ES2913483T3 - Formulaciones estabilizadas de polisulfato de pentosano (PPS) - Google Patents

Abstract

Una formulación líquida que comprende polisulfato de pentosano (PPS) a una concentración de 25 mg/mL a 500 mg/mL y un antioxidante que se selecciona del grupo que consiste en metabisulfito de sodio y bisulfito de sodio a una concentración de 0,02 % p/v a 5 % p/v de la formulación, en donde la formulación es estable sin refrigeración en una solución que tiene un pH en el intervalo de 4 a 8.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones estabilizadas de polisulfato de pentosano (PPS)

Campo de la invención

La presente invención se dirige a formulaciones de polisulfato de pentosano (PPS). Más particularmente, la presente invención se dirige a diversas formulaciones de PPS que tienen una resistencia mejorada a la degradación y decoloración y una estabilidad mejorada, incluso después de la esterilización. La presente invención también se dirige a métodos para usar estas formulaciones como un anticoagulante y/o para tratar la artritis y otras afecciones, tales como la cistitis intersticial, en mamíferos.

Técnica relacionada

El polisulfato de pentosano (PPS) es un oligosacárido polisulfatado semisintético que comprende una mezcla de polisacáridos aniónicos de carga múltiple. El PPS se produce por sulfatación química de polisacáridos (por ejemplo, xilano) que se obtienen de plantas leñosas, por ejemplo, árboles de haya. El producto resultante típicamente contiene aproximadamente de 15-17 % de azufre en la forma de aproximadamente 1,5-1,9 grupos sulfato unidos covalentemente por residuo de azúcar en una mezcla de moléculas poliméricas polidispersas que se estima que tienen aproximadamente de 4000-10000 de peso molecular. El PPS consiste en polisacáridos lineales sulfatados de aproximadamente 12 a 30 unidades de ¿eta-D-xilopiranosa 1-4 conjugadas (Mr = aproximadamente 4000 -aproximadamente 10000), los cuales tienen un ácido D-glucónico en aproximadamente cada décima unidad. El PPS típicamente se fabrica semisintéticamente a partir de sustancias fitogénicas o se puede obtener a partir de microorganismos.

El PPS se usa más comúnmente como una formulación oral para tratar la cistitis intersticial en humanos y como un fármaco inyectable para tratar la osteoartritis en animales de compañía (Fuller, Ghosh y otros, "Plasma and synovial fluid concentrations of calcium pentosan polysulfate achieved in the horse following intramuscular injection", Equine Veterinary Journal (2002)). El compuesto PPS también puede usarse como un anticoagulante, para prevenir la formación de coágulos de sangre. También se ha usado para el tratamiento de hematomas, hemorroides, sabañones, quemaduras, y enfermedades multiparamétricas tal como la trombosis y la ateroesclerosis. El documento US 6,828,309 describe el uso de formulaciones líquidas que comprenden PPS para tratar ciertas afecciones de la próstata, tales como hiperplasia prostática benigna, prostatitis crónica, prostadinia, y afecciones vesicales irritativas.

Si bien los usos del PPS se vuelven más difundidos, persiste un problema fundamental en el desarrollo de un producto que no se degrade o decolore bajo ciertas condiciones de uso, y que pueda usarse bajo una variedad de condiciones. Las formulaciones inyectables de PPS tienden a degradarse y decolorarse con el tiempo, lo que limita su vida útil. Además, se ha observado que algunas formulaciones de PPS se vuelven de color marrón con el tiempo. Adicionalmente, los métodos de caracterización habituales para definir las formulaciones de PPS, los cuales son un elemento importante en el control de calidad, generalmente se consideran inadecuados. Por lo tanto, en la actualidad no permanece claro qué características específicas de las formulaciones de PPS en realidad se relacionan con la estabilidad y la efectividad clínica.

La naturaleza polidispersa del PPS requiere un método de control de calidad que detecte las variaciones en la composición que se relacionan con el tamaño, el grado de sulfatación, o la degradación parcial. Los métodos estándar de análisis, tales como la cromatografía de capa fina, la cromatografía de exclusión por tamaño (Maffrand, Herbert, y otros, "Experimental and Clinical Pharmacology of Pentosan Polysulfate", Seminars in Thrombosis and Hemostatis, Volumen 17, Suplemento 2, 1991), o la espectroscopia no han demostrado resolver estas cuestiones. La cromatografía en gel se ha usado exitosamente para probar la presencia de sulfato de sodio y acetato de sodio. Sin embargo, los inconvenientes de este método incluyen largos tiempos de análisis y poca eficiencia en la separación de la composición en sus partes componentes.

Se ha usado el análisis por electroforesis capilar (CE) para generar un perfil de picos que parece ser capaz de distinguir un intervalo de moléculas de PPS, que incluye los oligosacáridos que difieren al menos en tamaño (Degenhardt, Benend y otros, "Quality control of pentosane polysulfate by capillary zone electrophoresis using indirect detection", Journal of Chromatography A 817 (1998));Degenhardt, Ghosh y otros, "Studies on the Structural Variations of Pentosan Polysulfate Sodium (NaPPS) from Different Sources by Capillary Electrophoresis", Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. (2001)). Un problema experimentado con el método de CE radica en la reproducibilidad de los tiempos de migración de los picos. Este problema se ha resuelto parcialmente al recurrir a un método de reconocimiento de patrones computarizado y realineación de perfiles de huellas moleculares (Schirm, Benend y otros, "Improvements in pentosan polysulfate sodium quality assurance using fingerprint electropherograms", Electrophoresis 2001). Sin usar esta mejora, se hicieron comparaciones de huellas moleculares que se obtuvieron al analizar y comparar una fuente de PPS con las otras dos en estudios separados (Degenhardt y otros, 1998, 2001). Degenhardt demostró que las tres fuentes diferían en los niveles de picos de oligosacáridos más cortos, y se hizo la sugerencia que algo de la heterogeneidad puede reflejar especies que no son PPS (Degenhardt y otros, 2001).

Sin embargo, estos artículos no describían un método que pudiera usarse para evaluar las características de las formulaciones que podrían degradarse o los efectos del almacenamiento después de la producción de un lote determinado.

Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de formulaciones de polisulfato de pentosano que resistan la degradación y la decoloración y una necesidad paralela de métodos de prueba que permitan una caracterización rutinaria y precisa de tales formulaciones de PPS. Diversas modalidades de la presente invención proporcionan tales formulaciones y métodos para verificar la pureza de las formulaciones.

Resumen de la invención

La invención proporciona diversas formulaciones estables que comprenden PPS. El objetivo de la presente invención es tal como se define en las reivindicaciones 1-11. En una modalidad, las formulaciones son estables sin refrigeración en una solución que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 8. En otra modalidad, las formulaciones son estables sin refrigeración en una solución que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8. En algunas modalidades, las formulaciones son estables sin refrigeración después de la esterilización terminal.

En algunas modalidades, las moléculas de PPS en la formulación tienen una distribución sustancialmente simétrica de pesos moleculares. Por ejemplo, un cromatograma que muestra el número de moléculas que tienen pesos moleculares particulares, por ejemplo, como se indica en un electroferograma de una muestra de la formulación, puede ser una curva en forma de campana sustancialmente suave y sustancialmente simétrica. En algunas modalidades, las moléculas de PPS en la formulación tienen una distribución sustancialmente simétrica de pesos moleculares después de la esterilización terminal.

En algunas modalidades, las formulaciones que comprenden moléculas de PPS tienen pesos moleculares sustancialmente homogéneos. Por ejemplo, las moléculas de PPS pueden consistir esencialmente en moléculas de PPS que tienen pesos moleculares sustancialmente homogéneos. En una modalidad, la formulación mantiene pesos moleculares sustancialmente similares u homogéneos después de la esterilización terminal. De acuerdo con algunas modalidades, las formulaciones tienen pesos moleculares sustancialmente similares después de la esterilización terminal. Por ejemplo, un electroferograma de la formulación se puede caracterizar por una curva en forma de campana sustancialmente suave que corresponde a la presencia de moléculas de PPS. En algunas modalidades, las moléculas de PPS pueden tener pesos moleculares que oscilan sustancialmente de aproximadamente 4700 a aproximadamente 10700 daltons.

En algunas modalidades, las formulaciones líquidas de acuerdo con la presente invención pueden comprender oligosacáridos que consisten esencialmente en polisulfato de pentosano, en donde la formulación es estable sin refrigeración.

En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención permanecen estables bajo diversas condiciones. Por ejemplo, las formulaciones pueden permanecer estables durante seis meses. Algunas formulaciones pueden permanecer estables hasta por uno, dos, tres, o cinco años. En algunas modalidades, la formulación puede permanecer estable a una temperatura que es significativamente mayor que la temperatura ambiente, por ejemplo, durante un período de tiempo tal como aproximadamente doce horas, aproximadamente un día, aproximadamente una o dos semanas, aproximadamente un mes, aproximadamente seis meses, o aproximadamente un año.

La invención proporciona una formulación estable que comprende PPS en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 mg/mL. En algunas modalidades, la formulación puede comprender PPS en una concentración de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 mg/mL. En algunas modalidades, un análisis de electroforesis capilar de la formulación a una concentración de aproximadamente 1-5 mg/mL muestra una curva sustancialmente en forma de campana que corresponde a la presencia de PPS en un gráfico de cambio en la absorción versus tiempo. La curva en forma de campana tiene una primera mitad que corresponde a una absorción anterior y una segunda mitad que corresponde a una absorción posterior. Las dos mitades se encuentran en una porción del pico de la forma de campana. El área dentro de la forma de campana es sustancialmente mayor que el área total que se define por cualquier pico que defina desviaciones en la primera mitad de la curva sustancialmente en forma de campana. En otras modalidades, la altura de la campana es sustancialmente más alta que la altura de cualquier pico en la primera mitad de la forma de campana.

También se describen en la presente descripción diversos métodos para detectar productos de degradación en una formulación que comprende PPS. En una modalidad, la formulación se expone a condiciones de degradación forzada. Luego se usa electroforesis capilar para preparar un electroferograma en una muestra de la formulación. Se identifica un pico de degradación en el electroferograma. El pico de degradación es sustancialmente más alto que el pico de la campana.

Se describe adicionalmente un método para esterilizar una formulación que comprende PPS. En una modalidad, se prepara una formulación que comprende PPS y luego se esteriliza, por ejemplo, mediante esterilización terminal en un autoclave. Los métodos tales como el análisis de CE se usan para mostrar las características de estabilidad de la formulación esterilizada, por ejemplo, mediante la detección de uno o más productos de degradación aparte del sulfato.

La descripción también describe un método para detectar un producto de degradación en una formulación que comprende PPS. Se lleva a cabo una primera medición de electroforesis capilar en una muestra de la formulación. Posteriormente, la formulación se somete a una o más condiciones, tales como calor, ácido, base, o lapso de tiempo. Luego, se lleva a cabo una segunda medición de electroforesis capilar en una muestra de la formulación. Las mediciones primera y segunda se comparan, por ejemplo, al comparar sus correspondientes electroferogramas. La segunda medición indica la presencia (o falta) de productos de degradación que no se mostraron en la primera medición.

En otra modalidad, se describe un método para detectar un indicio de estabilidad de una formulación de polisulfato de pentosano (PPS) mediante el uso de electroforesis capilar. Se diluye una muestra de la formulación a una concentración de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL en agua. Se prepara un electroferograma para la formulación mediante el uso de electroforesis capilar de manera que satisfaga un Estándar de Resolución de Picos (como se define a continuación), el electroferograma que comprende un gráfico de cambio en la absorción versus tiempo. Se identifica una porción sustancialmente en forma de campana del electroferograma que define sustancialmente una campana y que corresponde al PPS.

Un indicio de estabilidad de la formulación basada en una característica de tamaño de la campana en comparación con una característica de tamaño de uno o más picos, en donde las características de tamaño se determinan por integración de valle a valle. Otro indicio de estabilidad puede ser que el área de la campana sea al menos aproximadamente trece veces mayor que el área total combinada de uno o más picos secundarios que pueden aparecer en la porción generalmente en forma de campana de la curva que corresponde al PPS. Otro indicio de estabilidad puede ser que la altura de la campana sea más de aproximadamente tres veces mayor que la altura de cualquier pico secundario que satisfaga un Estándar de Homogeneidad de Pentosano. Otro indicio de estabilidad puede ser que la altura de la campana sea más de aproximadamente cuatro veces mayor que un tercer pico más alto. En algunas modalidades, la formulación puede someterse a una condición de potenciación de la degradación antes de preparar la muestra, tal como el paso del tiempo, o una temperatura significativamente mayor que la temperatura ambiente. El análisis del electroferograma puede indicar si el PPS satisface un Estándar de Homogeneidad de Pentosano, como se define en la presente descripción.

En otra modalidad, se proporciona una formulación líquida que comprende polisulfato de pentosano (PPS). Un análisis de electroforesis capilar de la formulación a una concentración de muestra de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL puede mostrar una curva sustancialmente en forma de campana que corresponde a la presencia de PPS en un gráfico de cambio en la absorción versus tiempo. La curva en forma de campana puede comprender una primera porción que corresponde a una absorción anterior y una segunda porción que corresponde a una absorción posterior. La primera porción y la segunda porción se pueden unir en una porción de pico medio. En algunas modalidades, el área dentro de la porción sustancialmente en forma de campana de la curva es más de aproximadamente trece veces mayor que el área total que se define por todos los picos distintos que aparecen en la primera porción de la curva sustancialmente en forma de campana, en donde el área se determina por la integración de valle a valle.

La descripción describe adicionalmente un método de control de calidad para detectar indicios de estabilidad de una formulación de PPS mediante el uso de electroforesis capilar. Se diluye en agua una muestra de la formulación con una concentración de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL. Se prepara un electroferograma para la muestra de formulación mediante electroforesis capilar. El electroferograma comprende un gráfico de cambio en la absorción versus tiempo. Una porción sustancialmente en forma de campana del electroferograma define sustancialmente una campana y corresponde al PPS. La campana tiene una altura y define un área dentro de la campana. La campana tiene una primera mitad que corresponde a una absorción anterior y una segunda mitad que corresponde a una absorción posterior. La primera mitad comprende uno o más picos. Cada pico tiene una altura y un área que corresponde a su desviación de la campana. Se determina un indicio de estabilidad de la formulación como un elemento de control de calidad basado en una comparación de una característica de tamaño de la campana y una característica de tamaño del uno o más picos.

En aún otra modalidad, una formulación de la invención comprende una formulación de polisulfato de pentosano esterilizada estable que está sustancialmente libre de impurezas marrones, que incluyen, por ejemplo, después de la esterilización terminal. Algunas formulaciones pueden estar sustancialmente libres de productos de degradación de PPS, que incluyen, por ejemplo, después de la esterilización terminal.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la estructura química básica del polisulfato de pentosano.

La Figura 2 muestra un esquema de un instrumento ilustrativo de electroforesis capilar de alto rendimiento.

La Figura 3 muestra una vista de la sección transversal de un capilar 300 ilustrativo en un instrumento de electroforesis capilar.

La Figura 4 muestra un esquema ilustrativo de electroforesis y electroósmosis en una separación de analitos aniónicos, neutros y catiónicos.

La Figura 5 muestra un sistema ilustrativo para llevar a cabo mediciones de electroforesis en formulaciones de muestra.

Las Figuras 6A y 6B muestran una curva ilustrativa de cambio en la absorción versus tiempo para una muestra ilustrativa que viaja a través de un capilar que se genera mediante el uso de detección indirecta.

Las Figuras 7-9 muestran electroferogramas para sustancias que contienen PPS que no se formularon de acuerdo con la presente invención.

Las Figuras 10-13 muestran electroferogramas para una formulación comercialmente disponible de PPS.

La Figura 14 muestra un electroferograma ilustrativo de materia prima de PPS.

Las Figuras 15A y 15B muestran electroferogramas para una sustancia comercialmente disponible que contiene PPS un período de tiempo sustancial después de la adquisición.

Las Figuras 16A, 16B, 16C, y 16D muestran electroferogramas de formulaciones ilustrativas de PPS de acuerdo con diversas modalidades de la invención.

Las Figuras 17A, 17B, 18A, 18B, 19A, 19B, 20A, y 20B muestran electroferogramas para formulaciones ilustrativas de PPS antes y después de la esterilización, de acuerdo con diversas modalidades de la invención. Las Figuras 21, 22A, 22B, 23A, y 23B muestran electroferogramas después de la degradación forzada de una formulación ilustrativa de acuerdo con la presente invención.

La Figura 24 muestra un electroferograma de una formulación comercialmente disponible que contiene PPS después de la degradación forzada.

Las Figuras 25A, 25B, 26A, 26B, 27A, 27B, 28A, y 28B muestran electroferogramas para muestras esterilizadas y no esterilizadas que comprenden PPS que se almacenaron a diferentes temperaturas.

La Figura 29 muestra un electroferograma de un anión perclorato en una muestra de perclorato de sodio.

Las Figuras 30A y 30B muestran un electroferograma de una muestra de pentosano en la ausencia y presencia de perclorato adicionado.

Las Figuras 31A y 31B muestran un electroferograma de API pentosano diluido en agua en la ausencia y presencia de perclorato.

La Figura 32 muestra un electroferograma del anión formiato presente en el formiato de sodio.

Las Figuras 33A y 33B muestran un electroferograma de API pentosano diluido en agua en la ausencia y presencia de formiato.

Descripción detallada de modalidades ilustrativas

Diversas modalidades que se describen en la presente descripción se dirigen a formulaciones que contienen polisulfato de pentosano de acuerdo con la invención, métodos para usar tales formulaciones, y métodos para evaluar tales formulaciones. Las formulaciones de polisulfato de pentosano de la presente invención pueden usarse como un anticoagulante y/o para tratar la artritis (por ejemplo, osteoartritis) u otras afecciones tales como cistitis intersticial, encefalopatía espongiforme transmisible (TSE), por ejemplo, encefalopatía espongiforme bovina (BSE), y virus de la inmunodeficiencia (tales como el VIH/SIDA o el Virus de la Inmunodeficiencia Felina (FIV)) en mamíferos, tales como humanos, mamíferos productores de alimentos, y mamíferos de compañía (tales como felinos, caninos y equinos). El PPS también puede usarse para tratar hematomas, hemorroides, sabañones, quemaduras, y enfermedades multiparamétricas tales como trombosis y ateroesclerosis, que incluyen, por ejemplo, en tales mamíferos.

Debido a que el PPS puede usarse bajo diversas condiciones y, particularmente en el contexto veterinario puede usarse en el campo, hay una necesidad de formulaciones de PPS que resistan o resistan sustancialmente la degradación y/o decoloración bajo diversas condiciones, tales como esterilización, desafío microbiano, almacenamiento en el tiempo, la luz y el calor.

Además, debido a que el PPS puede ingerirse o inyectarse en mamíferos, hay una necesidad adicional de formulaciones que permanezcan estables a un pH fisiológico.

También hay una necesidad de un método reproducible de control de calidad para evaluar los lotes de PPS, por ejemplo, los lotes proporcionados por un proveedor potencial. preferentemente, el método debería detectar los cambios que puedan producirse en el producto después de la degradación.

Se llevaron a cabo experimentos para determinar la eficacia del uso de electroforesis capilar (CE) para evaluar diversas formulaciones de PPS y cambios en aquellas formulaciones en diversas condiciones. Se usó un instrumento de electroforesis capilar para analizar las muestras de PPS, y los resultados, como se establecen en un electroferograma, se compararon con la fuente que se describe en los estudios citados anteriormente. Basados en estos resultados, fue posible determinar si la CE tiene utilidad para detectar la degradación. Estos experimentos también permitieron la identificación diversas formulaciones de PPS que tienen características convenientes, tales como la resistencia a la degradación.

Los experimentos se llevaron a cabo en un sistema de electroforesis capilar Beckman-Coulter PACE-MDQ mediante el uso de un método esencialmente igual al que describe Degenhardt y otros (Degenhardt, Ghosh y otros 2001). Estos experimentos demuestran que una formulación estabilizada de la presente invención es diferente de una formulación existente comercialmente disponible (Cartrophen®). Específicamente, una formulación estabilizada de la presente invención no contiene niveles apreciables de oligosacáridos más pequeños que previamente se demostró que están presentes y característicos de Cartrophen®, el cual es un ejemplo de una forma inyectable de PPS actualmente disponible en el mercado (Degenhardt, Benend y otros 1998; Degenhardt, Ghosh y otros 2001). Los artículos Degenhardt, Benend y otros 1998 y Degenhardt, Ghosh y otros 2001, así como también los artículos de Schirm y otros 2001, Fuller y otros 1992, y Maffrand y otros 1991 discutidos anteriormente, se incorporan en la presente descripción por referencia en su totalidad.

Las modalidades de la presente invención incluyen una formulación de PPS esterilizada terminalmente que es adecuada para la administración a mamíferos. Por ejemplo, en algunas modalidades, la formulación se puede proporcionar a los mamíferos como un fármaco o suplemento dietético. Otras modalidades de la presente descripción incluyen un método que distingue entre diversas formulaciones de PPS y detecta productos de degradación, que incluyen productos de degradación aparte del sulfato. Además, este método ha permitido la identificación de diversas formulaciones de PPS que tienen propiedades convenientes, tales como la resistencia a la degradación.

Como se usa en esta solicitud, los siguientes términos tendrán los siguientes significados: "Producto de degradación" (también llamado producto de descomposición) significa una o más moléculas que resultan de un cambio químico en la sustancia que se produce con el tiempo y/o por la acción de factores internos o externos, por ejemplo, luz, temperatura, pH o agua, o por reacción con un excipiente y/o el sistema de envase/cierre inmediato. La aparición de productos de degradación en una formulación de PPS se caracteriza en parte por una disminución general en el área de un pico en forma de campana correspondiente al PPS en un electroferograma, como se mide antes y después de la aparición del(de los) producto(s) de degradación o un aumento en el número o área de los picos secundarios que aparecen en el borde delantero de la curva en forma de campana.

En algunas modalidades, un electroferograma puede mostrar la ausencia de productos de degradación en una formulación. Por ejemplo, en un electroferograma de diversas formulaciones de la presente invención, el área de la curva en forma de campana correspondiente al PPS es al menos aproximadamente trece veces mayor que el área total combinada del uno o más picos, en donde el área se determina por integración de valle a valle, por ejemplo, integración manual de valle a valle. En algunas modalidades, la altura de la campana es más de aproximadamente tres veces mayor que la altura de cualquier pico que satisfaga un Estándar de Homogeneidad de Pentosano, como se define a continuación.

"La degradación forzada", o "prueba de estrés", implica exponer una sustancia a condiciones reales o simuladas que son más severas que un entorno típico. En algunos casos, estas condiciones pueden ser más severas que aquellas que se usan para las pruebas aceleradas de una sustancia. Tales condiciones severas pueden ser un pH, temperatura, o presión que son significativamente mayores o menores que las condiciones normales. (Las condiciones normales pueden incluir un intervalo de pH de 6,5-7,5 a temperatura y presión estándar, por ejemplo). La degradación forzada también puede implicar la exposición de una sustancia a otras condiciones o sustancias. La degradación forzada típicamente se lleva a cabo para proporcionar datos sobre los productos de descomposición forzada y los mecanismos de descomposición relacionados con una sustancia, tal como un fármaco. Las condiciones severas que pueden encontrarse durante la distribución de una sustancia, tales como un producto farmacéutico, pueden analizarse mediante pruebas de estrés en lotes definitivos de la sustancia farmacéutica. Los estudios de degradación forzada pueden usarse para establecer las características de estabilidad inherentes de las moléculas componentes, tales como las trayectorias de degradación de las moléculas, y la degradación forzada puede conducir a la identificación de productos de degradación y, por lo tanto, respaldar la idoneidad de los procedimientos analíticos propuestos. La naturaleza detallada de los estudios dependerá de la sustancia individual y el tipo de producto farmacéutico.

"Fragmento" significa una molécula incompleta, por ejemplo de PPS, con un patrón irregular no repetitivo de picos visibles en el electroferograma.

"Estable" en referencia a una formulación de PPS significa que mantiene una cantidad sustancialmente constante (por ejemplo, una concentración sustancialmente constante) de sulfato y no exhibe sustancialmente decoloración (por ejemplo, sustancialmente ninguna decoloración marrón), o el área total de todos los picos que migran antes del pico principal de pentosano de la curva en forma de campana no debe exceder el 5 % del área total de pentosano. Por ejemplo, una formulación de PPS "estable" es capaz de tener estas características durante una vida útil, por ejemplo, una vida útil de seis meses, o en algunos casos hasta uno, dos o tres años. Un análisis de electroforesis capilar de una muestra de formulación de PPS "estable" mostraría pocos o ningún pico de degradación visible. La "esterilización terminal" significa el proceso en el cual se esteriliza una formulación en su forma final, que incluye todos los materiales y envases. Este proceso de esterilización terminal se puede realizar, por ejemplo, por calor húmedo con o sin fluidos de enfriamiento rápido, óxido de etileno o radiación. Se dice que una sustancia que ha pasado por el proceso de esterilización terminal está "esterilizada terminalmente".

Se apreciará que el PPS a menudo se formula como una sal, tal como PPS de sodio, PPS de calcio, o PPS de potasio, por ejemplo. El pentosano puede obtenerse de forma natural a partir de plantas, microorganismos, o sintetizarse. En consecuencia, las referencias al PPS a lo largo de esta solicitud pueden referirse al PPS así como también a las diversas sales del mismo, como sea apropiado, ya sea que se obtengan de forma natural, sintética o semisintética.

Diversas formulaciones de la presente invención pueden tener una o más propiedades beneficiosas, tales como la resistencia a la degradación. Tales formulaciones de acuerdo con la presente invención comprenden PPS o una sal del mismo y uno o más de los siguientes componentes: uno o más tampones, tales como bisulfito de sodio, citrato de sodio, y/o ácido cítrico; uno o más quelantes o agentes quelantes, tales como EDTA; uno o más conservantes; uno o más agentes antimicrobianos, tales como metilparabeno; uno o más antioxidantes; y cualquier otro excipiente adecuado. En algunas formulaciones de acuerdo con diversas modalidades de la presente invención, el PPS se puede combinar con uno o más de los componentes anteriores, así como también aminoazúcar y/o ácido hialurónico.

Los quelantes ilustrativos que se pueden incluir en diversas formulaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), dietilentriaminopentaacetato (DPTA), EDTA sódico, y otros agentes quelantes conocidos.

Los tampones ilustrativos que se pueden incluir en diversas formulaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, citrato, hidróxido de sodio/ácido levulínico, acetato, bicarbonato, bisulfito, hidróxido de sodio/glicina, fosfato, y otros tampones conocidos.

Los antioxidantes ilustrativos que se pueden incluir en diversas formulaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, acetona, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, y otros conservantes conocidos.

Los agentes antimicrobianos ilustrativos que pueden incluirse en diversas formulaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, metil o propilparabenos, alcohol bencílico, y otros agentes antimicrobianos conocidos.

Los aminoazúcares ilustrativos que se pueden incluir en diversas formulaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, clorhidrato de glucosamina, galactosamina, sulfato de glucosamina, fosfato de glucosamina, N-acetilglucosamina, manosamina, y fragmentos, sales, y mezclas de los mismos. Adicionalmente, el término aminoazúcar también se usa en la presente descripción para abarcar aminoazúcares que pueden haber sido modificados químicamente pero que aún retienen su función. Tales modificaciones químicas incluyen, pero no se limitan a esterificación, sulfatación, polisulfatación, acetilación, y metilación. Además, se contempla que el término aminoazúcar puede extenderse a cualquier composición de materia que sea insustancialmente diferente de los aminoazúcares descritos anteriormente.

Diversas formulaciones también pueden comprender ácido hialurónico. El ácido hialurónico es un glicosaminoglicano no sulfatado. El ácido hialurónico puede derivarse de un animal (por ejemplo, que se extrae de crestas de gallo o humor vítreo bovino) o de un microorganismo (por ejemplo, fermentación bacteriana o de levadura), por ejemplo. Diversas formulaciones de acuerdo con la presente invención o que se describen en la presente descripción pueden comprender uno o más de los componentes anteriores en cualquier concentración o cantidad adecuada. El ^p P^s está presente en una concentración de aproximadamente 25 mg/mL a aproximadamente 500 mg/mL, o con mayor preferencia de aproximadamente 250 mg/mL. En otro ejemplo, el PPS puede estar presente en una cantidad total de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 5 g. Los tampones, por ejemplo, que incluyen el citrato de sodio, el ácido cítrico, u otros tampones, pueden estar presentes en concentraciones tales como de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mM. Por ejemplo, en algunas modalidades, un tampón tal como el citrato de sodio puede tener concentraciones en la formulación de aproximadamente 50 mM (14,7 mg/mL), o un tampón tal como el ácido cítrico puede comprender aproximadamente 55 mM (aproximadamente 10,5 mg/mL). El EDTA puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 0,5 % p/v, de 0,1 mM a aproximadamente 1 mM, aproximadamente 0,25 mg/mL, o con mayor preferencia 0,25 % p/v. Los quelantes pueden estar presentes en concentraciones tales como de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 mM. Los conservantes pueden estar presentes en concentraciones tales como de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1 %. Los antioxidantes pueden estar presentes en concentraciones tales como de aproximadamente 0,1 a 10 mM. De acuerdo con la invención, los antioxidantes están presentes en concentraciones de aproximadamente 0,02 % p/v a aproximadamente 5 % p/v. Los excipientes (por ejemplo, excipientes farmacéuticos) pueden estar presentes en cualquier concentración adecuada, por ejemplo, concentraciones de aproximadamente 1 a aproximadamente 90 %.

En otras modalidades de la invención, diversas formulaciones pueden comprender uno o más de estos componentes en cualquier concentración o cantidad adecuada. Por ejemplo, el PPS puede estar presente en una concentración de aproximadamente 25 mg/mL a aproximadamente 500 mg/mL, o con mayor preferencia de aproximadamente 250 mg/mL. Los tampones pueden estar presentes en concentraciones tales como de aproximadamente 0,005 % a aproximadamente 5 % p/v. Como se describe en la presente descripción, el bisulfito de sodio puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 0,02 % a aproximadamente 1 % p/v, 10 mg/mL, o con mayor preferencia aproximadamente 1 % p/v. (Cuando se adiciona a la formulación de la presente invención, el metabisulfito de sodio puede convertirse en dióxido de azufre y bisulfito de sodio. En las modalidades, entre aproximadamente 25 % y casi todo el metabisulfito puede, al adicionarse a las formulaciones de la presente invención, convertirse en dióxido de azufre y bisulfito de sodio.)

El EDTA puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 0,5 % p/v, de 0,1 mM a aproximadamente 1 mM, aproximadamente 0,25 mg/mL, o con mayor preferencia 0,25 % p/v. El citrato de sodio puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 % p/v, o con mayor preferencia aproximadamente 1,47 % p/v. El ácido cítrico puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 2 % p/v, o con mayor preferencia aproximadamente 1,05 % p/v. Los agentes antimicrobianos, tales como el metilparabeno pueden estar presentes en concentraciones tales como de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 0,2 % p/v, o aproximadamente 1 mg/mL, o con mayor preferencia aproximadamente 0,1 % p/v.

Las formulaciones de la presente invención son una forma líquida y preferentemente se formulan como una solución acuosa. La formulación está en una solución que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8. En algunas modalidades, la formulación puede tener un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.

Aquellos expertos en la técnica deberían apreciar que las formulaciones de la presente invención pueden liofilizarse para crear una forma de dosificación liofilizada, mediante el uso de técnicas evidentes para los expertos en la técnica a la luz de esta descripción. Adicionalmente, las formas de dosificación liofilizadas se pueden formular para comprender, después de la reconstitución, una forma de dosificación de cualquiera de las formulaciones que se describen en la presente descripción.

Una formulación ilustrativa puede comprender uno o más de los siguientes: PPS en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 mg/mL; metabisulfito o bisulfito (por ejemplo, bisulfito de sodio) en una concentración de aproximadamente 0,05 % p/v a 5 % p/v; uno o más quelantes en una concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 0,5 % p/v; uno o más tampones en una concentración de aproximadamente 0,005 % p/v a aproximadamente 5 % p/v; uno o más antioxidantes en una concentración de aproximadamente 0,02 % p/v a aproximadamente 1 % p/v; uno o más agentes antimicrobianos en una concentración de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 0,2 % p/v de ácido hialurónico; y glucosamina.

En algunas modalidades, el bisulfito de sodio puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 10 mg/mL. El EDTA puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 0,25 mg/mL. El citrato de sodio puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 14,7 mg/mL. El ácido cítrico puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 10,5 mg/mL. El metilparabeno puede estar presente en concentraciones tales como de aproximadamente 1 mg/mL.

Una modalidad ilustrativa puede comprender una forma de dosificación inyectable que comprende polisulfato de pentosano (PPS) a una concentración de aproximadamente 250 mg/mL; bisulfito de sodio en una concentración de hasta aproximadamente 20 mg/mL; y EDTA a una concentración de aproximadamente 0,25 mg/mL. La formulación puede ser estable en un intervalo de pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7. La formulación se puede formular en cualquier forma de dosificación, tal como un líquido, por ejemplo, para administración oral, o una dosificación inyectable.

Una formulación ilustrativa puede comprender PPS en una concentración de aproximadamente 250 mg/mL; bisulfito de sodio en una concentración de hasta aproximadamente 10 mg/mL; EDTA en una concentración de aproximadamente 0,25 mg/mL; y metilparabeno en una concentración de aproximadamente 1 mg/mL. La formulación puede ser estable en un intervalo de pH de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,2. La formulación se puede formular en cualquier forma de dosificación, tal como un líquido, por ejemplo, para administración oral, o una dosificación inyectable.

Otra formulación ilustrativa puede comprender PPS en una concentración de aproximadamente 250 mg/mL; bisulfito de sodio en una concentración de hasta aproximadamente 10 mg/mL; EDTA en una concentración de aproximadamente 0,25 mg/mL; y metilparabeno en una concentración de aproximadamente 1 mg/mL. La formulación puede ser estable en un intervalo de pH de aproximadamente 7,8 a aproximadamente 8,2. En algunas modalidades, el pH de la formulación se puede ajustar con hidróxido de sodio al 1 % p/v. La formulación se puede formular en cualquier forma de dosificación, tal como un líquido, por ejemplo, para administración oral, o una dosificación inyectable.

De acuerdo con diversas modalidades de la invención, las formulaciones de PPS que se describen en la presente descripción, tales como las formulaciones farmacéuticas de PPS, pueden usarse como un anticoagulante y/o para tratar afecciones tales como artritis, cistitis intersticial, encefalopatía espongiforme transmisible (TSE) (tal como BSE ) y virus de inmunodeficiencia (tales como el VIH/SIDA o FIV) en mamíferos, tales como humanos, mamíferos productores de alimentos, y mamíferos de compañía (tales como felinos, caninos y equinos). Las formulaciones que se describen en la presente descripción pueden usarse también para tratar hematomas, hemorroides, sabañones, quemaduras, y enfermedades multiparamétricas tales como trombosis y ateroesclerosis.

De acuerdo con diversas modalidades de la presente invención, las formulaciones de PPS que se describen en la presente descripción pueden administrarse a mamíferos, tales como a un humano, caballo, perro, gato, u otros mamíferos, de cualquier manera adecuada, por ejemplo, para tratar una cualquiera o más de las afecciones antes identificadas. Por ejemplo, las formulaciones que se describen en la presente descripción pueden comprender formulaciones tópicas y sistémicas para administración oral, intravenosa, intramuscular, intraarticular, o subcutánea. Se pueden formular diversas otras modalidades para administrarse por medio de un parche transdérmico, una crema, una solución intravenosa, gotas para los ojos, aerosol, liposomas o cualquier otro método de aplicación e ingestión.

De acuerdo con algunas modalidades, las formulaciones de PPS líquidas (por ejemplo, acuosas) pueden administrarse mediante inyección. En algunas modalidades, las formulaciones de PPS líquidas se pueden administrar oralmente. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas pueden no esterilizarse terminalmente. Las formulaciones de PPS de la presente invención pueden procesarse adicionalmente mediante métodos conocidos para producir una composición farmacéuticamente aceptable. En ciertos casos, esto puede implicar el uso de un portador farmacéuticamente aceptable con cualquiera de las formulaciones que se describen en la presente descripción, ya sea que el portador esté en formato líquido o sólido. Por ejemplo, la formulación puede procesarse adicionalmente para administrarse en cualquier forma líquida o en polvo adecuada, tal como por píldora, cápsula, líquido, liposoma, composición liofilizada, comprimido masticable duro o blando. La formulación se puede administrar, por ejemplo, a un mamífero, en una o más formas de dosificación. Las formas de dosificación de la formulación se pueden administrar en una cantidad efectiva para tratar una o más enfermedades.

Las formulaciones de PPS de la presente invención pueden formularse para administración a un mamífero, por ejemplo, para administración oral o inyectable, en cualquiera de los intervalos de dosis que se describen a continuación.

Una dosis de las formulaciones de PPS que se describen en la presente descripción, por ejemplo, una dosis inyectable líquida, puede comprender PPS en una cantidad de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 5 g o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, por ejemplo. En algunas modalidades, se puede administrar una dosis de aproximadamente 3 mg/kg mediante inyección. En algunas modalidades, la cantidad de la forma de dosificación comprende una cantidad suficiente para inyectar de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de PPS en cada inyección.

En algunas modalidades, una dosis de las formulaciones de PPS que se describen en la presente descripción, por ejemplo, una dosis líquida para administración oral, puede comprender PPS en una cantidad de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. En algunas modalidades, se puede administrar oralmente una dosis de aproximadamente 10 mg/kg. En algunas modalidades, la cantidad de la formulación líquida comprende una cantidad suficiente para suministrar una concentración oral de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de PPS en cada administración.

Una dosis de formulación de PPS puede comprender adicionalmente un aminoazúcar en cualquiera de las siguientes cantidades: de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 5 g, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 mg/mL para inyección, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg para administración oral. En algunas modalidades, se puede administrar una cantidad de aproximadamente 6 mg/kg mediante inyección. En otras modalidades, se puede administrar oralmente una cantidad de aproximadamente 21 mg/kg.

Una dosis de formulación de PPS puede comprender adicionalmente ácido hialurónico en cualquiera de las siguientes cantidades: de aproximadamente O,0l a 5 mg/kg, de 0,1 a aproximadamente 50 mg/mL, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 g para inyección o de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg para administración oral. En algunas modalidades, se puede administrar una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/kg mediante inyección. En otras modalidades, se puede administrar oralmente una cantidad de aproximadamente 0,2 mg/kg.

Se apreciará que las dosis más pequeñas pueden ser apropiadas para humanos y pequeños mamíferos, mientras que las dosis más grandes pueden ser apropiadas para animales más grandes. Una cantidad de dosificación puede basarse en la masa del sujeto objetivo. Por ejemplo, una dosificación puede comprender aproximadamente 3 mg por kg de masa corporal del sujeto objetivo, tal como un humano o un caballo. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la dosificación para una formulación particular depende en parte de la sal de p Ps en la formulación. Por ejemplo, las formulaciones que comprenden PPS de sodio pueden tener una dosificación diferente que las formulaciones que comprenden PPS de calcio. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar los cálculos de dosificación al evaluar el peso corporal, el área superficial, y las diferencias entre especies.

De acuerdo con diversas modalidades de la presente invención, las dosis pueden administrarse en una diversidad de frecuencias. Las dosis orales de las formulaciones que se describen en la presente descripción pueden administrarse diariamente, aproximadamente una vez cada dos o tres días, aproximadamente dos veces por semana, o semanalmente. Las formulaciones orales de acuerdo con la presente invención se pueden administrar durante una duración total de aproximadamente cuatro a aproximadamente cinco semanas, durante varios meses, varios años, o permanentemente.

Las dosis inyectables, tales como dosis intramusculares, intraarticulares, subcutáneas o intravenosas, pueden administrarse aproximadamente diariamente, aproximadamente una vez cada dos o tres días, aproximadamente dos veces por semana, aproximadamente semanalmente, aproximadamente quincenalmente, aproximadamente mensualmente, o en otras frecuencias de administración. Tales dosis pueden administrarse durante periodos de tiempo tales como de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente cinco semanas, aproximadamente dos meses, aproximadamente seis meses, u otro período de tratamiento.

Las dosis que se describen en la presente descripción también se pueden administrar en la terapia de pulso, por ejemplo, donde las dosis se administran periódicamente (por ejemplo, aproximadamente diariamente) durante un período de tiempo tal como de 1-3 meses, luego no se administran durante un período de tiempo tal como de 1-3 meses, y luego se administran de nuevo periódicamente (por ejemplo, aproximadamente diariamente o en algún otro intervalo apropiado) durante un período de tiempo tal como de 1-3 meses. Otros regímenes de dosificación son evidentes para un experto en la técnica a la luz de esta descripción.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán que una sola dosis de las formulaciones que se describen en la presente descripción, tal como una sola dosis diaria, puede administrarse en partes y/o en diferentes tiempos a lo largo de un solo día. Por ejemplo, una dosis diaria puede dividirse de manera que la mitad se administre dos veces por día, por ejemplo, la mitad por la mañana y la mitad por la noche o se administre tres veces en un solo día.

En algunas modalidades de la presente descripción, la electroforesis capilar puede usarse para analizar muestras de sustancias que contienen PPS, tales como las formulaciones de PPS de la presente invención. Tal análisis puede usarse para lograr, por ejemplo, cualquiera de los siguientes: detectar cualquier producto de degradación polimérico; determinar sulfato libre como un índice adicional de degradación; comparar diferentes lotes de muestra antes y después de la esterilización; comparar una muestra con otra formulación que contenga PPS o una muestra conocida publicada, tal como Cartrophen®.

En algunas modalidades de la presente descripción, la electroforesis de zona capilar puede usarse para analizar una o más muestras de formulaciones de PPS. La electroforesis de zona capilar se puede llevar a cabo en una solución libre. La separación de los componentes durante la electroforesis de zona capilar puede basarse en las diferencias en la relación carga-masa de diversos componentes. Puede usarse una solución tampón homogénea. Puede aplicarse un campo eléctrico constante. El proceso de electroforesis de zona capilar puede depender del pH.

Los aditivos de tampón para electroforesis de zona capilar pueden comprender cualquier tampón adecuado y pueden incluir cualquiera de los siguientes: sales inorgánicas, disolventes orgánicos, urea, ácidos sulfónicos, tensioactivos catiónicos, derivados de celulosa, aminas, ácidos orgánicos, y polímeros orgánicos.

La capacidad analítica de la CE en una formulación de PPS de acuerdo con diversas modalidades de la invención permite la cuantificación de sulfato en la presencia o ausencia de una cantidad conocida de sulfito; cuantificación de los niveles totales de pentosano; detección y cuantificación de fragmentos y/o productos de degradación; y detección y cuantificación de oligosacáridos.

Los procedimientos que se usan para identificar la degradación y las formulaciones de PPS beneficiosas se describen más completamente en las Figuras, las cuales muestran sistemas de electroforesis capilar ilustrativos, resultados que muestran los grados de estabilidad y degradación logrados en diferentes circunstancias, y formulaciones identificadas por tener propiedades convenientes.

La Figura 1 muestra la estructura química básica del polisulfato de pentosano. En el diagrama, la R representa ya sea Hidrógeno o SO³-Na+.

La Figura 2 muestra un esquema ilustrativo de un instrumento 200 de electroforesis capilar de alto rendimiento (HPCE). El instrumento HPCe comprende un suministro de energía 210 que tiene electrodos 230, 240 que se conectan a un anolito (entrada) 260 y un catolito (salida) 250. El suministro de energía 210 genera una tensión entre el anolito (+) 260 y el catolito (-) 250. Un extremo del capilar 70 se sumerge junto con el ánodo en el tampón de anolito 260, y el otro extremo se sumerge junto con el cátodo en el tampón de catolito 250. Un detector 220 se configura para detectar la absorción en el capilar 70.

La Figura 3 muestra una vista de la sección transversal de un capilar ilustrativo 300. El capilar 300 puede comprender una porción interior 310 y un recubrimiento exterior 330. La porción interior 310 puede comprender sílice fundida, u otro material adecuado, y puede definir un diámetro total de aproximadamente 360 pm. El recubrimiento 330 puede comprender un recubrimiento de poliimida, u otro material adecuado, y puede tener un grosor de aproximadamente 12 pm. El capilar 300 puede tener forma tubular y definir un eje interior hueco 320. El eje interior 320 puede tener una forma sustancialmente cilíndrica, y puede tener un diámetro de aproximadamente 20-100 pm. La Figura 4 muestra un esquema ilustrativo de electroforesis y electroósmosis en una separación de analitos aniónicos 430, neutros 440, y catiónicos 450. Después de la inyección de una muestra en el tubo, el extremo derecho del tubo 410 y un electrodo (el cátodo 470) se colocan en un depósito de tampón, mientras que el extremo izquierdo del tubo 410 y otro electrodo (el ánodo 460) se colocan simultáneamente en otro depósito de tampón. Se aplica una tensión entre el electrodo y el cátodo. Como se representa en la Figura 4, el volumen total de fluido en el tubo 410 fluye con los cationes hidratados cargados positivamente en un proceso denominado electroósmosis o flujo electroosmótico (EOF). Otros analitos cargados positivamente se mueven en la misma dirección. Las moléculas aniónicas cargadas negativamente se mueven en la dirección opuesta hacia el cátodo. Si el EOF excede la movilidad electroforética de un grupo de aniones, los aniones se moverán en la otra dirección. La polaridad de los electrodos se puede invertir para asegurar que los aniones cargados negativamente en la muestra pasen por la ventana del detector 420.

La movilidad electroforética y el EOF causan que los diferentes componentes de la muestra viajen efectivamente a través del tubo 410 a diferentes velocidades. En consecuencia, diferentes tipos de moléculas alcanzan la ventana del detector 420 a diferentes tiempos. Cuando una molécula absorbente de luz en particular fluye más allá de la ventana del detector 420, su paso puede detectarse directamente como un cambio en la absorción de luz. Si la molécula no absorbe luz (como el pentosano) pero desplaza un componente tampón absorbente de luz cargado similarmente, puede detectarse indirectamente como una disminución en la absorción de luz por el tampón.

La Figura 5 muestra un sistema ilustrativo para llevar a cabo mediciones de electroforesis en formulaciones de muestra. Más específicamente, la Figura 5 muestra una impresión de la pantalla de carga del paquete de Software Karat 32 (versión 5, compilación 1021). Se representan un puerto de entrada 510 y un puerto de salida 520 ilustrativos, junto con la lámpara de deuterio 530 y las longitudes de onda 540 de salida de la luz por la lámpara de deuterio 530.

La Figura 6A muestra que mientras la muestra y el tampón se mueven a través del capilar, la muestra que no absorbe la luz cargada similarmente desplaza al tampón que absorbe la luz, al crear una zona de concentración reducida del tampón. Como se muestra en el gráfico de la Figura 6B, mientras la muestra pasa por la ventana del detector, el detector detectará una reducción en la absorción de luz 640 seguida de un retorno a una absorción de luz de línea base después de que pase la muestra. Debido a que diferentes moléculas viajan efectivamente a través del tubo a diferentes velocidades y alcanzan la ventana del detector a diferentes tiempos, pueden separarse y distinguirse al detectar la absorción de luz en la ventana del detector 420.

Se apreciará que los electroferogramas que se obtienen mediante el uso de métodos de detección indirecta pueden invertirse a conveniencia para visualizar los resultados. Por ejemplo, el PPS puede desencadenar un "valle" que se invierte para formar un pico. Independientemente de la representación gráfica, el "valle" o "pico" de PPS representa una desviación sustancial de la "línea base". Al reconocer esta intercambiabilidad, las representaciones de CE de PPS se denominarán como "picos" en lugar de "valles" para los fines de esta descripción.

En términos generales, los electroferogramas que se muestran en las Figuras 7-13 se caracterizan por un pico de absorción principal generalmente en forma de campana durante un período de tiempo de varios minutos y una pluralidad de otros picos de absorción durante períodos de tiempo mucho más pequeños. El pico principal generalmente aparece cerca del medio de estos electroferogramas. Notablemente, en muchos de los electroferogramas, el pico de absorción principal en forma de campana tiene una pluralidad de picos de absorción sucesivos en su borde delantero, el borde delantero que es la parte izquierda de la curva del electroferograma que se detecta antes en el tiempo. Estos picos probablemente corresponden a moléculas de PPS de peso molecular más pequeño. Debido a que son más pequeñas, pueden viajar más rápido a través del capilar y, por lo tanto, se detectan antes en el electroferograma que el pico principal de PPS, que corresponde a la parte superior de la forma de campana.

Las Figuras 7-9 muestran electroferogramas para sustancias que contienen PPS que no se formularon de acuerdo con la presente invención. Estos electroferogramas son curvas de cambio en la absorción versus tiempo que se generan mediante el uso de electroforesis de zona capilar (CZE). Las Figuras 7 y 9 se copiaron de Degenhardt, Benend y otros (1998). La Figura 7 muestra el análisis de electroforesis capilar de Cartrophen® y un producto de PPS no identificado. La Figura 8 se copió de Degenhardt, Ghosh y otros (2001), y muestra curvas que se generaron mediante el uso de CZE. Las curvas D, E, y F en la parte inferior izquierda de la Figura 8 son curvas en forma de campana relativamente suaves que muestran el análisis CE de muestras de PPS que tienen pesos moleculares sustancialmente homogéneos. La porción de PPS de estas curvas (que corresponde a la forma de campana general cerca del centro de cada gráfico) está sustancialmente libre de picos distintivos en la porción de PPS del gráfico (aparte del pico de PPS primario en la parte superior de la campana).

En consecuencia, la presencia de estos picos en el borde delantero del pico ancho de PPS en diversos electroferogramas de las Figuras 7-9 indica oligosacáridos que tienen pesos moleculares diferentes (o heterogéneos). Cada pico sucesivo en la porción izquierda de la curva en forma de campana de PPS indica un peso molecular diferente (o un conjunto diferente de pesos moleculares). Se ha argumentado que esta propiedad de heterogeneidad (que corresponde a los múltiples picos en el lado izquierdo de la forma de campana) es necesaria para la efectividad biológica. Sin embargo, se cree que diversas modalidades de la presente invención, que tienen PPS de pesos moleculares sustancialmente homogéneos, también son biológicamente efectivas. En consecuencia, la presente invención proporciona formulaciones de PPS que tienen niveles reducidos de oligosacáridos heterogéneos en las mismas, como lo demuestra un menor número de picos en su borde delantero. Para estas formulaciones, se dice que las moléculas de PPS tienen pesos moleculares sustancialmente similares (o sustancialmente homogéneos).

Un gráfico ilustrativo que muestra las impurezas de una muestra de PPS que no se formuló de acuerdo con la presente invención es el gráfico superior de la Figura 7. Este gráfico muestra una serie de picos en períodos de tiempo cortos que gradualmente pasan a una curva más suave durante un período de tiempo significativamente más largo. La curva suave es generalmente en forma de campana, aunque el lado delantero (izquierdo) de la "campana" exhibe una serie de picos. En la Figura 7, los picos en realidad alcanzan niveles de absorción mayores que la curva dominante en forma de campana que corresponde a moléculas de PPS más grandes. Esto indica una presencia aumentada de oligosacáridos heterogéneos en la muestra. En el gráfico inferior de la Figura 7, los picos son mucho más pequeños en relación con la curva de PPS dominante, de esta manera indica un porcentaje menor de oligosacáridos heterogéneos.

La Figura 8 muestra seis curvas de absorción para muestras de PPS que no se formularon de acuerdo con la presente invención, las tres superiores corresponden a un fabricante y las tres inferiores corresponden a otro fabricante. Como se muestra en la leyenda en la parte superior del gráfico, la porción de PPS de la curva corresponde a la absorción de aproximadamente 7 minutos a aproximadamente 17 minutos. Las tres curvas superiores indican una presencia significativa de pequeños oligosacáridos. Estas curvas superiores muestran picos de borde delantero considerables, de esta manera se indica una composición relativamente heterogénea, es decir, un intervalo más amplio de pesos moleculares. Las tres curvas inferiores indican sustancialmente oligosacáridos no pequeños (o picos) y una estructura más homogénea, es decir, moléculas de PPS que tienen una distribución de pesos moleculares en forma de campana más simétrica. En consecuencia, las curvas más suaves de la parte inferior indican la presencia de moléculas de PPS que tienen un peso molecular sustancialmente homogéneo, es decir, la ausencia de oligosacáridos que tienen pesos moleculares heterogéneos.

Al comparar los diversos electroferogramas, se apreciará que la porción del gráfico que corresponde al PPS es a menudo en forma de campana y más amplia que cualquier región del gráfico que corresponda a un solo pico. Aunque los picos a menudo distorsionan la forma de "campana" general presente en muchos de estos gráficos, aún se puede determinar una forma de campana general, ya que se caracteriza por un aumento general en el eje y, un pico (que corresponde al PPS en lugar de cualquier pico solo), y luego una disminución general en el eje y durante un período de tiempo que es sustancialmente mayor que el de cualquier pico solo. En consecuencia, la forma de campana que corresponde al PPS y su pico cerca del centro de la "campana" no debe confundirse con ningún pico o picos particulares que puedan estar presentes en el gráfico.

Las Figuras 10-13 muestran varias curvas de absorción de CE para una sola muestra de Cartrophen®, una sustancia que contiene PPS disponible comercialmente.

Para los análisis de CE que se describen en la presente descripción, se usó un sistema de electroforesis capilar Beckman-Coulter Pace/MDQ para analizar las formulaciones que comprenden PPS. El método usado fue sustancialmente similar al método que describieron Degenhardt y otros en "Quality control of pentosane polysulfate by capillary zone electrophoresis using indirect detection", Journal of Chromatography A 817 (1998). Se usaron columnas de sílice fundida. El capilar se pretrató con NaOH 1 M. La electroforesis se realizó mediante el uso de ácido benceno-1,2,4-tricarboxílico (BTC). El BTC se preparó mediante el uso de 368 mg de BTC (obtenido de Sigma) y 50 mL de agua desionizada. El pH se ajustó a 4,9 mediante el uso de NaOH 0,1 M. Se adicionó agua hasta 200 mL, lo que resultó en una concentración final de tampón de BTC 8,75 mM a pH 4,9. La electroforesis se realizó mediante el uso de ácido benceno-1,2,4-tricarboxílico (BTC). El BTC se preparó mediante el uso de 368 mg de BTC (obtenido de Sigma) y 50 mL de agua desionizada. El pH se ajustó a 4,9 mediante el uso de NaOH 0,1 M. Se adicionó agua hasta 200 mL, lo que resultó en una concentración final de tampón de BTC 8,75 mM a pH 4,9.

El capilar se enjuagó con tampón de corrida durante 60 minutos antes de la primera medición de electroforesis capilar, y luego 10 minutos entre las mediciones de CE con tampón de corrida. Todos los reactivos y muestras se filtraron a través de un filtro de 0,45 micrómetros antes de su uso. La inyección se realizó durante 20 segundos mediante el uso de una presión de 0,5 psi. El capilar se sumergió en BTC para enjuagar cualquier residuo de muestra en el exterior del capilar. La CE se ejecutó a 20 kV durante 20 a 40 minutos.

Se aplicó polaridad inversa como se describe en Degenhardt (1998). La absorción del electrolito de fondo se monitoreó a una longitud de onda de 217 nm. La efectividad de la separación por peso molecular en el capilar se determinó al analizar la separación de los diferentes oligosacáridos de Cartrophen®. Las muestras de Cartrophen® se diluyeron con agua de 100 mg/mL a 3 mg/mL. El capilar tenía las siguientes propiedades: detección 217 nm, 67 cm de longitud total del capilar, 50 cm de longitud efectiva, 50 pm de diámetro interior.

Las Figuras 10-13 representan los resultados de aplicar estos métodos a una solución que contiene Cartrophen® en una concentración de aproximadamente de 3 mg/mL de agua. Se apreciará que se pueden obtener resultados similares mediante el uso de concentraciones de muestra de PPS de aproximadamente de 1 a aproximadamente 5 mg/mL. Estas figuras representan electroferogramas progresivamente más resueltos de una sola muestra, que se obtienen al extender los tiempos de migración con acondicionamiento de columna adicional. Como muchas de las figuras discutidas anteriormente, los picos del borde delantero en los picos de PPS de estos gráficos indican la presencia de pequeños oligosacáridos.

La Figura 14 muestra un electroferograma ilustrativo de materia prima de PPS sola, presente en agua en una concentración de aproximadamente 2 mg/mL. El PPS se obtuvo de Nature Vet, Australia (número de lote M62004037). La curva en forma de campana relativamente suave en el electroferograma muestra una falta de oligosacáridos pequeños y un peso molecular sustancialmente homogéneo del PPS. En este gráfico, está claro que la altura y el área de cualquiera de los picos en el borde delantero de la curva en forma de campana son insignificantes en comparación con el tamaño y el área de la curva en forma de campana general que corresponde al PPS. Este mismo fenómeno se puede observar en otros electroferogramas que corresponden a diversas modalidades de la invención como se describe a continuación, por ejemplo, en las Figuras 16A-17B.

Las Figuras 15A y 15B muestran electroferogramas para una formulación de PPS comercialmente disponible más de dos años después de que se preparara la formulación. Antes del análisis de CE, esta formulación se envejeció durante más de dos años después de su creación. Durante una porción sustancial de ese período de tiempo, la muestra no se refrigeró y se expuso a temperaturas significativamente mayores a la temperatura ambiente (es decir, mayores que 18-27 grados Celsius). Durante ese período de tiempo, el color de la formulación se volvió marrón oscuro de un color pajizo original a amarillo claro. Las dos curvas de las Figuras 15A y 15B se ven ligeramente diferentes debido a la escala de las ordenadas para mostrar todo el pico a los 15 minutos aproximadamente. El contenido de esta formulación (número de lote G103 de Nature Vet, Australia) se describe en la Tabla 1, a continuación. En algunas modalidades, esta formulación puede usarse para el tratamiento de equinos, por ejemplo, mediante inyección.

Tabla 1

Cada electroferograma en las Figuras 15A y 15B exhibe un solo pico alto agudo 1510, 1520 cerca de la mitad del pico de PPS, lo que indica un producto de degradación sospechoso. Estos picos a veces se denominan como "picos de degradación". Aquí, cada uno de los picos 1510, 1520 en las Figuras 15A y 15B está en la parte media izquierda del pico de PPS. Un solo pico alto agudo similar también está presente en las Figuras 21 y 24, las cuales corresponden a formulaciones que contienen PPS de la presente invención, y la Figura 24, la cual corresponde a una muestra de Cartrophen®, cada uno sometido a degradación forzada por tratamiento con hidróxido de sodio. En consecuencia, estos picos de degradación en las Figuras 15A y 15B muestran un ejemplo de la degradación que puede producirse en formulaciones de PPS con el tiempo, por ejemplo, para una formulación comercialmente disponible.

Las Figuras 16A-20B muestran análisis de electroforesis capilar de doce formulaciones ilustrativas de PPS. Las doce formulaciones se identifican a continuación en la Tabla 2. Las muestras 1B, 1C, 2B, 2C, 3B, 3C son modalidades de la invención, las muestras 1A, 1D, 2A, 2D, 3A, 3D no son parte de la invención reivindicada.

Estas formulaciones se prepararon de acuerdo con los métodos que se describieron anteriormente.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán que algo o todo el metabisulfito de sodio se convierte en dióxido de azufre y bisulfito de sodio al adicionarlo a la formulación. También se debe señalar que la tercera columna de la izquierda, que representa el pH, es un pH esperado en lugar de un pH medido. El pH medido ("mpH") se proporciona en la última columna de la derecha. Aunque en realidad no se midió el pH para las formulaciones de las muestras 2 y 3, estas muestras deberían ser casi idénticas a aquellos que se midieron para las formulaciones del grupo 1 debido a su similitud química. Por lo tanto, se espera que el pH para las formulaciones 2B y 3B sea sustancialmente el mismo que el medido para 1B, es decir, aproximadamente pH 4,15.

Tabla 2

En consecuencia, se evaluaron doce formulaciones, que incluyen cuatro de la muestra 1 (1A-1D), cuatro de la muestra 2 (2A-2D), y cuatro de la muestra 3 (3A-3D). Estas doce formulaciones parecen comprender una mezcla más homogénea de pesos moleculares en lugar de una mezcla más polidispersa de un intervalo más amplio de pesos moleculares como se encontró en otras formulaciones tales como Cartrophen®, el cual se ha demostrado que contiene una mezcla de moléculas de PPS con un intervalo de tamaños que parecen incluir oligosacáridos discretos más pequeños junto con tamaños más grandes. De estas doce, se identificó que las formulaciones 1A-1C, 2A-2C, y 3A-3C tenían propiedades especialmente convenientes. En particular, estas nueve formulaciones tampoco mostraron degradación ni cambio de color después de la esterilización terminal o el almacenamiento (por ejemplo, almacenamiento sin refrigeración, tal como a temperatura ambiente). Finalmente, las formulaciones 1B, 1C, 2^b , 2C, 3B, y 3C tienen un intervalo de pH fisiológicamente más compatible que se espera que no sea irritante cuando se inyecta.

Se debe señalar que se midió que los tres grupos "A" tenían propiedades sustancialmente similares bajo análisis de CE en todas las muestras, al igual que las formulaciones "B", "C", y "D". En otras palabras, los electroferogramas eran sustancialmente idénticos para 1c , 2C, y 3C, por ejemplo.

Los gráficos de las Figuras 16A-20B muestran curvas en forma de campana sustancialmente suaves, lo que indica que el PPS en estas formulaciones está sustancialmente libre de oligosacáridos que tienen pesos moleculares heterogéneos o impurezas tales como oligosacáridos más pequeños. Como se señaló anteriormente, los resultados para cada grupo (A-D) fueron consistentes en todas las muestras (1-3). En otras palabras, los resultados para la formulación 1B fueron sustancialmente idénticos a los resultados que se obtuvieron para las formulaciones 2B y 3B. La observación física de las muestras a través de estas pruebas reveló que todas las muestras en los grupos "A", "B", y "C" permaneció sustancialmente transparente y libre de decoloración. Se ha observado que las muestras de la técnica anterior, así como también las muestras del grupo "D", se vuelven marrones bajo condiciones similares. En la actualidad no se conoce exactamente qué causa la decoloración, tal como la decoloración marrón observada, aunque claramente representa un cambio en la formulación química de la muestra y, por lo tanto, es una indicación de degradación.

Las Figuras 17A-20B muestran electroferogramas para muestras A-D, respectivamente, antes y después de la esterilización terminal. Las figuras marcadas con una "A" (como en las Figuras 17A, 18A, 19A, y 20A) muestran electroferogramas para muestras que no se esterilizaron antes de la medición. Las figuras marcadas con una "B" (como en las Figuras 17B, 18B, 19B, y 20B) muestran electroferogramas para muestras que se esterilizaron terminalmente antes de la medición. Por lo tanto, por ejemplo, las Figuras 20A y 20B muestran electroferogramas para la formulación "D", respectivamente, antes y después de la esterilización terminal.

Para obtener estos resultados, se tomaron mediciones de CE para dos viales de cada una de las 12 mezclas (que se muestran en la Tabla 2). Un vial no era estéril, y el otro se esterilizó terminalmente a 121 °C durante 15 minutos. La concentración de PPS era inicialmente de 250 mg/mL para cada vial. Se observó que las muestras del grupo A tenían un color pajizo pálido. Se observó que las muestras del grupo B tenían un color pajizo. Se observó que las muestras del grupo C tenían un color amarillo. Todas las muestras se diluyeron a 2,5 a 3 mg/mL en agua en 200­ 250 |^jL de muestra en viales de inyección. El análisis de CE se llevó a cabo al aplicar 20 kV hasta por 40 minutos. Los electroferogramas de las muestras esterilizadas y no esterilizadas muestran que el pico de PPS no se alteró sustancialmente por la esterilización. En los electroferogramas de cada muestra, la porción de PPS de la curva (es decir, la curva general en forma de campana durante varios minutos que tiene un pico gradual en el medio de la "campana") no muestra productos de degradación apreciables ya sea antes o después de la esterilización. (Se debe señalar que, para verificar que un electroferograma muestre una curva en forma de campana sustancialmente suave, se recomienda verificar primero que los métodos de CE que se usaron para obtener los resultados sean capaces de detectar heterogeneidad en otras muestras).

Adicionalmente, las muestras de los grupos A, B, y C no se decoloraron después de la esterilización. Sin embargo, se observó que la muestra del grupo D se oscurecía después de la esterilización. Además, como se muestra en su electroferograma en la Figura 20B, la muestra del grupo D exhibió un aumento en los picos en el borde delantero de la curva de PPS después del autoclave, aunque los picos aún son relativamente pequeños en comparación con la forma de campana de la curva de PPS. Aparece un gran pico cerca de los 22-25 minutos en todos los electroferogramas de las muestras del grupo D. Se produjo un pico de aspecto similar cerca de los 22-25 minutos en una solución de citrato de sodio con un pH ajustado a 4,0 con HCl y a 14,7 mg/mL, diluido a 147 jg/mL para que coincida con las muestras del grupo D. Por lo tanto, el pico de aspecto similar en los electroferogramas de las muestras del grupo D a los 22-25 minutos probablemente corresponde al citrato, el cual está presente en las muestras del grupo D pero no en las otras muestras.

De acuerdo con diversas modalidades de la invención, el análisis de CE puede usarse para detectar productos de degradación en formulaciones de PPS, por ejemplo, después de la degradación forzada de la muestra. Por ejemplo, diversas formulaciones de la presente invención se sometieron a degradación forzada. El análisis de CE de estas muestras mostró la presencia de un pico de degradación, de esta manera indica la degradación del PPS como un resultado de la degradación forzada. También se usó el análisis de CE para mostrar que al menos una formulación disponible comercialmente exhibe degradación después de someterse a condiciones de degradación tales como envejecimiento y calor (ver las Figuras 15A y 15B).

Las Figuras 21, y 22A-23B muestran electroferogramas de muestras del grupo C después de la degradación forzada. Las Figuras 21, 23A, y 23B cada una muestra la presencia de un pico alto 2110, 2310, 2320 que se produce entre 9 y 10 minutos que indica un producto de degradación. Se observa un pico de degradación similar 1510 en el PPS degradado naturalmente que se ve en las Figuras 15A y 15B. Se observó adicionalmente que las muestras del grupo "C" permanecieron sustancialmente claras y no exhibieron coloración marrón u otra decoloración a lo largo de estas pruebas de degradación forzada. Se ha observado que las formulaciones de PPS de la técnica anterior se vuelven marrones con el tiempo con la presencia de un producto de degradación visible en el electroferograma (por ejemplo, las Figuras 15Ay 15B).

La Figura 21 muestra un electroferograma para una muestra del grupo "C" después de la degradación forzada con hidróxido de sodio 0,1 N durante 24 horas a 60 °C, neutralizada con HCl y acetato de sodio. (Se colocó un vial que contenía una muestra del grupo C en un baño de agua caliente que se mantiene a 60 °C durante 24 horas antes del análisis de CE). El gráfico muestra una curva sustancialmente en forma de campana que indica la presencia de PPS. El primer pico grande en el gráfico representa el anión cloruro del ácido clorhídrico que se usó para la neutralización antes de la prueba. El segundo pico grande representa el sulfato. La cantidad de sulfato (como indica la altura del pico de sulfato en el electroferograma) aumenta debido al sulfato libre que se genera durante la degradación forzada. El electroferograma muestra picos adicionales a 8-9 minutos, los cuales se asocian con el cloruro y no se derivan del pentosano. (Se cree que estos picos representan un anión asociado con el cloruro debido a que aparecen cuando se prueba el NaCl). La curva restante es esencialmente en forma de campana excepto por el pico agudo discreto en el medio de la porción del pentosano del gráfico, que indica un producto de degradación.

Las Figuras 22A y 22B muestran electroferogramas de las muestras 1C (Figura 22A) y 2C (Figura 22B) después de 24 horas de exposición a ácido HCl 0,1 N y calor (60 °C). La degradación bajo condiciones ácidas es más severa que en condiciones básicas y altera el electroferograma, de manera que ya no mantiene una distribución homogénea de moléculas de ^p P^s .

Las Figuras 23A y 23B muestran electroferogramas de muestras 1C y 2C, respectivamente, después de degradación forzada con hidróxido de sodio 0,1 N durante 24 horas a 60 °C, neutralizado con ácido acético. Como en la Figura 21, los electroferogramas de las Figuras 23A y 23B muestran una curva sustancialmente en forma de campana que indica la presencia de PPS. También está presente un pico agudo de un producto de degradación. La Figura 24 muestra un electroferograma de una muestra de Cartrophen® después de la degradación forzada con hidróxido de sodio 0,1 N durante 24 horas a 60 °C. En comparación con la degradación forzada correspondiente a las muestras del grupo "C", hay sustancialmente menos PPS presente, como lo indica la curva de PPS en forma de campana más pequeña y el pico más corto correspondiente. Como en las Figuras 23Ay 23B para las muestras 1C y 2C, el electroferograma de la Figura 24 muestra un pico de degradación 2410 en Cartrophen® después de la degradación forzada. Además, se observó que la muestra de Cartrophen® se decoloraba al volverse de un color marrón claro.

Las Figuras 25A-28B muestran electroferogramas para muestras esterilizadas y no esterilizadas que comprenden PPS que se almacenó a diferentes temperaturas. En estos y posteriores análisis, la longitud capilar efectiva se incrementó de 50 cm a 70 cm, lo que resultó en migraciones más largas para los componentes de sulfato y PPS. Las Figuras 25A y 25B muestran electroferogramas de la formulación 1A (Tabla 2) no esterilizada (Figura 25A) y esterilizada en autoclave durante 15 minutos a 121 °C (Figura 25B), luego almacenado a 5 ° durante 3 meses. Como se muestra en las Figuras 25A y 25B, los electroferogramas de las muestras esterilizadas y no esterilizadas son muy similares. Parece haber poco efecto de la esterilización sobre la formulación de la presente invención, con un ligero aumento en el pico de sulfato y un ligero aumento en el pico de oligosacárido a los 10,5 minutos. Ninguna muestra cambió de color ni de cualquier otra manera exhibió la decoloración marrón clara que caracterizó a la muestra de Cartrophen® después de la degradación forzada.

Las Figuras 26A y 26B muestran electroferogramas de la formulación 1A (Tabla 2) no esterilizada (Figura 26A) y esterilizada en autoclave durante 15 minutos a 121 °C (Figura 26B), luego almacenada a 40 °C y 75 % de humedad relativa durante 3 meses. Los electroferogramas de las Figuras 26A y 26B casi no muestran indicación de un pico de pentosano, pero sí muestran un aumento muy grande en el pico de sulfato. Aquí, la aplicación del método de CE a estas muestras muestra la degradación del p Ps en las muestras en un entorno de alta temperatura con el tiempo. Las Figuras 27A y 27B muestran electroferogramas de la formulación 1B (Tabla 2) no esterilizada (Figura 27A) y esterilizada en autoclave durante 15 minutos a 121 °C (Figura 27B), en donde ambas formulaciones se almacenaron luego a 5 °C durante 3 meses. Como se muestra en las Figuras 27A y 27B, los electroferogramas de las muestras esterilizadas y no esterilizadas son muy similares. Se observó que la esterilización tenía poco o ningún efecto sobre la formulación de pentosano. La muestra esterilizada permaneció estable sin picos de degradación detectables bajo condiciones de almacenamiento en frío. Ninguna muestra cambió de color ni de cualquier otra manera exhibió la decoloración marrón clara que caracterizó a la muestra de Cartrophen® después de la degradación forzada.

Las Figuras 28A y 28B muestran electroferogramas de la formulación 1B (Tabla 2) no esterilizada (Figura 28A) y esterilizada en autoclave durante 15 minutos a 121 °C (Figura 28B), luego almacenada a 40 °C y 75 % de humedad relativa durante 3 meses. Como se muestra en las Figuras 28A y 28B, los electroferogramas de las muestras esterilizadas y no esterilizadas son muy similares. Se observó que la esterilización tenía poco o ningún efecto sobre la formulación de pentosano. La muestra esterilizada permaneció estable sin picos de degradación detectables bajo condiciones de almacenamiento de alta temperatura. Ninguna muestra cambió de color ni de cualquier otra manera exhibió la decoloración marrón clara que caracterizó a la muestra de Cartrophen® después de la degradación forzada.

En algunos experimentos, se tomaron pasos adicionales para asegurar adicionalmente mediciones de CE confiables y resolución de picos de manera suficiente para asegurar la detección de fragmentos de degradación y/o pequeños oligosacáridos en formulaciones de pentosano de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, para los métodos de CE que se usaron para producir los electroferogramas de las Figuras 29 y 30A-33B, cada capilar nuevo se acondicionó con NaOH 1 N durante un período de tiempo, en algunos casos de hasta 3 horas. Para algunas muestras, se incluyó un estándar interno (ver las Figuras 29, 30B y 31B) y/o un estándar de referencia (ver las Figuras 32 y 33B) para garantizar una cuantificación capilar y una resolución suficientes para la detección de pentosano. Adicionalmente, se encontró que un capilar de 50 cm de longitud efectiva, 50 pm de diámetro interior muestra el tiempo de migración del pico de sulfato a 6,0-8,0 minutos, el tiempo de migración del estándar interno de perclorato a 6,70-9,0 minutos, y el pico principal de formiato a 12-16 minutos (ver las Figuras 33A y 33B). El pico principal de formiato, que se detecta en una muestra que contiene 10 pg/mL de formiato de sodio y 3 mg/mL de pentosano, debe servir como un límite de manera que el área que define la curva del electroferograma desde el lado derecho (es decir, el lado trasero) del pico de formiato hasta el extremo derecho del pico ancho de pentosano en forma de campana sea al menos 50 % del área total atribuida al pentosano. Como se usa en la presente descripción, el término "Estándar de Resolución de Picos" se refiere al uso de un estándar interno o de referencia y los otros controles de calidad y métodos que se describen en este párrafo.

Para una resolución óptima de pentosano mediante el uso de CE, la resolución (R) de los picos de sulfato y perclorato debe ser de al menos 2,30 mediante el uso de concentraciones de aniones de sulfato y perclorato de

50 ug/ml y el método de la Farmacopea de los Estados Unidos para calcular la resolución en la cual la resolución R=[2(t2-t1)]/[W2+W1], donde t2 y W2 son el tiempo de migración del perclorato y el ancho del pico, y t1 y W1 son el tiempo de migración del sulfato y el ancho del pico, respectivamente. Como se usa en la presente descripción, los picos en un electroferograma (por ejemplo, que corresponden a perclorato y sulfato) satisfacen el "Estándar de Resolución Óptima" cuando la resolución (R) para aquellos picos es al menos 2,30 de acuerdo con el método de la Farmacopea de los Estados Unidos que se describió anteriormente para calcular la resolución.

En algunas modalidades, el porcentaje del área total del pico de PPS atribuible a los picos secundarios (por ejemplo, en el borde delantero del pico de p Ps ) puede variar de 4 a 7 %, mientras que el porcentaje atribuible a cualquier pico secundario solo puede ser de 1 a 1,5 %.

En algunas modalidades, el porcentaje del área total del pico de PPS atribuible a los picos secundarios (por ejemplo, en el borde delantero del pico de PPS) puede variar de 3 a 12 %, mientras que el porcentaje atribuible a cualquier pico secundario solo puede ser de 0,5 a 3 %.

La homogeneidad de una muestra de pentosano puede determinarse al calcular el tamaño relativo de los pequeños picos de oligosacáridos como un porcentaje del pico de pentosano total en un electroferograma de una muestra de pentosano. Como se usa en la presente descripción, una muestra de pentosano que cumple con un "Estándar de Homogeneidad de Pentosano" es una muestra para la cual los picos discretos que se detectan en un electroferograma en la porción ascendente del pico de pentosano (es decir, la porción de la curva atribuible a pentosano), que excluye el pico debido al sulfato libre, colectivamente comprende menos de 5 % del área total atribuible al pentosano (en donde el área se calcula mediante el uso de la integración de valle a valle para picos individuales), y en donde no más de 1,0 % del área total del pentosano se contiene en un solo pico.

La Figura 29 muestra un electroferograma del anión perclorato en una muestra de perclorato de sodio. Se detectaron dos picos: un pico principal agudo a los 12 minutos (291), y un pico más pequeño menos agudo aproximadamente a los 17 minutos (292).

Las Figuras 30A y 30B muestran un electroferograma de una muestra de pentosano (Cartrophen®) en la ausencia (Figura 30A) y presencia de perclorato adicionado como estándar interno (IS) (Figura 30B). El tiempo de migración del pico de perclorato aparece después del pico de sulfato y antes de la aparición de cualquiera de los picos de oligosacáridos que caracterizan al control positivo. Este tiempo de migración lo hace adecuado como un estándar interno que se puede adicionar a las muestras de pentosano y usarse para monitorear la recuperación para la cuantificación.

Las Figuras 31A y 31B muestran un electroferograma de API pentosano diluido en agua en la ausencia (Figura 31A) y presencia (Figura 31B) de perclorato adicionado que se usó como un estándar interno (311). El pico de perclorato aparece después del pico de sulfato y antes de la aparición de cualquiera de los picos menores que preceden al pico ancho sustancialmente homogéneo del pentosano.

La Figura 32 muestra un electroferograma del anión formiato presente en el formiato de sodio. Aparece un pico grande agudo a los 22,5 minutos y un pico mucho más pequeño a los 29 minutos aproximadamente. La falta de cualesquiera otros picos y el hecho de que estos tiempos de migración aparecen en ambos lados del pico principal de pentosano hace que este anión sea un estándar de referencia interno útil (321) para definir los criterios de rendimiento capilar aceptable para analizar muestras de pentosano.

Las Figuras 33A y 33B muestran un electroferograma de API pentosano diluido en agua en la ausencia (Figura 33A) y presencia (Figura 33B) de formiato adicionado. Los picos de formiato (331) aparecen a ambos lados del pico ancho principal que caracteriza al pentosano. Por lo tanto, los picos de formiato pueden servir como marcadores de su posición y distancia relativa desde los picos estándar internos de sulfato (332) y perclorato (333).

51 bien diversas modalidades de la presente invención se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado solo a manera de ejemplo, y no como limitación. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no deben estar limitados por ninguna de las modalidades ilustrativas que se describieron anteriormente, sino que deben definirse solo de acuerdo con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación líquida que comprende polisulfato de pentosano (PPS) a una concentración de 25 mg/mL a 500 mg/mL y un antioxidante que se selecciona del grupo que consiste en metabisulfito de sodio y bisulfito de sodio a una concentración de 0,02 % p/v a 5 % p/v de la formulación, en donde la formulación es estable sin refrigeración en una solución que tiene un pH en el intervalo de 4 a 8.

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos uno de un quelante, un tampón y un agente antimicrobiano.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 2, en donde el agente antimicrobiano se selecciona del grupo que consiste en metilparabeno, propilparabeno, y alcohol bencílico, y en donde el agente antimicrobiano está presente en una concentración de 0,05 % p/v a 0,2 % p/v de la formulación

4. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente EDTA a una concentración de 0,1 mM a 1 mM.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un aminoazúcar.

6. La formulación de conformidad con la reivindicación 5, en donde el aminoazúcar está presente a una concentración de 25 mg/mL a 500 mg/mL para inyección.

7. La formulación de las reivindicaciones 5 o 6, en donde el aminoazúcar se selecciona del grupo que consiste en clorhidrato de glucosamina, galactosamina, sulfato de glucosamina, fosfato de glucosamina, N-acetilglucosamina, manosamina, mezclas o sales de los mismos.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente ácido hialurónico, preferentemente en una concentración de 0,1 mg/mL a 50 mg/mL para inyección.

9. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha formulación es una formulación inyectable.

10. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso como un anticoagulante y/o para tratar la artritis.

11. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento de cistitis intersticial, encefalopatía espongiforme transmisible (TSE), virus de inmunodeficiencia, hematomas, hemorroides, sabañones, quemaduras, trombosis o ateroesclerosis.