BR102012016298A2

BR102012016298A2 - composiÇÕes e mÉtodos para formulaÇÕes de polissacarÍdeo estabilizadas

Info

Publication number: BR102012016298A2
Application number: BRBR102012016298-9A
Authority: BR
Inventors: Dongling Su; Julia Hwang; Brooks J Story
Original assignee: Depuy Mitek Inc
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2013-07-09
Also published as: AU2012203580A1; EP2540284B1; US20140088038A1; EP3260116B1; US20130005681A1; EP2540284A3; EP2540284A2; JP2013014586A; AU2012203580B2; CN102846653A; CN108125980A; US8623839B2; BR102012016298B1; CA2782122A1; JP6113424B2; EP3260116A1

Abstract

Patente de Invenção: COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA FORMULAÇOES DE POLISSACARÍDEO ESTABILIZADAS. A presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de condições das articulações, como osteoartrite e/ou a dor associada a ela. As composições e métodos utilizam um primeiro componente, a saber ácido hialurônico (HA), em combinação com pelo menos um estabilizante. A composição pode incluir um estabilizante que aumenta a estabilidade e a vida útil do HA. Em outra modalidade, as composições e métodos podem também incluir um componente adiciona, como um ou mais glicosaminoglicanos (GAG) ou precursores do GAG. Exemplos de GAGs ou precursores de GAG podem incluir sulfato de condroitina (CS), sulfato de dermatano, heparina, sulfato de heparano, sulfato de queratano e glicosamina (GIcN).

Description

Λ 1/43

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA FORMULAÇÕES DE POLISSACARÍDEO ESTABILIZADAS".

CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se em geral às composições e méto

dos para tratamento das articulações.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Osteoartrite ("OA"), a forma mais comum da artrite, é um tipo de artrite que é caracterizada por alterações degenerativas (deterioração gra10 dual da articulação) ou anormais do osso, da cartilagem e da sinóvia das articulações. A OA é caracterizada por um desgaste progressivo das superfícies de articulações opostas acompanhado às vezes por inflamação que resulta em dor, inchaço e rigidez da junta. OA pode ocorrer em um ou mais articulações, seguido por trauma da articulação, seguido de uma infecção da 15 articulação ou simplesmente como resultado do envelhecimento. Além disso, há evidências emergentes de que anatomia anormal, genética e obesidade podem contribuir para o desenvolvimento precoce da OA.

O tratamento da OA em geral envolve uma combinação de exercícios, terapia física, modificação do estilo de vida e analgésicos. Acetaminofeno é tipicamente o tratamento de primeira linha para a OA. Para sintomas de brandos a moderados, a eficácia é semelhante à dos fármacos antiinflamatórios não-esteroidais ("AINEs"), como ibuprofeno. Para sintomas mais severos, os AINEs podem ser mais eficazes. Entretanto, embora sejam mais eficazes, os AINEs em casos graves são associados a maiores efeitos colaterais como sangramento gastrintestinal e complicações renais. Uma outra classe de AINEs, inibidores seletivos da COX-2 (como Celecoxib), são tão eficazes quanto os AINEs, porém não são mais seguros em termos de efeitos colaterais. Existem vários AINEs disponíveis para uso tópico, incluindo diclofenaco. Tipicamente, eles apresentam menos efeitos colaterais sistêmicos do que a administração oral e pelo menos alguns efeitos terapêuticos. Embora os analgésicos opioides, como a morfina e fentanila, melhorem a dor, este benefício é suplantado pelos eventos adversos freqüentes e, deste modo, eles não são rotineiramente usados. Injeções de esteroides intra-articulares também são usadas no tratamento de OA, e elas são muito eficazes em proporcionar alívio de dores, especificamente em pacientes que apresentam elementos inflamatórios de OA. Entretanto, a duração do alívio 5 de dores é limitada a 4 a 6 e há efeitos adversos que podem incluir danos à cartilagem colaterais. Se a dor se tornar debilitante, a cirurgia de substituição de articulação pode ser usada para otimizar a mobilidade e a qualidade de vida. Não há tratamento provado para Ientificar ou reverter a doença.

Para pacientes que não conseguem o alívio de dores adequado usando simples aliviadores de dor, como acetaminofeno ou de terapia de exercícios e física, injeções intrarticulares do ácido hialurônico (HA) proporcionam outra opção de tratamento para tratar dor sintomática e podem retardar a necessidade de uma cirurgia de substituição de articulação total. Sabe-se que a concentração e o peso molecular de HA nativo é deficiente em indivíduos que sofrem de OA e, portanto, acredita-se que injeções na articulação de HA exógeno restaurem essas moléculas e restabeleçam as propriedades viscoelásticas do fluido sinovial. É esta a propriedade que é responsável por lubrificar e amortecer as articulações. Há também evidências de que HA tem atividade biológica através da ligação aos receptores da superfície celular e pode ter um papel na mitigação da inflamação e degradação da cartilagem. Independentemente do mecanismo de ação, o alívio de dores é observado durante cerca de seis meses após o curso do tratamento. Um curso de tratamento para produtos HA no mercado norte-americano pode variar na faixa de uma única injeção até outros que requerem de 3 a 5 injeções semanais para atingir esta durabilidade de alívio de dores.

Atualmente, formulações de ácido hialurônico ("HA”) no mercado nos Estados Unidos são comercializadas como soluções de HA líquidas prontas para uso em seringas pré-cheias. Elas podem ser armazenadas à temperatura ambiente, e tipicamente apresentam uma vida útil de dois anos. 30 Embora HA de peso molecular baixo a moderado possa ser eficaz, fórmulas de HA de alto peso molecular podem proporcionar benefícios adicionais, especificamente em concentrações de HA mais elevadas. Entretanto, o HA em solução é conhecido por degradar ao longo do tempo à temperatura ambiente, conforme medido por redução no peso molecular do HA, que poderia impactar a sua eficácia como uma terapia da OA.

Ainda permanece uma necessidade por métodos e composições 5 aprimoradas para tratamento das articulações, e, em particular, aos métodos e composições aprimorados para tratamento das articulações com o uso de HA de alto peso molecular, sozinhos ou combinados com componentes adicionais, para tratar os problemas de estabilidade e de vida útil associados com os tratamentos atuais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos são fornecidos para o tratamento de condições da articulação, como osteoartrite e/ou a dor associada com ela. Os métodos e composições apresentados na presente invenção são em geral direcionados aos tratamentos das articulações utilizando um primeiro 15 componente, a saber, ácido hialurônico ("HA"), juntamente com pelo menos um estabilizante.

Em um aspecto, formulações ou composições são apresentadas para o tratamento de uma condição de articulação que compreende uma formulação. A formulação ou composição pode estar na forma líquida. A formulação pode também ser estável em temperatura ambiente. Além disso, a formulação pode incluir uma solução de ácido hialurônico (HA). A formulação de HA pode ser um HA de alto peso molecular. O peso molecular pode ser, por exemplo, de 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000 kDa ou mais, ou qualquer faixa derivável nisso. Em modalidades exemplificadoras, o HA tem um peso molecular na faixa de cerca de 1 MDa a 6 MDa. Em uma outra modalidade exemplar, o HA tem um peso molecular maior que 1 MDa.

Além disso, a formulação de HA pode estar presente em concentrações particulares na forma líquido, sólida ou liofilizada. Em uma modalídade, o HA está presente em uma concentração líquida de pelo menos cerca de 1 mg/mL. Em uma outra modalidade exemplar, o HA tem uma concentração líquida de pelo menos cerca de 5 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 7 mg/mL, e com mais preferência de pelo 5 menos cerca de 10 mg/mL, e com mais preferência pelo menos cerca de 15 mg/mL, e em algumas modalidades a concentração pode ser de pelo menos cerca de 25 mg/mL. Em outra modalidade, o HA pode possuir uma concentração na faixa de cerca de 15 mg/mL a cerca de 25 mg/mL.

Em um outro aspecto, a formulação ou composição inclui pelo menos um componente adicional. O componente adicional adicionado à formulação ou composição pode ser, por exemplo, aminoácidos, açúcares amino, álcoois de açúcar, proteínas, sacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, tampões, tensoativos, lipídeos, lipossomas, outros excipientes e misturas dos mesmos. Outros componentes úteis podem incluir esteroides, agentes antiinflamatórios, agentes antiinflamatórios não-esteroidais, analgésicos, células, antibióticos, agentes microbicidas, agentes antiinflamatórios, fatores de crescimento, fragmentos de fator de crescimento, estimulantes de cicatrização de feridas de moléculas pequenas, hormônios, citocinas, peptídeos, anticorpos, enzimas, células isoladas, plaquetas, imunossupressores, ácidos nucleicos, tipos de células, vírus, partículas virais, nutrientes essenciais, minerais, metais ou vitaminas, e combinações dos mesmos. Adicionalmente, a formulação ou composição pode incluir um diluente, como água, solução salina ou um tampão.

Em uma modalidade exemplificadora, a formulação ou compo25 sição inclui pelo menos um estabilizante ou excipiente estabilizante, como tocoferol, derivados do tocoferol, manitol, glicose, sacarose e trealose. Os estabilizadores podem estar presentes na faixa de cerca de 0,1 a 70%, em peso; de cerca de 0,1 a 50%, em peso, de cerca de 0,1 a 20%, em peso; ou de cerca de 0,5 a 20%, em peso. Alternativamente, o excipiente pode estar 30 presente em uma concentração na faixa de cerca de 1 mg/mL a cerca de 700 mg/mL, e com mais preferência na faixa de cerca de 1 mg/mL a cerca de 500 mg/mL, e com mais preferência na faixa de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, e com mais preferência na faixa de cerca de 5 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Em um outro aspecto, a formulação ou composição inclui pelo menos um componente adicional, como um glicosaminoglicano (GAG), incluindo GAGs tipo sulfato de condroitina ("CS"), sulfato de dermatano, heparina, sulfato de heparano e sulfato de queratano, ou um precursor da GAG como glicosamina ("GlcN"). Em uma modalidade, um precursor de GAG ou GAG pode estar presente na composição a uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 2 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 5 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 7 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 20 mg/mL. Em outra modalidade, as GAGs podem possuir vários pesos moleculares, porém em certas modalidades exemplificadoras o peso molecular está na faixa de cerca de 5 a 1.000 KDa, com mais preferência na faixa de cerca de 6 a 500 KDa, com mais preferência na faixa de cerca de 7 a 300 KDa, com mais preferência na faixa de cerca de 8 a 200 KDa1 com mais preferência na faixa de cerca de 9 a 100 KDa e, com a máxima preferência, na faixa de cerca de 10 a 80 KDa. Em outras modalidades, o peso molecular de um fragmento GAG pode ser abaixo de cerca de 5 KDa e, com mais preferência ainda, abaixo de cerca de 3 KDa. Em outra modalidade, o precursor da GAG pode possuir um peso molecular de cerca de 180 Da Em outras modalidades, o precursor da GAG pode possuir um peso molecular de pelo menos cerca de 100 Da. Em uma modalidade exemplificadora, o precursor da GAG pode possuir um peso molecular na faixa de cerca de 100 Da a cerca de 250 Da.

Além disso, a formulação ou composição pode possuir uma razão entre o peso de HA para estabilizante na faixa de cerca de 1:0,001 a cerca de 1:100, e com mais preferência em uma razão na faixa de cerca de 1:0,0125 a cerca de 1:10, cerca de 1:0,00125 a cerca de 1:100, e com mais 30 preferência em uma razão na faixa de cerca de 1:0,01 a cerca de 1:10. Alternativamente, a formulação ou composição pode incluir cerca de 1% a cerca de 75% ou mais, em peso, de qualquer um dos componentes individuais, por exemplo, HA e um estabilizante.

Um ou mais aspectos pode incluir um kit e métodos de uso do kit. O kit pode incluir uma solução de ácido hialurônico de alto peso molecular (HA) e pelo menos um estabilizante. O kit pode ser armazenado à 5 temperatura ambiente. Adicionalmente, o kit pode incluir uma seringa contendo a solução de HA e o estabilizante em uma câmara única. Outra modalidade pode incluir uma câmara única com a solução de HA e estabilizante e uma câmara separada com um componente adicional, como um precursor de GAG ou GAG. Por exemplo, um glicosaminoglicano (GAG) pode estar 10 presente no kit em uma câmara separada da solução de HA/estabilizante. O componente adicional pode estar presente na forma de líquido, sólido ou liofilizado. O kit pode incluir, ainda, um diluente, como água, solução salina e um tampão, para solubilizar um dos componentes, o componente adicional.

Em um aspecto adicional, um método para o tratamento das arti15 culações é apresentado que inclui a administração de uma formulação líquida que compreende ácido hialurônicode alto peso molecular a um indivíduo necessitado. O método pode incluir o ácido hialurônico de alto peso molecular na presença de um estabilizante. Além disso, o ácido hialurônico de alto peso molecular pode ser armazenado em uma formulação líquida em 20 temperatura ambiente antes da administração. O método pode também incluir a administração da solução de HA presente no kit ou presente na formulação ou composição de HA de alto peso molecular.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos em anexo foram incluídos na presente invenção de 25 modo que as características, vantagens e objetos citados acima se tornarão claros e podem ser compreendidos em detalhes. Esses desenhos formam uma parte do relatório descritivo. Deve ser observado, entretanto, que os desenhos em anexo ilustram modalidades exempIificadoras e não devem ser considerados Iimitantes do escopo.

A figura 1 é uma vista esquemática de uma modalidade de um

sistema de mistura e liberação para uso com as composições e métodos da presente invenção; a figura 2 é uma vista em perspectiva de outra modalidade de um sistema de mistura e liberação para uso com as composições e métodos da presente invenção;

a figura 3 mostra a degradação de HA, conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho-cromatografia líquida de alta eficiência (SEC-HPLC) quando em uma solução salina de HA e CS armazenada a 5°C e 40°C/75% de umidade relativa durante 5 meses;

a figura 4 apresenta o efeito estabilizante que a trealose tem sobre o HA quando em solução com CS armazenado a 5°C e 40°C/75% de umidade relativa durante 5 meses conforme determinado por SEC-HPLC;

a figura 5 é um gráfico que compara as larguras da lesão da cartilagem em um modelo de rasgo do menisco mediano de rato (MMT) que recebeu injeções intrarticulares de trealose com aqueles que não receberam tratamento;

a figura 6 é um gráfico que compara a razão da profundidade da

lesão da cartilagem no modelo MMT de rato que recebeu as injeções intrarticulares de trealose com aqueles que não receberam tratamento;

a figura 7 é um gráfico que compara a degradação do colágeno no modelo MMT de rato que recebeu as injeções intrarticulares de trealose com aqueles que não receberam tratamento;

a figura 8 mostra o efeito que a trealose teve na degeneração da cartilagem do platô da tíbia mediano; e

a figura 9 mostra o efeito que a trealose teve na degradação da cartilagem em um modelo de transecção do ligamento cruzado anterior de coelho (ACLT) da osteoartrite.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Em geral, a presente invenção apresenta composições e métodos para o tratamento de condições da articulação, como osteoartrite e/ou a dor associada com ela. As composições e métodos utilizam um primeiro 30 componente, a saber, ácido hialurônico ("HA") de alto peso molecular, sozinho ou em combinação com um componente adicional, combinado com um estabilizante para prolongar a vida útil. Em uma modalidade exemplificadora, a composição inclui um estabilizante ou excipiente estabilizante para estabilizar HA e, caso esteja presente, um precursor da GAG ou GAG.

Ácido hialurônico

Ácido hialurônico (HA) pode possuir várias formulações e pode ser fornecido em várias concentrações e pesos moleculares. Os termos "ácido hialurônico’', "hialuronano", "hialuronato" e "HA" são usados de maneira intercambiável na presente invenção para se referir aos ácidos hialurônicos ou sais do ácido hialurônico, como os sais de sódio, potássio, magnésio e cálcio, dentre outros. Esses termos também se destinam a incluir não apenas soluções de ácido hialurônico puras, mas também ácido hialurônico com outros elementos traço ou em várias composições com outros elementos. Os termos "ácido hialurônico", "hialuronano" e "HA" abrangem derivados químicos ou poliméricos ou reticulados do HA. Exemplos de modificações químicas que podem ser feitas ao HA incluem qualquer reação de um agente com os quatro grupos reativos de HA, a saber a extremidade acetamido, carboxila, hidroxila e redutora. O HA usado no presente pedido tem por objetivo incluir formulações naturais (isoladas de tecido animal) ou formulações sintéticas (derivadas da fermentação bacteriana) ou combinações dos mesmos. O HA pode ser fornecido na forma líquida ou em formulações sólidas que são reconstituídas com diluentes para atingir uma concentração adequada.

HA é um glicosaminoglicano (GAG), e, em particular, HA é um polissacarídeo não ramificado composto por unidades de ácido glicurônico e N-acetil glicosamina alternadas. Na forma líquida, o HA possui propriedades 25 viscoelásticas. HA também é encontrado na matriz extracelular da cartilagem como um importante componente estrutural do agrecano, que compõe o complexo proteoglicano. A função principal do complexo proteoglicano é reter água na matriz da cartilagem, conferindo a sua característica de turgidez e resiliência mecânica.

HA não apenas ajuda a manter as propriedades mecânicas

saudáveis da cartilagem que amortece as articulações, mas também é um componente principal do fluido sinovial. Anormalidades do HA são uma thread em distúrbios do tecido conjuntivo. HA pode, deste modo, ser usado para evitar, tratar ou auxiliar no reparo cirúrgico de distúrbios do tecido conjuntivo.

HA pode ser usado nas composições e métodos da presente 5 invenção em vários pesos moleculares. Uma vez que HA é uma molécula polimérica, o componente HA pode exibir uma faixa de pesos moleculares, e quase qualquer média de formulação de peso molecular modal de HA pode ser usada nas composições e métodos da presente invenção, incluindo hialuronano de baixo peso molecular ("LWM") (cerca de 500 a 700 quilo10 daltons (kDa), hialuronano de peso molecular médio ("MMW") (700 a 1000 KDa), e hialuronano de alto peso molecular ("HMW") (1,0 a 6,0 milhões de daltons (MDa)). Em certas modalidades exemplificadoras, o HA tem um peso molecular de pelo menos cerca de 700 KDa1 e em certas modalidades, o HA é um HA de alto peso molecular ("HWM") que possui um peso molecular de

pelo menos cerca de 1 MDa. O peso molecular pode ser, por exemplo, de 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 20 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000 kDa ou mais, ou qualquer faixa derivável nisso. Espera-se que HAs quimicamente modificados poderiam possuir pesos moleculares bastante diferentes do que os descritos acima. HA reticulado pode, de modo semelhante, possuir um peso molecular muito alto do que o observado acima. Independentemente, esses materiais 25 também são aplicáveis nesta invenção.

HA pode ser representado na forma sólida, Iiofilizada ou líquida. Quando na forma líquida, solventes podem ser utilizados para solubilizar HA. Solventes podem incluir, mas não se limitam a, água, solução salina ou outras soluções de sal, soluções tampão como solução salina tamponada 30 com fosfato, histidina, lactato, succinato, glicina e glutamato, dextrose, glicerol, bem como combinações dos mesmos.

A concentração do HA presente na formulação pode também variar, porém em uma modalidade exemplificadora HA é fornecido em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Em uma modalidade, o HA possui uma concentração de pelo menos cerca de 1 mg/mL. Em uma modalidade exemplar, o HA tem uma concentração de pelo menos cerca de 5 mg/mL, e 5 com mais preferência de pelo menos cerca de 7 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 10 mg/mL, e com mais preferência pelo menos cerca de 15 mg/mL, e em algumas modalidades a concentração pode ser de pelo menos cerca de 25 mg/mL. Em outra modalidade, o HA pode possuir uma concentração na faixa de cerca de 15 mg/mL a cerca de 10 25 mg/mL. Concentrações adequadas de HA incluem cerca de 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mg, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL,

16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 15 29 mg/mL, 30 mg/mL, 31 mg/mL, 32 mg/mL, 33 mg/mL, 34 mg/mL, 35 mg/mL, 36 mg/mL, 37 mg/mL, 38 mg/mL, 39 mg/mL, 40 mg/mL, 41 mg/mL, 42 mg/mL, 43 mg/mL, 44 mg/mL, 45 mg/mL, 46 mg/mL, 47 mg/mL, 48 mg/mL, 49 mg/mL, 50 mg/mL, 51 mg/mL, 52 mg/mL, 53 mg/mL, 54 mg/mL, 55 mg/mL, 56 mg/mL, 57 mg/mL, 58 mg/mL, 59 mg/L, 60 mg/mL ou mais ou 20 qualquer faixa derivável nisso.

Em uma modalidade, o primeiro componente compreende um HA possuindo um alto peso molecular (1 a 6 MDa) possuindo uma concentração na faixa de cerca de 5 a 40 mg/mL. Um tal produto é Orthovisc® produzido pela Anika Therapeutics, Inc. de Bedford, MA. Orthovisc® é uma 25 solução estéril, não pirogênica, límpida e viscoelástica do hialuronano. Orthovisc® consiste de hialuronano natural ultrapuro de alto peso molecular (1,0 a 2,9 MDa) dissolvido em solução salina fisiológica e apresentando concentrações nominais entre 12,5 e 17,5 mg/mL. Orthovisc® é isolado através de fermentação bacteriana. O versado na técnica reconhecerá que 30 há empresas como Shiseido and Lifecore que podem produzir alto peso molecular HA através de um processo de fermentação bacteriano. Outro exemplo de um produto HA disponível nos Estados Unidos com estas características é Euflexxa .

Estabilizadores

O HA pode ser combinado com pelo menos um estabilizante. Estabilizantes podem ser usados nos métodos e composições da presente 5 invenção. Estabilizantes podem ser açúcares ou derivados, como sacarídeos, dissacarídeos, sacarídeos modificados, álcoois de açúcar ou polissacarídeos. Em uma modalidade exemplificadora, o estabilizante pode ser tocoferol, derivados do tocoferol, glicose, manitol, saca rose e/ou trealose.

Estabilizantes ou excipientes estabilizadores comuns usados na indústria farmacêutica são sacarídeos, dissacarídeos, sacarídeos modificados, álcoois de açúcar e polissacarídeos. Algumas dessas moléculas são comumente usadas como excipientes porque elas também podem servir como um agente adoçante quando o fármaco está na forma de um comprimido para liberação oral. De acordo com a Patente U.S. n°: 7.351.798, ácido hialurônico e glicosaminoglicanos também podem ser excipientes. Por muito tempo acreditou-se que esses polissacarídeos são moléculas estáveis. De fato, todos os materiais de HA que são comercializados nos Estados Unidos são armazenados em temperatura ambiente. Alguns desses produtos de HA estão em soluções tamponadas ou em soluções salinas, mas nenhum possui qualquer outro excipiente incluído. Esses produtos de HA são aprovados nos Estados Unidos como dispositivos de viscossuplementação e são injetados na articulação para aliviar a dor que resulta da osteoartrite. Além disso, um produto no mercado chamado de Viscoat (vendido por Alcon) é uma formulação que incorpora ácido hialurônico e sulfato de condroitina em uma solução tamponada e que não contém nenhum outro excipiente. Este produto é usado em cirurgia oftálmica durante a implantação de lentes intraoculares. Sabe-se que o armazenamento de HA em temperatura ambiente resulta na perda gradual da estabilidade e degradação para reduzir os pesos moleculares, especificamente na presença de outros componentes, como sulfato de condroitina, por isso o requisito de armazenamento refrigerado para o Viscoat

Tocoferol pertence a uma ciasse de compostos químicos que abrangem mono, di e trimetilcotóis. Muitos dos tocoferóis demonstram atividade de vitamina E. Beta, gama e delta são estereoisômeros do alfa-tocoferol. Esteres do tocoferol são comumente usados em produtos cosméticos e de cuidados pessoais. Esses ésteres incluem, acetato de tocoferila, o éster 5 do ácido acético do tocoferol; Iinoleato de tocoferila, o éster do ácido IinoIeico do tocoferol; linoleato/oleato de tocoferila, uma mistura de ésteres do ácido Iinoleico e oleico do tocoferol; nicotinato de tocoferila, o éster do ácido nicotínico do tocoferol; e succinato de tocoferila, o éster do ácido succínico do tocoferol, fosfato de ascorbil tocoferila potássico, um sal tanto da vitamina 10 E (tocoferol) quanto da vitamina C (ácido ascórbico) pode também ser usado em produtos cosméticos.

Outros ingredientes derivados do tocoferol que podem ser encontrados em produtos cosméticos incluem dioleil tocoferil metilsilanol, que é o éter dioleílico do monoéter de acetato de tocoferila com metilsilanotriol, e 15 tocofersolano, que também é chamado de succinato detocoferil polietileno glicol 1000. A adição de ácido succínico e uma média de 22 grupos de óxido de etileno ao tocoferil torna o tocofersolano uma forma solúvel em água do tocoferol.

Manitol também é um estabilizante exemplificador devido à sua 20 baixa capacidade higroscópica, excelente compatibilidade de fármaco química e física, melhor doçura e cinética de dissolução relativamente mais lenta. Ele também possui solubilidade em água relativamente baixa e boa dispersibilidade e é comumente utilizado para melhorar a estabilidade da formulação onde outros excipientes falharam. Manitol pode ser usado em 25 uma ampla variedade de formas de dosagem, incluindo, mas não se limitando, aos comprimidos, cápsulas, sachês, pastilhas, líquidos, emulsões, suspensões, unguentos, pastas, loções e soluções intravenosas.

Manitol também serve como um aditivo formador de matriz para a liofilização. quando usado em concentrações de até 10% em peso por volume, manitol forma uma matriz amorfa (não cristalina) que suporta proteínas e outras biomoléculas para a liofilização. Ele é geralmente inerte e, uma vez liofilizado, se reidrata rapidamente. Sua estrutura amorfa quando congelado evita que ele rompa proteínas enquanto proporciona canais para a sublimação da água durante o processamento.

Semelhante ao manitol, a sacarose também é amplamente usada na forma de comprimido para distribuição oral devido à sua doçura e 5 palatabilidade. Sacarose, é um dissacarídeo não redutor (glicose ligada por seu carbono anomérico à frutose) que é amplamente usada como um Iioprotetor.

Trealose (a-D-glicopiranosil α-D-glicopiranosídeo), um dissacarídeo conhecido por suas propriedades antioxidantes, era conhecido como um 10 sacarídeo não redutor que consiste em glicoses. Tal como é descrito em Advances ín Carbohydrate Chemistry, Vol. 18, pp.201-225 (1963), publicado por Academic Press, EUA, e Applied and Environmental Microbiology, Vol. 56, pp.3,213-3,215 (1990), trealose existe amplamente em microrganismos, cogumelos, insetos, etc., embora o conteúdo seja relativamente baixo. 15 Trealose é um sacarídeo não redutor de modo que ele nem reage com substâncias contendo grupos amino como aminoácidos e proteínas, induz a reação amino-carbonil e nem deteriora as substâncias contendo os aminoácidos. Deste modo, a trealose pode ser usada sem medo de causar um escurecimento e deterioração insatisfatórios.

Trealose pode também inibir a cascata inflamatória, assim supri

mindo a produção de citocinas. (Minutoli, et al, SHOCK, VoL 27, No. 1, pp. 91-96, 2007; e Chen Q, Haddad GG: Role of trehalose phosphate synthase and trehalose during hypoxia: from flies to mammals. J Exp Biol 207:3125- 3129, 2004.) Trealose é um açúcar único capaz de proteger as biomoléculas 25 contra o estresse ambiental e pode inibir a cascata inflamatória que, por sua vez, causa danos oxidativos e a produção de citocinas. Também foi demonstrado que a trealose preserva a viabilidade celular, durante a exposição a uma faixa de estresses ambientais, como choque térmico, desidratação e hipóxia.

Trealose também é um aditivo alimentar comum porque ela é um

forte antioxidante e adoçante, e é comumente utilizada como um agente estabilizante em preparações farmacêuticas. Trealose, como a sacarose, é um dissacarídeo não redutor (duas moléculas de glicose ligadas pelo carbono anomérico) que pode atuar como um Iipoprotetor eficaz para a liofilização de proteínas e outras biomoléculas. Durante o processo de liofilização, as proteínas podem desnaturar conforme a água é removida, a menos que uma 5 molécula substituta esteja disponível para suportar a estrutura da proteína. A trealose preenche o espaço vazio deixado pela saída de água e evita esta desnaturação. Quando usada em concentrações tão baixas quanto 2%, ela pode efetivamente proteger proteínas e outras biomoléculas.

Formas úteis de trealose podem incluir trealose diidratada (TD) 10 que é cristalina, trealose amorfa (AT) que é uma forma vítrea, e as formas anidras de trealose, trealose amorfa anidra (AAT) e trealose cristalina anidra (ACT). Trealose anidra em pó pode conter AAT e/ou ACT. O termo "trealose", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer forma física da trealose incluindo anidra, parcialmente hidratada, completamente hidratada e 15 misturas e soluções das mesmas. A fabricação e uso de trealose anidra de TD pode ser encontrada na publicação internacional n°: PCT/GB97/00367, a descrição da qual sendo incorporada neste relatório descritivo por referência.

A adição de trealose à formulação ou composição pode ajudar a estabilizar HA de alto peso molecular, bem como inibir cascatas inflamatório 20 danosas. A trealose pode estar presente nas formas líquida, sólida, Iiofilizada ou cristalina. Quando presente na forma líquida, a trealose pode estar em uma solução tamponada. Solventes que podem ser usados para solubilizar a trealose podem incluir, mas não se limitam a, água, solução salina ou outras soluções de sal, soluções tampão como solução salina tamponada 25 com fosfato, histidina, lactato, succinato, glicina e glutamato, dextrose, glicerol, bem como combinações dos mesmos. Particularmente, a trealose pode estar presente na formulação de HA como uma solução.

Pelo menos um estabilizante pode estar presente na formulação de HA. Solventes que podem ser usados para solubilizar o estabilizante podem incluir, mas não se limitam a, água, solução salina ou outras soluções de sal, soluções tampão como solução salina tamponada com fosfato, histidina, lactato, succinato, glicina e glutamato, dextrose, glicerol, bem como 10

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combinações dos mesmos. Particularmente, o estabilizante pode estar presente na formulação de HA como uma solução.

A concentração de pelo menos um estabilizante presente na formulação de HA pode variar, porém em uma modalidade exemplificadora, pelo menos um excipiente é fornecido em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Em uma modalidade exemplar, o pelo menos um estabilizante tem uma concentração de pelo menos cerca de 1 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 5 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 50 mg/mL, e com mais preferência pelo menos cerca de 100 mg/mL, e em algumas modalidades a concentração pode ser de pelo menos cerca de 200 mg/mL. Concentrações adequadas de pelo menos um estabilizante podem incluir cerca de 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mg, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL,

16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 29 mg/mL, 30 mg/mL, 31 mg/mL, 32 mg/mL, 33 mg/mL, 34 mg/mL, 35 mg/mL, 36 mg/mL, 37 mg/mL, 38 mg/mL, 39 mg/mL, 40 mg/mL, 41 mg/mL, 42 mg/mL, 43 mg/mL, 44 mg/mL, 45 mg/mL, 46 mg/mL, 47 mg/mL, 48 mg/mL, 49 mg/mL, 50 mg/mL, 51 mg/mL, 52 mg/mL, 53 mg/mL, 54 mg/mL, 55 mg/mL, 56 mg/mL, 57 mg/mL, 58 mg/mL, 59 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL, 300 mg/mL, 400 mg/mL, 500 mg/mL, 600 mg/mL ou mais oi qualquer faixa derivável nisso. Estabilizantes podem também estar em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 a 60%, em peso; de cerca de 0,1 a 50%, em peso, de cerca de 0,1 a 45%, em peso; ou de cerca de 0,1 a 20%, em peso. Outras concentrações adequadas de pelo menos um excipiente podem incluir cerca de 0,1%, 0,5%, 1%, 2,5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ou cerca de 60%, em peso.

Componentes Adicionais

Em uma modalidade exemplificadora, pelo menos um componente adicional pode também ser combinado com a formulação ou compo5 sição de HA. O componente adicional pode ser um precursor do glicosaminoglicano (GAG) ou GAG liofilizado. O termo "glicosaminoglicano", ou "GAG", refere-se de maneira intercambiável à família de mucopolissacarídeos sulfatados que tipicamente incluem heparina, sulfato de heparina, condroitina, sulfato de condroitina, sulfato de queratano, sulfato de dermatano e 10 seus respectivos derivados.

Glicosaminoglicanos (GAGs) são polissacarídeos não ramificados longos contendo uma unidade de dissacarídeo e repetição. As unidades de dissacarídeo contêm qualquer um dos dois açúcares modificados, Nacetilgalactosamína (GaINAc) ou N-acetilglicosamina (GIcNAc), e um ácido 15 urônico como glicuronato ou iduronato. GAGs são moléculas altamente negativamente carregadas, com conformação estendida que confere alta viscosidade à mistura. GAGs estão localizadas primariamente sobre a superfície das células ou na matriz extracelular (ECM). Juntamente com a alta viscosidade das GAGs ocorre a baixa compressibilidade, que torna essas 20 moléculas ideais para um fluido lubrificante nas articulações. GAGs podem, deste modo, ajudar a Ientificar o processo inflamatório. Ao mesmo tempo, a rigidez deles proporciona integridade estrutural às células e fornece passagens entre as células, permitindo a migração de células. Além disso, uma GAG como CS foi encontrada no fluido sinovial, e pode desempenhar uma 25 função na saúde da articulação. Portanto, pode ser vantajoso ter uma terapia que pode liberar CS ao mesmo tempo que HA. Acredita-se que CS pode melhorar a eficácia de HA. Entretanto, foi observado que HA na presença de CS pode degradar ao longo do tempo. Portanto, a fim de evitar esta degradação, HA deve ser refrigerado até o uso. Entretanto, a maioria das clínicas 30 e hospitais não têm a capacidade de armazenar esses tipos de produtos em um refrigerador, de modo que poderia ser benéfico fornecer produtos que combinem HA e GAGs que são estáveis e que são capazes de serem armazenados à temperatura ambiente.

As GAGs podem possuir vários pesos moleculares, porém em certas modalidades exemplificadoras o peso molecular está na faixa de cerca de 5 a 1.000 KDa, com mais preferência na faixa de cerca de 6 a 500 5 KDa, com mais preferência na faixa de cerca de 7 a 300 KDa5 com mais preferência na faixa de cerca de 8 a 200 KDa, com mais preferência na faixa de cerca de 9 a 100 KDa e com a máxima preferência, na faixa de cerca de 10 a 80 KDa. Em outras modalidades, o peso molecular do fragmento GAG está abaixo de cerca de 5 KDa e, com mais preferência ainda, abaixo de 10 cerca de 3 KDa.

A concentração das GAGs presentes na mistura pode também variar, porém em uma modalidade exemplificadora a GAG é fornecida em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Em uma modalidade exemplar, a GAG tem uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 mg/mL, e com 15 mais preferência de pelo menos cerca de 2 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 5 mg/mL, e com mais preferência pelo menos cerca de 7 mg/mL, e com mais preferência pelo menos cerca de 20 mg/mL. Em outra modalidade, a GAG ou precursor da GAG pode estar presente na composição a uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 20 mg/mL. Concentrações adequadas de GAGs incluem cerca de 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mg, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 25 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 29 mg/mL, 30 mg/mL, 31 mg/mL, 32 mg/mL, 33 mg/mL, 34 mg/mL, 35 mg/mL, 36 mg/mL, 37 mg/mL, 38 mg/mL, 39 mg/mL, 40 mg/mL, 41 mg/mL, 42 mg/mL, 43 mg/mL, 44 mg/mL, 45 mg/mL, 46 mg/mL, 47 mg/mL, 48 mg/mL, 49 mg/mL, 50 mg/mL, 51 30 mg/mL, 52 mg/mL, 53 mg/mL, 54 mg/mL, 55 mg/mL, 56 mg/mL, 57 mg/mL, 58 mg/mL, 59 mg/mL, 60 mg/mL ou mais ou qualquer faixa derivável disso.

Sulfato de condroitina (CS), que é um componente essencial da cartilagem, é composto de uma seqüência alternada de resíduos de ácido Dglícurônico (GIcA) e N-acetil-D-galactosamina (GaINAc) sulfatados e/ou não sulfatados ligados através de ligações alternadas β(1,3) e β(1,4). Cada um desses compostos tem uma estrutura polimérica consistindo principalmente 5 de cerca de 40 a 100 vezes a repetição das unidades dissacarídicas. CS pode ser usado em vários pesos e concentrações moleculares, conforme discutido acima em relação ao componente GAG, porém em uma modalidade exemplificadora, o CS tem um peso molecular na faixa de cerca de 10.000 a 80.000 KDa e uma concentração na faixa de cerca de 0,1 a 100 10 mg/mL. CS pode ser isolado de fontes bovinas ou marinhas. Uma cadeia de condroitina pode ter mais de 100 açúcares individuais, cada uma dos quais pode ser sulfatado em posições e quantidades variadas. Sulfato de condroitina 4, também carbono 4 do açúcar de N-acetilgalactosamina (GaINAc), é encontrado nas cartilagens do nariz e traqueia de bovinos e suínos, ela tam15 bém é encontrada nos ossos, carne, sangue, pele, cordão umbilical e urina desses animais. Sulfato de condroitina 6, também o carbono 6 do açúcar GaINAc, foi isolado da pele, cordão umbilical e válvulas cardíacas desses animais. Sulfato de condroitina 6 tem a mesma composição, porém propriedades físicas levemente diferentes do sulfato de condroitina 4. Sulfato de 20 condroitina está envolvido na ligação do colágeno e também está diretamente envolvido na retenção de umidade. Estas duas são propriedades que auxiliam o processo de cura. Um versado na técnica irá perceber que os termos "sulfato de condroitina", "CS", "condroitina", "ácido condroitinossulfúrico" e "chonsurid" são usados de maneira intercambiável na presente inven25 ção e também englobam derivados químicos ou isoméricos ou reticulados ao longo deste pedido.

Sulfato de dermatano (DS), também chamado de sulfato de condroitina B, é principalmente composto de unidades dissacarídicas dissulfatadas e/ou trissuIfatadas do ácido L-idurônico e N-acetil-D-galactosamina 30 unidas por ligações β1,4 ou 1,3, porém existe um caso onde algumas das unidades de repetição contêm ácido L-idurônico sulfatado ou ácido D-ácido glicurônico como ácido urônico, ou contém N-acetilgalactosamina não sulfatada ou N-acetilgalactosamina 4,6-dissulfatada, ao invés de N-acetilgalactosamina-4-sulfato. DS é definida como um sulfato de condroitina pela presença de GaINAc. A presença do ácido idurônico (IdoA) em DS faz distinção dela em relação aos sulfatos-A (4-O-suIfatados de condroitina) e -C (6-0- sulfatado) e a liga à heparina e HS, que também contém este resíduo. É considerado que o sulfato de dermatano é absorvido pelo corpo quando é oralmente ingerido. O peso molecular e concentração de DS podem variar, conforme discutido acima em relação ao componente GAG, porém em uma modalidade exemplifícadora o peso molecular está na faixa de cerca de 10 a 80 KDa e uma concentração na faixa de cerca de 0,1 a 100 mg/mL. Um versado na técnica irá perceber que, diferentemente de HA, que é fermentado por bactérias e, portanto, tem um peso molecular que pode ser controlado, sulfato de dermatano é isolado do tecido animal e pode conter fragmentos. O peso molecular do sulfato de dermatano, e quaisquer fragmentos ali contidos, pode portanto variar significativamente. Um versado na técnica também perceberá que os termos "sulfato de dermatano", "DS" e "dermatano" são usados de maneira intercambiável na presente invenção e também incluem derivados sulfatados de sulfato de dermatano, o sal de benzetônio do sulfato de dermatano, os derivados persulfatados dos sais de benzetônio do sulfato de dermatano e também o sal de sódio do sulfato de dermatano.

Heparina e sulfato de heparano (HS) são compostos de um ácido glicurônico (GIcA) ligado à N-acetilglicosamina. Eles são compostos e unidades de repetição de dissacarídeo a1-4 ligadas contendo um ácido urônico e um amino açúcar. Proteoglicanos de sulfato de heparano são uma 25 parte integral da membrana basal. Proteoglicano de HS é uma grande biomolécula com uma massa molecular tão alta quanto 400 KDa, composta de uma proteína do núcleo covalentemente ligada às cadeias de sulfato de heparano. O número das cadeias de polissacarídeo e o tamanho da proteína do núcleo podem variar de acordo com a fonte. Proteoglicano de sulfato de 30 heparano é uma molécula multifuncional que se liga aos fatores de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e receptores de VEGF através da porção açúcar, atuando como uma molécula de ancoragem para a matrilisina (MMP-7) e outras metaIoproteinases da matriz e que desempenha papéis importantes na proliferação e diferenciação celular. Proteoglianos de sulfato de heparano também promove a ligação das células pela ligação a uma variedade de moléculas encontradas na ma5 triz extracelular, incluindo laminina, fibronectina, colágeno tipo IV e FGF-básico. O peso molecular e concentração de HS podem variar, conforme discutido acima em relação ao componente GAG, porém em uma modalidade exemplificadora o peso molecular está na faixa de cerca de 3 a30 KDa (quando isolado de tecidos) e uma concentração na faixa de cerca de 0,1 a

100 mg/mL.

Sulfato de queratano, também queratossulfato (KS)1 é altamente carregado negativamente e encontrado principalmente em agrecano, o proteoglicano mais abundante na matriz extracelular da hialina, cartilagem fibrosa e elástica. KS é composto da unidade de repetição de dissacarídeo, 4GlcNAcpi-3Gaipi-. A sulfatação ocorre na posição do carbono 6 (C6) de qualquer um ou ambos da galactose (Gal) ou GlcNAc. Tipos de KS específicos são compostos de três regiões: uma região de ligação, em uma extremidade da qual a cadeia KS está ligada à proteína do núcleo, a unidade de repetição de dissacarídeo, e a região de cobertura da cadeia, que ocorre na extremidade oposta da cadeia KS em relação à região de ligação da proteína. O peso molecular e concentração de KS podem variar, conforme discutido acima em relação ao componente GAG, porém em uma modalidade exemplificadora o peso molecular está na faixa de cerca de 5 a 10 KDa (quando isolado de tecidos) e uma concentração na faixa de cerca de 1 a 100 mg/mL.

A concentração de precursores GAGs ou GAG presentes na mistura também pode variar, mas em uma modalidade exemplificadora o precursor GAG ou GAG é fornecido em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Em uma modalidade exemplificadora, o precursor GAG ou GAG tem 30 uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 2 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 5 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 7 mg/mL, e com mais preferência de pelo menos cerca de 20 mg/mL. Em outra modalidade, a GAG ou precursor da GAG pode estar presente na composição a uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Concentrações adequadas dos precursores GAGs ou GAG in5 cluem cerca de 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL,

11 mg/mg, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL,

24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 29 mg/mL, 30 mg/mL, 31 mg/mL, 32 mg/mL, 33 mg/mL, 34 mg/mL, 35 mg/mL, 36 mg/mL, 10 37 mg/mL, 38 mg/mL, 39 mg/mL, 40 mg/mL, 41 mg/mL, 42 mg/mL, 43 mg/mL, 44 mg/mL, 45 mg/mL, 46 mg/mL, 47 mg/mL, 48 mg/mL, 49 mg/mL, 50 mg/mL, 51 mg/mL, 52 mg/mL, 53 mg/mL, 54 mg/mL, 55 mg/mL, 56 mg/mL, 57 mg/mL, 58 mg/mL, 59 mg/mL, 60 mg/mL ou mais ou qualquer faixa derivável disso.

Um versado na técnica irá perceber que, embora precursores

GAGs ou GAG Iiofilizados sejam particularmente úteis em modalidades exemplificadoras, precursores de GAGs ou GAG líquidos também podem ser utilizados na composição. Por exemplo, CS pode ser obtido na forma de pó e misturado com um solvente, como água, para formar uma solução. A 20 solução podem ser combinada com HA líquido para formar uma mistura possuindo uma viscosidade reduzida, em comparação com o HA sozinho. Embora seja eficaz para reduzir a viscosidade do HA, a mistura resultante terá uma concentração reduzida devido à presença de água. Deste modo, embora as GAGs líquidas não Iiofilizados podem ser usados com a presente 25 invenção, em uma modalidade exemplificadora a GAG é Iiofilizada para permitir o uso de HA em uma alta concentração.

Glicosamina (C6H13NO5) ("GlcN") ou seus derivados ou outros precursores GAG também podem ser incluídos na formulação de HA para acentuar a síntese dos componentes chave da cartilagem e do fluido sinovial 30 pela alimentação de ambas as reações necessárias para a produção de hialuronano, bem como para proteogIicanos. GIcN é um amino açúcar transportando quatro grupos hidroxila e um grupo amina, e ele é um precursor proeminente na síntese bioquímica de lipídeos e proteínas glicosilados. GIcN é uma molécula de ocorrência natural que possui funções nutritivas e efetoras. Por exemplo, GIcN é compatível com e promove o crescimento de células tronco e a diferenciação das células tronco mesenquimais para 5 formar os condrócitos. GIcN pode possuir um papel no desenvolvimento e reparo tecidual, como o crescimento e desenvolvimento de cartilagem, em geral. Ele é usado como um suplemento nutricional para combater os sintomas de OA1 e mostrou diminuir a taxa de destruição da cartilagem em estudos clínicos. Em uma modalidade, o GIcN pode ser Iiofilizado juntamente 10 com o CS. As formas de sal da glicosamina podem apresentar estabilidade limitada na fase líquida. Além disso, o sal de HCI do GIcN pode reduzir o pH suficientemente para degradar o HA uma vez combinado. Por essa razão, a fim de reter a estabilidade dos componentes, é vantajoso possuir GIcN na forma Iiofilizada para ser solubilizado com o gel de HA antes da injeção. 15 Para uso na presente invenção, "glicosamina" inclui sais de glicosamina, como cloridrato de glicosamina e sulfato de glicosamina, bem como formas não salinas como N-acetilglicosamina.

A concentração de GIcN pode variar. Uma concentração local adequada pode ser de pelo menos cerca de 10 mg/mL, cerca de 9 mg/mL, cerca de 8 mg/mL, cerca de 7 mg/mL, cerca de 6 mg/mL, 5 mg/mL, 4,5 mg/mL, 4 mg/mL, 3,5 mg/mL, 3 mg/mL, cerca de 2,9 mg/mL, cerca de 2,8 mg/mL, cerca de 2,7 mg/mL, cerca de 2,6 mg/mL, cerca de 2,5 mg/mL, cerca de 2,4 mg/mL, cerca de 2,3 mg/mL, cerca de 2,2 mg/mL, cerca de 2,1 mg/mL, cerca de 2,0 mg/mL, cerca de 1,9 mg/mL, cerca de 1,8 mg/mL, cerca de 1,7 mg/mL, cerca de 1,6 mg/mL, cerca de 1,5 mg/mL, cerca de 1,4 mg/mL, cerca de 1,3 mg/mL, cerca de 1,2 mg/mL, cerca de 1,1 mg/mL, cerca de 1,0 mg/mL, cerca de 0,9 mg/mL, cerca de 0,8 mg/mL, cerca de 0,7 mg/mL, cerca de 0,6 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL ou assim por diante. Um versado na técnica pode determinar uma concentração local adequada de métodos que praticam GIcN conhecidos na técnica farmacêutica, e que a determinação irá reger a natureza e a composição da composição de GIcN de interesse para obter a concentração desejada de GlcN. Agentes de tamponagem podem também ser adicionados à formulação de HA para controlar o pH. Exemplos de agentes de tamponagem podem ser qualquer um ou mais dos seguintes agentes, e não se limitam ao ácido acético, carbonato de amônio, fosfato de amônio, ácido bórico, 5 ácido cítrico, glicina, ácido láctico, ácido fosfórico citrato de potássio, metafosfato de potássio, fosfato de potássio monobásico, acetato de sódio, citrato de sódio, solução de Iactato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, TRIS e carbonato de sódio.

Adicionalmente, os agentes isotônicos podem ser adicionados para controlar a concentração iônica e/ou a pressão osmótica da formulação de HA. Exemplos de agentes isotônicos podem ser qualquer um ou mais dos seguintes agentes, e não se limitam à dextrose, sacarose, trealose, glicerina, manitol, cloreto de potássio e cloreto de sódio.

Um versado na técnica irá perceber que as composições e métodos da presente invenção podem incluir vários outros componentes de tratamento de articulação, incluindo, por exemplo, aminoácidos, proteínas, sacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos, iipídeos, ácidos nucleicos, tampões, tensoativos e misturas dos mesmos. Outros componentes úteis podem incluir esteroides, agentes antiinflamatórios agentes antiinflamatórios nãoesteroidais analgésicos células, antibióticos, agentes microbicidas, agentes antiinflamatórios, fatores de crescimento, fragmentos de fator de crescimento, estimulantes de cicatrização de feridas de moléculas pequenas, hormônios, citocinas, peptídeos, anticorpos, enzimas, células isoladas, plaquetas, imunossupressores, ácidos nucleicos, tipos de células, vírus, partículas virais, nutrientes essenciais ou vitaminas, e combinações dos mesmos.

Liofilizacão

Qualquer um ou mais dos componentes presentes nas composições e métodos da presente invenção pode ser Iiofilizado com o uso de várias técnicas conhecidas na arte. A liofilização é um processo de desidrata30 ção que é tipicamente usado para preservar um material perecível, e ele funciona pelo congelamento do material e, a seguir, redução da pressão circundante e adição de calor suficiente para permitir que a água congelada no material sublime diretamente da fase sólida para a fase de gás. Técnicas de liofilização padrão conhecidas na arte podem ser usadas para Iiofilizar qualquer um ou mais dos componentes. Em uma modalidade exemplificadora, o HA é liofilizado.

Antes da liofilização, várias solventes podem ser usados para

formar uma mistura aquosa contendo o(s) componente(s) a serem Iiofilizados. Em uma modalidade exemplificadora, a mistura aquosa é preparada pela combinação de água com um ou mais dos componentes. Em uma modalidade exemplificadora, a composição é esterilizada por filtração, como com um filtro de 0,2 μητι, antes da liofilização.

Em uma modalidade, o(s) componente(s) pode(m) ser Iiofilizado(s) com o uso do seguinte ciclo:

Congelamento: da temperatura ambiente até 5°C em 15 minutos Manter a 5°C durante 100 minutos Abaixar a temperatura até -45°C em 50 minutos

Mantera -45°C durante 180 minutos Secagem Primária: ajustar a pressão a 6,7 Pa (50 mTorr)

Elevar a temperatur até -15°C em 175 minutos Manter a -15°C durante 2300 minutos Secagem Secundária: ajustar a pressão a 10,0 Pa (75 mTorr)

Elevar a temperatur até 25°C em 200 minutos Manter a temperatura durante 900 minutos Final do ciclo: Preencher novamente com nitrogênio até ~9,7 Pa

(-730 Torr)

Tamparefrisar

Variações para as temperaturas, tempos e ajustes podem ser feitos de acordo com as práticas utilizadas por um versado na técnica. Variações podem incluir, mas não se limitam, às temperaturas de ciclização para o ciclo e congelamento, temperaturas de secagem e ciclos finais. 30 Variações também podem incluir diferenças nos tempos de espera para os ciclos de congelar, secar e tampar/frisar. Variações também podem incluir diferenças nas pressões estabelecidas para os ciclos de secar e de tampar/frisar. Além disso, o número de ciclos de secagem pode ser aumentado ou diminuído dependendo da máquina usado ou do(s) componente(s) a ser(em) liofilizado(s).

A adição de um agente tampão pode proporcionar solubilidade e 5 estabilidade aprimorada da proteína nas formulações de HA liofilizadas. Agentes de tamponagem biocompatíveis conhecidos na técnica podem ser usados, como glicina; sais de acetato de sódio, potássio ou de cálcio; sais de citrato de sódio, potássio ou de cálcio; sais de Iactato de sódio, potássio ou de cálcio; sais de fosfato de sódio ou potássio, incluindo fosfato monobá10 sico, fosfato dibásico, fosfato tribásico e misturas dos mesmos. Os agentes de tamponagem podem adicionalmente possuir açúcar adicionado à composição para funcionar como um agente avolumador. O pH de preferência pode ser controlado para estar entre pH5 e pH10, e com mais preferência entre pH 6 a 8.

Formulações

Em uma modalidade, o HA e pelo menos um componente adicional, como um excipiente, pode ser configurado para ser combinado e administrada intrarticularmente como parte de um procedimento cirúrgico envolvendo uma junta articulada, imediatamente antes, durante ou imediatamente 20 após o procedimento cirúrgico. Alternativamente, o HA e pelo menos um componente adicional poderia ser anteriormente combinado e presente como uma formulação de combinação no momento do procedimento cirúrgico. Os outros componentes, quando combinados, podem formar uma composição ou mistura resultante possuindo cada componente presente na com25 posição em várias quantidades. A quantidade de cada componente na composição pode variar, porém em uma modalidade exemplificadora, a razão de mistura entre HA e pelo menos um componente adicional, como um excipiente, pode possuir uma razão entre o peso de HA e o componente adicional na faixa de cerca de 1:0,001 a cerca de 1:100, e com mais preferência 30 em uma razão na faixa de cerca de 1:0,01 a cerca de 1:10. Alternativamente, a formulação pode incluir cerca de 1% a cerca de 75% ou mais, em peso, de cada um dos componentes individuais, como HA e pelo menos um componente adicional (por exemplo, um excipiente), na composição total, alternativamente cerca de 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou mais, em peso, de HA e pelo menos um componente adicional, como um excipiente, na formulação total. Em uma modalidade exemplificadora, a 5 quantidade de HA presente na formulação apresentada pode ser de cerca de 1 a 20%, em peso, da formulação total, e a quantidade de pelo menos um componente adicional, como um excipiente, pode estar presente na formulação apresentada a cerca de 0,01 a 20%, em peso, da formulação total.

Solventes que podem ser usados para solubilizar um ou mais dos componentes incluem, por exemplo, água, solventes ácidos, ácido clorídrico, ácido acético, ácido benzóico, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações. Solventes que podem ser usados para solubilizar HA e/ou o componente adicional podem incluir, mas não se limitam, a água, solução salina ou outras soluções salinas, soluções tampão, como solução salina tamponada com fosfato, histidina, lactato, succinato, glicina e glutamato, dextrose, glicerol, ácido clorídrico, ácido acético, ácido benzóico, solvente ácido e outros solventes adequados, bem como suas combinações. A formulação pode também incluir outros componentes, como meio de dispersão, revestimentos, agentes bactericidas e fungicidas, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Agentes isotônicos incluem, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Uma formulação pode também incluem quantidades menores de substâncias adjuvantes como agentes de molhagem ou emulsificação, conservantes ou tampões, que melhoram a vida útil ou efetividade da formulação.

As formulações podem ser incorporadas em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende HA e outro componente, como pelo me30 nos um excipiente, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Para uso na presente invenção, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes bactericidas e fungicidas, agentes de retardo de absorção e isotônicos, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, ácido clorídrico, ácido acético, ácido benzóico, solvente ácido, solução salina, solução salina tamponada com 5 fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações. Em muitos casos, pode ser útil incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Veículos farmaceuticamente aceitável podem compreender, ainda, quantidades menores de substâncias adjuvantes como agentes de molhagem ou 10 emulsificação, conservantes ou tampões, que melhoram a vida útil ou efetividade da composição.

As composições podem estar em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infundíveis), 15 dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas e pós. Uma forma exemplificadora pode depender do modo de administração tencionado e da aplicação terapêutica. Composições típicas podem estar sob a forma soluções injetáveis ou infundíveis, como composições semelhantes àquelas usadas para a injeção in vivo. Em uma modalidade, um modo de administração 20 exemplificador é a parenteral (por exemplo, intrarticular, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Em outra modalidade, a composição pode ser administrada por infusão ou injeção diretamente dentro da área alvo, como uma articulação. Em ainda outra modalidade, a composição pode ser administrada por injeção intramuscular ou subcutânea.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorpo

ração do composto ativo em uma quantidade terapeuticamente eficaz ou benéfica em um solvente adequado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do com30 posto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, as modalidades podem incluir métodos de Preparação de secagem a vácuo e liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo.

Sistemas de Liberação

Os métodos e composições abrangem kits para o tratamento de distúrbios articulares, como as articulações. Os kits podem compreender HA1 e pelo menos um estabiIizante. Ambos e/ou todos os componentes podem ser alojados em uma única câmara. O kit pode também incluir HA com pelo 10 menos um estabilizante e um componente adicional. O componente adicional pode ser alojado em uma câmara única ou separada de uma seringa para injeção com a mistura de HA e pelo menos um estabilizante. O HA e pelo menos um estabilizante pode ser liofilizado. Em uma modalidade exemplificadora, o HA é combinado com pelo menos um estabilizante em 15 uma câmara individual. Em outra modalidade, um kit é fornecido que possui HA e pelo menos um estabilizante alojado na mesma câmara e um componente adicional em uma segunda câmara. Em uma outra modalidade exemplar, o HA é combinado com pelo menos um estabilizante na mesma câmara e um precursor de GAG ou GAG é alojado em uma segunda câma20 ra. O componente HA pode compreender até cerca de 10 mL de Orthovisc®, que contém cerca de 150 mg de hialuronano, 90 mg de cloreto de sódio e até a cerca de 10,0 mL de água para injeção e pode ser proporcionalmente e adequadamente reduzido ou aumentado para a indicação específica. Exemplos podem ser para o joelho, ombro e quadril, o volume da injeção 25 para um único produto de injeção pode estar na faixa de cerca de 3 mL a 10 mL e a mão pode estar na faixa de cerca de 500 μΙ e 1,5 mL. O HA pode possuir um peso molecular na faixa de cerca de 1,0 a 6 MDa. O pelo menos um estabilizante presente na formulação ou composição de HA pode possuir uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL. O 30 pelo menos um estabilizante pode ser liofilizado ou, alternativamente, pode estar em uma solução, conforme observado acima, em combinação com o componente HA. Compostos podem ser armazenados separadamente para aumentar a vida útil. Os compostos individuais podem ser Iiofilizados ou estar na forma sólida em uma seringa/cartucho com diluente ou um segundo composto em uma segunda seringa/cartucho. Em uma modalidade, um dos 5 compostos está na forma Iiofilizada ou na forma sólida e o segundo composto é uma solução capaz de combinar com o composto liofilizado/sólido. Um exemplo pode ser pelo menos um componente liofilizado ou sólido que pode ser armazenado em uma primeira câmara e um HA solubilizado pode ser armazenado em uma segunda câmara. Em outra modalidade, ambos os 10 compostos podem ser Iiofilizados ou estar na forma sólida e alojado em uma única câmara ou em câmaras separadas de uma seringa/cartucho. Em outra modalidade, compostos podem ser liofilizados diretamente na seringa ou cartucho.

Seringas e/ou cartuchos de câmara dupla pré-enchidos podem também ser utilizados com os componentes e composições. Seringas de câmara dupla pré-enchidas permitem a administração seqüencial de duas composições separadas com um único empurrão de seringa, assim substituindo duas seringas com uma. Os benefícios de uma única capacidade de liberação incluem aumentar a velocidade e facilidade de administração do fármaco; risco reduzido de infecção pela redução do número de conexões; redução do risco de erros de administração do fármaco e de seqüência, e distribuição mais rápida das composições que requerem a combinação antes da administração. A seringa de câmara dupla pode acomodar formulações íiofilizadas, em pó ou líquidas na câmara frontal combinado com diluentes, solução salina ou tampão na câmara posterior.

Seringas pré-cheias podem conter a dose liberável exata dos compostos e diluentes desejados. As seringas pré-cheias podem conter volumes de cerca de 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL, 0,5 mL, 0,6 mL, 0,7 mL, 0,8 mL, 0,9 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2 mL, 2,5 mL, 3 mL, 3,5 mL, 4 mL, 4,5 mL, 5 mL, 5,5 mL, 6 mL, 6,5 mL, 7 mL, 7,5 mL, 8 mL, 8,5 mL, 9 mL,

9,5 mL, 10 mL ou mais ou qualquer derivado nisso.

A seringa e/ou cartucho duplo pode ser compreendido de câmaras lado a lado com êmbolos de seringa separados que misturam em uma única câmara ou câmaras lineares com um embolo. As seringa e/ou cartuchos de câmara dupla podem também possuir um tampão ou conector no meio para servir como uma barreira entre as duas câmaras. O tampão ou 5 conector pode ser removido para permitir a mistura ou combinação dos compostos nas duas câmaras.

A figura 1 ilustra uma modalidade de um sistema de mistura e de liberação que está sob a forma de uma seringa de câmara dupla 10. Conforme mostrado, a seringa de câmara dupla 10 em geral inclui um comparti10 mento possuindo as câmaras proximal e distai 14, 12 separadas por uma válvula 16. Um êmbolo 18 é colocado de maneira deslizante dentro da câmara proximal 14 e é configurado para injetar fluido presente dentro da câmara proximal 14 na câmara distai 12 para assim misturar os componentes. Em uma modalidade, o primeiro componente, por exemplo, HA líquido 15 com pelo menos um estabilizante, pode estar presente na câmara proximal

14 e um componente adicional, por exemplo, um ou mais componentes adicionais, podem estar presentes na câmara distai 12. Alternativamente, o primeiro componente, por exemplo, HA líquido, pode estar presente na câmara proximal 14 com pelo menos um estabilizante, como trealose, e pelo 20 menos um componente adicional, por exemplo, sulfato de condroitina, pode estar presente na câmara distai 12. O êmbolo 18 pode avançar através da câmara proximal 14 para injetar o primeiro componente, por exemplo, HA líquido com pelo menos um estabilizante, na câmara distai 12 contendo o segundo componente, por exemplo, um ou mais componentes adicionais. 25 Em outra modalidade, a câmara proximal 14 pode conter um solvente, como água ou solução salina, e a câmara distai 12 pode conter todos os componentes na forma sólida. Por exemplo, a câmara distai 12 pode conter HA liofilizado ou sólido com pelo menos um estabilizante. O êmbolo 18 pode avançar através da câmara proximal 14 para injetar o solvente na câmara 30 distai 12, assim solubilizando os componentes na câmara distai 12. Uma vez que todos os componentes são combinados na câmara distai 12, a mistura pode ser liberada no tecido, por exemplo por fixação de uma agulha na extremidade distai da seringa de câmara dupla.

A figura 2 ilustra outra modalidade de um sistema de mistura e liberação 20, que é vendido comercialmente sob o nome comercial de MixJect®. Nesta modalidade, o sistema inclui um conjunto controlador de fluido 22 que é acoplado entre uma seringa 24 e um frasco 26. A seringa 24 define uma primeira câmara 24a (não marcada na figura) que pode conter um líquido, como HA líquido ou um solvente, e o frasco define uma segunda câmara 26a (não marcada na figura) que pode conter um sólido, como um ou mais componentes adicionais. O posicionamento do êmbolo 28 através da seringa 24 irá injetar o líquido através do sistema de controle e dentro do frasco 26, onde o sólido será solubilizado pelo líquido. Uma vez que os componentes são completamente solubilizados, o frasco 26 pode ser invertido e o êmbolo 28 pode ser retraído para puxar a mistura de volta para dentro da câmara 24a na seringa 24. O frasco 26 pode então ser removido do sistema, e a mistura pode ser injetada da seringa através de uma agulha 29 e dentro do tecido.

Um versado na técnica perceberá que quaisquer sistemas de câmara dupla conhecidos na técnica podem ser usados, e que as câmaras podem ser câmaras lado a lado com êmbolos de seringa separados que misturam em uma única câmara ou câmaras lineares com um único êmbolo.

Tratamentos

O método e as composições podem ser administrado, para aplicações in vivo, parenteralmente por injeção ou por perfusão gradual ao longo do tempo. A administração pode ser intrarticular, intravenosa, intraperi25 toneal, intramuscular, subcutânea, intracavidade ou transdérmica. Para estudos in vitro os agentes podem ser adicionados ou dissolvidos em um tampão apropriado biologicamente aceitável e adicionados a uma célula ou tecido.

Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não-aquosas estéreis. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meio tamponado. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, veículo intravenosos de Ringer Iactato incluem reabastecedores de fluido e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (como aqueles baseados 5 na dextrose de Ringer), e similares. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, fatores de crescimento e gases inertes e similares.

"Veículos" ou "adjuvantes" frequentemente usados incluem carbonato de magnésio, dióxido de titânio, lactose, manitol e outros açúcares, 10 talco, proteína do leite, gelatina, amido, vitaminas, celulose e seus derivados, óleos de origem animal e vegetal, polietilenoglicóis e solventes, como água estéril, álcoois, glicerol e álcoois poliídricos, e sulfóxido de dimetila. Veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluido e nutrientes. Conservantes incluem agentes microbicidas, antioxidantes, agentes quelantes e 15 gases inertes. Outros veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas, excipientes não-tóxicos, incluindo sais, conservantes, tampões e similares, conforme descrito, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed. Easton: Mack Publishing Co.: 1405-1412, 1461- 1487, 1975 e The National Formulary XIV., 14a ed. Washington: American 20 Pharmaceutical Association, 1975 os conteúdos das quais sendo aqui incorporados, por referência. O pH e a concentração exata dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados de acordo com as habilidades rotineiras na técnica. Consulte Goodman and GiIman1S The Pharmacological Basis for Therapeutics (7a ed.).

Exemplos de sintomas ou doenças, para os quais a composição

e os métodos apresentados aqui podem ser úteis, abrangem o tratamento de distúrbios da articulação, como artrite causada por infecções, injúrias, alergias, transtornos metabólicos, etc., reumatoides como artrite reumatoide crônica e Iupus erythematosus sistêmico; distúrbios da articulação acompanha30 dos por gota, artropatia como osteoartrite, desarranjo interno, hidrartrose, pescoço duro, lumbago, etc. Variando os efeitos dependendo do uso da composição ou dos tipos de doenças a serem tratadas, o agente pode exercer efeitos profiláticos e de alívio desejados, ou mesmo efeitos terapêuticos no inchaço, dor, inflamação e destruição das articulações sem afetar seriamente os corpos vivos. A composição para o tratamento de distúrbio articular pode ser usada para prevenir o início dos distúrbios de articulação, 5 bem como para melhorar, aliviar e curar os sintomas e seus inícios.

Os métodos de tratamento podem incluir a injeção direta das composições na área alvo, como uma articulação. As injeções podem ser realizadas tão frequentemente quanto diariamente, semanalmente, durante várias vezes por semana, bimestralmente, várias vezes durante o mês, men10 salmente ou tão frequentemente quanto for necessário para proporcionar o alívio dos sintomas. Para intrarticular, o uso de cerca de 1 a cerca de 30 mg/mL de HA por articulação, dependendo do tamanho da articulação e da gravidade da condição, pode ser injetado. A frequência das injeções subsequentes em uma determinada articulação são espaçadas até o tempo de 15 recorrência dos sintomas na articulação. Ilustrativamente1 os níveis de dosagem em seres humanos da composição podem ser: joelho, cerca de 1 a cerca de 30 mg/mL por injeção na articulação; ombro, cerca de 1 a cerca de 30 mg/mL de HA por injeção na articulação; metacorporal ou proximal intrafalange, cerca de 1 mg/mL a cerca de 30 mg/mL de HA por injeção na arti20 culação; e cotovelo, cerca de 1 a cerca de 30 mg/mL por injeção na articulação. A quantidade total de injeção pode situar-se na faixa de cerca de 1 mg/mL a 200 mg/mL de HA.

Será compreendido, no entanto, que o nível de dosagem específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fato25 res incluindo a atividade do composto específico utilizado, a idade, peso corporal, estado de saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, combinação de fármaco e a gravidade da doença particular sendo submetida a terapia. As composições farmacêuticas podem ser preparadas e administradas em unidades de dose. Sob determi30 nadas circunstâncias, entretanto, unidades de dose mais elevadas ou mais baixas podem ser adequadas. A administração da unidade de dose pode ser executada tanto por administração individual da composição ou a administração pode ser realizada em várias unidades de dose menores e também por múltiplas administrações de doses subdivididas em intervalos específicos.

Em uma modalidade, a condição médica é a osteoartrite (OA) e 5 a composição é administrada em um espaço da articulação, como, por exemplo, um joelho, ombro, articulações têmporo-mandibulares e articulações carpo-metacarpais, cotovelo, quadril, pulso, tornozelo e articulações lombar zigapofisária (faceta) na espinha dorsal. A viscossuplementação pode ser realizada através de uma única injeção ou de múltiplas injeções intrar10 ticulares administradas em um período de semanas no joelho ou outras articulações afligidas. Por exemplo, um indivíduo humano com OA no joelho pode receber uma, duas, três, quatro ou cinco injeções de cerca de 0,5, 1, 1,5,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mL ou mais por joelho. Para outras articulações, o volume administrado pode ser ajustado com base no tamanho da articulação.

Será compreendido, no entanto, que o nível de dosagem espe

cífico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico utilizado, a idade, peso corporal, estado de saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, combinação de fármaco e a gravidade da doença particular sendo submetida a terapia.

Dados Experimentais

Example 1: Estabilidade das formulações de CS e HA líquidas com vários estabilizantes

HA a 2,5 mg/mL e sulfato de condroitina (CS) a 2,5 mg/mL foram 25 formulados com diferentes estabilizantes, conforme esboçado na Tabela 1. As formulações foram testadas para a estabilidade de HA sob as condições de armazenamento de 5°C e 40°C/75% de umidade relativa (Figura 3). Após cinco meses, as amostras de teste foram analisadas por um método de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)-cromatografia líquida de alta 30 eficiência. Brevemente, a amostra de teste foi diluída com uma fase móvel (tampão de fosfato de sódio 100 mM, pH 7) até 0,1 mg/mL de HA. A amostra diluída foi, então, injetada em uma coluna de HPLC (coluna linear phenomenex, Poly Sep-GFC-P, número de catálogo 00H-3147-K0) com um fluxo de 0,6 mL/min. Os picos de HA eluídos foram monitorados com comprimento de onda de 207 nm e o tempo de retenção foi comparado com os padrões de peso molecular de HA para determinar o peso molecular da amostra de 5 teste.

Conforme mostrado na Tabela 1, a formulação de solução salina foi a formulação menos estável a 40°C em comparação com as outras amostras a 40°C. A figura 3 mostra os cromatogramas da formulação de solução salina. O pico de HA da amostra salina foi deslocado bastante para 10 a direita, indicando que HA se degradou em moléculas menores. Ao contrário, a formulação de trealose a 40°C teve um deslocamento muito menor conforme mostrado na figura 4. Resultados similares foram observados com as formulações de sacarose e manitol. Essas formulações devem apresentar melhor vida útil em temperatura ambiente em comparação com a formulação 15 de solução salina.

Tabela 1. Estudo de estabilidade da Formulação de HA e CS líquida no

ponto de tempo de cinco meses

Excipientes e concentração Identificação de amostra Peso molecular, Dalton Recém-preparado em fase móvel padrão 2014438 NaCI 0,9% 9 (peso por volume) em água Formulação de solução salina, 5°C 2000484 Formulação de solução salina, 40°C 487429 NaCI 0,9% (peso por volume) com Formulação de PBS15°C 1984656 Formulação de PBS140°C 783509 Glicose a 5% (peso por volume) com Formulação de Glicose, 5°C 2034540 Formulação de Glicose, 40°C 511731 Manitol a 5% (peso por volume) com Formulação de manitol, 5°C 2030504 Formulação de manitol, 40°C 1765220 Sacarose a 10% (peso por volume) com Formulação de Sacarose, 5°C 2024464 Formulação de Sacarose, 40°C 1688080 Trealose a 10% (peso por volume) com Formulação de trealose, 5°C 2089824 Formulação de trealose, 40°C 1706619 Manitol a 5% (peso por volume) em água Manitol, nenhuma formulação de fosfa¬ 2112776 to, 5°C Manitol, nenhuma formulação de fosfa¬ 734536 to, 40°C HA a 8 mg/mL e sulfato de condroitina a 8 mg/mL também foram formulados com vários estabilizantes conforme esboçado na Tabela 2. As soluções formuladas foram preenchidas em frascos de vidro de 3 mL a

0,5 mL/frasco e IiofiIizadas. As amostras secas foram colocadas a 40°C/75% 5 de umidade relativa para estudo de estabilidade. Após 4 meses, as amostras de teste foram reconstituídas com WFI e analisadas pelo método SEC-HPLC conforme mencionado no exemplo 1. Conforme mostrado na tabela 2, as formulações contendo solução salina foram menos estáveis em comparação com as formulações contendo glicose, manitol, sacarose e trealose. Real10 mente nenhuma alteração significativa no peso molecular foi detectada nessas formulações Iiofilizadas quando armazenadas a 40°C durante quatro meses.

Tabela 2. Estabilidade da Formulação de HA e CS Liofilizada no ponto de

1:empo de quatro meses Excipientes e concentrações Pré-liofilização Identificação de amostra Peso molecular kDa Solução salina a 0,9% (peso por volume) com Formulação de PBS A140°C 873 869 Glicose a 5% (peso por volume) com tampão de Formulação de Glicose B, 40°C 2070 2191 Manitol a 5% (peso por volume) com tampão de Formulação de manitol C, 40°C 2020 2028 2,5% (peso por volume) de manitol/5% (peso Formulação de manitol/sacarose D, 2034 2046 Trealose a 10% (peso por volume) com tampão Formulação de trealose E, 40°C 1939 1968 Sacarose a 10% (peso por volume) com Formulação de Sacarose F, 40°C 2036 2024 10% de trealose com tampão de histidina 10 Formulação de trealose G, 40°C 1962 1960 0,9% de solução salina em água Fomulação de solução salina H1 964 978 Altas concentrações de HA também foram testadas. HA a

mg/mL e CS a 20 mg/mL formulados com vários estabilizantes. As formulações foram testadas quanto à estabilidade nas condições de armazenamento de 5°C e 40°C/75% de umidade relativa conforme esboçado na Tabela 3. Após três meses, as amostras de teste foram analisadas com o uso do método de SEC-HPLC. Conforme mostrado na Tabela 3, a formulação contendo salina apenas teve menor estabilidade em comparação com as formulações contendo trealose, sacarose e manitol.

Tabela 3. Estabilidade das formulações de HA e Cs líquidas de alta concentração no ponto de tempo de três meses__

Excipientes e concentrações Identificação de amostra PM de HA, kDa Recém preparado na fase móvel STD 2077 Trealose a 10% (peso por volume) Formulação de trealose A, 5°C 2041 Formulação A, 40°C 1565 Sacarose a 10% (peso por volume) Formulação de Sacarose B, 5°C 2039 Formulação B, 40°C 1590 Manitol a 5% (peso por volume) Formulação de manitol C1 5°C 1965 Formulação C, 40°C 1611 Solução salina a 0,9% (peso por Formulação de solução salina D, 1967 volume) em água 5°C Formulação D, 40°C 785 5% (peso por volume) de trealo- Formulação de Treaiose/PBS, 5C 2023 Formulação de Trealose/PBS40C, 1852 Example 2: Estabilidade da formulação de HA com várias concentrações de trealose HA em diferentes concentrações foi formulado com várias concentrações de trealose, conforme esboçado na Tabela 4. Algumas das soluções formuladas foram divididas em dois grupos. Uma foi colocada em câmaras de estabilidade para estudo de estabilidade de líquido e a outra foi 5 Iiofilizada para avaliação da estabilidade de sólido. Após três meses de armazenamento a 5°C e 40°C/75% de umidade relativa, as amostras de teste foram analisadas usando o método SEC-HPLC. Conforme mostrado na Tabela 4, nenhuma diferença significativa no peso molecular foi observada entre as amostras com diferentes concentrações de trealose. Entretanto, 10 sem quaisquer excipientes, HA formulado com água apenas foi muito menos estável na forma líquida e na forma liofilizada.

Tabela 4. Estabilidade da formulação de HA com várias concentrações de

trealose Composição da Formulação ID da formulação Peso molecular kDa mg/mL de HA com 5% (peso Líquido 177A, 5°C 2103 Líquido 177A, 40°C 1902 2 mg/mL de HA com 2% (peso por Líquido 146A, 5°C 2050 Líquido 146A, 40°C 1713 Lio 146A, 5°C 2090 Lio 146A, 40°C 2036 2 mg/mL de HA com 0,67% (peso Líquido 146B, 5°C 2052 Líquido 146B, 40°C 1690 Lio 146B, 5°C 2112 Lio 146B, 40°C 2013 Sem qualquer excipiente Líquido 171E1 5°C 2057 Líquido 171 D, 40°C 666 Lio 171E, 5°C 2038 Lio 171E, 40°C 731 Exemplo 3: Modelo MMT de Rato de Osteoartrite

No modelo de rasgo do menisco médio do rato (MMT) da os

teoartrite, a transecção do menisco mediano resulta na deterioração da articulação e reduzida capacidade de suportar o peso que mimetiza a osteoartrite humana. Um rasgo do menisco mediano unilateral em ratos de 300 a 400 gramas resulta em alterações degenerativas da cartilagem que progridem rapidamente caracterizadas por perda de condrócito e proteoglicano, fibrilação, formação de osteófito e clonagem de condrócito. Tais alterações são 5 tipicamente observadas como sendo substanciais por volta do dia 21 após a cirurgia do menisco. A extensão da deterioração da articulação, conforme determinado primariamente pela extensão das lesões na cartilagem formadas pode ser medida usando um sistema de pontuação histológico semiquantitativo.

Para testar a utilidade da trealose como um veículo para com

postos injetados intrarticularmente, uma solução de trealose foi formulada como uma solução a 5% em tampão de glicina 3 mM-HCI, possuindo um pH de aproximadamente 3. A solução foi testada no modelo MMT de rato. A transecção do ligamento colateral mediano logo abaixo da fixação ao me15 nisco foi realizada em 15 ratos Lewis do sexo masculino. O menisco foi cortado em seu ponto mais estreito (distante dos oscículo) tomando cuidado para não danificar a superfície da tíbia.

Iniciando três dias após a cirurgia de MMT, injeções intrarticuIares da solução de trealose foram administradas semanalmente durante cinco semanas, seguido de eutanásia na sexta semana.

Os resultados histológicos mostraram que a solução de trealose proporciono uma melhoria inesperada na preservação da cartilagem. Conforme mostrado na figura 5, a trealose proporcionou uma redução significativa na largura de lesões de cartilagem significativas, conforme é definido pela 25 largura de lesões na cartilagem tibial, em que as perdas de condrócitos e de proteoglicanos se estendem através de 50% ou mais da espessura da cartilagem original. Tais medições são realizadas usando um micrômetro ocular de seções transversais histológicas manchadas do compartimento mediano da articulação.

Outra medida da preservação a cartilagem é mostrada na Figura

6. A trealose demonstrou um aprimoramento significativo na razão da profundidade da lesão, que é calculada pela comparação da profundidade da lesão com a espessura da cartilagem original, que é estimada mediante a medição da distância do platô tibial original extrapolado até a linha da pegada. Essas medições são realizadas usando um micrômetro ocular de seções transversais histológicas manchadas do compartimento mediano da articulação.

A conservação da cartilagem também se correlacionou com a extensão da degeneração do colágeno. A figura 7 mostra que a trealose reduziu significativamente a largura das lesões da cartilagem que exibem depleção de colágeno, caracterizada como acentuada ou severa, conforme 10 medido usando um micrômetro ocular para avaliar a espessura da seção transversal da cartilagem que apresenta colocação de colágeno reduzida. A extensão da degeneração de colágeno é definida conforme exposto a seguir: Lesão grave (perda total ou quase total de colágeno até a marca, >90% de espessura)

Lesão acentuada (se estende através de 61 a 90% da espessura

da cartilagem)

Lesão moderada (se estende através de 31 a 60% da espessura da cartilagem)

Lesão moderada (se estende através de 11 a 30% da espessura da cartilagem)

Lesão mínima (muito superficial, afetando apenas até 10%) Trealose também melhorou as classificações da degeneração da cartilagem, que é uma medida da viabilidade celular da cartilagem remanescente. As pontuações da degeneração da cartilagem foram determinadas histologicamente pela estimativa da área de matriz de cartilagem não-viável (perda significativa de condrócito e proteoglicano, porém retenção de colágeno) e matriz de cartilagem completamente ausente, a seguir, pela estimativa da porcentagem daquela área em comparação com a área da área em seção transversal da cartilagem original extrapolada. Uma pontuação de 1 a 5 é atribuída, com uma pontuação de 1 indicando a degeneração da cartilagem de 10% ou menos, e uma pontuação de 5 indicando a completa degeneração da cartilagem. Na figura 8, a zona 1 refere-se a um terço do platô da tíbia mediano mais próximo do menisco transfectado. A zona 1 é a área que possui o dano à cartilagem mais grave no modelo MMT, e foi considerado extremamente desafiador como um alvo para as terapias de OA. A zona 3 é a terça parte do platô tibial mais distante do sítio cirúrgico, e sustentado pela 5 menor quantidade de lesão da cartilagem. A zona 2 foi considerada como sendo a área da lesão da cartilagem intermediária e é representada por um alvo razoável para as terapias de OA. A trealose estatisticamente melhorou a pontuação da degeneração da cartilagem em todas as três zonas.

Exemplo 4: Modelo ACLT de Coelho da osteoartrite A formulação de trealose (uma solução a 5% de trealose em

tampão de glicina 3 mM-HCI com um pH de aproximadamente 3) descrita acima também foi testada no modelo de transecção do ligamento cruzado anterior de coelho (ACLT) de OA. A cirurgia de ACLT desestabilizou o joelho de coelho até uma extensão maior do que a transecção do menisco, resul15 tando não apenas na deterioração da cartilagem substancial, mas também na formação de osteófitos. Estudos investigando o desenvolvimento e regulação da formação de osteófitos no modelo de coelho de OA detctaram formações tipo placa tão cedo quanto 4 semanas após ACLT, e o crescimento de osteófitos em todos os compartimentos do joelho por 12 semanas após a 20 ACLT.

Os coelhos foram anestesiados. O bloco de gordura patelar foi retraído, e a ACL foi isolada. O ligamento cruzado anterior foi agravado co uma lâmina cirúrgica. Os tecido da cápsula fibrosa e subcutâneo foram fechado s antes da pele ser suturada. Iniciando uma semana após a cirurgia, 25 injeções intrarticulares foram administradas semanalmente durante sete semanas, seguido de eutanásia em 8 semanas. A degradação da cartilagem foi determinada histologicamente usando uma escala Mankin modificada. Pontuações elevadas indicaram degradação da cartilagem mais extensa, com uma pontuação máxima de 18.

Conforme mostrado na figura 9, a formulação de trealose for

neceu uma melhoria significativa na pontuação de Mankin modificada em comparação com os animais não tratados, (n = 15), indicando a degeneração da cartilagem diminuída como resultado das injeções de trealose intrarticulares.

Terminologia

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" é aquela quantidade de um agente para alcançar um efeito farmacológico. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" inclui, por exemplo, uma quantidade profilaticamente eficaz. Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz para alcançar um efeito farmacológico desejado ou melhoria terapêutica sem efeitos colaterais adversos indevidos. Por exemplo, uma quantidade eficaz refere-se a uma quantidade que aumenta a operatividade, a qualidade de vida, aumenta a capacidade do paciente de aumentar a mobilidade ou aumenta a carga de suportar o peso, ou diminui a dor, ou aumenta o crescimento no osso e cartilagem de uma ou mais articulações, ou reduz a distorção da articulação, dor, inchaço ou dureza. A quantidade eficaz de um agente será selecionada pelos versados na técnica dependendo do paciente e do nível da doença. É entendido que uma "quantidade eficaz" ou "uma quantidade terapeuticamente eficaz" pode variar de indivíduo para indivíduo, devido à variação no metabolismo de agentes terapêuticos e/ou agentes procinéticos, idade, peso, condição geral do indivíduo, o problema de saúde sendo tratado, a gravidade do problema de saúde sendo tratado e o julgamento do clínico que está prescrevendo.

"Tratar" ou "tratamento" refere-se a qualquer tratamento de um distúrbio ou doença associado ao osso, cartilagem de distúrbio de tecido mole (como a sinóvia), como prevenção da ocorrência de distúrbio ou doença 25 em um indivíduo que pode estar predisposto ao distúrbio ou doença, mas que não foi ainda diagnosticado como possuindo o distúrbio ou doença; inibição do distúrbio ou doença, por exemplo, interrupção do desenvolvimento do distúrbio ou doença, alívio do distúrbio ou doença, causa da regressão do distúrbio ou doença, alívio de uma condição causada pela doença ou 30 distúrbio ou interrupção dos sintomas da doença ou distúrbio. Deste modo, para uso na presente invenção, o termo "tratar" é usado da mesma maneira que o termo "evitar". Por "coadministrado" se entende a administração simultânea na mesma formulação ou em duas formulações diferentes que são combinadas em uma formulação para administração. Em uma modalidade, o HA e o outro componente são coadministrados através da aplicação na mesma 5 formulação.

O termo "indivíduo", para uso na presente invenção, refere-se a um animal, em uma modalidade, a um mamífero e, em outra modalidade, a um ser humano, que pode se beneficiar das composições e métodos da presente invenção. Não há limitação do tipo de animal que poderia se bene10 ficiar dos presentes métodos. Um indivíduo, independentemente se é um ser humano ou animal não humano, pode ser chamado de um indivíduo, sujeito, animal, hospedeiro ou receptor. Os métodos da presente invenção possuem aplicações na medicina humana, medicina veterinária, bem como na criação de animais em geral, domésticos ou selvagens. Em uma modalidade, o 15 indivíduo candidato é um mamífero como um ser humano, animal de tste de laboratório, como um camundongo, rato, coelho, cobaia, hamster ou espécie de ave, como um pássaro doméstico e animal de veterinário, como um cachorro, gato, cavalo, vaca, ovelha, etc.

O versado na técnica observará características e vantagens adi20 cionais da invenção com base nas modalidades acima descritas. Em conseqüência, a invenção não deve ser limitada pelo que foi particularmente mostrado e descrito, exceto conforme indicado pelas reivindicações anexas. Todas as publicações e referências aqui citadas são aqui expressamente incorporadas, através de referência, em sua totalidade.

Claims

1. Composição para o tratamento de uma condição de articulação, que compreende: uma formulação que compreende ácido hialurônico (HA) de alto peso molecular; e pelo menos um estabilizante, sendo que o estabilizante aumenta a estabilidade da formulação.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o HA de alto peso molecular tem um peso molecular na faixa de cerca de 1 MDa a 6 MDa.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o HA está presente em uma concentração líquida de pelo menos cerca de 1 mg/mL.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o HA é liofilizado.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o pelo menos um estabilizante é selecionado do grupo consistindo em tocoferol, derivados de tocoferol, manitol, sacarose e trealose.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o pelo menos um estabilizante é trealose.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um estabilizante está presente na faixa de cerca de 0,1% a 50%, em peso da composição.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a formulação é estável à temperatura ambiente.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, que compreende, ainda, pelo menos um componente adicional.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, em que o componente adicional é selecionado do grupo que consiste em um glicosaminoglicano (GAG) e um precursor do GAG e está presente na composição em uma razão de HA para componente adicional na faixa de cerca de 1:0,005 a 1:100.

11. Kit, o qual compreende: uma composição de ácido hialurônico (HA) de alto peso molecular e pelo menos um estabilizante; e uma seringa que compreende a composição de HA e estabilizante em uma única câmara.

12. Kit, de acordo com a reivindicação 11, em que o HA tem um peso molecular maior que 1 MDa.

13. Kit, de acordo com a reivindicação 11, em que o HA está presente em uma concentração de líquido de pelo menos cerca de 1 mg/mL.

14. Kit, de acordo com a reivindicação 11, em que o HA é liofilizado.

15. Kit, de acordo com a reivindicação 11, no qual o pelo menos um estabilizante é selecionado do grupo consistindo em tocoferol, derivados de tocoferol, manitol, sacarose e trealose.

16. Kit, de acordo com a reivindicação 11, em que o pelo menos um estabilizante está presente na faixa de cerca de 0,1% a 50%, em peso da composição.

17. Kit, de acordo com a reivindicação 10, em que a composição compreende adicionalmente pelo menos um componente adicional selecionado do grupo consistindo em um glicosaminoglicano (GAG) e um precursor de GAG.

18. Kit, de acordo com a reivindicação 17, em que a seringa compreende adicionalmente uma câmara separada que compreende o pelo menos um componente adicional.

19. Kit, de acordo com a reivindicação 17, em que o pelo menos um componente adicional é liofilizado.

20. Método para o tratamento das articulações, que compreende: administrar uma formulação que compreende ácido hialurônico de alto peso molecular e pelo menos um estabilizante a um indivíduo que precisa de tal tratamento.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que a etapa de administraão adicional compreende armazenar a formulação à temperatura ambiente antes da administração.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que a etapa de administração compreende adicionalmente combinar a formulação com pelo menos um componente adicional antes da administração.