SU1439476A1 - Способ определени гексозаминов в медицинских препаратах - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохимии и фармакологии. Цель изобретени  -по- вЫшение точности и упрощение способа. После отбора пробы препарата провод т ее гидролиз сол ной кислотой при 115- 120°С. Гидролизат нейтрализуют раствором едкого натри  до рН 6,0-8,0. Провод т отбор нейтрализованного гид- ролизата, в который ввод т раствор ацетилацетона в бикарбонате натри . Смесь после нагревани  охлаждают . К гидролизату добавл ют этиловый спирт, парадиметиламинобензальдегид, концентрированную сол ную кислоту и этанол. Затем определ ют количественное содержание гексозаминов. Способ применим дл  определени  кератансуль- фата из роговицы глаза и гликозами- ногликанов, выделенньгх из 12-перст- ньЕХ кишок свиней. S

Description

4ib

оа со

4ii 1 О)

Изобретение относитс  к биохимии и фармакологии, а именно к определе- FiHio содержани  гексозаминов в меди- дииских препаратах, содержащих гли- козаминогликаны в качестве основного фармакологически активного компо.нен- та, и можеть быть использовано при контроле качества препаратов и дл  установлени  вли ни  отдельных тех- нологических операций па вькод этих биологически активных компонентов в препаратах. Кроме того, этот способ может быть использован при проведении диагностики заболеваний, св зан- HLK с нарушением обмена этих соединений .

Цель изобретени  - повышение точности и упрощение способа за счет сокращени  числа трудоемких операций

Способ осуществл етс  следующим образом.

После отбора пробы препарата провод т ее гидролиз сол ной кислотой при 115-120 С, полученный гидролизат нейтрализуют раствором едкого натра до рИ 6,0-8,0 и провод т отбор нейтрализованного гидролизата, в который ввод т 1,,5%-ньй раствор ацетила- цгтопа в бикарбонате натри  и далее смесь нагревают до температуры 97+1 С и охлаждают до TeNmepaTypH 20 + 1°С, затем осуществл ют цветную реакцию

Отбор пробы

препарата- ---

путем введени  этилового спирта в объемном соотношении к гидролизату 1:10 и смеси парадиметиламинобензаль- дегида, концентрированной сол ной кислоты и этилового-спирта, которые берут в соотношении 0,08:1:1,5 (реактива Эрлиха). Количественное содержание гексозамина в медицинских препаратах определ ют по следующей формуле:

V, V,

100 %,

де С - количество гексозамина в

1 мл, найденное по калибровочному графику, мг;

а - навеска препарата, мг;

.V - объем нейтрализованного

гидролизата, мл;

V - объем разбавленного гидро- лизата перед нейтрализацией , мл;

V - объем гидролизата, вз тый дл  нейтрализации, мл;

V - объем нейтрализованного гидролизата, вз тьш дл  реакции, мл;

too - множитель дли перевода, %.

- Предлагаемый способ определени  содержа}ш  гликозаминогликанов в ме- дигщнских препаратах может быть схе--- матично представлен в следующем виде:

Гндр олиэ.сОЛЯ ной киел от он

основного действующего ве- ;«щества до гексоэамина 115- 20° С

1 ейтрапнзац ш гидролизата раствором едкого атра до слаСпуцепочиой реакции

Окла дение

до 20 i I C

Нагревание 07 i

Добавлегше

реактива

Эрлиха

. Отечественна  промышленность дл  медицинских целей вьшускает следую- wf ..e препараты, содержащие гликозами- ногликаны в качестве фармакологически активного компонента: стеклоглад- ное тело (гиалуронова  кислота), ге- пгрин, хонсурид .(хондроитинсульфат) . Способ применим дл  определени  кера- тансульфага роговицы глаза и гликоза- миногликанов. выделенных из двенадцатиперстных кишок свиней

50

- Ксшорнмагркрооание при в.Капичестцен 1ое определекне

530 ш.«основного действующего

вещества по калибровочной кривой и формуле.

Дл  каждого глнкопротеина установ- оптимальные услови  гидролиза. Эта необходимость объ сн етс  тем, что устойчивость к кислотам данной гликозидной св зи зависит ох природы Сахаров, участвующих в образовании св зи, и от положени  св зи по отно шению к агликону.

В предлагаемом способе такими оптимальными услови ми  вл ютс : дл  гепарина и гликозаминогликанов, вы55

Прибавлеггне1 ,5%-ного раствора аЦетилацетоиа в бикарбонате натри 

добавлеш1е 3TIlJlOlJOrO

croipra t: 10

деленных из двенадцатиперстных кншок свиней-гидролиз А н. сол ной кислотой в течение 3 ч при дл  хон- сурида (хондроитинсульфат) те же услови , но температура гидролиза 120 С дл  кератансульфата из роговицы глаз жив.отньк-врем  гидролиза 18 ч, температура гидролиза 120°С; дл  стекловидного тела (гиалуронова  кислота) - врем  гидролиза 3 ч при 118°С,

Пример 1. Провод т отбор пробы препарата гепарин - 10 мг (точна  навеска), Отобранную пробу количественно перенос т в пробирку с притер- той пробкой. Прибавл ют 5 мл 4 н,сол ной кислоты. Пробирку плотно закры вайт и нагревают в термостате при в течение 3 ч. 5 мл полученного гидролизата количественно перено- с т в мерную пробирку вместимостью 10 m. Довод т объем гидролизатора водой до 10 МП (V,,). 5 мл полученного раствора (Vj) нейтрализуют до рН 6,0 по Oj1%-HOM раствору метилро та или по универсальной индикаторной бумаге, прибавл   вначале 2,4 мп4 н, раствора едкого натра., а затем 2 капли 0,1 н, раствора едкого нат.у-а. Отмечают конечньш объем нейтрализован- ного гидролизата з пробирке (V). К оставшимс  5 мп раствора ттрибавл ют 2,4 мл 4 н, раствора едкого натра и 2 капли 0,1 н, раствора ег;кого натра Из каждой пробирки отбкрают по 1 ш нейтрализованного идролизата (V) и помещают в высокие пробирки вместимостью 25 мл с притертыми пробками и довод т объем раствора водой до 2 мл, прибавл ют по 2 мп раствора ацетилацетона. Пробирки закрывают и помещают на вод ную баню 97 + 1 С на 20 мин. Во избежание испарени  ацетилацетона верхний конец пробирок должен быть значительно выше уровн  .воды. Быстро охлаждают раствор до комнатной температуры и прибавл ют до 20 мл этилового спирта 95%j тщательно перемешивают и приливают по 2 МП смеси парадиметиламинобензаль- дегида, концентрированной сол ной кислоты и этилового .спирта 0,08:1:1,,5 (реактив Эрлиха). Содержание проб - рок тщательно перемешивают дл  удалени  пузырьков углекислого газа, - Через 45 мин измер ют оптическую плотность растворов на фотоэлектро- колориметре с максимумом п.оглощени  при 530 нм в кювете с толщиной сло 

t см. Измерение провод т против контрольной пробы. Контрольную пробу готов т одновременно с опытной: в про бирку с притертой пробкой помешают 2 мл воды к 2 МП раствора ацетилацетона . Пробирку закрывают и помещают на вод ную баню 97 j 1°С на 20 QШ, Далее провод т определение как описано . На фотоэлектрокелориметре наход т разность между оптической плотностью опытной пробы и оптической плотностью контрольной пробы, она . Составл ет 0,364, По калибропочному гр афикуз построенному прк использовании раствора стандартного образца гек созамирш, нахоц т количество гексозд- MiiHa в 1 мл пробы, оно составл ет 0,113 f-m,

Содержание гл11коза -п1ногл тконов (по гексоэаьшну) в препарате гепарин в процентах (Х) определ ют по формуле

X

а . V.

Y.

iOO %,

где С 0,13 мг; V, 7,6 м.п; V 10 мп; ii - 10 мг,- V - 5 ил; V 1 wi; х, 17,2 %,

И р и к ер 2„ Провод т отбор пробы препарата хонсурид - 10 мг (точна  навеска). Далее поступают как описано в примере 1 за исключеютем того, что температура гидролиза 120°С и объем нейтрализованного гицрс.-лизата, вз тьй дл  реакции. 0,5 мл (V), На ФЭКе наход т разкость методу оптической плотностью опытной пробы и опти- чесхой плотностью контрольной пробы, она составл ет 0,278, По калибровочному графику наход т количество гек- созамина в 1 мл пробы, оно составл ет 0,0860. Содержание хондроитинсуль- фата в препарате хонсурид (по гексо- замин О определ ют по формуле и оно составл ет 26-20%,

П р и м е р 3, Провод т отбор пробы препарата стекловидное тело - 4 мл препарата. Далее поступают, как описано в примере 1, за исключением того, что гидролиз провод т 4 мл 8 н, раствора сол ной киспоты при 118 С, после нейтрализации объем нейтрализованного гидролизата довод т до 10 hin (V ) , объем нейтрализованного гидролт- эата, вз тый дл  реакции, 2 мп (4). На ФЭКе наход т разность между оптичес кой плотност1;:о ОПЫТНОЙ пробы И оПтической контрольной пробы, она составл ет 0,168, По калибровочной кривой наход т количество гексозамина в 1 ivtn пробы, оно составл ет 0,052. Содержание гаилуроновой кислоты (по гексо- замину) в препарате стекловидное тело определ ют по формуле и оно составл ет 13,1%.

В сравнении с известным способом, продлагаемый способ проще (отсутствует стади  отгонки 2-метилпиррола) и обладает более высокой точностью (оишбка определени  0,82%, в известном способе - 30%),

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  гексозаминов в медицинских препаратах путем отбо- ра пробы .препарата, гидролиза сол ной кислотой, нейтрализации, добавлени  к гидролизованной пробе ацетилацето- на, приготовленного на карбонате натри , нагревани , охлаждени , добав- лени  реактива Эрлиха и этилового спирта с последующим колориметриро- ванием, отличающийс  тем, что, с целью повышени  точности и упрощени  способа за счет сокращени  числа трудоемких операций, гидролиз провод т при температуре 115-120 С,

   используют 1,5%-HbDi раствор ацетила- цетона в бикарбонате натри , к гидро- лизату дополнительно добавл ют этиловый спирт в объемном соотношении

   1:10, используют реактив Эрлиха, содержащий п-диметйламинобензальдегид, концентрированную сол ную кислоту и этанол в объемном соотношении 0,08:

   :1:1,5, при этом количественное содержание гексозаминов опредап ют по формуле

   С .100,

   а . V, . V4

   де X - содержание гексозаминов, %;

   С - количество гексозамина в 1 мл, найденное по калибровочному графику;

   а - навеска медицинского препарата , мг;

   V, - объем нейтрализованного гидролизата, мл;

   V - объем разбавленного гидролизата перед нейтрализацией , мл;

   V - объем гидролизата, вз тый дл  нейтрализации, мп;

   V - объем нейтрализованного гидролизата, вз тый дл  реакции, мл.