de FcRn en las condiciones neutras en plasma aunque vuelva a la superficie celular mediante su unión a FcRn en las condiciones ácidas en los endosomas y, por consiguiente, su retención en plasma permanece inalterada o, más bien, se empeora (véanse, por ejemplo, los documentos NPL 3; NPL 4; NPL 5).
Recientemente, se han notificado anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente del pH (véanse, por ejemplo, los documentos PTL 11 y PTL 12). Estos anticuerpos se unen fuertemente a antígenos en las condiciones neutras de plasma y se disocian de los antígenos en las condiciones ácidas endosómicas. Después de disociarse de los antígenos, los anticuerpos pasan una vez más a poder unirse a antígenos cuando se reciclan al plasma mediante FcRn. Por tanto, una única molécula de anticuerpo puede unirse de manera repetida a múltiples moléculas de antígeno. En general, la retención en plasma de un antígeno es mucho más corta que la de un anticuerpo que tiene el mecanismo de reciclaje mediado por FcRn anteriormente mencionado. Por tanto, cuando se une un antígeno a un anticuerpo, el antígeno muestra normalmente una retención en plasma prolongada, dando como resultado un aumento de la concentración en plasma del antígeno. Por otro lado, se ha notificado que los anticuerpos anteriormente descritos, que se unen a antígenos de una manera dependiente del pH, eliminan antígenos a partir del plasma de una manera más rápida que los anticuerpos típicos porque se disocian a partir de los antígenos dentro de los endosomas durante el procedimiento de reciclaje mediado por FcRn. El documento PTL 13 también describió un análisis de modelado por ordenador que muestra que un anticuerpo con unión dependiente del pH dirigido contra C5 puede prolongar la atenuación de antígeno. En el documento PTL 14 se describen anticuerpos anti-C5 para inhibir la inflamación mediada por anafilotoxina C5a y complemento terminal y tratar trastornos asociados con el complemento.
[Lista de referencias]
[Bibliografía de patentes]
[PTL 1]
Patente estadounidense n.° 6.355.245
[PTL 2]
Patente estadounidense n.° 7.432.356
[PTL 3]
Documento WO 2005/074607
[PTL 4]
Documento WO 2007/a106585
[PTL 5]
Documento WO 2008/069889
[PTL 6]
Documento WO 2010/054403
[PTL 7]
Documento WO 95/29697
[PTL 8]
Documento WO 02/30985
[PTL 9]
Documento WO 2004/007553
[PTL 10]
Documento WO 2010/015608
[PTL 11]
Documento WO 2009/125825
[PTL 12]
Documento WO 2011/122011
[PTL 13]
Documento WO 2011/111007
[PTL 14]
Patente estadounidense n.° 9.079.949
[Bibliografía no de patentes]
[NPL 1]
Holerset al.,Immunol. Rev. 223:300-316 (2008)
[NPL 2]
Dmytrijuket al.,The Oncologist 13(9):993-1000 (2008)
[NPL 3]
Yeunget al.,J Immunol. 182(12): 7663-7671 (2009)
[NPL 4]
Datta-Mannanet al,J Biol. Chem. 282(3): 1709-1717 (2007)
[NPL 5]
Dall'Acquaet al,J. Immunol. 169(9):5171-5180 (2002)
[Sumario de la invención]
[Problema técnico]
Un objetivo de la invención es proporcionar anticuerpos anti-C5 y métodos de uso de los mismos.
[Solución al problema]
La invención proporciona anticuerpos anti-C5 que comprenden una secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 111 y métodos de uso de los mismos. La invención se expone en el juego adjunto de reivindicaciones.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación se une a un epítopo dentro del dominio MG1-MG2 de la cadena beta de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33 124 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110 de SEQ ID NO: 40. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8. En otra realización, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8. En una realización adicional, el anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en las tablas 7 u 8. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en las tablas 7 u 8 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y (j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación tiene una característica seleccionada del grupo que consiste en: (a) el anticuerpo entra en contacto con los aminoácidos D51 y K109 de C5 (SEQ ID NO: 39); (b) la afinidad del anticuerpo por C5 (SEQ ID NO: 39) es mayor que la afinidad del anticuerpo por un mutante de C5 que consiste en una sustitución E48A de SEQ ID NO: 39; o (c) el anticuerpo se une a una proteína de C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 a pH 7,4, pero no se une a una proteína de C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 con una sustitución H72Y a pH 7,4. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación inhibe la activación de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación inhibe la activación de la variante de C5 R885H. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación es un fragmento de anticuerpo que se une a C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación es un anticuerpo de IgG1 de longitud completa.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención comprende un marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 133; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 135; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 138; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención comprende un marco de dominio variable de cadena ligera FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 143; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 145; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 147; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148.
Un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 111.
La invención proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 111.
La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican para el anticuerpo anti-C5 de la presente invención. La invención también proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. La invención también proporciona un método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar una célula huésped de la presente invención de modo que se produce el anticuerpo. La invención también proporciona un anticuerpo anti-C5 tal como puede obtenerse mediante el método de producción de un anticuerpo de la presente invención.
La divulgación proporciona además un método de producción de un anticuerpo anti-C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar un animal frente a un polipéptido que comprende el dominio MG1-MG2 (SEQ ID NO: 43) de la cadena beta de C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar un animal frente a un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 33 a 124 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar un animal frente a un polipéptido que comprende al menos un fragmento seleccionado de los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar un animal frente a un polipéptido que comprende un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5, que comprende al menos un aminoácido seleccionado de Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110.
La invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-C5 de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Los anticuerpos anti-C5 de la presente invención pueden ser para su uso como medicamento. Los anticuerpos anti-C5 de la presente invención pueden ser para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. Los anticuerpos anti-C5 de la presente invención pueden ser para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma.
Los anticuerpos anti-C5 de la presente invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento es para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En algunas realizaciones, el medicamento es para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma.
La invención también proporciona anticuerpos anti-C5 para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 de la presente invención debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz. La divulgación también proporciona anticuerpos anti-C5 para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma en un individuo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación debe administrarse al individuo individual en una cantidad eficaz para potenciar el aclaramiento de C5 a partir del plasma.
[Breve descripción de los dibujos]
[Figura 1]
La figura 1 ilustra la agrupación de epítopos de anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 2.2. Los anticuerpos agrupados en la misma agrupación de epítopos están encerrados en un recuadro con una línea gruesa.
[Figura 2A]
La figura 2A ilustra sensogramas de BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 a pH 7,4 (línea continua) y pH 5,8 (línea de rayas) para evaluar la dependencia del pH, tal como se describe en el ejemplo 3.2. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538 y CFA0599 son anticuerpos agrupados en el epítopo C, tal como se describe en el ejemplo 2.2.
[Figura 2B]
La figura 2B ilustra sensogramas de BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 a pH 7,4 (línea continua) y pH 5,8 (línea de rayas) para evaluar la dependencia del pH, tal como se describe en el ejemplo 3.2. CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C, y CFA0330 y CFA0341 son anticuerpos agrupados en el epítopo B, tal como se describe en el ejemplo 2.2. 305LO5 es un anticuerpo humanizado de CFA0305, tal como se describe en el ejemplo 2.3.
[Figura 3]
La figura 3 ilustra análisis de inmunotransferencia de tipo Western frente a fragmentos derivados de cadena beta de C5 (aminoácidos 19-180, 161-340, 321-500 y 481-660 de SEQ ID NO: 40) fusionados a etiqueta de GST, tal como se describe en el ejemplo 4.1. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C. El anticuerpo anti-GST es un control positivo. La posición de los fragmentos de C5 fusionados a GST (46-49 kDa) está marcada con una flecha.
[Figura 4]
La figura 4 ilustra sensogramas de BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 frente a dominio MG1-MG2 de la cadena beta de C5, tal como se describe en el ejemplo 4.3. El panel superior muestra los resultados de CFA0305 (línea continua), CFA0307 (línea de rayas), CFA0366 (línea de rayas y puntos) y eculizumab (línea de puntos). El panel central muestra los resultados de CFA0501 (línea continua), CFA0599 (línea de rayas), CFA0538 (línea de rayas y puntos) y eculizumab (línea de puntos). El panel inferior muestra los resultados de CFA0666 (línea continua),<c>F<a>0672 (línea de rayas), CFA0675 (línea de rayas y puntos) y eculizumab (línea de puntos). CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C. Eculizumab es un anticuerpo anti-C5 de control.
[Figura 5A]
La figura 5A ilustra análisis de inmunotransferencia de tipo Western frente a fragmentos de péptidos derivados de dominio MG1-MG2 (aminoácidos 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 y 45-111 de SEQ ID NO: 40) fusionados a etiqueta de GST, tal como se describe en el ejemplo 4.4. El anticuerpo anti-GST se usa como anticuerpo para la reacción. La posición de los fragmentos de C5 fusionados a GST (35-37kDa) está marcada con una flecha.
[Figura 5B]
La figura 5B ilustra análisis de inmunotransferencia de tipo Western frente a fragmentos de péptidos derivados de dominio MG1-MG2 (aminoácidos 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 y 45-111 de SEQ ID NO: 40) fusionados a etiqueta de GST, tal como se describe en el ejemplo 4.4. CFA0305 se usa como un anticuerpo para la reacción. [Figura 5C]
La figura 5C resume las reacciones de unión de anticuerpos anti-C5 a fragmentos derivados de cadena beta de C5, tal como se describe en el ejemplo 4.4. Los fragmentos a los que se unen los anticuerpos anti-C5 agrupados en el epítopo C (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675) se muestran en gris y los fragmentos a los que no se unen se muestran en blanco.
[Figura 6]
La figura 6 ilustra análisis de inmunotransferencia de tipo Western frente a mutantes puntuales de C5 en los que E48, D51 y K109 de la cadena beta están sustituidos por alanina (E48A, D51A y K109A, respectivamente), tal como se describe en el ejemplo 4.5. En el panel izquierdo, se usa eculizumab (anticuerpo anti-C5, agente de unión a cadena alfa) como anticuerpo para la reacción y la posición de la cadena alfa de C5 (aproximadamente 113 kDa) está marcada con una flecha. En el panel derecho, se usa CFA0305 (agrupado en el epítopo C, agente de unión a la cadena beta) como anticuerpo para la reacción y la posición de la cadena beta de C5 (aproximadamente 74 kDa) está marcada con una cabeza de flecha.
[Figura 7]
La figura 7 presenta sensogramas de BIACORE (marca registrada) que muestran la interacción de eculizumab-F760G4 (panel superior) o 305LO5 (panel inferior) con mutantes de C5, tal como se describe en el ejemplo 4.6. Se obtuvieron sensogramas mediante inyección de C5-wt (curva continua gruesa), C5-E48A (curva de rayas cortas), C5-D51A (curva de rayas largas) y C5-K109A (curva continua delgada), respectivamente, sobre la superficie de sensor con eculizumab-F760G4 o 305LO5 inmovilizadas. Eculizumab es un anticuerpo anti-C5 de control. 305LO5 es un anticuerpo humanizado de CFA0305 (agrupado en el epítopo C), tal como se describe en el ejemplo 2.3.
[Figura 8]
La figura 8 presenta sensogramas de BIACORE (marca registrada) que muestran la interacción de 305LO5 con mutantes de His de C5 para evaluar la dependencia del pH, tal como se describe en el ejemplo 4.7. Se obtuvieron sensogramas mediante inyección de C5-wt (curva continua gruesa), C5-H70Y (curva de rayas largas), C5-H72Y (curva de rayas cortas), C5-H110Y (curva de puntos) y C5-H70Y+H110Y (curva continua delgada), respectivamente, sobre la superficie del sensor con 305LO5 inmovilizado. Se dejó que los complejos de anticuerpo/antígeno se disociaran a pH 7,4, seguido por disociación adicional a pH 5,8 (indicado por una flecha) para evaluar las interacciones dependientes del pH.
[Figura 9A]
La figura 9A ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 5.1. Se muestran los resultados de CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 agrupados en el epítopo C, tal como se describe en el ejemplo 2.2.
[Figura 9B]
La figura 9B ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 5.1. Se muestran los resultados de los anticuerpos CFA0330 y CFA0341 agrupados en el epítopo B, tal como se describe en el ejemplo 2.2.
[Figura 10A]
La figura 10A ilustra la inhibición de la generación de C5a mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 5.2. Se cuantificaron las concentraciones de C5a en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 9A.
[Figura 10B]
La figura 10B ilustra la inhibición de la generación de C5a mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 5.2. Se cuantificaron las concentraciones de C5a en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 9B.
[Figura 11]
La figura 11 ilustra la inhibición de la hemolisis activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 5.3. Se activaron complementos mediante la ruta clásica.
[Figura 12]
La figura 12 ilustra la inhibición de la hemolisis activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 5.4. Se activaron complementos mediante la ruta alternativa.
[Figura 13]
La figura 13 ilustra el transcurso de tiempo de la concentración de C5 humana en plasma después de la administración intravenosa de C5 humana sola o C5 humana y un anticuerpo anti-C5 humana en ratones evaluando el aclaramiento de C5, tal como se describe en el ejemplo 6.2. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C y CFA0330 y CFA0341 son anticuerpos agrupados en el epítopo B, tal como se describe en el ejemplo 2.2.
[Figura 14]
La figura 14 ilustra el transcurso de tiempo de la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma después de la administración intravenosa de C5 humana y un anticuerpo anti-C5 humana en ratones evaluando la farmacocinética de anticuerpo, tal como se describe en el ejemplo 6.3. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C y CFA0330 y CFA0341 son anticuerpos agrupados en el epítopo B, tal como se describe en el ejemplo 2.2.
[Figura 15]
La figura 15 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 9.1. Se muestran los resultados de anticuerpos 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422 y 305L020-SG115.
[Figura 16]
La figura 16 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 9.1. Se muestran los resultados de anticuerpos 305LO15-SG115 y 305LO23-SG429.
[Figura 17]
La figura 17 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 9.1. Se muestran los resultados de anticuerpos 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 y 305LO23-SG422.
[Figura 18]
La figura 18 ilustra la inhibición de la generación de C5a mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 9.2. Se cuantificaron las concentraciones de C5a en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 15.
[Figura 19]
La figura 19 ilustra la inhibición de la generación de C5a mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 9.2. Se cuantificaron las concentraciones de C5a en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 16.
[Figura 20]
La figura 20 ilustra la inhibición de la actividad del complemento en plasma de macaco mediante anticuerpos anti-C5, tal como se describe en el ejemplo 9.3. Se administraron anticuerpos anti-C5 en macacos cangrejeros y se midieron las actividades del complemento en plasma de los macacos en un ensayo de hemolisis.
[Figura 21]
La figura 21 ilustra la inhibición de la actividad biológica de C5 de tipo natural (WT) y variantes de C5 (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D) mediante un anticuerpo anti-C5 (eculizumab), tal como se describe en el ejemplo 9.4.
[Figura 22]
La figura 22 ilustra la inhibición de la actividad biológica de C5 de tipo natural (WT) y variantes de C5 (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D) mediante un anticuerpo anti-C5 (una variante 305), tal como se describe en el ejemplo 9.4.
[Figura 23]
La figura 23 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante anticuerpos anti-C5 (BNJ441 y una variante 305), tal como se describe en el ejemplo 9.5.
[Figura 24]
La figura 24 ilustra el transcurso de tiempo de la concentración de C5 en plasma de macaco cangrejero después de la administración intravenosa de un anticuerpo anti-C5 humana en macacos cangrejeros evaluando el aclaramiento de C5, tal como se describe en el ejemplo 10.2.
[Figura 25]
La figura 25 ilustra el transcurso de tiempo de la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma después de la administración intravenosa de un anticuerpo anti-C5 humana en macacos cangrejeros evaluando la farmacocinética de anticuerpo, tal como se describe en el ejemplo 10.3.
[Figura 26]
Las figuras 26A y 26B ilustran la estructura cristalina del Fab de 305 unido al dominio MG1 de C5 humana (hC5), tal como se describe en el ejemplo 11.6. La figura 26A ilustra una unidad asimétrica. MG1 se muestra en la representación de superficie y el Fab de 305 se muestra como cintas (gris oscuro: cadena pesada, gris claro: cadena ligera). La figura 26B ilustra las moléculas 1 y 2 superpuestas (gris oscuro: molécula 1, gris claro: molécula 2).
[Figura 27A]
La figura 27A ilustra el epítopo de la región de contacto de Fab de 305 en el dominio MG1, tal como se describe en el ejemplo 11.6. La figura 27A ilustra el mapeo de epítopos en la secuencia de aminoácidos de MG1 (gris oscuro: más cerca de 3,0 Angstrom, gris claro: más cerca de 4,5 Angstrom).
[Figura 27B]
La figura 27B ilustra el epítopo de la región de contacto de Fab de 305 en el dominio MG1, tal como se describe en el ejemplo 11.6. La figura 27B ilustra el mapeo de epítopos en la estructura cristalina (esferas de color gris oscuro: más cerca de 3,0 Angstrom, barras de color gris claro: más cerca de 4,5 Angstrom).
[Figura 28A]
La figura 28A ilustra una vista a escala aumentada de las interacciones de E48, D51 y K109 (representación en barras) con el Fab de 305 (representación de superficie), tal como se describe en el ejemplo 11.7.
[Figura 28B]
La figura 28B ilustra interacciones entre E48 y su entorno (línea de puntos de color gris oscuro: enlace de hidrógeno con el Fab, línea de puntos de color gris claro: enlace de hidrógeno mediado por agua), tal como se describe en el ejemplo 11.7.
[Figura 28C]
La figura 28C ilustra interacciones entre D51 y su entorno (línea de puntos de color gris oscuro: enlace de hidrógeno con el Fab), tal como se describe en el ejemplo 11.7.
[Figura 28D]
La figura 28D ilustra interacciones entre K109 y su entorno (línea de puntos de color gris oscuro: enlace de hidrógeno con el Fab, línea de puntos de color gris claro: puente de sal con H-CDR3_D95), tal como se describe en el ejemplo 11.7.
[Figura 29A]
La figura 29A ilustra una vista a escala aumentada de las interacciones de H70, H72 y H110 (representación en barras) con el Fab de 305 (representación de superficie), tal como se describe en el ejemplo 11.8, en la misma orientación que la figura 28A.
[Figura 29B]
La figura 29B ilustra interacciones entre H70 y su entorno, tal como se describe en el ejemplo 11.8. Este residuo de histidina se indica en representación de barras y malla. El enlace de hidrógeno se indica mediante una línea de puntos.
[Figura 29C]
La figura 29C ilustra interacciones entre H72 y su entorno, tal como se describe en el ejemplo 11.8. Este residuo de histidina se indica en representación de barras y malla. El enlace de hidrógeno se indica mediante una línea de puntos.
[Figura 29D]
La figura 29D ilustra interacciones entre H110 y su entorno, tal como se describe en el ejemplo 11.8. Este residuo de histidina se indica en representación de barras y malla. La distancia entre H110 y H-CDR3_H100c se muestra mediante una línea de puntos.
[Descripción de realizaciones]
Las técnicas y procedimientos descritos o a los que se hace referencia en el presente documento se entienden de manera general y se emplean habitualmente usando metodología convencional por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, las metodologías ampliamente usadas descritas en Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel,et al.eds., (2003)); la serie de Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, y Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doile, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mulliset al.,eds., 1994); Current Protocols en Immunology (J.E. Coliganet al.,eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley y Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., iRl Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVitaet al.,eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. Definiciones
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Singletonet al.,Dictionnary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4a ed., John Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1992) proporcionan a un experto en la técnica una guía general a muchos de los términos usados en la presente solicitud.
Con fines de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, siempre que sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. Debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente con fines de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitativa.
Un “marco humano aceptor” para los fines en el presente documento es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, tal como se define a continuación. Un marco humano aceptor “derivado de” un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco humano aceptor de VL tiene una secuencia idéntica a la secuencia de marco de inmunoglobulina humana de VL o secuencia de marco consenso humano.
“Afinidad” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede representarse generalmente mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos habituales conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. A continuación se describen realizaciones ilustrativas y a modo de ejemplo específicas para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo “madurado por afinidad” se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariable (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no presenta tales alteraciones, dando tales alteraciones como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Los términos “anticuerpo anti-C5” y “un anticuerpo que se une a C5” se refieren a un anticuerpo que puede unirse a C5 con suficiente afinidad de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección de C5 como diana. En una realización, el alcance de unión de un anticuerpo anti-C5 a una proteína distinta de C5 no relacionada es de menos de aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo a C5 tal como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a C5 tiene una constante de disociación (Kd) de 1 microM o menos, 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 0,1 nM o menos, 0,01 nM o menos o 0,001 nM o menos (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, desde 10-8 M hasta 10-13 M, por ejemplo, desde 10-9 M hasta 10-13 M). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo de C5 que está conservado entre C5 de diferentes especies.
El término “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.
Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un “anticuerpo que se une al mismo epítopo” que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición y/o, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición. En el presente documento se proporciona un ensayo de competición a modo de ejemplo.
El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una especie o fuente particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una especie o fuente diferente.
La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que presenta su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente.
El término “agente citotóxico” tal como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la destrucción o muerte celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); fármacos o agentes quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes de intercalación); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos dados a conocer a continuación.
Las “funciones efectoras” se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región de Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.
Una “cantidad eficaz” de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término “epítopo” incluye cualquier determinante al que puede unirse un anticuerpo. Un epítopo es una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo que selecciona como diana ese antígeno, e incluye aminoácidos específicos que entran directamente en contacto con el anticuerpo. Los determinantes de epítopos pueden incluir agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferiblemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
El término “región de Fc” se usa en el presente documento para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones de Fc de secuencia nativa y regiones de Fc variantes. En una realización, una región de Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina (Lys447) o glicina-lisina (residuos 446-447) C-terminales de la región de Fc pueden estar presentes o no. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región de Fc o región constante es según el sistema de numeración de EU, también denominado índice de EU, tal como se describe en Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
“Marco” o “FR” se refiere a residuos de dominio variable distintos de residuos de región hipervariable (HVR). El FR de un dominio variable consiste generalmente en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Los términos “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto” y “anticuerpo completo” se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región de Fc tal como se define en el presente documento.
Los términos “célula huésped”, “línea de célula huésped” y “cultivo de células huésped” se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en cuanto al contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. En el presente documento se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica tal como se examina o selecciona en la célula originalmente transformada.
Un “anticuerpo humano” es uno que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que usa repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican para anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un “marco consenso humano” es un marco que representa los residuos de aminoácido que se producen más habitualmente en una selección de secuencias de marco de VL o VH de inmunoglobulina humana Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación de NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3. En una realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabatet al.,citado anteriormente. En una realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabatet al.,citado anteriormente.
Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todos o sustancialmente todos los FR corresponden a los de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
El término “región hipervariable” o “HVR” tal como se usa en el presente documento se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que tienen secuencia hipervariable (“regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR”) y/o forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables”) y/o contienen los residuos de contacto con antígeno (“contactos con antígeno”). Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR a modo de ejemplo en el presente documento incluyen: (a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3) (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDR que se producen en los residuos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), y 95-102 (H3) (Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)); (c) contactos con antígeno que se producen en los residuos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), y 93 101 (H3) (MacCallumet al.J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); y (d) combinaciones de (a), (b), y/o (c), incluyendo residuos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), y 94-102 (H3).
A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento según Kabatet al.,citado anteriormente.
Un “ inmunoconjugado” es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo, pero sin limitarse a, un agente citotóxico.
Un “ individuo” o “sujeto” es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza de más del 95% o el 99% tal como se determina, por ejemplo, mediante métodos electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de métodos para la evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatmanet al.,J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un ácido nucleico “aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de manera extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.
“Ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo anti-C5” se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para cadenas pasadas y ligeras de anticuerpos (o fragmentos de las mismas), incluyendo tal(es) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o en vectores independientes, y tal(es) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más ubicaciones en una célula huésped.
El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones que se producen de manera natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando generalmente tales variantes en cantidades minoritarias. A diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que se requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo el, pero sin limitarse al, método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos y métodos que usan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento tales métodos y otros métodos a modo de ejemplo para producir anticuerpos monoclonales.
Un “anticuerpo desnudo” se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
Los “anticuerpos nativos” se refieren a moléculas de inmunoglobulina que se producen de manera natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos de IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguida por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De manera similar, desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada demonio ligero variable o dominio variable de cadena ligera, seguida por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (kappa) y lambda (lambda), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término “prospecto” se usa para referirse a instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso use de tales productos terapéuticos.
El “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación, con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, puede lograrse de diversas maneras que se encuentran dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible para el público tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, software Megalign (DNASTAR) o GENETYX (marca registrada) (Genetyx Co., Ltd ). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que están comparándose. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 lo creó Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con documentación de usuario en la US Copyright Office, Washington D.C., 20559, en la que está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE.UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible para el público de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN- 2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (lo cual puede expresarse alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 multiplicado por la fracción X/Y, donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación de A y B del programa, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que, cuando la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se mencione específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen tal como se describió en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa informático ALIGN-2.
El término “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que está en una forma tal como para permitir que la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea tóxico de manera inaceptable para un sujeto al que se le administrará la formulación.
Un “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un componente en una formulación farmacéutica, distinto de un principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.
El término “C5”, tal como se usa en el presente documento, abarca cualquier C5 nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos y monos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). A menos que se indique lo contrario, el término “C5” se refiere a una proteína de C5 humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 39 y que contiene la secuencia de cadena beta mostrada en SEQ ID NO: 40. El término abarca C5 de “ longitud completa” sin procesar así como cualquier forma de C5 que resulta de un procesamiento en la célula. El término también abarca variantes que se producen de manera natural de C5, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una C5 humana a modo de ejemplo se muestra en SEQ ID NO: 39 (C5 de “tipo natural” o “WT”). La secuencia de aminoácidos de una cadena beta a modo de ejemplo de C5 humana se muestra en SEQ ID NO: 40. Las secuencias de aminoácidos de dominios MG1, MG2 y MG1-MG2 a modo de ejemplo de la cadena beta de C5 humana se muestran en SEQ ID NO: 41,42 y 43, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de C5 de macaco cangrejero y murina a modo de ejemplo se muestran en SEQ ID NO: 44 y 105, respectivamente. Los residuos de aminoácido 1-19 de SEQ ID NO: 39, 40, 43, 44 y 105 corresponden a una secuencia señal que se retira durante el procesamiento en la célula y, por tanto, no se encuentra en las secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo correspondientes.
Tal como se usa en el presente documento, “tratamiento” (y variaciones gramaticales del mismo tales como “tratar” o “que trata”) se refieren a la intervención clínica en un intento por alterar el transcurso natural del individuo que está tratándose, y puede realizarse o bien para profilaxis o bien durante el transcurso de patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevenir la aparición o recidiva de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o alivio del estado patológico, y remisión o mejora de pronóstico. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son para su uso en un método de retrasar el desarrollo de una enfermedad o ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera<( V h>y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones de marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindtet al.Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un único domino VH o<V l>puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, pueden aislarse anticuerpos que se unen a un antígeno particular usando un dominio VH o VL a partir de un anticuerpo que se une al antígeno para examinar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolanoet al.,J. Immunol.
150:880-887 (1993); Clarksonet al.,Nature 352:624-628 (1991).
El término “vector”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que está unida. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”.
II. Composiciones y métodos
En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos anti-C5 que comprenden una secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 111 y en métodos de producción de los mismos. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para su uso en un método de diagnóstico o tratamiento de una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5.
A. Anticuerpos anti-C5 a modo de ejemplo
La divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a C5. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro del dominio MG1-MG2 de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 19 180 de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro del dominio MG1 (aminoácidos 20-124 de SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 41)) de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33 124 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40). En otra realización, el anticuerpo no se une a un fragmento más corto que el fragmento que consiste en los aminoácidos 33-124 de la cadena beta de C5, por ejemplo, un fragmento que consiste en los aminoácidos 45-124, 52-124, 33-111, 33-108, o 45-111 de la cadena beta de c 5 (SEQ ID NO: 40).
La divulgación proporciona anticuerpos anti-C5 que muestran características de unión dependiente del pH. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “unión dependiente del pH” significa que el anticuerpo muestra una “unión reducida a C5 a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro” (para los fines de la presente divulgación, ambas expresiones pueden usarse de manera intercambiable). Por ejemplo, anticuerpos “con características de unión dependiente del pH” incluyen anticuerpos que se unen a C5 con afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido. Los anticuerpos de la presente divulgación se unen a C5 con una afinidad al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor a pH neutro que a pH ácido. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, los anticuerpos de la presente divulgación se unen a C5 con una afinidad al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
La “afinidad” de un anticuerpo por C5, para los fines de la presente divulgación, se expresa en cuanto a la KD del anticuerpo. La KD de un anticuerpo se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno. Cuanto mayor es el valor de KD para un anticuerpo que se une a su antígeno, más débil es su afinidad de unión por ese antígeno particular. Por consiguiente, tal como se usa en el presente documento, la expresión “afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido” (o la expresión equivalente “unión dependiente del pH”) significa que la KD para el anticuerpo que se une a C5 a pH ácido es mayor que la KD para el anticuerpo que se une a C5 a pH neutro. Por ejemplo, en el contexto de la presente divulgación, se considera que un anticuerpo se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido si la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH ácido es al menos 2 veces mayor que la k D del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro. Por tanto, la presente divulgación incluye anticuerpos que se unen a C5 a pH ácido con una KD que es al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor times que la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M, 10'1° M, 10' 11 M, 10-12 M o menos. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10‘9 M, 10‘8 M, 10‘7 M, 10‘6 M o más.
Se considera que un anticuerpo se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido si la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH 5,8 es al menos 2 veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH 7,4. En algunas realizaciones, los anticuerpos dados a conocer se unen a C5 a pH 5,8 con una KD que es al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH 7,4. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10‘7 M, 10‘8 M, 10‘9 M, 10■1° M, 10‘11 M, 10-12 M o menos. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10‘9 M, 10‘8 M, 10‘7 M, 10‘6 M o más.
Las propiedades de unión de un anticuerpo para un antígeno particular pueden expresarse en cuanto a la kd del anticuerpo. La kd de un anticuerpo se refiere a la constante de velocidad de disociación del anticuerpo con respecto a un antígeno particular y se expresa en cuanto a segundos recíprocos (es decir, sec1). Un aumento del valor de kd significa una unión más débil de un anticuerpo a su antígeno. Por tanto, la presente divulgación incluye anticuerpos que se unen a C5 con un valor de kd mayor a pH ácido que a pH neutro. La presente divulgación incluye anticuerpos que se unen a C5 a pH ácido con una kd que es al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor que la kd del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10-21/s, 10-31/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menos. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-11/s o más. La divulgación también incluye anticuerpos que se unen a C5 con un valor de kd mayor a pH 5,8 que a pH 7,4. La presente divulgación incluye anticuerpos que se unen a C5 a pH 5,8 con una kd que es al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor que la kd del anticuerpo que se une a C5 a pH 7,4. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10-21/s, 10-31/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menos. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-11/s o más.
En determinados casos, una “unión reducida a C5 a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro” se expresa en cuanto a la razón del valor de KD del anticuerpo que se une a C5 a pH ácido con respecto al valor de KD del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo muestra una “unión reducida a C5 a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro”, para los fines de la presente divulgación, si el anticuerpo muestra una razón de KD ácida/neutra razón de 2 o más. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo de la presente divulgación es de 2 o más. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD ácida/neutra para un anticuerpo de la presente divulgación puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M o menos. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M o más. En casos adicionales, puede considerarse que un anticuerpo muestra una “unión reducida a C5 a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro”, para los fines de la presente divulgación, si el anticuerpo muestra una razón de Kd a pH 5,8/pH 7,4 de 2 o más. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo de la presente divulgación puede ser de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M o menos. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M o más.
En determinados casos, una “unión reducida a C5 a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro” se expresa en cuanto a la razón del valor de kd del anticuerpo que se une a C5 a pH ácido con respecto al valor de kd del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo muestra una “unión reducida a C5 a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro”, para los fines de la presente divulgación, si el anticuerpo muestra una razón de kd ácida/neutra de 2 o más. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de kd a pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo de la presente divulgación es de 2 o más. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de kd ácida/neutra para un anticuerpo de la presente divulgación puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más. En realizaciones a modo de ejemplo adicionales, la razón de kd a pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo de la presente divulgación puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH neutro ser de 10-21/s, 10-3 1/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menos. En una realización adicional, el valor de kd del anticuerpo a pH 7,4 ser de 10 2 1/s, 10-31/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menos. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH ácido ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-11/s o más. En una realización adicional, el valor de kd del anticuerpo a pH 5,8 ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-11/s o más.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “pH ácido” significa un pH de 4,0 a 6,5. La expresión “pH ácido” incluye valores de pH de uno cualquiera de 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 y 6,5. En aspectos particulares, el “pH ácido” es de 5,8.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “pH neutro” significa un pH de 6,7 a aproximadamente 10,0. La expresión “pH neutro” incluye valores de pH de uno cualquiera de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 y 10,0. En aspectos particulares, el “pH neutro” es de 7,4.
Los valores de KD, y valores de kd, tal como se expresan en el presente documento, pueden determinarse usando un biosensor basado en resonancia de plasmón superficial para caracterizar interacciones de anticuerpo-antígeno. (Véase, por ejemplo, el ejemplo 3, en el presente documento). Los valores de KD, y valores de kd, pueden determinarse a 25 grados C o 37 grados C.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5 que consiste en el dominio MG1 (SEQ ID NO: 41). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 e His110. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110. En determinadas realizaciones, la unión de un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación a un mutante de C5 está reducida en comparación con su unión a C5 de tipo natural, en el que el mutante de C5 tiene al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His72 y Lys109. En otra realización, la unión dependiente del pH de un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación a un mutante de C5 está reducida en comparación con su unión dependiente del pH a C5 de tipo natural, en el que el mutante de C5 tiene al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en His70, His72 e His110. En una realización adicional, un aminoácido en una posición seleccionada de Glu48, Asp51 y Lys109 está sustituido por alanina, y un aminoácido en una posición seleccionada de His70, His72 e His110 está sustituido por tirosina en el mutante de C5.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y V l seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 26; (c) un VH de SEQ ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 25; (d) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (e) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (f) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (g) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (h) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (i) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (j) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (k) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; (l) un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 27; y (m) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 y entra en contacto con el aminoácido Asp51 (D51) de SEQ ID NO: 39. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 y entra en contacto con aminoácido el Lys109 (K109) de SEQ ID NO: 39. En una realización adicional, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 y entra en contacto con el aminoácido Asp51 (D51) y el aminoácido Lys109 (K109) de SEQ ID NO: 39.
En determinadas realizaciones, la unión de un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación a un mutante de C5 está reducida en comparación con su unión a C5 de tipo natural, en el que el mutante de C5 tiene una sustitución Glu48Ala (E48A) de SEQ ID NO: 39. En otra realización, unión dependiente del pH de un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación a un mutante de C5 está reducida en comparación con su unión dependiente del pH a C5 de tipo natural, en el que el mutante de C5 tiene una sustitución Glu48Ala (E48A) de SEQ ID NO: 39.
En una realización adicional, un anticuerpo anti-C5 se une a una proteína de C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, pero no se une a una proteína de C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 con una sustitución H72Y, en el que la proteína de c 5 y la proteína de C5 con sustitución H72Y se preparan y examinan en las mismas condiciones. En una realización adicional, el anticuerpo anti-C5 se une a una proteína de C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 a pH 7,4, pero no se une a la proteína de C5 con sustitución H72Y a pH 7,4.
Sin limitarse a ninguna teoría particular, puede especularse que la unión de un anticuerpo anti-C5 a C5 se reduce (o casi se pierde) cuando se sustituye un residuo de aminoácido en C5 por otro aminoácido, lo cual significa que el residuo de aminoácido en C5 es crítico para las interacciones entre el anticuerpo anti-C5 y C5, y que el anticuerpo puede reconocer un epítopo alrededor del residuo de aminoácido en C5.
En la presente invención se ha descubierto que un grupo de anticuerpos anti-C5 que compiten entre sí o se unen al mismo epítopo pueden mostrar características de unión dependiente del pH. Entre los aminoácidos, histidina, con un valor de pKa de aproximadamente 6,0 a 6,5, puede tener diferentes estados de disociación de protones entre pH neutro y ácido. Por tanto, un residuo de histidina en C5 puede contribuir a las interacciones dependientes del pH entre un anticuerpo anti-C5 y C5. Sin limitarse a ninguna teoría particular, puede especularse que un anticuerpo anti-C5 puede reconocer una estructura conformacional alrededor de un residuo de histidina en C5, que puede variar dependiendo del pH. Esa especulación puede ser compatible con los resultados experimentales descritos a continuación: que la dependencia del pH de un anticuerpo anti-C5 se reduce (o casi se pierde) cuando se sustituye un residuo de histidina en C5 por otro aminoácido (es decir, un anticuerpo anti-C5 con características de unión dependiente del pH se une a un mutante de histidina de C5 con afinidad similar a C5 de tipo natural a pH neutro, mientras que el mismo anticuerpo se une al mutante de histidina de C5 con afinidad mayor que a C5 de tipo natural a pH ácido).
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 de más de una especie. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 de ser humano y de un animal no humano. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 de ser humano y de mono (por ejemplo, macaco cangrejero, mono Rhesus, tití, chimpancé o babuino).
En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-C5 que inhiben la activación de C5. En determinadas realizaciones, se dan a conocer anticuerpos anti-C5 que evitan la escisión de C5 para formar C5a y C5b, por tanto evitando la generación de actividad anafilotóxica asociada con C5a, así como evitando el ensamblaje del complejo de ataque a la membrana (MAC) de C5b-9 asociado con C5b. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 que bloquean la conversión de C5 para dar C5a y C5b mediante C5 convertasa. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 que bloquean el acceso de la C5 convertasa al sitio de escisión en C5. En determinadas realizaciones, se dan a conocer anticuerpos anti-C5 que bloquean la actividad hemolítica provocada por la activación de C5. En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-C5 de la presente divulgación inhiben la activación de C5 mediante la ruta clásica y/o ruta alternativa.
En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-C5 que inhiben la activación de una variante de C5. Una variante de C5 significa una variante genética de C5 que se debe a variación genética tal como una mutación, polimorfismo o variación alélica. Una variación genética puede comprender una deleción, sustitución o inserción de uno o más nucleótidos. Una variante de C5 puede comprender una o más variaciones genéticas en C5. En determinadas realizaciones, la variante de C5 tiene actividad biológica similar a C5 de tipo natural. Tal variante de C5 puede comprender al menos una variación seleccionada del grupo que consiste en V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D. En el presente documento, R885H, por ejemplo, significa una variación genética en la que la arginina en la posición 885 está sustituida por histidina. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación inhibe la activación tanto de C5 de tipo natural como de al menos una variante de C5 seleccionada del grupo que consiste en V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 111.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención comprende un VH y VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención comprende un VH y VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-C5 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se da a conocer un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2. Tal como se demuestra mediante los ejemplos de realización a continuación, todos los anticuerpos anti-C5 descritos en la tabla 2 se agrupan en la misma agrupación de epítopos de C5 y muestran características de unión dependiente del pH.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo proporcionado en el presente documento. En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en las tablas 7 u 8. En determinadas realizaciones, se da a conocer un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33-124 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40). En determinadas realizaciones, se da a conocer un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40) que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110. En determinadas realizaciones, se da a conocer un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40) que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 e His110. En otra realización, un epítopo de un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación es un epítopo conformacional.
En un aspecto adicional de la divulgación, un anticuerpo anti-C5 según cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-C5 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG1 de longitud completa.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-C5 según cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, de manera individual o en combinación, tal como se describen en las secciones 1-7 a continuación.
1. Afinidad de anticuerpo
En determinadas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de 1 microM o menos, 100 nMo menos, 10 nMo menos, 1 nM o menos, 0,1 nM o menos, 0,01 nM o menos o 0,001 nM o menos (por ejemplo, 10‘8 M o menos, por ejemplo, desde 10‘8 M hasta 10‘13 M, por ejemplo, desde 10‘9 M hasta 10‘13 M).
En una realización, Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En una realización, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en disolución de Fab por antígeno equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno sin marcar, capturando después antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chenet al.,J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocilios de MICROTITER (marca registrada) (Thermo Scientific) durante la noche con 5 microg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con albúmina de suero bovina al 2% (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 grados C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, compatible con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Prestaet al.,Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Después se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más prolongado (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de eso, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Después se retira la disolución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 al 0,1% (TWEEN-20 (marca registrada)) en PBS. Cuando se han secado las placas, se añaden 150 microl/pocillo de agente de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas con un contador gamma TOPCo Un T™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que proporcionan menos del o igual al 20% de la unión máxima para su uso en ensayos de unión de competición.
Según otra realización, Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial de BIACORE (marca registrada). Por ejemplo, un ensayo usando un dispositivo BIACORE (marca registrada)-2000 o BIACORE (marca registrada)-3000 (BIACORE (marca registrada), Inc., Piscataway, NJ) se realiza a 25 grados C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En una realización, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE (marca registrada), Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. Se diluye antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 microg/ml (~0,2 microM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 microl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones de cinética, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo de polisorbato 20 al 0,05% (TWEEN-20™) (PBST) a 25 grados C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 microl/minuto. Se calculan velocidades de asociación (kasoc) y velocidades de disociación (kd¡s) usando un simple modelo de unión de Langmuir de uno a uno (software de evaluación de BIACORE (marca registrada) versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y de disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la razón kdis/asoc. Véase, por ejemplo, Chenet al.,J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación supera 106 M'1 s_1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 grados C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma de Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones recientes de antígeno tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitación.
2. Fragmentos de anticuerpo
En determinadas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudsonet al.,Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer- Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes estadounidenses n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para una discusión de fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de tipo natural y que tienen semividain vivoaumentada, véase la patente estadounidense n.° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudsonet al.,Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollingeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudsonet al.,Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un único dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de un único dominio es un anticuerpo de un único dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.248.516 B1).
Pueden producirse fragmentos de anticuerpo mediante diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como producción mediante células huésped recombinantes (por ejemplo,E. colio fagos), tal como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En determinadas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento es un anticuerpo quimérico.
Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4.816.567; y Morrisonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo sometido a “conmutación de clase” en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad frente a seres humanos, al tiempo que se conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, CDR, (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y los FR (o porciones de los mismos) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen por residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de anticuerpo.
Se revisan anticuerpos humanizados y métodos de producción de los mismos, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmannet al.,Nature 332:323-329 (1988); Queenet al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes estadounidenses n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiriet al.,Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto de región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el “tratamiento de superficie”); Dall'Acquaet al.,Methods 36:43-60 (2005) (que describe el “ intercambio de FR”); y Osbournet al.,Methods 36:61-68 (2005) y Klimkaet al.,Br. J. Cancer 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque de “selección guiada” para el intercambio de FR).
Las regiones de marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones de regiones marco seleccionadas usando el método de “mejor ajuste” (véase, por ejemplo, Simset al.,J. Immunol.
151:2296 (1993)); regiones de marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carteret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); y Prestaet al.,J. Immunol. 151:2623 (1993)); regiones de marco maduras humanas (mutadas de manera somática) o regiones de marco de línea germinal humanas (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones de marco derivadas del examen de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Bacaet al.,J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosoket al.,J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Anticuerpos humanos
En determinadas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento es un anticuerpo humano. Pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos de manera general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharma. 5:368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a exposición antigénica. Tales animales contienen normalmente la totalidad o una porción de los loci de inmunoglobulina humana, que sustituyen a los loci de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de manera extracromosómica o integrados de manera aleatoria en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, generalmente los loci de inmunoglobulina endógena se han inactivado. Para una revisión de métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología de XENOMOUSE™; la patente estadounidense n.° 5.770.429 que describe la tecnología de HUMAB (marca registrada); la patente estadounidense n.° 7.041.870 que describe la tecnología de K-M MOUSE (marca registrada), y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología de VELOCIMOUS<e>(marca registrada). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante combinación con una región constante humana diferente.
También pueden producirse anticuerpos humanos mediante métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humana y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeuret al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerneret al.,J. Immunol. 147:86 (1991)). También se describen anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridoma de células B humanas en Liet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos de IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humanos-humanos). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) en Vollmers, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) y Vollmers, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191 (2005).
También pueden generarse anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación en fago derivadas de ser humano. Entonces pueden combinarse tales secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. A continuación se describen técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos.
5. Anticuerpos derivados de bibliotecas
Pueden aislarse anticuerpos de la invención examinando bibliotecas combinatorias para detectar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conoce una variedad de métodos en la técnica para generar bibliotecas de presentación en fago y examinar tales bibliotecas para detectar anticuerpos que presentan las características de unión deseadas. Tales métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboomet al.,Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCaffertyet al.,Nature 348:552-554; Clacksonet al.,Nature 352:624-628 (1991); Markset al.,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks, Met. Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhuet al.,J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Leeet al.,J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); Leeet al.,J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004).
En determinados métodos de presentación en fagos, se clonan por separado repertorios de genes de VH y VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan de manera aleatoria en bibliotecas de fagos, que entonces se examinan para detectar fago de unión a antígeno tal como se describe en Winteret al.,Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Normalmente los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, o bien como fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las bibliotecas a partir de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad frente al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio nativo puede clonarse (por ejemplo, a partir de ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos frente a una amplia gama de antígenos distintos de autoantígenos y también autoantígenos sin ninguna inmunización tal como se describe por Griffithset al.,EMBO J, 12:725-734 (1993). Finalmente, también pueden prepararse bibliotecas no expuestas previamente a antígeno mediante síntesis clonando segmentos de gen V no sometidos a transposición a partir de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y lograr la transposiciónin vitro,tal como se describe por Hoogenboom, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente estadounidense n.° 5.750.373, y las publicaciones estadounidenses n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados a partir de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.
6. Anticuerpos multiespecíficos
En determinadas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es para C5 y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de C5. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos frente a células que expresan C5. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)), documento WO 93/08829 yTrauneckeret al.,EMBO J. 10:3655 (1991)), e ingeniería de “botón en ojal” (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.731.168). También pueden producirse anticuerpos multiespecíficos mediante modificación por ingeniería de efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.676.980, y Brennanet al.,Science 229:81 (1985)); uso de cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelnyet al.,J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)); uso de tecnología de “diacuerpos” para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollingeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); y uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (scFv) (véase, por ejemplo, Gruberet al.,J. Immunol. 152:5368 (1994)); y preparación de anticuerpos triespecíficos tal como se describe, por ejemplo, en Tuttet al.,J. Immunol. 147:60 (1991).
También se incluyen en el presente documento anticuerpos modificados por ingeniería con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo “anticuerpos de tipo pulpo” (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).
El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un “Fab de acción doble” o “DAF” que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a C5 así como a otro antígeno diferente (véase el documento US 2008/0069820, por ejemplo).
7. Variantes de anticuerpos
En determinadas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para obtener el constructo final, siempre que el constructo final presente las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
a. Variantes de sustitución, inserción y deleción
En determinadas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácido. Los sitios de interés para mutagénesis por sustitución incluyen las HVR y los FR. En la tabla 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el título de “sustituciones preferidas”. En la tabla 1 se proporcionan cambios más sustanciales bajo el título de “sustituciones a modo de ejemplo” y tal como se describe a continuación con referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoácido en un anticuerpo de interés y examinarse los productos para detectar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, reducción de inmunogenicidad o aumento de ADCC o CDC.
[Tabla 1]
Pueden agruparse aminoácidos según propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; y (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas conllevarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) con respecto al anticuerpo original y/o habrán conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución a modo de ejemplo es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse de manera conveniente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en presentación en fagos tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y se presentan los anticuerpos variantes en fagos y se examinan para detectar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Pueden producirse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de anticuerpo. Tales alteraciones pueden producirse en “puntos críticos” de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el procedimiento de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o residuos que entran en contacto con antígeno, sometiéndose el VH o VL variante resultante a prueba para determinar la afinidad de unión. La maduración por afinidad mediante construcción y reselección a partir de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboomet al.,en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunas realizaciones de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, intercambio de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Después se crea una biblioteca secundaria. Después se examina la biblioteca para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos cada vez). Pueden identificarse específicamente residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis por barrido con alanina o modelado. Con frecuencia se seleccionan en particular<c>DR-H3 y CDR-L3 como diana.
En determinadas realizaciones, pueden producirse sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse a antígeno. Por ejemplo, pueden producirse en HVR alteraciones conservativas (por ejemplo, sustituciones conservativas tal como se proporciona en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión. Tales alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de residuos de contacto con antígeno en las HVR. En determinadas realizaciones de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR o bien no está alterada o bien contiene no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácido.
Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden seleccionarse como diana para la mutagénesis se denomina “mutagénesis por barrido con alanina” tal como se describe por Cunningham, Science 244:1081-1085 (1989). En este método, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativa o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos contiguos pueden seleccionarse como diana o eliminarse como candidatos para la sustitución. Pueden examinarse variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi-terminales cuya longitud oscila entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos de aminoácido. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C-terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
b. Variantes de glicosilación
En determinadas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento se altera para aumentar o reducir el alcance al que se glicosila el anticuerpo. La adición o deleción de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede lograrse de manera conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que se crean o se retiran uno o más sitios de glicosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región de Fc, puede alterarse el hidrato de carbono unido al mismo. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero comprenden normalmente un oligosacárido ramificado biantenario que se une generalmente mediante una unión en N a Asn297 del dominio CH2 de la región de Fc. Véase, por ejemplo, Wrightet al.,TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos hidratos de carbono, por ejemplo, manosa, N-acetil-glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como fucosa unida a un GlcNAc en el “tallo” de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, pueden producirse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpos con determinadas propiedades mejoradas.
En una realización, se dan a conocer variantes de anticuerpos que tienen una estructura de hidrato de carbono que carece de una fucosa unida (directa o indirectamente) a una región de Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de desde el 1% hasta el 80%, desde el 1% hasta el 65%, desde el 5% hasta el 65% o desde el 20% hasta el 40%. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) tal como se mide mediante espectrometría de masas de MALDI-TOF, tal como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región de Fc (numeración de Eu de los residuos de región de Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar ubicado aproximadamente /- 3 aminoácidos en el sentido de 5' o en el sentido de 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia minoritarias en anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden tener una función de ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente estadounidense n.os US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos “desfucosiladas” o “deficientes en fucosa” incluyen: documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazakiet al.,J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiet al.,Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripkaet al.,Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); documento US 2003/0157108, Presta, L; y documento W<o>2004/056312, Adamset al.,especialmente en el ejemplo 11), y líneas celulares desactivadas, tales como células CHO con desactivación del gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8 (véase, por ejemplo, Yamane- Ohnukiet al.,Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kandaet al.,Biotechnol. Bioeng.
94(4):680-688 (2006); y documento WO2003/085107).
Se dan a conocer adicionalmente variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario unido a la región de Fc del anticuerpo se biseca mediante GlcNAc. Tales variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de tales variantes de anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairetet al.);la patente estadounidense n.° 6.602.684 (Umanaet al.);y el documento US 2005/0123546 (Umanaet al.).También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región de Fc. Tales variantes de anticuerpos pueden tener una función de CDC mejorada. Tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patelet al.);WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Variantes de región de Fc
En determinadas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácido en la región de Fc de un anticuerpo dado a conocer en el presente documento, generando de ese modo una variante de región de Fc. La variante de región de Fc puede comprender una secuencia de región de Fc humana (por ejemplo, una región de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.
En determinadas realizaciones, la divulgación contempla una variante de anticuerpo que presenta algunas pero no todas las funciones efectoras, lo cual hace que sea un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante pero determinadas funciones efectoras (tal como, complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/agotamiento de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a R de Fc gamma (por tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en ADCC, células NK, expresan únicamente RIII de Fc gamma, mientras que los monocitos expresa RI de Fc gamma, RII de Fc gamma y RIII de Fc gamma. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitativos de ensayosin vitropara evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en la patente estadounidense n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstromet al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstromet al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); patente estadounidense n.° 5.821.337 (véase Bruggemannet al.,J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, pueden emplearse métodos de ensayo no radiactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACT1™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (marca registrada) (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, puede evaluarse la actividad de ADCC de la molécula de interésin vivo,por ejemplo, en un modelo de animal tal como el dado a conocer en Clyneset al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad de CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos W o 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoroet al.,J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragget al.,Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragget al.,Blood 103:2738-2743 (2004)). También pueden realizarse determinaciones de unión a FcRn y de aclaramiento/semividain vivousando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkovaet al.,Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de región de Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense n.° 6.737.056). Tales mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de Fc “DANA” con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente estadounidense n.° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpos con unión mejorada o reducida a FcR (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312, y Shieldset al.,J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)).
En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región de Fc con una o más sustituciones de aminoácido que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región de Fc (numeración de EU de residuos).
En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región de Fc que dan como resultado una unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, o bien mejoradas o bien reducidas), por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.194.551, el documento WO 1999/51642 e Idusogieet al.,J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
Anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al.,J. Immunol. 117:587 (1976) y Kimet al.,J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934 (Hintonet al.).Estos anticuerpos comprenden una región de Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región de Fc a FcRn. Tales variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de región de Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo de región de Fc 434 (patente estadounidense n.° 7.371.826).
Véase también Duncan, Nature 322:738-40 (1988); patente estadounidense n.° 5.648.260; patente estadounidense n.° 5.624.821; y documento WO 1994/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de región de Fc.
d. Variantes de anticuerpos modificadas por ingeniería con cisteína
En determinadas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína, por ejemplo, “tioAcM”, en los que uno o más residuos de un anticuerpo están sustituidos por residuos de cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo esos residuos por cisteína, de ese modo se posicionan grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármacos o restos de grupo de unión-fármaco, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinadas realizaciones, puede sustituirse uno cualquiera o más de los siguientes residuos por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la región de Fc de cadena pesada. Pueden generarse anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.521.541.
e. Derivados de anticuerpos
En determinadas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Estos restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (o bien homopolímeros o bien copolímeros al azar), y dextrano o poli(n-vinil-pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización puede determinarse basándose en consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que van a mejorarse, si el anticuerpo derivado se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.
En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y resto no proteico que pueden calentarse selectivamente mediante exposición a radiación. En una realización, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kamet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no perjudican a células habituales, pero que calientan el resto no proteico hasta una temperatura a la que se destruyen las células proximales al anticuerpo-resto no proteico.
B. Métodos recombinantes y composiciones
Pueden producirse anticuerpos usando métodos recombinantes y composiciones, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 4.816.567. En una realización, se proporciona ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo anti-C5 que comprende una secuencia de VH de<S e Q>ID NO: 106 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 111 descrito en el presente documento. En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende tal ácido nucleico. En una realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de VL de SEQ ID NO: 111, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de VL de SEQ ID NO: 111. En una realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En una realización, se proporciona un método de producción de un anticuerpo anti-C5, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, tal como se proporcionó anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo a partir de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-C5, se aísla ácido nucleico que codifica para un anticuerpo, por ejemplo, tal como se describió anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para su clonación adicional y/o expresión en una célula huésped. Tal ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican para anticuerpo incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular cuando no se necesita glicosilación y función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli).Tras la expresión, puede aislarse el anticuerpo a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican para anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glicosilación se han “humanizado”, dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Liet al.,Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
También se derivan células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado a partir de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células invertebradas incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que pueden usarse junto con células de insecto, particularmente para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.
También pueden usarse cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología de PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También pueden usarse células de vertebrados como huéspedes. Por ejemplo, líneas celulares de mamíferos que están adaptadas para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7); línea de riñón embrionaria humana (293 o células 293 tal como se describe, por ejemplo, en Grahamet al.,J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster recién nacido (BHK); células Sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humanas (HELA); células de riñón caninas (MDCK; células de hígado de rata Búfalo (BRL 3A); células de pulmón humanas (W138); células de hígado humanas (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, tal como se describe, por ejemplo, en Matheret al.,Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaubet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003).
Preferiblemente se producen anticuerpos policlonales en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en la especie que va a inmunizarse, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de semilla de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2 o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Se inmunizan animales (habitualmente mamíferos no humanos) frente al antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 microg o 5 microg de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se administra un refuerzo a los animales con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después, se extrae sangre de los animales y se somete el suero a ensayo para determinar el título de anticuerpos. Se administran refuerzos a los animales hasta que su título alcanza una meseta. Preferiblemente, se administra un refuerzo al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o mediante un reactivo de reticulación diferente. También pueden producirse conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. Además, se usan de manera adecuada agentes de agregación tales como alúmina para potenciar la respuesta inmunitaria.
Se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural y/o modificaciones postraduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo de no ser una mezcla de anticuerpos diferenciados.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden realizarse usando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohleret al.Nature 256(5517): 495-497 (1975). En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, tal como se describió anteriormente en el presente documento para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse linfocitosin vitro.
El agente de inmunización incluirá normalmente la proteína antigénica o una variante de fusión de la misma. Generalmente, o bien se usan linfocitos de sangre periférica (PBL) si se desean células de origen humano o bien se usan células de bazo o células de ganglio linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. Después se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), págs.
59-103).
Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosilo transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), que son sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes para HGPRT.
Las células de mieloma inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan producción de anticuerpos a alto nivel estable mediante las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre las mismas, se prefieren líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y células SP-2 (y derivadas de las mismas, por ejemplo, X63-Ag8-653) disponibles de la Colección americana de cultivos tipo, Manassas, Virginia, EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humanas y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozboret al.,J Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeuret al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987), págs. 51-63).
El medio de cultivo en el que están creciendo las células de hibridoma se somete a ensayo para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos mediante células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de uniónin vitro,tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión puede determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson, Anal Biochem. 107(1):220-239 (1980).
Tras identificarse las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, pueden subclonarse los clones mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer mediante métodos convencionales (Goding, citado anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecerin vivocomo tumores en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Pueden producirse anticuerpos inmunizando un animal huésped apropiado frente a un antígeno. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende una C5 de longitud completa. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende el dominio MG1-MG2 (SEQ ID NO: 43) de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende el dominio MG1 (SEQ ID NO: 41) de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 19 a 180 de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 33 a 124 de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende al menos un fragmento seleccionado de los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende un fragmento de la cadena beta de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 e His110. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende un fragmento de la cadena beta de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110. También se incluyen en la presente invención anticuerpos producidos inmunizando un animal frente al antígeno. Los anticuerpos pueden incorporar cualquiera de las características, de manera individual o en combinación, tal como se describió anteriormente en “anticuerpos anti-C5 a modo de ejemplo”.
C. Ensayos
Los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento pueden identificarse, seleccionarse o caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de unión y otros ensayos
En un aspecto, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, mediante métodos conocidos tales como ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, BIACORE (marca registrada), etc.
En otro aspecto, pueden usarse ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite por la unión a C5 con un anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento. En determinadas realizaciones, cuando un anticuerpo de competencia de este tipo está presente en exceso, bloquea (por ejemplo, reduce) la unión de un anticuerpo de referencia a C5 en al menos el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% o más. En algunos casos, se inhibe la unión en al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o más. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de competencia de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) al que se une un anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 descrito en la tabla 2). Se proporcionan métodos a modo de ejemplo detallados para el mapeo de un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris, “Epitope Mapping Protocols”, en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) (1996).
En un ensayo de competición a modo de ejemplo, se incuba C5 inmovilizada en una disolución que comprende un primer anticuerpo (de referencia) marcado que se une a C5 y un segundo anticuerpo sin marcar que está sometiéndose a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a C5. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba C5 inmovilizada en una disolución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo sin marcar. Tras la incubación en condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo a C5, se retira el anticuerpo sin unir en exceso y se mide la cantidad de marcador asociado con C5 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con C5 inmovilizada está sustancialmente reducida en la muestra de prueba con respecto a la muestra de control, entonces esto indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a C5. Véase, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1988).
En otro ensayo de competición a modo de ejemplo, se usa un análisis de BIACORE (marca registrada) para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-C5 de prueba para competir por la unión a C5 con un segundo anticuerpo anti-C5 (de referencia). En un aspecto adicional en el que se hace funcionar un instrumento de BIACORE (marca registrada) (por ejemplo, el dispositivo BIACORE (marca registrada) 3000) según las recomendaciones del fabricante, se captura proteína de C5 en un chip CM5 de BIACORE (marca registrada) usando una técnica convencional conocida en la técnica para generar una superficie recubierta con C5. Normalmente se acoplarán 200-800 unidades de resonancia de C5 al chip (una cantidad que proporciona niveles fácilmente medibles de unión pero que puede saturarse fácilmente por las concentraciones de anticuerpo de prueba que están usándose). Los dos anticuerpos (es decir, el anticuerpo de prueba y el de referencia) que van a evaluarse para determinar su capacidad para competir entre sí se mezclan en una razón molar de 1:1 de sitios de unión en un tampón adecuado para crear una mezcla de prueba. Cuando se calculan las concentraciones basándose en los sitios de unión, se supone que el peso molecular de un anticuerpo de prueba o de referencia es el peso molecular total del anticuerpo correspondiente dividido entre el número de sitios de unión a C5 en el anticuerpo. La concentración de cada anticuerpo (es decir, anticuerpo de prueba y de referencia) en la mezcla de prueba debe ser lo suficientemente alta como para saturar fácilmente los sitios de unión para ese anticuerpo en las moléculas de C5 capturadas en el chip de BIACORE (marca registrada). Los anticuerpos de prueba y de referencia en la mezcla están a la misma concentración molar (basándose en la unión), normalmente entre 1,00 y 1,5 micromolar (basándose en sitios de unión). También se preparan disoluciones independientes que contienen el anticuerpo de prueba solo y el anticuerpo de referencia solo. El anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia en estas disoluciones deben estar en el mismo tampón y en la misma concentración y condiciones que en la mezcla de prueba. Se hace pasar la mezcla de prueba que contiene el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia sobre el chip de BIACORE (marca registrada) recubierto con C5 y se registra la cantidad total de unión. Después se trata el chip de tal manera que se retira el anticuerpo de prueba o de referencia unido sin dañar la C5 unida a chip. Normalmente, esto se realiza tratando el chip con HCl 30 mM durante 60 segundos. Después se hace pasar la disolución de anticuerpo de prueba solo sobre la superficie recubierta con C5 y se registra la cantidad de unión. Se trata de nuevo el chip para retirar todo el anticuerpo unido sin dañar la C5 unida a chip. Después se hace pasar la disolución de anticuerpo de referencia solo sobre la superficie recubierta con C5 y se registra la cantidad de unión. A continuación se calcula la unión teórica máxima de la mezcla de anticuerpo de prueba y anticuerpo de referencia y es la suma de la unión de cada anticuerpo (es decir, de prueba y de referencia) cuando se hace pasar sobre la superficie de C5 solo. Si la unión registrada real de la mezcla es menor que este máximo teórico, entonces el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia están compitiendo entre sí por la unión a C5. Por tanto, en general, un anticuerpo anti-C5 de prueba de competencia es uno que se unirá a C5 en el ensayo de bloqueo de BIACORE (marca registrada) anterior de tal manera que, durante el ensayo y en presencia del anticuerpo anti-C5 de referencia, la unión registrada es de entre el 80% y el 0,1% (por ejemplo, 80% > 4%) de la unión teórica máxima, específicamente entre el 75% y el 0,1 % (por ejemplo, del 75% al 4%) de la unión teórica máxima, y más específicamente entre el 70% y el 0,1% (por ejemplo, del 70% al 4%) de la unión teórica máxima (tal como se definió anteriormente) del anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia en combinación.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de anticuerpo CFA0341 y CFA0330. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con un anticuerpo seleccionado de: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 y CFA0672. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con anticuerpo CFA0329. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con anticuerpo CFA0666.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL de anticuerpo CFA0305 o 305LO5.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 y CFA0672. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con anticuerpo CFA0666. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL de anticuerpo CFA0305 o 305LO5. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y<V l>seleccionado de un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 26, o un VH de SEQ ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (b) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (c) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (d) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (e) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (f) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; y (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con anticuerpo que comprende un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con anticuerpo que comprende un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y<V l>seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 26; (c) un VH de SEQ ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 25; (d) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (e) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (f) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (g) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (h) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (i) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (j) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (k) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; (l) un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 27; y (m) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 26; (b) un VH de SEQ ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 25; (c) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (d) un VH de SEQ ID NON y un VL de SEQ ID NO: 14; (e) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (f) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (g) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (h) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (i) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (j) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; (k) un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 27.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11, o un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido y compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y (j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido y compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de: (a) un<V h>de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (b) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (c) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (d) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (e) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (f) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; y (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH neutro que a pH ácido y compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL seleccionado de un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11, o un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una afinidad mayor a pH 7,4 que a pH 5,8.
En determinadas realizaciones, puede determinarse si un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a un determinado epítopo de la siguiente manera: se expresan mutantes puntuales de C5 en los que un aminoácido (excepto por alanina) en C5 está sustituido por alanina en células293, y se somete a prueba la unión de un anticuerpo anti-C5 a los mutantes de C5 mediante ELISA, inmunotransferencia de tipo Western o BIACORE (marca registrada); en el que una reducción o eliminación sustancial de la unión del anticuerpo anti-C5 al mutante de C5 con respecto a su unión a C5 de tipo natural indica que el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo que comprende ese aminoácido en C5. En determinadas realizaciones, el aminoácido en C5 que va a sustituirse por alanina se selecciona del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40). En realizaciones adicionales, el aminoácido en C5 que va a sustituirse por alanina es Asp51 o Lys109 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40).
En otra realización, puede determinarse si un anticuerpo anti-C5 con características de unión dependiente del pH se une a un determinado epítopo de la siguiente manera: se expresan mutantes puntuales de C5 en los que un residuo de histidina en C5 está sustituido por otro aminoácido (por ejemplo, tirosina) en células 293, y se somete a prueba la unión de un anticuerpo anti-C5 a los mutantes de C5 mediante ELISA, inmunotransferencia de tipo Western o BIACORE (marca registrada); en el que una reducción sustancial de la unión del anticuerpo anti-C5 a C5 de tipo natural a pH ácido con respecto a su unión al mutante de C5 a pH ácido, indica que el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo que comprende ese residuo de histidina en C5. En realizaciones adicionales, la unión del anticuerpo anti-C5 a C5 de tipo natural a pH neutro no está sustancialmente reducida con respecto a su unión al mutante de C5 a pH neutro. En determinadas realizaciones, el residuo de histidina en C5 que va a sustituirse por otro aminoácido se selecciona del grupo que consiste en His70, His72 e His110 de la cadena beta de C5<( s E q>ID NO: 40). En una realización adicional, el residuo de histidina His70 se sustituye por tirosina.
2. Ensayos de actividad
En un aspecto, se dan a conocer ensayos para identificar anticuerpos anti-C5 de los mismos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, inhibir la activación de C5, prevenir la escisión de C5 para formar C5a y C5b, bloquear el acceso de C5 convertasa al sitio de escisión en C5, bloquear la actividad hemolítica provocada por la activación de C5, etc. También se proporcionan anticuerpos que tienen tal actividad biológicain vivoy/oin vitro.
En determinadas realizaciones, se somete a prueba un anticuerpo de la divulgación para detectar tal actividad biológica.
En determinadas realizaciones, se determina si un anticuerpo de prueba inhibe la escisión de C5 para dar C5a y C5b, mediante métodos descritos, por ejemplo, en Isenmanet al.,J Immunol. 124(1):326-331 (1980). En otra realización, esto se determina mediante métodos para la detección específica de proteínas C5a y/o C5b escindidas, por ejemplo, ELISA o inmunotransferencias de tipo Western. Cuando se detecta una cantidad reducida de un producto de escisión de C5 (es decir, C5a y/o C5b) en presencia de (o tras el contacto con) el anticuerpo de prueba, se identifica que el anticuerpo de prueba es un anticuerpo que puede inhibir la escisión de C5. En determinadas realizaciones, la concentración y/o actividad fisiológica de C5a puede medirse mediante métodos, por ejemplo, ensayos de quimiotáxis, RIA o ELISA (véase, por ejemplo, Ward yZvaifler J. Clin. Invest. 50(3):606-616 (1971)).
En determinadas realizaciones, si un anticuerpo de prueba bloquea el acceso de C5 convertasa a C5 se determina mediante métodos para la detección de interacciones de proteínas entre la C5 convertasa y C5, por ejemplo, ELISA o BIACORE (marca registrada). Cuando se reducen las interacciones en presencia de (o tras el contacto con) el anticuerpo de prueba, se identifica que el anticuerpo de prueba es un anticuerpo que puede bloquear el acceso de C5 convertasa a C5.
En determinadas realizaciones, puede medirse la actividad de C5 en función de su capacidad de lisis celular en los líquidos corporales de un sujeto. La capacidad de lisis celular, o una reducción de la misma, de C5 puede medirse mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, un ensayo hemolítico convencional, tal como el ensayo de hemolisis descrito por Kabat and Mayer (eds), Experimental Immunochemistry, 2a edición, 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), páginas 135-139, o una variación convencional de ese ensayo, tal como el método de hemolisis de eritrocitos de pollo tal como se describe, por ejemplo, en Hillmenet al.,N. Engl. J. Med. 350(6): 552-559 (2004). En determinadas realizaciones, la actividad de C5, o inhibición de la misma, se cuantifica usando un ensayo de CH50eq. El ensayo de CH50eq es un método para medir la actividad clásica total del complemento en suero. Esta prueba es un ensayo de lisis, que usa eritrocitos sensibilizados frente a anticuerpo como activador de la ruta del complemento clásica, y diversas diluciones del suero de prueba para determinar la cantidad requerida para proporcionar una lisis del 50% (CH50). El porcentaje de hemolisis puede determinarse, por ejemplo, usando un espectrofotómetro. El ensayo de CH50eq proporciona una medida indirecta de la formación de complejo del complemento terminal (TCC), dado que los propios TCC son directamente responsables de la hemolisis medida. La inhibición de la activación de C5 también puede detectarse y/o medirse usando los métodos expuestos y ejemplificados en los ejemplos de realización. Usando ensayos de estos u otros tipos adecuados, pueden examinarse anticuerpos candidatos que pueden inhibir la activación de C5. En determinadas realizaciones, la inhibición de la activación de C5 incluye una reducción de al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 40% o más en la activación de C5 en un ensayo en comparación con el efecto de un control negativo en condiciones similares. En algunas realizaciones, se refiere a la inhibición de la activación de C5 en al menos el 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más.
D. Inmunoconjugados
La divulgación también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-C5 en el presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterápicos o fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas de proteínas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o isótopos radiactivos.
En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo está conjugado a uno o más fármacos, incluyendo, pero sin limitarse a, un maitansinoide (véanse las patentes estadounidenses n.os 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0425235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse las patentes estadounidenses n.os 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (véanse las patentes estadounidenses n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinmanet al.,Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lodeet al.,Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorubicina (véase Kratzet al.,Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffreyet al.,Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgovet al.,Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagyet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchiket al.,Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); Kinget al.,J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente estadounidense n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo tal como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa),cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor deMomordica charantia,curcina, crotina, inhibidor deSapaonaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo tal como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Hay una variedad de isótopos radiactivos disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios de centellografía, por ejemplo tc99m o I123, o un marcador de espín para obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, IRM), tales como yodo 123 de nuevo, yodo 131, indio 111, flúor 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro.
Pueden prepararse conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento a proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricino tal como se describe en Vitettaet al.,Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El grupo de unión puede ser un “grupo de unión escindible” que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un grupo de unión lábil en medio ácido, grupo de unión sensible a peptidasa, grupo de unión fotolábil, grupo de unión de dimetilo o grupo de unión que contiene disulfuro (Chariet al.,Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente estadounidense n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o ADC en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, tales conjugados preparados con reactivos de reticulación incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SlAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU.).
E. Métodos y composiciones para diagnóstico y detección
En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de C5 en una muestra biológica. El término “detectar” tal como se usa en el presente documento abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como suero, sangre completa, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, suspensión celular, saliva, esputo, líquido oral, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido ascítico, leche, calostro, secreción de glándulas mamarias, linfa, orina, sudor, líquido lagrimal, líquido gástrico, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido para lente ocular y mucosa.
En una realización, se da a conocer un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de diagnosis o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método de detección de la presencia de C5 en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-C5 tal como se describe en el presente documento en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-C5 a C5, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-C5 y<c>5. Tal método puede ser un métodoin vitro.En una realización, un anticuerpo anti-C5 es para su uso en un método de selección de sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-C5, por ejemplo, cuando C5 es un biomarcador para la selección de pacientes.
En otra realización, se proporciona un anticuerpo anti-C5 de la presente invención para su uso en un método de selección de un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5 como adecuado para una terapia. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención es para su uso en un método que comprende (a) detectar una variación genética en C5 derivada del individuo, y (b) seleccionar al individuo como adecuado para la terapia cuando se detecta la variación genética en C5 derivada del individuo. En otra realización, se proporciona un anticuerpo anti-C5 de la presente invención que es para su uso en un método de selección de una terapia para un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención es para su uso en un método que comprende (a) detectar una variación genética en C5 derivada del individuo, y (b) seleccionar una terapia para el individuo cuando se detecta la variación genética en C5 derivada del individuo.
En otra realización, se proporciona un anticuerpo anti-C5 de la presente invención que es para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención es para su uso en un método que comprende (a) detectar una variación genética en C5 derivada del individuo, (b) seleccionar al individuo como adecuado para la terapia cuando se detecta la variación genética en C5 derivada del individuo, y (c) proporcionar el anticuerpo anti-C5 que va a administrarse al individuo.
En otra realización, se da a conocer un anticuerpo anti-C5 de la presente invención para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención es para su uso en un método de tratamiento del individuo cuando se detecta la variación genética en C5 derivada del individuo.
En otra realización, se proporciona un usoin vitrode una variación genética en C5 para seleccionar a un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5 como adecuado para una terapia que comprende un anticuerpo anti-C5 de la presente invención. En determinadas realizaciones, se selecciona al individuo como adecuado para la terapia cuando se detecta la variación genética en C5 derivada del individuo. En otra realización, se proporciona un usoin vitrode una variación genética en C5 para seleccionar una terapia para un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En determinadas realizaciones, se selecciona una terapia que comprende un anticuerpo anti-C5 de la presente invención para el individuo cuando se detecta la variación genética en C5 derivada del individuo.
Se ha notificado que algunos pacientes que tienen una variación genética en C5 muestran una escasa respuesta a una terapia que comprende un anticuerpo anti-C5 existente (Nishimuraet al.,N. Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)). Se recomienda que se trate a un paciente de este tipo con una terapia que comprende un anticuerpo anti-C5 de la presente invención, porque un anticuerpo de este tipo tiene una actividad inhibidora sobre la activación de variantes de C5 así como C5 de tipo natural, tal como se demuestra en los ejemplos de realización a continuación.
La detección de una variación genética en C5 puede llevarse a cabo usando un método conocido en la técnica anterior. Un método de este tipo puede incluir secuenciación, PCR, RT-PCR y un método basado en hibridación tal como transferencia de tipo Southern o transferencia de tipo Northern, pero no se limita a lo mismo. Las variantes de C5 pueden comprender al menos una variación genética. La variación genética puede seleccionarse de un grupo que consiste en V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D. En el presente documento, R885H, por ejemplo, significa una variación genética en la que la arginina en la posición 885 está sustituida por histidina. En determinadas realizaciones, una variante de C5 tiene actividad biológica similar a C5 de tipo natural.
Los trastornos a modo de ejemplo que pueden diagnosticarse usando un anticuerpo de la invención incluyen artritis reumatoide (RA); lupus eritematoso sistémico (SLE); nefritis lúpica; lesión por isquemia-reperfusión (IRI); asma; hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH); síndrome urémico hemolítico (HUS) (por ejemplo, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS)); enfermedad por depósitos densos (DDD); neuromielitis óptica (NMO); neuropatía motora multifocal (m Mn ); esclerosis múltiple (MS); esclerosis sistémica; degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD)); síndrome de hemolisis, nivel elevado de enzimas hepáticas y nivel bajo de plaquetas (HELLP); púrpura trombocitopénica trombótica (TTP); muerte fetal espontánea; epidermólisis ampollosa; muerte fetal recurrente; pre-eclampsia; lesión cerebral por traumatismo; miastenia grave; enfermedad de aglutininas frías; síndrome de Sjogren; dermatomiositis; penfigoide bulloso; reacciones fototóxicas; síndrome urémico hemolítico relacionado conE. coliproductora de toxina Shiga; síndrome urémico hemolítico típico o infeccioso (tHUS); glomerulonefritis C3; vasculitis asociada con anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA); rechazo de trasplante humoral y vascular; rechazo mediado por anticuerpos agudo (AMR); disfunción de injerto; infarto de miocardio; un trasplante alogénico; septicemia; arteriopatía coronaria; angioedema hereditario; dermatomiositis; enfermedad de Graves; aterosclerosis; enfermedad de Alzheimer (AD); enfermedad de Huntington; enfermedad de Creutzfeld-Jacob; enfermedad de Parkinson; cánceres; heridas; choque séptico; lesión de la médula espinal; uveítis; enfermedades oculares diabéticas; retinopatía del prematuro; glomerulonefritis; nefritis membranosa; nefropatía de inmunoglobulina A; síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); fibrosis quística; anemia hemolítica; hemoglobinuria paroxística por frío; choque anafiláctico; alergia; osteoporosis; osteoartritis; tiroiditis de Hashimoto; diabetes tipo I; psoriasis; pénfigo; anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA); púrpura trombocitopénica idiopática (ITP); síndrome de Goodpasture; enfermedad de Degos; síndrome antifosfolipídico (APS); APS catastrófico (CAPS); un trastorno cardiovascular; miocarditis; un trastorno cerebrovascular; un trastorno vascular periférico; un trastorno renovascular; un trastorno vascular mesentérico/entérico; vasculitis; nefritis púrpura de Henoch-Schonlein; enfermedad de Takayasu; cardiomiopatía dilatada; angiopatía diabética; enfermedad de Kawasaki (arteritis); embolia gaseosa venosa (VGE), reestenosis tras colocación de endoprótesis; aterectomía rotacional; nefropatía membranosa; síndrome de Guillain-Barre (GBS); síndrome de Fisher; artritis inducida por antígenos; inflamación sinovial; infecciones virales; infecciones bacterianas; infecciones fúngicas; y lesión resultante de infarto de miocardio, circulación extracorporal y hemodiálisis.
En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromofóricos, electrodensos, quimioluminiscentes y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa del rábano (HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactoso oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.
F. Formulaciones farmacéuticas
Se preparan formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-C5 tal como se describe en el presente documento mezclando tal anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Generalmente, los portadores farmacéuticamente aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil-parabenos tales como metil o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los portadores farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármaco intersticial tales como glicoproteínas de hialuronidasa activas neutras solubles (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX (marca registrada), Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP a modo de ejemplo y métodos de uso, incluyendo rHuPH2o, tal como se describe en las publicaciones estadounidenses n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.
Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas a modo de ejemplo en la patente estadounidense n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente estadounidense n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón de acetato de histidina.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un principio activo según sea necesario para la indicación particular que está tratándose, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Tales principios activos están presentes de manera adecuad en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.
Los principios activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que van a usarse para la administraciónin vivoson generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
G. Métodos terapéuticos y composiciones
Cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento pueden ser para su uso en métodos terapéuticos.
En un aspecto, se da a conocer un anticuerpo anti-C5 para su uso como medicamento. En aspectos adicionales, se da a conocer un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En determinadas realizaciones, se da a conocer un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de tratamiento. En determinadas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5, en el que el anticuerpo anti-C5 debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz. En una realización de este tipo, el método comprende además proporcionar al menos un agente terapéutico adicional que va a administrarse al individuo en una cantidad eficaz. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
Cuando el antígeno es una proteína soluble, la unión de un anticuerpo a su antígeno puede dar como resultado una semivida prolongada del antígeno en plasma (es decir, aclaramiento reducido del antígeno a partir del plasma), dado que el propio anticuerpo tiene una semivida más larga en plasma y sirve como portador para el antígeno. Esto se debe al reciclaje del complejo de antígeno-anticuerpo mediante FcRn a través de la ruta endosómica en la célula (Roopenian, Nat. Rev. Immunol. 7(9):715-725 (2007)). Sin embargo, se espera que un anticuerpo con características de unión dependiente del pH, que se une a su antígeno en entorno extracelular neutro mientras que lo libera en compartimentos endosómicos ácidos tras la entrada en las células, tenga propiedades superiores en cuanto a neutralización de antígeno y aclaramiento con respecto a su homólogo que se une de una manera independiente del pH (Igawaet al.,Nat. Biotech. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyinaet al.,mAbs 5(6):851-859 (2013); documento WO 2009/125825).
En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma. En determinadas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma en un individuo, en el que el anticuerpo anti-C5 debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz para potenciar el aclaramiento de C5 a partir del plasma. En una realización, un anticuerpo anti-C5 potencia el aclaramiento de C5 a partir del plasma, en comparación con un anticuerpo anti-C5 convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de supresión de la acumulación de C5 en plasma. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de supresión de la acumulación de C5 en plasma en un individuo, en el que el anticuerpo anti-C5 debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz para suprimir la acumulación de C5 en plasma. En una realización, la acumulación de C5 en plasma es el resultado de la formación de un complejo de antígeno-anticuerpo. En otra realización, un anticuerpo anti-C5 suprime la acumulación de C5 en plasma, en comparación con un anticuerpo anti-C5 convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
Un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación puede inhibir la activación de C5. En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de inhibición de la activación de C5. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de inhibición de la activación de C5 en un individuo, en el que el anticuerpo anti-C5 debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz para inhibir la activación de C5. En una realización, la citotoxicidad mediada por C5 se suprime inhibiendo la activación de C5. Un “ individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-C5 en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5, en el que el medicamento debe administrarse a un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5 en una cantidad eficaz. En una realización de este tipo, el método comprende además proporcionar al menos un agente terapéutico adicional que va a administrarse al individuo en una cantidad eficaz. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma en un individuo, en el que el medicamento debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz para potenciar el aclaramiento de C5 a partir del plasma. En una realización, un anticuerpo anti-C5 potencia el aclaramiento de C5 a partir del plasma, en comparación con un anticuerpo anti-C5 convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de supresión de la acumulación de C5 en plasma. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de supresión de la acumulación de C5 en plasma en un individuo, en el que el medicamento debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz para suprimir la acumulación de C5 en plasma. En una realización, la acumulación de C5 en plasma es un resultado de la formación de un complejo de antígeno-anticuerpo. En otra realización, un anticuerpo anti-C5 suprime la acumulación de C5 en plasma, en comparación con un anticuerpo anti-C5 convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
Un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación puede inhibir la activación de C5. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de inhibición de la activación de C5. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de inhibición de la activación de C5 en un individuo, en el que el medicamento debe administrarse al individuo en una cantidad eficaz para inhibir la activación de C5. En una realización, la citotoxicidad mediada por C5 se suprime inhibiendo la activación de C5. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional.
En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica es para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para su uso en un método de potenciación del aclaramiento de C5 a partir del plasma. En una realización, un anticuerpo anti-C5 potencia el aclaramiento de C5 a partir del plasma, en comparación con un anticuerpo anti-C5 convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para su uso en un método de supresión de la acumulación de C5 en plasma. En una realización, la acumulación de C5 en plasma es un resultado de la formación de un complejo de antígeno-anticuerpo. En otra realización, un anticuerpo anti-C5 suprime la acumulación de C5 en plasma, en comparación con un anticuerpo anti-C5 convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. Un anticuerpo anti-C5 de la presente invención puede inhibir la activación de C5. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para su uso en un método de inhibición de la activación de C5. En una realización, la citotoxicidad mediada por C5 se suprime inhibiendo la activación de C5. En una realización, la formulación farmacéutica debe administrarse a un individuo que tiene una enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
En un aspecto, un individuo tiene C5 de tipo natural. En otro aspecto, un individuo tiene una variante de C5. En determinadas realizaciones, una variante de C5 tiene actividad biológica similar a C5 de tipo natural. Una variante de C5 de este tipo puede comprender al menos una variación seleccionada del grupo que consiste en V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D. En el presente documento, R885H, por ejemplo, significa una variación genética en la que la arginina en la posición 885 está sustituida por histidina.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica, que comprenden mezclar cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, los métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica comprenden además añadir al menos un agente terapéutico adicional al medicamento o formulación farmacéutica.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento que implica una activación excesiva o no controlada de C5 se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA); lupus eritematoso sistémico (SLE); nefritis lúpica; lesión por isquemia-reperfusión (IRI); asma; hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH); síndrome urémico hemolítico (HUS) (por ejemplo, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS)); enfermedad por depósitos densos (DDD); neuromielitis óptica (NMO); neuropatía motora multifocal (MMN); esclerosis múltiple (MS); esclerosis sistémica; degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD)); síndrome de hemolisis, nivel elevado de enzimas hepáticas y nivel bajo de plaquetas (HELLP); púrpura trombocitopénica trombótica (TTP); muerte fetal espontánea; epidermólisis ampollosa; muerte fetal recurrente; pre eclampsia; lesión cerebral por traumatismo; miastenia grave; enfermedad de aglutininas frías; síndrome de Sjogren; dermatomiositis; penfigoide bulloso; reacciones fototóxicas; síndrome urémico hemolítico relacionado conE. coliproductora de toxina Shiga; síndrome urémico hemolítico típico o infeccioso (tHUS); glomerulonefritis C3; vasculitis asociada con anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA); rechazo de trasplante humoral y vascular; rechazo mediado por anticuerpos agudo (AMR); disfunción de injerto; infarto de miocardio; un trasplante alogénico; septicemia; arteriopatía coronaria; angioedema hereditario; dermatomiositis; enfermedad de Graves; aterosclerosis; enfermedad de Alzheimer(AD); enfermedad de Huntington; enfermedad de Creutzfeld-Jacob; enfermedad de Parkinson; cánceres; heridas; choque séptico; lesión de la médula espinal; uveítis; enfermedades oculares diabéticas; retinopatía del prematuro; glomerulonefritis; nefritis membranosa; nefropatía de inmunoglobulina A; síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); fibrosis quística; anemia hemolítica; hemoglobinuria paroxística por frío; choque anafiláctico; alergia; osteoporosis; osteoartritis; tiroiditis de Hashimoto; diabetes tipo I; psoriasis; pénfigo; anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA); púrpura trombocitopénica idiopática (ITP); síndrome de Goodpasture; enfermedad de Degos; síndrome antifosfolipídico (APS); APS catastrófico (CAPS); un trastorno cardiovascular; miocarditis; un trastorno cerebrovascular; un trastorno vascular periférico; un trastorno renovascular; un trastorno vascular mesentérico/entérico; vasculitis; nefritis púrpura de Henoch-Schonlein; enfermedad de Takayasu; cardiomiopatía dilatada; angiopatía diabética; enfermedad de Kawasaki (arteritis); embolia gaseosa venosa (VGE), reestenosis tras colocación de endoprótesis; aterectomía rotacional; nefropatía membranosa; síndrome de Guillain-Barre (GBS); síndrome de Fisher; artritis inducida por antígenos; inflamación sinovial; infecciones virales; infecciones bacterianas; infecciones fúngicas; y lesión resultante de infarto de miocardio, circulación extracorporal y hemodiálisis.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento es un estado patológico ocular. En realizaciones adicionales, el estado ocular es degeneración macular. En realizaciones adicionales la degeneración macular es AMD. En realizaciones adicionales, la AMD es la forma seca de AMD.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento es PNH.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento es un infarto de miocardio.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento es RA.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento es osteoporosis u osteoartritis.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento es inflamación.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o estado mediado por el complemento es cáncer.
Los anticuerpos de la invención pueden ser para su uso en un método de terapia o bien solos o bien en combinación con otros agentes. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención debe administrarse opcionalmente de manera conjunta con al menos un agente terapéutico adicional.
Tales terapias de combinación indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (en la que dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma formulación o formulaciones independientes), y administración independiente, en cuyo caso la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes de, simultáneamente con, y/o tras, la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En una realización, la administración del anticuerpo anti-C5 y la administración de un agente terapéutico adicional se producen dentro del plazo de aproximadamente un mes, o dentro del plazo de aproximadamente una, dos o tres semanas, o dentro del plazo de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, uno con respecto al otro.
Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) tiene que administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede realizarse mediante cualquier ruta adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples a lo largo de diversos puntos de tiempo, administración en bolo e infusión pulsada.
Los anticuerpos de la invención se formularán, dosificarán y tienen que administrarse de una manera compatible con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que esté tratándose, el mamífero particular que esté tratándose, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. No es necesario, pero opcionalmente el anticuerpo se formula con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores comentados anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con vías de administración tal como se describe en el presente documento, o aproximadamente desde el 1 hasta el 99% de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación o mediante cualquier vía que se determine de manera empírica/clínica que es apropiada.
Para su uso en un método de prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, el tipo de anticuerpo, la gravedad y transcurso de la enfermedad, si el anticuerpo tiene que administrarse con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico encargado. El anticuerpo tiene que administrarse de manera adecuada al paciente en una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 microg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya se realice, por ejemplo, mediante una o más administraciones independientes o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 1 microg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento se mantendrá generalmente hasta que se produzca una supresión deseada de síntomas de la enfermedad. Una dosificación a modo de ejemplo del anticuerpo estará en el intervalo de desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, pueden administrarse una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) al paciente. Tales dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe desde aproximadamente dos hasta aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga superior inicial, seguida por una o más dosis inferiores. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencional.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores pueden llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-C5.
H. Artículos de fabricación
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales para su uso en un método de tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de disolución i.v., etc. Los recipientes pueden estar formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, por sí sola o combinada con otra composición, es eficaz para su uso en un método de tratamiento, prevención y/o diagnóstico del estado y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición es para su uso en un método de tratamiento del estado de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o terapéutico de otro modo adicional. El artículo de fabricación en esta realización de la divulgación puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones son para su uso en un método de tratamiento de un estado particular. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua para inyección bacteriostática (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, cargas, agujas y jeringas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la divulgación en lugar o además de un anticuerpo anti-C5.
[Ejemplos]
Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica varias otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
[Ejemplo 1]
Preparación de C5
1.1. La expresión y purificación de C5 de macaco cangrejero y C5 humana recombinante (número de registro de GenBank de NCBI: NP_001726.2, SEQ ID NO: 39) se expresó de manera transitoria usando línea celular FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se diluyeron medios condicionados que expresaban C5 humana con un volumen igual de agua milliQ, después se aplicaron a una columna de intercambio aniónico Q-sepharose FF o Q-sepharose HP (GE healthcare, Uppsala, Suecia), seguido por elución con un gradiente de NaCl. Se combinaron las fracciones que contenían C5 humana, después se ajustaron la concentración de sal y el pH hasta NaCl 80 mM y pH 6,4, respectivamente. Se aplicó la muestra resultante a una columna de intercambio catiónico SP-sepharose<h>P (GE healthcare, Uppsala, Suecia) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Se combinaron las fracciones que contenían C5 humana y se sometieron a una columna de hidroxiapatita de cerámica CHT (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Después se aplicó el eluato de C5 humana a una columna de filtración en gel Superdex 200 (GE healthcare, Uppsala, Suecia). Se combinaron las fracciones que contenían C5 humana y se almacenaron a -150 grados C.
Se realizó la expresión y purificación de C5 de macaco cangrejero recombinante (número de registro de GenBank de NCBI: XP_005580972, SEQ ID NO: 44) de la misma manera que el homólogo humano.
1.2. Purificación de C5 de macaco cangrejero (cynoC5) a partir de plasma
Se aplicó una muestra de plasma de macaco cangrejero a SSL7-agarosa (Invivogen, San Diego, CA, EE.UU.) seguido por elución con acetato de Na 100 mM, pH 3,5. Se neutralizaron inmediatamente las fracciones que contenían cynoC5 y se sometieron a una columna de proteína A HP (GE healthcare, Uppsala, Suecia) en tándem con una agarosa de péptido M (Invivogen, San Diego, Ca , EE.UU.). Después se aplicó la fracción de flujo a través a una columna de filtración en gel Superdex 200 (GE healthcare, Uppsala, Suecia). Se combinaron las fracciones que contenían cynoC5 y se almacenaron a -80 grados C.
[Ejemplo 2]
Generación de anticuerpos anti-C5
2.1. Examen de anticuerpos
Se prepararon anticuerpos anti-C5, se seleccionaron y se sometieron a ensayo de la siguiente manera: se inmunizaron conejos NZW de doce a dieciséis semanas de edad por vía intradérmica con C5 humana y/o C5 de macaco (50-100 microg/dosis/conejo). Se repitió esta dosis 4-5 veces a lo largo de un periodo de 2 meses. Una semana después de la inmunización final, se recogieron el bazo y sangre de los conejos inmunizados. Se tiñeron células B específicas de antígeno con antígeno marcado, se clasificaron con un clasificador celular FCM (FACS aria III, BD) y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de una célula/pocillo junto con 25.000 células/pocillo de células EL4 (Colección europea de cultivos celulares) y medio condicionado de células T de conejo activadas diluido 20 veces y se cultivaron durante 7-12 días. Se trataron las células EL4 con mitomicina C (Sigma, n.° de cat. M4287) durante 2 horas y se lavaron 3 veces por adelantado. El medio condicionado de células T de conejo activadas se preparó cultivando timocitos de conejo en medio RPMI-1640 que contenía fitohemaglutinina-M (Roche, n.° de cat. 11082132-001), forbol-12-miristato-13-acetato (Sigma, n.° de cat. P1585) y FBS al 2%. Tras el cultivo, se recogieron sobrenadantes de cultivo de células B para su análisis adicional y se crioconservaron los sedimentos.
Se usó un ensayo ELISA para someter a prueba la especificidad de anticuerpos en un sobrenadante de cultivo de células B. Se recubrió estreptavidina (GeneScript, n.° de cat. Z02043) sobre una placa MAXISorp de 384 pocillos (Nunc, n.° de cat. 164688) a 50 nM en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se bloquearon las placas con Blocking One (Nacalai Tesque, n.° de cat. 03953-95) diluido 5 veces. Se marcó C5 humana o de macaco con NHS-PEG4-biotina (PIERCE, n.° de cat. 21329) y se añadió a las placas de ELISA bloqueadas, se incubó durante 1 hora y se lavó. Se añadieron sobrenadantes de cultivo de células B a las placas de ELISA, se incubaron durante 1 hora y se lavaron. Se detectó la unión mediante IgG de cabra anti-conejo-peroxidasa del rábano (BETHYL, n.° de cat. A120-111P) seguido por la adición de ABTS (KPL, n.° de cat. 50-66-06).
Se usó un ensayo ELISA para evaluarte la unión dependiente del pH de anticuerpos frente a C5. Se añadió IgG-Fc de cabra anti-conejo (BET<h>Y<l>, n.° de cat. A120-111A) diluido hasta 1 microg/ml con PBS(-) a una placa MAXISorp de 384 pocillos (Nunc, n.° de cat. 164688), se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se bloqueó con Blocking One (Nacalai Tesque, n.° de cat. 03953-95) diluido 5 veces. Tras la incubación, se lavaron las placas y se añadieron sobrenadantes de cultivo de células B. Se incubaron las placas durante 1 hora, se lavaron y se añadieron 500 pM de C5 humana o de macaco biotinilada y se incubaron durante 1 hora. Tras la incubación, se lavaron las placas y se incubaron o bien con tampón de MES a pH 7,4 (MES 20 mM, NaCl 150 mM y CaCl2 1,2 mM) o bien con tampón de MES a pH 5,8 (MES 20 mM, NaCl 150 mM y E<d>T<a>1 mM) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la incubación, se detectó la unión de C5 biotinilada mediante conjugado de estreptavidina-peroxidasa del rábano (Thermo Scientific, n.° de cat. 21132) seguido por la adición de ABTS (KPL, n.° de cat. 50-66-06).
Se usó el sistema Octet RED384 (Pall Life Sciences) para evaluar la afinidad y unión dependiente del pH de anticuerpos frente a C5. Se cargaron anticuerpos secretados en el sobrenadante de cultivo de células B sobre una punta de biosensor de proteína A (Pall Life Sciences) y se sumergieron en 50 nM de C5 humana o de macaco en tampón de MES a pH 7,4 para analizar la cinética de asociación. Se analizó al cinética de disociación tanto en tampón de Me s a pH 7,4 como en tampón de MES a pH 5,8.
Se examinó un total de 41.439 líneas de células B para detectar la afinidad y unión dependiente del pH a C5 humana o de macaco y se seleccionaron 677 líneas y se denominaron CFA0001-0677. Se purificó el a Rn de las líneas seleccionadas a partir de sedimentos celulares crioconservados usando kits ZR-96 Quick-RNA (ZYMO RESEARCH, n.° de cat. R1053). Se amplificó el ADN que codificaba para regiones variables de cadena pesada de anticuerpo en las líneas seleccionadas mediante PCR de transcripción inversa y se recombinó con el ADN que codificaba para la región constante de cadena pesada de F760G4 (SEQ ID NO: 33) o F939G4 (SEQ ID NO: 34). Se amplificó el ADN que codificaba para regiones variables de cadena ligera de anticuerpo mediante PCR de transcripción inversa y se recombinó con el ADN que codificaba para la región constante de cadena ligera de k0MTC (SEQ ID NO: 36). Por separado, se sintetizaron los genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-C5 humanizado existente, eculizumab (EcuH-G2G4, SEQ ID NO: 29 y EcuL-k0, Se Q ID NO: 30). Se fusionó el ADN que codificaba para VH (EcuH, SEQ ID NO: 31) en marco con el ADN que codificaba para una CH de IgG4 humana modificada (F760G4, SEQ ID NO: 33), y se fusionó el ADN que codificaba para VL (EcuL, SEQ ID NO: 32) en marco con el ADN que codificaba para una región constante de cadena ligera de k0 (SEQ ID NO: 37). También se clonó cada una de las secuencias codificantes fusionadas en un vector de expresión. Se expresaron los anticuerpos en células FreeStyle™ 293-F (Invitrogen) y se purificaron a partir de cultivo sobrenadante para evaluar la actividad funcional. Se evaluaron las actividades neutralizantes de los anticuerpos sometiendo a prueba la inhibición de la actividad del complemento usando un ensayo de lisis de liposomas tal como se describe en el ejemplo 5.1.
2.2. Agrupación de epítopos mediante ELISA de tipo sándwich
Se seleccionaron anticuerpos anti-C5 con alta afinidad, dependencia del pH o actividad neutralizante para su análisis adicional. Se usó un ensayo ELISA de tipo sándwich para agrupar los anticuerpos seleccionados en diferentes agrupaciones de epítopos que se unían a epítopos iguales o solapantes de la proteína de C5. Se diluyeron anticuerpos de captura sin marcar hasta 1 microg/ml con PBS (-) y se añadieron a placas MAXISorp de 384 pocillos (Nunc, n.° de cat. 164688). Se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente y se bloquearon con Blocking One (Nacalai Tesque, n.° de cat. 03953-95) diluido 5 veces. Se incubaron las placas durante 1 hora, se lavaron y se añadieron 2 nM de C5 humana y se incubaron durante 1 hora. Tras la incubación, se lavaron las placas y se añadieron anticuerpos de detección marcados (1 microg/ml, biotinilados mediante NHS-PEG4-biotina). Después de 1 hora de incubación, se detectó la unión de anticuerpo biotinilado mediante conjugado de estreptavidina-peroxidasa del rábano (Thermo Scientific, n.° de cat. 21132) seguido por la adición de ABTS (KPL, n.° de cat. 50-66-06).
Se usaron todos los anticuerpos anti-C5 como anticuerpo de captura y como anticuerpo de detección, y se emparejaron de manera exhaustiva. Tal como se muestra en la figura 1, se agruparon anticuerpos mutuamente competitivos en 7 agrupaciones de epítopos: se agruparon CFA0668, CFA0334 y CFA0319 en el epítopo A, se agruparon CFA0647, CFA0589, CFA0341, CFA0639, CFA0635, CFA0330 y CFA0318 en el epítopo B, se agruparon CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0305, CFA0675, CFA0666 y CFA0672 en el epítopo C, se agruparon eculizumab y CFA0322 en el epítopo D, se agrupo CFA0329 en el epítopo E, se agruparon CFA0359 y CFA0217 en el epítopo F, y se agruparon CFA0579, CFA0328 y CFA0272 en el epítopo G. La figura 1 muestra la agrupación de epítopos de algunos de los anticuerpos quiméricos anti-C5. Las secuencias de los anticuerpos anti-C5 de VH y VL agrupados en el epítopo C se indican en la tabla 2.
[Tabla 2]
2.3. Humanización y optimización
Se realizó la humanización de la región variable de algunos de los anticuerpos anti-C5 con el fin de reducir la posible inmunogenicidad de los anticuerpos. Se injertaron regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo de conejo anti-C5 en marcos (FR) de anticuerpo humano homólogos usando un enfoque de injerto de CDR convencional (Nature 321:522-525 (1986)). Se sintetizaron los genes que codificaban para los VH y VL humanizados y se combinaron con un CH de IgG4 humano modificado (SG402, SEQ ID NO: 35) y un CL humano (SK1, SEQ ID NO: 38), respectivamente, y se clonó cada una de las secuencias combinadas en un vector de expresión.
Se examinaron varias mutaciones y combinaciones de mutaciones para identificar mutaciones y combinaciones de mutaciones que mejoraban las propiedades de unión de algunos de los anticuerpos principales. Después se introdujeron múltiples mutaciones en las regiones variables humanizadas para potenciar la afinidad de unión a C5 a un pH neutro o para reducir la afinidad de unión a C5 a un pH ácido. Por tanto, una de las variantes optimizadas, 305LO5 (VH, SEQ ID NO: 10; VL, SEQ ID NO: 20; HVR-H1, SEQ ID NO: 54; HVR-H2, SEQ ID NO: 64; HVR-H3, SEQ ID NO: 74; HVR-L1, SEQ ID NO: 84; HVR-L2, SEQ ID NO: 94; y HVR-L3, SEQ ID NO: 104), se generó a partir de CFA0305.
Se expresaron anticuerpos en células HEK293 cotransfectadas con una mezcla de vectores de expresión de cadena pesada y ligera y se purificaron mediante proteína A.
Caracterización de unión de anticuerpos anti-C5
3.1. Expresión y purificación de anticuerpos recombinantes
Se expresaron anticuerpos recombinantes de manera transitoria usando línea celular FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se realizó la purificación a partir de los medios condicionados que expresaban anticuerpos usando un método convencional usando proteína A. Se llevó a cabo adicionalmente una filtración en gel si fue necesario.
3.2. Evaluación de la dependencia del pH
Se evaluaron los parámetros cinéticos de anticuerpos anti-C5 frente a C5 humana recombinante a pH 7,4 y pH 5,8, a 37 grados C usando un instrumento T200 de BIACORE (marca registrada) (GE Healthcare). Se inmovilizó ProA/G (Pierce) sobre un chip sensor CM4 usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) según los ajustes recomendados por GE Healthcare. Se diluyeron anticuerpos y analitos en los respectivos tampones de ejecución, ACES pH 7,4 y pH 5,8 (ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl21,2 mM, Tween 20 al 0,05%, N aN al 0,005%). Se capturó cada anticuerpo sobre la superficie de sensor mediante ProA/G. Los niveles de captura de anticuerpos eran normalmente de 60-90 unidades de resonancia (UR). Después, se inyectó C5 humana recombinante a concentraciones de 10 y 20 nM o 20 y 40 nM seguido por disociación. Se regeneró la superficie usando NaOH 25 mM. Se determinaron parámetros cinéticos en ambas condiciones de pH ajustando los sensogramas con un modelo de unión 1:1 usando un software de evaluación de T200 de BIACORE (marca registrada), versión 2.0 (GE Healthcare). Los sensogramas de todos los anticuerpos se muestran en las figuras 2A y 2B. La velocidad de asociación (ka), la velocidad de disociación (kd) y la afinidad de unión (KD) de los anticuerpos se indican en la tabla 3. Todos los anticuerpos excepto CFA0330 (VH, SEQ ID NO: 21 y VL, SEQ ID NO: 25) y CFA0341 (VH, SEQ ID NO: 22 y VL, SEQ ID NO: 26) mostraron una velocidad de disociación relativamente más rápida a pH 5,8 que a pH 7,4.
Tabla 3
Parámetros cinéticos de anticuerpos anti-C5 en condiciones de pH 7,4 y pH 5,8
Nombre de anticuerpo pH 7,4 pH 5,8
ka kd KD ka kd KD
CFA0305 3,82E+04 5,89E-04 1,54E-08 4,27E+04 1,83E-02 4,30E-07
CFA0307 3,24E+05 2,63E-03 8,13E-09 2,04E+05 3,34E-02 1,64E-07
CFA0366 1,04E+06 9,34E-03 8,99E-09 9,35E+05 7,03E-02 7,52E-08
CFA0501 4,74E+05 1,69E-03 3,56E-09 1,50E+05 2,62E-02 1,74E-07
CFA0538 4,73E+05 1,85E-03 3,91E-09 1,22E+05 3,01E-02 2,46E-07
CFA0599 4,74E+05 2,81E-03 5,93E-09 4,54E+05 3,73E-02 8,21E-08
CFA0666 3,65E+05 6,26E-04 1,71E-09 2,82E+05 9,39E-03 3,33E-08
CFA0672 5,23E+05 1,83E-04 3,51E-10 7,11E+04 9,78E-03 1,38E-07
CFA0675 3,83E+05 4,12E-04 1,08E-09 3,89E+05 6,61E-03 1,70E-08
305-LO5 4,48E+05 2,11E-04 4,71E-10 2,03E+06 2,85E-02 1,40E-08
CFA0330 1,66E+06 2,02E-04 1,22E-10 1,22E+06 2,24E-04 1,84E-10
CFA0341 6,28E+05 9,77E-05 1,55E-10 1,24E+06 7,39E-05 5,95E-11
3.3. Comprobación de reactividad cruzada
Para observar la reactividad cruzada de anticuerpos anti-C5 frente a C5 humana (hC5) y C5 de macaco cangrejero (cynoC5), se realizó un análisis de cinética de BIACORE (marca registrada). Los ajustes del ensayo fueron los mismos tal como se describieron en el ejemplo 3.2. Se inyectó cynoC5 recombinante a concentraciones de 2, 10 y 50 nM. Se determinaron los parámetros cinéticos mediante el mismo ajuste de datos tal como se describió en el ejemplo 3.2. La cinética de unión y la afinidad a pH 7,4 se indican en la tabla 4. Los parámetros cinéticos frente a hC5 presentados en la tabla 4 son los resultados del ejemplo 3.2. Todos los anticuerpos anti-C5 excepto CFA0672 mostraron KD comparable frente a hC5 y cynoC5. KD de CFA0672 frente a cynoC5 fue 8 veces más débil que frente a hC5.
[Tabla 4]
Cinética de unión y afinidad de anticuerpos anti-C5 frente a hC5 y cynoC5 a pH 7,4Nombre de anticuerpo Afinidad frente a hC5 Afinidad frente a cynoC5
ka kd KD ka kd KD
CFA0305 3,82E+04 5,89E-04 1,54E-08 1,21E+04 6,70E-04 5,54E-09
CFA0307 3,24E+05 2,63E-03 8,13E-09 2,90E+05 2,23E-03 7,68E-09
CFA0366 1,04E+06 9,34E-03 8,99E-09 5,04E+05 9,04E-03 1,79E-08
CFA0501 4,74E+05 1,69E-03 3,56E-09 2,66E+05 1,56E-03 5,88E-09
CFA0538 4,73E+05 1,85E-03 3,91E-09 3,05E+05 1,66E-03 5,44E-09
CFA0599 4,74E+05 2,81E-03 5,93E-09 5,42E+05 2,35E-03 4,33E-09
CFA0666 3,65E+05 6,26E-04 1,71E-09 3,14E+05 4,93E-04 1,57E-09
CFA0672 5,23E+05 1,83E-04 3,51E-10 6,41E+05 1,85E-03 2,88E-09
CFA0675 3,83E+05 4,12E-04 1,08E-09 2,94E+05 3,78E-04 1,29E-09 [Ejemplo 4]
Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-C5
4.1. Unión de AcM anti-C5 a péptidos derivados de cadena beta de C5.
Se sometieron a prueba anticuerpos monoclonales anti-C5 (AcM) para determinar su unión a péptidos derivados de cadena beta de C5 en análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se expresaron los péptidos de C5: 19-180, 161-340, 321-500 y 481-660, fusionados a etiqueta de GST (pGEX-4T-1, GE Healthcare Life Sciences, 28-9545-49) enE. coli(DH5 alfa, TOYOBO, DNA-903). Se recogieron las muestras deE. colitras la incubación con isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM durante 5 horas a 37 grados C y se centrifugaron a 20000 x g durante 1 min para obtener sedimentos. Se suspendieron los sedimentos con una disolución de tampón de muestra (2ME+) (Wako, 191-13272) y se usaron para análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se confirmó la expresión de cada péptido con anticuerpo anti-GST (Abcam, ab9085) (figura 3). La flecha indica péptidos de C5 fusionados con GST (46 49 kDa). Los AcM anti-C5: CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675, se unieron a 19-180 de C5 (figura 3).
4.2. Expresión y purificación de dominio MG1-MG2 (1-225) de C5 humana
Se expresó dominio MG1-MG2 recombinante (SEQ ID NO: 43) de cadena beta de C5 humana de manera transitoria usando la línea celular FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se diluyeron medios condicionados que expresaban el dominio MG1-MG2 con 1/2 vol de agua milliQ, seguido por aplicación a una columna de intercambio aniónico Q-sepharose FF (GE healthcare, Uppsala, Suecia). Se ajustó la fracción de flujo a través de la columna de intercambio aniónico a pH 5,0 y se aplicó a una columna de intercambio catiónico SP-sepharose HP (GE healthcare, Uppsala, Suecia) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Se recogieron las fracciones que contenían el dominio MG1-<m>G2 a partir del eluyente y posteriormente se sometieron a una columna de filtración en gel Superdex 75 (GE healthcare, Uppsala, Suecia) equilibrada con 1x PBS. Después se combinaron las fracciones que contenían el dominio MG1-MG2 y se almacenaron a -80 grados C.
4.3. Capacidad de unión a dominio MG1-MG2
Se midió la capacidad de unión de anticuerpos anti-C5 frente al dominio MG1-MG2 usando los mismos ajustes de ensayo tal como se describió en el ejemplo 3.2, excepto porque sólo se realizaron mediciones en condiciones de pH 7,4. Se inyectó el dominio MG1-MG2 a concentraciones de 20 nM y 40 nM. Tal como se muestra en la figura 4, todos los anticuerpos excepto eculizumab-F760G4 mostraron un aumento de la respuesta de unión, indicando que estos anticuerpos son agentes de unión a MG1-MG2. Eculizumab-F760G4, que es un agente de unión a cadena alfa conocido, no mostró unión al dominio MG1-MG2.
4.4. Unión de AcM anti-C5 a péptidos derivados de dominio MG1-MG2 de C5
Se sometieron a prueba los AcM anti-C5 para determinar su unión a péptidos derivados de dominio MG1-MG2 en análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se expresaron los péptidos de C5: 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 y 45-111 (SEQ ID NO: 40), fusionados a etiqueta de GST, enE. coli.Se recogieron las muestras deE. colitras la incubación con IPTG 1 mM durante 5 horas a 37 grados C y se centrifugaron a 20000 x g durante 1 min para obtener sedimentos. Se suspendieron los sedimentos con la disolución de tampón de muestra (2ME+) y se usaron para análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se confirmó la expresión de péptidos derivados de C5 con anticuerpo anti-GST (figura 5A). CFA0305 se unió únicamente al péptido de 33-124 (figura 5B). CFA0305 se unió a cadena beta de C5 humana recombinante (rhC5) (aproximadamente 70 kDa), que se usó como control. La figura 5C resume la reacción de AcM anti-C5 frente a péptidos derivados de C5.
4.5. Unión de AcM anti-C5 a mutantes de C5
Dado que se predijo que tres residuos de aminoácido en la cadena beta de C5: E48, D51 y K109, participaban en la unión entre C5 y los AcM anti-C5 mediante análisis de estructura cristalina, se sometieron a prueba los AcM anti-C5 para determinar su unión a mutantes puntuales de C5 humana en análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se expresaron mutantes puntuales de C5, en los que uno cualquiera de E48, D51 y K109 estaba sustituido por alanina, en células FS293 mediante lipofección. Se recogieron los medios de cultivo 5 días después de la lipofección y después de eso se usaron para inmunotransferencia de tipo Western. Se llevó a cabo SDS-PAGE en condiciones reductoras. Los resultados se muestran en la figura 6. Eculizumab se unió a cadena alfa de C5 de tipo natural (WT) y tres mutantes puntuales de C5, mientras que CFA0305 se unió fuertemente a la cadena beta de C5 WT, débilmente al mutante de C5 E48A, y no se unió a la cadena beta de los mutantes de C5 D51A y K109A, indicando que estos 3 residuos de aminoácido participan en las interacciones de anticuerpo/antígeno. La tabla 5 presenta un resumen de análisis de inmunotransferencia de tipo Western de los AcM anti-C5 (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675). Los AcM anti-C5 se agrupan en el mismo epítopo C, pero los patrones de unión son ligeramente diferentes entre los anticuerpos, sugiriendo que las regiones de unión de C5 a los AcM anti-C5 están cerca unas de otras pero no son idénticas.
[Tabla 5]
Sumario de reacción de AcM anti-C5 frente a mutantes de C5
WT E48A D51A K109A
Eculizumab
CFA0305 - -
CFA0307 - - -
CFA0366 - - -
CFA0501 - - -
CFA0538 - - -
CFA0599 - -
CFA0666 - -
CFA0672 - -
CFA0675 -
4.6. Análisis de unión de BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 con mutantes de C5
Para someter a prueba si los residuos E48, G51 y K109 participan realmente en las interacciones de anticuerpo/antígeno, se realizó análisis de unión de BIACORE (marca registrada). Se prepararon tres mutantes de C5: E48A, G51A y K109A, tal como se describió en el ejemplo 4.5. Se prepararon muestras de sobrenadante de cultivo que contenían la C5 mutante sobreexpresada en células FS293 a 40 microg/ml de la C5 mutante. Para el análisis de unión de BIACORE (marca registrada), se diluyó la muestra 10x con tampón de ejecución de BIACORE (marca registrada) (ACES pH 7,4, BSA 10 mg/ml, carboximetildextrano 1 mg/ml) hasta una concentración de muestra final de 4 microg/ml de la C5 mutante.
Se evaluaron las interacciones de los tres mutantes de C5 con anticuerpos anti-C5 a 37 grados C con instrumento T200 de BIACORE (marca registrada) (GE Healthcare), usando la condición de ensayo descrita en el ejemplo 3.2. Se usó tampón de ACES pH 7,4 que contenía BSA 10 mg/ml, carboximetildextrano 1 mg/ml, como tampón de ejecución. Se capturaron eculizumab-F760G4 y 305LO5 en diferentes celdas de flujo mediante anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG humana, anticuerpo específico de fragmento Fc (GE Healthcare). Se usó la celda de flujo 1 como superficie de referencia. Se inyectaron proteínas de C5 de tipo natural y mutante sobre una superficie de sensor a una concentración de 4 microg/ml para interaccionar con los anticuerpos capturados. Al final de cada ciclo de análisis, se regeneró la superficie de sensor con MgCh 3 M. Se analizaron los resultados con software Bia Evaluation, versión 2.0 (GE Healthcare). Se restaron curvas de la celda de flujo de referencia (celda de flujo 1) e inyecciones de blanco de tampón de ejecución a partir de curvas de la celda de flujo con anticuerpos capturados.
Tal como se muestra en la figura 7, los tres mutantes de C5 podían unirse a eculizumab con un perfil de unión similar en comparación con C5 de tipo natural. Para 305LO5, los tres mutantes mostraron una respuesta de unión inferior a 305LO5 en comparación con C5 de tipo natural. Los mutantes D51A y K109A redujeron la unión de C5 por 305LO5 hasta el nivel inicial.
4.7. Identificación de residuos de His en C5 que contribuyen a interacciones dependientes del pH entre anticuerpo anti-C5 y C5
El análisis de estructura cristalina reveló que 3 residuos de histidina en C5 humana están ubicados en la superficie de contacto anticuerpo/antígeno. Se sabe que un residuo de histidina con un pKa típico de aproximadamente 6,0 contribuye a interacciones proteína-proteína dependientes del pH (Igawaetal.,Biochim Biophys Acta 1844(11): 1943 1950 (2014)). Para investigar cuál de los residuos de His en la superficie de contacto anticuerpo/antígeno contribuye a interacciones dependientes del pH entre anticuerpo anti-C5 y C5, se realizó un análisis de unión de BIACORE (marca registrada). Se prepararon tres mutantes de C5 humana con una mutación de His individual (H70Y, H72Y y H110Y) y un mutante con una mutación de His doble (H70Y H110Y) de la siguiente manera: se expresaron mutantes de His individuales en los que uno cualquiera de H70, H72 y H110 está sustituido por tirosina, y un mutante de His doble en el que tanto H70 como H110 están sustituidos por tirosina, en células FS293 mediante lipofección. Se determinaron las propiedades de unión a antígeno de los mutantes de His de C5 a 305LO5, un anticuerpo anti-C5 dependiente del pH, mediante un ensayo de BIACORE (marca registrada) modificado tal como se describió en el ejemplo 4.6. En resumen, se integró una fase de disociación adicional a pH 5,8 en el ensayo de BIACORE (marca registrada) inmediatamente después de la fase de disociación a pH 7,4 para evaluar la disociación dependiente del pH entre el anticuerpo y el antígeno a partir de los complejos formados a pH 7,4. Se determinó la velocidad de disociación a pH 5,8 mediante procesamiento y ajuste de datos usando el software de ajuste de curva Scrubber 2.0 (BioLogic Software).
Tal como se muestra en la figura 8, la mutación de His individual de C5 en H70 o H110 y la mutación de His doble (H70 H110) no afectaron a la unión de C5 a 305LO5 a pH neutro. Mientras tanto, la mutación de His individual en H72 mostró una alteración significativa de la unión de C5 a 305LO5. Las velocidades de disociación a pH 5,8 para los mutantes de His de C5 y la proteína de C5-wt se muestran en la tabla 6. Tal como se muestra en la tabla 6, C5-wt mostró la disociación más rápida a partir de 305LO5 a pH 5,8 entre los antígenos de C5 sometidos a prueba. La mutación de His individual en H70 mostró una velocidad de disociación casi dos veces más lenta a pH 5,8 y la mutación de His individual en H110 dio como resultado una velocidad de disociación ligeramente más lenta a pH 5,8 en comparación con C5-wt. La mutación de His doble tanto en H70 como en H110 dio como resultado un mayor efecto sobre la unión dependiente del pH con una velocidad de disociación a pH 5,8 casi tres veces más lenta que C5-wt.
[Tabla 6]
Valor de velocidad de disociación a pH 5,8 para mutantes de His de C5 que se unen a 305LO5Antígenos kd (1/s)
C5-wt 1, 1E-2
C5-H70Y 5 3E-3
C5-H110Y 9 3E-3
C5-H70Y, H110Y 3, 9E-3
[Ejemplo 5]
Actividad inhibidora de anticuerpos anti-C5 sobre la activación de C5
5.1. Inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante AcM anti-C5
Se sometieron a prueba los AcM anti-C5 para determinar la inhibición de la actividad del complemento mediante un ensayo de lisis de liposomas. Se mezclaron treinta microlitros de suero humano normal (6,7%) (Biopredic, SER018) con 20 microL del AcM diluido en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 30 min a 25 grados C. Se transfirieron liposomas sensibilizados con los anticuerpos frente a dinitrofenilo (Autokit CH50, Wako, 995-40801) a cada pocillo y se colocó la placa en un agitador durante 2 min a 25 grados C. Se añadieron cincuenta microlitros de disolución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezclaron mediante agitación durante 2 min a 25 grados C. Se incubó la mezcla final a 37 grados C durante 40 minutos y después de eso se midió la DO a 340 nm de la mezcla. Se definió el porcentaje de lisis de liposomas como 100 X [(DOacM - DOfondo de suero y liposoma)]/[(DOsin AcM - DOfondo de suero y liposoma)]. La figura 9A muestra que los AcM anti-C5: CFA0305, 0307, 0366, 0501, 0538, 0599, 0666, 0672 y 0675, inhibieron la lisis de liposomas. Dos anticuerpos no dependientes del pH: CFA0330 y 0341, también inhibieron la lisis (figura 9B).
5.2. Inhibición de la generación de C5a mediante AcM anti-C5
Se sometieron a prueba los AcM anti-C5 para determinar la generación de C5a durante la lisis de liposomas para confirmar que los AcM anti-C5 inhiben la escisión de C5 para dar C5a y C5b. Se cuantificó el nivel de C5a en los sobrenadantes a partir del ensayo de lisis de liposomas usando un kit de ELISA de C5a (R&D Systems, DY2037). Todos los AcM inhibieron la generación de C5a en los sobrenadantes de manera dependiente de la dosis (figuras 10A y 10B).
5.3. Inhibición de la hemolisis activada por el complemento mediante AcM anti-C5
Se sometieron a prueba los AcM anti-C5 para determinar la inhibición de la actividad del complemento clásica en un ensayo hemolítico. Se lavaron glóbulos rojos de pollo (cRBC) (Innovative research, IC05-0810) con gelatina/solución salina tamponada con veronal que contenía MgCh 0,5 mM y CaCl20,15 mM (GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X) y después de eso se sensibilizaron con anticuerpo anti-RBC de pollo (Rockland 103-4139) a 1 microg/ml durante 15 minutos a 4 grados C. Después se lavaron las células con GVB++ y se suspendieron en el mismo tampón a 5X107 células/ml. En una placa de microprueba de 96 pocillos de fondo redondo independiente, se mezclaron 50 microL de suero humano normal (20%) (Biopredic, SER019) con 50 microL de AcM diluido y se incubaron en un agitador a 37 grados C durante 30 minutos. Después se añadieron sesenta microlitros de la suspensión de cRBC sensibilizados a los pocillos que contenían el suero y se incubó la mezcla de anticuerpo a 37 grados C durante 30 minutos. Tras la incubación, se centrifugó la placa a 1000 X g durante 2 minutos a 4 grados C. Se transfirieron los sobrenadantes (100 microL) a pocillos en una placa de microprueba de 96 pocillos de fondo plano para la medición de la DO a 415 nm con una longitud de onda de referencia a 630 nm. Se definió el porcentaje de hemolisis como 100 X [(DOacm - DOsueroy<crbc>)]/ [(DOsinAcM - DOfondo de suero y<crbc>)]. La figura 11 muestra que los AcM anti-C5: CFA0305 y 305LO5, inhibieron la hemolisis de cRBC.
5.4. Inhibición de la ruta del complemento alternativa mediante AcM anti-C5
Se realizó un ensayo hemolítico para la ruta alternativa de una manera similar al ensayo hemolítico de la ruta clásica. Se mezcló sangre extraída de un conejo blanco de Nueva Zelanda (InVivos) con el mismo volumen de disolución de Alsever (Sigma, A3551) y se usó la mezcla como RBC conejo (rRBC). Se lavaron los rRBC con GVB complementado con MgCl2 2 mM y EGTa 10 mM y se suspendieron en el mismo tampón a 7X108 células/ml. En una placa de microprueba de 96 pocillos de fondo redondo, se mezclaron 40 microL de suero humano normal (25%) (Biopredic, SER019) con 40 microL de AcM diluido y se incubaron en un agitador a 37 grados C durante 30 minutos. Después se añadieron veinte microlitros de la suspensión de rRBC a los pocillos que contenían el suero y se incubó la mezcla de anticuerpo a 37 grados C durante 60 minutos. Tras la incubación, se centrifugó la placa a 1000 X g durante 2 minutos a 4 grados C. Se transfirieron los sobrenadantes (70 microL) a pocillos en una placa de microprueba de 96 pocillos de fondo plano para la medición de la DO a 415 nm con una longitud de onda de referencia a 630 nm. La figura 12 muestra que los AcM anti-C5: CFA0305 y CFA0672, inhibieron la hemolisis de rRBC, indicando que estos anticuerpos inhiben las rutas del complemento alternativas.
[Ejemplo 6]
Estudio farmacocinético de anticuerpos monoclonales anti-C5 con C5 humana en ratones
6.1. Pruebain vivousando ratones C57BL/6
Se evaluó la cinéticain vivode C5 humana (Calbiochem) y anticuerpo anti-C5 humana tras administrar C5 humana sola o C5 humana y anticuerpo anti-C5 humana a ratones C57BL/6 (In vivos o Biological Resource Centre, Singapur). Se administró una disolución de C5 humana (0,01 mg/ml) o una disolución de mezcla que contenía C5 humana y anticuerpo anti-C5 humana (0,01 mg/ml y 2 mg/ml (CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538- F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4 y CFA0675-F760G4) o 0,2 mg/ml (CFA0330- F760G4 y CFA0341-F760G4), respectivamente) una vez a una dosis de 10 ml/kg en la vena caudal. En este caso, el anticuerpo anti-C5 humana está presente en exceso con respecto a C5 humana y, por tanto, se supone que casi todas las C5 humanas se unen al anticuerpo. Se extrajo sangre 5 minutos, siete horas, un día, dos días, tres días y siete días después de la administración. Se centrifugó inmediatamente la sangre extraída a 14.000 rpm y 4 grados C durante 10 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado en un frigorífico a -80 grados C antes del ensayo. Los anticuerpos anti-C5 humana usados son: CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0330-F760G4, CFA0341-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4 y CFA0675-F760G4 anteriormente descritos.
6.2. Medición de la concentración en plasma de C5 humana total mediante ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL)
Se midió la concentración de C5 humana total en plasma de ratón mediante ECL.
En presencia de CFA0330-F760G4, CFA0341-F760G4 o C5 humana sola en la muestra de plasma, se usó el siguiente método. Se dispensó anticuerpo anti-C5 humana (Santa Cruz) sobre una placa sin recubrir de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se dejó reposar durante la noche a 4 grados C para preparar placas con anticuerpo anti-C5 humana inmovilizado. S prepararon muestras de curva de calibración y muestras de plasma de ratón diluidas 100 veces o más con anticuerpo inyectado a 1 microg/ml (CFA0330-F760G4 o CFA0341-F760G4) y se incubaron durante 30 minutos a 37 grados C. Posteriormente, se dispensaron las muestras sobre las placas con anticuerpo anti-C5 humana inmovilizado y se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente. Después, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con SULFO-TAG (Meso Scale Discovery) para reaccionar durante una hora a temperatura ambiente y se realizó un lavado. Inmediatamente después de eso, se dispensó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) y se realizó una medición usando un dispositivo Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
En presencia de CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538- F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4, o CFA0675-F760G4 en la muestra de plasma, se usó el siguiente método. Se dispensó anticuerpo anti-C5 humana (CFA0329-F939G4; VH, SEQ ID NO: 23 y VL, SEQ ID NO: 27) sobre una placa sin recubrir de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se dejó reposar durante la noche a 4 grados C para preparar placas con anticuerpo anti-C5 humana inmovilizado. Se prepararon muestras de curva de calibración y muestras de plasma de ratón diluidas 100 veces o más con disolución ácida (pH 5,5) y se incubaron durante 30 minutos a 37 grados C. Posteriormente, se dispensaron las muestras sobre las placas con anticuerpo anti-C5 humana inmovilizado y se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente. Después, se añadió anticuerpo anti-C5 humana marcado con SULf O-TAG (CFA0300-F939G4; v H, SEQ ID NO: 24 y VL, SEQ ID NO: 28) para reaccionar durante una hora a temperatura ambiente y se realizó un lavado. Inmediatamente después de eso, se dispensó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) y se realizó una medición usando un dispositivo Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
Se calculó la concentración de C5 humana basándose en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso de tiempo de la concentración de C5 humana en plasma después de la administración intravenosa tal como se midió mediante este método se muestra en la figura 13. Los datos se representan gráficamente como el porcentaje restante en comparación con la concentración de C5 humana en plasma a los 5 minutos.
6.3. Medición de la concentración en plasma de anticuerpo anti-C5 humana mediante ensayo de ECL
Se midió la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma de ratón mediante ECL. Se dispensaron fragmento de anticuerpo F(ab')2 anti-IgG humana (específico de cadena gamma) (Sigma) o anticuerpo anti-cadena kappa de IgG humana (Antibody Solutions) sobre una placa sin recubrir de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se dejó reposar durante la noche a 4 grados C para preparar placas con anticuerpo anti-IgG humana inmovilizado. Se prepararon muestras de curva de calibración y muestras de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Posteriormente, se dispensaron las muestras sobre las placas con anticuerpo anti-IgG humana inmovilizado y se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente. Después, se añadió anticuerpo biotinilado anti-IgG humana (Southernbiotech) o anticuerpo anti-Fc de IgG humana marcado con SULFO-TAG (Southernbiotech) para reaccionar durante una hora a temperatura ambiente y se realizó un lavado. Posteriormente, sólo cuando se usó anticuerpo biotinilado anti-IgG humana, se añadió estreptavidina marcada con SULFO-TAG (Meso Scale Discovery) para reaccionar durante una hora a temperatura ambiente y se realizó un lavado. Inmediatamente después de eso, se dispensó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) y se realizó una medición usando un dispositivo Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Se calculó la concentración de anticuerpo anti-C5 humana basándose en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso de tiempo de la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma después de la administración intravenosa tal como se midió mediante este método se muestra en la figura 14. Los datos se representan gráficamente como el porcentaje restante en comparación con la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma a los 5 minutos.
6.4. Efecto de la unión de anticuerpo anti-C5 humana dependiente del pH sobre el aclaramiento de C5 humanain vivo
Se sometieron a prueba los anticuerpos anti-C5 humana dependientes del pH (CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4, y CFA0675- F760G4) y anticuerpos anti-C5 humana no dependientes del pH (CFA0330-F760G4, y CFA0341-F760G4)in vivoy se compararon la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma y concentración de C5 humana en plasma resultantes. Tal como se muestra en la figura 14, la exposición de anticuerpo fue comparable. Mientras tanto, el aclaramiento de C5 humana administrada simultáneamente con los anticuerpos anti-C5 humana dependientes del pH se aceleró en comparación con el de aquella con los anticuerpos anti-C5 humana no dependientes del pH (figura 13).
[Ejemplo 7]
Optimización de anticuerpos monoclonales anti-C5 (variantes 305)
Se introdujeron varias mutaciones en la región variable optimizada del anticuerpo anti-C5 305LO5 para mejorar adicionalmente sus propiedades, y se generaron las regiones variables optimizadas 305LO15, 305LO16, 305LO18, 305LO19, 305LO20, 305LO22 y 305LO23. Las secuencias de aminoácidos de VH y VL de las variantes 305 se indican en las tablas 7 y 8, respectivamente. Se combinaron los genes que codifican para VH humanizado con una variante de CH de IgG1 humana modificada SG115 (SEQ ID NO: 114), y variantes de Ch de IgG4 humana modificada SG422 (SEQ ID NO: 115) o SG429 (SEQ ID NO: 116). Se combinaron los genes que codifican para el VL humanizado con un CL humano (SK1, SEQ ID NO: 38). Por separado, se sintetizaron genes de cadena pesada y ligera que codifican para un anticuerpo anti-C5 humanizado, BNJ441 (BNJ441H, SEQ ID NO: 149; BNJ441L, SEQ ID NO: 150) y se clonaron cada uno en un vector de expresión.
Se expresaron anticuerpos en células HEK293 cotransfectadas con una combinación de vectores de expresión de cadena pesada y ligera y se purificaron mediante proteína A.
[Tabla 7]
[Tabla 8]
[Ejemplo 8]
Caracterización de la unión de anticuerpos anti-C5 (variantes 305)
Se evaluaron los parámetros cinéticos de anticuerpos anti-C5 frente a C5 humana recombinante a 37 grados C usando un instrumento T200 de BIACORE (marca registrada) (GE Healthcare) en tres condiciones diferentes; (1) tanto la asociación como la disociación se realizaron a pH 7,4, (2) tanto la asociación como la disociación se realizaron a pH 5,8, y (3) la asociación se realizó a pH 7,4 pero la disociación se realizó a pH 5,8. Se inmovilizó ProA/G (Pierce) sobre un chip sensor CM1 usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) según los ajustes recomendados por GE Healthcare. Se diluyeron anticuerpos y analitos para las condiciones (1) y (3) en tampón de ACES pH 7,4 (ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1,2 mM, Tween 20 al 0,05%, NaN3 al 0,005%) y para la condición (2) se diluyeron en tampón de ACES pH 5,8 (ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCh 1,2 mM, Tween 20 al 0,05%, N aN al 0,005%). Se capturó cada anticuerpo sobre la superficie de sensor mediante ProA/G. Los niveles de captura de anticuerpos eran normalmente de 60-90 unidades de resonancia (UR). Después, se inyectó C5 humana recombinante a de 3 a 27 nM o de 13,3 a 120 nM preparada mediante dilución en serie de tres veces, seguido por disociación. Se regeneró la superficie usando NaOH 25 mM. Se determinaron los parámetros cinéticos en las condiciones (1) y (2) mediante ajuste de los sensogramas con un modelo de unión de 1:1 y se determinó la velocidad de disociación en la condición (3) mediante ajuste de los sensogramas con una disociación de 1:1 para modelo de MCK usando el software de evaluación de T200 de BIACORE (marca registrada), versión 2.0 (GE Healthcare). Se mostró la dependencia del pH de todos los anticuerpos como la razón de la velocidad de disociación de las condiciones (2) y (1).
La velocidad de asociación (ka), la velocidad de disociación (kd), la afinidad de unión (KD) y la dependencia del pH se indican en la tabla 9. Todos los anticuerpos mostraron una velocidad de disociación más rápida a pH 5,8 que a pH 7,4 y su dependencia del pH fue de aproximadamente 20 veces.
[Tabla 9]
Parámetros cinéticos de variantes de anticuerpo anti-C5 en condiciones de pH 7,4 y pH 5,8
ncia
H
Se determinó la afinidad de unión de anticuerpos anti-C5 (BNJ441, eculizumab y una variante 305) a C5 humana recombinante a pH 7,4 y pH 5,8 a 37 grados C usando un instrumento T200 de BIACORE (marca registrada) (GE Healthcare) para evaluar el efecto del pH sobre la unión a antígeno. Se inmovilizó anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (Fc) (KPL n.° 01-10-20) sobre un chip sensor CM4 usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) según los ajustes recomendados por el fabricante. Se diluyeron anticuerpos y analitos o bien en tampón de ACES pH 7,4 o bien en tampón de ACES pH 5,8 que contenía AC<e>S 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl21,2 mM, Tween 20 al 0,05% y NaN3 al 0,005%. Se capturaron anticuerpos sobre la superficie de sensor usando el método anti-Fc, los niveles de captura fueron normalmente de 50-80 unidades de resonancia (UR). Se preparó C5 humana recombinante mediante dilución en serie de tres veces empezando a partir de 27 nM para las condiciones de ensayo a pH 7,4, o 135 nM para las condiciones de ensayo a pH 5,8. Se regeneró la superficie usando HCl 20 mM, Tween 20 al 0,01%. Se procesaron los datos y se ajustaron con un modelo de unión de 1:1 usando el software BiaEvaluation 2.0 (GE Healthcare).
La afinidad de unión (KD) de BNJ441, eculizumab y la variante 305 a C5 humana recombinante a pH 7,4 y pH 5,8 se muestra en la tabla 10. La variante 305 mostró una razón de (KD a pH 5,8)/(KD a pH 7,4) de casi 800, 8 veces superior a BNJ441 que sólo mostró una razón de (KD a pH 5,8)/(KD a pH 7,4) de 93.
[Tabla 10]
Anticuerpo KD (M) Razón de KD a pH 5,8/pH 7,4
pH 7,4 pH 5,8
Variante 305LO5 1,66E-10 1,32E-07 795
Eculizumab 1,42E-10 2,64E-09 19
BNJ441 1,38E-09 1,28E-07 93
[Ejemplo 9]
Actividad inhibidora de anticuerpos anti-C5 (variantes 305) sobre la activación de C5
9.1. Inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediada por AcM anti-C5
Se sometieron a prueba los AcM anti-C5 para determinar la inhibición de la actividad del complemento mediante un ensayo de lisis de liposomas. Se mezclaron treinta microlitros de suero humano normal (6,7%) (Biopredic, SER019) con 20 microL de AcM diluido en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una disolución de liposomas sensibilizada con anticuerpos frente a dinitrofenilo (Autokit CH50, Wako, 995-40801) a cada pocillo y se colocó en un agitador durante 2 min a 37 grados C. Se añadieron cincuenta microlitros de disolución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezclaron mediante agitación durante 2 min a 37 grados C. Se incubó la mezcla final a 37 grados C durante 40 minutos y después de eso se midió la DO a 340 nm. Se definió el porcentaje de lisis de liposomas como 100 X [(DO<ac>M - DOfondo de suero y liposoma)]/ [(DOsin AcM - DOfondo de suero y liposoma)]. La figura 15 muestra que los AcM anti-C5: 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-<s>G422, 305LO20-SG422 y 305LO20-SG115, inhibieron la lisis de liposomas. Dos anticuerpos con variantes de Fc: 305LO15-SG115 y 305LO23-SG429, también inhibieron la lisis de liposomas (figura 16).
Se sometieron a prueba los AcM anti-C5 para determinar la inhibición de C5 humana recombinante (SEQ ID NO: 39). Se mezclaron diez microlitros de suero humano deficiente en C5 (Sigma, C1163) con 20 microL de AcM diluido y 20 microL de C5 recombinante (0,1 microg/ml) en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 1 hora a 37 grados C. Se transfirieron liposomas (Autokit CH50) a cada pocillo y se colocaron en un agitador durante 2 min a 37 grados C. Se añadieron cincuenta microlitros de disolución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezclaron mediante agitación durante 2 min a 37 grados C. Se incubó la mezcla final a 37 grados C durante 180 minutos y después de eso se midió la DO a 340 nm. Se definió el porcentaje de lisis de liposomas como anteriormente. La figura 17 muestra que los AcM anti-C5: 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 y 305LO23- SG422, inhibieron la lisis de liposomas.
9.2. Inhibición de la generación de C5a mediante AcM anti-C5
Se sometieron a prueba AcM anti-C5 para determinar la generación de C5a durante la lisis de liposomas para confirmar que los AcM anti-C5 inhiben la escisión de C5 para dar C5a y C5b. Se cuantificaron los niveles de C5a en los sobrenadantes a partir de un ensayo de lisis de liposomas usando un kit de ELISA de C5a (R&D Systems, DY2037). Todos los AcM inhibieron la generación de C5a en los sobrenadantes de una manera dependiente de la dosis (figuras 18 y 19).
9.3. Medición de la actividad del complemento en plasma de macaco cangrejero
Se sometieron a prueba AcM anti-C5 para determinar la inhibición de la actividad del complemento en plasma de macaco cangrejero. Se administraron los AcM anti-C5 a los macacos (20 mg/kg) y se extrajeron muestras de plasma periódicamente hasta el día 56. Se lavaron glóbulos rojos de pollo (cRBC) (Innovative research, IC05-0810) con gelatina/solución salina tamponada con veronal que contenía MgCh 0,5 mM y CaCl2 0,15 mM (GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X) y después de eso se sensibilizaron con anticuerpo anti-RBC de pollo (Rockland 103-4139) a 1 microg/ml durante 15 minutos a 4 grados C. Después se lavaron las células con GVB++ y se suspendieron en el mismo tampón a 1X108 células/ml. En una placa de microprueba de 96 pocillos de fondo redondo independiente, se incubó plasma de macaco con los cRBC sensibilizados a 37 grados C durante 20 minutos. Tras la incubación, se centrifugó la placa a 1000 X g durante 2 minutos a 4 grados C. Se transfirieron sobrenadantes a los pocillos en una placa de microprueba de 96 pocillos de fondo plano para la medición de la DO a 415 nm con una longitud de onda de referencia at 630 nm. Se definió el porcentaje de hemolisis como 100 X [(DOiras la administración - DOfondo de plasma ycRBC)]/ [(DOAntes de la administración - DOfondo de plasma ycRBC)]. La figura 20 muestra que los AcM anti-C5.305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115 y 305LO23-SG115, inhibieron la actividad del complemento en el plasma.
9.4. Inhibición de la actividad biológica de variantes de C5 mediante AcM anti-C5
Se sometieron a prueba AcM anti-C5 para determinar la inhibición de variantes de C5 humana recombinante: V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D. Se ha notificado que los pacientes con PNH que tienen una mutación R885H en C5 muestran una escasa respuesta a eculizumab (véase, por ejemplo, Nishimuraet al.,New Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)). Se expresó cada una de las variantes de C5 humana en células FS293 y se usaron los sobrenadantes para el siguiente estudio. Se mezclaron diez microlitros de suero humano deficiente en C5 (Sigma, C1163) con 20 microL de AcM diluido y 20 microL de medios de cultivo celular que contenían una variante de C5 recombinante (2-3 microg/ml) en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 0,5 horas a 37 grados C. Se transfirieron liposomas (Autokit CH50) a cada pocillo y se colocaron en un agitador durante 2 min a 37 grados C. Se añadieron cincuenta microlitros de disolución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezclaron mediante agitación durante 2 min a 37 grados C. Se incubó la mezcla final a 37 grados C durante 90 minutos y después de eso se midió la DO a 340 nm. Se definió el porcentaje de lisis de liposomas como anteriormente. La figura 21 muestra que un AcM anti-C5 (eculizumab) no inhibió la variante de C5 R885H, pero inhibió las otras variantes sometidas a prueba. La figura 22 muestra que el AcM anti-C5 (una variante 305) inhibió todas las variantes de C5 sometidas a prueba.
9.5. Inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante AcM anti-C5
Se sometieron a prueba AcM anti-C5 para determinar la inhibición de la actividad del complemento mediante un ensayo de lisis de liposomas. Se mezclaron treinta microlitros de suero humano normal (6,7%) (Biopredic, SER019) con 20 microL de AcM diluido en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió disolución de liposomas sensibilizada con anticuerpos frente a dinitrofenilo (Autokit CH50, Wako, 995-40801) a cada pocillo y se colocó en un agitador durante 2 min a 25 grados C. Se añadieron cincuenta microlitros de disolución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezclaron mediante agitación durante 2 min a 25 grados C. Se incubó la mezcla final a 37 grados C durante 45 minutos y después de eso se midió la DO a 340 nm. Se definió el porcentaje de inhibición de lisis de liposomas como 100 X [(DOacm - DOfondo de suero y liposoma)]/ [(DOsin acm -DOfondo de suero y liposoma)]. La figura 23 muestra que los AcM anti-C5, BNJ441 y la variante 305 inhibieron la lisis de liposomas y que la variante 305 tiene una capacidad inhibidora más fuerte que BNJ441.
[Ejemplo 10]
Estudio farmacocinético de anticuerpos monoclonales anti-C5 (variantes 305) en macaco cangrejero
10.1. Pruebain vivousando macaco cangrejero
Se sometió a ensayo la cinéticain vivode anticuerpo anti-C5 humana después de administrar anticuerpo anti-C5 humana en macaco cangrejero (Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd., Japón). Se administró una disolución de anticuerpo anti-C5 humana (2,5 mg/ml) una vez a una dosis de aproximadamente 8 ml/kg en la vena cefálica del antebrazo mediante infusión de 30 minutos. Se extrajo sangre antes de la administración y 5 minutos, siete horas, un día, dos días, tres días, siete días, catorce días, veintiún días, veintiocho días, treinta y cinco días, cuarenta y dos días, cuarenta y nueve días y cincuenta y seis días después de la administración. Se centrifugó inmediatamente la sangre extraída a 1.700 X g y 4 grados C durante 10 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado en un frigorífico a -70 grados C o menos antes del ensayo. Se prepararon los anticuerpos anti-C5 humana tal como se describió en el ejemplo 7.
10.2. Medición de la concentración en plasma de C5 de macaco cangrejero total mediante ensayo ELISA
Se midió la concentración de total C5 de macaco cangrejero en plasma de macaco cangrejero mediante ELISA. Se dispensó anticuerpo anti-C5 humana (anticuerpo interno generado usando el método descrito en el ejemplo 2) sobre una placa Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) y se dejó reposar durante la noche a 4 grados C para preparar placas con anticuerpo anti-C5 de macaco cangrejero inmovilizado. Se prepararon muestras de curva de calibración y muestras de plasma de macaco cangrejero diluidas 20000 veces con anticuerpo inyectado a 0,4 microg/ml y se incubaron durante 60 minutos a 37 grados C. Posteriormente, se dispensaron las muestras sobre las placas con anticuerpo anti-C5 de macaco cangrejero inmovilizado y se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente. Después, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con h Rp (SouthernBiotech) para reaccionar durante treinta minutos a temperatura ambiente y se realizó un lavado. Posteriormente, se añadió sustrato de HRP de ELISA de ABTS (KPL). Se midió la señal mediante un lector de placas a una longitud de onda de 405 nm. Se calculó la concentración de C5 de macaco cangrejero basándose en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso de tiempo de la concentración de C5 de macaco cangrejero en plasma después de la administración intravenosa tal como se midió mediante este método se muestra en la figura 24. Los datos se representan gráficamente como el porcentaje restante en comparación con la concentración de C5 de macaco cangrejero en plasma antes de la administración. Los anticuerpos anti-C5 humana dependientes del pH (305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG422 y 305LO23-SG115) mostraron una acumulación inferior de C5 en plasma en comparación con los anticuerpos anti-C5 humana no dependientes del pH.
10.3. Medición de la concentración en plasma de anticuerpo anti-C5 humana mediante ensayo ELISA
Se midió la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma de macaco cangrejero mediante ELISA. Se dispensó anticuerpo anti-cadena kappa de IgG humana (Antibody Solutions) sobre una placa Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) y se dejó reposar durante la noche a 4 grados C para preparar placas con anticuerpo anti-IgG humana inmovilizado. Se prepararon muestras de curva de calibración y muestras de plasma de macaco cangrejero diluidas 100 veces o más. Posteriormente, se dispensaron las muestras sobre las placas con anticuerpo anti-IgG humana inmovilizado y se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente. Después, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con HRP (SouthernBiotech) para reaccionar durante treinta minutos a temperatura ambiente y se realizó un lavado. Posteriormente, se añadió sustrato de HRP de ELISA de ABTS (KPL). Se midió la señal mediante un lector de placas a una longitud de onda de 405 nm. Se calculó la concentración de anticuerpo anti-C5 humana basándose en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso de tiempo de la concentración de anticuerpo anti-C5 humana en plasma después de la administración intravenosa tal como se midió mediante este método se muestra en la figura 25. Los anticuerpos anti-C5 humana dependientes del pH (305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG422 y 305LO23-SG115) mostraron una semivida más larga en comparación con los anticuerpos anti-C5 humana no dependientes del pH.
[Ejemplo 11]
Análisis de estructura cristalina de rayos X de un complejo de Fab de variante 305 y dominio MG1 de C5 humana
11.1. Expresión y purificación del dominio MG1 (20-124) de C5 humana
Se expresó el dominio MG1 (residuos de aminoácido 20-124 de SEQ ID NO: 39) fusionado a una etiqueta de GST mediante grupo de unión escindible por trombina (GST-MG1) en la cepa deE. coliBL21 DE3 pLysS (Promega) usando un vector pGEX-4T-1 (GE healthcare). Se indujo la expresión de proteína con isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,1 mM a 25 grados C durante 5 horas. Se sometió el sedimento de células bacterianas a lisis con Bugbuster (Merck) complementado con Lysonase (Merck) y cóctel de inhibidores de proteasa completo (Roche), seguido por la purificación de GST-MG1 a partir de la fracción soluble usando una columna GSTrap (GE healthcare) según las instrucciones del fabricante. Se escindió la etiqueta de GST con trombina (Sigma) y se purificó adicionalmente el dominio MG1 resultante con una columna de filtración en gel Superdex 75 (GE healthcare). Se combinaron las fracciones que contenían dominio MG1 y se almacenaron a -80 grados C.
11.2. Preparación de fragmento Fab de una variante 305
Se prepararon fragmentos Fab de una de las variantes optimizadas de 305 mediante el método convencional usando digestión limitada con papaína (Roche Diagnostics, n.° de cat.1047825), seguido por carga en una columna de proteína A (Mab-Slect SuRe, GE Healthcare) para retirar fragmentos Fc, una columna de intercambio catiónico (HiTrap SP HP, GE Healthcare) y una columna de filtración en gel (Superdex200 16/60, GE Healthcare). Se combinaron las fracciones que contenían fragmento Fab y se almacenaron a -80 grados C.
11.3. Preparación de un complejo de Fab de variante 305 y dominio MG1 de C5 humana
Se mezcló dominio MG1 de C5 humana recombinante purificado con un fragmento Fab de variante 305 purificado en una razón molar de 1:1. Se purificó el complejo mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex200 10/300 Increase, GE Healthcare) usando una columna equilibrada con HEPES 25 mM pH 7,5, NaCI 100 mM.
11.4. Cristalización
Se concentraron los complejos purificados hasta aproximadamente 10 mg/ml y se llevó a cabo la cristalización mediante el método de difusión de vapor de gota colgante en combinación con el método de siembra a 4 grados C. La disolución de reserva consistía en formiato de magnesio deshidratado 0,2 M, polietilenglicol 3350 al 15,0% p/v. Esto logró proporcionar cristales de tipo placa en unos pocos días. Se empapó el cristal en una disolución de formiato de magnesio deshidratado 0,2 M, polietilenglicol 3350 al 25,0% p/v y glicerol al 20%.
11.5. Recopilación de datos y determinación de la estructura
Se midieron datos de difracción de rayos X mediante BL32XU en SPring-8. Durante la medición, se colocó el cristal de manera constante en un vapor de nitrógeno a -178 grados C para mantener un estado congelado y se recopiló un total de 180 imágenes de difracción de rayos X usando un detector MX-225HS CCD (RAYONIX) conectado a una línea de haz, mientras se hacía rotar el cristal 1,0 grado cada vez. Se realizó la determinación de los parámetros de celda, indexación de puntos de difracción y procesamiento de los datos de difracción obtenidos a partir de las imágenes de difracción usando el programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 43:186-190 (2010), XDS Package (Acta. Cryst. D66:125-132 (2010)), y Scala (Acta. Cryst. D62:72-82 (2006)), y finalmente se obtuvieron los datos de intensidad de difracción con una resolución de hasta 2,11 Angstrom. Los datos estadísticos de los datos de cristalografía se muestran en la tabla 11.
[Tabla 11]
Recopilación de datos de rayos X y datos estadísticos de refinamiento Recopilación de datos
Grupo espacialP1
Celda unitaria
a, b, c(A) 39,79, 55,10, 127,76 a, P,Y (°) 89,18, 86,24, 78,20 Resolución (A) 49,49-2,11 Reflexiones totales 112,102 Reflexiones únicas 56,154 Completitud (cubierta de mayor resolución) (%) 92,1 (95,8) Rfusióna (cubierta de mayor resolución) (%) 7,2(31,7)Refinamiento
Resolución (A) 25,00-2,11 Reflexiones 53,398
Rfactorb (Rl¡brec) (%) 20,42 (26,44) desviación de rms con respeto a lo ideal
Longitudes de enlace (A) 0,0088 Ángulos de enlace (°) 1,3441 a; Rfusión =ZhklZj\Ij (hkl)- (I(hkl))|/Ihk /I/|j' (hkl)|, dondeIj (hkl)y(I(hkl))son la intensidad de mediciónjy la intensidad media para la reflexión con índiceshkl,respectivamente.
b;Rfactor = Ihkl|Fcalc(hkl)| - \Fobs (hkl)|/Ihkl|Fobs (hkl)\, donde Fobsy Fcalc son las amplitudes de factor de estructura observada y calculada, respectivamente.
c; Rlibre se calcula con el 5% de la reflexión apartado de manera aleatoria.
Se determinó la estructura mediante sustitución molecular con el programa Phaser (J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007)). El modelo de búsqueda del dominio de Fab se derivó a partir de la estructura cristalina de Fab de IgG4 humana publicada (código PDB: 1BBJ), y el modelo de búsqueda del dominio MG1 era de la estructura cristalina de C5 humana publicada (código PDB: 3CU7, Nat. Immunol. 9:753-760 (2008)). Se construyó un modelo con el programa Coot (Acta Cryst. D66:486-501 (2010)) y se refinó con el programa Refmac5 (Acta Cryst. D67:355-367 (2011)). El factor de fiabilidad cristalográfica (R) para los datos de intensidad de difracción a partir de 25-2,11 Angstrom era del 20,42%, con un valor de R libre del 26,44%. Los datos estadísticos de refinamiento de estructura se muestran en la tabla 11.
11.6. Estructura global de un complejo de Fab de variante 305 y dominio MG1 de C5
El fragmento Fab de una variante optimizada de 305 (“Fab de 305”) se unió al dominio MG1 de C5 humana (“MG1”) en una razón de 1:1, y la unidad asimétrica de la estructura cristalina contenía dos complejos, moléculas 1 y 2, tal como se representa en la figura 26A. Las moléculas 1 y 2 pueden alinearse bien a una RMSD (raíz del error cuadrático medio, del inglésRoot Mean Square Deviation)de 0,717 Angstrom con la posición del átomo de C alfa en todos los residuos, tal como se muestra en la figura 26B. Las figuras comentadas a continuación se prepararon usando la molécula 1.
En las figuras 27A y 27B, se mapea el epítopo de la región de contacto de Fab de 305 en la secuencia de aminoácidos de MG1 y en la estructura cristalina, respectivamente. El epítopo incluye los residuos de aminoácido de MG1 que contienen uno o más átomos ubicados dentro de una distancia de 4,5 Angstrom con respecto a cualquier parte del Fab de 305 en la estructura cristalina. Además, el epítopo dentro de una distancia de 3,0 Angstrom está destacado en la figura 27A.
11.7. Interacciones de E48, D51 yK109
Tal como se describió en los ejemplos 4.5 y 4.6, se sometieron a prueba los AcM anti-C5 que incluyen la serie de anticuerpos 305 para determinar la unió a tres mutantes puntuales de C5 humana, E48A, d 51A y K109A, mediante análisis de unión de inmunotransferencia de tipo Western y BIACORE (marca registrada). Aunque las variantes 305 se unieron fuertemente a C5 WT, sólo se unieron se unieron al mutante de C5 E48A y no se unieron a los mutantes D51A y K109A. La estructura cristalina del complejo de Fab de 305 y MG1 reveló que los tres aminoácidos E48, D51 y K109, están todos ellos dentro de una distancia de 3,0 Angstrom desde el Fab de 305, formando varios enlaces de hidrógeno con el Fab, tal como se muestra en la figura 28A. En un examen más detallado, el residuo K109 de MG1 está enterrado en un surco formado en la superficie de contacto de la cadena pesada del Fab e interacciona estrechamente con el Fab mediante tres enlaces de hidrógeno con H-CDR3_G97, H-CDR3_Y100 y H-CDR3_T100b, y mediante un puente de sal con H-CDR3_D95 (figura 28D). D51 está ubicado entre MG1 y la cadena pesada del Fab de 305 y forma dos enlaces de hidrógeno con H-CDR1_Ser32 y H-CDR2_Ser54 llenando el espacio (figura 28C). Estos indican que K109 y D51 de C5 son ambos residuos críticos para la unión de la serie de anticuerpos 305. Por otro lado, E48 está ubicado más cerca de la superficie y sólo forma un enlace de hidrógeno con el Fab, sugiriendo que su contribución a la unión de anticuerpo será menor que la de K109 y E51 (figura 28B). Estas relaciones son compatibles con los resultados de los análisis de unión de inmunotransferencia de tipo Western y BIACORE (marca registrada) de mutantes de C5 humana (ejemplos 4.5 y 4.6). Nota complementaria: la numeración de residuos para los aminoácidos de Fab se basa en el esquema de numeración de Kabat. (Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).
11.8. Interacciones de H70, H72 y H110 de C5 humana y la serie de anticuerpos 305
El análisis de estructura cristalina reveló que tres residuos de histidina en C5 humana, concretamente, H70, H72 y H110, están incluidos en el epítopo del Fab de variante 305, tal como se muestra en la figura 27A y la figura 29A. Se realizó un análisis de unión de BIACORE (marca registrada) para investigar la contribución de estos residuos de histidina a la interacción proteína-proteína dependiente del pH entre C5 humana y el Fab de variante 305 usando los mutantes de C5 humana H70Y, H72Y, H110<y>y H70Y+H110Y (ejemplo 4.7). H72Y dio como resultado la pérdida completa de la unión del Fab de variante 305 a C5. Este residuo de C5 está ubicado en la cavidad formada por el bucle de CDR2 de la cadena pesada del Fab de 305 y el bucle de MG1 (L73, S74 y E76) y rellena estrechamente este espacio, tal como se muestra en la figura 29C. Además, el residuo H72 de C5 forma un enlace de hidrógeno con H-c DR2_Y58. No se esperará que se tolere la mutación H72Y ya que no hay suficiente espacio para albergar la cadena lateral más voluminosa de tirosina. Además no puede mantenerse un enlace de hidrógeno con H-CDR2_Y58. Con respecto a la contribución de H70 y H110 a la dependencia del pH, las mutaciones H70Y y H110Y dieron como resultado una disociación más lenta del Fab de variante 305 a partir de C5 a pH 5,8. H70 forma un enlace de hidrógeno intramolecular con T53 de MG1, que se cree que se perturba a pH 5,8 cuando la protonación de H70 de C5 provoca un cambio conformacional en la parte correspondiente de la superficie de contacto de interacción de MG1 (figura 29B). Para H110, se esperará que la protonación de este residuo de C5 provoque una repulsión de carga para el Fab de 305, que puede aumentarse mediante la protonación del residuo de histidina contiguo, H-CDR3_H100c (figura 29D).

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-C5 que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 111.
2. El anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.
3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo de IgG1 de longitud completa.
4. Un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 4.
6. Un método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 5 de modo que se produce el anticuerpo.
7. Un anticuerpo anti-C5 tal como puede obtenerse mediante el método según la reivindicación 6.
8. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
ES16875755T 2015-12-18 2016-12-16 Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso Active ES2969440T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015247069 2015-12-18
PCT/JP2016/087481 WO2017104779A1 (en) 2015-12-18 2016-12-16 Anti-c5 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2969440T3 true ES2969440T3 (es) 2024-05-20

Family

ID=58186002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16875755T Active ES2969440T3 (es) 2015-12-18 2016-12-16 Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso

Country Status (35)

Country Link
EP (2) EP3390442B1 (es)
JP (4) JP6088703B1 (es)
KR (2) KR102467124B1 (es)
CN (2) CN114478760A (es)
AR (1) AR107077A1 (es)
AU (1) AU2016372930B2 (es)
BR (1) BR112018009067A8 (es)
CA (1) CA3005592C (es)
CL (1) CL2018001577A1 (es)
CO (1) CO2018007374A2 (es)
CR (1) CR20180364A (es)
DK (1) DK3390442T3 (es)
EA (1) EA036756B1 (es)
ES (1) ES2969440T3 (es)
FI (1) FI3390442T3 (es)
HK (1) HK1251942A1 (es)
HR (1) HRP20231456T1 (es)
HU (1) HUE065073T2 (es)
IL (1) IL259256B2 (es)
LT (1) LT3390442T (es)
MA (1) MA44081B1 (es)
MX (2) MX2018007144A (es)
MY (1) MY186948A (es)
PE (2) PE20181402A1 (es)
PH (1) PH12018501282A1 (es)
PL (1) PL3390442T3 (es)
PT (1) PT3390442T (es)
RS (1) RS64998B1 (es)
RU (1) RU2742606C2 (es)
SA (1) SA518391704B1 (es)
SG (2) SG10201709415WA (es)
SI (1) SI3390442T1 (es)
TW (4) TW202344514A (es)
UA (1) UA123774C2 (es)
WO (1) WO2017104779A1 (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101479381B (zh) 2006-03-31 2015-04-29 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
CN103251948A (zh) 2008-04-11 2013-08-21 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
CN107973851A (zh) 2010-11-30 2018-05-01 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
PL3233921T3 (pl) 2014-12-19 2022-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania
WO2017104779A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
EP3468990B1 (en) 2016-06-14 2024-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibodies and uses thereof
EP3472316A4 (en) * 2016-06-17 2020-01-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-C5 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
RU2766112C2 (ru) 2016-08-05 2022-02-08 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Композиция для профилактики или лечения связанных с il-8 заболеваний
MX2020006113A (es) 2017-12-13 2020-08-24 Regeneron Pharma Combinaciones de anticuerpos anti-c5 y usos de las mismas.
CN114072174A (zh) * 2019-04-24 2022-02-18 宾夕法尼亚大学理事会 双功能人源化抗c5抗体和因子h融合蛋白以及它们的用途
CN115068604A (zh) 2019-07-31 2022-09-20 豪夫迈·罗氏有限公司 通过使用抗c5抗体可伐利单抗来治疗或预防c5相关疾病的剂量和施用方案
CN115137815A (zh) 2019-07-31 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 通过使用抗c5抗体可伐利单抗来治疗或预防c5相关疾病的剂量和施用方案
CA3211070A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Regeneration and multiple use of depth filters

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
JPH047733Y2 (es) * 1986-09-09 1992-02-28
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
JP2001521909A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 ジェネンテク・インコーポレイテッド 糖タンパク質グリコフォームを含む方法及び組成物
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270149T3 (en) 1999-04-09 2016-05-09 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCEDURE TO CONTROL THE ACTIVITY OF IMMUNOLOGICAL FUNCTIONAL MOLECULE.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
CA2395660A1 (en) 1999-12-29 2001-07-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
NZ581474A (en) 2001-08-03 2011-04-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2283594T5 (es) 2001-08-17 2016-03-15 Genentech, Inc. Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a C5 y C5a sin impedir la formación de C5b
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
WO2003085102A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
KR20070055625A (ko) 2002-12-16 2007-05-30 제넨테크, 인크. 이뮤노글로불린 변이체 및 이들의 용도
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20040258705A1 (en) * 2003-02-28 2004-12-23 Antigenics Inc. Use of lectins to promote oligomerization of glycoproteins and antigenic molecules
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
LT2348051T (lt) 2003-11-05 2019-02-25 Roche Glycart Ag Cd20 antikūnai su padidintu fc receptoriaus prisijungimo giminingumu ir efektorine funkcija
CN1938046B (zh) 2003-11-06 2014-03-19 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
WO2005097832A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
KR100891620B1 (ko) 2004-04-13 2009-04-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｐ-셀렉틴 항체
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
PT1988882E (pt) * 2006-03-02 2015-02-17 Alexion Pharma Inc Prolongamento da sobrevivência de um aloenxerto por inibição da atividade do complemento
US20090269356A1 (en) * 2006-03-08 2009-10-29 David Epstein Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101679486A (zh) * 2007-03-22 2010-03-24 诺瓦提斯公司 C5抗原及其用途
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
CN103251948A (zh) 2008-04-11 2013-08-21 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
MY159396A (en) * 2008-08-05 2016-12-30 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting complement protein c5
US8999340B2 (en) 2010-03-01 2015-04-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating multiorgan, systemic degos' disease with a complement inhibitor
SG183867A1 (en) * 2010-03-11 2012-10-30 Rinat Neuroscience Corp ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING
US9334334B2 (en) * 2012-03-16 2016-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified non-human animals for generating the same
TWI619729B (zh) * 2012-04-02 2018-04-01 再生元醫藥公司 抗－ｈｌａ－ｂ*２７抗體及其用途
AR092098A1 (es) * 2012-08-13 2015-03-25 Regeneron Pharma ANTICUERPOS ANTI-PCSK9 CON CARACTERISTICAS DE UNION DEPENDIENTES DEL pH
RU2663349C2 (ru) * 2013-01-31 2018-08-03 СЕУЛ НЭШНЛ ЮНИВЕРСИТИ Ар энд ДиБи ФАУНДЕЙШН Антитело против с5 и способ предупреждения и лечения обусловленных комплементом заболеваний
US20160184391A1 (en) 2013-08-16 2016-06-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of graft rejection by administering a complement inhibitor to an organ prior to transplant
US9701743B2 (en) * 2014-02-20 2017-07-11 Allergan, Inc. Complement component C5 antibodies
NZ631007A (en) * 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
PL3233921T3 (pl) * 2014-12-19 2022-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania
WO2017104779A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
MX2018007144A (es) 2018-11-29
RS64998B1 (sr) 2024-01-31
AU2016372930A1 (en) 2018-06-21
BR112018009067A8 (pt) 2019-02-26
SI3390442T1 (sl) 2024-01-31
MA44081B1 (fr) 2023-11-30
FI3390442T3 (fi) 2023-11-10
MA44081A (fr) 2018-10-24
EA201891410A1 (ru) 2019-01-31
KR20170107422A (ko) 2017-09-25
RU2018125624A3 (es) 2020-03-27
TW201726728A (zh) 2017-08-01
EP3390442B1 (en) 2023-11-08
HRP20231456T1 (hr) 2024-03-01
MX2022014885A (es) 2023-01-04
CA3005592C (en) 2024-01-23
SG10201709415WA (en) 2017-12-28
SA518391704B1 (ar) 2021-12-23
EA036756B1 (ru) 2020-12-16
IL259256A (en) 2018-07-31
AU2016372930B2 (en) 2020-10-08
EP4342529A2 (en) 2024-03-27
RU2742606C2 (ru) 2021-02-09
EP3390442A1 (en) 2018-10-24
KR20180085678A (ko) 2018-07-27
PH12018501282A1 (en) 2019-01-28
PT3390442T (pt) 2024-01-08
WO2017104779A1 (en) 2017-06-22
PL3390442T3 (pl) 2024-03-18
KR101789973B1 (ko) 2017-10-26
TWI597292B (zh) 2017-09-01
JP6879751B2 (ja) 2021-06-02
CN108401431B (zh) 2022-01-25
JP6088703B1 (ja) 2017-03-01
TWI747936B (zh) 2021-12-01
MY186948A (en) 2021-08-26
JP2023030197A (ja) 2023-03-07
PE20240365A1 (es) 2024-03-04
CR20180364A (es) 2018-08-22
KR102467124B1 (ko) 2022-11-15
CO2018007374A2 (es) 2018-07-19
CN114478760A (zh) 2022-05-13
CL2018001577A1 (es) 2018-09-28
PE20181402A1 (es) 2018-09-07
JP2017112996A (ja) 2017-06-29
TWI812979B (zh) 2023-08-21
LT3390442T (lt) 2023-12-11
AR107077A1 (es) 2018-03-21
CN108401431A (zh) 2018-08-14
UA123774C2 (uk) 2021-06-02
RU2018125624A (ru) 2020-01-20
BR112018009067A2 (pt) 2018-10-30
JP2017113013A (ja) 2017-06-29
CA3005592A1 (en) 2017-06-22
TW201741336A (zh) 2017-12-01
SG11201610782YA (en) 2017-07-28
JP7208299B2 (ja) 2023-01-18
EP3390442A4 (en) 2021-01-06
IL259256B2 (en) 2023-02-01
HK1251942A1 (zh) 2019-05-03
TW202344514A (zh) 2023-11-16
JP2021121197A (ja) 2021-08-26
DK3390442T3 (da) 2023-11-13
TW202140545A (zh) 2021-11-01
HUE065073T2 (hu) 2024-04-28
IL259256B (en) 2022-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2969440T3 (es) Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso
ES2899894T3 (es) Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso
KR101852739B1 (ko) 항-c5 항체 및 사용 방법
RU2789788C2 (ru) Антитела к с5 и способы их применения
BR122024004392A2 (pt) Anticorpos anti-c5 e métodos de uso
EA041632B1 (ru) Антитела к с5 и способы их применения
EA041304B1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИ-C5 АНТИТЕЛА С БОЛЕЕ ВЫСОКОЙ АФФИННОСТЬЮ ПРИ pH 7,4, ЧЕМ ПРИ pH 5,8 (ВАРИАНТЫ)