CN116355113A - 一种去除热原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用羟基氯化铝去除透明质酸或其衍生物或他们的盐等生物相容性高分子中热原的方法，不仅能有效去除热原，而且能够提高透明质酸或其衍生物或他们的盐的水溶液的稳定性。

Description

一种去除热原的方法
技术领域
本发明属于医药技术与生物医药领域，具体涉及一种去除热原的方法，由此方法可制备获得不含热原的透明质酸或其衍生物或它们的盐等。
背景技术
透明质酸，英文名称为hyaluronic acid，英文缩写为HA，常称为玻璃酸，常常是钠盐形式，即透明质酸钠。透明质酸是人类在自然界中发现的保湿性最好的物质之一，被誉为理想的天然保湿因子。
透明质酸是由美国的Meyer等人于1934年首先从牛眼玻璃体中分离得到的一种以乙酰氨基葡萄糖与葡萄糖醛酸双糖单元交替连接而成的直链酸性黏多糖。HA普遍存在于人和动物的皮肤、血清、组织细胞间液中，具独特的皮肤保湿、营养、抗衰老、稳定乳化、抗菌消炎、促进伤口愈合及药物载体等特殊功能，是一种在日化、制药及医学美容、生化与保健食品等领域内用途极为广泛、性能优良的功能性生物相容性高分子化合物。
透明质酸在医疗美容领域的常见应用形式为：制成透明质酸钠凝胶作为皮下填充剂，以实现美容和填充的作用；用作透明质酸钠外用敷贴的主要成分；用作透明质酸钠外用修复生物膜或外用修复贴的主要成分等。透明质酸在制药领域的常见应用形式包括：作为主药成分制成滴眼剂等药品，如玻璃酸钠滴眼液；作为药用辅料用作多种剂型的处方组成成分；经修饰或结构改造过的透明质酸可作为新型给药系统的载体等。在透明质酸钠的各项应用中，目前最为常见和知名的是注射用透明质酸钠凝胶，注射用透明质酸钠凝胶也称为玻尿酸。
中国对注射用透明质酸钠凝胶是按医疗器械进行管理，由于其适用范围或预期用途为用于面部真皮组织中层至深层注射以纠正中重度鼻唇部皱纹等，且对人体具有潜在风险的医疗器械类型或药品类型，因此，对注射用透明质酸钠凝胶等产品生产过程中各潜在风险、各杂质成分或污染成分的控制或有效去除，已成为在此类产品生产过程中需要重点关注的问题，而这些问题的彻底解决，可以由此促成上述这些产品在临床和医疗美容应用中的避免关键风险点，从而为患者和医疗美容用户提供安全性更高的产品。
修饰化透明质酸也可称为透明质酸衍生物，修饰化透明质酸钠最常见的类型是交联透明质酸钠，在各种交联透明质酸钠中，因交联方式、制备过程等的不同而对应各种交联透明质酸钠产品；目前在文献及产品上市信息中还可查到的修饰化透明质酸包括-SH化透明质酸、PEG修饰化透明质酸等。氧化透明质酸，是多种修饰化或结构改造型透明质酸的一个新兴类别。氧化透明质酸，除了可以用作构建医美用交联水凝胶的核心原料之外，还可作为创新型外用型医疗器械及创新型外用药品的核心原料。
氧化透明质酸，即醛基透明质酸，其英文缩写一般为AHA。氧化程度可根据产品开发的需要及产品特征而相应调节，氧化位点可以通过个性化的调节化学合成工艺实现并达到预期效果，分子量范围与用作原料的透明质酸的初始分子量相关，可经交联反应形成凝胶网络的特征。
热原，是由微生物产生的，能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。热原包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量一般为5×104～5×105Da，分子量越大致热作用也越强。当注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg时，就可引起不良反应，发热反应通常在注入人体1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。该现象称为“热原反应”。对于注射型的医疗器械，其中若携带有热原，也会导致人体出现热原反应。细菌内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。
《中国药典》2000年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。在此后历版药典之中，对热原的检查都沿用上述这些方法。
由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml，试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法。
热原的特性有：耐热性、滤过性、水溶性、不挥发性，且不耐强酸、强碱和强氧化剂。
热原包括细菌内毒素，是药品注射剂和注射型医疗器械中不可避免的可引起不良反应的有害成分。
在药品注射剂和注射型医疗器械的生产过程中，典型的热原污染途径包括：1、从溶剂中引入，这是药品注射剂和注射型医疗器械出现热原污染的主要原因，以下的因素：蒸馏器结构不合理、操作不当、注射用水贮存时间过长，都会带来热原的污染。因此，在药品和医疗器械生产过程中，应使用新鲜注射用水，最好能随蒸随用。2、从原料中带入，容易滋长微生物的药物，如葡萄糖等，因贮存时间较长包装破损常致热原污染；用生物方法制造的药品，如右旋糖酐、水解蛋白、抗生素等，常因热原成分未除尽而在后续注射剂或医疗器械生产中带入热原。3、从容器、器具、管道和装置中带入。4、制备过程中带入，制备过程中，由于车间的环境控制不到位、操作时间长、装置达不到充分密闭等，均增加污染细菌的机会，从而导致了热原的产生。5、从输液器引入。这种热原污染一般体现于药品注射剂和注射型医疗器械的使用过程中，但对于预灌装式注射型医疗器械，也可能在预灌装生产环节由输液器引入热原。6、可能使产品中引入热原污染的其他情形。
对于本发明中所涉及的透明质酸或其衍生物或他们的盐制备的药品或医疗器械产品，在其生产过程之中，上述列举的5种热原污染途径均可能涉及，但其中的第1、3、4种情况，均可在生产环境控制和生产质量控制环节加以消除；第5种情况，可以在输液器选用和质控环节加以消除；只有第2种情况，属于所用原料带入热原，应在原料制备环节除去热原，并由此在医疗器械产品开始生产前即解决热原污染。
除去热原的定义是：除去所有使患者体温升高的物质。目前，在药品生产过程中，已有实际应用的可去除其中热原成分的方法，主要是物理去除方法、钝化方法。物理去除方法包括：蒸馏法、超滤法、活性炭吸附、疏水吸附法、氧化法等。典型的钝化方法是以酸碱化学钝化，去除容器、器具、装置等的表面热原。
本发明所涉及的透明质酸或其衍生物或他们的盐，以其作为原料所生产的药品及医疗器械产品，由于这些产品自身的性质，在现有技术中难以将产品所含的热原除去。尤其是用于注射的透明质酸或其衍生物或他们的盐，虽属于医疗器械的管理范畴，但在其实际应用时会注射入人体，也需参照注射剂药品的通用要求，且随着近年来国际和中国医疗美容市场的快速发展，开发一种新的有效除去透明质酸或其衍生物或他们的盐中热原的方法，已成为行业内的必然要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种去除透明质酸或其衍生物或他们的盐等生物相容性高分子中热原的方法，该方法可解决上述生物相容性高分子在生产过程中不可避免的热原污染问题，从而解决了现有的以上述生物相容性高分子制备的药品及医疗器械等产品因不可避免的热原存在或污染而导致的安全性风险，避免不良事件的出现。
本发明发现，使用羟基氯化铝能够有效去除透明质酸或其衍生物或他们的盐中的热原，特别是意外发现使用羟基氯化铝去除热原后的透明质酸或其衍生物或他们的盐的溶液的稳定性提高了，其中[Al2(OH)5Cl]m，m为正整数且m≤10提高稳定性的技术效果最为明显。
本发明提供一种去除透明质酸或其衍生物或他们的盐中热原的方法，其中，包括如下步骤：
(1)将羟基氯化铝溶于水中，得羟基氯化铝的水溶液；
(2)将透明质酸或其衍生物或他们的盐溶于水中，得透明质酸或其衍生物或他们的盐的水溶液；
(3)搅拌下，向步骤(2)所得溶液中滴加步骤(1)所得溶液，静置，取上清，先后用0.45μm微孔滤膜和0.22μm微孔滤膜过滤。
优选地，进一步包括步骤(4)去除水。
根据本发明，透明质酸衍生物即修饰化透明质酸，例如交联透明质酸、氧化透明质酸(即醛基化透明质酸)、巯基化透明质酸、PEG化透明质酸等。
根据本发明，透明质酸或其衍生物的盐优选碱金属盐或碱土金属盐，更优选钠盐或钾盐。
根据本发明，透明质酸或其衍生物或他们的盐优选透明质酸钠。
本发明的透明质酸或其衍生物或他们的盐，可以是合成、半合成来源的，也可以是天然来源的，可以市售品，也可以自制。
根据本发明，透明质酸或其衍生物或他们的盐的重均分子量优选为5万-200万道尔顿，优选10-50万道尔顿。
羟基氯化铝，又名碱式氯化铝，是一种多盐基多价电解质，分子式为[Al2(OH)nCl6-n]m，m、n为正整数，n＝1-5，m≤10。在本发明中，若使用含有结晶水的羟基氯化铝，在配制其溶液时，应换算为不含结晶水的羟基氯化铝。例如，2.5％的羟基氯化铝溶液，应为不含结晶水的羟基氯化铝2.5g加水配制成100mL。
根据本发明，羟基氯化铝优选[Al2(OH)nCl6-n]m，其中n＝5，m为正整数且m≤10，即[Al2(OH)5Cl]m，m为正整数且m≤10。
根据本发明，水优选去除热原的水，例如注射用水。
根据本发明，步骤(1)中，羟基氯化铝的浓度以重量/体积计优选1.5％-6.0％，更优选2.0％-5.5％，最优选2.5％-5.0％。
根据本发明，步骤(2)中，透明质酸或其衍生物或他们的盐的浓度以重量/体积计优选0.01％-2.5％，更优选0.2％-2.2％。
根据本发明，步骤(3)中，羟基氯化铝以重量/体积(步骤(3)所形成物的总体积)计优选0.005％-0.12％，进一步优选0.01％-0.10％，更优选0.02-0.08％，最优选0.03％-0.07％。
根据本发明，步骤(2)中，透明质酸或其衍生物或他们的盐的水溶液的pH优选在5.0-8.5之间，优选在6.1-7.5之间。必要时，可以使用pH调节剂。pH调节剂例如碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液、盐酸水溶液等。
根据本发明，步骤(3)中，优选静置0.5小时-8小时。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种如上方法制备得到的透明质酸或其衍生物或他们的盐，或其水溶液。
本发明的有益效果是，本发明的制备方法获得的透明质酸、修饰化透明质酸、或他们的盐，具有不含热原并更适用于制备注射型产品的属性，注射型产品可以是医疗器械，也可以是药品。
另外，本发明意外发现，以羟基氯化铝去除热原后的透明质酸或其衍生物或他们的盐，其水溶液在室温下存放超过7天后，保持均一稳定，与此相比，未用羟基氯化铝去除热原的透明质酸或其衍生物或他们的盐，或者以活性炭去除热原后的透明质酸或其衍生物或他们的盐，其水溶液在室温下存放后，会出现一定程度的沉降，表现为：溶液下部浓度增加，即变得更浓，而溶液上部浓度降低，即变得更稀薄。因此，使用羟基氯化铝去除热原会提高透明质酸或其衍生物或他们的盐的水溶液的稳定性，其中[Al2(OH)5Cl]m，m≤10提高稳定性的技术效果最为明显。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
制备例1配制羟基氯化铝水溶液1
称取羟基氯化铝适量溶于水中，配制成w/v浓度为5.0％的羟基氯化铝水溶液，记为羟基氯化铝水溶液1。所用羟基氯化铝为[Al2(OH)5Cl]m，m为正整数且m≤10。
制备例2配制羟基氯化铝水溶液2
称取羟基氯化铝适量溶于水中，配制成w/v浓度为4.0％的羟基氯化铝水溶液，记为羟基氯化铝水溶液2。所用羟基氯化铝为[Al2(OH)5Cl]m，m为正整数且m≤10。
制备例3配制羟基氯化铝水溶液3
称取羟基氯化铝适量溶于水中，配制成w/v浓度为2.5％的羟基氯化铝水溶液，记为羟基氯化铝水溶液3。所用羟基氯化铝为[Al2(OH)5Cl]m，m为正整数且m≤10。
制备例4配制羟基氯化铝水溶液4
称取羟基氯化铝适量溶于水中，配制成w/v浓度为4.0％的羟基氯化铝水溶液，记为羟基氯化铝水溶液4。所用羟基氯化铝为[Al2(OH)4Cl2]m，m为正整数且m≤10。
制备例5配制羟基氯化铝水溶液5
称取羟基氯化铝适量溶于水中，配制成w/v浓度为5.0％的羟基氯化铝水溶液，记为羟基氯化铝水溶液5。所用羟基氯化铝为[Al2(OH)2Cl4]m，m为正整数且m≤10。
实施例1
透明质酸钠为外购市售品，化妆品级别，重均分子量37万道尔顿。
称取透明质酸钠适量溶于无热原的注射用水中，配制成w/v浓度为2.0％的透明质酸钠水溶液，其pH为6.51；
搅拌下，向980mL上述透明质酸钠水溶液中，缓慢滴加制备例1中制得的羟基氯化铝水溶液20mL，静置2小时，取上清，先后用0.45μm微孔滤膜和0.22μm微孔滤膜过滤，得滤液900mL；
按照实施例11的方法进行热原检查，结果为阴性；按照实施例12的方法进行细菌内毒素检查，结果显示为合格。去除水，得类白色粉末状的透明质酸钠。
实施例2-6
实施例2-6均参照实施例1，具体如下表1所示：
表1
Figure BDA0003440712330000091
实施例7
氧化透明质酸钠为自制，化妆品级别，重均分子量30万道尔顿。
称取氧化透明质酸钠适量溶于无热原的注射用水中，配制成w/v浓度为2.0％的氧化透明质酸钠水溶液，其pH为6.35；
搅拌下，向980mL上述氧化透明质酸钠水溶液中，缓慢滴加制备例1中制得的羟基氯化铝水溶液20mL，静置3小时，取上清，先后用0.45μm微孔滤膜和0.22μm微孔滤膜过滤，得滤液900mL；
按照实施例11的方法进行热原检查，结果为阴性；按照实施例12的方法进行细菌内毒素检查，结果显示为合格。去除水，得白色至类白色粉末状的氧化透明质酸钠。
实施例8以活性炭吸附法除去透明质酸溶液中的热原(对比例)
取实施例1中所用的相同批号透明质酸钠，化妆品级别，重均分子量37万道尔顿。
称取透明质酸钠适量溶于无热原的注射用水中，配制成w/v浓度为2.0％的透明质酸钠水溶液，其pH为6.51；
搅拌下，向加热至50℃的1000mL上述透明质酸钠水溶液中，加入针剂用活性炭5.0g，保温并持续搅拌30分钟，随后，先后用0.45μm微孔滤膜和0.22μm微孔滤膜过滤，得滤液。
实施例9
取实施例1中所用的相同批号透明质酸钠，化妆品级别，重均分子量37万道尔顿。
称取透明质酸钠适量溶于无热原的注射用水中，配制成w/v浓度为2.0％的透明质酸钠水溶液，其pH为6.51；
搅拌下，向980mL上述透明质酸钠水溶液中，缓慢滴加制备例4中制得的羟基氯化铝水溶液20mL，静置2小时，取上清，先后用0.45μm微孔滤膜和0.22μm微孔滤膜过滤，得滤液900mL；
按照实施例11的方法进行热原检查，结果为阴性；按照实施例12的方法进行细菌内毒素检查，结果显示为合格。去除水，得类白色粉末状的透明质酸钠。
实施例10
取实施例1中所用的相同批号透明质酸钠，化妆品级别，重均分子量37万道尔顿。
称取透明质酸钠适量溶于无热原的注射用水中，配制成w/v浓度为2.0％的透明质酸钠水溶液，其pH为6.51；
搅拌下，向980mL上述透明质酸钠水溶液中，缓慢滴加制备例5中制得的羟基氯化铝水溶液20mL，静置2小时，取上清，先后用0.45μm微孔滤膜和0.22μm微孔滤膜过滤，得滤液900mL；
按照实施例11的方法进行热原检查，结果为阴性；按照实施例12的方法进行细菌内毒素检查，结果显示为合格。去除水，得类白色粉末状的透明质酸钠。
实施例11热原检查
分别取实施例1-10中，除热原前后的各样品溶液，参照2015年版中国药典(附录1142)的热原检查法，进行热原检查。
取适用的家兔3只，在测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注人规定剂量并温热至约38℃的各样品溶液，然后每隔30分钟测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最髙的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度(℃)。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或高于0.6℃，或3只家兔体温升髙的总和达1.3℃或高于1.3℃，应另取5只家兔复试，检查方法同上。
结果判断：在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃，均判定供试品的热原检査符合规定。
在初试的3只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃，均判定供试品的热原检查不符合规定。当家兔升温为负值时，均以0℃计。
热原检查结果参见下表2。
实施例12细菌内毒素检查
分别取实施例1-10中，除热原前后的各样品溶液，参照2015版中国药典(附录1143)，进行细菌内毒素检查，每1mg透明质酸或其透明质酸衍生物或他们的盐中所含内毒素的量小于0.5EU为合格，反之为不合格。
细菌内毒素检查结果参见下表2。
表2热原和细菌内毒素检查结果
Figure BDA0003440712330000121
上述表2表明：实施例1-10各样品，在去除热原之前均可引起家兔的热原反应、含有超限的细菌内毒素，而去除热原之后均不引起家兔的热原反应，细菌内毒素均符合规定。
实施例13均一稳定性
样品均一稳定性测定方法：分别取实施例1(也即8、9、10)除热原前(即原料)的溶液和实施例1、2、7、8、9、10除热原后的各样品溶液，每个溶液平行取样3份，每份取样量均为25mL，分别置于25mL的纳氏比色管中，在室温下密封放置7天后，在不振摇纳氏比色管的情况下，可观察到实施例1、2、7、9、10除热原后的纳氏比色管中，溶液上下部呈现基本均一状态，相对比，实施例8除热原后的纳氏比色管中，溶液的上部呈现较稀薄状态下部呈现较浓状态各实施例除热原前的纳氏比色管中，溶液的上部呈现较稀薄状态，溶液的下部呈现较浓状态。在实施例1、2、7、9、10中以透光率进行比较，其中实施例1、2、7的均一稳定性优于实施例9、10。透光率试验具体为：在不振摇纳什比色管的情况下，逐步从上向下吸取比色管中的透明质酸或透明质酸衍生物水溶液，吸取量分别为上部8mL、中部8mL、下部8mL。将吸取所得溶液，按照2015版中国药典附录通则0401的方法，在550nm处测定透光率，记录透光率数值。透光率测得值相差为0.1％时，具显著性差异。
结果见下表3。
表3除热原前、后的透光率测定结果
Figure BDA0003440712330000131
综上，以羟基氯化铝去除热原的透明质酸或透明质酸衍生物，其水溶液较除热原之前和以活性炭除热原更均一稳定，即以羟基氯化铝去除热原，不仅去除了热原和细菌内毒素，而且提高了透明质酸或其衍生物溶液的均一稳定性。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种去除透明质酸或其衍生物或他们的盐中热原的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将羟基氯化铝溶于水中，得羟基氯化铝的水溶液；
(2)将透明质酸或其衍生物或他们的盐溶于水中，得透明质酸或其衍生物或他们的盐的水溶液；
(3)搅拌下，向步骤(2)所得溶液中滴加步骤(1)所得溶液，静置，取上清，先后用0.45μm微孔滤膜和0.22μm微孔滤膜过滤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤(4)去除水。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述透明质酸衍生物为交联透明质酸、氧化透明质酸、巯基化透明质酸、PEG化透明质酸。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述透明质酸或其衍生物的盐为碱金属盐或碱土金属盐。
优选，所述盐为钠盐或钾盐。
所述透明质酸或其衍生物或他们的盐优选透明质酸钠。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，透明质酸或其衍生物或他们的盐的重均分子量为5万-200万道尔顿，优选10-50万道尔顿。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，羟基氯化铝为[Al2(OH)5Cl]m，m为正整数且m≤10。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，羟基氯化铝的浓度以重量/体积计为1.5％-6.0％，优选2.0％-5.5％，更优选2.5％-5.0％。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，透明质酸或其衍生物或他们的盐的浓度以重量/体积计为0.01％-2.5％，优选0.2％-2.2％。
优选地，步骤(2)中，透明质酸或其衍生物或他们的盐的水溶液的pH为5.0-8.5，优选为6.1-7.5。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，羟基氯化铝以重量/体积计为0.005％-0.12％，优选0.01％-0.10％，更优选0.02-0.08％，最优选0.03％-0.07％。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法制备得到的透明质酸或其衍生物或他们的盐，或其水溶液。
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