DE60317620T2

DE60317620T2 - Methode zur Bestimmung von UDP-GlcNac

Info

Publication number: DE60317620T2
Application number: DE60317620T
Authority: DE
Inventors: Charles Burghardt; Jarema Peter Kochan
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2023-12-10
Also published as: JP2004194659A; US20040191811A1; EP1431397A1; DE60317620D1; EP1431397B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Messen der Bildung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin in Extrakten aus menschlichem und tierischem Gewebe oder Zellen in Gewebekulturen und Verfahren zum Messen der Inhibitoraktivität einer Testverbindung auf die Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin-Bildung in Zellen.
Verfahren zur Analyse von Glucosamin-6-phosphat und Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin (UDP-N-Acetylglucosamin, UDP-GlcNAc) sind bekannt. Glucosamin-6-phosphat ist das erste Produkt des Enzyms Glutamin:Fructose-6-phosphat-amidotransferase (GFAT), welches das geschwindigkeitsbestimmende Enzym im Hexosamin-Biosynthesestoffwechselweg ist. UDP-N-Acetylglucosamin ist das Endprodukt im Hexosamin-Biosynthesestoffwechselweg, das dann bei der N- und O-Glycosylierung von Proteinen verwendet wird. Überdies wird es von O-N-Acetylglucosamintransferase zum Transfer eines einzelnen N-Acetylglucosaminrestes zu Serin- oder Threoninaminosäuren beeinflußt. Diese Stoffwechselwege sind zur Regulierung der Proteinglycosylierung wichtig und stehen mit der Insulinempfindlichkeit und Glucoseregulierung in Verbindung. Die Messung von Glucosamin-6-phosphat war unter Verwendung eines von zwei Detektionsverfahren arbeitsaufwendig: 1) Extraktion und Reinigung der Probe, gefolgt von HPLC/MS-Analyse (K. A. Robinson, M. L. Weinstein, G. E. Lindenmager und M. G. Buse (1995) Diabetes 44 1438–1446); oder 2) eines spektrophotometrischen Verfahrens, das entweder das Köchen der Proben in Wasser oder Extrahieren der Proben mit Perchlorsäure, gefolgt von Neutralisations- und Zentrifugationsschritten, erfordert. Diese Verfahren sind nicht für Hochdurchsatzassays zugänglich.
Dieses Verfahren der Glucosamin-6-phosphat-Bestimmung wird zur Identifizierung von GFAT-Inhibitoren sowie deren anschließender Optimierung verwendet. Die Messung von UDP-GlcNAc wird zur Bestimmung der Wirkung von GFAT-Inhibitoren in vivo, sowie der Wirkungen verschiedener Modulatoren der Enzyme im Hexosaminstoffwechselweg verwendet.
Die Verfahren zur Analyse von Glucosamin-6-phosphat und UDP-N-Acetylglucosamin basieren auf der Farbreaktion von N-Acetylglucosamin mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (Ehrlich-Reagens) in verdünnter Alkalilösung (W. J. Morgan und L. A. Elson (1934) Biochem J. 28, 988–995). Modifikationen dieses Originalverfahrens unter Verwendung eines Boratpuffers für einen stabileren pH erhöhten die Ausbeute um das 2 fache und reduzierten die Zeit für die Farbentwicklung, erforderten aber auch hohe Wärme und ml-Mengen an Reagenzien (J. L. Reissig, J. L. Strominger und L. F. Le Loir (1955) JBC 217, 959–966). Die Acetylierung von Glucose-6-phosphat unter Verwendung einer verdünnten Essigsäureanhydridacetonlösung, gefolgt von einer Boratalkalilösung, ermöglichte die quantitative Umwandlung von Glucosamin in N-Acetylglucosamin, erforderte aber auch ml-Volumen und das Erwärmen in siedendem Wasser (G. A. Levvy und A. McAllan (1959) Biochem. J. 73, 127–132). Mit diesem Verfahren kann Glucosamin-6-phosphat in verschiedenen Geweben gemessen werden, es erfordert aber einen Erwärmungsschritt in überkappten Röhrchen (T. C. Richards und O. Greengard (1973) Biochemica et Biophysica Acta 304, 842–850). Andere haben die GFAT-Aktivität in kleineren Mengen gemessen, dieses Verfahren erfordert jedoch Perchlorsäure zum Stoppen der Reaktion, Neutralisation mit Kaliumhydroxid, Zentrifugation und Überführung des Überstandes für die Analyse (G. L. McKnight, S. L. Mudri, S. L. Mathewest, R. R. Traxinger, S. Marshall, P. O. Sheppard und P. J. O'Hara (1992), JBC 267, 25204–25212). Ein spektrophotometrisches Verfahren zur Quantifizierung von UDP-N-Acetylglucosamin ist nicht beschrieben worden. Die derzeitigen Verfahren erfordern die Reinigung der Probe und Analyse durch HPLC/MS (K. A. Robinson, M. L. Weinstein, G. E. Lindenmager und M. G. Buse (1995) Diabetes 44, 1438–1446).
WO 93/21330 (Zymogenetics) offenbart DNA-Moleküle, die humane Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase kodieren. Die DNA-Moleküle werden in Verfahren zum Screenen von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase-Antagonisten verwendet. Die DNA-Moleküle, die humane Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase kodieren, werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert, und es wird rekombinante Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase erzeugt. Eine Testsubstanz wird der rekombinanten humanen Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase in Gegenwart von Fructose-6-phosphat und Glutamin ausgesetzt. Eine Reduktion der Aktivität der Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase im Vergleich zur Aktivität in Abwesenheit der Testsubstanz zeigt eine Verbindung an, die humane Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase inhibiert.
US-Patent Nr. 5,876,713 (Nishi et al.) offenbart Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase; eine DNA, die für das Protein kodiert; einen rekombinanten Vektor; eine Transformante; ein Verfahren zur Herstellung des Proteins; eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein, und einen Antikörper gegen das Protein oder sein Teilpeptid. Das Protein und die DNA werden als ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel für Hypoglykämie verwendet. Der Antikörper wird in dem Assay des Proteins verwendet, und das Protein als ein Reagens zum Screenen medizinischer Versuchsverbindungen verwendet.
1 zeigt, daß die Produktion von Glucosamin-6-phosphat von der Menge an GFAT-Enzym, die dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, abhängt. 1A ist eine graphische Darstellung, die die Abhängigkeit der Glucosamin-6-phosphat-Produktion von der Menge an GFAT-alpha-Enzym zeigt. 1B ist eine graphische Darstellung, die die Abhängigkeit der Glucosamin-6-phosphat-Produktion von der Menge an GFAT-beta-Enzym zeigt
2 ist eine graphische Darstellung, die veranschaulicht, daß die produzierten Glucosamin-6-phosphat-Konzentrationen von der Inkubationszeit mit dem GFAT-Enzym abhängen.
3 veranschaulicht die Wirkungen der Variierung der Substratkonzentrationen, Glutamin und Fructose-6-phosphat, auf die von GFAT-alpha und GFAT-beta produzierten Glucosamin-6-phosphat-Konzentrationen. 3A ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Inkubation von GFAT mit 10 µl Glutamin 200 mM + 10 µl Fructose-6-phosphat 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 und 200 mM unter Standardinkubationsbedingungen bei 37°C für 60 Minuten zeigt. 3B ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Inkubation von GFAT mit 10 µl Fructose-6-phosphat 200 mM + 10 µl Glutamin 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 und 200 mM unter Standardinkubationsbedingungen bei 37°C für 60 Minuten zeigt.
3C ist eine Tabelle, die die Km-Werte der Substrate für die GFAT-alpha- und GFAT-beta-Enzyme, berechnet aus den in 3A und 3B erzeugten Daten, veranschaulicht.
4 veranschaulicht die Bestimmung der optischen Dichte bei 585 nm für bekannte Mengen an D-Glucosamin-6-phosphat, erzeugt in 50% DMSO bei einer Konzentration von 40 mM, bei der Zugabe zu dem Standardinkubationsgemisch in Abwesenheit aktiver GFAT-Enzyme.
5 ist eine Tabelle, die die Ergebnisse von Tests bekannter GFAT-Inhibitoren hinsichtlich ihrer Wirkungen auf GFAT-alpha- und GFAT-beta-Enzyme zusammenfaßt.
6 ist ein Diagramm, das die Wirkungen der Acetylierung von Glucosamin-6-phosphat mit verschiedenen Konzentrationen an Essigsäureanhydrid veranschaulicht.
7 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen von Zeit und Temperatur auf die Glucosamin-6-phosphat-Acetylierung in einer Mikrotiterplatte, bestimmt durch die optische Dichte (OD) bei 585 nm in dem Reaktionsgemisch, veranschaulicht.
8 ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich von N-Acetylglucosamin, hergestellt durch unterschiedliche Verfahren, veranschaulicht.
9 ist ein Diagramm, das die Wirkung von Zeit und Temperatur auf die Hydrolyse von UDP-N-Acetylglucosamin auf N-Acetylglucosamin veranschaulicht.
10 ist ein Balkendiagramm, daß einen Vergleich der Bestimmung von UDP-N-Acetylglucosamin-Konzentrationen, erhalten mit dem HPLC/MS-Verfahren und dem Säurehydrolyseverfahren in Extrakten von COS-Zellen, die mit GFAT-beta transfektiert wurden, veranschaulicht.
Offenbart wird ein Verfahren zum Messen der Aktivität von Glutamin:Fructose-6-phosphatamidotransferase, umfassend die Schritte

(a) Bilden eines Gemisches aus Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase, Fructose-6-phosphat und Glutamin;
(b) Inkubieren des Gemisches von (a) unter physiologischen Bedingungen für einen Zeitraum, der zur Bildung von Glucosamin-6-phosphat ausreicht;
(c) Acetylieren des Glucosamin-6-phosphats von (b) zur Bildung von N-Acetylglucosamin-6-phosphat;
(d) Umsetzen des N-Acetylglucosamin-6-phosphats von (c) mit Ehrlich-Reagens und
(e) Messen der Menge an N-Acetyglucosamin-6-phosphat in (d) durch Bestimmen der optischen Dichte bei 500–610 nm des Gemisches von (d) und Vergleichen der Menge an N-Acetylglucosamin-6-phosphat in (d) mit der Kontrollprobe von N-Acetyglucosamin-6-phosphat und einer nicht-inkubierten Kontrollprobe von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase oder einer inkubierten Kontrollprobe von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase ohne Glutamin oder ohne Fructose-6-phosphat.

Bevorzugt ist die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase-human-alpha-Form mit einem Km von 1,49 mM für Glutamin und einem Km von 1,85 mM für Fructose-6-phosphat oder die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase-human-beta-Form mit einem Km von 1,99 mM für Glutamin und einem Km von 6,8 mM für Fructose-6-phosphat. Die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase kann in Zellen transfektiert werden oder auch nicht. Bevorzugt umfaßt das Gemisch in (a) Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase (0,25–25 µl), Glutamin (2–40 mM), Fructose-6-phosphat (2–40 mM), phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, Ethylendiamintetraessigsäure (5 mM) und Dithiothreitol (1 mM), wird der Inkubationsschritt in (b) bei 37°C für einen Zeitraum von 5 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt und wird der Acetylierungsschritt in (c) mit Essigsäureanhydrid, 0,09375%, in Aceton, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat, 62,5 mM, bei 80°C für 25 Minuten durchgeführt. Das Ehrlich-Reagens in (d) umfaßt bevorzugt 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd, 0,3 ml Wasser, 2,2 ml konzentrierte Salzsäure und 17,4 ml Essigsäure, das 1:2 in Essigsäure verdünnt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gemisch in (a) in einer Mikrotiterplatte gebildet, und diese umfaßt ferner den Schritt der Zugabe einer Kontrollprobe von N-Acetylglucosamin-6-phosphat und einer nicht-inkubierten Kontrollprobe von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase oder einer inkubierten Kontrollprobe von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase ohne Glutamin oder ohne Fructose-6-phosphat in die Mikrotiterplatte nach dem Inkubationsschritt in (b).
Offenbart wird auch ein Verfahren zum Messen der Inhibitoraktivität einer Testverbindung auf Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase, umfassend die Schritte

(a) Bilden eines Gemisches aus einer Testverbindung, Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase, Fructose-6-phosphat und Glutamin;
(b) Inkubieren des Gemisches von (a) unter physiologischen Bedingungen für einen Zeitraum, der ausreicht, daß die Testverbindung verhindern kann, daß Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase Glucosamin-6-Phosphat bildet;
(c) Acetylierung des Glucosamin-6-Phosphats von (b) zur Bildung von N-Acetylglucosamin-6-phosphat;
(d) Umsetzen des N-Acetylglucosamin-6-Phosphats von (c) mit Ehrlich-Reagens und
(e) Messen der Menge an N-Acetylglucosamin-6-phosphat in (d) durch Bestimmen der optischen Dichte bei 500–610 nm des Gemisches in (d) und Vergleichen der Menge an N-Acetylglucosamin-6-phosphat in (d) mit einer Kontrollprobe von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase, die keine Testverbindung enthält, und einer Kontrollprobe von N-Acetylglucosamin-6-phosphat, wodurch die Inhibitoraktivität der Testverbindung bestimmt wird.

Bevorzugt ist die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase-human-alpha-Form mit einem Km von 1,49 mM für Glutamin und einem Km von 1,85 mM für Fructose-6-phosphat oder die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase-human-beta-Form mit einem Km von 1,99 mM für Glutamin und einem Km von 6,8 mM für Fructose-6-phosphat. Die Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase kann in Zellen transfektiert werden oder auch nicht. Bevorzugt umfaßt das Gemisch in (a) die Testverbindung, Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase (0,25–25 µl), Glutamin (10 mM), Fructose-6-phosphat (10 mM), phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, Ethylendiamintetraessigsäure (5 mM) und Dithiothreitol (1 mM), wird der Inkubationsschritt in (b) bei 37°C für eine Stunde durchgeführt und wird der Acetylierungsschritt in (c) mit Essigsäureanhydrid, 0,09.3 75%, in Aceton, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat, 62,5 mM, bei 80°C für 25 Minuten durchgeführt. Das Ehrlich-Reagens in (d) umfaßt bevorzugt 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd, 0,3 ml Wasser, 2,2 ml konzentrierte Salzsäure und 17,4 ml Essigsäure, das 1:2 in Essigsäure verdünnt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gemisch in (a) in einer Mikrotiterplatte gebildet, und diese umfaßt ferner den Schritt der Zugabe einer Kontrollprobe von N-Acetylglucosamin-6-phosphat und einer nicht-inkubierten Kontrollprobe von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase, oder einer inkubierten Kontrollprobe von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase ohne Glutamin oder ohne Fructose-6-phosphat in die Mikrotiterplatte nach dem Inkubationsschritt in (b).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Messen der Bildung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin in Extrakten aus menschlichem und tierischem Gewebe oder Zellen in Gewebekulturen, umfassend die Schritte

(a) Hydrolysieren eines Extrakts aus menschlichem oder tierischem Gewebe oder Zellen in Gewebekultur zur Umwandlung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin zu N-Acetylglucosamin;
(b) Umsetzen des N-Acetylglucosamins in (a) mit Ehrlich-Reagens und
(c) Messen der Menge an N-Acetylglucosamin, das in (b) vorliegt, durch Bestimmen der optischen Dichte bei 500 bis 610 nm des Gemisches in (b) und Vergleichen der Menge von N-Acetylglucosamin in (b) mit einer Kontrollprobe von N-Acetylglucosamin, wodurch die Bildung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin bestimmt wird.

Bevorzugt stammen die Extrakte aus menschlichem Gewebe oder Zellen. Bevorzugt wird der Hydrolyseschritt in (a) mit Salzsäure, 0,1 N, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat, 62,5 mM, bei 80°C für 10 Minuten durchgeführt, und das Ehrlich-Reagens in (b) umfaßt 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd, 0,3 ml Wasser, 2,2 ml konzentrierte Salzsäure und 17,4 ml Essigsäure, das 1:2 in Essigsäure verdünnt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden der Hydrolyseschritt in (a) in einem Mikrofugenröhrchen und der Meßschritt in (c) in einer Mikrotiterplatte durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Messen der Inhibitoraktivität einer Testverbindung auf die Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin-Bildung in Zellen, umfassend die Schritte:

(a) Inkubieren einer Testverbindung mit Zellen in Gewebekultur unter physiologischen Bedingungen für eine Zeit, die ausreichend ist, daß die Testverbindung Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase inhibieren und zelluläre Niveaus von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin reduzieren kann;
(b) Extrahieren des Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamins in (a);
(c) Hydrolysieren des Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamins in (b) unter Bildung von N-Acetylglucosamin;
(d) Umsetzen des N-Acetylglucosamins in (c) mit Ehrlich-Reagens und
(e) Messen der Menge an N-Acetylglucosamin in (d) durch Bestimmen der optischen Dichte bei 500 bis 610 nm des Gemisches in (d) und Vergleichen der Menge von N-Acetylglucosamin in (d) mit der Menge in Zellen in Gewebekultur, die nicht mit der Testverbindung inkubiert wurde, und einer Kontrollprobe von N-Acetylglucosamin, wodurch die Inhibitoraktivität der Testverbindung bestimmt wird.

Bevorzugt werden die Zellen in (a) aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus menschlichen Nierenzellen vom Typ 293, menschlichen Nierenzellen vom Typ 293, transfektiert mit GFAT-beta, oder COS-Affennierenzellen, COS-Affennierenzellen, transfektiert mit GFAT-beta, Säugerzellen, Hefezellen und bakteriellen Zellen. Bevorzugt wird der Hydrolyseschritt in (c) mit Salzsäure, 0,1 N, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat, 62,5 mM, bei 80°C für 10 Minuten durchgeführt, und das Ehrlich-Reagens in (d) umfaßt 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd, 0,3 ml Wasser, 2,2 ml konzentrierte Salzsäure und 17,4 ml Essigsäure, das 1:2 in Essigsäure verdünnt ist.
Offenbart werden schnelle spektrophotometrische Verfahren für die Hochdurchsatzmikrotiterplattenanalyse der Glucosamin-6-phosphat-Konzentrationen. Die Verfahren ermöglichen auch die einfache Messung und Quantifizierung von UDP-GlcNAc aus einer Vielzahl von Quellen. Die beschriebenen spektrophotometrischen Verfahren werden bevorzugt in einer Mikrotiterplatte durchgeführt und basieren auf der Farbreaktion von N-Acetylglucosamin mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (Ehrlich-Reagens) in verdünnter Alkalilösung. Die spektrophotometrischen Verfahren erfordern nicht die vielen Reinigungsschritte, die für HPLC/MS-Verfahren erforderlich sind, und können viele Proben mit einem Mal untersuchen. Die Verfahren umfassen die Hydrolyse von UDP-N-Acetylglucosamin zu N-Acetylglucosamin, das dann durch das spektrophotometrische Verfahren für N-Acetylglucosemin gemessen wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „physiologische Bedingungen" auf Konzentration, Temperatur, pH, Innenstärke, Viskosität, Zeit und verschiedene biochemische Parameter, die mit einem lebenden Organismus kompatibel sind und/oder die typischerweise intrazellulär in einer lebenden kultivierten Tierzelle oder Säugerzelle existieren. Geeignete Reaktionsbedingungen für In-vitro-Enzymreaktionen sind im allgemeinen physiologische Bedingungen. Die Inkubation des Gemisches aus Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase, Fructose-6-phosphat und Glutamin wird im allgemeinen unter physiologischen Bedin gungen für einen Zeitraum, in dem sich Glucosamin-6-phosphat bilden kann, durchgeführt. Für die Messung von Glucosamin-6-phosphat umfassen die bevorzugten physiologischen Bedingungen NaCl, 150 mM, bei pH 7,4 und 37°C. Für die Messung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin werden die Zellen bevorzugt in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) bei pH 7,4 mit 10% fetalem Rinderserum herangezogen. Besondere wässerige Bedingungen können von einem Fachmann gemäß herkömmlichen Verfahren mit der optionalen Zugabe von zweiwertigen Kationen und/oder Metallchelatbildnern und/oder nichtionischen Reinigungsmitteln und/oder Membranfraktionen und/oder Schaumhemmern ausgewählt werden.
GFAT-Inhibitoren reduzieren oder inhibieren die Produktion von Glucosamin-6-phosphat und letztlich die Produktion von UDP-N-Acetylglucosamin. Das In-vitro-Verfahren unter Verwendung von Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase ermöglicht nur die Messung von Glucosamin-6-phosphat. Eine andere Betrachtung bei der Identifizierung eines GFAT-Inhibitors zur potentiellen Verwendung bei der Behandlung von Patienten ist, ob die Testverbindung in vivo in Zellen eindringt. Unter physiologischen Bedingungen in Zellen werden biologische Mittel, z. B. Enzyme, in Verbindung mit dem Hexosamin-Biosynthesestoffwechselweg produziert, die in die Produktion von UDP-GlcNAc involviert sind. Verbindungen, die möglicherweise die GFAT-Enzymaktivität in Zellen inhibieren, können in Tieren getestet werden, um zu bestimmen, ob sie in Gewebe eindringen, die GFAT-Aktivität inhibieren und die Produktion von UDP-GlcNAc inhibieren.
Zur Messung von N-Acetylglucosamin-6-phosphat werden die GFAT-Enzymreaktion und die Analyse des Produktes bevorzugt direkt in einer Mikrotiterplatte durchgeführt. Das bevorzugte Reaktionsvolumen von 100 µl besteht aus den Substraten Glutamin (10 mM) und Fructose-6-phosphat (10 mM), phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (5 mM), Dithiothreitol (DTT) (1 mM) und dem GFAT-Enzympräparat oder Gewebeextrakt (0,25–50 µl). Das Inkubationsgemisch wird der Platte zugegeben, die Platte verschlossen und für eine Stunde schwimmend auf einem 37°C warmen Wasserbad plaziert. Ein weiteres Inkubationsgemisch wird auf Eis gehalten, um es Standard- und Kontrollproben zuzugeben. Nach der Inkubation werden die nicht-inkubierte Kontrolle und Glucosamin-6-phosphat-Standards von 2,5 bis 30 nmol zusammen mit dem kalten Inkubationsgemisch in die entsprechenden Löcher der Platte gegeben. Das in den Inkubationsgemischen produzierte Glucosamin-b-phosphat wird acetyliert, indem zunächst Essigsäureanhydrid, 1,5% in Aceton (10 µl), gefolgt von Kaliumtetraborat 200 mM (50 µl), zugegeben wird. Die Platte wird verschlossen, 2 Minuten auf einem Mikroschüttler geschüttelt und für 25 Minuten auf einem 80°C warmen Wasserbad plaziert. Die Platte wird durch Plazieren auf Eis für 5 Minuten abgekühlt, und dann wird Ehrlich-Reagens zugegeben (130 µl) (2 g Ehrlich-Reagens + 0,3 ml Wasser + 2,2 ml konzentrierte Salzsäure + 17,4 ml Essigsäure, das vor der Verwendung 1:2 in Essigsäure verdünnt wird). Die Platte wird dann für 20 Minuten auf einem 37°C warmen Wasserbad plaziert und die OD bei 500–610 nm, bevorzugt 585 nm, bestimmt.

Zur Messung von UDP-N-Acetylglucosamin in Extrakten aus menschlichem und tierischem Gewebe oder Zellen in Gewebekulturen wird die Extraktprobe zunächst in 0,1 N HCl bei 80°C 10 Minuten hydrolysiert, um so N-Acetylglucosamin zu erzeugen. Die Probe wird dann auf Eis 5 Minuten abgekühlt und mit 0,1 N KOH neutralisiert. Dann wird Kaliumtetraborat (62,5 mM [end]) zugegeben und die Probe bei 80°C 25 Minuten inkubiert und dann 5 Minuten auf Eis abgekühlt. Dann wird Ehrlich-Reagens zugegeben und die Probe 20 Minuten bei 37°C gehalten, und dann wird die OD bei 500–610 nm, bevorzugt 585 nm, bestimmt. Ausgangsreagenzien für den Mikrotiterplattenassay für Glucosamin-6-phosphat

Glutamin	100 mM
Fructose-6-phosphat	100 mM
PBS	10 X
EDTA	50 mM
DTT	10 mM
Essigsäureanhydrid	1,5%/Aceton
Kaliumtetraborat	200 mM
p-Dimethylaminobenzaldehyd	2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd/0,3 ml Wasser
(Ehrlich-Reagens)	2,2 ml konz. HCl/17,4 ml Essigsäure, verdünnt 1:2 in Essigsäure vor der Verwendung
N-Acetylglucosamin für Standards
Enzympräparat oder Gewebeextrakt

Inkubationsmengen für den Mikrotiterplattenassay für Glucosamin-6-phosphat

Glutamin 100 mM	10 µl
Fructose-6-phosphat 100 mM	10 µl
PBS 10 X	10 µl
EDTA 50 mM	10 µl
DTT 10 mM	10 µl
+/– Inhibitor	10 µl
Enzympräparat oder Gewebeextrakt	0,25–50 µl
Wasser	auf 100 µl
Kaliumtetraborat 200 mM	50 µl
Ehrlich-Reagens	130 µl
Essigsäureanhydrid 1,5%/Aceton	10 µl

Das Reaktionsgemisch enthielt genug für Standardkurvenproben und wurde auf Eis gehalten. Die Reaktion wurde durch die Zugabe der Inkubationsreagenzien in die Mikrotiterplatte, Verschließen der Platte und Plazieren der Platte in einem Wasserbad bei 37°C für 1 h gestartet. Standardkurvenproben wurden der Platte zugegeben, 2,5 bis 30 nmol/Loch/10 µl, und das kalte Gemisch Kontroll- und Standardkurvenproben zugegeben. Glucosamin-6-phosphat wurde mit Essigsäureanhydrid, 1,5%/Aceton 10 µl + Kaliumtetraborat, 200 mM 50 µl, durch Verschließen der Platte, Schütteln für 2 Minuten und Plazieren auf einem 80°C Wasserbad für 25 Minuten, dann Abkühlen auf Eis für 5 Minuten acetyliert. Verdünntes Ehrlich-Reagens, 130 µl, wurde zugegeben und die Platte für 20 Minuten auf einem 37°C Wasserbad plaziert. Die OD wurde bei 585 nm bestimmt. Ausgangsreagenzien für den spektrophotometrischen Assay zum Messen von UDP-N-Acetylglucosamin

HCl	1 N
KOH	1 N
Kaliumtetraborat	200 mM
p-Dimethylaminobenzaldehyd	2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd/0,3 ml Wasser
(Ehrlich-Reagens)	2,2 ml konz. HCl/17,4 ml Essigsäure, verdünnt 1:2 in Essigsäure vor der Verwendung
Acetonitril
N-Acetylglucosamin für Standards
Enzympräparat oder Gewebeextrakt

Inkubationsgemisch für den spektrophotometrischen Assay zum Messen von UDP-N-Acetylglucosamin

+/– Inhibitor	10 µl
Acetonitril (sofern notwendig)	50 µl
HCl 1 N	10 µl
KOH 1 N	10 µl
Kaliumtetraborat 200 mM	50 µl
Ehrlich-Reagens	150 µl
Zellen oder Gewebeextrakt	50–100 µl
Wasser	auf 100 µl

Das Reaktionsgemisch wurde, wie oben für den Glucosamin-6-phosphat-Assay beschrieben, hergestellt, außer daß die Reaktion vorzugsweise in einem Mikrofugenröhrchen gestartet wurde. Enthielt die Probe zu viel Protein, wurde Acetonitril zugegeben, um zunächst das Protein zur Klärung der Lösung auszufällen. Die Probe wurde dann in HCl, 0,1 N, bei 80°C 10 Minuten hydrolysiert, auf Eis abgekühlt und 5 Minuten zur Entfernung von Bruchstücken bei einem hohen Proteingehalt zentrifugiert. Die Probe wurde mit KOH, 0,1 N, neutralisiert. K₂B₄O₇ (59 mM [end]) wurde zugegeben und die Probe bei 80°C 25 Minuten inkubiert und dann auf Eis 5 Minuten abgekühlt. Ehrlich-Reagens wurde 20 Minuten bei 37°C zugegeben, die Proben 2 Minuten zentrifugiert und 200 ml des Überstandes in eine Mikrotiterplatte gegeben. Die OD wurde bei 585 nm bestimmt.
Über diese Offenbarung hinweg schlägt der Anmelder verschiedene Theorien oder Mechanismen vor, durch die nach Ansicht des Anmelders die vorliegenden Verfahren funktionieren. Während der Anmelder verschiedene Mechanismen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung darlegt, möchte der Anmelder jedoch auf keine Theorie festgelegt werden. Diese Theorien werden zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung dargelegt, sollen den tatsächlichen Umfang der Ansprüche jedoch nicht einschränken.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die zum Zwecke der Demonstration, aber nicht Einschränkung der Herstellung der Verbindungen und Zusammensetzungen dieser Erfindung dargelegt werden, weiter veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1: Messung von Glucosamin-6-phosphat
Enzympräparation. GFAT-alpha (GenBank Zugangsnummer M90516) und GFAT-beta (Zugangsnummer AB016789) werden in pET12- und pEF-BOS C-Vektoren (New England Bio-Labs) zur Transfektion in SF9- und Hi5-Insektenzellen, COS-, Typ-293-Zellen und E. coli geklont. Die endogene Aktivität für jede Zellinie wurde auch in nicht-transfektierten Zellen gemessen. Die Enzyme wurden in jeder Zellinie durch das Heranziehen in großen 24 × 24 cm Platten und Ernten 20 Stunden nach der Transfektion exprimiert. Die Medien wurden entfernt und die Platten in 15 ml PBS gewaschen. 1,5 ml Lysepuffer (PBS 1 X, KCl 50 mM, EDTA 10 mM, mit den Proteaseinhibitoren Leupeptin 10 µg/ml, PMSF 20 µg/ml, A-Protinin 30 µg/ml und Pepstatin 10 µg/ml) wurden in jede Platte gegeben und die Zellen unter Verwendung eines großen Plastikzellschabers entfernt. Dies führte zu einem Endvolumen von etwa 3 ml. Das Zell#/Lyse-Volumen betrug etwa 4 × 10⁷ Zellen/ml. Die Suspension wurde 15 Sekunden unter Verwendung eines Mikrotips auf Eis ultraschallbehandelt (Branson-Sonicator-Einstellung 2,5 bis 3). Die ultraschallbehandelten Zellextrakte wurden in Mikrofugenröhrchen bei –80°C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Extrakte bei 15.000 × g 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Jedes Enzympräparat wurde zur Bestimmung des Volumens, das zwischen 20 und 30 nmol Glucosamin-6-phosphat ergibt, in einem Reaktionsgemisch in einer 60 minütigen Inkubation bei 37°C titriert (1A und 1B).
Stimulation der GFAT-Aktivität. Es wurde herausgefunden, daß die Enzymreaktion über die Zeit in Gegenwart von Substratsättigungskonzentrationen linear ist (2). Bei den meisten Tests wird eine 60 minütige Inkubation bei 37°C in 96-Lochmikrotiterplatten durchgeführt. Für die beste Wärmeübertragung werden die Platten mit einem Costar-Plattenversiegler verschlossen und auf einem 37°C Wasserbad schwimmengelassen. Die Luftblasen wurden vom Boden der Platte entfernt, um so die richtige Wärmeübertragung zu allen Löchern sicherzustellen. Das Reaktionsvolumen von 100 µl bestand aus Glutamin, 10 mM, Fructose-6-phosphat, 10 mM, PBS 1 X, EDTA, 5 mM, DTT, 1 mM und dem Enzympräparat. Ein Gemisch aus den Inkubationsreagenzien wurde auf Eis gehalten und das Enzym kurz vor der Zugabe in die Platte dem Gemisch zugegeben. Ein weiteres Inkubationsgemisch wurde zur Zugabe zu Standard- und Kontrollproben auf Eis gehalten. Bei 4°C fand keine Reaktion statt. Bei der Verwendung der Testmittel wurden vor der Zugabe des Inkubationsgemisches 10 µl in die entsprechenden Löcher und das Vehikel in die Kontrollöcher gegeben. 15 Löcher wurden für die Zugabe von Kontroll- und Standard-Glucosamin-6-phosphat-Proben frei gelassen. Nach der Inkubation wurden 10 µl der Standards, aufgefüllt in dem entsprechenden Vehikel (DMSO), in die entsprechenden Löcher gegeben. Ein Konzentrationsbereich von 2,5 bis 30 nmol befand sich im linearen Teil der Kurve und deckte die Quantität von Glucosamin 6-phosphat, hergestellt unter den Inkubationsbedingungen, ab (4). Das kalte Gemisch wurde in die Standardprobenlöcher gegeben, und dann wurde das Glucosamin-6-phosphat gemessen.
Die Aktivität der GFAT-alpha- und GFAT-beta-Enzyme, exprimiert in SF9-Insektenzellen, wurde mit den bekannten Inhibitoren von GFAT charakterisiert (5). DON (6-Diazo-5-oxo-L-norleucin) inhibierte beide Enzyme mit einem IC₅₀ von 18 µM. UDP-N-Acetylglucosamin inhibierte GFAT-alpha mit einem IC₅₀ von 8 µM, aber zur Inhibierung von GFAT-beta mit einem IC₅₀ von 100 µM war 12 mal mehr UDP-N-Acetylglucosamin erforderlich. Analog inhibierte das Glucosamin FMDP (N3-(-4-Methoxyfumaroyl)-L-2,3-diaminopropionsäure) GFAT-alpha mit einem IC₅₀ von 4 µM und GFAT-beta mit einem IC₅₀ von 2,3 µM. N3-(Bromacetyl)-L-2,3-diaminopropionsäure inhibierte GFAT-alpha mit einem IC₅₀ von 0,38 µM und GFAT-beta mit einem IC₅₀ von 0,27 µM. Die Inhibierung mit UDP-N-Acetylglucosamin ist daher ein Diskriminator zwischen GFAT-alpha und GFAT-beta und liefert Informationen über die funktionalen Rollen der beiden Enzyme.
Messung von Glucosamin-6-phosphat. Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Inkubationsgemisches in die entsprechenden Löcher in einer Mikrotiterplatte und Plazieren der Platte auf einem 37°C Wasserbad gestartet. Nach der entsprechenden Inkubationszeit wurde die Reaktion durch die Zugabe von 10 µl 1,5%igem Essigsäureanhydrid (end 0,09375%), gefolgt von 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM (end 62,5 mM), gestoppt. Die Platte wurde verschlossen und 2 Minuten auf einem Mikroschüttler plaziert. Dann wurde die Platte 30 Minuten auf einem 80°C Wasserbad schwimmengelassen, um so alle Luftblasen unter der Platte zu entfernen. Es wurde herausgefunden, daß 0,09375% Essigsäureanhydrid (aus einem Bereich von 0,00625% bis 0,625%) bei 80°C (aus einem Bereich von 20 bis 80°C) die beste Konzentration zur Acetylierung von Glucosamin-6-phosphat (6) und 30 Minuten (aus einem Bereich von 10 bis 30 Minuten) bei 80°C (aus einem Bereich von 65°C bis 80°C) eine gute Inkubationsbedingung (7) ist. Nach der Acetylierung bei 80°C wurde die Platte auf Eis 5 Minuten abgekühlt. Das acetylierte Glucosamin wurde durch die Morgan-und-Elson-Farbreaktion (Morgan, W. T. J. & Elson, L. A. (1934), Biochem. J. 28, 988) gemessen. In jedes Loch wurden 130 µl Ehrlich-Reagens (2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd + 0,3 ml Wasser + 2,2 ml konz. HCl + 17,4 ml Essigsäure, vor der Verwendung 1:2 in Essigsäure verdünnt) gegeben und bei 37°C durch Schwimmenlassen auf einem Wasserbad für 20 Minuten inkubiert. Die OD wurde bei 585 nm bestimmt und die Quantität des produzierten Glucosamin-6-phosphats aus der Standardkurve unter Verwendung eines Softmax-Pro-Programms berechnet, um so die ODs aus der Standardkurve zum Erhalt der produzierten nmol zu interpolieren.
Beispiel 2: Messung von UDP-N-Acetylglucosamin in Zellen und Gewebe
Gewebeextrakt. Das zu untersuchende Gewebe wurde bei –80°C gefroren und während des Herstellungs- und Wiegeverfahrens auf Trockeneis gehalten. Das Gewebe wurde zu einem feinen Pulver pulverisiert, indem das Gewebe in Schwerfolie eingewickelt, auf einen Metallblock in einem Bett aus Trockeneis gelegt und schnell darauf eingehämmert wurde, bis es ein feines Pulver war. Dann wurde es in einem geteerten Mikrofugenröhrchen plaziert und bis zum Wiegen auf Trockeneis gehalten. Das Gewebe wurde in Chloroform:Wasser (1 mg + 2 µl Chloroform +2 µl Wasser) extrahiert. Die Suspension wurde für etwa 5 Sekunden auf Eis ultraschallbehandelt (Branson-Sonicator-Einstellung 3 bis 5 mit Mikrotip), um alle Klumpen aufzubrechen. Der Extrakt konnte dann bei –80°C gelagert werden. Vor der Analyse wurde der Gewebeextrakt dann aufgetaut und bei 15.000 × g 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Zellextrakt. Zellen in Kultur wurden in 35-mm-Kulturschalen mit und ohne einen GFAT-Inhibitor inkubiert und mit Glucose behandelt, um so UDP-N-Acetylglucosamin zu produzieren. Die Zellen wurden normalerweise bei etwa 80% Konfluenz in DMEM-Glucose, 4,5 mM + 10% fetales Rinderserum, herangezogen. Die Medien wurden darin durch DMEM (keine Glucose) + 10% fetales Rinderserum für 12 bis 16 Stunden ausgewechselt. Lag ein GFAT-Inhibitor vor, wurde dieser für 30 Minuten zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Glucose, 25 mM, für Zeiträume von 1 Stunden bis 24 Stunden. Die Medien wurden entfernt, die Zellen 1 X in PBS gewaschen und in 200 µl Chloroform:Wasser (1:1) extrahiert. Die Suspension wurde für etwa 5 Sekunden auf Eis ultraschallbehandelt, um so alle Klumpen aufzubrechen. Der Extrakt konnte bei –80°C gelagert werden. Vor der Analyse wurde der Gewebeextrakt aufgetaut und bei 15.000 × g 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Analyse von UDP-N-Acetylglucosamin in Gewebeextrakten 50 µl Gewebeextrakt (25 mg Ausgangsgewebe) wurden in einem Mikrofugenröhrchen plaziert, und 50 µl Acetonitril wurden zugegeben. Dies ist zum Ausfällen von überschüssigem Protein in der Probe erforderlich und hilft bei der Klärung der Probe. Für die Hydrolyse des UDP-N-Acetylglucosamins in der Probe wurden 10 µl HCl, 1 N, zugegeben und die Probe verwirbelt. Dieses Gemisch wurde bei 80°C 20 Minuten erwärmt. Die Probe wurde dann bei 15.000 × g bei Raumtemperatur 15 Sekundenzentrifugiert, um so jegliche gebildete Kondensation auszufällen. Die Probe wurde durch die Zugabe von 10 µl KOH, 1 N, neutralisiert. Das resultierende Produkt, N-Acetylglucosamin, wurde durch die Morgan-und-Elson-Farbreaktion gemessen. Dann wurden 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, zugegeben und die Probe bei 80°C 25 Minuten erwärmt, gefolgt vom Abkühlen auf Eis für 5 Minuten. Dann wurden 150 ml Ehrlich-Reagens zugegeben und gemischt. Nach 20 Minuten bei 37°C wurde die Probe bei 15.000 × g bei Raumtemperatur für 2 Minuten zentrifugiert. 200 µl des Überstandes wurden in eine 96-Lochplatte gegeben und die OD bei 585 nm bestimmt. Die Quantität von N-Acetylglucosamin wurde aus Standardproben von N-Acetylglucosamin unter Verwendung eines Softmax-Pro-Programms berechnet. Die Standardkurvenproben wurden aus N-Acetylglucosamin, 2,5 bis 30 nmol/Loch, ähnlich wie die Gewebeproben hergestellt. Vergleichsexperimente wurden durchgeführt, um die Analyse von N-Acetylglucosamin, hergestellt durch drei unterschiedliche Verfahren, zu bestätigen. Die Experimente demonstrierten, daß: 1) Glucosamin-6-phosphat, acetyliert mit Essigsäureanhydrid + Kaliumtetraborat, 2) N-Acetylglucosamin, behandelt mit Kaliumtetraborat, und 3) UDP-N-Acetylglucosamin, hydrolysiert mit HCl, 0,1 N, gefolgt von der Behandlung mit Kaliumtetraborat, alle ähnliche Ergebnisse ergaben (8). Die Daten demonstrierten auch, daß das UDP-N-Acetylglucosamin mit HCl, 0,1 N, nach 20 Minuten bei 80°C komplett zu N-Acetylglucosamin hydrolysiert war. Studien hinsichtlich der Zeit (5 bis 120 Minuten) und Temperatur (20, 37 und 80°C) zeigten an, daß 5 Minuten bei 80°C für eine vollständige Hydrolyse von UDP-N-Acetylglucosamin zu N-Acetylglucosamin ausreichen (9). Diese Studien zeigten auch an, daß UDP-N-Acetylglucosamin, behandelt mit Kaliumtetraborat, nicht unter Erzeugung von Farbe mit dem Ehrlich-Reagens reagierte. Zur Verifizierung, daß das Hydrolyseverfahren und das HPLC/MS-Verfahren vergleichbare Ergebnisse brachten, wurden Extrakte von COS-Zellen durch zwei Verfahren ana lysiert. COS-Zellen, transfektiert mit GFAT-beta, das in Glucose-freien Medien 16 Stunden herangezogen wurde, wurden 5 Stunden 25 mM Glucose ausgesetzt. Die Glucosebehandlung führte zu einer Erhöhung der zellulären UDP-N-Acetylglucosaminkonzentrationen. Die gemessenen Konzentrationen an Nicht-Glucose- und mit 25 mM Glucose-stimulierten Zellen waren zwischen den beiden Verfahren vergleichbar (10).
1 zeigt, daß die Produktion von Glucosamin-6-phosphat von der Menge an GFAT-Enzym abhängt. 1A ist ein Diagramm, das die Abhängigkeit der Glucosamin-6-phosphat-Produktion von der GFAT-alpha-Enzym-Konzentration veranschaulicht. 1B ist ein Diagramm, das die Abhängigkeit der Glucosamin-6-phosphat-Produktion von der GFAT-beta-Enzym-Konzentration veranschaulicht. Zu einem Inkubationsgemisch aus 10 µl Glutamin, 100 mM, 10 µl Fructose-6-phosphat, 100 mM, 10 µl PBS 10 X, 10 µl EDTA, 50 mM, 10 µl DTT, 10 mM, und Wasser auf 100 µl wurden 1, 2, 5, 10, 15, 20 und 25 µl GFAT-alpha-Zellextrakte oder 0,25, 0,5, 1, 2 und 5 µl GFAT-beta-Zellextrakte gegeben. Die Inkubation wurde durch die Zugabe des Inkubationsgemisches in die entsprechenden Löcher einer 96-Loch-Mikrotiterplatte, wobei separate Platten für jedes Enzym verwendet wurden, und Plazieren (schwimmend) der Platten auf einem 37°C Wasserbad gestartet. Nach einer 60 minütigen Inkubation wurden die Platten aus dem Wasserbad entfernt und die Standardkurvenproben in die entsprechenden Löcher der Platte gegeben. Dem folgte die Zugabe von 10 µl Essigsäureanhydrid, 1,5%, und 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, in alle Löcher und Schütteln der Platte für 2 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Mikroschüttler. Die Platten wurden bei 80°C durch Plazieren der Platten (schwimmend) auf einem 80°C Wasserbad für 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden auf Eis 5 Minuten abgekühlt. 130 µl Ehrlich-Reagens wurden für 20 Minuten bei 37°C in alle Löcher gegeben und die OD für alle Löcher bei 585 nm bestimmt. Die nmol an Glucosamin-6-phosphat in jedem Loch wurden für jede Konzentration an Enzym bestimmt.
Die Differenzierung des GFAT-alpha von GFAT-beta kann durch ihre Empfindlichkeit gegen UDP-N-Acetylglucosamin bestimmt werden. GFAT-alpha wird von UDP-N-Acetylglucosamin mit einem IC₅₀ von 8 µM inhibiert. GFAT-beta wird von UDP-N-Acetylglucosamin mit einem IC₅₀ von 100 µM inhibiert.
2 ist ein Diagramm, das veranschaulicht, daß die GFAT-Aktivität von der Inkubationszeit bei der Expression in Hi5-Insektenzellen abhängt. Zur Bestimmung der GFAT-Aktivität mit der Zeit wurden Extrakte von GFAT-alpha und GFAT-beta, exprimiert in Hi5-Insektenzellen, über einen Zeitraum von 180 Minuten inkubiert. Die Reaktion fand in 96-Loch-Mikrotiterplatten statt. Die Inkubationsgemische sind 1) 10 µl Glutamin, 100 mM, 10 µl Fructose-6-phosphat, 100 mM, 10 µl PBS 10 X, 10 µl EDTA, 50 mM, 10 µl DTT, 10 mM, 5 µl GFAT-alpha-Hi5-Zellextrakt und 45 µl Wasser und 2) 10 µl Glutamin, 100 mM, 10 µl Fructose-6-phosphat, 100 mM, 10 µl PBS 10 X, 10 µl EDTA, 50 mM, 10 µl DTT, 10 mM, 0,25 µl GFAT-beta-Hi5-Zellextrakt und 49,75 µl Wasser. Die Reaktionsgemische wurden auf Eis gehalten und die GFAT-alpha- und GFAT-beta-Enzyme in verschiedenen Platten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl des Inkubationsgemisches in die Platte gestartet, wobei mit dem Zeitraum von 180 Minuten begonnen wurde, bis zur Zeit 0. Die Reaktion wurde durch das Plazieren der Platte auf Eis gestoppt. Die Standardproben wurden in die entsprechenden Löcher der Platte gegeben, gefolgt von der Zugabe von 10 µl Essigsäureanhydrid, 1,5% in Aceton, und 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM. Die Platten wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und bei 80°C 30 Minuten durch Schwimmenlassen auf einem Wasserbad inkubiert. Die Platten wurden 5 Minuten auf Eis plaziert, gefolgt von der Zugabe von Ehrlich-Reagens, 130 µl. Nach einer 20 minütigen Inkubation bei 37°C wurde die OD bei 585 nm für alle Löcher auf der Platte bestimmt und die Menge an N-Acetylglucosamin-6-phosphat bestimmt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit GFAT-Enzymen, hergestellt aus unterschiedlichen Quellen, erhalten.
3 veranschaulicht die Wirkung variierender Konzentrationen der Substrate Glutamin und Fructose-6-phosphat auf die Enzymaktivität von GFAT-alpha und GFAT-beta. 3A ist ein Diagramm, das die Inkubation mit 10 µl Glutamin, 200 mM, + 10 µl Fractose-6-phosphat, 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 mM, veranschaulicht. 3B ist ein Diagramm, das die Inkubation mit 10 µl Fructose-6-phosphat, 200 mM, + 10 µl Glutamin, 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 mM, veranschaulicht. 10 µl GFAT-alpha- und 5 µl GFAT-beta-Extrakte aus transfektierten SF9-Insektenzellen wurden mit 1) 10 µl Glutamin, 200 mM, + 10 µl Fructose-6-phosphat 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 mM, und 2) 10 µl Fructose-6-phosphat, 200 mM, + 10 µl Glutamin, 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 mM in einem Inkubationsmedium, das 10 µl PBS 10 X, 10 µl EDTA, 50 mM, 10 µl DTT, 10 mM, und Wasser auf 100 µl enthielt, inkubiert. Die Platte wurde mit einem Costar-Plattenversiegler verschlossen und 60 Minuten bei 37°C durch Schwimmenlassen auf einem Wasserbad inkubiert. Ein weiteres Inkubationsgemisch wurde zur Zugabe zu Standard- und Kontrollproben auf Eis gehalten. Nach der Inkubation wurden die Standards zusammen mit dem kalten Inkubationsgemisch in die entsprechenden Löcher auf der Platte gegeben, gefolgt von 10 µl Essigsäureanhydrid und 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, in alle Löcher. Die Platte wurde 2 Minuten geschüttelt und bei 80°C durch Schwimmenlassen auf einem Wasserbad inkubiert. Die Platte wurde 5 Minuten auf Eis abgekühlt, gefolgt von Zugabe von Ehrlich-Reagens in jedes Loch. Nach einer 20 minütigen Inkubation bei 37°C wurde die OD für jedes Loch bei 585 nm bestimmt.
3C ist eine Tabelle, die die Km-Werte der Substrate für die GFAT-alpha- und GFAT-beta-Enzyme, berechnet aus den Daten, erzeugt in den 3A und 3B, veranschaulicht. Ein Plot der Daten unter Verwendung eines Lineweaver-Burk-Plots (Lineweaver, H. und Burk, D (1934) J. Amer. Chem. Soc. 56, 658–666) ergab die berichteten Km-Werte. In der Tabelle beträgt der Km von Glutamin für GFAT-alpha und GFAT-beta 1,49 mM bzw. 1,99 mM. Der Km von Fructose-6-phosphat für GFAT-beta beträgt 6,8 mM und für GFAT-alpha 1,85 mM.
4 ist ein Diagramm, das die Standards von D-Glucosamin-6-phosphat (Sigma-Aldrich Kat.-# G5509), hergestellt in 50% DMSO, bei einer Konzentration von 40 mM veranschaulicht. Aus diese Stammlösung wurden zum Erhalt von 0, 2,5, 5, 10, 20 und 30 nmol in einer 10-µl-Probe Verdünnungen vorgenommen. Die OD des 0-mM-DMSO-Vehikels allein wird von allen bestimmten Werten auf der Platte subtrahiert. 10 µl der Standardproben wurden in die entsprechenden Löcher auf der Platte gegeben, wobei die Löcher in zweifacher Ausfertigung vorlagen. Die Platte wurde mit einem Costar-Plattenversiegler verschlossen und 60 Minuten bei 37°C durch Schwimmenlassen auf einem Wasserbad inkubiert. Während der Inkubation wurde das Inkubationsgemisch auf Eis gehalten. Das Inkubationsgemisch enthielt 10 µl Glutamin, 100 mM, 10 µl Fructose-6-phosphat, 100 mM, 10 µl PBS 10 X, 10 µl EDTA, 50 mM, 10 µl DTT, 10 mM, 2 µl Enzymextrakt von COS-Zellen, transfektiert mit GFAT-alpha, und 48 µl Wasser. Nach der Inkubation wurden 90 µl des kalten Inkubationsgemisches zugegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 10 µl Essigsäureanhydrid, 1,5%, ge folgt von 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, in alle Löcher, gestoppt. Die Platte wurde 2 Minuten geschüttelt und 30 Minuten bei 80°C durch Schwimmenlassen auf einem Wasserbad inkubiert. Die Platte wurde 5 Minuten auf Eis abgekühlt, gefolgt von der Zugabe von Ehrlich-Reagens in alle Löcher. Nach einer 20 minütigen Inkubation bei 37°C wurde die OD für alle Löcher bei 585 nm bestimmt.
5 veranschaulicht das Testen bekannter Inhibitoren von GFAT auf die Empfindlichkeit gegen die GFAT-alpha- und GFAT-beta-Enzyme. Das Inkubationsgemisch bestand aus 10 µl Glutamin, 100 mM, 10 µl Fructose-6-phosphat, 100 mM, 10 µl PBS 10 X, 10 µl EDTA, 50 mM, 10 µl DTT, 10 mM, 5 µl GFAT-alpha oder 0,25 µl GFAT-beta, 10 µl der Testverbindung in DMSO, 50%, oder DMSO, 50%, allein, und Wasser, für ein Endvolumen von 100 µl. Die Verbindungen wurden in die entsprechenden Löcher einer 96-Loch-Mikrotiterplatte gegeben, gefolgt von 90 µl des Inkubationsmediums für GFAT-alpha und GFAT-beta in die entsprechenden Löcher. Die Platte wurde bei 37°C durch Plazieren der Platte auf eifern Wasserbad für 60 Minuten inkubiert. Dann wurden die Standardproben auf die Platte gegeben, gefolgt von 10 µl Essigsäureanhydrid, 1,5%, und 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, in alle Löcher. Nach dem Schütteln der Platte für 2 Minuten wurde die Platte bei 80°C 3.0 Minuten inkubiert. Die Platte wurde auf Eis 5 Minuten abgekühlt, und 130 µl Ehrlich-Reagens wurden für 20 Minuten bei 37°C in alle Löcher gegeben. Die OD für jedes Loch wurde bei 585 nm bestimmt, und die Menge an produziertem Glucosamin-6-phosphat wurde berechnet. Das Ausmaß der Inhibierung mit der Verbindung wurde aus der Enzymaktivität in Gegenwart von DMSO allein berechnet. Die Inhibierung wurde als der IC₅₀ oder die Konzentration, die 50% der maximalen Stimulation inhibiert, ausgedrückt.
6 ist ein Diagramm, das die Acetylierung von Glucosamin-6-phosphat mit unterschiedlichen Konzentrationen an Essigsäureanhydrid veranschaulicht. Die Reaktion wurde in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte durchgeführt. Das Inkubationsgemisch bestand aus Glucosamin-6-phosphat, 1 µmol in 100 µl, + 10 µl Essigsäureanhydrid, aufgefüllt in Aceton, in Ausgangskonzentrationen von 0,1% bis 10%, was Endkonzentrationen von 0,00625% bis 0,625% ergab, + 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM. Das Gemisch wurde bei 80°C 30 Minuten inkubiert, indem die Platte mit einem Costar-Plattenversiegler verschlossen und auf einem 80°C Wasserbad schwimmengelassen wurde. Nach der Inkubation wurde die Platte auf Eis 5 Minu ten abgekühlt. Dann wurden 130 µl Ehrlich-Reagens in alle Löcher gegeben, die Platte verschlossen und bei 37°C 20 Minuten durch Schwimmenlassen auf einem 37°C Wasserbad inkubiert. Die OD wurde für alle Löcher bei 585 nm bestimmt, und die Daten wurden als die optische Dichte, erzeugt bei unterschiedlichen Konzentrationen an Essigsäureanhydrid, ausgedrückt.
7 ist ein Balkendiagramm, das die optimalen Bedingungen für die Acetylierung von Glucosamin-6-phosphat in den Löchern einer Mikrotiterplatte durch variierende Zeiten und Temperaturen zeigt. Damit der Assay in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden konnte, waren Temperaturen von weniger als 100°C notwendig. Zur leichteren Handhabung der unterschiedlichen Bedingungen wurden die Inkubationen in diesem Assay in Mikrofugenröhrchen durchgeführt. 1 µmol Glucosamin-6-phosphat in 100 µl Wasser + 22,5 µl Essigsäureanhydrid, 1,5% in Aceton, + 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, + 80 µl Wasser wurden unter den unterschiedlichen Bedingungen inkubiert. Nach jeder Inkubation wurde das Röhrchen 5 Minuten auf Eis abgekühlt, und 140 µl Ehrlich-Reagens wurden für 20 Minuten bei 37°C in jedes Röhrchen gegeben. Die OD wurde bei 585 nm bestimmt. Es wurden die folgenden Inkubationsbedingungen durchgeführt: 1) Als Standard wurde eine 5-Minuten-Inkubation des Acetylierungsgemisches 5 Minuten in einem siedenden Wasserbad plaziert. 2) Eine 5-Minuten-Inkubation mit Essigsäureanhydrid allein bei 100°C, gefolgt von Kaliumtetraborat für 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde durchgeführt, um die Notwendigkeit des Erwärmungsschrittes mit Kaliumtetraborat zu demonstrieren. 3) Eine 10-Minuten-Inkubation bei 65°C. 4) Eine 30-Minuten-Inkubation bei 65°C. 5) Eine 60-Minuten-Inkubation bei 65°C. 6) Eine 30-Minuten-Inkubation bei 75°C. 7) Eine 60-Minuten-Inkubation bei 75°C. 8) Eine 30-Minuten-Inkubation bei 80°C. Wenn die Temperatur stieg, stieg auch die OD, was eine bessere Empfindlichkeit anzeigte. Wenn die Zeit stieg, stieg auch die OD, was eine bessere Empfindlichkeit anzeigte.
8 ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich des N-Acetylglucosamins, hergestellt durch verschiedene Verfahren, veranschaulicht. Standardlösungen von Glucosamin-6-phosphat (Sigma-Aldrich G5509), N-Acetylglucosamin (Sigma-Aldrich A8625) und UDP-N-Acetylglucosamin (Sigma-Aldrich U4375) wurden in Wasser auf eine Konzentration von 4 mM gelöst und auf 2,5 und 5 nmol/10 µl verdünnt. Die Standardlösungen wurden folgendermaßen behandelt: 1) Glucosamin-6-phosphat wurde durch die Zugabe von 10 µl jeder Lösung zu 90 µl Wasser, 10 µl HCl, 1 N, 10 µl KOH, 1 N, und 10 µl Essigsäureanhydrid, 1,5%, gefolgt von 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, acetyliert. Das Gemisch wurde auf 80°C in einem Wasserbad für 30 Minuten erwärmt und dann für 5 Minuten auf Eis abgekühlt. 2) 10 µl der N-Acetylglucosaminlösungen wurden zu 90 µl Wasser, 10 µl HCl, 1 N, 10 µl KOH, 1 N, und 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80°C in einem Wasserbad für 30 Minuten erwärmt und dann für 5 Minuten auf Eis abgekühlt. 3) 10 µl jeder Standardlösung von UDP-N-Acetylglucosamin wurden zu 90 µl Wasser und 10 µl HCl, 1 N, zugegeben. Dieses Gemisch wurde durch Erwärmen in einem 80°C Wasserbad für 10 Minuten hydrolysiert und dann bei 15.000 × g für 15 Sekunden zentrifugiert. 10 µl KOH, 1 N, und 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, wurden in jedes Röhrchen gegeben und bei 80°C für 30 Minuten in einem Wasserbad erwärmt. Die Reaktion wurde für 5 Minuten auf Eis abgekühlt. Dann wurden 150 µl Ehrlich-Reagens in die acetylierten Produkte gegeben und wie in den Verfahren beschrieben analysiert.
9 ist ein Diagramm, das die Wirkung von Zeit und Temperatur auf die Hydrolyse von UDP-N-Acetylglucosamin zu N-Acetylglucosamin veranschaulicht. Zur Bestimmung der Temperatur und Zeit, die zur Hydrolyse von UDP-N-Acetylglucosamin zu N-Acetylglucosamin notwendig sind, wurden 20 nmol UDP-N-Acetylglucosamin mit HCl, 0,1 N, bei 20, 37 und 80°C für 5, 30, 60 und 120 Minuten inkubiert. 10 µl UDP-N-Acetylglucosamin + 10 µl HCl, 1 N, + 80 µl Wasser wurden in einem Mikrofugenröhrchen für die angezeigten Zeiten und Temperaturen inkubiert. 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, wurden für 30 Minuten bei 80°C zugegeben, gefolgt vom Abkühlen auf Eis für 5 Minuten. Dann wurden für 20 Minuten bei 37°C 130 µl Ehrlich-Reagens in jedes Röhrchen gegeben und die Proben in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte überfüht, um die OD bei 585 nm zu bestimmen. Eine Probe mit 20 nmol UDP-N-Acetylglucosamin und ohne HCl, 0,1 N, erzeugte kein N-Acetylglucosamin, was ein Anzeichen dafür ist, daß HCl, oder eine andere geeignete saure Lösung, für die Hydrolyse von UDP-N-Acetylglucosamin notwendig ist. Da sich bei 20°C oder 37°C kein Produkt bildete, zeigen diese Ergebnisse an, daß eine Temperatur von mehr als 37°C erforderlich ist.
10 ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich der Konzentrationen an UDP-N-Acetylglucosamin, erhalten mit dem hierin beschriebenen HPLC/MS-Verfahren und dem Hydro lyseverfahren, an Extrakten von COS-Zellen, transfektiert mit GFAT-beta, veranschaulicht. Die COS-GFAT-beta-Zellen wurden auf 35-mm-Platten plattiert, und als sie eine 80%ige Konfluenz erreicht hatten, wurde das DMEM-Mediumdurch DMEM plus 10% fetales Rinderserum ohne Glucose für 16 Stunden ausgewechselt. Dann wurde über 5 Stunden Glucose für eine Endkonzentration von 25 mM zugegeben. Das Medium wurde abgesaugt, die Zellen in PBS 1 X gewaschen in 0,5 ml PBS abgeschabt und in ein Mikrofugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden 2 Minuten bei 15.000 × g bei 4°C zentrifugiert und das Pellet in 200 µl Wasser + 200 µl Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde für 15 Sekunden auf Eis unter Verwendung eines Mikrotips ultraschallbehandelt und dann bei 15.000 × g 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Überstand sichergestellt. Dann wurden 10 µl des Extrakts zur Analyse durch das HPLC/MS-Verfahren genommen. Dann wurden 150 µl des Extraktes + 50 µl Acetonitril + 20 µl HCl 1 N in einem Mikrofugenröhrchen plaziert. Dieses Gemisch wurde für 10 Minuten auf 80°C erwärmt. Dann wurden 20 µl KOH, 1 N, + 50 µl Kaliumtetraborat, 200 mM, in jedes Röhrchen gegeben und 30 Minuten bei 80°C erwärmt, gefolgt vom Abkühlen für 5 Minuten auf Eis. Dann wurden für 20 Minuten bei 37°C 150 µl Ehrlich-Reagens in jedes Röhrchen gegeben und zur OD-Bestimmung bei 585 nm 300 µl in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte überführt. Die nmol an N-Acetylglucosamin wurden aus einer Standardkurve von N-Acetylglucosamin berechnet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Messen der Bildung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin in Extrakten aus menschlichem und tierischem Gewebe oder Zellen in Gewebekulturen, umfassend die Schritte (a) Hydrolysieren eines Extrakts aus menschlichem oder tierischem Gewebe oder Zellen in Gewebekultur zur Umwandlung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin zu N-Acetylglucosamin; (b) Umsetzen des N-Acetylglucosamins in (a) mit Ehrlich-Reagens; und (c) Messen der Menge an N-Acetylglucosamin, das in (b) vorliegt, durch Bestimmen der optischen Dichte bei 500 bis 610 nm des Gemisches in (b) und Vergleichen der Menge von N-Acetylglucosamin in (b) mit einer Kontrollprobe von N-Acetylglucosamin, wodurch die Bildung von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Extrakte aus menschlichem Gewebe oder Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der Hydrolysierungsschritt in (a) mit Salzsäure, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat für 10 bis 30 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der Hydrolysierungsschritt in (a) mit Salzsäure, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat für 10 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der Hydrolysierungsschritt in (a) mit Salzsäure, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat bei mehr als 37°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Ehrlich-Reagens in (b) 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd, 0,3 ml Wasser, 2,2 ml konzentrierte Salzsäure und 17,4 ml Essigsäure umfaßt, wobei es vor der Verwendung 1:2 in Essigsäure verdünnt wird.
Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, wobei der Hydrolysierungsschritt in (a) in einem Mikrofugenröhrchen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Meßschritt in (c) in einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird.
Verfahren zum Messen der Inhibitoraktivität einer Testverbindung auf die Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin-Bildung in Zellen, umfassend die Schritte: (a) Inkubieren einer Testverbindung mit Zellen in Gewebekultur unter physiologischen Bedingungen für eine Zeit, die ausreichend ist, daß die Testverbindung Glutamin:Fructose-6-phosphat-Amidotransferase inhibieren und zelluläre Niveaus von Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin reduzieren kann; (b) Extrahieren des Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamins in (a); (c) Hydrolysieren des Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamins in (b) unter Bildung von N-Acetylglucosamin; (d) Umsetzen des N-Acetylglucosamins in (c) mit Ehrlich-Reagens; und (e) Messen der Menge an N-Acetylglucosamin in (d) durch Bestimmen der optischen Dichte bei 500 bis 610 nm des Gemisches in (d) und Vergleichen der Menge von N-Acetylglucosamin in (d) mit der Menge in Zellen in Gewebekultur, die nicht mit der Testverbindung inkubiert wurde, und einer Kontrollprobe von N-Acetylglucosamin, wodurch die Inhibitoraktivität der Testverbindung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zellen in (a) aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus menschlichen Nierenzellen vom Typ 293, menschlichen Nierenzellen vom Typ 293, transfektiert mit GFAT-beta, oder COS-Affennierenzellen, COS-Affennierenzellen, transfektiert mit GFAT-beta, Säugerzellen, Hefezellen und bakteriellen Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10, wobei der Hydrolysierungsschritt in (c) mit Salzsäure, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat für 10 bis 30 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10, wobei der Hydrolysierungsschritt in (c) mit Salzsäure, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat für 10 Minuten durchgeführt
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10, wobei der Hydrolysierungsschritt in (c) mit Salzsäure, gefolgt von der Zugabe von Kaliumtetraborat bei mehr als 37°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei das Ehrlich-Reagens in (d) 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd, 0,3 ml Wasser, 2,2 ml konzentrierte Salzsäure und 17,4 ml Essigsäure umfaßt, wobei es vor der Verwendung 1:2 in Essigsäure verdünnt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der Hydrolysierungsschritt in (c) in einem Mikrofugenröhrchen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei der Meßschritt in (e) in einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird.