ES2915948T3 - Administración conjunta de alfa-aminoéster de derivado de hidroxipropiltiazolidin-carboxamida y un agente tocolítico - Google Patents

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Abstract

Compuesto representado por la fórmula (I) **(Ver fórmula)** o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la prevención del parto prematuro en una paciente humana, en el que el compuesto se administra a la paciente con un agente tocolítico adicional.

Description

DESCRIPCIÓN
Administración conjunta de alfa-aminoéster de derivado de hidroxipropiltiazolidin-carboxamida y un agente tocolítico Campo de la invención
La invención se refiere a composiciones químicas, tales como compuestos, sales y polimorfos cristalinos, que pueden unirse a, e inhibir la actividad de, el receptor de prostaglandina F2a (PGF2a ), así como a métodos de prevención del parto prematuro en la fase gestacional temprana mediante la administración de estas composiciones a una paciente que necesita tratamiento.
Antecedentes de la invención
El parto prematuro representa una causa prevalente de mortalidad perinatal en los países desarrollados y se produce en aproximadamente del 7% al 10% de todos los partos (Berkowitz et al. Epidemiol. Rev. 15:414-443 (1993)). La morbilidad grave, especialmente el síndrome de dificultad respiratoria, la hemorragia intraventricular, la displasia broncopulmonar y la enterocolitis necrosante, son mucho más comunes en los recién nacidos prematuros que en los recién nacidos a término. El deterioro a largo plazo, tal como la parálisis cerebral infantil, la deficiencia visual y la pérdida de audición, también son más comunes en recién nacidos prematuros. En la actualidad, el nacimiento prematuro sigue siendo la causa principal de morbimortalidad infantil en los Estados Unidos, donde, a pesar de las mejoras significativas en la medicina obstétrica, la tasa de mortalidad infantil es más alta que en muchas otras naciones industrializadas, lo que genera costes que superan los cinco mil millones de dólares al año para los cuidados intensivos neonatales de bebés con bajo peso al nacer. Los costes reales asociados con estos cuidados son incluso más altos cuando se tiene en consideración la prestación de asistencia sanitaria de enfermedades relacionadas con el parto prematuro, tales como el síndrome de dificultad respiratoria, cardiopatías, la parálisis cerebral infantil, la epilepsia y graves dificultades de aprendizaje.
Durante los últimos 40 años de investigaciones clínicas, y a pesar del uso de múltiples agentes terapéuticos, la tasa de nacimientos prematuros no ha disminuido drásticamente. La prevención del parto prematuro es difícil y, aunque la terapia tocolítica sigue siendo la piedra angular del tratamiento del parto prematuro, no existe ningún acuerdo universal en cuanto a su valor en este estado. Los agentes tocolíticos disponibles por sí solos no prolongan el parto durante más de 48 horas, y la mayoría de estos agentes carecen de selectividad uterina y, por tanto, pueden provocar efectos secundarios potencialmente graves tanto para la madre como para el feto.
Fundamentalmente, el parto a término y el parto prematuro son procesos similares en el sentido de que comparten un criterio de valoración fisiológico común caracterizado por contracciones uterinas, dilatación del cuello uterino y activación de las membranas fetales. Las diferencias se basan en la edad gestacional a la que se producen estos procesos y en los mecanismos por los que se activan. Se piensa que el parto a término es el resultado de la activación fisiológica de la ruta terminal, mientras que el parto prematuro es un estado patológico caracterizado por múltiples etiologías en las que uno o más componentes de esta ruta se activan de manera aberrante.
La contractilidad uterina se estimula o inhibe por diversos receptores en células miometriales. Se plantea la hipótesis de que la activación del miometrio es el resultado de la expresión coordinada de proteínas asociadas a la contracción (CAP), incluyendo actina, miosina, conexina-43 y los receptores de oxitocina y prostaglandinas. En general, los receptores que provocan la entrada de calcio o la liberación calcio de las reservas intracelulares estimulan la contractilidad. Sin embargo, los receptores relacionados con la producción de nucleótidos cíclicos, tales como monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), relajan el útero. Por ejemplo, los receptores de oxitocina y prostaglandina F (FP) son estimuladores, mientras que los adrenoceptores p2 y los receptores de prostaglandina E2 relacionados con la formación de cAMP son inhibidores.
En los tejidos uterinos, se ha demostrado que las prostaglandinas E2 (PGE2) y F2a (PGF2a ) inducen cambios cervicouterinos y provocan la contractilidad uterina, dos acontecimientos clave en la fisiología del periodo de dilatación y del parto. La activación del receptor de FP en el miometrio humano por PGF2a da como resultado la elevación de la concentración de calcio intracelular, que, a su vez, conduce a la contracción del músculo liso uterino (Abramovitz et al. J. Biol. Chem. 269:2632-2636 (1994) y Senior et al. Br. J. Pharmacol. 108:501-506 (1993)). Los receptores de FP están regulados por incremento en los tejidos uterinos hacia el término (Al-Matubsi et al. Biol. Reprod. 65:1029-1037 (2001)). Los inhibidores de la síntesis de prostaglandina (tales como indometacina y nimesulida) han mostrado algún efecto tocolítico, pero no están exentos de efectos secundarios, y su uso no autorizado en la práctica clínica ha generado preocupaciones con respecto a la seguridad fetal (Norton et al. New Engl. J. Med. 329:1602-1067 (1993) y Peruzzi et al. New Engl. J. Med. 354:1615 (1999)). El documento WO 2003/082278 describe derivados de tiazolidin-carboxamida que pueden usarse para tratar y/o prevenir el parto prematuro, el nacimiento prematuro y la dismenorrea, así como para detener el parto antes del parto por cesárea. Sigue existiendo la necesidad de desarrollar productos terapéuticos con selectividad miometrial que permitan la inhibición duradera de las contracciones uterinas que conducen al parto y que prolonguen el embarazo hasta una fase en la que una mayor maduración fetal aumenta las posibilidades de supervivencia.
Sumario de la invención
La invención abarca alfa-aminoésteres de un derivado de hidroxipropiltiazolidin-carboxamida, así como sales de los mismos, que pueden antagonizar la interacción entre prostaglandina F2a (PGF2a) y el receptor de prostaglandina F, para su uso tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Estos compuestos pueden administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de tratar o prevenir el parto prematuro.
En un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto representado por la fórmula (I),
Figure imgf000003_0001
L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la prevención del parto prematuro en una paciente humana, en el que el compuesto se administra a la paciente con un agente tocolítico adicional. En algunas realizaciones, el compuesto está representado por la fórmula (III), clorhidrato de L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo.
Figure imgf000003_0002
En otro aspecto, el compuesto representado por la fórmula (III)
Figure imgf000003_0003
está en un estado cristalino.
En algunas realizaciones, el compuesto presenta picos de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H centrados en 1,1 ppm, 3,3 ppm, 4,9 ppm, 5,4 ppm, 7,1 ppm, 7,7 ppm, 7,9 ppm y 8,0 ppm.
También se describe una composición farmacéutica que contiene el compuesto según cualquiera de los aspectos anteriormente descritos. La composición farmacéutica puede contener opcionalmente uno o más excipientes. En algunas realizaciones, el compuesto y/o la composición farmacéutica se formula para administración oral a un sujeto. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es un comprimido, una cápsula, una cápsula de gelatina, un polvo, una disolución líquida o una suspensión líquida. En algunas realizaciones, el compuesto y/o la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa a un sujeto.
Una composición farmacéutica para su uso según la invención puede administrarse a un sujeto para retrasar el inicio del parto en el sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas). En algunas realizaciones, el sujeto está experimentando parto prematuro. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) antes del inicio del parto prematuro. Una composición farmacéutica para su uso según la invención puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) para prevenir el parto antes del parto por cesárea. Una composición farmacéutica para su uso según la invención puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) para el tratamiento o la prevención de dismenorrea. Una composición farmacéutica para su uso según la invención puede administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de aliviar uno o más síntomas asociados con el parto, tales como sangrado vaginal y rotura de las membranas uterinas.
El agente terapéutico adicional es un agente tocolítico adicional.
La composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un agente tocolítico adicional. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y un agente tocolítico adicional.
En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un antagonista del receptor de oxitocina, tal como atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, o una o más variantes, formulaciones, formas cristalinas o derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y atosibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y atosibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una variante de atosibán, tal como una variante descrita en la patente estadounidense n.° 4.504.469 o 4.402.942. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y una variante de atosibán, tal como una variante descrita en la patente estadounidense n.° 4.504.469 o 4.402.942.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y retosibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y retosibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una variante de retosibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 8.071.594; 8.357.685; 8.937.179; o US 2016/0074413. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y una variante de retosibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 8.071.594; 8.357.685; 8.937.179; o US 2016/0074413.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y barusibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y barusibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una variante de barusibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 6.143.722; 7.091.314; 7.816.489; o US 2016/0175283. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y una variante de barusibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 6.143.722; 7.091.314; 7.816.489; o US 2016/0175283.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y epelsibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y epelsibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una variante de epelsibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 7.550.462; 7.919.492; 8.202.864; 8.742.099; 9.408.851; 8.716.286; o 8.815.856. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y una variante de epelsibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 7.550.462; 7.919.492; 8.202.864; 8.742.099; 9.408.851; 8.716.286; o 8.815.856.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y nolasibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y nolasibán. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una variante, formulación o forma cristalina de nolasibán, tal como una variante, formulación o forma cristalina descrita en la patente estadounidense n.° 7.115.754 o las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os 2015/0073032; 2015/0164859; o 2016/0002160. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y una variante, formulación o forma cristalina de nolasibán, tal como una variante, formulación o forma cristalina descrita en la patente estadounidense n.° 7.115.754 o las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os 2015/0073032; 2015/0164859; o 2016/0002160.
En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un betamimético, tal como terbutalina, ritodrina, hexoprenalina, albuterol, fenoterol, nilidrina u orciprenalina.
En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un inhibidor de los canales de calcio, tal como una dihidropiridina. En algunas realizaciones, el inhibidor de los canales de calcio es nifedipina. En algunas realizaciones, el inhibidor de los canales de calcio es nicardipina.
En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es una sal de magnesio, tal como sulfato de magnesio. En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un donador de óxido nítrico, tal como nitroglicerina.
En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un antagonista del receptor de oxitocina, tal como atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán, nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración oral y el agente tocolítico adicional se formula para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración intravenosa y el agente tocolítico adicional se formula para administración intravenosa. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración oral y el agente tocolítico adicional se formula para administración intravenosa. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración intravenosa y el agente tocolítico adicional se formula para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración oral y el agente tocolítico adicional se formula para administración intramuscular. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración intravenosa y el agente tocolítico adicional se formula para administración intramuscular.
En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración oral y el agente tocolítico adicional se formula para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración intravenosa y el agente tocolítico adicional se formula para administración intravenosa. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración oral y el agente tocolítico adicional se formula para administración intravenosa. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración intravenosa y el agente tocolítico adicional se formula para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración oral y el agente tocolítico adicional se formula para administración intramuscular. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración intravenosa y el agente tocolítico adicional se formula para administración intramuscular.
En algunas realizaciones, un agente terapéutico adicional es progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y progesterona o caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración oral y la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formula para administración intravaginal. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración intravenosa y la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formula para administración intravaginal. En algunas realizaciones, tanto el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formulan para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración intravenosa y la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formula para administración oral.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la fórmula (III) y progesterona o caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración oral y la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formula para administración intravaginal. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración intravenosa y la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formula para administración intravaginal. En algunas realizaciones, tanto el compuesto representado por la fórmula (III) como la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formulan para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración intravenosa y la progesterona o el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona se formula para administración oral.
En algunas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un corticosteroide. En algunas realizaciones, el corticosteroide es betametasona. En algunas realizaciones, el corticosteroide es dexametasona. En algunas realizaciones, el corticosteroide es hidrocortisona. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración oral y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración intramuscular. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración intravenosa y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración intramuscular. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración oral y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administración intravenosa y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración oral y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración intramuscular. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración intravenosa y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración intramuscular. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración oral y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración oral. En algunas realizaciones, el compuesto representado por la fórmula (III) se formula para administración intravenosa y el corticosteroide (por ejemplo, betametasona, dexametasona o hidrocortisona) se formula para administración oral.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de tratamiento del parto prematuro en un sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o de la composición farmacéutica según cualquiera de los aspectos anteriormente descritos de la invención.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de prevención del parto prematuro en un sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o de la composición farmacéutica según cualquiera de los aspectos anteriormente descritos de la invención.
En algunas realizaciones, el sujeto se caracteriza por una edad gestacional de desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 34 semanas.
En algunas realizaciones, el método incluye administrar por vía oral el compuesto o la composición farmacéutica al sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar por vía intravenosa el compuesto o la composición farmacéutica al sujeto.
El compuesto se administra al sujeto en combinación con un agente tocolítico adicional.
El compuesto puede administrarse al sujeto en combinación con un antagonista del receptor de oxitocina. El método puede incluir administrar por vía oral el antagonista del receptor de oxitocina al sujeto. El método puede incluir administrar por vía intravenosa el antagonista del receptor de oxitocina al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto al mismo tiempo que se administra el antagonista del receptor de oxitocina. El compuesto puede administrarse al sujeto antes de la administración del antagonista del receptor de oxitocina al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto después de la administración del antagonista del receptor de oxitocina al sujeto. El compuesto puede mezclarse con el antagonista del receptor de oxitocina, y estos agentes se administran al sujeto de manera concurrente. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de oxitocina es atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán o nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de oxitocina es atosibán, o una variante de atosibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 4.504.469 o 4.402.942.
En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de oxitocina es retosibán, o una variante de retosibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 8.071.594; 8.357.685; 8.937.179; o US 2016/0074413.
En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de oxitocina es barusibán, o una variante de barusibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 6.143.722; 7.091.314; 7.816.489; o US 2016/0175283.
En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de oxitocina es epelsibán, o una variante de epelsibán, tal como una variante descrita en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 7.550.462; 7.919.492; 8.202.864; 8.742.099; 9.408.851; 8.716.286; o 8.815.856.
En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de oxitocina es nolasibán, o una variante, formulación o forma cristalina de nolasibán, tal como una variante, formulación o forma cristalina descrita en la patente estadounidense n.° 7.115.754 o las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os 2015/0073032; 2015/0164859; o 2016/0002160.
El compuesto puede administrarse al sujeto en combinación con un betamimético, tal como terbutalina, ritodrina, hexoprenalina, albuterol, fenoterol, nilidrina u orciprenalina. El método puede incluir administrar por vía oral el betamimético al sujeto. El método puede incluir administrar por vía intravenosa el betamimético al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto al mismo tiempo que se administra el betamimético. El compuesto puede administrarse al sujeto antes de la administración del betamimético al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto después de la administración del betamimético al sujeto. El compuesto puede mezclarse con el betamimético, y estos agentes se administran al sujeto de manera concurrente.
El compuesto puede administrarse al sujeto en combinación con un inhibidor de los canales de calcio, tal como una dihidropiridina. En algunas realizaciones, el inhibidor de los canales de calcio es nifedipina. En algunas realizaciones, el inhibidor de los canales de calcio es nicardipina. El método puede incluir administrar por vía oral el inhibidor de los canales de calcio al sujeto. El método puede incluir administrar por vía intravenosa el inhibidor de los canales de calcio al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto al mismo tiempo que se administra el inhibidor de los canales de calcio. El compuesto puede administrarse al sujeto antes de la administración del inhibidor de los canales de calcio al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto después de la administración del inhibidor de los canales de calcio al sujeto. El compuesto puede mezclarse con el inhibidor de los canales de calcio, y estos agentes se administran al sujeto de manera concurrente.
El compuesto puede administrarse al sujeto en combinación con una sal de magnesio, tal como sulfato de magnesio. El método puede incluir administrar por vía intravenosa la sal de magnesio al sujeto. El método puede incluir administrar por vía intramuscular la sal de magnesio al sujeto. El método puede incluir administrar por vía oral la sal de magnesio al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto al mismo tiempo que se administra la sal de magnesio. El compuesto puede administrarse al sujeto antes de la administración de la sal de magnesio al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto después de la administración de la sal de magnesio al sujeto. El compuesto puede mezclarse con la sal de magnesio, y estos agentes se administran al sujeto de manera concurrente.
El compuesto puede administrarse al sujeto en combinación con un donador de óxido nítrico, tal como nitroglicerina. El método puede incluir administrar por vía oral el donador de óxido nítrico al sujeto. El método puede incluir administrar por vía intravenosa el donador de óxido nítrico al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto al mismo tiempo que se administra el donador de óxido nítrico. El compuesto puede administrarse al sujeto antes de la administración del donador de óxido nítrico al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto después de la administración del donador de óxido nítrico al sujeto. El compuesto puede mezclarse con el donador de óxido nítrico, y estos agentes se administran al sujeto de manera concurrente.
El compuesto puede administrarse al sujeto en combinación con progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. El método puede incluir administrar por vía oral la progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona, al sujeto. El método puede incluir administrar por vía intravaginal la progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona, al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto al mismo tiempo que se administra la progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-ahidroxiprogesterona. El compuesto puede administrarse al sujeto antes de la administración de la progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona, al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto después de la administración de la progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona, al sujeto. El compuesto puede mezclarse con la progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona (por ejemplo, en una formulación oral, entre otras), y estos agentes se administran al sujeto de manera concurrente.
El compuesto puede administrarse al sujeto en combinación con un corticosteroide. En algunas realizaciones, el corticosteroide es betametasona. En algunas realizaciones, el corticosteroide es dexametasona. El método puede incluir administrar por vía oral el corticosteroide al sujeto. El método puede incluir administrar por vía intramuscular el corticosteroide al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto al mismo tiempo que se administra el corticosteroide.
El compuesto puede administrarse al sujeto antes de la administración del corticosteroide al sujeto. El compuesto puede administrarse al sujeto después de la administración del corticosteroide al sujeto. El compuesto puede mezclarse con el corticosteroide (por ejemplo, en una formulación oral, entre otras), y estos agentes se administran al sujeto de manera concurrente.
Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a un valor que se encuentra dentro del 10% por encima o por debajo del valor que está describiéndose.
Tal como se usa en el presente documento, el término “afinidad” se refiere a la fuerza de una interacción de unión entre dos moléculas, tales como un ligando y un receptor. Se pretende que el término “Ki”, tal como se usa en el presente documento, se refiera a la constante de inhibición de un antagonista para una molécula particular de interés, y se expresa como concentración molar (M). Los valores de Ki para interacciones antagonista-diana pueden determinarse, por ejemplo, usando métodos establecidos en la técnica. Los métodos que pueden usarse para determinar la Ki de un antagonista para una diana molecular incluyen experimentos de unión competitiva, tales como ensayos de unión competitiva de radioligandos, por ejemplo, tal como se describe en el documento US 8.415.480. Se pretende que el término “Kd”, tal como se usa en el presente documento, se refiera a la constante de disociación, que puede obtenerse, por ejemplo, a partir de la razón de la constante de velocidad para la disociación de las dos moléculas (kd) con respecto a la constante de velocidad para la asociación de las dos moléculas (ka) y se expresa como concentración molar (M). Los valores de Kd para interacciones receptor-ligando pueden determinarse, por ejemplo, usando métodos establecidos en la técnica. Los métodos que pueden usarse para determinar la Kd de una interacción receptor-ligando incluyen resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, a través del uso de un sistema de biosensores tal como un sistema BIACORE®.
Tal como se usa en el presente documento, el término “corticosteroide” se refiere a cualquiera de las hormonas esteroideas producidas por la corteza suprarrenal o a sus equivalentes sintéticos. Los corticosteroides a modo de ejemplo incluyen betametasona, dexametasona e hidrocortisona, entre otros, así como variantes de los mismos. Los corticosteroides para su uso junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen aquellos que pueden inducir la maduración pulmonar fetal, por ejemplo, para prevenir el desarrollo de síndrome de dificultad respiratoria en recién nacidos prematuros. Los corticosteroides a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen los descritos en Jobe et al. Am. J. Obstet. Gynecol. 190:878-881 (2004) y Miracle et al. J. Perinat. Med. 36:191-196 (2008).
Tal como se usa en el presente documento, el término “cristalino” o “forma cristalina” significa que tiene un estado físico que es una red tridimensional regular de átomos, iones, moléculas o ensamblajes moleculares. Las formas cristalinas tienen matrices reticulares de elementos estructurales denominados unidades asimétricas que se disponen según simetrías bien definidas para dar celdas unitarias que se repiten en las tres dimensiones. Más bien, el término “amorfo” o “forma amorfa” se refiere a una estructura no organizado (no ordenada). El estado físico de un compuesto terapéutico puede determinarse mediante técnicas a modo de ejemplo tales como difracción de rayos X, microscopía de luz polarizada y/o calorimetría diferencial de barrido.
Tal como se usa en el presente documento, el término “endógeno” describe una molécula (por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico o un cofactor) que se encuentra de manera natural en un organismo particular (por ejemplo, un ser humano) o en una ubicación particular dentro de un organismo (por ejemplo, un órgano, un tejido o una célula, tal como una célula humana).
Tal como se usa en el presente documento, el término “exógeno” describe una molécula (por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico o un cofactor) que no se encuentra de manera natural en un organismo particular (por ejemplo, un ser humano) ni en una ubicación particular dentro de un organismo (por ejemplo, un órgano, un tejido o una célula, tal como una célula humana). Los materiales exógenos incluyen aquellos que se proporcionan a partir de una fuente externa a un organismo o a la materia cultivada extraída a partir del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “edad gestacional” describe cómo de avanzado está un embarazo particular, y se mide desde el primer día del último ciclo menstrual de un sujeto hembra embarazada hasta la fecha actual. Tal como se usa en el presente documento, el término “parto” (que también puede denominarse nacimiento) se refiere a la expulsión del feto y de la placenta a partir del útero de un sujeto hembra embarazada. Para un embarazo normal, el parto puede producirse a una edad gestacional de aproximadamente 40 semanas. “Parto prematuro”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un estado en el que el parto comienza más de tres semanas antes del periodo de gestación completo, que normalmente es de aproximadamente 40 semanas. Es decir, el parto prematuro se produce en cualquier fase antes de, por ejemplo, 38 semanas de gestación. El parto prematuro conduce normalmente al inicio del parto, o a cambios fisiológicos asociados con el parto, en un sujeto hembra embarazada, si no se trata. El parto prematuro puede estar asociado o no con sangrado vaginal o rotura de las membranas uterinas. El parto prematuro también puede denominarse parto previo al término. La evitación del parto prematuro en un sujeto prolongará el término del embarazo y, por tanto, puede evitar el parto prematuro, reduciendo de ese modo el riesgo de morbimortalidad neonatal.
Tal como se usa en el presente documento, el término “CI50” se refiere a la concentración de una sustancia (antagonista) que reduce la eficacia de un agonista de referencia o la actividad constitutiva de una diana biológica en un 50%, por ejemplo, tal como se mide en un ensayo de unión competitiva de ligandos. Los ensayos de unión competitiva de ligandos incluyen ensayos de unión competitiva de radioligandos, ensayos competitivos de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) y ensayos basados en anisotropía de fluorescencia, entre otros conocidos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento en el contexto de proporcionar o administrar dos o más agentes terapéuticos a un sujeto, la expresión “en combinación con” se refiere a la administración de dos o más agentes terapéuticos a un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano), por ejemplo, o bien de manera concurrente o bien en momentos diferentes. Por ejemplo, un agente terapéutico puede administrarse a un sujeto en combinación con otro mediante la administración de ambos agentes al sujeto de manera concurrente, tal como en una única composición farmacéutica o en composiciones independientes que se administran al sujeto simultáneamente (por ejemplo, mediante vías de administración diferentes). En otro ejemplo, un agente terapéutico puede administrarse a un sujeto en combinación con otro mediante, en primer lugar, la administración al sujeto de un agente terapéutico y, posteriormente, la administración del otro agente terapéutico, o bien mediante la misma vía de administración o bien mediante una diferente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “nolasibán” se refiere a O-metiloxima de (3Z,5S)-5-(hidroximetil)-1-[(2’-metil-1,1’-bifenil-4-il)carbonil]pirrolidin-3-ona, representada por la siguiente fórmula estructural:
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Nolasibán
Se describen variantes, formulaciones y la forma cristalina de nolasibán, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.115.754 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os 2015/0073032; 2015/0164859; y 2016/0002160.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biodisponibilidad oral” se refiere a la fracción de un compuesto administrado a un sujeto, tal como un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que llega a la circulación sistémica en el sujeto, y que no queda retenida en un órgano no diana o se excreta sin absorción a través del tracto gastrointestinal. El término se refiere a una concentración en plasma sanguíneo que se integra con el tiempo y se expresa normalmente como porcentaje de la dosis administrada por vía oral.
Tal como se usa en el presente documento, el término “antagonista del receptor de oxitocina” o “antagonista de oxitocina” se refiere a un compuesto que puede inhibir la interacción entre la oxitocina y el receptor de oxitocina, por ejemplo, de tal manera que se inhibe la actividad de una o más moléculas de señalización aguas abajo en la cascada de transducción de señales de la oxitocina. Los antagonistas de oxitocina para su uso con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen compuestos que se unen a, e inhiben, el receptor de oxitocina, tales como atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, así como variantes, formulaciones, formas cristalinas y derivados de los mismos, incluyendo los descritos en el presente documento, entre otros.
Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son adecuados para el contacto con los tejidos de un sujeto, tal como un mamífero (por ejemplo, un ser humano) sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y otras complicaciones problemáticas excesivas, compatibles con una relación beneficio/riesgo razonable.
Tal como se usa en el presente documento, el término “composición farmacéutica” significa una mezcla que contiene un compuesto terapéutico que va a administrarse a un sujeto, tal como un mamífero, por ejemplo, un ser humano, con el fin de prevenir, tratar o controlar una enfermedad o un estado particular que afecta al mamífero, tal como parto prematuro o dismenorrea, entre otros, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo protector” se refiere a un resto químico que, cuando se une a un grupo funcional, hace que el grupo funcional sea inerte a una o más reacciones químicas. Tales reacciones pueden modificar uno o más sustituyentes del compuesto y, en ausencia de un grupo protector, pueden dar como resultado una modificación química no deseada (por ejemplo, adición electrófila, solvólisis, oxidación, reducción o interconversión de grupos funcionales) de un resto de interés (por ejemplo, un resto amino, hidroxilo, carboxilo o carboxamida). En el momento apropiado, los grupos protectores pueden hacerse reaccionar químicamente para regenerar la funcionalidad original. La identidad del grupo protector puede seleccionarse para que sea compatible con la parte restante de la molécula, por ejemplo, de tal manera que no se retire el grupo protector durante otras etapas de la síntesis o modificación de la molécula y, opcionalmente, de tal manera que las condiciones de reacción usadas para efectuar la retirada del grupo protector no den como resultado la retirada de grupos protectores diferentes ubicados en otros sustituyentes en la molécula. Los grupos protectores a modo de ejemplo incluyen aquellos que pueden unirse de manera covalente a, por ejemplo, un sustituyente amino, tal como el grupo amino de un a-aminoéster. La posterior retirada de un grupo protector, denominada en el presente documento “desprotección” de un resto químico, puede lograrse usando reactivos y condiciones conocidos en la técnica. Los ejemplos de grupos protectores incluyen, sin limitación, bencilo, acetilo, oxiacetilo, carboxibencilo, 9-fluoreniloxicarbonilo, 2-cloro-1-indanilmetoxi-carbonilo, benzo[f]inden-3-metoxicarbonilo, 2-(terc-butilsulfonil)-2-propeniloxicarbonilo, benzotiofensulfona-2-metilcarbonilo, terc-butoxicarbonilo, terc-amiloxicarbonilo, p-trimetilsililetiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, 1-metilciclobutiloxicarbonilo, 2-(p-bifenilil)propil-2-oxicarbonilo, 2-(p-fenilazofenil)propil-2-oxicarbonilo, 2-2-dimetil-3,5-dimetiloxibenciloxicarbonilo, 2-fenilpropil-2-oxicarbonilo, benciloxicarbonilo, ptoluenosulfonilaminocarbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, ditiasuccinoílo, ftaloílo, piperidinoxicarbonilo, formilo, trifluoroacetilo, 2,4,6-trimetoxibencilo, 2,3,6-trimetil-4-metoxibencenosulfonilo, terc-butoximetilo, pentametilcromansulfonilo, adamantilo, p-trimetilsililetilo, p-trimetilililetiloxicarbonilo, terc-butilo, terc-butilbencilo, ciclopentilo, trifenilmetilo, benciloxicarbonilo, formilo y trifluoroacetilo, entre otros. Los grupos protectores pueden ser adecuados para un sustituyente químico particular. Por ejemplo, los ejemplos de grupos protectores de hidroxilo incluyen, sin limitación, bencilo, p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, alilo, tritilo, dialquilsilil éteres, tales como dimetilsilil éter, y trialquilsilil éteres, tales como trimetilsilil éter, trietilsilil éter y t-butildimetilsilil éter; ésteres tales como benzoílo, acetilo, fenilacetilo, formilo, monohaloacetilo, dihaloacetilo y trihaloacetilo tal como cloroacetilo, dicloroacetilo, tricloroacetilo, trifluoroacetilo; y carbonatos tales como metilo, etilo, 2,2,2-tricloroetilo, alilo, bencilo y p-nitrofenilo. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de grupos protectores, por ejemplo, en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a ed., 1991, John Wiley & Sons, así como en McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, 1975, Plenum Press. Se describen otros ejemplos de grupos protectores, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 3.835.175; 4.508.657; 3.839.396; 4.581.167; 4.460.501; y 4.108.846.
Tal como se usa en el presente documento en el contexto de tratamiento terapéutico, los términos “proporcionar” y “que proporciona” se refieren a la administración de un agente terapéutico a un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, tal como un ser humano) que necesita tratamiento, tal como un sujeto que experimenta o está en riesgo de experimentar parto prematuro. Un agente terapéutico puede proporcionarse a un sujeto que lo necesita, por ejemplo, mediante la administración directa del agente terapéutico al sujeto, o mediante la administración de un profármaco que se convierte in vivo en el agente terapéutico tras la administración del profármaco al sujeto. Los profármacos a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, ésteres, fosfatos y otras funcionalidades químicas susceptibles a la hidrólisis tras la administración a un sujeto. Los profármacos incluyen aquellos conocidos en la técnica, tales como los descritos, por ejemplo, en Vig et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 65:1370-1385 (2013), y Huttunen et al., Pharmacol. Rev. 63:750-771 (2011).
Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a una muestra biológica (por ejemplo, sangre, componente sanguíneo (por ejemplo, suero o plasma), orina, saliva, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, tejido (por ejemplo, placentario o dérmico), líquido pancreático, muestra de vellosidad coriónica y células) aislada de un sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “se une específicamente” y “se une” se refieren a una reacción de unión que determina la presencia de una proteína particular en una población heterogénea de proteínas y otras moléculas biológicas que reconoce, por ejemplo, un ligando con particularidad. Un ligando (por ejemplo, una proteína, un proteoglicano o un glicosaminoglicano) que se une específicamente a una proteína se unirá a la proteína, por ejemplo, con una Kd de menos de 100 nM. Por ejemplo, un ligando que se une específicamente a una proteína puede unirse a la proteína con una Kd de hasta 100 nM (por ejemplo, entre 1 pM y 100 nM). Un ligando que no presenta unión específica a una proteína o a un dominio de la misma presentará una Kd de más de 100 nM (por ejemplo, mayor de 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nm, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 pM, 100 pM, 500 pM o 1 mM) para esa proteína o ese dominio de la misma particular. Pueden usarse diversos formatos de ensayo para determinar la afinidad de un ligando por una proteína específica. Por ejemplo, se usan de manera rutinaria ensayos ELISA en fase sólida para identificar ligandos que se unen específicamente a una proteína diana. Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1988) y Harlow y Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1999) para una descripción de formatos de ensayo y condiciones que pueden usarse para determinar la unión de proteínas específicas.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “sujeto” y “paciente” son intercambiables y se refieren a un organismo que recibe tratamiento para una enfermedad o un estado particular tal como se describe en el presente documento (tal como parto prematuro o dismenorrea) o que se diagnostica que padece una enfermedad o un estado según los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos de sujetos y pacientes incluyen mamíferos, tales como seres humanos, que reciben tratamiento para enfermedades o estados, por ejemplo, parto prematuro a una edad gestacional temprana (por ejemplo, 24-34 semanas).
Un compuesto, una forma de sal, un polimorfo cristalino, un agente terapéutico u otra composición descritos en el presente documento puede designarse como caracterizado mediante datos gráficos “sustancialmente tal como se representa en” una figura. Tales datos pueden incluir, sin limitación, difractogramas de rayos X de polvo, espectros de RMN, curvas de calorimetría diferencial de barrido y curvas de análisis termogravimétrico, entre otros. Tal como se conoce en la técnica, tales datos gráficos pueden proporcionar información técnica adicional para definir adicionalmente el compuesto, la forma de sal, el polimorfo cristalino, el agente terapéutico u otra composición. Tal como entiende un experto en la técnica, tales representaciones gráficas de datos pueden estar sujetas a pequeñas variaciones, por ejemplo, en intensidades relativas de pico y posiciones de pico, debido a factores tales como las variaciones en la respuesta del instrumento y las variaciones en la concentración y pureza de la muestra. No obstante, un experto en la técnica podrá comparar fácilmente los datos gráficos en las figuras en el presente documento con datos gráficos generados para un compuesto, una forma de sal, un polimorfo cristalino, un agente terapéutico u otra composición y confirmar si los dos conjuntos de datos gráficos están caracterizando el mismo material o dos materiales diferentes. Por ejemplo, se entenderá, por tanto, que una forma cristalina de clorhidrato de L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo designada en el presente documento como caracterizada por datos gráficos “sustancialmente tal como se representa en” una figura incluye cualquier forma cristalina de clorhidrato de L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo caracterizada por los datos gráficos, que tiene opcionalmente una o más de pequeñas variaciones, por ejemplo, una o más variaciones descritas anteriormente o conocidas por un experto en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratar” o “tratamiento” se refiere a tratamiento terapéutico, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) un trastorno o cambio fisiológico no deseado, tal como la evolución del parto prematuro a una edad gestacional temprana (por ejemplo, 24-34 semanas). Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, tales como sangrado vaginal o rotura de las membranas, y retraso o ralentización del parto. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen, por ejemplo, mujeres embarazadas que ya experimentan un parto prematuro, así como aquellas propensas a desarrollar este estado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “agente tocolítico” se refiere a una sustancia que puede retrasar el inicio del parto en un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano). Los agentes tocolíticos pueden funcionar para suprimir la contractilidad uterina, por ejemplo, aumentando los niveles citoplásmicos de cAMP e inhibiendo la movilización de Ca2+ intracelular. Se describen agentes tocolíticos a modo de ejemplo, por ejemplo, en Haas et al. Int. J. Womens Health. 6:343-349 (2014). Los agentes tocolíticos para su uso junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, las sustancias enumeradas en la tabla 1, a continuación.
Tabla 1. Agentes tocolíticos a modo de ejemplo
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Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un gráfico que demuestra el efecto del compuesto II y del compuesto III sobre la contractilidad uterina espontánea en ratas preñadas de término tardío tras la administración intravenosa.
La figura 2 es un gráfico que muestra el efecto dependiente de la dosis y reversible del compuesto I sobre la contracción uterina espontánea en ratas preñadas de término tardío.
La figura 3 es un gráfico que demuestra el efecto del compuesto II y del compuesto III sobre la contractilidad uterina espontánea en ratas preñadas de término tardío tras la administración oral.
La figura 4 es una tabla que resume diversos métodos usados para generar la base libre del compuesto I, así como observaciones con respecto a las características físicas y los espectros de RMN de compuesto I que se generan mediante cada método.
La figura 5 es una tabla que resume diversos métodos usados para generar sales del compuesto I, así como observaciones con respecto a las características físicas y los espectros de RMN de estas sales que se generan mediante cada método.
La figura 6 es una tabla que resume características físicas así como espectros de difracción de rayos X de polvo (XRPD) de diversas sales del compuesto I.
La figura 7 es una tabla que resume métodos usados para generar formas cristalinas de diversas sales del compuesto I, así como observaciones con respecto a las propiedades físicas y los espectros de XRPD de cada forma cristalina.
La figura 8 es una tabla que resume la solubilidad de diversas sales del compuesto I en disolución acuosa.
La figura 9 es una tabla que resume la estabilidad de formas cristalinas de diversas sales del compuesto I a la humedad relativa (HR) indicada.
La figura 10 es una tabla que resume diversas características del compuesto III tal como se determinan mediante difracción de rayos X de polvo (XRPD), calorimetría diferencial de barrido (DSC), análisis termogravimétrico (TG), sorción/desorción de humedad (MB) y resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H.
La figura 11 es una tabla que resume diversas características de la sal de hidrosulfato del compuesto I tal como se determinan mediante difracción de rayos X de polvo (XRPD), calorimetría diferencial de barrido (DSC), análisis termogravimétrico (TG) y resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H.
La figura 12 muestra un espectro de XRPD de la sal de mesilato del compuesto I.
La figura 13 muestra un espectro de 1H-RMN de la sal de mesilato del compuesto I.
La figura 14 muestra un espectro de XRPD de la base libre del compuesto I.
La figura 15 muestra un espectro de 1H-RMN de la base libre del compuesto I.
La figura 16 muestra un espectro de infrarrojos Raman de la base libre del compuesto I.
La figura 17 muestra un espectro de 1H-RMN de la sal de mesilato del compuesto I. La sal de mesilato se preparó mediante la adición de ácido metanosulfónico a una disolución de la base libre del compuesto I en dietil éter.
La figura 18 muestra una serie de espectros de 1H-RMN de la base libre del compuesto I registrados durante experimentos de desacoplamiento homonuclear.
La figura 19 muestra una serie de espectros de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I que se produce a partir de una suspensión en acetona (parte superior), a partir de evaporación de una mezcla de cloruro de metileno:etil éter (segundo desde la parte superior) y a partir de evaporación lenta de una mezcla 1:1 de acetona:tolueno (segundo desde la parte inferior y parte inferior).
La figura 20 muestra una superposición de una curva de calorimetría diferencial de barrido (que oscila entre aproximadamente -0,5 y aproximadamente 1,3 W/g) y una curva de análisis termogravimétrico (que oscila entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 100% en peso) registradas para la sal de cloruro del compuesto I que se produce a partir de una suspensión en acetona.
La figura 21 muestra un espectro de 1H-RMN de la sal de cloruro del compuesto I que se produce a partir de una mezcla 1:1 de acetona:tolueno.
La figura 22 muestra una serie de espectros de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I que se produce a partir de una suspensión en acetona (parte superior) y después de secarse a vacío a aproximadamente 50°C durante 1 día (parte inferior).
La figura 23 muestra una superposición de una curva de calorimetría diferencial de barrido (que oscila entre aproximadamente -1,0 y aproximadamente 0,2 W/g) y una curva de análisis termogravimétrico (que oscila entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 100% en peso) registradas para la sal de cloruro del compuesto I después de secarse a vacío a aproximadamente 50°C durante 1 día.
La figura 24 muestra una superposición de curvas de análisis termogravimétrico de la sal de cloruro del compuesto I que se produce a partir de una suspensión en acetona (parte superior) y después de secarse a vacío a aproximadamente 50°C durante 1 día (parte inferior).
La figura 25 muestra una superposición de curvas de calorimetría diferencial de barrido registradas para la sal de cloruro del compuesto I que se produce a partir de una suspensión en acetona (parte superior) y después de secarse a vacío a aproximadamente 50°C durante 1 día (parte inferior).
La figura 26 muestra una curva de sorción/desorción de humedad registrada para la sal de cloruro del compuesto I. Los valores en el eje y muestran el cambio en porcentaje en el peso de la sal de cloruro en función de la humedad relativa (HR) en la atmósfera que rodea a la sal.
La figura 27 es una tabla que notifica los datos obtenidos a partir de experimentos de sorción/desorción de humedad realizados con la sal de cloruro del compuesto I.
La figura 28 muestra una curva de sorción/desorción de humedad registrada para la sal de cloruro del compuesto I. Los valores en el eje y muestran el cambio en porcentaje en el peso de la sal de cloruro en función del tiempo durante el cual se alteró la humedad relativa en la atmósfera que rodea a la sal.
La figura 29 muestra una superposición de espectros de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I después (parte superior) y antes de realizar (parte inferior) experimentos de sorción/desorción de humedad.
La figura 30 muestra una superposición de un espectro de XRPD de la sal de fumarato del compuesto I producida mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1 de metanol:tolueno (parte superior) y un espectro de XRPD de ácido fumárico (parte inferior).
La figura 31 muestra una superposición de un espectro de XRPD de la sal de dihidrofosfato del compuesto I (parte superior) y un espectro de x Rp D de la sal de hidrosulfato del compuesto I (parte inferior).
La figura 32 muestra una superposición de una curva de calorimetría diferencial de barrido (que oscila entre aproximadamente -1,9 y aproximadamente 0 W/g) y una curva de análisis termogravimétrico (que oscila entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 95% en peso) registradas para la sal de hidrosulfato del compuesto
La figura 33 muestra un espectro de 1H-RMN de la sal de hidrosulfato del compuesto I.
La figura 34 muestra un espectro de 1H-RMN de la sal de sulfato del compuesto I.
La figura 35 muestra un espectro de XRPD de la sal de mesilato del compuesto I.
La figura 36 muestra un espectro de XRPD de la sal de citrato del compuesto I.
La figura 37 muestra un espectro de XRPD de la sal de edisilato del compuesto I.
La figura 38 muestra un espectro de XRPD de la sal de hidrosulfato del compuesto I.
La figura 39 muestra un espectro de XRPD de la sal de citrato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:2 de metanol:tolueno.
La figura 40 muestra un espectro de XRPD de la sal de hidrosulfato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 6:1 de acetato de etilo:heptano.
La figura 41 muestra un espectro de XRPD de la sal de hidrosulfato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla de acetato de etilo.
La figura 42 muestra un espectro de XRPD de la sal de dihidrofosfato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:2 de metanol:acetonitrilo.
La figura 43 muestra un espectro de XRPD de la sal de dihidrofosfato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1 de metil etil cetona:acetato de n-butilo.
La figura 44 muestra un espectro de XRPD registrado a partir de un experimento de XRPD duplicado de la sal de dihidrofosfato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1 de metil etil cetona:acetato de n-butilo.
La figura 45 muestra un espectro de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1 de acetona:tolueno.
La figura 46 muestra un espectro de XRPD registrado a partir de un experimento de XRPD duplicado de la sal de cloruro del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1 de acetona:tolueno.
La figura 47 muestra un espectro de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla de dietil éter:cloruro de metileno.
La figura 48 muestra un espectro de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I que se produce a partir de una suspensión en acetona.
La figura 49 muestra un espectro de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I después de secarse a vacío.
La figura 50 muestra un espectro de XRPD de la sal de fumarato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1 de metanol:tolueno.
La figura 51 muestra un espectro de XRPD de la sal de fumarato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1 de metanol:acetato de etilo.
La figura 52 muestra un espectro de XRPD de la sal de fumarato del compuesto I que se produce mediante secado a vacío de una mezcla 1:1 de metanol:tolueno.
La figura 53 muestra un espectro de XRPD de la sal de edisilato del compuesto I que se produce mediante evaporación lenta de una mezcla 1:1:1 de metanol:metil etil cetona:tolueno.
La figura 54 muestra una superposición de espectros de XRPD de la sal de cloruro del compuesto I antes (parte inferior) y después (parte superior) del almacenamiento a 40°C y una humedad relativa del 75%.
La figura 55 es una tabla que resume la estabilidad de la sal de mesilato del compuesto I y del compuesto II en el tampón usado en experimentos de penetración de Caco-2: tampón solución salina equilibrada de Hank (HBSS), concentración final de DMSO del 2%.
La figura 56a es una tabla que notifica los datos obtenidos a partir del análisis de la capacidad de la sal de mesilato del compuesto I para pasar desde el compartimento apical hasta el basolateral de un Transwell recubierto con una monocapa de células Caco-2. Se incubaron células Caco-2 cultivadas con la concentración indicada de la sal de mesilato del compuesto I en el compartimento apical del Transwell, y se tomaron alícuotas del compartimento basolateral en los tiempos de muestreo indicados con el fin de determinar la presencia de compuesto I o compuesto II. Los datos notifican la concentración de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial indicada de la sal de mesilato del compuesto I. La figura 56b es una tabla que notifica los datos obtenidos a partir del análisis de la capacidad de la sal de mesilato del compuesto I para pasar desde el compartimento basolateral hasta el apical de un Transwell recubierto con una monocapa de células Caco-2. Se incubaron células Caco-2 cultivadas con la concentración indicada de la sal de mesilato del compuesto I en el compartimento basolateral del Transwell, y se tomaron alícuotas del compartimento apical en los tiempos de muestreo indicados con el fin de determinar la presencia de compuesto I o compuesto II. Los datos notifican la concentración de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial indicada de la sal de mesilato del compuesto I. La figura 56c es un gráfico que muestra la concentración relativa de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial de la sal de mesilato del compuesto I en el compartimento apical. La figura 56d es un gráfico que muestra la concentración relativa de compuesto II en el compartimento apical como porcentaje de la concentración inicial de la sal de mesilato del compuesto I en el compartimento basolateral. No se detectó compuesto I en el compartimento basolateral después de 60 ó 120 minutos de incubación en el compartimento apical. Además, no se detectó compuesto I en el compartimento apical después de 60 ó 120 minutos de incubación en el compartimento basolateral. Más bien, se detectó compuesto II en cada caso. La figura 56e es una tabla que muestra la recuperación de compuesto I en el compartimento apical después de 120 minutos de incubación. Principalmente se recuperó el compuesto inicial en forma de la variante desesterificada, el compuesto II.
La figura 57a es una tabla que notifica los datos obtenidos a partir del análisis de la capacidad del compuesto II para pasar desde el compartimento apical hasta el basolateral de un Transwell recubierto con una monocapa de células Caco-2. Se incubaron células Caco-2 cultivadas con la concentración indicada de compuesto II en el compartimento apical del Transwell, y se tomaron alícuotas del compartimento basolateral en los tiempos de muestreo indicados con el fin de determinar la presencia de compuesto II. Los datos notifican la concentración de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial indicada de compuesto II. La figura 57b es una tabla que notifica los datos obtenidos a partir del análisis de la capacidad del compuesto II para pasar desde el compartimento basolateral hasta el apical de un Transwell recubierto con una monocapa de células Caco-2. Se incubaron células Caco-2 cultivadas con la concentración indicada de compuesto II en el compartimento basolateral del Transwell, y se tomaron alícuotas del compartimento apical en los tiempos de muestreo indicados con el fin de determinar la presencia de compuesto II. Los datos notifican la concentración de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial indicada de compuesto II. La figura 57c es una tabla que muestra la recuperación de compuesto II en el compartimento apical después de 60 y 120 minutos de incubación en el compartimento basolateral, así como la tasa de permeabilidad del compuesto II a través de la monocapa de células Caco-2. La figura 57d es un gráfico que muestra la concentración relativa de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial de compuesto II en el compartimento apical. La figura 57e es un gráfico que muestra la concentración relativa de compuesto II en el compartimento apical como porcentaje de la concentración inicial de compuesto II en el compartimento basolateral.
La figura 58a es una tabla que notifica los datos obtenidos a partir del análisis de la capacidad de la sal de mesilato del compuesto I para pasar desde el compartimento apical hasta el basolateral de un Transwell recubierto con una monocapa de células Caco-2. Se incubaron células Caco-2 cultivadas con la concentración indicada de la sal de mesilato del compuesto I en el compartimento apical del Transwell, y se tomaron alícuotas del compartimento basolateral en los tiempos de muestreo indicados con el fin de determinar la presencia de compuesto I o compuesto II. Los datos notifican la concentración de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial indicada de la sal de mesilato del compuesto I. No se detectó compuesto I en el compartimento basolateral después de 60 ó 120 minutos de incubación en el compartimento apical. La figura 58b es un gráfico que muestra la concentración relativa de compuesto II en el compartimento basolateral como porcentaje de la concentración inicial de la sal de mesilato del compuesto I en el compartimento apical. La figura 58c es una tabla que muestra la recuperación de compuesto I en el compartimento apical después de 120 minutos de incubación. Principalmente se recuperó el compuesto inicial en forma de la variante desesterificada del compuesto, el compuesto II.
La figura 59 es una tabla que resume los parámetros de cromatografía y espectrometría de masas usados para el análisis de concentraciones de compuesto I y compuesto II en los experimentos de penetración de células Caco-2 descritos en el presente documento.
La figura 60a es un gráfico que ilustra la viabilidad fraccionaria de la camada de ratones CD-1 tratados con RU486 o lipopolisacárido (LPS) a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. El asterisco designa un valor de p de p<0,05. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney frente al grupo correspondiente. La figura 60b es un gráfico que ilustra la cantidad de camada viable y no viable de ratones CD-1 tratados con RU486 o LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto.
La figura 61a es un gráfico que ilustra el tiempo desde la inducción hasta el parto de la primera cría para ratones CD-1 tratados con RU486 o LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. Las figuras 61b y 61c son gráficos que ilustran el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre ratones CD-1 tratados con RU486 o LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores a lo largo del eje y indican la proporción de ratones CD-1 que han completado el parto. En cada figura, un asterisco designa un valor de p de p<0,05. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney o una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente.
La figura 62a es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea) y nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral) sobre la viabilidad fraccionaria de la camada de ratones CD-1 tratados con RU486 o lipopolisacárido (LPS) a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. El asterisco designa un valor de p de p<0,05; “ns” designa un valor de p de p>0,05. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney o una prueba de la t para datos independientes frente al grupo de vehículo correspondiente. La figura 62b es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea) y nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral) sobre la cantidad de camada viable y no viable de ratones CD-1 tratados con RU486 o LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto.
La figura 63a es un gráfico que demuestra los efectos del compuesto III (10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg, administrado por vía oral) sobre la viabilidad fraccionaria de la camada de ratones CD-1 tratados con RU486 o LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. “ns” designa un valor de p de p>0,05. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney frente al grupo de vehículo correspondiente. La figura 63b es un gráfico que demuestra los efectos del compuesto III (10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg, administrado por vía oral) sobre la cantidad de camada viable y no viable de ratones CD-1 tratados con RU486 o LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto.
La figura 64a es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre la viabilidad fraccionaria de la camada de ratones CD-1 tratados con RU486 a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente; “NS” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney frente al grupo correspondiente de interés. La figura 64b es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre la cantidad de camada viable y no viable de ratones CD-1 tratados con RU486 a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto.
La figura 65a es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta el parto de la primera cría para ratones CD-1 tratados con RU486 a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente al grupo correspondiente; dos asteriscos designan un valor de p de p<0,01 frente al grupo correspondiente. Las ramas de nifedipina, compuesto III y combinación presentaron valores de p de p=0,0576, p=0,0601 y p<0,001 (indicados por el símbolo “$$$”), respectivamente, en relación con el grupo tratado con vehículo solo. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney o una prueba de la t para datos independientes frente al grupo correspondiente de interés. La figura 65b es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre ratones CD-1 tratados con RU486 a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores a lo largo del eje y indican la proporción de ratones CD-1 que han completado el parto. La figura 65c es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de vehículo y combinación mostradas en la figura 65b. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés. La figura 65d es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de compuesto III y combinación mostradas en la figura 65b. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés. La figura 65e es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de nifedipina y combinación mostradas en la figura 65b. Dos asteriscos designan un valor de p de p<0,01 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés.
La figura 66a es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre la viabilidad fraccionaria de la camada de ratones CD-1 tratados con RU486 a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente; “NS” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney frente al grupo correspondiente de interés. La figura 66b es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre la cantidad de camada viable y no viable de ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto.
La figura 67a es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta el parto de la primera cría para ratones CD-1 tratados con RU486 a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente; “NS” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente. Las ramas de atosibán, compuesto III y combinación presentaron valores de p de p>0,05, p=0,0601 y p>0,05, respectivamente, en relación con el grupo de vehículo. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de la t para datos independientes frente al grupo correspondiente de interés. La figura 67b es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre ratones CD-1 tratados con RU486 a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores a lo largo del eje y indican la proporción de ratones CD-1 que han completado el parto. La figura 67c es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de vehículo y combinación mostradas en la figura 67b. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés. La figura 67d es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de compuesto III y combinación mostradas en la figura 67b. La rama de combinación presentó un valor de p de p=0,0832 en relación con la rama de compuesto III. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés. La figura 67e es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de atosibán y combinación mostradas en la figura 67b. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés.
La figura 68a es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg, administrado por vía oral) y combinaciones de los mismos sobre la viabilidad fraccionaria de la camada de ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente; “NS” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente. La rama de nifedipina presentó un valor de p de p=0,0859 en relación con el grupo tratado con vehículo solo. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney o una prueba de la t para datos independientes frente al grupo correspondiente de interés. La figura 68b es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg, administrado por vía oral) y combinaciones de los mismos sobre la cantidad de camada viable y no viable de ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto.
La figura 69a es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg, administrado por vía oral) y combinaciones de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta el parto de la primera cría para ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. Dos asteriscos designan un valor de p de p<0,01 frente al grupo correspondiente tal como se evalúa mediante una prueba de Mann-Whitney frente al grupo correspondiente; “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente tal como se evalúa mediante una prueba de Mann-Whitney frente al grupo correspondiente; “NS” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente tal como se evalúa mediante una prueba de la t para datos independientes frente al grupo correspondiente; “sin análisis” indica que no se llevó a cabo ningún análisis estadístico para el par indicado. La figura 69b es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (10 mg/kg, administrado por vía oral) y combinaciones de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. La figura 69c es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (30 mg/kg, administrado por vía oral) y combinaciones de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. La figura 69d es un gráfico que demuestra los efectos de nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y combinaciones de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. La figura 69e es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de vehículo y combinación mostradas en la figura 69b. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente. La figura 69f es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de compuesto III y combinación mostradas en la figura 69b. Dos asteriscos designan un valor de p de p<0,01 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés. La figura 69g es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de nifedipina y combinación mostradas en la figura 69b. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente. La figura 69h es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de vehículo y combinación mostradas en la figura 69c. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente. La figura 69i es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de compuesto III y combinación mostradas en la figura 69c. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente. La figura 69j es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de nifedipina y combinación mostradas en la figura 69c. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente. La figura 69k es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de vehículo y combinación mostradas en la figura 69d. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente. La figura 69I es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de compuesto III y combinación mostradas en la figura 69d. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente. La figura 69m es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de nifedipina y combinación mostradas en la figura 69d. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente.
La figura 70a es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre la viabilidad fraccionaria de la camada de ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente; “NS” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney o una prueba de la t para datos independientes frente al grupo correspondiente de interés. La figura 70b es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre la cantidad de camada viable y no viable de ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto.
La figura 71a es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta el parto de la primera cría para ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. Los valores representan la media más/menos el error estándar de la media. “ns” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo correspondiente; “NS” designa un valor de p de p>0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente; “$” designa un valor de p de p<0,05 frente al grupo de vehículo correspondiente. La rama de combinación presentó un valor de p de p=0,0909 en relación con la rama tratada con atosibán solo. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba de Mann-Whitney o una prueba de la t para datos independientes frente al grupo correspondiente de interés. La figura 71b es un gráfico que demuestra los efectos de atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea), compuesto III (100 mg/kg, administrado por vía oral) y una combinación de los mismos sobre el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días para inducir el parto. La figura 71c es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de vehículo y combinación mostradas en la figura 71b. Dos asteriscos designan un valor de p de p<0,01 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés. La figura 71d es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de compuesto III y combinación mostradas en la figura 71b. La rama de combinación presentó un valor de p de p=0,0964 en relación con la rama de compuesto III. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés. La figura 71e es un gráfico que muestra el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto de la camada para las ramas de atosibán y combinación mostradas en la figura 71b. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al grupo correspondiente. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando una prueba del rango logarítmico frente al grupo correspondiente de interés.
La figura 72a es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre la frecuencia de contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (Ad INSTRUMENt S™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas. La medición de la frecuencia de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre la frecuencia contráctil a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre la frecuencia contráctil en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la frecuencia de contracciones como porcentaje de la frecuencia de contracciones de nivel inicial espontáneas. El símbolo “#” designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. La figura 72b es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre el trabajo realizado por contracción (área bajo la curva o “AUC”) de contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo espontáneo realizado por contracción. La medición del trabajo espontáneo realizado por contracción se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre el trabajo realizado por contracción a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre el trabajo realizado por contracción en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo realizado por contracción como porcentaje del trabajo realizado por contracción para contracciones de nivel inicial espontáneas. El símbolo “#” designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. La figura 72c es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre la amplitud máxima de contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la amplitud máxima de contracciones espontáneas. La medición de la amplitud máxima de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre la amplitud máxima de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre la amplitud máxima de contracciones en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la amplitud máxima de contracciones como porcentaje de la amplitud máxima de contracciones de nivel inicial espontáneas. El símbolo “#” designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. La figura 72d es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre la duración de las contracciones de músculo liso inducidas por PGF2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la duración de contracciones espontáneas. La medición de la duración de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre la duración de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre la duración de contracciones en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la duración de contracciones como porcentaje de la duración de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 72e es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre el trabajo total realizado por todas las contracciones (suma de área bajo la curva para todas las contracciones) para contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas. La medición del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre el trabajo total realizado para todas las contracciones posteriores a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre el trabajo total realizado por las contracciones en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo total realizado por las contracciones como porcentaje del trabajo total realizado por las contracciones de nivel inicial espontáneas. El símbolo “#” designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO.
La figura 73a es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre la frecuencia de contracciones de músculo liso inducidas por oxitocina (OT) en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas. La medición de la frecuencia de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre la frecuencia contráctil a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre la frecuencia contráctil en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la frecuencia de contracciones como porcentaje de la frecuencia de contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. La figura 73b es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre el trabajo realizado por contracción (área bajo la curva o “AUC”) de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo espontáneo realizado por contracción. La medición del trabajo espontáneo realizado por contracción se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre el trabajo realizado por contracción a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre el trabajo realizado por contracción en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo realizado por contracción como porcentaje del trabajo realizado por contracción para contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 73c es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre la amplitud máxima de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la amplitud máxima de contracciones espontáneas. La medición de la amplitud máxima de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre la amplitud máxima de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre la amplitud máxima de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la amplitud máxima de contracciones como porcentaje de la amplitud máxima de contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. La figura 73d es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre la duración de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la duración de contracciones espontáneas. La medición de la duración de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre la duración de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre la duración de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la duración de contracciones como porcentaje de la duración de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 73e es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (6 nM, 60 nM, 600 nM y 6000 nM) sobre el trabajo total realizado por todas las contracciones (suma de área bajo la curva para todas las contracciones) para las contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas. La medición del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o compuesto II a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o del compuesto II sobre el trabajo total realizado para todas las contracciones posteriores a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Compuesto II”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II sobre el trabajo total realizado por las contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo total realizado por las contracciones como porcentaje del trabajo total realizado por las contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO.
La figura 74a es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre la frecuencia de contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas. La medición de la frecuencia de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán (“Ato”) a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre la frecuencia contráctil a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre la frecuencia contráctil en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la frecuencia de contracciones como porcentaje de la frecuencia de contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. La figura 74b es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre el trabajo realizado por contracción (área bajo la curva o “AUC”) de contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo espontáneo realizado por contracción. La medición del trabajo espontáneo realizado por contracción se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre el trabajo realizado por contracción a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre el trabajo realizado por contracción en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo realizado por contracción como porcentaje del trabajo realizado por contracción para contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 74c es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre la amplitud máxima de contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la amplitud máxima de contracciones espontáneas. La medición de la amplitud máxima de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre la amplitud máxima de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre la amplitud máxima de contracciones en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la amplitud máxima de contracciones como porcentaje de la amplitud máxima de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 74d es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre la duración de contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la duración de contracciones espontáneas. La medición de la duración de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre la duración de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre la duración de contracciones en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la duración de contracciones como porcentaje de la duración de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 74e es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre el trabajo total realizado por todas las contracciones (suma de área bajo la curva para todas las contracciones) para contracciones de músculo liso inducidas por PGF-2a en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas. La medición del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de d MsO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre el trabajo total realizado para todas las contracciones posteriores a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre el trabajo total realizado por las contracciones en presencia de PGF2a exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGF2a (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGF2a 1 nM”, “PGF2a 10 nM” y “PGF2a 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo total realizado por las contracciones como porcentaje del trabajo total realizado por las contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO.
La figura 75a es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre la frecuencia de contracciones de músculo liso inducidas por PGE2 en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas. La medición de la frecuencia de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán (“Ato”) a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre la frecuencia contráctil a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre la frecuencia contráctil en presencia de PGE2 exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGE2 (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGE2 1 nM”, “PGE2 10 nM” y “PGE2 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la frecuencia de contracciones como porcentaje de la frecuencia de contracciones de nivel inicial espontáneas. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente al control de DMSO. La figura 75b es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre el trabajo realizado por contracción (área bajo la curva o “AUC”) de contracciones de músculo liso inducidas por PGE2 en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 Ms (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo espontáneo realizado por contracción. La medición del trabajo espontáneo realizado por contracción se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre el trabajo realizado por contracción a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre el trabajo realizado por contracción en presencia de PGE2 exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGE2 (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGE2 1 nM”, “PGE2 10 nM” y “PGE2 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo realizado por contracción como porcentaje del trabajo realizado por contracción para contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 75c es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre la amplitud máxima de contracciones de músculo liso inducidas por PGE2 en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 Ms (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la amplitud máxima de contracciones espontáneas. La medición de la amplitud máxima de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre la amplitud máxima de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre la amplitud máxima de contracciones en presencia de PGE2 exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGE2 (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGE2 1 nM”, “PGE2 10 nM” y “PGE2 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la amplitud máxima de contracciones como porcentaje de la amplitud máxima de contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. La figura 75d es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre la duración de contracciones de músculo liso inducidas por PGE2 en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la duración de contracciones espontáneas. La medición de la duración de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre la duración de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre la duración de contracciones en presencia de PGE2 exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGE2 (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGE2 1 nM”, “PGE2 10 nM” y “PGE2 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la duración de contracciones como porcentaje de la duración de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 75e es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de atosibán (6 nM, 60 nM y 600 nM) sobre el trabajo total realizado por todas las contracciones (suma de área bajo la curva para todas las contracciones) para las contracciones de músculo liso inducidas por PGE2 en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 m S (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas. La medición del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de d MsO o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de atosibán sobre el trabajo total realizado para todas las contracciones posteriores a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Ato”. Posteriormente se midieron los efectos de atosibán sobre el trabajo total realizado por las contracciones en presencia de PGE2 exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de PGE2 (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “PGE2 1 nM”, “PGE2 10 nM” y “PGE2 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo total realizado por las contracciones como porcentaje del trabajo total realizado por las contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente al control de DMSO.
La figura 76a es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), atosibán (6 nM) y combinaciones de compuesto II y atosibán sobre la frecuencia de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=3 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas. La medición de la frecuencia de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de atosibán sobre la frecuencia contráctil a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de atosibán sobre la frecuencia contráctil en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la frecuencia de contracciones como porcentaje de la frecuencia de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 76b es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), atosibán (6 nM) y combinaciones de compuesto II y atosibán sobre el trabajo realizado por contracción (área bajo la curva o “AUC”) de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=3 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo espontáneo realizado por contracción. La medición del trabajo espontáneo realizado por contracción se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de atosibán sobre el trabajo realizado por contracción a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de atosibán sobre el trabajo realizado por contracción en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo realizado por contracción como porcentaje del trabajo realizado por contracción para contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 76c es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), atosibán (6 nM) y combinaciones de compuesto II y atosibán sobre la amplitud máxima de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=3 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la amplitud máxima de contracciones espontáneas. La medición de la amplitud máxima de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de atosibán sobre la amplitud máxima de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de atosibán sobre la amplitud máxima de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la amplitud máxima de contracciones como porcentaje de la amplitud máxima de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 76d es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), atosibán (6 nM) y combinaciones de compuesto II y atosibán sobre la duración de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=3 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRu Me Nt S™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la duración de contracciones espontáneas. La medición de la duración de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de atosibán sobre la duración de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de atosibán sobre la duración de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la duración de contracciones como porcentaje de la duración de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 76e es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), atosibán (6 nM) y combinaciones de compuesto II y atosibán sobre el trabajo total realizado por todas las contracciones (suma de área bajo la curva para todas las contracciones) para las contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=3 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMEnTs ™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas. La medición del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o atosibán a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de atosibán sobre el trabajo total realizado para todas las contracciones posteriores a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de atosibán sobre el trabajo total realizado por las contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo total realizado por las contracciones como porcentaje del trabajo total realizado por las contracciones de nivel inicial espontáneas. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente al control de DMSO. Dos símbolos “#” designan un valor de p de p<0,01 frente al tratamiento con atosibán a una concentración de 6 nM.
La figura 77a es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM y 10 pM) sobre la frecuencia de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=2 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (Ad INSTRUMENt S™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas. La medición de la frecuencia de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de nifedipina sobre la frecuencia contráctil a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Nif”. Posteriormente se midieron los efectos de nifedipina sobre la frecuencia contráctil en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la frecuencia de contracciones como porcentaje de la frecuencia de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 77b es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM y 10 pM) sobre el trabajo realizado por contracción (área bajo la curva o “AUC”) de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=2 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo espontáneo realizado por contracción. La medición del trabajo espontáneo realizado por contracción se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de nifedipina sobre el trabajo realizado por contracción a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Nif”. Posteriormente se midieron los efectos de nifedipina sobre el trabajo realizado por contracción en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo realizado por contracción como porcentaje del trabajo realizado por contracción para contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 77c es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM y 10 pM) sobre la amplitud máxima de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=2 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRu Me Nt S™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la amplitud máxima de contracciones espontáneas. La medición de la amplitud máxima de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de nifedipina sobre la amplitud máxima de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Nif”. Posteriormente se midieron los efectos de nifedipina sobre la amplitud máxima de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la amplitud máxima de contracciones como porcentaje de la amplitud máxima de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 77d es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM y 10 pM) sobre la duración de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=2 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la duración de contracciones espontáneas. La medición de la duración de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de nifedipina sobre la duración de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Nif”. Posteriormente se midieron los efectos de nifedipina sobre la duración de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la duración de contracciones como porcentaje de la duración de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 77e es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM y 10 pM) sobre el trabajo total realizado por todas las contracciones (suma de área bajo la curva para todas las contracciones) para las contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=2 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas. La medición del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control o de nifedipina sobre el trabajo total realizado para todas las contracciones posteriores a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “Nif”. Posteriormente se midieron los efectos de nifedipina sobre el trabajo total realizado por las contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo total realizado por las contracciones como porcentaje del trabajo total realizado por las contracciones de nivel inicial espontáneas.
La figura 78a es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), nifedipina (6 nM) y combinaciones de compuesto II y nifedipina sobre la frecuencia de contracciones de músculo liso inducidas por Ot en N=5 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas. La medición de la frecuencia de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de nifedipina sobre la frecuencia contráctil a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de nifedipina sobre la frecuencia contráctil en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la frecuencia de contracciones como porcentaje de la frecuencia de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 78b es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), nifedipina (6 nM) y combinaciones de compuesto II y nifedipina sobre el trabajo realizado por contracción (área bajo la curva o “AUC”) de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=5 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (Ad INSTRUMENt S™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo espontáneo realizado por contracción. La medición del trabajo espontáneo realizado por contracción se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de nifedipina sobre el trabajo realizado por contracción a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de nifedipina sobre el trabajo realizado por contracción en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo realizado por contracción como porcentaje del trabajo realizado por contracción para contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 78c es un gráfico que demuestra los efectos de concentraciones variables de compuesto II (60 nM y 600 nM), nifedipina (6 nM) y combinaciones de compuesto II y nifedipina sobre la amplitud máxima de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=5 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la amplitud máxima de contracciones espontáneas. La medición de la amplitud máxima de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de nifedipina sobre la amplitud máxima de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto 11 y/o de nifedipina sobre la amplitud máxima de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la amplitud máxima de contracciones como porcentaje de la amplitud máxima de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 78d es un gráfico que demuestra los efectos del compuesto II (60 nM y 600 nM), nifedipina (6 nM) y combinaciones de compuesto II y nifedipina sobre la duración de contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=5 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial de la duración de contracciones espontáneas. La medición de la duración de contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de nifedipina sobre la duración de contracciones a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de nifedipina sobre la duración de contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan la duración de contracciones como porcentaje de la duración de contracciones de nivel inicial espontáneas. La figura 78e es un gráfico que demuestra los efectos del compuesto II (60 nM y 600 nM), nifedipina (6 nM) y combinaciones de compuesto II y nifedipina sobre el trabajo total realizado por todas las contracciones (suma de área bajo la curva para todas las contracciones) para las contracciones de músculo liso inducidas por OT en N=5 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 Ms (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab. Una vez que se habían establecido contracciones regulares durante al menos 20 minutos, se registraron mediciones de nivel inicial del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas. La medición del trabajo realizado para todas las contracciones espontáneas se representa en el eje x como “Espon.”. Luego se añadió un control de DMSO, compuesto II y/o nifedipina a cada muestra miometrial a las concentraciones indicadas y se midieron los efectos del control, del compuesto II y/o de nifedipina sobre el trabajo total realizado para todas las contracciones posteriores a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Este punto de tiempo se representa en el eje x como “ANT”. Posteriormente se midieron los efectos del compuesto II y/o de nifedipina sobre el trabajo total realizado por las contracciones en presencia de OT exponiendo las muestras de tejido miometrial con concentraciones crecientes de OT (1 nM, 10 nM y 100 nM) a intervalos secuenciales de 10 minutos. Estos puntos de tiempo se representan en el eje x como “OT 1 nM”, “OT 10 nM” y “OT 100 nM”, respectivamente. Los valores a lo largo del eje y representan el trabajo total realizado por las contracciones como porcentaje del trabajo total realizado por las contracciones de nivel inicial espontáneas. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente al control de DMSO. Dos asteriscos designan un valor de p de p<0,01 frente al control de DMSO. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente al control de DMSO. Tres símbolos “+” designan un valor de p de p<0,001 frente al tratamiento con compuesto II a una concentración de 60 nM.
La figura 79a es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina, de nolasibán y de una combinación de los mismos sobre la expresión de p65 fosforilada(p-p65), p38 fosforilada (p-p38) y cinasa regulada por señales extracelulares fosforilada (p-ERK) en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con nolasibán a una concentración de 1 pM o se trataron tanto con oxitocina como con nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control. La figura 79b es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina y/o de concentración variable de compuesto II, opcionalmente en combinación con nolasibán, sobre la expresión de p-p65, p-p38 y p-ERK en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con compuesto II a una concentración de 3 pM o se trataron tanto con oxitocina como con compuesto II a concentraciones variables de compuesto II, tanto en presencia como en ausencia de nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control. La figura 79c es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina, de nolasibán y de una combinación de los mismos sobre la expresión de los genes proinflamatorios ciclooxigenasa 2 (COX-2) y fosfolipasa A2 dependiente de calcio fosforilada (p-cPLA2) en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con nolasibán a una concentración de 1 pM o se trataron tanto con oxitocina como con nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control. La figura 79d es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina y/o de concentración variable de compuesto II, opcionalmente en combinación con nolasibán, sobre la expresión de los genes proinflamatorios COX-2 y p-cPLA2 en N=6 biopsias miometriales previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con compuesto II a una concentración de 3 pM o se trataron tanto con oxitocina como con compuesto II a concentraciones variables de compuesto II, tanto en presencia como en ausencia de nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control. La figura 79e es un gráfico que cuantifica la expresión de p-p65 mostrada en las figuras 79a y 79b. La figura 79f es un gráfico que cuantifica la expresión de p-p38 mostrada en las figuras 79a y 79b. La figura 79g es un gráfico que cuantifica la expresión de p-e Rk mostrada en las figuras 79a y 79b. La figura 79h es un gráfico que cuantifica la expresión de COX-2 mostrada en las figuras 79c y 79d. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente a las muestras no estimuladas (“NS”). Dos asteriscos designan un valor de p de p<0,01 frente a las muestras no estimuladas. Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente a las muestras no estimuladas. Tres símbolos “#” designan un valor de p de p<0,001 frente a muestras tratadas con oxitocina (OT). La figura 79i es un gráfico que cuantifica la expresión de p-cPLA2 mostrada en las figuras 79c y 79d. El asterisco designa un valor de p de p<0,05 frente a las muestras no estimuladas (“NS”). Tres asteriscos designan un valor de p de p<0,001 frente a las muestras no estimuladas.
La figura 80a es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina, de nolasibán y de una combinación de los mismos sobre la expresión de p-p65, p-p38 y p-ERK en N=3 biopsias de amnios previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con nolasibán a una concentración de 1 pM o se trataron tanto con oxitocina como con nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control. La figura 80b es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina y/o de concentración variable de compuesto II, opcionalmente en combinación con nolasibán, sobre la expresión de p-p65, p-p38 y p-ERK en N=3 biopsias de amnios previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con compuesto II a una concentración de 3 pM o se trataron tanto con oxitocina como con compuesto II a concentraciones variables de compuesto II, tanto en presencia como en ausencia de nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control. La figura 80c es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina, de nolasibán y de una combinación de los mismos sobre la expresión de los genes proinflamatorios COX-2 y p-cPLA2 en N=3 biopsias de amnios previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con nolasibán a una concentración de 1 pM o se trataron tanto con oxitocina como con nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control. La figura 80d es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los efectos de oxitocina y/o de concentración variable de compuesto II, opcionalmente en combinación con nolasibán, sobre la expresión de los genes proinflamatorios COX-2 y p-cPLA2 en N=3 biopsias de amnios previas al parto a término recogidas de mujeres que se someten a parto por cesárea. Las muestras no se estimularon (“NS”), se estimularon con oxitocina (“OT”), se trataron con compuesto II a una concentración de 3 pM o se trataron tanto con oxitocina como con compuesto II a concentraciones variables de compuesto II, tanto en presencia como en ausencia de nolasibán a una concentración de 1 pM durante los periodos de tiempo indicados. Se realizó una inmunotransferencia contra p-actina como control.
Descripción detallada
La invención se refiere a L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo, así como a formas de sal y a polimorfos cristalinos del mismo. Estos compuestos pueden inhibir la actividad de proteínas de la familia del receptor de prostaglandina F (FP-R), tales como el receptor de prostaglandina F2a (PGF2a ). Los compuestos, las sales y los polimorfos cristalinos descritos en el presente documento pueden usarse para inhibir la actividad del receptor de prostaglandina F in vitro e in vivo, y representan composiciones terapéuticas eficaces para el tratamiento del parto prematuro. Los compuestos, las sales y los polimorfos cristalinos descritos en el presente documento pueden administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, tal como un ser humano) que está experimentando o está en riesgo de experimentar el parto a una edad gestacional temprana, por ejemplo, antes de las 38 semanas (por ejemplo, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 37 semanas, tal como a una edad gestacional de aproximadamente 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas o 37 semanas, preferiblemente desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 34 semanas, tal como a una edad gestacional de aproximadamente 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas o 34 semanas). La divulgación proporciona además métodos para sintetizar L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo, así como procedimientos para preparar formas de sal y polimorfos cristalinos del mismo. Además, se describen métodos para tratar el parto prematuro en un sujeto mediante la administración de un alfa-aminoéster de la invención a un sujeto que necesita tratamiento, tal como un sujeto que experimenta parto prematuro o un sujeto en riesgo de experimentar parto prematuro, en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales tal como se describe en el presente documento.
El compuesto 3-([1,T-bifenil]-4-ilsulfonil)-W-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-1,3-tiazolidin-2-carboxamida puede proporcionarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, tal como un ser humano) que está experimentando o está en riesgo de experimentar el parto a una edad gestacional temprana, por ejemplo, antes de las 38 semanas (por ejemplo, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 37 semanas, tal como a una edad gestacional de aproximadamente 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas o 37 semanas, preferiblemente desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 34 semanas, tales como una edad gestacional de aproximadamente 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas o 34 semanas), en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales tal como se describe en el presente documento.
L-Valinato_____ de_____ (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo (compuesto I)
La invención se basa en el descubrimiento de que el compuesto I (L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propilo, representado por la fórmula I, a continuación) y las sales del mismo se convierten in vivo en 3-([1,T-bifenil]-4-ilsulfonil)-W-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-1,3-tiazolidin-2-carboxamida (representada por la fórmula II, a continuación). El compuesto II, previamente descrito en el documento US 8.415.480, es un antagonista del receptor de prostaglandina F, ya que este compuesto presenta una constante de inhibición (Ki) de 6 nM para el FP-R humano tal como se determina mediante ensayos de unión competitiva de radioligandos (se describen detalles experimentales de ensayos de unión competitiva de radioligandos útiles para la determinación de los valores de Ki, por ejemplo, en el documento US 8.415.480, ejemplo 51). Tras la administración a un sujeto, se ha hallado que el compuesto I se desesterifica in vivo para formar el compuesto II debido a la actividad de esterasas endógenas, tales como las presentes en el tracto gastrointestinal.
Figure imgf000029_0001
Se ha descubierto que el compuesto I es un inhibidor del receptor de prostaglandina F, ya que el compuesto I inhibe el FP-R humano con una Ki de 1 nM. El compuesto I presenta mejoras en varias características fisicoquímicas en relación con el compuesto II, incluyendo la solubilidad en agua así como en medios que simulan el contenido del intestino delgado en estado posprandial (FeSSIF) y en ayunas (FaSSIF). Estos datos se resumen en la tabla 2, a continuación.
Tabla 2. Comparación de las propiedades fisicoquímicas del compuesto I y del compuesto II
Figure imgf000029_0002
Además de presentar una solubilidad en agua mejorada, el compuesto I y las sales del mismo presentan un mecanismo de absorción sorprendente y beneficioso. Tal como se describe en los ejemplos a continuación, el compuesto I se desesterifica mediante las esterasas ambientales en el intestino delgado y, posteriormente, penetra de forma pasiva en el epitelio del intestino delgado. Sorprendentemente, el compuesto I y las sales del mismo no son sustratos para la proteína transportadora Pept1, un cotransportador acoplado a protones que media en la absorción de nutrientes peptídicos. Este descubrimiento representa una propiedad inesperada y farmacológicamente beneficiosa. Se sabe que Pept1 media en la absorción de varios ésteres valinato, tal como se describe, por ejemplo, en Vig et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 65:1370-1385 (2013). Pept1 presenta una amplia especificidad de sustratos, tal como se evidencia por la diversidad estructural de los compuestos que transporta esta proteína a través del epitelio intestinal. A pesar de la presencia la funcionalidad éster valinato, el compuesto I y las sales del mismo no dependen de este transportador para la absorción a través del epitelio del intestino delgado. Esta es una propiedad ventajosa, ya que, por tanto, el compuesto I y las sales del mismo (por ejemplo, el compuesto III) no compiten con los sustratos naturales de Pept1, tales como nutrientes peptídicos, por la unión a esta proteína y su transporte. Más bien, el compuesto I y las sales del mismo se convierten in vivo en una forma que se absorbe fácilmente de una manera independiente de la energía y del gradiente local de protones. Esta propiedad inesperada, junto con la alta solubilidad en agua del compuesto I y de las sales del mismo, proporcionan en conjunto un perfil farmacocinético beneficioso mediante el cual los compuestos de la invención se disuelven fácilmente en un entorno acuoso y, a su vez, se convierten en una forma que puede realizar una absorción independiente del transportador.
Clorhidrato de L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il1carbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)prop¡lo (compuesto III)
Se ha descubierto que la sal de cloruro del compuesto I (clorhidrato de L-valinato de (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-¡lsulfon¡l)-1,3-t¡azol¡d¡n-2-il]carbon¡l}-am¡no)-3-(4-fluorofen¡l)prop¡lo, designado como fórmula III a continuación) cristaliza fácilmente usando varios procedimientos experimentales distintos, tal como se describe en los ejemplos a continuación. El compuesto III adopta una forma cristalina reproducible única tras la cristalización a partir de varios medios y en condiciones ambientales diferentes. Además, esta forma cristalina del compuesto III presenta una estabilidad aumentada en condiciones ambientales y en presencia de una humedad relativa elevada. Tal como se describe con más detalle en los ejemplos presentados a continuación, el compuesto III presenta una baja higroscopicidad, y por tanto, no demuestra propensión a absorber humedad a partir de la atmósfera local. Por tanto, el compuesto III presenta una resistencia a cambios químicos, tales como hidrólisis, así como una resistencia a la incorporación de impurezas. Por ejemplo, las impurezas asociadas con el agua atmosférica no se integran fácilmente en la forma cristalina del compuesto III. El compuesto III puede administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas). El compuesto III también puede administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de aliviar uno o más síntomas asociados con el parto, tales como sangrado vaginal y rotura de las membranas uterinas.
Figure imgf000030_0001
El compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, se administra en combinación con uno o más agentes adicionales, concretamente agentes tocolíticos adicionales, tales como un antagonista del receptor de oxitocina descrito en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, que es O-metiloxima de (3Z, 5S)-5-(hidroximetil)-1-[(2’-metil-1,1’-bifenil-4-il)carbonil]pirrolidin-3-ona, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos. Al suprimir la transducción de señales de la oxitocina, los antagonistas del receptor de oxitocina pueden sinergizar con los antagonistas del receptor de prostaglandina F2a descritos en el presente documento para ralentizar o detener las contracciones uterinas, por ejemplo, en una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que se presenta con uno o más síntomas de) parto prematuro. Los agentes tocolíticos adicionales a modo de ejemplo incluyen betamiméticos, tales como terbutalina, ritodrina, hexoprenalina, albuterol, fenoterol, nilidrina y orciprenalina, que pueden funcionar para inactivar la cinasa de cadena ligera de miosina inactiva y/o para agotar las reservas miometriales de Ca2+ mediante la regulación por incremento de cAMP, suprimiendo de ese modo la contractilidad uterina. De manera adicional o alternativa, los inhibidores de los canales de calcio, tales como dihidropiridinas (por ejemplo, nifedipina y nicardipina), pueden administrarse junto con un compuesto de la invención, por ejemplo, para modular la [Ca2+] miometrial y suprimir la activación mediada por Ca2+ de filamentos de miosina, lo que conduce a contracciones miometriales. De manera adicional o alternativa, las sales de magnesio, tales como el sulfato de magnesio, pueden administrarse junto con un compuesto de la invención, por ejemplo, para hiperpolarizar la membrana plasmática y/o para competir con el Ca2+ por la unión a la cadena ligera de miosina. De manera adicional o alternativa, los donadores de óxido nítrico, tales como nitroglicerina, puede administrarse junto con un compuesto descrito en el presente documento, por ejemplo, para aumentar los niveles miometriales de monofosfato de guanosina cíclico, inactivando de ese modo los filamentos de cadena ligera de miosina.
De manera adicional o alternativa, el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse junto con progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como 17-a -hidroxiprogesterona, para suprimir la contractilidad uterina en un sujeto que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que se presenta con uno o más síntomas de) parto prematuro.
De manera adicional o alternativa, el compuesto puede administrarse junto con un corticosteroide descrito en el presente documento o conocido en la técnica, por ejemplo, para fomentar la maduración pulmonar fetal para prevenir la aparición de síndrome de dificultad respiratoria, entre otros trastornos infantiles.
Además, el compuesto III puede formularse en una composición farmacéutica, tal como una composición farmacéutica formulada tal como se describe a continuación.
Métodos de tratamiento
El compuesto I, así como las sales del mismo, representan robustos inhibidores del receptor de prostaglandina F y pueden usarse para antagonizar la interacción entre los miembros de la familia de prostaglandina F, tales como la prostaglandina F2a , con el receptor de prostaglandina F correspondiente in vivo con el fin de atenuar las contracciones uterinas. El compuesto I y las sales del mismo pueden administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de tratar o prevenir el parto prematuro. La prostaglandina F2a endógena se sintetiza en y se libera por células epiteliales uterinas en respuesta a las cascadas de transducción se señales iniciadas por la oxitocina. Tras la unión de PGF2a a PGF2a-R sobre la superficie extracelular de un miocito uterino, la fosfolipasa C escinde el fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) para producir diacilglicerol (DAG) e inositol-1,4,5-trisfosfato (IP3). A su vez, el IP3 potencia la liberación de calcio (Ca2+) intracelular a partir del retículo sarcoplásmico. El aumento repentino en las reservas de calcio conduce, en última instancia, a contracciones musculares uterinas y a una necrosis de células endoteliales del cuerpo lúteo, una estructura que secreta progesterona que soporta el feto en desarrollo. El inicio aberrante de contracciones uterinas y la degradación del cuerpo lúteo provocada por la desregulación de la secreción de PGF2a pueden conducir al parto prematuro. El compuesto I y las sales del mismo, tales como el compuesto III, pueden atenuar la formación medida por fosfolipasa C de IP3, y la posterior movilización de las reservas de calcio intracelular, mediante la inhibición de la asociación de PGF2a con PGF2a R. Por tanto, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a sujetos, tales como mujeres embarazadas, con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas). Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a un sujeto con el fin de prevenir el parto antes del parto por cesárea. Además, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a un sujeto para la profilaxis y/o el tratamiento de dismenorrea. El compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, también puede administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de aliviar uno o más síntomas asociados con el parto, tales como sangrado vaginal y rotura de las membranas uterinas.
Además, el compuesto puede usarse para tratar la endometriosis en una paciente (por ejemplo, una paciente humana). La sobreexpresión del receptor de prostaglandina F2a se ha correlacionado con el crecimiento endometrial aberrante. Como antagonistas de la actividad del receptor de prostaglandina F2a , los compuestos (por ejemplo, el compuesto (I) o una sal del mismo, tal como el compuesto (III)) pueden administrarse a una paciente que padece endometriosis con el fin de tratar esta indicación. Los compuestos también pueden administrarse a una paciente con el fin de aliviar uno o más síntomas de endometriosis, incluyendo tales síntomas dolorosos dismenorrea, dispareunia, dolor pélvico crónico, disuria y disquecia durante y/o aparte de la menstruación. El tratamiento con éxito de la endometriosis mediante la administración de un compuesto de la invención a una paciente puede indicarse, por ejemplo, por una reducción en el crecimiento de tejido endometrial y/o una reducción en los síntomas dolorosos durante y/o aparte de la menstruación.
Además de lo anterior, son posibles métodos de tratamiento terapéutico proporcionando el compuesto II a un sujeto que necesita tratamiento para los estados descritos en el presente documento. Por ejemplo, el compuesto II puede proporcionarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de tratar o prevenir el parto prematuro. El compuesto II es un antagonista competente del receptor de PGF2a y, por tanto, puede inhibir la asociación de este receptor con PGF2a . Por tanto, el compuesto II puede proporcionarse a sujetos, tales como mujeres embarazadas, con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas). Por ejemplo, el compuesto II puede proporcionarse a un sujeto con el fin de prevenir el parto antes del parto por cesárea. Además, el compuesto II puede proporcionarse a un sujeto para la profilaxis y/o el tratamiento de dismenorrea. El compuesto II también puede proporcionarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de aliviar uno o más síntomas asociados con el parto, tales como sangrado vaginal y rotura de las membranas uterinas.
Además, el compuesto II puede proporcionarse a un sujeto para tratar la endometriosis en una paciente (por ejemplo, una paciente humana). Como antagonista del receptor de PGF2a , el compuesto II puede proporcionarse a una paciente que padece endometriosis con el fin de tratar esta indicación. El compuesto II puede proporcionarse a una paciente con el fin de aliviar uno o más síntomas de endometriosis, incluyendo tales síntomas dolorosos dismenorrea, dispareunia, dolor pélvico crónico, disuria y disquecia durante y/o aparte de la menstruación. El tratamiento con éxito de la endometriosis mediante la provisión del compuesto II al sujeto puede indicarse, por ejemplo, por una reducción en el crecimiento de tejido endometrial y/o una reducción en los síntomas dolorosos durante y/o aparte de la menstruación.
Terapia de combinación
Aunque los procesos implicados en el inicio del parto aún no están definidos completamente, cada vez hay más evidencias que respaldan la importancia de la inflamación tanto en el parto a término como en el parto prematuro. Durante el inicio del parto, se produce un aumento sistémico en el número de factores proinflamatorios, incluyendo prostaglandinas, citocinas y superóxido dismutasa de manganesa. Además, la inflamación se ha implicado fuertemente en el parto prematuro provocado por infección.
Se piensa que la oxitocina inicia el parto al ejercer dos efectos distintos: inducir directamente la contracción del miometrio uterino y potenciar la síntesis y la liberación de prostaglandinas contráctiles a partir del endometrio/membrana caduca uterinos. Al inhibir la transducción de señales de la oxitocina, pueden lograrse los efectos directos (contráctiles) e indirectos (síntesis de prostaglandina potenciada) de la oxitocina sobre el útero. Además, el tratamiento de la membrana caduca humana con oxitocina da como resultado la estimulación de la producción de prostaglandina F2a . Esto sugiere que existe un papel complementario para la señalización de la oxitocina en tejidos uterinos, mediante el cual la oxitocina puede interaccionar no sólo directamente con el miometrio en la estimulación de las contracciones uterinas, sino también indirectamente a través de la formación de prostaglandinas en otros tejidos.
Hay evidencias recientes que correlacionan la actividad del receptor de prostaglandina F contráctil con el inicio y durante la evolución del parto. Informes recientes también indican que la oxitocina induce la producción de prostaglandinas en células miometriales humanas a través de la potenciación de la ciclooxigenasa 2 (COX-2). Un mecanismo de este tipo puede explicar la liberación sostenida de prostaglandinas en el tejido uterino que fomenta el parto. Por tanto, una terapia de combinación que incluye un antagonista del receptor de prostaglandina F2a , tal como el compuesto I o una sal del mismo (por ejemplo, el compuesto III) y un antagonista del receptor de oxitocina puede ser útil para el tratamiento y/o la prevención del parto prematuro. Además, la combinación de un antagonista del receptor de oxitocina y un antagonista del receptor de prostaglandina F2a puede ser más eficaz para tratar el parto prematuro que los regímenes actuales. Pueden observarse efectos sinérgicos, y se describen en el presente documento, en la prevención tanto de los procesos contráctiles como de los inflamatorios que subyacen al parto prematuro, ya que la(s) dosis de un antagonista del receptor de oxitocina administrada(s) a una paciente pueden ser menores cuando se administran en combinación con un antagonista del receptor de prostaglandina F en relación con dosis que pueden administrarse a una paciente que recibe un antagonista del receptor de oxitocina solo.
El compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse con uno o más agentes adicionales, tales como un antagonista del receptor de oxitocina, con el fin de reducir el inicio de las contracciones uterinas y retrasar el inicio del parto. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse simultáneamente con, mezclarse con o administrarse por separado de un antagonista del receptor de oxitocina. Los antagonistas del receptor de oxitocina a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos de la invención incluyen atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse antes de, después de o simultáneamente con nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado del mismo, con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
De manera adicional o alternativa, el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un betamimético. Los betamiméticos, tales como terbutalina, ritodrina, hexoprenalina, albuterol, fenoterol, nilidrina y orciprenalina, pueden funcionar para agotar los niveles de Ca2+ intracelular (por ejemplo, niveles miometriales de Ca2+ intracelular) a través de la potenciación de los receptores adrenérgicos p-2, regulando por incremento de ese modo el cAMP y agotando las reservas de Ca2+ intracelular que de otro modo estarían disponibles para estimular la contractilidad uterina. Se describen betamiméticos a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, así como métodos a modo de ejemplo para la administración de betamiméticos junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en Gyetvai et al. Obstet. Gynecol.
94:869-877 (1999).
De manera adicional o alternativa, el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un inhibidor de los canales de calcio, tal como un inhibidor de los canales de calcio de tipo L. Los inhibidores de los canales de calcio, incluyendo las dihidropiridinas, tales como nifedipina y nicardipina, pueden funcionar suprimiendo la liberación de Ca2+ a partir del retículo sarcoplásmico, previniendo de ese modo la movilización de Ca2+ que estimula las contracciones musculares uterinas. Se describen inhibidores de los canales de calcio a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, así como métodos a modo de ejemplo para la administración de inhibidores de los canales de calcio junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en Wojcieszek et al. Cochrane Database Syst. Rev. 6:CD002255 (2014).
De manera adicional o alternativa, el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con una sal de magnesio, tal como sulfato de magnesio. Las sales de magnesio, tales como el sulfato de magnesio, pueden modular la contractilidad uterina a través de múltiples mecanismos, tales como mediante la inducción de hiperpolarización de la membrana plasmática y/o mediante la competencia con el Ca2+ por la unión a la cadena ligera de miosina, suprimiendo de ese modo la contracción de los filamentos de miosina en miocitos uterinos.
De manera adicional o alternativa, el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un donador de óxido nítrico. El óxido nítrico, un vasodilatador que es esencial para el mantenimiento del tono normal del músculo liso, se produce en varias células. El óxido nítrico se sintetiza durante la oxidación de L-arginina para dar L-citrulina. Esta reacción está catalizada por la óxido nítrico sintasa, que existe en varias isoformas. Tanto la óxido nítrico sintasa inducible (tipo 2) como la cerebral (tipo 1) se expresan en células miometriales y en células endoteliales de los vasos sanguíneos, mientras que la óxido nítrico sintasa endotelial (tipo 3) se expresa exclusivamente en células endoteliales de los vasos sanguíneos. La interacción entre el óxido nítrico y la guanilil ciclasa soluble, que está presente en las células efectoras cercanas, representa un mecanismo de transducción de señales generalizado que acopla diversos estímulos extracelulares de la formación de óxido nítrico con la síntesis de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) en células diana. El aumento en el contenido de cGMP en células de músculo liso, tales como los miocitos uterinos, inactiva las cinasas de cadena ligera de miosina, lo que conduce a la relajación del músculo liso. Los efectos tocolíticos de los donadores de óxido nítrico, tales como la nitroglicerina, se describen, por ejemplo, en Simhan et al. New Engl. J. Med. 357:477-487 (2007).
De manera adicional o alternativa, el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con progesterona o una variante de la misma, tal como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. La progesterona es una hormona esteroidea secretada por el cuerpo lúteo y por la placenta después de aproximadamente 8 semanas de gestación. La progesterona y las variantes de la misma, tal como el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona, pueden regular la quiescencia uterina al modular directamente la [Ca2+] miometrial y la síntesis de prostaglandina, tal como se describe, por ejemplo, en Muglia et al. New Engl. J. Med. 362:529-535 (2010); Simhan et al. New Engl. J. Med. 357:477-487 (2007); Smith et al. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 142:3-11 (2009); Bernal. Sem. Cell Dev. Biol. 18:340-347 (2007); y Hubinont et al. J. Embarazo.
941057 (2011).
De manera adicional o alternativa, el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un corticosteroide. Los corticosteroides prenatales, tales como betametasona, dexametasona e hidrocortisona, representan una clase de agentes terapéuticos que pueden administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada durante el parto prematuro o a un sujeto en riesgo de parto prematuro (por ejemplo, un sujeto que presenta uno o más síntomas de parto prematuro, tales como sangrado vaginal y rotura de las membranas uterinas) para acelerar la maduración pulmonar fetal. El tratamiento con corticosteroides prenatales está asociado con una reducción global en la muerte neonatal, el síndrome de dificultad respiratoria, la hemorragia intraventricular, la enterocolitis necrosante, la respiración asistida, las admisiones en cuidados intensivos y las infecciones sistémicas en las primeras 48 h de vida. Además, la terapia con corticosteroide prenatales es eficaz en mujeres con rotura de las membranas prematura (PROM) y síndromes de hipertensión relacionados con el embarazo. Hay evidencias que sugieren un beneficio en un amplio intervalo de edades gestacionales, tal como desde aproximadamente 26 hasta aproximadamente 34 semanas, entre otros (Miracle et al. J. Perinat. Med. 36:191-196 (2008)).
Además de lo anterior, según los métodos descritos en el presente documento, el compuesto II puede proporcionarse (por ejemplo, mediante la administración directa o mediante la administración de un profármaco del mismo) a un sujeto que necesita tratamiento (por ejemplo, un sujeto humano que experimenta o está en riesgo de experimentar parto prematuro, o un sujeto humano que padece dismenorrea o endometriosis) con uno o más agentes adicionales, tales como un antagonista del receptor de oxitocina, por ejemplo, con el fin de reducir el inicio de las contracciones uterinas y para retrasar el inicio del parto. Por ejemplo, el compuesto II puede proporcionarse simultáneamente con, mezclarse con o proporcionarse por separado de un antagonista del receptor de oxitocina. Los antagonistas del receptor de oxitocina a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos de la invención incluyen atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos. Por ejemplo, el compuesto II puede proporcionarse antes de, después de o simultáneamente con nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado del mismo, con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
De manera adicional o alternativa, el compuesto II puede proporcionarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un betamimético. Tal como se describió anteriormente, los betamiméticos, tales como terbutalina, ritodrina, hexoprenalina, albuterol, fenoterol, nilidrina y orciprenalina, pueden funcionar para agotar los niveles de Ca2+ intracelular (por ejemplo, niveles miometriales de Ca2+ intracelular) a través de la potenciación de los receptores adrenérgicos p-2, regulando por incremento de ese modo el cAMP y agotando las reservas de Ca2+ intracelular que de otro modo estarían disponibles para estimular la contractilidad uterina. Se describen betamiméticos a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, así como métodos a modo de ejemplo para la administración de betamiméticos junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en Gyetvai et al. Obstet. Gynecol. 94:869-877 (1999).
De manera adicional o alternativa, el compuesto II puede proporcionarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un inhibidor de los canales de calcio, tal como un inhibidor de los canales de calcio de tipo L. Tal como se describió anteriormente, los inhibidores de los canales de calcio, incluyendo las dihidropiridinas, tales como nifedipina y nicardipina, pueden funcionar suprimiendo la liberación de Ca2+ a partir del retículo sarcoplásmico, previniendo de ese modo la movilización de Ca2+ que estimula las contracciones musculares uterinas. Se describen inhibidores de los canales de calcio a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, así como métodos a modo de ejemplo para la administración de inhibidores de los canales de calcio junto con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en Wojcieszek et al. Cochrane Database Syst. Rev. 6:CD002255 (2014).
De manera adicional o alternativa, el compuesto II puede proporcionarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con una sal de magnesio, tal como sulfato de magnesio. Tal como se describió anteriormente, las sales de magnesio, tales como el sulfato de magnesio, pueden modular la contractilidad uterina a través de múltiples mecanismos, tales como mediante la inducción de hiperpolarización de la membrana plasmática y/o mediante la competencia con el Ca2+ por la unión a la cadena ligera de miosina, suprimiendo de ese modo la contracción de los filamentos de miosina en miocitos uterinos.
De manera adicional o alternativa, el compuesto II puede proporcionarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un donador de óxido nítrico. Tal como se describió anteriormente, el óxido nítrico, un vasodilatador que es esencial para el mantenimiento del tono normal del músculo liso, se produce en varias células, y el aumento inducido por óxido nítrico en el contenido de cGMP en células de músculo liso, tales como los miocitos uterinos, conduce a la relajación del músculo liso. Los efectos tocolíticos de los donadores de óxido nítrico, tales como la nitroglicerina, se describen, por ejemplo, en Simhan et al. New Engl. J. Med. 357:477-487 (2007).
De manera adicional o alternativa, el compuesto II puede proporcionarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con progesterona o una variante de la misma, tal como caproato de 17-a -hidroxiprogesterona. Tal como se describió anteriormente, la progesterona y las variantes de la misma, tal como el caproato de 17-a-hidroxiprogesterona, pueden regular la quiescencia uterina al modular directamente la [Ca2+] miometrial y la síntesis de prostaglandina, tal como se describe, por ejemplo, en Muglia et al. New Engl. J. Med. 362:529-535 (2010); Simhan et al. New Engl. J. Med.
357:477-487 (2007); Smith et al. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 142:3-11 (2009); Bernal. Sem. Cell Dev. Biol.
18:340-347 (2007); y Hubinont et al. J. Embarazo. 941057 (2011).
De manera adicional o alternativa, el compuesto II puede proporcionarse a una paciente que experimenta o está en riesgo de experimentar (por ejemplo, que presenta uno o más síntomas de) parto prematuro junto con un corticosteroide. Tal como se describió anteriormente, los corticosteroides prenatales, tales como betametasona, dexametasona e hidrocortisona, representan una clase de agentes terapéuticos que pueden administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada durante el parto prematuro o a un sujeto en riesgo de parto prematuro (por ejemplo, un sujeto que presenta uno o más síntomas de parto prematuro, tales como sangrado vaginal y rotura de las membranas uterinas) para acelerar la maduración pulmonar fetal, y el tratamiento con corticosteroides prenatales está asociado con una reducción global en la muerte neonatal, el síndrome de dificultad respiratoria, la hemorragia intraventricular, la enterocolitis necrosante, la respiración asistida, las admisiones en cuidados intensivos y las infecciones sistémicas en las primeras 48 h de vida.
Composiciones farmacéuticas
El compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede formularse en una composición farmacéutica para su administración a un sujeto, tal como una mujer embarazada, en una forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo. Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que contiene el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, mezclado con un diluyente, portador o excipiente adecuado. El compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse, por ejemplo, por vía oral o mediante inyección intravenosa.
La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto II. Tales composiciones pueden incluir el compuesto II mezclado con un diluyente, portador o excipiente adecuado.
En condiciones habituales de almacenamiento y uso, una composición farmacéutica puede contener un conservante, por ejemplo, para prevenir el crecimiento de microorganismos. Se describen procedimientos y componentes convencionales para la selección y la preparación de formulaciones adecuadas, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2012, 22a ed.) y en The United States Pharmacopeia: The National Formulary (2015, USP 38 NF 33).
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir disoluciones acuosas, dispersiones o polvos estériles, por ejemplo, para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones estériles. En todos los casos, la forma puede esterilizarse usando técnicas conocidas en la técnica y pueden fluidificarse en la medida en que puedan administrarse fácilmente a un sujeto que necesita tratamiento.
Una composición farmacéutica puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, sola o en combinación con portadores farmacéuticamente aceptable, tal como se indica en el presente documento, cuya proporción puede determinarse por la solubilidad y/o la naturaleza química del compuesto, la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica convencional.
Composiciones para la terapia de combinación
El compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, se usa en combinación con uno o más agentes adicionales útiles para la inhibición de las contracciones uterinas y/o de la luteólisis, tales como atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos, entre otros agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes tocolíticos) descritos en el presente documento. El compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede mezclarse con un agente activo adicional, tal como un antagonista del receptor de oxitocina, un betamimético, un inhibidor de los canales de calcio, una sal de magnesio, un donador de óxido nítrico, progesterona o una variante de la misma o un corticosteroide descritos en el presente documento, y administrarse a una paciente en una única composición, o el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse a una paciente por separado de un agente activo adicional. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, y un agente activo adicional pueden administrarse secuencialmente a una paciente.
Además de lo anterior, el compuesto II puede proporcionarse a un sujeto en combinación con uno o más agentes adicionales útiles para la inhibición de las contracciones uterinas y/o de la luteólisis, tales como atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos, entre otros agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes tocolíticos) descritos en el presente documento. El compuesto II puede mezclarse con un agente activo adicional, tal como un antagonista del receptor de oxitocina, un betamimético, un inhibidor de los canales de calcio, una sal de magnesio, un donador de óxido nítrico, progesterona o una variante de la misma o un corticosteroide descritos en el presente documento, y administrarse a una paciente en una única composición, o el compuesto II puede proporcionarse a una paciente por separado de un agente activo adicional. Por ejemplo, el compuesto II y un agente activo adicional pueden administrarse secuencialmente a una paciente, por ejemplo, proporcionando el compuesto II a la paciente seguido de la administración del agente activo adicional a la paciente.
Una composición para la terapia de combinación descrita en el presente documento, tal como una composición farmacéutica descrita en el presente documento, puede administrarse a un sujeto para retrasar el inicio del parto en el sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas). En algunas realizaciones, el sujeto está experimentando parto prematuro. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) antes del inicio del parto prematuro. Una composición farmacéutica puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) para prevenir el parto antes del parto por cesárea. Una composición farmacéutica puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) para el tratamiento o la prevención de dismenorrea. Una composición farmacéutica puede administrarse a un sujeto, tal como una mujer embarazada, con el fin de aliviar uno o más síntomas asociados con el parto, tales como sangrado vaginal y rotura de las membranas uterinas.
Un agente terapéutico adicional presente dentro de una composición para la terapia de combinación según la presente invención es otro agente tocolítico. El agente tocolítico adicional puede ser, por ejemplo, un antagonista del receptor de oxitocina, tal como atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, así como una o más variantes, formulaciones, formas cristalinas o derivados de los mismos. Por ejemplo, se describen atosibán y variantes del mismo en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.504.469 y 4.402.942. Se describen retosibán y variantes del mismo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 8.071.594; 8.357.685; 8.937.179; y en el documento US 2016/0074413. Se describen barusibán y variantes del mismo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 6.143.722; 7.091.314; 7.816.489; y en el documento US 2016/0175283. Se describen epelsibán y variantes del mismo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 7.514.437; 8.367.673; 8.541.579; 7.550.462; 7.919.492; 8.202.864; 8.742.099; 9.408.851; 8.716.286; y 8.815.856. Se describen nolasibán y variantes, formulaciones y formas cristalinas del mismo, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.115.754 y en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os 2015/0073032; 2015/0164859; y 2016/0002160.
En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un betamimético, tal como terbutalina, ritodrina, hexoprenalina, albuterol, fenoterol, nilidrina u orciprenalina. En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un inhibidor de los canales de calcio, tal como una dihidropiridina, tal como nifedipina o nicardipina. En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es una sal de magnesio, tal como sulfato de magnesio. En algunas realizaciones, el agente tocolítico adicional es un donador de óxido nítrico, tal como nitroglicerina.
En algunas realizaciones, un agente terapéutico adicional es progesterona o una variante o un derivado de la misma, tal como caproato de 17-a -hidroxiprogesterona.
En algunas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un corticosteroide. En algunas realizaciones, el corticosteroide es betametasona. En algunas realizaciones, el corticosteroide es dexametasona. En algunas realizaciones, el corticosteroide es hidrocortisona.
En los tratamientos de combinación, las dosificaciones de uno o más de los compuestos terapéuticos pueden reducirse a partir de las dosificaciones convencionales cuando se administran solos. Por ejemplo, las dosis pueden determinarse empíricamente a partir de combinaciones y permutaciones de fármacos o puede deducirlas un médico experto en la técnica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la técnica una descripción de cómo pueden usarse, prepararse y evaluarse las composiciones y los métodos descritos en el presente documento. Ejemplo 1. Preparación de los compuestos I y III
Se prepararon el compuesto I y la sal de cloruro del mismo (compuesto III) según el esquema 1, mostrado a continuación. Este ejemplo describirá cada una de las etapas llevadas a cabo para sintetizar el compuesto I, designadas como etapas 1-6.
Esquema 1. Preparación del compuesto I y de la sal de cloruro del mismo
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Etapa 1: preparación de éster terc-butílico del ácido 2-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil]tiazolidin-3-carboxílico
Figure imgf000037_0001
A un matraz con dimensiones adecuadas (recipiente A), se le añadió ácido 3-(butoxicarbonil)-1,3-tiazolidin-(2S)-carboxílico (1 p), seguido de tetrahidrofurano, y posteriormente se enfrió el contenido del matraz hasta de -35°C a aproximadamente -45°C. Luego se añadió W-metilmorfolina (1,18 vol) al matraz mientras se mantenía la temperatura entre -30°C y -40°C. Luego se añadió cloroformiato de isobutilo (0,58 vol) al matraz mientras se mantenía la temperatura entre -30°C y -40°C.
A un recipiente independiente (recipiente B), se le añadieron (3S)-amino-3-(4-fluorofenil)propan-1-ol (0,76 p) y THF y se mezcló vigorosamente el recipiente hasta que se disolvieron los sólidos a granel.
Luego se añadió la disolución de (3S)-amino-3-(4-fluorofenil)propan-1-ol del recipiente B al recipiente de reacción A mientras se mantenía la temperatura entre -30°C y -40°C. Luego se permitió que el contenido del matraz se calentara hasta de 15°C a 25°C durante un periodo de 1 h a 24 h. Se agitó la mezcla de reacción a de 15°C a 25°C hasta que se observó la completitud de la reacción. Se concentró la mezcla de reacción hasta sequedad, y posteriormente se añadió acetato de etilo al residuo, seguido de disolución acuosa saturada de cloruro de amonio. Se separó la fase orgánica y se lavó con disolución acuosa saturada de cloruro de amonio. Luego se separó la fase orgánica y se lavó con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró, y se concentró el filtrado a de 35°C a 40°C hasta que el contenido de acetato de etilo era < 10% en peso (p/p) para producir éster ferc-butílico del ácido 2-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil]tiazolidin-3-carboxílico.
Etapa 2: preparación de [1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-amiduro del ácido 3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carboxílico
Figure imgf000037_0002
A un matraz con dimensiones adecuadas (recipiente A), se le añadió éster ferc-butílico del ácido 2-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil]tiazolidin-3-carboxílico (1 p), seguido de diclorometano. Posteriormente se permitió que el contenido del matraz se enfriara hasta de -15°C a -20°C. Luego se añadió ácido clorhídrico (3,3 vol) al matraz mientras se mantenía la temperatura entre -15°C y -20°C hasta que se observó la completitud de la reacción. Luego se enfrió la mezcla de reacción hasta de -35°C a -40°C y se añadió tetrahidrofurano a la mezcla mientras se mantenía la temperatura entre -30°C y -40°C. Luego se añadió W,W-diisopropiletilamina a la mezcla (8,16 vol) mientras se mantenía la temperatura entre -15°C y -45°C. Luego se añadió 4-dimetilaminopiridina (0,032 p) al recipiente mientras se mantenía la temperatura entre -15°C y -45°C.
En un recipiente independiente (recipiente B), se añadió cloruro de 4-bifenilsulfonilo (0,85 p), seguido de THF.
Se añadió la disolución de cloruro de 4-bifenilsulfonilo del recipiente B al recipiente de reacción A mientras se mantenía la temperatura entre -15°C y -45°C. Luego se permitió que el contenido de la mezcla de reacción se calentara hasta de 15°C a 25°C durante un periodo de 1 h a 24 h. Posteriormente se añadió acetato de etilo al matraz, seguido de disolución acuosa saturada de cloruro de amonio. Se separó la fase orgánica y se lavó con disolución acuosa saturada de cloruro de amonio seguido de disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio y se filtró. Se concentró el filtrado a de 35°C a 40°C hasta que se obtuvo un residuo sólido. Luego se añadió diclorometano al residuo y se mezcló a de 30°C a 35°C. Después de la evaporación, luego se añadió acetato de etilo al residuo, y se transfirió la suspensión a un recipiente adecuado. Luego se calentó la suspensión agitada hasta reflujo, y luego se enfrió hasta de 0°C a 5°C. Se recogió el sólido precipitado mediante filtración. Se lavó la torta de filtración con acetato de etilo seguido de terc-butil metil éter y se arrastró la torta de filtración hasta sequedad durante de 1 h a 24 h bajo nitrógeno para producir [1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-amiduro del ácido 3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carboxílico.
Etapa 3A: preparación de éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propílico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-3-metilbutírico
Figure imgf000038_0001
A un matraz con dimensiones adecuadas (recipiente A), se le añadieron Boc-L-valina (0,48 p), diclorometano y N,N-dimetilformamida y posteriormente se agitó la mezcla bajo nitrógeno a de 15°C a 25°C. Luego se añadieron 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 0,3 p) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI, 0,42 p) al recipiente mientras se mantenía la temperatura a de 15°C a 25°C. Posteriormente se agitó la mezcla a de 15°C a 25°C hasta que se disolvieron los sólidos a granel con el fin de producir la disolución A.
A un recipiente independiente (recipiente B), se le añadieron [1-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]amiduro del ácido 3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carboxílico (1,0 p), diclorometano y N,N-dimetilformamida, y posteriormente se agitó la mezcla a de 15°C a 25°C bajo nitrógeno. Luego se añadió 4-dimetilaminopiridina (0,27 p) al recipiente mientras se mantenía la temperatura entre 15°C y 25°C. Se agitó la mezcla a esta temperatura hasta que se disolvieron los sólidos a granel (normalmente de 5 a 15 minutos) para producir la disolución B.
Luego se añadió la disolución A a la disolución B mientras se mantenía la temperatura entre 15°C y 30°C. Se agitó la mezcla a esta temperatura hasta que se observó la completitud de la reacción. Se concentró la mezcla de reacción para eliminar los disolventes volátiles. Posteriormente se añadió acetato de etilo al matraz, seguido de disolución acuosa de ácido cítrico al 10% p/p. Se separó la fase acuosa y se extrajo con acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con una mezcla de disolución acuosa de ácido cítrico al 10% p/p y disolución acuosa saturada de cloruro de sodio, seguido de disolución acuosa saturada de cloruro de amonio, disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y disolución acuosa saturada de cloruro de sodio. Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtró, y se lavó la torta de filtración con acetato de etilo. Se concentraron los filtrados hasta que se obtuvo un residuo sólido para producir éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propílico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-3-metilbutírico en bruto.
Etapa 3B: purificación de éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propílico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-3-metilbutírico
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Para purificar el éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propílico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-3-metilbutírico, se mezclaron el producto en bruto (1 p) y diclorometano en un recipiente hasta que se disolvieron los sólidos a granel. Luego se cargó la disolución sobre sílice seguido de la adición de diclorometano. Se eluyó el producto con acetato de etilo:heptanos. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se concentraron hasta sequedad a vacío a una temperatura del baño de agua de 35°C a 40°C para producir el éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propílico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-3-metilbutírico purificado.
Etapa 4: preparación de metanosulfonato del éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico
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A un matraz con dimensiones adecuadas, se le añadió éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propílico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-3-metilbutírico (1 p), seguido de 1,4-dioxano, y se agitó la mezcla bajo nitrógeno. Posteriormente se añadió ácido metanosulfónico (0,18 p), y se calentó el contenido del matraz hasta de 68°C a 73°C. Se agitó la reacción a esta temperatura hasta que se observó la completitud de la reacción mediante análisis por 1H-RMN. Posteriormente se enfrió la mezcla de reacción hasta de 35°C a 40°C y se concentró hasta sequedad a esta temperatura. Luego se disolvió el residuo en THF y se concentró hasta sequedad a de 35°C a 40°C. Se repitió el ciclo de secado azeotrópico hasta que el contenido de 1,4-dioxano era inferior al 1,0% p/p para producir metanosulfonato del éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico.
Etapa 5: preparación de éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico (compuesto I)
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A un matraz con dimensiones adecuadas, se le añadió metanosulfonato del éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico (1 p), seguido de diclorometano. Posteriormente se permitió que el contenido del matraz se enfriara hasta de 5°C a 15°C. Se añadió disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio a la mezcla mientras se mantenía la temperatura entre 5°C y 25°C. Posteriormente se separaron las fases, y volvió a añadirse la fase orgánica al recipiente, seguido de disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio mientras se mantenía la temperatura a de 5°C a 25°C. Luego se separaron las fases acuosa y orgánica, y se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtró, y se lavó la torta de filtración con diclorometano. Luego se concentraron las fases orgánicas combinadas hasta sequedad a de 40°C a 45°C hasta que el contenido de diclorometano era < 2% p/p para producir éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico (compuesto I).
Etapa 6: preparación de clorhidrato del éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico (compuesto III)
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A un matraz con dimensiones adecuadas, se le añadió agua (1,66 vol), seguido de ácido clorhídrico (0,18 vol), y se ajustó la temperatura de la mezcla a de 15°C a 25°C. Luego se filtró la disolución, y se añadió la disolución filtrada a un matraz con dimensiones adecuadas (recipiente A), seguido de etanol y acetato de etilo. Se agitó la mezcla resultante bajo nitrógeno a de 15°C a 25°C durante al menos 5 minutos.
En un recipiente con dimensiones adecuadas (recipiente B), se añadió éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico (1 p), seguido de etanol. Posteriormente se mezcló el contenido del matraz para disolver los sólidos a granel y clarificar la disolución.
Luego se añadió la disolución del recipiente B al recipiente A mientras se mantenía la temperatura a de 15°C a 25°C. Se enfrió la mezcla agitada hasta de 0°C a 5°C y se agitó a esta temperatura durante de 50 a 70 minutos. Se recogió el sólido mediante filtración y se arrastró la torta de filtración hasta sequedad bajo nitrógeno durante al menos 12 horas para producir clorhidrato del éster 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-carbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)propílico del ácido 2-amino-3-metilbutírico en bruto.
Ejemplo 2. Propiedades farmacodinámicas del compuesto I y de las sales del mismo
Farmacología no clínica
El compuesto I y las sales del mismo se convierten rápidamente en el compuesto II tras la administración al tracto gastrointestinal. El compuesto II es un antagonista del receptor de prostaglandina F2a competitivo y reversible (receptor de FP2a humana, Ki=6 nM) que se encuentra en desarrollo para la gestión del parto prematuro mediante la inhibición de las contracciones uterinas prematuras. Se ha demostrado la farmacología de eficacia (efecto tocolítico) en un modelo de actividad uterina espontánea en ratas preñadas de término tardío.
Farmacología in vitro
Se evaluó la potencia de inhibición del compuesto I y del compuesto II sobre el receptor de prostaglandina F2a mediante el análisis de la afinidad de estos compuestos por el receptor de FP recombinante expresado en células HEK293-EBNA. Los resultados muestran una alta afinidad de unión del compuesto I y del compuesto II al receptor humano (véase la tabla 2).
Se sometió a prueba la selectividad del compuesto II contra los ocho subtipos de receptor de prostaglandina. La selectividad era aproximadamente 10 veces frente al receptor de prostaglandina E 2 (EP2) y mayor de 100 veces frente a otros receptores. Las pruebas del efecto de compuesto II 1 |iM frente a un panel de 50 receptores, canales y sitios de unión a enzimas mostraron una alta selectividad para FP.
Se realizó la caracterización funcional del compuesto II sobre FP humana en células HEK293-EBNA transfectadas. El compuesto II pudo inhibir de manera dependiente de la dosis la síntesis de IP3 con un valor de CI50 de 60 nM. Cuando se añadió solo a células FP/HEK293-EBNA, el compuesto II sometido a prueba hasta 10 |iM no indujo ninguna síntesis de IP3, lo que indica que el compuesto está desprovisto de actividad agonista.
Farmacología in vivo
Se investigaron los efectos tocolíticos del compuesto I y del compuesto II en un modelo de actividad uterina espontánea en ratas preñadas (19-21 días de gestación) anestesiadas de término tardío (Kawarabayashi et al. Am. J. Obstet. Gynecol. 175:1348-1355 (1996) y Shinkai et al. J. Pharm. Pharmacol. 52:1417-1423 (2000)). En resumen, se anestesiaron ratas preñadas de término tardío con uretano. Se expuso una trompa uterina preñada y se insertó en la luz un catéter de polietileno que portaba sobre la punta un globo de látex lleno de solución salina. Se conectó el catéter a un sistema de amplificación/registro a través de un transductor de presión. Se administraron por vía oral o se inyectaron mediante una infusión i.v. de 10 min dosis crecientes del compuesto I (como sal de mesilato) o del compuesto II. Para la administración i.v., se cuantificó la actividad contráctil uterina mediante el cálculo del AUC durante el periodo de inyección de 10 min.
Se calculó el porcentaje de variación de los valores de AUC en relación con la respuesta uterina espontánea observada después de cada administración de compuesto en comparación con el valor registrado antes de la primera administración de dosis (valor inicial). Se evaluó el efecto del compuesto I o del compuesto II mediante la comparación de los valores de presión uterina luminal antes y después del tratamiento. Para la administración oral, se aplicó el mismo procedimiento de computación en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento. Se determinaron las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento en cada punto de tiempo mediante el uso de ANOVA unilateral seguido de la prueba de Tukey. Ambos compuestos, administrados por vía intravenosa o por vía oral, pudieron reducir en gran medida las contracciones uterinas espontáneas en aproximadamente el 40-50% (efecto máximo obtenido a 30 mg/kg por vía i.v. y a 60 mg/kg por vía oral). La actividad intravenosa era comparable 0 ligeramente superior a la del fármaco tocolítico atosibán con licencia en la Unión Europea.
El efecto inhibidor tras la administración oral apareció con un inicio rápido (5-15 min después de la administración) y permaneció a un nivel sostenido hasta el final del periodo de observación de 3 h (figura 3).
Mediante una dosis oral única, se logra una inhibición significativa de las contracciones uterinas a 30 mg/kg.
Por tanto, los estudios de farmacología in vitro mostraron la alta afinidad del compuesto I y del compuesto II por el receptor de FP humano. Cuando se administran por vía intravenosa u oral, estos compuestos pudieron reducir en gran medida las contracciones uterinas espontáneas en aproximadamente el 40-50% cuando se investigaron en un modelo de actividad uterina espontánea en ratas preñadas (19-21 días de gestación) anestesiadas de término tardío.
Ejemplo 3. Examen de cristales de sales del compuesto I
Este ejemplo describe experimentos llevados a cabo para generar y caracterizar formas de sal cristalinas del compuesto I.
Sumario
Se determinó que la sal de mesilato del compuesto I era amorfa mediante XRPD. Los intentos de cristalizar el material no tuvieron éxito. Se sintetizó la base libre a partir de la sal de mesilato y se usó en la preparación de varias sales. Se obtuvo una sal de hidrosulfato cristalina directamente a partir de la síntesis de la sal. Se cristalizaron tres sales usando diferentes mezclas de disolventes y técnicas de cristalización: clorhidrato, fumarato y dihidrofosfato. Parecía que la sal de clorhidrato presentaba una baja higroscopicidad, una mayor estabilidad a una humedad relativa (Hr ) elevada y adoptaba una forma cristalina individual cuando cristalizaba a partir de varias condiciones experimentales distintas.
Se obtuvo la sal de HCI cristalina en dos experimentos de evaporación y un experimento en suspensión. Se observó el mismo patrón de XRPD en cada caso. Basándose en los datos términos, el material tenía algo de disolvente residual; un punto de fusión probable era de aproximadamente 146-147°C. Probablemente se produjo una descomposición parcial durante la fusión. La sal de clorhidrato no era higroscópica basándose en los datos del balance de humedad.
La sal de hidrosulfato cristalina probablemente estaba solvatada y se descomponía por encima de aproximadamente 100°C. El material era estable a humedades relativas de hasta aproximadamente el 65%.
Las sales de dihidrofosfato y fumarato cristalinas eran higroscópicas a una HR de aproximadamente el 65%. Los intentos de aumentar de escala las sales no tuvieron éxito debido a la alta humedad del laboratorio. Por tanto, sólo estaba disponible una caracterización parcial para estas sales.
Las sales de clorhidrato, hidrosulfato y fumarato mostraron solubilidades en agua comparables (por debajo de 1 mg/ml, véase la figura 8).
Parte experimental
Los análisis por difracción de rayos X de polvo descritos en el presente documento se llevaron a cabo en un difractómetro de rayos X de polvo XRD-6000 de Shimadzu usando radiación Cu Ka . El instrumento está equipado con un tubo de rayos X de foco fino largo. La tensión y el amperaje del tubo se establecieron en 40 kV y 40 mA, respectivamente. Las ranuras de divergencia y de dispersión se establecieron a 1° y la ranura de recepción se estableció a 0,15 mm. La radiación difractada se detectó mediante un detector de centelleo de Nal. Se usó un barrido continuo de theta-dos theta a 3°/min (paso de 0,4 s/0,02°) desde 2,5 hasta 40° 20. Se analizó un patrón de silicio cada día para comprobar la alineación del instrumento. Las muestras se analizaron con un soporte para muestras de silicio.
Los análisis por difracción de rayos X de polvo descritos en el presente documento también se realizaron en un difractómetro XRG-3000 de Inel, equipado con un detector sensible a la posición curvado con un intervalo de 20 de 120°. Se recogieron datos en tiempo real usando radiación Cu Ka comenzando a aproximadamente 4° 20 a una resolución de 0,03° 20. La tensión y el amperaje del tubo se establecieron en 40 kV y 30 mA, respectivamente. La ranura del monocromador se estableció a 5 mm por 160 pm. Los patrones se presentan desde 2,5 hasta 40° 20. Se prepararon muestras para su análisis empaquetándolas en capilares de vidrio de paredes delgadas. Se montó cada capilar sobre una cabeza de goniómetro que está motorizada para permitir el giro del capilar durante la adquisición de datos. Se analizaron las muestras durante 5 ó 10 min. La calibración del instrumento se realizó diariamente usando un patrón de referencia de silicio.
Los análisis por DSC descritos en el presente documento se llevaron a cabo en un calorímetro diferencial de barrido 2920 de TA Instruments. Se calibró el instrumento usando indio como material de referencia. Se colocaron las muestras en una bandeja para DSC de aluminio convencional, se fijó la bandeja y se registró el peso con precisión. Se equilibraron las muestras a 25°C y se calentaron bajo una purga de nitrógeno a una velocidad de 10°C/min hasta 350°C. Se usó el metal indio como patrón de calibración.
Los análisis por TG descritos en el presente documento se llevaron a cabo en un analizador termogravimétrico 2950 de TA Instruments. Los patrones de calibración fueron níquel y ALUMEL™. Se colocaron las muestras en una bandeja para muestras de aluminio y se insertaron en el horno de TG. En primer lugar se equilibraron las muestras a 25°C, luego se calentaron bajo una corriente de nitrógeno a una velocidad de calentamiento de 10°C/min hasta 350°C.
Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H en disolución descritos en el presente documento se adquirieron a temperatura ambiental con un espectrómetro UNITYINOVA-400 de Varian a una frecuencia de Larmor de 1H de 399,8 MHz. Se disolvieron las muestras en metanol-d4, cloruro de metileno-d2 o cloroformo-d3. Se adquirieron los espectros con un ancho de pulso de 1H de 7,8 ó 8,6 ps, un tiempo de adquisición de 2,50 segundos, un retardo entre barridos de 5 segundos, un ancho espectral de 4095 ó 6400 Hz con 20474 ó 32000 puntos de datos y 16 ó 40 barridos adicionales. Se procesó la descomposición por inducción libre (FID) usando el software VNMR 6.1 C de Varian con 65536 puntos y un factor de ensanchamiento de línea exponencial de 0,2 Hz para mejorar la relación señal/ruido. Los espectros se referenciaron al tetrametilsilano (TMS) interno a 0,0 ppm o al pico de disolvente residual.
Los espectros de FT-Raman descritos en el presente documento se adquirieron en un espectrómetro FT-Raman 960 ó 860 (Thermo Nicolet). Este espectrómetro usa una longitud de onda de excitación de 1064 nm. Se usó una potencia de láser de Nd:YVO4 de aproximadamente 0,5-0,7 W para irradiar las muestras. Los espectros de Raman se midieron con un detector de arseniuro de indio y galio (InGaAs). Las muestras se prepararon para su análisis colocando el material en un capilar de vidrio y luego en un soporte para capilares recubierto de oro en el accesorio. Se recogieron un total de 256 barridos de muestra desde 3600 hasta 100 cirr1 a una resolución espectral de 4 cm-1, usando apodización de Happ-Genzel. La calibración de longitudes de onda se realizó usando azufre y ciclohexano. Los datos de sorción/desorción de humedad (MB) se recogieron en un analizador de sorción de vapor SGA-100 de VTI. Los datos de sorción y desorción se recogieron a lo largo de un intervalo de humedad relativa (HR) del 5% al 95% a intervalos de HR del 10% bajo una purga de nitrógeno. Las muestras no se secaron antes de su análisis. Los criterios de equilibrio usados para el análisis fueron un cambio de peso menor del 0,0100% en 5 minutos, con un tiempo de equilibrado máximo de 3 horas si se satisfacía el criterio de peso. Los datos no se corrigieron con respecto al contenido de humedad inicial de las muestras. Se usaron NaCl y PVP como patrones de calibración. Preparación del compuesto I
Se realizaron múltiples intentos de generar la base libre del compuesto I a partir de la sal de mesilato, cuyos resultados se describen en la figura 4. Inicialmente, se usó un equivalente de hidróxido de sodio por equivalente de la sal. La RMN de protón indicó la presencia de picos del ácido metanosulfónico. Se logró una reacción completa cuando se mezclaron la sal de mesilato en cloruro de metileno y una disolución de NaOH en agua a una razón 1:2 de sal:base. Se separó la fase orgánica después de varios lavados y se evaporó. Se secó el material oleoso viscoso o similar a una pasta resultante a vacío para producir un sólido amorfo. Se abalizó la base libre mediante 1H-RMN y espectroscopia de Raman (figura 15 y figura 16, respectivamente). Estudios posteriores de examen de sales usaron la base libre como material de partida (resumidos en las figuras 5-7).
Examen de sales del compuesto I
Se prepararon doce sales del compuesto I. Se precipitó una sal de hidrosulfato cristalina mediante la adición de un exceso molar de aproximadamente 25 de ácido sulfúrico a una disolución de base libre en acetona. Las demás sales a partir de la etapa de síntesis parecía que no eran birrefringentes mediante microscopía ni amorfas mediante XRPD (figuras 5-7). Las sales de bencenosulfonato, citrato, etanosulfonato, clorhidrato, hidrosulfato y sulfato se analizaron mediante RMN de protón.
Los experimentos de cristalización sobre las sales del compuesto I se resumen en las figuras 5-7. Se cristalizaron las siguientes sales: clorhidrato, fumarato y dihidrofosfato.
Se cristalizó la sal de cloruro a partir de una mezcla 1:1 de acetona:tolueno, una mezcla de cloruro de metileno:etil éter y una suspensión en acetona. Se observó el mismo patrón de XRPD en todos los experimentos y se designó como forma A (figura 7). Se obtuvo la sal de fumarato cristalina a partir de evaporación lenta de una disolución 1:1 de metanol:tolueno. El patrón de rayos X se designó como patrón B. Las sales de hidrosulfato y dihidrofosfato presentaron patrones de XRPD muy similares (designados como patrón X). Los contraiones HSO4- y H2PO4- son similares en cuanto a tamaño y pequeños en comparación con la molécula de base libre, por tanto, son probables estructuras cristalinas similares para las sales de hidrosulfato y dihidrofosfato. Los intentos de cristalizar la sal de mesilato produjeron materiales sólidos viscosos o vítreos.
Caracterización de la base libre y de la sal de mesilato del compuesto I
El espectro de RMN de protón de la base libre mostró dos dobletes a aproximadamente 1 ppm correspondientes a los grupos metilo del fragmento de valina. Los grupos metilo se encuentran en el centro de carbono quiral y, por tanto, no son equivalentes en RMN de protón. Se observaron dos dobletes para los grupos metilo para las siguientes sales del compuesto I: besilato, citrato, esilato, hidrosulfato (más solapados) y sulfato (más solapados). En los espectros de 1H-RMN de la sal de mesilato y de la sal de cloruro, el doblete a ~ 1 ppm correspondiente a seis átomos de hidrógeno era el resultado de un solapamiento completo de dos dobletes de los grupos metilo (figura 13 y figura 21).
Un experimento de 1H-RMN de desacoplamiento homonuclear sobre la base libre confirmó el multiplete de hidrógenos del metino (CH) a aproximadamente 2 ppm (figura 18). En la parte inferior de la figura 18 se muestra un espectro de 1H-RMN de la base libre registrada en ausencia de irradiación previo de cualquier grupo metilo. La irradiación de cada grupo metilo (parte superior, parte central) dio como resultado un multiplete de metino simplificado con el mismo número de líneas (5). Si los dos dobletes correspondían a diferentes diastereoisómeros, se observarían dos tipos de multipletes, el original y el simplificado.
Caracterización de la sal de cloruro del compuesto I (compuesto III)
Se analizó la sal de cloruro cristalina mediante técnicas térmicas, 1H-RMN y análisis de sorción/desorción de humedad automatizado. La endoterma a aproximadamente 147°C en DSC parecía más ancha que lo que se observa normalmente para la endoterma de fusión. Se observó una pérdida de peso de aproximadamente el 4% desde 25 hasta 160°C (muestra de suspensión en acetona analizada, figura 20). La 1H-RMN de la sal de cloruro fue compatible con la estructura (figura 21). Sin embargo, los datos no pueden correlacionarse con la pérdida de peso en los análisis térmicos porque se analizó una muestra diferente (evaporación lenta de una mezcla 1:1 de acetona:tolueno). Se secó a vacío la sal de cloruro a partir de una suspensión en acetona a aproximadamente 50°C durante 1 día. La muestra resultante era similar a la sal original mediante XRPD (figura 22). Los datos términos se presentan en la figura 23. Basándose en la comparación de los datos térmicos, el material secado tenía menores pérdidas de peso entre 25 y 100°C (el 0,2% frente al 0,6% para la sal de cloruro original) y entre 100 y 160°C (el 2,5% frente al 3,5%) (figura 24). Esto indicó que se había eliminado algo de disolvente en el secado a vacío. Sin embargo, la endoterma a aproximadamente 146-147°C en DSC todavía era ancha (figura 25). Probablemente se produjo una descomposición parcial durante la fusión (obsérvese la degradación de la línea base y la pérdida de peso correspondiente en TG).
La sal de cloruro del compuesto I no se volvió líquida después de 2 días a una HR de aproximadamente el 95%. Los datos de sorción/desorción de humedad se resumen en la figura 27 y se presentan en las figuras 26 y 28. Se observó una pérdida de peso mínima en el equilibrado a una HR del 5%. Se produjo un aumento de peso de aproximadamente el 0,9% en la sorción a una humedad relativa de desde el 5 hasta el 95%. La muestra presentó una pérdida de peso de aproximadamente el 0,7% en la desorción. El análisis por XRPD de la muestra posterior a MB presentó un patrón de rayos X similar al del material de partida (figura 29).
Caracterización de las sales de hidrosulfato y sulfato del compuesto I
Se prepararon tanto la sal de hidrosulfato como la de sulfato del compuesto I. Se precipitó la sal de hidrosulfato a partir de una disolución en acetona de la base libre mediante la adición de un exceso molar de aproximadamente 25 de ácido sulfúrico. Se halló que el precipitado era cristalino mediante XRPD (figura 38). Los datos térmicos para la sal de hidrosulfato se proporcionan en la figura 32. Una endoterma ancha a aproximadamente 68°C correspondía a una pérdida de peso de aproximadamente el 1% y probablemente se debía a la desolvatación (deshidratación). La descomposición se producía a mayores temperaturas. No se volvió líquida después de 3 días a una HR de aproximadamente el 65% (figura 32). Se preparó la sal de sulfato usando dos equivalentes de la base libre por un equivalente del ácido. Los intentos de cristalizar la sal de sulfato del compuesto I no tuvieron éxito (figuras 5-7). Se analizaron las sales de hidrosulfato y sulfato mediante RMN de protón (figura 33 y figura 34). Se observaron diferencias en los espectros de RMN. Por ejemplo, parecía que los grupos metilo del fragmento de valina tenían un acoplamiento diferente.
Caracterización de la sal de dihidrofosfato del compuesto I
Se cristalizó la sal de dihidrofosfato a partir de una mezcla 1:1 de metil etil cetona:acetato de n-butilo (figuras 5-7). Presentaba un patrón de rayos X similar al de la sal de hidrosulfato (figura 43). La caracterización de la sal de dihidrofosfato se limitó a x Rp D debido a la pérdida de muestra durante el análisis. Los intentos de preparar cantidades adicionales de la sal cristalina no tuvieron éxito. Se generó un material de baja cristalinidad durante el primer intento (figuras 5-7). Una recristalización de la sal de baja cristalinidad produjo un sólido viscoso. El material permaneció viscoso después de haberse secado a vacío. La humedad del laboratorio era una HR de aproximadamente el 62% durante la cristalización de aumento de escala y probablemente afectó al material debido a su higroscopicidad. No se efectuaron más intentos de cristalizar la sal de dihidrofosfato.
Caracterización de la sal de fumarato del compuesto I
Se cristalizó una pequeña cantidad de la sal de fumarato a partir de una mezcla 1:1 de metanol:tolueno (figuras 5-7). Se llevaron a cabo intentos de aumentar de escala la sal cristalina a la humedad del laboratorio HR de aproximadamente el 62% y no tuvieron éxito. Se produjeron materiales mayormente oleosos, aunque estaba presente algún sólido cristalino mediante microscopía. El secado del sólido viscoso a vacío produjo un material mayormente amorfo. Se usó la sal cristalina preparada originalmente para los experimentos de siembra. Sin embargo, no se generaron materiales cristalinos. Se confirmó la naturaleza higroscópica de la sal de fumarato en estudios de humedad relativa.
Parecía que la sal de fumarato era sensible a la humedad. La sal cristalina era estable a humedades relativas de aproximadamente el 43 y el 53%, y comenzó a volverse líquida en el plazo del primer día a una HR de aproximadamente el 65%. Se formó un aceite amarillo después de 3 días a una HR del 65% (ganancia de humedad de aproximadamente el 4%).
Conclusiones
Se halló que la sal de mesilato del compuesto I era amorfa mediante XRPD. Los intentos de cristalizar el material no tuvieron éxito.
Se sintetizó la base libre del compuesto I a partir de la sal de mesilato y se usó en la preparación de 12 sales. Se obtuvo una sal de hidrosulfato cristalina directamente a partir de la síntesis de la sal. Se cristalizaron tres sales usando diferentes mezclas de disolventes y técnicas de cristalización: clorhidrato, fumarato y dihidrofosfato. Parecía que la sal de cloruro era el mejor candidato para su desarrollo posterior. La sal de hidrosulfato cristalina probablemente estaba solvatada y se descompuso por encima de aproximadamente 100°C. El material era estable a humedades relativas de hasta aproximadamente el 65%. Se obtuvo la sal de HCl cristalina en dos experimentos de evaporación y un experimento en suspensión. Se observó el mismo patrón de XRPD. Basándose en los datos térmicos, el material tenía algo de disolvente residual; un punto de fusión probable era de aproximadamente 146-147°C. Probablemente se produjo una descomposición parcial durante la fusión. La sal de cloruro no era higroscópica basándose en los datos del balance de humedad. Las sales de dihidrofosfato y fumarato cristalinas eran higroscópicas a una HR de aproximadamente el 65%. Los intentos de aumentar de escala las sales no tuvieron éxito debido a la alta humedad del laboratorio. Por tanto, sólo estaba disponible una caracterización parcial para estas sales.
Ejemplo 4. Monitorización de la permeabilidad de células Caco-2 de la sal de mesilato del compuesto I
La biodisponibilidad de los fármacos administrados por vía oral depende en gran medida de su capacidad de transporte a través de las barreras intestinales. Pueden usarse células Caco-2, derivadas de un adenocarcinoma de colon humano, establecidas por J. Fogh por su capacidad para lograr un mayor grado de diferenciación enterocítica, como modelo in vitro para la investigación del transporte de fármacos a través del epitelio intestinal. Estas células forman una monocapa de células epiteliales polarizadas cuando crecen sobre una membrana de policarbonato recubierta de colágeno. La monocapa de células diferenciadas representa un modelo relevante para el epitelio del intestino delgado. El proceso de diferenciación que comienza en la confluencia de células conduce a la formación de un límite en forma de cepillo con microvellosidades bien desarrolladas, uniones apicales estrechas y una distribución polarizada de los componentes de membrana, incluyendo enzimas, receptores, sistemas de transporte, canales iónicos y moléculas lipídicas.
El propósito del estudio era, en una primera etapa, evaluar la unión inespecífica del compuesto I en el sistema de prueba de células Caco-2 (sin células) y, en una segunda etapa, evaluar la conversión del compuesto I en el compuesto II y determinar si el transporte del compuesto I a través de las monocapas de células Caco-2 está mediado por la proteína transportadora PepT1.
Materiales
Se obtuvo la línea de células Caco-2 (células de adenocarcinoma de colon humano) a partir de bancos celulares controlados (Biosearch S.p.A, Gerenzano, Italia). Se adquirieron medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino, disolución de aminoácidos no esenciales, L-glutamina 200 mM, disolución de penicilina/estreptomicina, disolución de tripsina-EDTA sin calcio ni magnesio de Celbio (Milán, Italia). Se adquirieron HEPES, solución salina equilibrada de Hank (HBSS), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS), dimetilsulfóxido (DMSO), glicina-sarcosina (Gly-Sar) de Sigma (Milán, Italia).
Parte experimental
Se cultivaron las células Caco-2 en DMEM complementado con suero fetal bovino al 10%, L-glutamina 200 mM al 2% y disolución de aminoácidos no esenciales al 1%.
Se almacenaron las células congeladas en criotubos bajo nitrógeno líquido, como volúmenes de 1 ml de suspensión celular en suero fetal bovino que contenía DMSO al 10%. Las células usadas para los experimentos se mantendrán en cultivo durante no más de un mes.
Cuando sea necesario, se descongelarán rápidamente los viales congelados de células Caco-2 a 37°C en un baño de agua agitando suavemente hasta una descongelación semicompleta. Luego se añadió gota a gota la suspensión celular a 10 ml de medio de cultivo. Luego se centrifugó la suspensión celular durante 7 minutos a 900-1000 rpm, se retiró el sobrenadante y se reconstituyó el sedimento celular en el medio y se distribuyó en matraces de 75 cm2 que contenía medio. Se incubaron los matraces a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2. Se subcultivaron en serie las células cuando se obtuvieron monocapas casi confluentes. Se retiró el medio de cada matraz y se lavó la monocapa con 10-15 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS).
Se añadió disolución de tripsina-EDTA a la monocapa celular, se incubó a 37°C y se golpeó suavemente a intervalos para desunir las células. Se confirmó el desprendimiento y la disgregación completos de la monocapa celular mediante examen por microscopía. Luego se resuspendieron las células en 10 ml de medio completo y se centrifugaron durante 7 minutos a 900-1000 rpm. Se descartó el sobrenadante; se resuspendieron las células en medio de cultivo y se sembraron a 2,5*105 células/ml en matraces de 175 cm2.
Se desprendieron y disgregaron las células de los matraces de cultivos casi confluentes mediante el tratamiento con tripsina tal como se describió anteriormente. Se resuspendieron las células en medio de cultivo y se contaron. Se diluyó la suspensión celular con medio para dar aproximadamente 1*106 células/ml y se colocaron 300 pl de la suspensión celular sobre el compartimento apical de cada Transwell (6,5 mm de diámetro, 0,4 pm de tamaño de poro). Se colocaron 600 pl de medio de cultivo en el compartimento basolateral. Se incubaron las placas a 37°C en una atmósfera humidificada del 5% de CO2 en aire durante 15-21 días, cambiando el medio cada 48-72 horas. Se evaluó la integridad de cada monocapa de células Caco-2 mediante resistencia eléctrica transepitelial (TEER), tanto antes del experimento como al final del tiempo de incubación. La TEER, expresada como ohmios * cm2, se midió en los Transwell usando Millicell-ERS (Millipore). Se considera que la monocapa está bien diferenciada cuando el valor de TEER es mayor de 800 ohmios * cm2.
Se evaluó la integridad de cada monocapa de células Caco-2 al final del tiempo de incubación mediante amarillo Lucifer. Después del experimento, se lavaron los Transwell dos veces con tampón de transporte. Se distribuyeron 200 pl de amarillo Lucifer a la concentración de 100 pM en HBSS en el compartimento apical, mientras que se añadieron 400 pl de HBSS al compartimento basolateral. Se incubaron los Transwell a 37°C durante 1 hora. Se cuantificó la cantidad de amarillo Lucifer en el compartimento basolateral a una longitud de onda de 535 nm frente a una curva de calibración de amarillo Lucifer en la misma solución salina, usando un espectrofluorómetro de microplacas (EG & G WALLAC). Se considera que la monocapa no está dañada si se detecta <1% de amarillo Lucifer en el compartimento basolateral.
Evaluación de la unión inespecífica a Transwell libres de células
Se evaluaron la unión inespecífica y la recuperación en Transwell libres de células. Se sometió a prueba el compuesto I a 1,5, 3 y 6 pM en Transwell libres de células duplicados. Se realizó la prueba en un gradiente de pH entre los compartimentos apical y basolateral. El compartimento apical (donante) tenía un pH de tampón de 6,5 mientras que el compartimento basolateral (receptor) tenía un pH de tampón de 7,4. Se realizaron los siguientes tiempos de muestreo: 60 y 120 min para el compartimento basolateral (receptor) y 120 min para el compartimento apical (donante). Se analizaron las muestras obtenidas mediante CL-EM, se monitorizaron tanto el compuesto I como el compuesto II con el fin de evaluar el porcentaje de recuperación.
Evaluación de la estabilidad del compuesto I y del compuesto II
Se evaluó la estabilidad tanto del compuesto I como del compuesto II durante la prueba. Se disolvieron estos compuestos en tampón HBSS (concentración final de DMSO del 1%) a las concentraciones de 1,5, 3 y 6 pM. Se tomó una alícuota de cada disolución a tiempo cero (t=0) para evaluar las concentraciones iniciales de los compuestos. Se incubaron las disoluciones a 37°C durante la duración del experimento de transporte. Se tomó una alícuota de cada disolución al final del experimento (t=120) para evaluar las concentraciones finales del compuesto I y del compuesto II. Se analizaron las muestras mediante CL-EM.
Evaluación de la permeabilidad bidireccional del compuesto I
Se disolvió el compuesto I en tampón HBSS (concentración final de DMSO del 1%) a las concentraciones de 1,5, 3 y 6 pM. Se ejecutó cada concentración/tiempo de muestreo en pocillos duplicados. Se realizó la prueba en un gradiente de pH: el compartimento apical (mucoso) tenía pH 6,5, el compartimento basolateral (seroso) tenía pH 7,4. Transporte apical a basolateral (A^-B, mucoso a seroso): se añadieron 200 pl de cada concentración de compuesto I al compartimento apical y se añadieron 400 pl de HBSS al compartimento basolateral. Se incubaron las placas a 37°C. Se tomó una alícuota del compartimento basolateral después de 60 y 120 min (t=60 y t=120). Se tomó una alícuota del compartimento apical en el momento inicial (t=0) y después de 120 min. (t=120).
Transporte basolateral a apical (B^A, seroso a mucoso): se añadieron 400 pl de cada concentración de compuesto I al compartimento basolateral y se añadieron 200 pl de HBSS al compartimento apical. Se incubaron las placas a 37°C. Se tomó una alícuota del compartimento apical después de 60 y 120 min (t=60 y t=120). Se tomó una alícuota del compartimento basolateral en el momento inicial (t=0) y después de 120 min (t=120). Todas las muestras se analizaron mediante CL-EM monitorizando tanto el compuesto I como la aparición del compuesto II.
Evaluación de la permeabilidad bidireccional del compuesto II
Se disolvió el compuesto II en tampón HBSS (concentración final de DMSO del 1%) a las concentraciones de 1,5, 3 y 6 pM. Se ejecutó cada concentración/tiempo de muestreo en pocillos duplicados. Se realizó la prueba en un gradiente de pH: el compartimento apical (mucoso) tenía pH 6,5, el compartimento basolateral (seroso) tenía pH 7,4. Transporte apical a basolateral (A^-B, mucoso a seroso): se añadieron 200 pl de cada concentración de compuesto II al compartimento apical y se añadieron 400 pl de HBSS al compartimento basolateral. Se incubaron las placas a 37°C. Se tomó una alícuota del compartimento basolateral después de 60 y 120 min (t=60 y t=120). Se tomó una alícuota del compartimento apical en el momento inicial (t=0) y después de 120 min. (t=120).
Transporte basolateral a apical (B^A, seroso a mucoso): se añadieron 400 pl de cada concentración de compuesto II al compartimento basolateral y se añadieron 200 pl de HBSS al compartimento apical. Se incubaron las placas a 37°C. Se tomó una alícuota del compartimento apical después de 60 y 120 min (t=60 y t=120). Se tomó una alícuota del compartimento basolateral en el momento inicial (t=0) y después de 120 min (t=120). Todas las muestras se analizaron mediante CL-EM monitorizando el compuesto II.
Inhibición del transporte mucoso a seroso del compuesto I por el sustrato PepTI (Gly-Sar)
Se pretrataron las células diferenciadas durante 30 min con 10 mM de Gly-Sar con el fin de bloquear el transportador activo PepT 1.
Se disolvió el compuesto I en tampón HBSS (concentración final de DMSO del 1%) a las concentraciones de 1,5, 3 y 6 pM. Se ejecutó cada concentración/tiempo de muestreo en pocillos duplicados. Se realizó la prueba en un gradiente de pH: el compartimento apical (mucoso) tenía pH 6,5, el compartimento basolateral (seroso) tenía pH 7,4. Transporte apical a basolateral (A^-B, mucoso a seroso): se añadieron 200 pl de cada concentración de compuesto I al compartimento apical y se añadieron 400 pl de HBSS al compartimento basolateral. Se incubaron las placas a 37°C. Se tomó una alícuota del compartimento basolateral después de 60 y 120 min (t=60 y t=120). Se tomó una alícuota del compartimento apical en el momento inicial (t=0) y después de 120 min (t=120). Todas las muestras se analizaron mediante CL-EM monitorizando tanto el compuesto I como la aparición del compuesto II.
Determinaciones analíticas
Se determinaron las concentraciones de compuesto II y de compuesto I en las muestras posteriores a la incubación mediante un método de cromatografía de líquidos de alta resolución/espectrometría de masas (CL/EM) notificado en los anexos (sección 7.1) sin ninguna dilución adicional.
Resultados
Los valores de TEER previos a los experimentos de las monocapas de células Caco-2 usadas oscilaron entre 850 y 1160 Q x cm2, lo que indica una monocapa confluente con uniones estrechas. Al final de los experimentos, los valores de TEER disminuyeron en un promedio de 170 Q x cm2 (desde 680 hasta 990 Q x cm2) sin influencia de la integridad de la monocapa celular. La prueba de amarillo Lucifer confirmó la integridad de todas las monocapas posteriores a los experimentos, de hecho, la cantidad de amarillo Lucifer detectada en los compartimentos basolaterales posteriores a los experimentos fue siempre <1% en todos los pocilios. La figura 55 notifica los datos obtenidos en la prueba de unión inespecífica sobre el compuesto I. En las condiciones de prueba, el compuesto I demostró que se recuperaba en el compartimento apical a todas las dosis sometidas a prueba. No se detectó compuesto I en el compartimento basolateral a ninguna dosis sometida a prueba. Se excluyó la unión inespecífica del compuesto I. No se detectó compuesto II en ningún compartimento. La figura 55 notifica los datos obtenidos en la prueba de estabilidad sobre el compuesto I y el compuesto II. Ambos compuestos demostraron ser estables en las condiciones de prueba: tampón HBSS (concentración final de DMSO del 2%) a 37°C durante 60 y 120 minutos. Las figuras 56a-56e notifican los datos obtenidos en la prueba de permeabilidad bidireccional sobre el compuesto I. Este compuesto no pasó a través de la monocapa celular. En la prueba de apical a basolateral no se detectó compuesto I en el compartimento receptor después de 60 y 120 minutos, mientras que se detectaron concentraciones crecientes de compuesto II al final del experimento en el compartimento basolateral. En la tabla se notifica el porcentaje de pase del compuesto II. Al final del experimento apical a basolateral, en el compartimento apical se observó una baja recuperación del compuesto I, mientras que se detectaron concentraciones aumentadas del compuesto II (alta recuperación). La concentración aumentada del compuesto II después de 120 min en el compartimento apical pudo explicarse por la presencia de esterasas extracelulares e intracelulares en la célula Caco-2 que pueden desesterificar los compuestos (Kern et al. J. Agric. Food Chem. 51: 7884-7891 (2003)). En la prueba de basolateral a apical no se detectó compuesto I en el compartimento receptor, mientras que se detectaron bajas concentraciones del compuesto II. Por tanto, es probable que el compuesto I se transfiera y transporte como compuesto II a través de la monocapa de células Caco-2. Las figuras 57a-57e notifican los datos obtenidos en la prueba de permeabilidad bidireccional sobre el compuesto II. Este compuesto mostró un buen porcentaje de pase apical a basolateral y una baja tasa de permeabilidad desde compartimento el basolateral al apical. Se calculó Papp porque se conocía la concentración en los compartimentos donantes. El compuesto II tiene un buen pase pasivo a través de la monocapa de células Caco-2. No se detectó eflujo. Las figuras 58a-58c notifican los datos obtenidos en la prueba de inhibición, en la que la monocapa de células Caco-2 se pretrató con Gly-Sar 10 mM (con el fin de saturar el transportador PepT1). No se detectó compuesto I en el compartimento receptor, mientras que se observó un pase del compuesto II. El porcentaje de pase no era lineal en esta prueba.
Discusión
En este estudio se evaluó la unión inespecífica del compuesto I en el sistema de prueba de células Caco-2 (sin células) y se excluyó. El compuesto I era estable en las condiciones de prueba. Se evaluó la conversión del compuesto I en el compuesto II y se confirmó en la prueba de permeabilidad bidireccional. El compuesto I no pasó a través de la monocapa celular en las condiciones sometidas a prueba. Por tanto, es probable que el compuesto I se transfiera y transporte como compuesto II desesterificado a través de la monocapa de células Caco-2.
En la prueba de permeabilidad bidireccional, el compuesto II mostró un buen pase pasivo a través de la monocapa de células Caco-2. No se hallaron evidencias de que el compuesto II pueda ser un sustrato para un transportador de eflujo.
La prueba con pretratamiento con Gly-Sar (con el fin de saturar el transportador PepT1) no mostró ningún pase del compuesto I y una tasa de pase del compuesto II. Es probable que el transporte del compuesto I a través de la monocapa de células Caco-2s no esté mediado por PepT1.
Estos experimentos indican que la absorción intestinal del compuesto I y de las sales del mismo no está mediado por la proteína transportadora Pept1. En cambio, los resultados anteriores demuestran que el compuesto I se desesterifica mediante las esterasas ambientales en el intestino delgado y posteriormente penetra de forma pasiva en el epitelio del intestino delgado. Que el compuesto I y las sales del mismo no sean sustratos para Pept1 representa una propiedad sorprendente y farmacológicamente beneficiosa. Pept1 es un cotransportador dependiente del pH que se sabe que media en la absorción de varios ésteres valinato, tal como se describe, por ejemplo, en Vig et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 65:1370-1385 (2013). Pept1 presenta una amplia especificidad de sustratos, tal como se evidencia por la diversidad estructural de los compuestos que transporta esta proteína a través del epitelio intestinal. Inesperadamente, a pesar de la presencia de la funcionalidad éster valinato, el compuesto I y las sales del mismo no dependen de este transportador para la absorción a través del epitelio del intestino delgado. Esta es una propiedad ventajosa, ya que, por tanto, el compuesto I y las sales del mismo no compiten con los sustratos naturales de Pept1, tales como nutrientes peptídicos, por la unión a esta proteína y su transporte. Más bien, el compuesto I y las sales del mismo se convierten in vivo en una forma que se absorbe fácilmente de una manera independiente de la energía y del gradiente local de protones. Esta propiedad inesperada, junto con la alta solubilidad en agua del compuesto I y de las sales del mismo, proporcionan en conjunto un perfil farmacocinético beneficioso mediante el cual estos productos terapéuticos se disuelven fácilmente en un entorno acuoso y, a su vez, se convierten en una forma que puede realizar una absorción independiente del transportador. Ejemplo 5. Terapia de combinación que incluye un agente tocolítico adicional
El compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, se administra a un sujeto, tal como un sujeto humano, en combinación con uno o más agentes adicionales, concretamente con un agente tocolítico adicional tal como un antagonista del receptor de oxitocina, un betamimético, un inhibidor de los canales de calcio, una sal de magnesio o un donador de óxido nítrico, por ejemplo, con el fin de reducir el inicio de las contracciones uterinas y retrasar el inicio del parto.
Un médico experto en la técnica puede administrar el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, simultáneamente con, como mezcla con o por separado de un antagonista del receptor de oxitocina. Los antagonistas del receptor de oxitocina a modo de ejemplo para su uso junto con las composiciones y los métodos de la invención incluyen atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán y nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado de los mismos. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse antes de, después de o simultáneamente con nolasibán, o una variante, una formulación, una forma cristalina o un derivado del mismo, con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
Además, un médico experto en la técnica puede administrar el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, simultáneamente con, como mezcla con o por separado de un betamimético, tal como un betamimético descrito en el presente documento. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse antes de, después de o simultáneamente con un betamimético descrito en el presente documento o conocido en la técnica con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
Además, un médico experto en la técnica puede administrar el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, simultáneamente con, como mezcla con o por separado de un inhibidor de los canales de calcio, tal como un inhibidor de los canales de calcio descrito en el presente documento. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse antes de, después de o simultáneamente con un inhibidor de los canales de calcio descrito en el presente documento o conocido en la técnica con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
Además, un médico experto en la técnica puede administrar el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, simultáneamente con, como mezcla con o por separado de una sal de magnesio, tal como sulfato de magnesio. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse antes de, después de o simultáneamente con sulfato de magnesio con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
Además, un médico experto en la técnica puede administrar el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, simultáneamente con, como mezcla con o por separado de un donador de óxido nítrico, tal como nitroglicerina. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse antes de, después de o simultáneamente con nitroglicerina con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
Además, un médico experto en la técnica puede administrar el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, simultáneamente con, como mezcla con o por separado de progesterona o un derivado o una variante de la misma, tal como un derivado o una variante descritos en el presente documento o conocidos en la técnica. Por ejemplo, el compuesto I o una sal del mismo, tal como el compuesto III, puede administrarse antes de, después de o simultáneamente con progesterona o una variante o un derivado de la misma descrito en el presente documento o conocido en la técnica con el fin de retrasar el inicio del parto en un sujeto, por ejemplo, en uno o más días o semanas, tal como desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 16 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 semanas).
Ejemplo 6. Efectos tocolíticos del compuesto I y de sales farmacéuticamente aceptables del mismo en combinación con nifedipina y atosibán en modelos murinos de parto prematuro
Para investigar los efectos terapéuticos del compuesto I en combinación con un bloqueador de los canales de calcio o con un antagonista del receptor de oxitocina en modelos animales de parto prematuro, se trataron ratonas CD-1 preñadas primigestas con inductores del parto establecidos a una edad gestacional temprana de 17 días y posteriormente se les administraron diversas dosificaciones de la sal de cloruro del compuesto I (compuesto III;
10 mg/kg, 30 mg/kg o 100 mg/kg, cada una administrada por vía oral) sola o en combinación con nifedipina (5 mg/kg, administrada por vía oral) o atosibán (300 mg/kg, administrado por vía subcutánea). Se evaluaron los efectos tocolíticos midiendo el tiempo desde la inducción hasta el parto de la primera cría para cada ratón en las cohortes de tratamiento y de control, el tiempo desde la inducción hasta la finalización del parto entre todos los ratones en cada cohorte y la viabilidad de la camada entre ratones en cada cohorte. Los inductores del parto prematuro usados en este estudio fueron RU486 (también denominado mifepristona), una antiprogestina esteroidea que fomenta la dilatación del cuello uterino y provoca una mayor contractilidad uterina y sensibilidad a prostaglandinas, y lipopolisacárido (LPS), un mediador de la inflamación.
Para inducir el parto a una edad gestacional temprana, se administró una dosis única de RU486 a cada ratón por vía subcutánea a 2,5 mg/kg (t=0). Los ratones tratados con LPS recibieron una inyección intraperitoneal única de LPS a 2 mg/kg (t=0). Se administró atosibán a los ratones CD-1 mediante inyección subcutánea a 300 mg/kg en dos sitios distintos. Se realizaron estas inyecciones a las 5 horas (t=5) y a las 29 horas (t=29) tras el tratamiento con el agente inductor RU486 o LPS. Se administró nifedipina a los ratones CD-1 por vía oral a 5 mg/kg a las 5 horas (t=5), a las 19 horas (t=19), a las 29 horas (t=29) y a las 43 horas (t=43) tras el tratamiento con el agente inductor RU486 o LPS. Se administró el compuesto III a los ratones CD-1 por vía oral a 10 mg/kg, 30 mg/kg o 100 mg/kg a las 5 horas (t=5), a las 19 horas (t=19), a las 29 horas (t=29) y a las 43 horas (t=43) tras el tratamiento con el agente inductor RU486 o LPS. Tras la inducción con RU486 o LPS y la posterior administración de atosibán, de nifedipina y/o del compuesto III, se sometieron las cohortes de ratones a monitorización visual continua para evaluar el tiempo transcurrido entre la inducción y el parto de la primera cría para cada ratón, así como la proporción de ratones en cada cohorte que había experimentado el parto en función del tiempo. Se evaluó la viabilidad de las crías paridas en cada cohorte mediante docimasia pulmonar hidrostática galénica.
Se confirmó la capacidad de RU486 y LPS de inducir el parto prematuro, ya que el tratamiento de ratones CD-1 con RU486 a una edad gestacional de 17 días dio como resultado un tiempo medio hasta el parto de aproximadamente 21 horas tras la inducción (t=21; media calculada=21 ± 1,00 horas), mientras que los ratones CD-1 tratados con LPS a una edad gestacional de 17 días presentaron un tiempo medio hasta el parto de aproximadamente 26 horas tras la inducción (t=26; media calculada=26 ± 2,34 horas). En cambio, el parto a término en ratones CD-1 se produjo a una edad gestacional de desde aproximadamente 19 días hasta aproximadamente 21 días, más de 50 horas después del día 17 de gestación. Entre las crías paridas a partir de ratones tratados con RU486, 96% se parieron vivas y el 48% de las crías paridas por ratones tratados con LPS se parieron vivas (figuras 60 y 61). Se excluyó al 3% de los ratones tratados con RU486 de esta investigación debido a muerte o eutanasia durante el estudio; se excluyó al 34% de los ratones tratados con LPS de esta investigación debido a muerte o eutanasia durante el estudio.
Durante la investigación, se observó que el tratamiento con nifedipina sola indujo un aumento significativo en el tiempo medio hasta el parto en comparación con el vehículo (23,53 ± 0,99 horas frente a 21,19 ± 1,00 horas; figura 65) en ratones tratados con RU486. El tratamiento con nifedipina sola fomentó además un aumento en el tiempo hasta el parto y aumentó significativamente la viabilidad fraccionaria de la camada en ratones tratados con LPS en comparación con el vehículo (el 90,39% ± 5,34% frente al 48,20% ± 16,45%; figuras 68 y 69). De manera similar, la administración de atosibán dio como resultado un aumento en el tiempo hasta el parto en ratones tratados con LPS (figura 70).
Se halló que el compuesto III fomentaba un aumento en el tiempo hasta el parto en comparación con el vehículo en ratones tratados con RU486 (figuras 65 y 67). Particularmente, los ratones tratados con RU486 a los que se les administró por vía oral el compuesto III a 30 mg/kg y 100 mg/kg presentaron aumentos en el tiempo hasta el parto en relación con el vehículo (p=0,0871 y p=0,0601, respectivamente). Además, la administración del compuesto III a ratones tratados con LPS dio como resultado un aumento dependiente de la dosis en la viabilidad fraccionaria de la camada (viabilidad del 69,41% ± 15,76% observada en respuesta a 100 mg/kg de compuesto III frente al 48,20% ± 16,45% observada en respuesta al vehículo; figura 68).
La combinación de nifedipina y del compuesto III dio como resultado un efecto tocolítico particularmente notable (figuras 65 y 69). La administración oral de nifedipina (5 mg/kg) y del compuesto III (100 mg/kg) a ratones tratados con RU486 dio como resultado un efecto sinérgico evidente, ya que esta combinación indujo un aumento significativo en el tiempo hasta el parto en relación con el vehículo (27,91 ± 0,35 horas frente a 21,19 ± 1,00 horas), la misma dosificación de nifedipina sola (27,91 ± 0,35 horas frente a 23,53 ± 0,99 horas) y la misma dosificación de compuesto III solo (27,91 ± 0,35 horas frente a 23,70 ± 0,60 horas). Además, la administración oral de nifedipina (5 mg/kg) y del compuesto III (10 mg/kg) a ratones tratados con LPS dio como resultado un aumento significativo en el tiempo hasta el parto en relación con la cohorte tratada con 10 mg/kg de compuesto III solo (31,01 ± 1,89 horas frente a 23,98 ± 0,66 horas). La administración oral de 10 mg/kg de compuesto III en combinación con 5 mg/kg de nifedipina también fomentó un aumento en la viabilidad de la crías paridas por ratones tratados con LPS en relación con los ratones a los que se les administró la misma dosificación de compuesto III solo (el 94,23% ± 3,68% frente al 57,90% ± 14,89%) y en relación con los ratones a los que se les administró vehículo solo (el 94,23% ± 3,68% frente al 48,20% ± 16,45%; figura 68).
La combinación de atosibán y del compuesto III potenció adicionalmente el efecto tocolítico de cada compuesto usado solo. La administración subcutánea de atosibán (300 mg/kg) y la administración oral del compuesto III (100 mg/kg) a ratones tratados con LPS indujeron un aumento significativo en el tiempo hasta el parto en relación con los ratones a los que se les administró vehículo solo (33,23 ± 2,95 horas frente a 26,17 ± 1,98 horas) y en relación con los ratones a los que se les administró la misma dosificación de atosibán solo (33,23 ± 2,95 horas frente a 28,41 ± 2,99 horas; figura 71). Esta combinación también presentaba una propensión a aumentar la viabilidad fraccionaria de la camada en comparación con los ratones tratados con vehículo solo, la misma dosificación de atosibán solo o la misma dosificación de compuesto III solo (figura 70).
Este estudio ilustra además el efecto tocolítico de una sal del compuesto I antagonista de FP en dos modelos animales de parto prematuro distintos y respalda el uso del compuesto I y de las sales del mismo para tratar y prevenir el parto prematuro independientemente de la etiología bioquímica subyacente. Esta investigación respalda además el uso de antagonistas de FP, tales como el compuesto I y las sales del mismo (por ejemplo, el compuesto III), en combinación con cada uno de un antagonista de los canales de calcio y un antagonista del receptor de oxitocina para la prevención del nacimiento prematuro. El uso del compuesto III en combinación con cada uno de nifedipina y atosibán superó significativamente los efectos terapéuticos de los componentes individuales, y demuestra que el compuesto I y las sales del mismo, tales como el compuesto III, pueden sinergizar con agentes tocolíticos adicionales.
Ejemplo 7. Efectos tocolíticos del compuesto II en combinación con nifedipina, atosibán y nolasibán en muestras de tejido humano
Para investigar los efectos terapéuticos del compuesto II, el metabolito activo del compuesto I y de las sales del mismo (tal como el compuesto III), en combinación con antagonistas del receptor de oxitocina y bloqueadores de los canales de calcio, se obtuvieron biopsias miometriales de mujeres previas al parto a término que se someten a parto por cesárea. Entre los objetivos de esta investigación estaba caracterizar los efectos del compuesto II, solo y en combinación con agentes tocolíticos adicionales, sobre la frecuencia, la amplitud máxima y la duración de las contracciones miometriales, así como sobre el trabajo realizado por contracción y el trabajo total realizado por todas las contracciones. Para este fin, los experimentos se realizaron usando un dispositivo DMT Myograph 800 MS (ADINSTRUMENTS™) en solución de Krebs oxigenada con el software ADI Powerlab, lo que facilitó la medición simultánea de múltiples preparaciones musculares en paralelo.
Los experimentos en biopsias miometriales se iniciaron permitiendo contracciones de músculo liso para establecer un valor inicial durante al menos 20 minutos. Tras este periodo de tiempo, se registraron mediciones de nivel inicial de la frecuencia de contracciones espontáneas, la amplitud máxima, la duración, el trabajo realizado por contracción y el trabajo total realizado por todas las contracciones. Posteriormente se trataron las muestras de biopsias miometriales con un control de DMSO, compuesto II, atosibán, nifedipina, una combinación de compuesto II y atosibán o una combinación de compuesto II y nifedipina. Posteriormente se midieron los efectos de estos agentes sobre la frecuencia, la amplitud y la duración de, así como el trabajo realizado por, las contracciones miometriales a lo largo del siguiente periodo de 10 minutos. Luego se expusieron las muestras miometriales mediante la adición de concentraciones crecientes de un agente estimulador de las contracciones, tal como oxitocina, PGF2a o PGE2, a lo largo del transcurso de intervalos secuenciales de 10 minutos, y se midieron la frecuencia de las contracciones, la amplitud máxima, la duración, el trabajo realizado por contracción y el trabajo total realizado por todas las contracciones por consiguiente. Cada una de oxitocina, PGF2a y PGE representan distintos moduladores de la contractilidad uterina y del parto prematuro. La oxitocina induce directamente la contracción del miometrio uterino y potencia la síntesis y la liberación de prostaglandinas contráctiles a partir del endometrio uterino y de la membrana caduca. La oxitocina también se ha implicado en fomentar la producción de prostaglandinas en células miometriales humanas a través de la potenciación de la ciclooxigenasa 2 (COX-2). Se ha demostrado que las prostaglandinas PGF2a y PGE2 inducen cambios cervicales y provocan la contractilidad uterina, dos acontecimientos clave en la fisiología del periodo de dilatación y del parto. La activación del receptor de FP en el miometrio humano por PGF2a da como resultado la elevación de la concentración de calcio intracelular, que, a su vez, conduce a la contracción del músculo liso uterino. Por tanto, otro objetivo de esta investigación era evaluar la capacidad del compuesto II para atenuar la actividad contráctil uterina que se induce por tres modalidades bioquímicas distintas.
Los resultados de estos experimentos demuestras que el compuesto II solo puede suprimir la contractilidad miometrial inducida tanto por PGF2a como por OT de manera dependiente de la dosis (figuras 72 y 73). Además, actualmente se ha descubierto que el compuesto II presenta un sorprendente efecto sinérgico sobre la reducción de la contractilidad miometrial cuando se usa en combinación con el antagonista del receptor de oxitocina atosibán (figura 76) y el bloqueador de los canales de calcio nifedipina (figura 78). Sorprendentemente, dosis de compuesto II que presentaron una menor potencia hacia la reducción de la contractilidad miometrial cuando se usaron en ausencia de un agente tocolítico adicional (tales como 60 nM, figuras 72 y 73) presentaron un sorprendente aumento en la actividad inhibidora cuando se combinaron con atosibán (figura 76) y nifedipina (figura 78). De manera similar, dosis de atosibán (6 nM, figuras 74 y 75) y nifedipina (6 nM, figura 77) que se halló que estaban por debajo de la óptima hacia la reducción de la contractilidad miometrial cuando se usaron en ausencia de compuesto II presentaron un inesperado aumento en la potencia anticontráctil cuando se combinaron con el compuesto II (figuras 76 y 78). Estos datos demuestran que el compuesto II puede sinergizar con agentes tocolíticos adicionales, tales como antagonistas del receptor de oxitocina y bloqueadores de los canales de calcio, para suprimir la actividad contráctil uterina que puede conducir al parto prematuro.
Además de suprimir la contractilidad miometrial, los efectos tocolíticos del compuesto II también se manifiestan en la capacidad de este agente para atenuar la expresión de genes proinflamatorios aguas abajo en biopsias miometriales y del amnios humanas (figuras 79 y 80). Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western con el fin de caracterizar la capacidad del compuesto II, solo y en combinación con agentes tocolíticos adicionales, para modular la expresión de diversas proteínas en muestras miometriales y del amnios aisladas de mujeres previas al parto a término que se someten a parto por cesárea. Los resultados de estos estudios demuestran que el compuesto II puede reducir la expresión de diversas proteínas proinflamatorias, y presenta una sorprendente sinergia cuando se usa en combinación con nolasibán hacia la reducción de la expresión de COX-2.
En conjunto, los datos generados a partir de estos experimentos demuestran que el compuesto II puede suprimir la actividad del músculo liso que puede conducir al parto prematuro que se induce por distintos moduladores de la contractilidad uterina. Además, el compuesto II presenta un inesperado efecto sinérgico sobre la atenuación de las contracciones uterinas cuando se usa en combinación con antagonistas del receptor de oxitocina y bloqueadores de los canales de calcio. Esta sinergia se manifiesta tanto a nivel de actividad del músculo liso como en la reducción de la expresión de genes proinflamatorios en biopsias miometriales y del amnios, y demuestra diversos beneficios de proporcionar el compuesto II en combinación con uno o más agentes tocolíticos adicionales a un sujeto que necesita tratamiento, tal como un sujeto que experimenta o está en riesgo de experimentar parto prematuro.

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Compuesto representado por la fórmula (I)
    Figure imgf000052_0001
    o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la prevención del parto prematuro en una paciente humana, en el que el compuesto se administra a la paciente con un agente tocolítico adicional.
  2. 2. Compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que el agente tocolítico adicional es un antagonista del receptor de oxitocina.
  3. 3. Compuesto para su uso según la reivindicación 2, en el que el antagonista del receptor de oxitocina es atosibán, retosibán, barusibán, epelsibán o nolasibán.
  4. 4. Compuesto para su uso según la reivindicación 3, en el que el antagonista del receptor de oxitocina es atosibán.
  5. 5. Compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que el agente tocolítico adicional es un inhibidor de los canales de calcio.
  6. 6. Compuesto para su uso según la reivindicación 5, en el que el inhibidor de los canales de calcio es nifedipina o nicardipina.
  7. 7. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el compuesto y el agente tocolítico adicional se administran a la paciente con un betamimético, una sal de magnesio, un donador de óxido nítrico, progesterona o caproato de 17-a-hidroxiprogesterona o un corticosteroide.
  8. 8. Compuesto para su uso según la reivindicación 7, en el que el compuesto y el agente tocolítico adicional se administran a la paciente con un betamimético seleccionado del grupo que consiste en terbutalina, ritodrina, hexoprenalina, albuterol, fenoterol, nilidrina y orciprenalina.
  9. 9. Compuesto para su uso según la reivindicación 7, en el que el compuesto y el agente tocolítico adicional se administran a la paciente con sulfato de magnesio.
  10. 10. Compuesto para su uso según la reivindicación 7, en el que el compuesto y el agente tocolítico adicional se administran a la paciente con nitroglicerina.
  11. 11. Compuesto para su uso según la reivindicación 7, en el que el compuesto y el agente tocolítico adicional se administran a la paciente con un corticosteroide seleccionado del grupo que consiste en betametasona, dexametasona e hidrocortisona.
  12. 12. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el compuesto está representado por la fórmula (III)
    Figure imgf000053_0001
  13. 13. Compuesto para su uso según la reivindicación 12, en el que el compuesto está en un estado cristalino.
  14. 14. Compuesto para su uso según la reivindicación 13, en el que el compuesto presenta picos de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H centrados en 1,1 ppm, 3,3 ppm, 4,9 ppm, 5,4 ppm, 7,1 ppm, 7,7 ppm, 7,9 ppm y 8,0 ppm.
  15. 15. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el compuesto se administra por vía oral a la paciente.
  16. 16. Compuesto para su uso según la reivindicación 15, en el que el compuesto se formula como comprimido, cápsula, cápsula de gelatina, polvo, disolución líquida o suspensión líquida.
  17. 17. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la paciente se caracteriza por una edad gestacional de desde 24 semanas hasta 34 semanas.
  18. 18. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que el compuesto está presente dentro de una composición farmacéutica que comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
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