JP2009532467A - 安定化ペントサンポリサルフェート（ｐｐｓ）製剤およびその分析方法 - Google Patents

Abstract

哺乳動物において、骨関節炎、間質性膀胱炎、および他の状態の治療に有用な、様々なペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）製剤を提供する。これらの製剤は、分解および変色に対する抵抗性の改善ならびに生理的ｐＨでの安定性の改善を、滅菌後にさえも示した。これらの製剤のキャピラリー電気泳動分析は、従来技術のＰＰＳ製剤においてＰＰＳの分解を引き起こした条件下で、様々な製剤が安定であることを示す。
【選択図】 図１４

Description

本発明は、ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）製剤を対象とする。さらに詳細には、本発明は、滅菌後でも、分解および変色に対する抵抗性の改善ならびに安定性の改善がなされている、様々なＰＰＳ製剤を対象とする。本発明は、哺乳動物において、抗凝固剤としてこれらの製剤を使用する方法、ならびに／または関節炎および他の状態、例えば間質性膀胱炎を治療するためにこれらの製剤を使用する方法も対象とする。

関連技術
ペントサンポリサルフェート(pentosan polysulfate)（ＰＰＳ）は、多価陰イオン性多糖の混合物を含む、半合成ポリ硫酸化オリゴ糖である。ＰＰＳは、木本、例えばブナから得られる多糖（例えばキシラン）の化学的硫酸化により生成される。生じる生成物は、典型的には分子量約４０００〜１００００と推定される多分散ポリマー分子の混合物中に糖残基１個あたり約１．５〜１．９個の共有結合硫酸基の形態で約１５〜１７％の硫黄を含有するものである。ＰＰＳは、β−Ｄ−キシロピラノース１〜４個が結合したユニットが約１２から３０個の硫酸化直鎖多糖からなり（Ｍ_ｒ＝約４０００〜約１００００）、約１０ユニット毎にＤ−グルコン酸を有する。ＰＰＳは、典型的には植物性物質から半合成的に製造されるが、微生物から得ることもできる。

ＰＰＳは、ヒトにおける間質性膀胱炎を治療するための経口製剤として、および伴侶動物における骨関節炎を治療するための注射薬として、通常使用される（Ｆｕｌｌｅｒ，Ｇｈｏｓｈら、「Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｅｎｔｏｓａｎ ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｒｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」、Ｅｑｕｉｎｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２））。化合物ＰＰＳは、凝血塊の形成を予防する抗凝固剤としてもまた使用されることがある。ＰＰＳは、血腫、痔、凍傷、火傷、ならびに血栓症およびアテローム性動脈硬化症などの多パラメーター病の治療にも使用されてきた。

ＰＰＳの使用は普及の一途であるが、ある種の使用条件下で分解も変色もせず、様々な条件で使用することができる製品を開発する上で、基本的な問題が存続している。注射用ＰＰＳ製剤は、経時的に分解および変色する傾向があるため、有効期間が制限される。さらに、ＰＰＳの一部の製剤は、経時的に褐色を帯びることが観察された。加えて、ＰＰＳ製剤を規定するための慣用的な特性決定法は、品質管理における重要な要素であるが、一般に不十分であると考えられている。したがって、ＰＰＳ製剤の特定の特性のどれが安定性および臨床有効性に実際に関係するかは、現在のところ依然として不明である。

ＰＰＳの多分散性のために、サイズ、硫酸化度または部分分解に関する組成物中での変動を検出する、品質管理のための方法が必要となる。薄層クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｍａｆｆｒａｎｄ，Ｈｅｒｂｅｒｔら、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｅｎｔｏｓａｎ Ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ」、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ、第１７巻、別冊２、１９９１）または分光法などの標準的な分析方法は、これらの問題を解決しないことが示されている。ゲルクロマトグラフィーの使用で、硫酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムの存在に関する検査が首尾よくなされてきた。しかし、この方法の欠点には、分析時間が長いことおよびこの組成物をその構成成分へ分離する効率が悪いことが包含される。

キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による分析は、少なくともサイズにおいて異なるオリゴ糖を包含する一連のＰＰＳ分子を区別できると思われる、ピークプロファイルを作成するために使用されてきた（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｂｅｎｅｎｄら、「Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｅｎｔｏｓａｎｅ ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ８１７（１９９８）；Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｈｏｓｈら「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｅｎｔｏｓａｎ Ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍ（ＮａＰＰＳ）ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｏｕｒｃｅｓ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００１））。ＣＥ法で直面する１つの問題は、ピークの泳動時間の再現性にある。この問題は、コンピュータ・パターン認識およびフィンガープリント・プロファイルの再整列の方法に頼ることによって部分的に解決されてきた（Ｓｃｈｉｒｍ，Ｂｅｎｅｎｄら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｅｎｔｏｓａｎ ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｕｒａｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００１）。この強化法を使用せずに、１つのＰＰＳ源と別の研究における他の２つのＰＰＳ源とを、分析し比較することによって、得られたフィンフィンガープリントの比較が行われた（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら、１９９８、２００１）。Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔは、これら３つのＰＰＳ源が、短いオリゴ糖のピークレベルにおいて異なっていたことを示し、一部の不均一性が非ＰＰＳ種を反映しうることを示唆した（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら、２００１）。しかし、これらの論文は、分解するおそれのある製剤の特性、または所与のバッチ生産後の保存の影響を評価するために用いることができる方法を記載していなかった。

したがって、当技術分野において、分解および変色に抵抗するペントサンポリサルフェート製剤が必要であり、このようなＰＰＳ製剤の日常的で正確な特性決定を可能にする検査法が同時に必要である。本発明の様々な実施形態は、このような製剤およびその製剤の純度を確証する方法を提供する。

本発明は、ＰＰＳを含む様々な安定製剤を提供する。一実施形態では、この製剤は、約４から約８の範囲のｐＨを有する溶液中で冷蔵(refrigeration)せずに安定である。別の実施形態では、この製剤は約７から約８の範囲のｐＨを有する溶液中で冷蔵せずに安定である。いくつかの実施形態では、この製剤は、最終滅菌後に冷蔵せずに安定である。

いくつかの実施形態では、この製剤中のＰＰＳ分子は、分子量の実質的に対称な分布を有する。例えば、特定の分子量を有する分子の数を示すクロマトグラム（例えばこの製剤の試料の電気泳動図に示されるように）は、実質的に滑らかで、実質的に対称なベル形曲線でありうる。いくつかの実施形態では、この製剤中のＰＰＳ分子は、最終滅菌後に実質的に対称な分子量分布を有する。

いくつかの実施形態では、ＰＰＳ分子を含む製剤は、実質的に均一な分子量を有する。例えば、このＰＰＳ分子は、実質的に均一な分子量を有するＰＰＳ分子から本質的になりうる。一実施形態では、この製剤は、最終滅菌後に、実質的に類似のまたは均一な分子量を維持する。いくつかの実施形態によると、この製剤は最終滅菌後に実質的に類似の分子量を有する。例えば、この製剤の電気泳動図は、ＰＰＳ分子の存在に対応する実質的に滑らかなベル形曲線により特徴付けられることがある。いくつかの実施形態では、ＰＰＳ分子は実質的に約４７００から約１０７００ダルトンの範囲の分子量を有することがある。

いくつかの実施形態では、本発明による液体製剤は、ペントサンポリサルフェートから本質的になるオリゴ糖を含むことがあり、この製剤は冷蔵せずに安定である。

別の実施形態では、本発明の製剤は、様々な条件で安定である。例えば、この製剤は、６カ月間安定でありうる。一部の製剤は、最大１、２、３、または５年間安定でありうる。いくつかの実施形態では、この製剤は、室温より著しく高い温度で、例えば約１２時間、約１日、約１もしくは２週間、約１カ月、約６カ月、または約１年間などの期間、安定でありうる。

本発明は、ＰＰＳを約２５から約５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む安定製剤を提供する。いくつかの実施形態では、この製剤は、約１００から約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＰＳを含みうる。いくつかの実施形態では、約１〜５ｍｇ／ｍＬ濃度のこの製剤のキャピラリー電気泳動分析は、時間に対する吸収変化のグラフにおいて、ＰＰＳの存在に対応する実質的なベル型曲線を示す。このベル型曲線は、初期吸収に対応する前半および後期吸収に対応する後半を有する。これら半分同士がベル型のピーク部分で接する。ベル形内部の面積は、実質的なベル形曲線の前半において偏差を定義する任意のピークにより定義される合計面積よりも、実質的に大きい。他の実施形態では、ベルの高さは、ベル形の前半における任意のピークの高さよりも実質的に高い。

本発明は、ＰＰＳを含む製剤中の分解産物を検出する様々な方法もまた提供する。一実施形態では、この製剤は、強制分解条件に曝露される。次に、キャピラリー電気泳動を用いて、この製剤の試料に関する電気泳動図を用意する。電気泳動図から分解ピークを確認する。この分解ピークは、ベルのピークよりも実質的に高い。

本発明は、ＰＰＳを含む製剤を滅菌する方法もまた提供する。一実施形態では、ＰＰＳを含む製剤を調製し、次いで例えばオートクレーブ中の最終滅菌により滅菌する。ＣＥ分析などの方法を用いて、例えばサルフェート以外の１つまたは複数の分解産物を検出することによって、滅菌された製剤の安定性の特徴を示す。

本発明は、ＰＰＳを含む製剤中の分解産物を検出する方法もまた提供する。この製剤の試料に最初のキャピラリー電気泳動測定を行う。その後、この製剤を熱、酸、塩基、または時間の経過などの１つまたは複数の条件に供する。次いで、この製剤の試料に２回目のキャピラリー電気泳動測定を行う。最初および２回目の測定を、例えば、それらに対応する電気泳動図を比較することによって、比較する。２回目の測定は、最初の測定で示されなかった分解産物の存在（または欠如）を示す。

別の実施形態では、キャピラリー電気泳動を用いてペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）製剤の安定性の指標(indicium)を検出する方法を提供する。この製剤の試料を水に約１ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈する。（以下に定義する）ピーク分解能基準を満たすように、キャピラリー電気泳動を用いて、この製剤についての電気泳動図を用意する。電気泳動図は、時間に対する吸収の変化のグラフを含む。ベルを実質的に定義しＰＰＳに対応する、電気泳動図の実質的なベル形部分を確認する。

この製剤の安定性の一指標は、１つまたは複数のピークのサイズ特性と比較した、このベルのサイズ特性に基づき、ここで、サイズ特性は、谷から谷までの積分によって決定される。安定性の別の指標は、ベルの面積が、ＰＰＳに対応する曲線の全般にベル形部分に出現しうる１つまたは複数の二次的ピークの総和面積の、少なくとも約１３倍であることでありうる。安定性の別の指標は、ベルの高さが、ペントサン均一性基準を満たす任意の二次的ピークの高さの、約３倍超であることでありうる。安定性の別の指標は、ベルの高さが、３番目に高いピークの、約４倍超であることでありうる。いくつかの実施形態では、この製剤は、試料を調製する前に、時間の経過、または室温よりも著しく高い温度などの、分解促進条件に供されうる。電気泳動図の分析により、ＰＰＳが本明細書に定める、ペントサン均一性基準を満たすかどうかを示すことができる。

別の実施形態では、ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）を含む液体製剤が提供される。約１ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの試料濃度の製剤のキャピラリー電気泳動分析は、時間に対する吸収変化のグラフにＰＰＳの存在に対応する実質的にベル形曲線を示しうる。ベル形曲線は、初期吸収に対応する第１の部分および後期吸収に対応する第２の部分を含むことがある。第１の部分および第２の部分はピーク中央部分で連結することがある。いくつかの実施形態では、曲線の実質的なベル形部分の内部の面積は、実質的なベル形曲線の第１の部分に出現するすべての別個のピークにより定まる合計面積の約１３倍超であり、ここで、面積は谷から谷までの積分によって決定される。

本発明は、キャピラリー電気泳動を用いて、ＰＰＳ製剤の安定性の指標を検出する品質管理法をさらに提供する。約１ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する製剤試料を水で希釈する。キャピラリー電気泳動を用いて、製剤試料についての電気泳動図を用意する。この電気泳動図は、時間に対する吸収変化のグラフを含む。電気泳動図の実質的なベル形部分は、実質的にベルを定め、ＰＰＳに対応する。ベルは高さを有し、ベル内部の面積を定める。このベルは、初期吸収に対応する前半および後期吸収に対応する後半を有する。前半は１つまたは複数のピークを含む。各ピークはベルからのそのピークの偏差に対応する高さおよび面積を有する。この製剤の安定性の指標は、ベルのサイズ特性および１つまたは複数のピークのサイズ特性の比較に基づく品質管理の一要素として決定される。

なお別の実施形態では、本発明の製剤は、例えば最終滅菌後を包含して、褐色不純物を実質的に有さない、安定な滅菌ペントサンポリサルフェート製剤を含む。一部の製剤は、例えば最終滅菌後を包含して、ＰＰＳの分解産物を実質的に有さないことがある。

本発明の様々な実施形態は、ペントサンポリサルフェートを含有する製剤、このような製剤を使用する方法、およびこのような製剤を評価する方法を対象とする。本発明のペントサンポリサルフェート製剤は、抗凝固剤として、および／または、ヒト、食料生産哺乳動物、および伴侶哺乳動物（例えばネコ、イヌ、およびウマ）などの哺乳動物における関節炎（例えば骨関節炎）もしくは間質性膀胱炎、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）、例えばウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、および免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＡＩＤＳまたはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））などの他の状態を治療するために、使用することができる。ＰＰＳは、例えばこのような哺乳動物におけるものを包含して、血腫、痔、凍傷、火傷、ならびに血栓症およびアテローム性動脈硬化症などの多パラメーター病を治療するためにもまた使用することができる。

ＰＰＳは様々な条件で使用することができ、特に獣医学の背景では野外で使用しうることから、滅菌、微生物の攻撃、経時的保存、光、および熱などの様々な条件で分解および／もしくは変色に抵抗性または実質的に抵抗性の、ＰＰＳ製剤が必要である。

さらに、ＰＰＳは哺乳動物に摂取または注射されうることから、生理的ｐＨで安定な製剤がさらに必要である。

ＰＰＳのバッチ、例えば供給業者候補により提供されるバッチを評価するための再現性のある品質評価法もまた必要である。好ましくは、この方法は、分解後の産物に起こりうる変化を検出しなければならない。

様々なＰＰＳ製剤および様々な条件でのその製剤の変化を評価するためにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いる有効性を決定するために実験を行った。キャピラリー電気泳動装置を使用してＰＰＳ試料を分析し、電気泳動図に示される結果を、上に引用した研究に記載された情報源と比較した。これらの結果に基づき、分解の検出における有用性がＣＥにあるかどうかを判定することが可能であった。これらの実験から、分解抵抗性などの所望の特徴を有する様々なＰＰＳ製剤の確認もまた可能になった。

実験は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡＣＥ−ＭＤＱキャピラリー電気泳動システムで、Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｈｏｓｈら、２００１）により記載されたものと本質的に同じ方法を用いて行った。これらの実験は、本発明の安定化製剤が、現存する市販の製剤（Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標））のものと異なることを実証する。具体的には、本発明の安定化製剤は、Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）に存在しそれに特徴的であることが以前に実証された、かなりのレベルの低分子オリゴ糖を含有せず、ここで、Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）は、現在市販されている注射用剤形のＰＰＳの一例である（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｂｅｎｅｎｄら、１９９８；Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｈｏｓｈら、２００１）。上に論じたＤｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｂｅｎｅｎｄら（１９９８）およびＤｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｈｏｓｈら（２００１）、ならびにＳｃｈｉｒｍら（２００１）、Ｆｕｌｌｅｒら（１９９２）、およびＭａｆｆｒａｎｄら（１９９１）の論文は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明の実施形態には、哺乳動物への投与に適する最終滅菌されたＰＰＳ製剤が包含される。例えば、いくつかの実施形態では、この製剤は、薬物または栄養補助食品として哺乳動物に提供することができる。本発明の他の実施形態には、様々なＰＰＳ製剤を区別し、サルフェート以外の分解産物を包含する分解産物を検出する方法が包含される。さらに、この方法は、分解抵抗性などの所望の性質を有する様々なＰＰＳ製剤の確認を可能にした。

本出願で使用する以下の用語は、以下の意味をもつものとする。

「分解産物(degradation product)」（分解物とも呼ばれる）は、経時的に、ならびに／あるいは内的もしくは外的要因、例えば光、温度、ｐＨ、もしくは水の作用により、または賦形剤および／もしくは直接容器／密閉方式との反応により、もたらされる、物質における化学変化に起因する１つまたは複数の分子を意味する。ＰＰＳ製剤中の分解産物の出現は、分解産物の出現前後に測定された電気泳動図におけるＰＰＳに対応するベル形ピークの面積の全体的な減少、またはベル形曲線の前縁(leading edge)に出現する二次的ピークの数もしくは面積の増加によって、部分的に特徴付けられる。

いくつかの実施形態では、電気泳動図は、製剤中の分解産物が存在しないことを示すことができる。例えば、本発明の様々な製剤の電気泳動図において、ＰＰＳに対応するベル形曲線の面積は、１つまたは複数のピークの総和面積の少なくとも約１３倍であり、ここで、この面積は谷から谷までの積分、例えば手作業による谷から谷までの積分によって決定される。いくつかの実施形態では、ベルの高さは、下に定義するペントサン均一性基準を満たす任意のピークの高さの約３倍超である。

「強制分解」または「ストレス検査」は、物質を典型的な環境よりも過酷な実在条件または模擬条件に曝露することを伴う。場合によっては、これらの条件は、物質の加速検査に使用される条件よりも過酷なことがある。このような過酷な条件は、正常条件よりも著しく高いまたは低いｐＨ、温度、または圧力でありうる。（正常条件は、例えば標準温度および圧力で６．５〜７．５のｐＨ範囲を包含しうる）。強制分解は、他の条件または物質に、物質を曝露することを伴うこともある。強制分解は、典型的には、製剤原料のような物質に関して、強制分解産物および分解メカニズムに関するデータを提供するために行われる。医薬品などの物質が流通する間に遭遇するおそれのある過酷条件は、製剤原料の確定バッチをストレス検査することによって分析することができる。強制分解の研究は、成分分子に固有な安定性の特徴、例えばその分子の分解経路を、確立するために利用することができ、強制分解は、分解産物の同定を導きうることから、提案された分析手順の適性を支えることができる。この研究の詳細な性質は、個別の物質および医薬品の種類に依存するだろう。

「断片」は、電気泳動図に見ることができる不規則な非反復パターンのピークを有する、例えばＰＰＳの、不完全な分子を意味する。

ＰＰＳ製剤に関して「安定な」とは、それが実質的に一定量（例えば実質的に一定濃度）のサルフェートを維持し、実質的に変色を示さない（例えば実質的に褐色に変色しない）か、またはベル形曲線のペントサン主ピーク以前に泳動する全ピークの合計面積がペントサンの合計面積の５％を超えてはならないことを意味する。例えば「安定な」ＰＰＳ製剤は、貯蔵期間、例えば６カ月の貯蔵期間、または場合によっては最大１、２、もしくは３年間にわたりこれらの特徴を有することができる。「安定な」ＰＰＳ製剤試料のキャピラリー電気泳動分析は、可視分解ピークをほとんどまたはまったく示さないであろう。

「最終滅菌」は、すべての材料および容器を包含する最終形態の製剤が滅菌される工程を意味する。この最終滅菌工程は、例えば急速冷却液の存在もしくは不在下での湿式加熱、エチレンオキサイド、または放射線照射により行うことができる。最終滅菌工程を経た物質は、「最終滅菌された」と言われる。

ＰＰＳは、例えば、ＰＰＳナトリウム、ＰＰＳカルシウム、またはＰＰＳカリウムなどの塩として多くの場合製剤化されることを認識すべきである。ペントサンは、植物もしくは微生物から天然に得られるか、または合成することができる。したがって、本出願にわたるＰＰＳへの言及は、天然、合成、または半合成のいずれから得られたものに該当しようと、ＰＰＳおよびその様々な塩を表すことがある。

本発明の様々な製剤は、分解抵抗性などの１つまたは複数の有益な性質を有することがある。本発明によるこのような製剤は、ＰＰＳまたはその塩と、以下の成分のうち１つまたは複数とを含むことがある：亜硫酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、および／またはクエン酸などの１つまたは複数の緩衝剤；ＥＤＴＡなどの１つまたは複数のキレーターすなわちキレート剤；１つまたは複数の保存料；メチルパラベンなどの１つまたは複数の抗菌剤；１つまたは複数の抗酸化剤；ならびに他の任意の適切な賦形剤。本発明の様々な実施形態による一部の製剤では、ＰＰＳは、１つまたは複数の上記成分ならびにアミノ糖および／またはヒアルロン酸と組み合わせることができる。

本発明の様々な製剤に包含されうるキレーターの例には、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、ＥＤＴＡナトリウム、および他の公知のキレート剤が包含される。

本発明の様々な製剤に包含されうる緩衝剤の例には、クエン酸塩、水酸化ナトリウム／レブリン酸、酢酸塩、重炭酸塩、亜硫酸水素塩、水酸化ナトリウム／グリシン、リン酸塩、および他の公知の緩衝剤が包含される。

本発明の様々な製剤に包含されうる抗酸化剤の例には、例えばアセトン、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および他の公知の保存料が包含される。

本発明の様々な製剤に包含されうる抗菌剤の例には、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン、ベンジルアルコール、および他の公知の抗菌剤が包含される。

本発明の様々な製剤に包含されうるアミノ糖の例には、例えばグルコサミン塩酸塩、ガラクトサミン、グルコサミンサルフェート、グルコサミンホスフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノサミン、ならびにその断片、塩、および混合物が包含される。加えて、アミノ糖という用語は、本明細書において、また、化学的に修飾されていることができ、さらにアミノ糖の機能は保持しているアミノ糖を含む。このような化学修飾には、非限定的に、エステル化、硫酸化、ポリ硫酸化、アセチル化、およびメチル化が包含される。さらに、アミノ糖という用語は、上記のアミノ糖と非実質的に異なる任意の組成物に及びうることが企図される。

様々な製剤は、ヒアルロン酸もまた含むことがある。ヒアルロン酸は、非硫酸化グルコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、例えば動物から（例えばオンドリの鶏冠もしくはウシ硝子体液から抽出して）または微生物から（例えば細菌または酵母の発酵）から得ることができる。

本発明による様々な製剤は、任意の適切な濃度または量で前述の成分を１つまたは複数含むことがある。例えばＰＰＳは、約２５ｍｇ／ｍＬから約７５０ｍｇ／ｍＬもしくは好ましくは約２５から約５００ｍｇ／ｍＬ、またはさらに好ましくは約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することがある。別の例では、ＰＰＳは、約１０ｍｇから約５ｇの合計量で存在することがある。緩衝剤、例えばクエン酸ナトリウム、クエン酸、または他の緩衝剤などは、約１から約１００ｍＭなどの濃度で存在することがある。例えば、いくつかの実施形態では、クエン酸ナトリウムなどの緩衝剤は、約５０ｍＭ（１４．７ｍｇ／ｍＬ）の製剤中濃度を有することがあり、または、クエン酸などの緩衝剤は、約５５ｍＭ（約１０．５ｍｇ／ｍＬ）を構成することがある。ＥＤＴＡは、約０．０１％から約０．５％ｗ／ｖ、０．１ｍＭから約１ｍＭ、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、またはさらに好ましくは約０．２５％ｗ／ｖなどの濃度で存在することがある。キレーターは、約０．１から約１ｍＭなどの濃度で存在することがある。保存料は、約０．１％から約１％などの濃度で存在することがある。抗酸化剤は、約０．１から１０ｍＭなどの濃度で存在することがある。抗酸化剤は、約０．０２％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖの濃度でもまた存在することがある。賦形剤（例えば薬学的賦形剤）は、任意の適切な濃度で、例えば約１から約９０％の濃度で存在することがある。

本発明の他の実施形態では、様々な製剤は、１つまたは複数のこれらの成分を任意の適切な濃度または量で含むことがある。例えば、ＰＰＳは、約２５ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬ、またはさらに好ましくは約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することがある。緩衝液は、約０．００５％から約５％ｗ／ｖなどの濃度で存在することがある。亜硫酸水素ナトリウムは、約０．０１％から約１％ｗ／ｖ、約０．０２％から約１％ｗ／ｖ、１０ｍｇ／ｍＬ、またはさらに好ましくは約１％ｗ／ｖなどの濃度で存在することがある。（本発明の製剤に添加すると、メタ重亜硫酸ナトリウムは、二酸化硫黄および亜硫酸水素ナトリウムに変換することができる。複数の実施形態では、メタ重亜硫酸塩の約２５％からほとんどすべてが、本発明の製剤に添加されたときに二酸化硫黄および亜硫酸水素ナトリウムに変換する）。

ＥＤＴＡは、約０．０１％から約０．５％ｗ／ｖ、０．１ｍＭから約１ｍＭ、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、またはさらに好ましくは約０．２５％ｗ／ｖなどの濃度で存在することがある。クエン酸ナトリウムは、約０．１から約４％ｗ／ｖ、またはさらに好ましくは約１．４７％ｗ／ｖなどの濃度で存在することがある。クエン酸は、約０．５％から約２％ｗ／ｖ、またはさらに好ましくは約１．０５％ｗ／ｖなどの濃度で存在することがある。メチルパラベンなどの抗菌剤は、約０．０５％から約０．２％ｗ／ｖ、もしくは約１ｍｇ／ｍＬ、またはさらに好ましくは約０．１％ｗ／ｖなどの濃度で存在することがある。

本発明の製剤は、液体、固体、または凍結乾燥形態であってもよいが、好ましくは水溶液として製剤される。この製剤は、ｐＨ約４から約８などの任意の適切なｐＨを有する溶液でありうる。いくつかの実施形態では、この製剤は、約７から約８のｐＨを有することがある。例えば、この製剤は、ｐＨ約４から約８などの任意の適切なｐＨを有する溶液でありうる。当業者は、本明細書に照らして当業者に明らかな技法を用いて本発明の製剤を凍結乾燥し、凍結乾燥剤形を作りうることを認識すべきである。加えて、凍結乾燥剤形は、再構成後に本明細書に記載する任意の製剤の剤形を含むように製剤化することができる。

製剤の例は、以下のうち１つまたは複数を含むことがある：約２５から約５００ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＰＳ；約０．０５％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖ濃度のメタ重亜硫酸塩または亜硫酸水素塩（例えば亜硫酸水素ナトリウム）；約０．０１％ｗ／ｖから約０．５％ｗ／ｖ濃度の１つまたは複数のキレーター；約０．００５％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖの濃度の１つまたは複数の緩衝剤；約０．０２％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖ濃度の１つまたは複数の抗酸化剤；約０．０５％ｗ／ｖから約０．２％ｗ／ｖヒアルロン酸濃度の１つまたは複数の抗菌剤；およびグルコサミン。

いくつかの実施形態では、亜硫酸水素ナトリウムは、約１０ｍｇ／ｍＬなどの濃度で存在することがある。ＥＤＴＡは、約０．２５ｍｇ／ｍＬなどの濃度で存在することがある。クエン酸ナトリウムは、約１４．７ｍｇ／ｍＬなどの濃度で存在することがある。クエン酸は、約１０．５ｍｇ／ｍＬなどの濃度で存在することがある。メチルパラベンは、約１ｍｇ／ｍＬなどの濃度で存在することがある。

実施形態の一例は、ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）を約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度、亜硫酸水素ナトリウムを最大約２０ｍｇ／ｍＬの濃度、およびＥＤＴＡを約０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含む注射用剤形を含むことがある。この製剤は、約６から約７のｐＨ範囲で安定でありうる。この製剤は、例えば経口投与用の液体または注射用剤形などの任意の剤形に製剤化されることがある。

製剤の一例は、ＰＰＳを約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度、亜硫酸水素ナトリウムを最大約１０ｍｇ／ｍＬの濃度、ＥＤＴＡを約０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度、およびメチルパラベンを約１ｍｇ／ｍＬの濃度で含むことがある。この製剤は、約５．８から約６．２のｐＨ範囲で安定でありうる。この製剤は、例えば経口投与用の液体または注射用剤形などの任意の剤形に製剤化されることがある。

別の製剤の例は、ＰＰＳを約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度、亜硫酸水素ナトリウムを最大約１０ｍｇ／ｍＬの濃度、ＥＤＴＡを約０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度、およびメチルパラベンを約１ｍｇ／ｍＬの濃度で含むことがある。この製剤は、約７．８から約８．２のｐＨ範囲で安定でありうる。いくつかの実施形態では、この製剤のｐＨは、１％ｗ／ｖ水酸化ナトリウムで調整することができる。この製剤は、例えば経口投与用の液体または注射用剤形などの任意の剤形に製剤化されることがある。

本発明の様々な実施形態によると、本明細書に記載される医薬用ＰＰＳ製剤などのＰＰＳ製剤は、抗凝固剤として、および／またはヒト、食料生産哺乳動物、および伴侶哺乳動物（ネコ、イヌ、およびウマなど）などの哺乳動物における、関節炎、間質性膀胱炎、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）（ＢＳＥなど）、および免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＡＩＤＳまたはＦＩＶ）などの状態を治療するために、使用することができる。本明細書に記載する製剤は、血腫、痔、凍傷、火傷、ならびに血栓症およびアテローム性動脈硬化症などの多パラメーター病を治療するためにもまた使用することができる。

本発明の様々な実施形態によると、本明細書に記載するＰＰＳ製剤は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、または他の哺乳動物などの哺乳動物に、任意の適切な方法で、例えば上に確認される任意の１つまたは複数の状態を治療するために投与することができる。例えば、本明細書に記載する製剤は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、または皮下投与のための、局所および全身用製剤を含むことがある。様々な他の実施形態を、経皮パッチ、クリーム、静脈用溶液、点眼液、スプレー、リポソーム、または任意の他の適用および摂取法により投与するよう製剤化することができる。

いくつかの実施形態では、液体（例えば水性）ＰＰＳ製剤は、注射により投与することができる。いくつかの実施形態では、液体ＰＰＳ製剤は、経口投与することができる。いくつかの実施形態では、液体製剤は、最終滅菌されないことがある。

本発明のＰＰＳ製剤を、公知の方法によりさらに加工して、薬学的に許容できる組成物を生産することができる。ある場合では、これは、担体が液体または固体の形態であろうと、薬学的に許容できる担体を本明細書に記載する任意の製剤と共に使用することを伴いうる。例えば、この製剤は、丸剤、カプセル、液体、リポソーム、凍結乾燥組成物、硬または軟咀しゃく錠などの、任意の適切な液体または粉末の形態で投与されるようにさらに加工することができる。この製剤は、１つまたは複数の剤形で、例えば哺乳動物に、投与することができる。この製剤の投与形態は、１つまたは複数の疾患を治療する有効量で投与することができる。

本発明のＰＰＳ製剤は、哺乳動物に投与するために、例えば経口投与または注射投与のために、下記の任意の用量範囲で製剤化することができる。

本明細書に記載するＰＰＳ製剤の用量、例えば液体注射用用量は、ＰＰＳを例えば約１０ｍｇから約５ｇまたは約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの量で含むことがある。いくつかの実施形態では、約３ｍｇ／ｋｇの用量を注射により投与することができる。いくつかの実施形態では、投薬形態の量は、１回の注射で約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇのＰＰＳを注射するために十分な量を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＰＰＳ製剤の用量、例えば経口投与用の液体の用量は、約４ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの量のＰＰＳを含むことがある。いくつかの実施形態では、約１０ｍｇ／ｋｇの用量を経口投与することができる。いくつかの実施形態では、液体製剤の量は、１回の投与で約４ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの経口濃度のＰＰＳを送達するために十分な量を含む。

ＰＰＳ製剤の用量は、以下の任意の量のアミノ糖をさらに含むことがある：注射用について約２から約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇから約５ｇ、もしくは約２５から約５００ｍｇ／ｍＬ；または経口投与用について約１５から約５０ｍｇ／ｋｇ。いくつかの実施形態では、約６ｍｇ／ｋｇの量を注射により投与することができる。他の実施形態では、約２１ｍｇ／ｋｇの量を経口投与することができる。

ＰＰＳ製剤の用量は、以下の任意の量のヒアルロン酸をさらに含むことがある：注射用について約０．０１から５ｍｇ／ｋｇ、０．１から約５０ｍｇ／ｍＬ、もしくは約０．１から約３ｇ；または経口投与用について約０．１から１０ｍｇ／ｋｇ。いくつかの実施形態では、約０．１ｍｇ／ｋｇの量を注射により投与することができる。他の実施形態では、約０．２ｍｇ／ｋｇの量を経口投与することができる。

より小さな用量がヒトおよび小型哺乳動物に適することがあり、より大きな用量が大型動物に適しうることを認識すべきである。投薬量は、標的対象の質量に基づくことがある。例えば、投薬量は、標的対象、例えばヒトまたはウマなどの、体重１ｋｇあたり約３ｍｇを構成することがある。当業者は、特定の製剤についての投薬量がその製剤中のＰＰＳの塩に部分的に依存することを認識するものである。例えば、ＰＰＳナトリウムを含む製剤は、ＰＰＳカルシウムを含む製剤と異なる投薬量を有することがある。投薬量の計算は、体重、表面積、および種差を評価することによって当業者が決定することができる。

本発明の様々な実施形態によると、用量は様々な回数で投与することができる。本明細書に記載する製剤の経口用量は、１日１回、２または３日に約１回、１週間に２回、または１週間に１回投与することができる。本発明による経口製剤は、約４から約５週間、数カ月間、数年間、または永続的な、全持続時間で投与することができる。

筋肉内、関節内、皮下、または静脈内投薬などの注射用用量は、１日約１回、２または３日に約１回、１週間に２回、１週間に約１回、２週間に約１回、１カ月に約１回、または他の投与回数で投与することができる。このような用量は、約４週間から約５週間、約２カ月、約６カ月、または他の治療期間などの期間で投与することができる。

本明細書に記載する用量は、例えば用量が定期的に（例えば１日約１回）１から３カ月などのある期間投与され、次いで１〜３カ月などのある期間投与されず、次いで再び定期的に（例えば１日約１回または何か他の適切な間隔で）１〜３カ月などのある期間投与される、パルス療法でもまた投与することができる。他の投薬方式は、本明細書に照らして当業者に明らかである。

当業者は、本明細書に記載する製剤の単回用量、例えば単回一日用量を、分割して、および／または１日を通して異なる回数で、投与することができることを認識するものである。例えば、半分を１日２回、例えば半分を朝に、そして半分を夜に投与するか、または１日に３回投与するよう、１日量を分割することができる。

本発明のいくつかの実施形態では、キャピラリー電気泳動は、本発明のＰＰＳ製剤などのＰＰＳ含有物の試料を分析するために使用することができる。このような分析は、例えば以下のうち任意のものを達成するために用いることができる：任意のポリマー分解産物の検出；追加の分解指数としての遊離サルフェートの決定；滅菌の前後での異なる試料ロットの比較；試料と、別のＰＰＳ含有製剤またはＣａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）などの公知の公表試料との比較。

本発明のいくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動を用いて、ＰＰＳ製剤の１つまたは複数の試料を分析することができる。キャピラリーゾーン電気泳動は、自由溶液中で行うことができる。キャピラリーゾーン電気泳動時の成分の分離は、様々な成分の質量対電荷比の差に基づくことがある。均一な緩衝溶液を使用することができる。定常電場を適用することができる。キャピラリーゾーン電気泳動の工程はｐＨに依存することがある。

キャピラリーゾーン電気泳動のための緩衝添加剤は、任意の適切な緩衝剤を含むことがあり、以下のうち任意のものを包含しうる：無機塩、有機溶媒、尿素、スルホン酸、陽イオン界面活性剤、セルロース誘導体、アミン、有機酸、および有機ポリマー。

本発明の様々な実施形態による、ＰＰＳ製剤に関するＣＥの分析能は、公知量の亜硫酸塩の存在下または不在下でのサルフェートの定量、合計ペントサンレベルの定量、断片および／または分解産物の検出および定量、ならびにオリゴ糖の検出および定量を可能にする。

分解および有益なＰＰＳ製剤を確認するために使用する手順は、図面にさらに十分に説明されており、これらの図面は、キャピラリー電気泳動システムの例、異なる状況で実現される安定性および分解の程度を示す結果、ならびに所望の性質を有すると確認された製剤を示す。

図１に、ペントサンポリサルフェートの基本化学構造を示す。図では、Ｒは水素またはＳＯ_３ ⁻Ｎａ^＋のいずれかを表す。

図２に、高性能キャピラリー電気泳動（ＨＰＣＥ）装置２００の概略図の一例を示す。ＨＰＣＥ装置は、陽極液（入口）２６０および陰極液（出口）２５０に接続した電極２３０、２４０を有する電源２１０を含む。電源２１０は、陽極液（＋）２６０と陰極液（−）２５０との間に電圧を発生する。キャピラリー７０の一端を陽極と共に陽極緩衝液２６０に浸し、もう一端を陰極と共に陰極緩衝液２５０に浸す。検出器２２０は、キャピラリー７０における吸収を検出するように設定される。

図３に、キャピラリー３００の一例の断面図を示す。キャピラリー３００は、内部３１０および外側被覆３３０を備えることがある。内部３１０は、溶融石英(fused silica)または別の適切な材料を含むことがあり、約３６０μｍという合計直径を規定することがある。被覆３３０は、ポリイミド被覆または他の適切な材料を含むことがあり、約１２μｍの厚さを有することがある。キャピラリー３００は管の形状のことがあり、中空のインナー・シャフト３２０を規定する。インナー・シャフト３２０は実質的に円筒形状のことがあり、約２０〜１００μｍの直径を有することがある。

図４に陰イオン性４３０、中性４４０、および陽イオン性４５０の分析物の分離における電気泳動および電気浸透の概略図の一例を示す。管に試料を注入後に、管４１０の右端および電極（陰極４７０）を緩衝液槽に置き、同時に管４１０の左端およびもう一方の電極（陽極４６０）を別の緩衝液槽に置く。この電極と陰極との間に電圧をかける。図４に示すように、管４１０中のバルク液は、電気浸透または電気浸透流（ＥＯＦ）と呼ばれる過程において正に荷電した水和陽イオンと共に流動する。他の正に荷電した分析物は、同じ方向に移動する。負に荷電した陰イオン性分子は、陰極に向けて反対方向に移動する。陰イオン性群についてＥＯＦが電気泳動移動度を超えたならば、この陰イオンは他方向に移動するであろう。電極の極性を逆転して、試料中の陰性荷電した陰イオンが検出器窓４２０を通過することを確認することができる。

電気泳動移動度およびＥＯＦは、効率的に、試料の種種の成分を管４１０中で種種の速度で移動させる。したがって、種々の分子型は種々の時間に検出器窓４２０に達する。特定の光吸収分子が検出器窓４２０を通過して流動した場合には、その通過は光吸収の変化として直接検出することができる。この分子が（ペントサンのように）光吸収性でないが、同様に荷電した光吸収性の緩衝液成分を置き換えるならば、この分子は、緩衝液による光吸収における減少として間接的に検出することができる。

図５に、試料製剤に関して電気泳動測定を行うためのシステムの一例を示す。さらに具体的には、図５に３２ Ｋａｒａｔソフトウェア・パッケージ（バージョン５、ビルド１０２１）からのローディング画面のプリントアウトを示す。入口ポート５１０および出口ポート５２０の一例を、重水素ランプ５３０および重水素ランプ５３０による光出力の波長５４０と共に示す。

図６Ａに、試料および緩衝液がキャピラリーを通過して移動するときに、同様に荷電した光非吸収性の試料が光吸収性の緩衝液と置き換わり、緩衝液濃度が減少した区域が生じることを示す。図６Ｂのグラフに示すように、試料が検出器窓を通過するときに、検出器は光吸収６４０の減少に続き、試料通過後にベースライン光吸収への復帰を検出するであえろう。種々の分子が種々の速度で効果的に管を移動し、種々の時間に検出器窓に達することから、これらの分子を分離し、検出器窓４２０で光吸収を検出することによってこれらの分子を識別することができる。

結果を表示するにあたり、間接検出法を用いて得られた電気泳動図を便宜上反転できることを認識すべきである。例えばＰＰＳは、上下逆にするとピークを形成する「谷」を誘発することができる。グラフ表示とは無関係に、ＰＰＳの「谷」または「ピーク」は、「ベースライン」から実質的な偏差を表す。この互換性を認識して、本明細書の目的のためにＰＰＳのＣＥ表示は、「谷」よりもむしろ「ピーク」として表される。

全般的に、図７〜１３に示す電気泳動図は、数分間にわたる全般的にベル形の主吸収ピークおよび、より短時間にわたる複数の他の吸収ピークを特徴とする。主ピークは、全般的にこれらの電気泳動図の中央付近に出現する。とりわけ、多くの電気泳動図では、ベル形の主吸収ピークは、その前縁に複数の連続する吸収ピークを有し、この前縁は電気泳動図曲線の左側であり初期に検出される。これらのピークは、ＰＰＳの低分子量分子に対応すると思われる。これらの分子は小さいためキャピラリーをより迅速に移動することができ、したがって、電気泳動図において、ベル形頂上に対応するＰＰＳについての主ピークよりも初期に検出される。

図７〜９に、本発明により製剤化されなかったＰＰＳ含有物質の電気泳動図を示す。これらの電気泳動図は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて作製した、時間に対する吸収変化の曲線である。図７および９はＤｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｂｅｎｅｎｄら（１９９８）からの転載である。図７に、Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）および未確認のＰＰＳ製品のキャピラリー電気泳動分析を示す。図８は、Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｈｏｓｈら（２００１）からの転載であり、ＣＺＥを用いて作製した曲線を示す。図８左下の曲線Ｄ、Ｅ、およびＦは、比較的滑らかなベル形曲線であり、実質的に均一な分子量を有するＰＰＳ試料に関するＣＥ分析を示す。これらの曲線のＰＰＳ部分（各グラフの中心近くの全般的なベル形に対応する）は、グラフのＰＰＳ部分に別個のピーク（ベル頂上での主ＰＰＳピーク以外）を実質的に有さない。

したがって、図７〜９の様々な電気泳動図において幅広いＰＰＳピークの前縁におけるこれらのピークの存在は、異なる（または不均一な）分子量を有するオリゴ糖を示す。ＰＰＳのベル形曲線の左側部分の各連続ピークは、異なる分子量（または異なるセットの分子量）を示す。この不均一性の性質（ベル形の左側での複数のピークに対応する）は、生物学的有効性に必要であるかが議論されてきた。しかし、実質的に均一の分子量のＰＰＳを有する本発明の様々な実施形態もまた生物学的に有効であると考えられる。したがって、本発明は、その前縁のピークが少ないことに実証されるように、含まれる不均一オリゴ糖のレベルが減少したＰＰＳ製剤を提供する。これらの製剤について、ＰＰＳ分子は実質的に類似（または実質的に均一）の分子量を有すると言われている。

本発明により製剤されなかったＰＰＳ試料の不純物を示すグラフの一例は、図７の一番上のグラフである。このグラフは、一連の短時間のピークを示し、そのピークは、著しく長い時間をかけて、より滑らかな曲線に徐々に移行する。この滑らかな曲線は、全般的にベル形であるが、「ベル」の前縁（左）側は一連のピークを示す。図７では、これらのピークは、大型のＰＰＳ分子に対応する主要なベル形曲線よりも実際高い吸収レベルに達する。これは、試料中に不均一オリゴ糖の存在が増加していることを示す。図７の一番下のグラフでは、ピークは主要なＰＰＳ曲線よりもずっと小さく、したがって不均一なオリゴ糖の率が小さいことを示している。

図８に本発明により製剤されなかったＰＰＳ試料についての６個の吸収曲線を示し、上３個は１つの製造業者に対応し、下３個は別の製造業者に対応する。グラフ上部の説明に示すように、曲線のＰＰＳ部分は約７分から約１７分の吸収に対応する。最も上の曲線３つは、小型オリゴ糖の著しい存在することを示す。これらの最も上の曲線は、相当な大きさの前縁のピークを示し、したがって、比較的不均一な組成物であること、すなわち分子量範囲が広いことを示す。下側の３つの曲線は、実質的に小型のオリゴ糖（またはピーク）がないこと、およびより均一な構造であること、すなわちより対称なベル形分子量分布を有するＰＰＳ分子であることを示す。したがって、最も下の滑らかな曲線は、実質的に均一な分子量を有するＰＰＳ分子の存在を示し、すなわち不均一な分子量を有するオリゴ糖が存在しないことを示す。

様々な電気泳動図を比較する上で、ＰＰＳに対応するグラフの部分は多くの場合でベル形であり、単一ピークに対応するグラフの任意の領域よりも広いことを認識すべきである。ピークは、これらのグラフの多くに存在する「ベル形」全体を多くの場合でゆがめるものの、全般的ベル形は、任意の単一ピークについての時間よりも実質的に長い時間にわたりｙ軸における全体的増加、（任意の単一ピークではなくＰＰＳに対応する）ピーク、および次いでｙ軸における全体的減少を特徴とするため、依然として判別することができる。したがって、ＰＰＳに対応するベル形および「ベル」の中心近くのそのピークは、グラフに存在しうる任意の特定の１つまたは複数のピークと混同してはならない。

図１０〜１３に、市販のＰＰＳ含有物質であるＣａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）の単一試料についての数個のＣＥ吸収曲線を示す。

本明細書に記載するＣＥ分析について、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐａｃｅ／ＭＤＱキャピラリー電気泳動システムを使用して、ＰＰＳを含む製剤を分析した。使用した方法は、Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔらが「Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｅｎｔｏｓａｎｅ ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ８１７（１９９８）に概要した方法に実質的に類似していた。溶融石英カラムを使用した。キャピラリーを１Ｍ ＮａＯＨで前処理した。ベンゼン−１，２，４−トリカルボン酸（ＢＴＣ）を使用して電気泳動を成し遂げた。ＢＴＣ（Ｓｉｇｍａから入手）３６８ｍｇおよび脱イオン水５０ｍＬを用いてＢＴＣを調製した。０．１Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨを４．９に調整した。水を２００ｍＬまで添加し、ｐＨ４．９で終濃度８．７５ｍＭのＢＴＣ緩衝液とした。ベンゼン−１，２，４−トリカルボン酸（ＢＴＣ）を用いて電気泳動を成し遂げた。ＢＴＣ（Ｓｉｇｍａから入手）３６８ｍｇおよび脱イオン水５０ｍＬを用いてＢＴＣを調製した。０．１Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨを４．９に調整した。水を２００ｍＬまで添加し、ｐＨ４．９で終濃度８．７５ｍＭのＢＴＣ緩衝液とした。

泳動用緩衝液でキャピラリーを６０分間すすいでから、第１回のキャピラリー電気泳動測定を行い、次いでＣＥ測定同士の間に泳動用緩衝液で１０分間すすいだ。すべての試薬および試料は、使用前に０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。注入は、圧力０．５ｐｓｉを用いて２０秒間行った。キャピラリーをＢＴＣに浸し、キャピラリー外側のどのような試料残渣もすすいで除去した。ＣＥは２０ｋＶで２０から４０分間泳動した。

Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ（１９９８）に記載されたように逆転した極性を適用した。バックグラウンド電解質の吸収は、波長２１７ｎｍでモニターした。キャピラリー中の分子量分離の有効性は、Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）の異なるオリゴ糖の分離を分析することによって判定した。Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）試料を水で１００ｍｇ／ｍＬから３ｍｇ／ｍＬに希釈した。キャピラリーは以下の性質、すなわち検出２１７ｎｍ、総キャピラリー長６７ｃｍ、有効長５０ｃｍ、内径５０μｍを有した。

図１０〜１３に、Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）を濃度約３ｍｇ／ｍＬ含有する水溶液にこれらの方法を適用した結果を示す。約１から約５ｍｇ／ｍＬのＰＰＳ試料濃度を用いて類似の結果を得られることを認識すべきである。これらの図は、追加的にカラム調整を行って泳動時間を延長することによって得られた、単一試料が次第に、分解能が上がる電気泳動図を示す。上に論じた図の多くと同様、これらのグラフのＰＰＳピークの前縁のピークは、小型オリゴ糖の存在を示す。

図１４に、水中に約２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するＰＰＳ原料単独の電気泳動図の一例を示す。ＰＰＳは、Ｎａｔｕｒｅ Ｖｅｔ（オーストラリア）（ロット番号Ｍ６２００４０３７）から得られた。電気泳動図における比較的滑らかなベル形曲線は、小型オリゴ糖の欠如およびＰＰＳが実質的に均一な分子量であることを示す。このグラフから、ベル形曲線の前縁の任意のピークの高さおよび面積が、ＰＰＳに対応する全体的なベル形曲線の大きさおよび面積に比べてわずかであることが明らかである。これと同じ現象は、下記の本発明の様々な実施形態に対応する他の電気泳動図、例えば図１６Ａ〜１７Ｂで観察することができる。

図１５Ａおよび１５Ｂに、製剤が調製されてから２年超の市販のＰＰＳ製剤についての電気泳動図を示す。製造からＣＥ分析までに、この製剤は２年超経過していた。その期間の大部分、試料は冷蔵せず、室温よりも著しく高い（すなわち１８〜２７℃よりも高い）温度に曝露した。その期間にわたり、製剤の色は、本来の麦わら色〜淡黄色から暗褐色に変化した。図１５Ａおよび１５Ｂの２つの曲線は、約１５分ですべてのピークを示すように縦座標の尺度を設定したため、わずかに異なるように見える。この製剤（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｅｔ（オーストラリア）ロット番号Ｇ１０３）の内容を下記表１に記載する。いくつかの実施形態では、この製剤は、例えば注射によりウマの治療に使用することができる。

図１５Ａおよび１５Ｂの各電気泳動図は、単一の高く鋭いピーク１５１０、１５２０をＰＰＳピークの中央付近に示し、分解産物の疑いがあることを示している。これらのピークは「分解ピーク(degradation peak)」と呼ばれることがある。ここで、図１５Ａおよび１５Ｂのピーク１５１０、１５２０のそれぞれはＰＰＳピークの左中央部にある。類似した単一の高く鋭いピークは図２１および２４（それらは本発明のＰＰＳ含有製剤に対応する）、および図２４（Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）の試料に対応する）にもまた出現し、それぞれは水酸化ナトリウム処理による強制分解に供されたものである。したがって、図１５Ａおよび１５Ｂにおけるこれらの分解ピークは、ＰＰＳ製剤、例えば市販の製剤に経時的に起こりうる分解の一例を示す。

図１６Ａ〜２０Ｂに、本発明の様々な実施形態によるＰＰＳ製剤１２例のキャピラリー電気泳動分析を示す。１２個の製剤を下記表２に明らかにする。これらの製剤は、上記の方法により調製された。当業者は、この製剤に添加すると、メタ重亜硫酸ナトリウムの一部またはすべてが二酸化硫黄および亜硫酸水素ナトリウムに変換されることを認識するであろう。ｐＨを表す左から３番目の欄は、測定したｐＨではなく予想されるｐＨであることにもまた留意すべきである。測定したｐＨ（「ｍｐＨ」）は、右側から１番目の欄に提供されている。試料２および３の製剤についてｐＨは実際には測定しなかったが、これらの試料はその化学的類似性により、群１の製剤について測定した試料とほぼ同一のはずである。したがって、製剤２Ｂおよび３ＢについてのｐＨは、１Ｂについて測定したｐＨと実質的に同一の約ｐＨ４．１５であると予想される。

したがって、試料１からの４個（１Ａ〜１Ｄ）、試料２からの４個（２Ａ〜２Ｄ）、および試料３からの４個（３Ａ〜３Ｄ）を包含する、１２個の製剤を評価した。Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）などの他の製剤にみられた広い分子量範囲の多分散混合物ではなく、これらの１２個の製剤は、均一な分子量の配合物を含むと思われる。Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）は、大型サイズのオリゴ糖と共に別個の小型オリゴ糖を包含すると思われるサイズ範囲のＰＰＳ分子の混合物を含有することが示されている。これら１２個のうち、製剤１Ａ〜１Ｃ、２Ａ〜２Ｃ、および３Ａ〜３Ｃは特に所望の性質を有することが確認された。特に、これらの９個の製剤は、最終滅菌または保存（例えば室温保存などの冷蔵しない保存）後に分解も色変化もまた示さなかった。最終的に、製剤１Ｂ、１Ｃ、２Ｂ、２Ｃ、３Ｂ、および３Ｃは、注射したときに刺激性ではないと予想される、生理学的にさらに適合できるｐＨ範囲を有する。

３つの「Ａ」群が、全試料にわたるＣＥ分析で実質的に類似の性質を有すると測定され、「Ｂ」、「Ｃ」、および「Ｄ」製剤も同様であったことに留意すべきである。言い換えると、電気泳動図は、例えば１Ｃ、２Ｃ、および３Ｃについて実質的に同一であった。

図１６Ａ〜２０Ｂのグラフは、実質的に滑らかなベル形曲線を示し、これは、これらの製剤中のＰＰＳが、不均一な分子量を有するオリゴ糖または小型オリゴ糖などの不純物を実質的に有さないことを示す。上述のように、各群（Ａ〜Ｄ）についての結果は、すべての試料（１〜３）にわたり一致していた。言い換えると、製剤１Ｂについての結果は、製剤２Ｂおよび３Ｂについて得られた結果と実質的に同一であった。

これらの検査による試料の物理的観察から、群「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」のすべての試料が実質的に透明で、変色していないことが明らかになった。従来技術の試料および群「Ｄ」の試料は、同様の条件で褐色に変化することが観察された。変色は試料の化学製剤の変化を明らかに表し、したがって、分解の指標であるものの、現在のところ、観察された褐色の変色などの変色を何が引き起こすかは正確には分かっていない。

図１７Ａ〜２０Ｂに、最終滅菌前後の試料Ａ〜Ｄについての電気泳動図をそれぞれ示す。（図１７Ａ、１８Ａ、１９Ａ、および２０Ａのような）「Ａ」付きの図は、測定前に滅菌しなかった試料についての電気泳動図を示す。（図１７Ｂ、１８Ｂ、１９Ｂ、および２０Ｂのような）「Ｂ」付きの図は、測定前に最終滅菌した試料についての電気泳動図を示す。したがって、例えば図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ滅菌前後の製剤「Ｄ」についての電気泳動図を示す。

これらの結果を得るために、（表２に示す）１２個の混合物からそれぞれ２本のバイアルについてＣＥ測定を行った。１本のバイアルは未滅菌で、もう１本は１２１℃で１５分間最終滅菌した。ＰＰＳ濃度は各バイアルについて最初２５０ｍｇ／ｍＬであった。群Ａの試料は、薄い麦わら色を有することが観察された。Ｂ群の試料は麦わら色を有することが観察された。Ｃ群の試料は黄色を有することが観察された。すべての試料は水で２．５から３ｍｇ／ｍＬに希釈し、注入バイアルに試料２００〜２５０μＬを入れた。最大４０分間２０ｋＶを適用することによってＣＥ分析を行った。

滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図は、ＰＰＳピークが滅菌によって実質的に乱されなかったことを示している。各試料についての電気泳動図において、曲線のＰＰＳ部分（「ベル」中央部に緩やかなピークを有する、数分間にわたる全般的なベル形曲線）は、滅菌前後のどちらにも感知できる分解産物を示さない。（電気泳動図が実質的に滑らかなベル形曲線を示すことを立証するためには、結果を得るために使用されるＣＥ法が他の試料における不均一性を検出できることを最初に立証することが推奨されることに留意すべきである）。

加えて、群Ａ、Ｂ、およびＣの試料は滅菌後に変色しなかった。しかし、群Ｄの試料は滅菌後に黒ずんだ。また、図２０Ｂの電気泳動図に示すように、群Ｄの試料は、オートクレーブ後にＰＰＳ曲線の前縁にあるピークの増加を示したものの、これらのピークはベル形のＰＰＳ曲線に比べてまだ比較的小さい。２２〜２５分近くの大きなピークがすべてのＤ群試料の電気泳動図に出現する。同様に見えるピークは、Ｄ群試料と一致するようにＨＣｌでｐＨ４．０に、そして１４．７ｍｇ／ｍＬに調整し、１４７μｇ／ｍＬに希釈したクエン酸ナトリウム溶液中で２２〜２５分近辺に生じた。したがって、Ｄ群試料の電気泳動図における２２〜２５分での同様に見えるピークは、Ｄ群試料に存在するが他の試料には存在しないクエン酸塩に対応すると思われる。

本発明の様々な実施形態によると、ＣＥ分析はＰＰＳ製剤中の分解産物を検出するために、例えば試料の強制分解後に使用することができる。例えば、本発明の様々な製剤を強制分解に供した。これらの試料のＣＥ分析は、分解ピークの存在を示し、それによって強制分解の結果としてＰＰＳが分解したことを示している。ＣＥ分析は、少なくとも１つの市販の製剤が、エージングおよび熱などの分解条件に供された後に分解を表すことを示すためにもまた使用された（図１５Ａおよび１５Ｂ参照）。

図２１および２２Ａ〜２３Ｂに、強制分解後の群Ｃ試料の電気泳動図を示す。図２１、２３Ａ、および２３Ｂに、９から１０分の間に生じる、分解産物を示す高いピーク２１１０、２３１０、２３２０の存在をそれぞれ示す。同様の分解ピーク１５１０は、図１５Ａおよび１５Ｂにみられる自然分解したＰＰＳで観察される。群「Ｃ」の試料は、実質的に透明のままで、これらの強制分解検査にわたり帯褐色も他の変色も示さなかったことが追加的に観察された。従来技術のＰＰＳ製剤は、電気泳動図で見ることができる分解産物の存在と共に経時的に褐色に変化することが観察された（例えば図１５Ａおよび１５Ｂ）。

図２１に、０．１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて６０℃で２４時間強制分解し、ＨＣｌおよび酢酸ナトリウムで中和後の群「Ｃ」試料についての電気泳動図を示す。（Ｃ群試料を含有するバイアルを熱水浴に浸け、６０℃で２４時間維持してからＣＥ分析を行った）。グラフは、ＰＰＳの存在を示す実質的なベル形曲線を示す。グラフの最初の大型ピークは、検査前に中和するために使用した塩酸由来の塩化物陰イオンを表す。２番目の大型ピークはサルフェートを表す。サルフェートの量（電気泳動図におけるサルフェートのピーク高により示される）は、強制分解中に発生した遊離サルフェートが原因で増加する。この電気泳動図は、８〜９分に追加のピークを示し、そのピークは塩化物を伴い、ペントサン由来ではない。（これらのピークはＮａＣｌを検査するときに出現することから、塩化物関連陰イオンを表すと考えられる）。残りの曲線は、グラフのペントサン部分中央の、分解産物を示す鋭い別個のピークを除いて本質的にベル形である。

図２２Ａおよび２２Ｂに、酸である０．１Ｎ ＨＣｌおよび熱（６０℃）に２４時間曝露後の試料１Ｃ（図２２Ａ）および２Ｃ（図２２Ｂ）の電気泳動図を示す。酸性条件での分解は、塩基性条件よりも激しく、電気泳動図を変更させる結果として、均一分布のＰＰＳ分子をもはや維持しない。

図２３Ａおよび２３Ｂに、１．０Ｎ水酸化ナトリウムを加えて６０℃で２４時間強制分解し、酢酸で中和後の試料１Ｃおよび２Ｃの電気泳動図をそれぞれ示す。図２１と同様に、図２３Ａおよび２３Ｂの電気泳動図は、ＰＰＳの存在を示す実質的なベル形曲線を示す。分解産物由来の鋭いピークもまた存在する。

図２４に、１．０Ｎ水酸化ナトリウムを加えて６０℃で２４時間強制分解後のＣａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）試料の電気泳動図を示す。群「Ｃ」試料の対応する強制分解に比べて、小さなベル形ＰＰＳ曲線および対応する短いピークが示すように、実質的に少量のＰＰＳが存在する。試料１Ｃおよび２Ｃについての図２３Ａおよび２３Ｂのように、図２４の電気泳動図は、強制分解後のＣａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）の分解ピーク２４１０を示す。さらに、Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）試料は、淡褐色に変化することによって変色することが観察された。

図２５Ａ〜２８Ｂに、異なる温度で保存したＰＰＳを含む滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図を示す。これらおよび後の分析では、有効キャピラリー長を５０ｃｍから７０ｃｍに増やし、その結果としてサルフェートおよびＰＰＳ成分についてさらに長時間の泳動となった。

図２５Ａおよび２５Ｂに、未滅菌で（図２５Ａ）、および１２１℃で１５分間オートクレーブすることにより滅菌し（図２５Ｂ）、次いで５°で３カ月間保存した製剤１Ａ（表２）の電気泳動図を示す。図２５Ａおよび２５Ｂに示すように、滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図は非常に類似している。本発明の製剤に及ぼす滅菌の効果はほとんどみられず、サルフェートのピークのわずかな増加および１０．５分でのオリゴ糖ピークのわずかな増加がみられる。どの試料も色が変化せず、その他に強制分解後のＣａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）試料の特徴である淡褐色の変色も示さなかった。

図２６Ａおよび２６Ｂに、未滅菌で（図２６Ａ）、および１２１℃で１５分間オートクレーブすることにより滅菌し（図２６Ｂ）、次いで４０℃および相対湿度７５％で３カ月間保存した製剤１Ａ（表２）の電気泳動図を示す。図２６Ａおよび２６Ｂの電気泳動図は、ペントサンピークの表示はほとんど示さず、サルフェートピークの非常に大きな増加を示す。ここで、これらの試料にＣＥ法を適用すると、経時的な高温環境での試料におけるＰＰＳの分解を示す。

図２７Ａおよび２７Ｂは、未滅菌（図２７Ａ）、および１２１℃で１５分間オートクレーブすることにより滅菌した（図２７Ｂ）製剤１Ｂ（表２）の電気泳動図を示し、ここで両製剤は、次いで５℃で３カ月間保存したものである。図２７Ａおよび２７Ｂに示すように、滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図は、非常に類似している。滅菌は、ペントサン製剤にほとんどまたはまったく影響を及ぼさないことが観察された。滅菌された試料は、冷保存条件で検出できる分解ピークをまったく有さずに安定であった。どの試料も色が変化せず、その他の点でも強制分解後のＣａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）試料の特徴である淡褐色の変色も示さなかった。

図２８Ａおよび２８Ｂに、未滅菌で（図２８Ａ）、および１２１℃で１５分間オートクレーブすることにより滅菌し（図２８Ｂ）、次いで４０℃および相対湿度７５％で３カ月間保存した製剤１Ｂ（表２）の電気泳動図を示す。図２８Ａおよび２８Ｂに示すように、滅菌および未滅菌試料の電気泳動図は非常に類似している。滅菌は、ペントサン製剤にほとんどまたはまったく影響を及ぼさないことが観察された。滅菌された試料は、高温保存条件で検出できる分解ピークをまったく有さずに安定であった。どの試料も色が変化せず、その他の点でも強制分解後にＣａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標）試料の特徴である淡褐色の変色も示さなかった。

一部の実験では、本発明によるペントサン製剤中の分解断片および／または小型オリゴ糖の検出を十分に確実にするよう、信頼できるＣＥ測定およびピークの分解能をさらに確実にするために、追加のステップを行った。例えば、図２９および３０Ａ〜３３Ｂの電気泳動図を作成するために使用したＣＥ法について、新しいキャピラリーは、それぞれある時間、場合によっては最大３時間１Ｎ ＮａＯＨで前処理した。一部の試料では、内部標準（図２９、３０Ｂ、および３１Ｂ参照）および／または標準品（図３２および３３Ｂ参照）を包含させ、ペントサンの検出に十分なキャピラリー定量および分解能を確実にした。加えて、有効長５０ｃｍ、内径５０μｍのキャピラリーが、６．０〜８．０分にサルフェートのピーク泳動時間、６．７０〜９．０分に過塩素酸塩内部標準の泳動時間、および１２〜１６分にギ酸塩の主ピークを示すことが明らかになった（図３３Ａおよび３３Ｂ参照）。１０μｇ／ｍｌギ酸ナトリウムおよび３ｍｇ／ｍｌペントサンを含有する試料で検出されたギ酸塩の主ピークは、ギ酸塩ピークの最も右側（すなわち立ち下がり側(trailing side)）から幅広いベル形ペントサンピークの最右端までの電気泳動図曲線により定められる面積が、ペントサンに帰する合計面積の少なくとも５０％になるような境界となるはずである。本明細書に使用する「ピーク分解能基準(Peak Resolution Standard)」という用語は、内部標準または標準品の使用ならびに本パラグラフに記載の他の品質管理および方法を表す。

ＣＥを用いたペントサンの最適な分解能(resolution)のために、サルフェートおよび過塩素酸塩のピークの分解能（Ｒ）は、５０ｕｇ／ｍｌの硫酸陰イオンおよび過塩素酸陰イオン濃度ならびに分解能を計算するための米国薬局方の方法（分解能Ｒ＝［２（ｔ２−ｔ１）］／［Ｗ２＋Ｗ１］（ここで、ｔ２およびＷ２は、それぞれ過塩素酸塩の泳動時間およびピークの幅であり、ｔ１およびＷ１はサルフェートの泳動時間およびピーク幅である））を用いたときに、少なくとも２．３０でなければならない。本明細書において、電気泳動図におけるピーク（過塩素酸塩およびサルフェートに対応する）は、それらのピークに関する分解能（Ｒ）が、上記の分解能を計算するための米国薬局方の方法に従って少なくとも２．３０である場合に、「最適分解能基準」を満たす。

いくつかの実施形態では、ＰＰＳピークの合計面積に占める二次的ピーク（例えばＰＰＳの前縁にある）の割合は４から７％の範囲でありうるが、任意の単一の二次的ピークが占める割合は１から１．５％でありうる。

いくつかの実施形態では、ＰＰＳピークの合計面積に占める二次的ピーク（例えばＰＰＳの前縁にある）の割合は３から１２％の範囲でありうるが、任意の単一の二次的ピークが占める割合は０．５から３％でありうる。

ペントサン試料の均一性は、ペントサン試料の電気泳動図における合計ペントサンピークの割合として小型オリゴ糖ピークの相対サイズを計算することによって決定することができる。本明細書において、「ペントサン均一性基準」に合致するペントサン試料は、遊離サルフェートによるピークを除いて、ペントサンピークの上昇部分（すなわちペントサンに帰する曲線部分）に電気泳動図で検出された別個のピークが、まとめるとペントサンに帰する合計面積の５％未満を構成する試料であり（ここで、面積は個別のピークについて谷から谷への積分を用いて計算される）、ここで、ペントサン合計面積の１．０％を超えない面積が任意の単一のピークに含有される。

図２９に、過塩素酸ナトリウム試料中の過塩素酸陰イオンの電気泳動図を示す。２つのピーク、すなわち１２分での鋭い主ピーク（２９１）および約１７分でのあまり鋭くない小ピーク（２９２）を検出した。

図３０Ａおよび３０Ｂに、内部標準（ＩＳ）としての過塩素酸塩の添加の不在下（図３０Ａ）および存在下（図３０Ｂ）におけるペントサン（Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ（登録商標））試料の電気泳動図を示す。過塩素酸塩のピークの泳動時間は、サルフェートのピーク後に、陽性対照の特徴である任意のオリゴ糖ピークの出現前に出現する。この泳動時間から、ペントサン試料に添加して定量のための回収をモニターするために使用することができる内部標準として過塩素酸塩は好適となる。

図３１Ａおよび３１Ｂは、内部標準（３１１）としての過塩素酸塩の添加の不在下（図３１Ａ）および存在下（図３１Ｂ）における、水に希釈したペントサンＡＰＩの電気泳動図を示す。サルフェートのピーク後であって、ペントサンの幅広い実質的に均一なピークに先行する任意のマイナーピークが出現する前に、過塩素酸塩のピークが出現する。

図３２に、ギ酸ナトリウムに存在するギ酸塩陰イオンの電気泳動図を示す。大きく鋭いピークが２２．５分に出現し、より小さなピークが約２９分に出現する。任意の他のピークの欠如およびこれらの泳動時間が主ペントサンピークの両側に出現する事実から、ペントサン試料を分析するための許容できるキャピラリー性能についての基準を定める上で、この陰イオンは有用な内部標準品（３２１）になる。

図３３Ａおよび３３Ｂに、ギ酸塩添加の不在下（図３３Ａ）および存在下（図３３Ｂ）における水に希釈したペントサンＡＰＩの電気泳動図を示す。ギ酸塩のピーク（３３１）は、ペントサンの特徴である幅広い主ピークの両側に出現する。したがって、ギ酸塩のピークは、サルフェート（３３２）および過塩素酸塩内部標準のピーク（３３３）からの、その位置および相対距離のマーカーとして作用することができる。

本発明の様々な実施形態を上に記載したが、これらは、限定ではなく単に例として示されたことが理解されるべきである。本発明は、上に例示した割合のペントサンポリサルフェートを有する製剤の調製に限定されず、特定の緩衝剤、保存料、またはキレーターにも限定されず、本発明は、特定の規模、バッチ・サイズ、または粒子径にも限定されない。本発明は、上に述べた疾患および状態の治療にもまた限定されず、本発明の製剤は他の状態の治療に使用することができよう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、任意の上記実施形態例に限定されてはならず、添付の特許請求の範囲およびその等価物だけにしたがって定められなければならない。

ペントサンポリサルフェートの基本化学構造を示す図である。 高性能キャピラリー電気泳動装置の一例の概略図である。 キャピラリー電気泳動装置におけるキャピラリー３００の一例の断面図である。 陰イオン性、中性、および陽イオン性分析物の分離における電気泳動および電気浸透の概略図の一例である。 試料製剤に関して電気泳動測定を行うためのシステムの一例を示す図である。 図６Ａおよび図６Ｂは、間接検出を用いて作製した、キャピラリーを通過して移動する試料の一例についての時間対吸収変化の一例を示す図である。 本発明により製剤化されなかったＰＰＳ含有物質についての電気泳動図である。 本発明により製剤化されなかったＰＰＳ含有物質についての電気泳動図である。 本発明により製剤化されなかったＰＰＳ含有物質についての電気泳動図である。 市販のＰＰＳ製剤についての電気泳動図である。 市販のＰＰＳ製剤についての電気泳動図である。 市販のＰＰＳ製剤についての電気泳動図である。 市販のＰＰＳ製剤についての電気泳動図である。 ＰＰＳ原料の電気泳動図の一例である。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、入手後に実質的な期間を経た市販のＰＰＳ含有物質についての電気泳動図である。 図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃおよび図１６Ｄは、本発明の様々な実施形態による、ＰＰＳ製剤の例の電気泳動図である。 図１７Ａ、図１７Ｂは、本発明の様々な実施形態による、滅菌前後のＰＰＳ製剤の例についての電気泳動図である。 図１８Ａ、図１８Ｂは、本発明の様々な実施形態による、滅菌前後のＰＰＳ製剤の例についての電気泳動図である。 図１９Ａ、図１９Ｂは、本発明の様々な実施形態による、滅菌前後のＰＰＳ製剤の例についての電気泳動図である。 図２０Ａ、図２０Ｂは、本発明の様々な実施形態による、滅菌前後のＰＰＳ製剤の例についての電気泳動図である。 本発明による例示的製剤を強制分解した後の電気泳動図である。 図２２Ａ、図２２Ｂは、本発明による例示的製剤を強制分解した後の電気泳動図である。 図２３Ａ、図２３Ｂは、本発明による例示的製剤を強制分解した後の電気泳動図である。 強制分解後の市販のＰＰＳ含有製剤の電気泳動図である。 図２５Ａ、図２５Ｂは、異なる温度で保存された、ＰＰＳを含む滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図である。 図２６Ａ、図２６Ｂは、異なる温度で保存された、ＰＰＳを含む滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図である。 図２７Ａ、図２７Ｂは、異なる温度で保存された、ＰＰＳを含む滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図である。 図２８Ａ、図２８Ｂは、異なる温度で保存された、ＰＰＳを含む滅菌および未滅菌試料についての電気泳動図である。 過塩素酸ナトリウム試料中の過塩素酸陰イオンの電気泳動図である。 図３０Ａおよび図３０Ｂは、過塩素酸塩の添加の不在下および存在下におけるペントサン試料の電気泳動図である。 図３１Ａおよび図３１Ｂは、過塩素酸塩の不在下および存在下における水に希釈したペントサンＡＰＩの電気泳動図である。 ギ酸ナトリウム中に存在するギ酸塩陰イオンの電気泳動図である。 図３３Ａおよび図３３Ｂは、ギ酸塩の不在下および存在下における水に希釈したペントサンＡＰＩの電気泳動図である。

Claims (83)

1. ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）を含む液体製剤であって、冷蔵せずに安定な製剤。
2. 約４から約８の範囲のｐＨを有する溶液中で冷蔵せずに安定である、請求項１に記載の製剤。
3. ペントサンポリサルフェートから本質的になるオリゴ糖を含む液体製剤であって、冷蔵せずに安定な製剤。
4. 冷蔵せずに約１年間安定である、請求項１に記載の製剤。
5. 冷蔵せずに約３年間安定である、請求項１に記載の製剤。
6. 冷蔵せずに約５年間安定である、請求項１に記載の製剤。
7. 約７から約８の範囲のｐＨを有する溶液中で冷蔵せずに安定である、請求項１に記載の製剤。
8. ＰＰＳの分解産物が実質的にない、請求項１に記載の製剤。
9. 前記製剤の最終滅菌が、前記製剤の色に実質的に影響しない、請求項１に記載の製剤。
10. 最終滅菌後に前記製剤が冷蔵せずに安定である、請求項１に記載の製剤。
11. 最終滅菌後にＰＰＳの分解産物が実質的にない、請求項１に記載の製剤。
12. 前記製剤の最終滅菌後に、前記製剤中の前記ＰＰＳが実質的に均一の分子量を有する、請求項１に記載の製剤。
13. 約２５ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＰＳを含む、請求項１に記載の製剤。
14. キレーター、緩衝剤、抗酸化剤、および抗菌剤のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の製剤。
15. メタ重亜硫酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、およびアスコルビン酸塩からなる群から選択される抗酸化剤をさらに含み、前記抗酸化剤が、前記製剤の約０．０２％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項１に記載の製剤。
16. メチルパラベン、プロピルパラベン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される抗菌剤をさらに含み、前記抗菌剤が、前記製剤の約０．０５％ｗ／ｖから約０．２％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項１に記載の製剤。
17. 約１ｍｇ／ｍＬの濃度でメチルパラベンをさらに含む、請求項１に記載の製剤。
18. 約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度でＥＤＴＡをさらに含む、請求項１に記載の製剤。
19. 前記ＰＰＳが、約２５ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記製剤が、
    約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム、または
    約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度のクエン酸
    をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
20. 約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度のＥＤＴＡをさらに含む、請求項１９に記載の製剤。
21. 約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度で存在する緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
22. さらに緩衝剤を含む請求項１に記載の製剤であって、前記緩衝剤は、クエン酸塩、水酸化ナトリウム／レブリン酸、酢酸塩、重炭酸塩、亜硫酸水素塩、水酸化ナトリウム／グリシン、およびリン酸塩のうち少なくとも１つを含む、前記の製剤。
23. さらに緩衝剤を含む請求項１に記載の製剤であって、前記緩衝剤が、製剤中で約１から約１００ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の製剤。
24. クエン酸を含む緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
25. 亜硫酸水素ナトリウムをさらに含む、請求項１に記載の製剤。
26. 前記亜硫酸水素ナトリウムが、最大約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２５に記載の製剤。
27. アミノ糖をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
28. 前記アミノ糖が、グルコサミン塩酸塩、ガラクトサミン、グルコサミンサルフェート、グルコサミンホスフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノサミン、その混合物または塩からなる群から選択される、請求項２７に記載の製剤。
29. ヒアルロン酸をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
30. ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）を含む液体製剤の試料中におけるサルフェート以外の分解産物を検出する方法であって：
    前記試料を最終滅菌すること；および
    サルフェート以外の１つまたは複数の分解産物を前記試料中において検出するためにキャピラリー電気泳動を用いること；
    を含む方法。
31. 最終滅菌することが、オートクレーブすることを含む、請求項３０に記載の方法。
32. ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）を含む液体注射用剤形であって、冷蔵せずに安定な剤形。
33. 約１０ｍｇから約５グラムのＰＰＳを含む、請求項３２に記載の剤形。
34. 約１０ｍｇから約５ｇのアミノ糖を含む、請求項３２に記載の剤形。
35. 約０．１ｍｇから約３ｇのヒアルロン酸を含む、請求項３２に記載の剤形。
36. 薬学的に許容できる担体を含む、請求項３２に記載の剤形。
37. 前記ＰＰＳが、約２５ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬのＰＰＳ濃度で存在する、請求項３２に記載の剤形。
38. キレーター、緩衝剤、抗酸化剤、および抗菌剤のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
39. メタ重亜硫酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、およびアスコルビン酸塩からなる群から選択される抗酸化剤をさらに含む剤形であって、前記抗酸化剤が、前記剤形の約０．０２％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項３２に記載の剤形。
40. メチルパラベン、プロピルパラベン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される抗菌剤をさらに含む剤形であって、前記抗菌剤が、前記剤形の約０．０５％ｗ／ｖから約０．２％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項３２に記載の剤形。
41. 約１ｍｇ／ｍＬの濃度のメチルパラベンをさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
42. 約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度のＥＤＴＡをさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
43. 約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム、または
    約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度のクエン酸
    をさらに含む、請求項３７に記載の剤形。
44. 約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度のＥＤＴＡをさらに含む、請求項４３に記載の剤形。
45. 約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度で存在する緩衝剤をさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
46. クエン酸塩、水酸化ナトリウム／レブリン酸、酢酸塩、重炭酸塩、亜硫酸水素塩、水酸化ナトリウム／グリシン、およびリン酸塩のうち少なくとも１つを含む緩衝剤をさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
47. 製剤中にクエン酸ナトリウムを約１から約１００ｍＭの濃度で含む緩衝剤をさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
48. クエン酸を含む緩衝剤をさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
49. 亜硫酸水素ナトリウムをさらに含む、請求項３２に記載の剤形。
50. 前記亜硫酸水素ナトリウムが、最大約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項４９に記載の剤形。
51. 前記アミノ糖が、グルコサミン塩酸塩、ガラクトサミン、グルコサミンサルフェート、グルコサミンホスフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノサミン、およびその混合物または塩からなる群から選択される、請求項３４に記載の剤形。
52. 前記アミノ糖が、約２５ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３４に記載の剤形。
53. 前記ヒアルロン酸が、約０．１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３５に記載の剤形。
54. 約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度のペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）、
    最大約２０ｍｇ／ｍＬの濃度の亜硫酸水素ナトリウム、および
    約０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＥＤＴＡ
    を含む注射用剤形であって、製剤が、約６から約７のｐＨ範囲で冷蔵せずに安定な剤形。
55. 約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度のペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）、
    最大約１０ｍｇ／ｍＬの濃度の亜硫酸水素ナトリウム、
    約０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＥＤＴＡ、および
    約１ｍｇ／ｍＬの濃度のメチルパラベン
    を含む注射用剤形であって、製剤が、約５．８から約６．２のｐＨ範囲で冷蔵せずに安定な剤形。
56. 約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度のペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）、
    最大約１０ｍｇ／ｍＬの濃度の亜硫酸水素ナトリウム、
    約０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＥＤＴＡ、および
    約１ｍｇ／ｍＬの濃度のメチルパラベン
    を含む注射用剤形であって、製剤が、約７．８から約８．２のｐＨ範囲で冷蔵せずに安定な剤形。
57. 再構成後に請求項３２から５６のいずれか一項に記載の剤形を含むように製剤化された凍結乾燥剤形。
58. 請求項３２から５６のいずれか一項に記載の剤形を凍結乾燥することによって製剤化された凍結乾燥剤形。
59. 哺乳動物において、骨関節炎、間質性膀胱炎、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）、免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＡＩＤＳまたはＦＩＶなど）、血腫、痔、凍傷、火傷、血栓症、またはアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記哺乳動物に前記疾患を治療するための有効量の、請求項１、３、および１４のいずれかに記載の液体製剤を経口投与することを含む方法。
60. 哺乳動物において、骨関節炎、間質性膀胱炎、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）、免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＡＩＤＳまたはＦＩＶなど）、血腫、痔、凍傷、火傷、血栓症、またはアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記哺乳動物に前記疾患を治療するための有効量の、請求項３２、３８、および５４から５６のいずれかに記載の剤形を注射することを含む方法。
61. 前記液体製剤を１日約１回または１週間に約２回投与することを含む、請求項５９に記載の方法。
62. 前記剤形を１週間に約１回注射することを含む、請求項６０に記載の方法。
63. 前記哺乳動物に前記液体製剤を１日約１回、約１〜３カ月間投与すること、次いで前記哺乳動物に前記液体製剤を投与することを約１〜３カ月間やめること、および次いで前記哺乳動物に前記液体製剤を１日約１回、約１〜３カ月間投与することを含む、請求項５９に記載の方法。
64. 前記哺乳動物に前記剤形を１週間に約１回約１〜３カ月間注射すること、次いで前記哺乳動物に前記剤形を注射することを約１〜３カ月間やめること、および次いで前記哺乳動物に前記剤形を１週間に約１回約１〜３カ月間注射することを含む、請求項６０に記載の方法。
65. 前記量の前記液体製剤が、各投与において約４ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの経口濃度のＰＰＳを送達するために十分な量を含む、請求項５９に記載の方法。
66. 前記量の前記剤形が、各注射において約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇのＰＰＳを注射するために十分な量を含む、請求項６０に記載の方法。
67. 哺乳動物において骨関節炎を治療する方法であって、前記哺乳動物に請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の液体製剤を経口投与することを含む方法。
68. 前記投与することが、前記哺乳動物に前記液体製剤を１日に約１回投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
69. 前記投与することが、前記哺乳動物に前記液体製剤を１日に約１回、約４から約５週間投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
70. 哺乳動物において骨関節炎を治療する方法であって、前記哺乳動物に請求項３２、３８、および５４から５６のいずれか一項に記載の剤形を注射することを含む方法。
71. 前記注射することが、前記哺乳動物に前記剤形を１週間に約１回注射することを含む、請求項７０に記載の方法。
72. 前記注射することが、前記哺乳動物に前記剤形を１週間に約１回、約４から約５週間注射することを含む、請求項７１に記載の方法。
73. キャピラリー電気泳動を用いてペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）製剤の安定性の指標を検出する方法であって、
    前記製剤の試料を水中で約１から約５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製すること、
    ピーク分解能基準を満たすように、キャピラリー電気泳動を用いて前記製剤について電気泳動図であって、時間に対する吸収変化のグラフを含む電気泳動図を用意すること、
    実質的にベルを定義し、ＰＰＳに対応する、前記電気泳動図の実質的なベル形部分を確認すること、および
    谷から谷までの積分によって決定されるサイズ特性であって、１つまたは複数のピークのサイズ特性に比べた前記ベルのサイズ特性に基づいて、前記製剤の安定性の指標を決定すること
    を含む方法。
74. 前記安定性の指標が、以下のものからなる群から選択される、請求項７３に記載の方法：
    前記ベルの面積が、前記１つまたは複数のピークの総和面積の少なくとも約１３倍であること；
    前記ベルの高さが、ペントサン均一性基準を満たす任意のピークの高さの約３倍超であること；および
    前記ベルの前記高さが、３番目に高いピークの約４倍超であること。
75. 前記試料を調製する前に、前記製剤を分解促進条件に供することをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
76. 前記製剤がペントサン均一性基準を満たすことを判定することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
77. 前記分解促進条件が、時間の経過を含む、請求項７５に記載の方法。
78. 前記分解促進条件が、室温よりも著しく高い温度を含む、請求項７５に記載の方法。
79. ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）を含む液体製剤であって、約１ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの試料濃度での前記製剤のキャピラリー電気泳動分析が、時間に対する吸収変化のグラフにおいてＰＰＳの存在に対応する実質的なベル形曲線を示し、前記ベル形曲線が、初期吸収に対応する第１の部分および後期吸収に対応する第２の部分を含み、前記第１の部分および前記第２の部分がピーク中央部分で連結し、前記曲線の実質的なベル形部分内部の面積が、前記実質的なベル形曲線の前記第１の部分に出現するすべての別個のピークにより定義される合計面積の約１０倍超であり、ここで面積が谷から谷への積分によって決定される製剤。
80. 前記キャピラリー電気泳動分析がピーク分解能基準を満たす、請求項７９に記載の製剤。
81. 前記ベル形曲線が、ペントサン均一性基準を満たす、請求項７９に記載の製剤。
82. 前記製剤が、約４から約８のｐＨ範囲を有する溶液中で冷蔵せずに安定である、請求項７９に記載の製剤。
83. ギ酸塩参照ピークの立ち下がり縁から測定される、前記実質的なベル形曲線内部の面積が、前記実質的なベル形曲線内部の合計面積の少なくとも５０％を含む、請求項７９に記載の製剤。