CN106596784A - 泰妙菌素中有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种泰妙菌素中有关物质的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法以梯度洗脱的方式将由泰妙菌素中可能存在的杂质四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素和磺化侧耳素制备的对照品溶液及泰妙菌素供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算杂质含量。本发明通过对色谱条件的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了泰妙菌素中可能存在的杂质四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素的液相色谱分析方法；通过对色谱分离系统的优化，建立了兽药泰妙菌素中有关物质的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对兽药泰妙菌素中有关物质的控制，确保其安全性，从而更有效的防治猪、鸡等动物感染性疾病。

Description

泰妙菌素中有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于生物医药检验检测技术领域，特别是涉及一种泰妙菌素中有关物质的检测方法。
背景技术
泰妙菌素(Tiamulin)是一种二萜烯类动物专用抗生素，主要用于防治家畜家禽呼吸系统疾病和动物促生长，是世界十大兽用抗生素之一。用于预防和治疗由支原体感染以及大肠杆菌、沙门氏菌、螺旋体等感染引发的疾病，对猪支原体肺炎、嗜血杆菌胸膜性肺炎、地方性肺炎(气喘病)和猪痢疾有特效，对支原体关节炎、放线杆菌胸膜肺炎、回肠炎、结肠炎、水肿等疾病有良好疗效。泰妙菌素在世界各地应用广泛，在美国被专家推荐为控制猪、鸡支原体感染的首选药物。
猪呼吸道综合症(PRDC)是目前养猪业最常见、最难控制的疾病，特别是规模化养猪场发病率很高，难以根除，是严重危害我国现代化养猪业的疾病。防治猪呼吸道综合症，目前敏感药物主要有泰妙菌素、替米考星、泰乐菌素、林可霉素、盐酸土霉素及喹喏酮类药物。上述药物中土霉素与泰乐菌素的临床治疗效果较差；泰乐菌素与金霉素或土霉素联合使用能够减轻疾病症状，有一定的治疗作用；喹喏酮抗菌药有良好的抗菌活性，如蒽诺沙星、氧氟沙星等，但由于使用混乱，耐药菌株越来越多，治疗效果逐渐变差；治疗效果较好的有泰妙菌素、替米考星、林可霉素。相比较而言，泰妙菌素具有抗菌谱广，疗效好，不易产生抗药性，禁忌少等优点，应用最为广泛。
同时，几乎每个鸡场都存在支原体感染的问题，所以控制了支原体，就可以显著降低呼吸道疾病的发病率，其造成的隐性损失也可降到最低。泰妙菌素可以有效控制败血和滑膜支原体的感染，降低鸡呼吸道病的发病率，减少其它混合感染病原体引起疾病的机会，从而大大降低生产损失。
2015年我国统计的生猪出栏量为5.1亿头。按照20％总发病率，发病动物使用药物一个疗程，泰妙菌素的使用率为20％，如果再加上在其它疾病防治中的应用，泰妙菌素的国内市场需求量每年超过400吨。
从以上分析可见，泰妙菌素作为防治畜禽呼吸道疾病的特效药物，建立泰妙菌素的质量控制体系，保证其产品质量及安全性就具有非常实际的意义。
发明内容
本发明的目的就在于建立一种泰妙菌素的质量控制体系，提供一种泰妙菌素中有关物质的检测方法。
本发明采用下述技术方案实现：
一种泰妙菌素中有关物质的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法以梯度洗脱的方式将由泰妙菌素中可能存在的杂质四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素和磺化侧耳素制备的对照品溶液及泰妙菌素供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算杂质含量，其中色谱条件：
Kromasil 100-5C18色谱柱(150×4.6mm)，
流动相：乙腈-0.05％磷酸溶液，体积比30～80∶20～70，
检测波长：225nm，
柱温：30～40℃；
流速：1.0ml/min。
所述梯度洗脱方式为：0分钟时，按照流动相A：流动相B＝80∶20的比例洗脱，8分钟时，按照流动相A：流动相B＝80∶20的比例洗脱，13分钟时，按照流动相A：流动相B＝30∶70的比例洗脱，23分钟时，按照流动相A：流动相B＝30∶70的比例洗脱，24分钟时，按照流动相A：流动相B＝80∶20的比例洗脱，其中流动相A为0.05％磷酸溶液，流动相B为乙腈。
所述对照品溶液的制备方法为：
分别精密称取对四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素适量，加乙腈并超声使溶解，用0.05％磷酸溶液稀释定容，获得四种贮备溶液；
分别精密吸取上述四种贮备溶液及富马酸储备溶液、泰妙菌素供试品溶液，用乙腈-0.05％磷酸溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得对照品溶液。
所述供试品溶液的制备方法为：称取泰妙菌素适量，用乙腈-0.05％磷酸溶液溶解并稀释定容，即可。
本发明中，泰妙菌素中含四丁基溴化铵不得大于5000ppm，含对甲基苯磺酸不得大于5000ppm。含截短侧耳素不得大于5000ppm，含磺化侧耳素不得大于5000ppm。
计算公式：
式中Ax为供试品溶液的峰面积；
Ar为对照品溶液的峰面积；
Cr为对照品溶液的浓度；
Cx为供试品溶液的浓度。
试验过程发现：泰妙菌素中杂质较多，现有的方法(供试品制备方法：称取泰妙菌素适量，用流动相超声并振摇使其溶解并稀释定容，即可；流动相为甲醇：碳酸铵溶液-乙腈(49:28:23)。)不能将所有杂质有效检出，并定量控制；同时处理过程复杂、繁琐，使得部分微量杂质损失。本发明通过大量实验，根据各杂质的性质，简化提取方式为直接溶解，同时采用梯度洗脱方式，用同一方法将泰妙菌素中所有杂质有效检出，并取得高效分离，有效控制泰妙菌素中的各项杂质，确保了泰妙菌素的安全性。
本发明首先通过对色谱条件的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了泰妙菌素中可能存在的杂质四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素的液相色谱分析方法；通过对色谱分离系统的优化，建立了兽药泰妙菌素中有关物质的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对兽药泰妙菌素中有关物质的控制，确保其安全性，从而更有效的防治猪、鸡等动物感染性疾病。
附图说明
图1为四丁基溴化铵标准曲线图；
图2为对甲基苯磺酸标准曲线图；
图3为截短侧耳素标准曲线图；
图4为磺化侧耳素标准曲线图；
图5为四丁基溴化铵对照品溶液HPLC色谱图；
图6为对甲基苯磺酸对照品溶液HPLC色谱图；
图7为截短侧耳素对照品溶液HPLC色谱图；
图8为磺化侧耳素对照品溶液HPLC色谱图；
图9为泰妙菌素供试品溶液HPLC色谱图；
图10为空白溶液HPLC色谱图。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
样品名称：泰妙菌素，(来源：宁夏泰瑞制药股份有限公司)。
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器，Shimadzu LabSolution色谱工作站。
色谱条件：Kromasil 100-5C18色谱柱(150×4.6mm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸溶液(30-80：20-70)，检测波长：225nm；柱温：30-40℃；流速：1.0ml/min。
贮备溶液的制备：精密称取对四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素各12.5mg，置25ml容量瓶中，加乙腈5ml超声使溶解，用0.05％磷酸溶液稀释至刻度。
供试品溶液的制备：称取泰妙菌素样品50.0mg，置10mi容量瓶中，用乙腈-0.05％磷酸溶液(20∶80)溶解并稀释至刻度。
对照品溶液的制备：分别精密吸取上述制备好的四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素各杂质贮备溶液5ml，富马酸储备溶液1ml，供试品溶液5ml，同置50ml容量瓶中，用乙腈-0.05％磷酸溶液(20∶80)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
含量测定：将上述供试品溶液和对照品溶液采用高效液相色谱法以梯度洗脱的方式注入液相色谱仪中，根据外标法计算杂质含量。本发明中，泰妙菌素中含四丁基溴化铵不得大于1.0％，含对甲基苯磺酸不得大于1.0％。含截短侧耳素不得大于1.5％，含磺化侧耳素不得大于1.5％。
梯度洗脱方式为：其中其中流动相A为0.05％磷酸溶液，流动相B为乙腈。
时间 流动相A(％) 流动相B(％)
0.0 80 20
8.0 80 20
13.0 30 70
23.0 30 70
24.0 80 20
计算公式：
式中Ax为供试品溶液的峰面积；
Ar为对照品溶液的峰面积；
Cr为对照品溶液的浓度；
Cx为供试品溶液的浓度。
精密度：取供试品溶液，重复进样5次，结果四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素的峰面积RSD分别为0.61％、0.8％、1.15％、0.45％。重复性良好(见表1)。
表1四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素精密度试验结果表
线性试验：精密称取四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素对照品适量，加乙腈5ml超声使溶解，用0.05％磷酸溶液稀释至刻度，制成每1ml含0.5mg的储备溶液，分别精密量取上述储备液1.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，置10ml量瓶中，用乙腈-0.05％磷酸溶液(20:80)稀释至刻度，摇匀，即得。试验结果表明:四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素在0.05～0.5mg/ml范围内，呈良好的线性关系。测定结果见表2，线性关系曲线图见图。
表2四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素测定线性范围

Claims (4)

1.一种泰妙菌素中有关物质的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法以梯度洗脱的方式将由泰妙菌素中可能存在的杂质四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素和磺化侧耳素制备的对照品溶液及泰妙菌素供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算杂质含量，其中色谱条件：
Kromasil 100-5C18 色谱柱，
流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液,体积比30～80：20～70，
检测波长：225nm，
柱温：30～40℃；
流速：1.0ml/min。
2.按照权利要求1所述的泰妙菌素中有关物质的检测方法，其特征在于所述梯度洗脱方式为：0分钟时，按照流动相A：流动相B=80:20的比例洗脱，8分钟时，按照流动相A：流动相B=80:20的比例洗脱，13分钟时，按照流动相A：流动相B=30:70的比例洗脱，23分钟时，按照流动相A：流动相B=30:70的比例洗脱，24分钟时，按照流动相A：流动相B=80:20的比例洗脱，其中流动相A为0.05%磷酸溶液，流动相B为乙腈。
3.按照权利要求1所述的泰妙菌素中有关物质的检测方法，其特征在于所述对照品溶液的制备方法为：
分别精密称取对四丁基溴化铵、对甲基苯磺酸、截短侧耳素、磺化侧耳素适量，加乙腈并超声使溶解，用0.05%磷酸溶液稀释定容，获得四种贮备溶液；
分别精密吸取上述四种贮备溶液及富马酸储备溶液、泰妙菌素供试品溶液，用乙腈-0.05%磷酸溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得对照品溶液。
4.按照权利要求1所述的泰妙菌素中有关物质的检测方法，其特征在于所述供试品溶液的制备方法为：称取泰妙菌素适量，用乙腈-0.05%磷酸溶液溶解并稀释定容，即可。
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