ES2908264T3

ES2908264T3 - Agentes inmunomoduladores

Info

Publication number: ES2908264T3
Application number: ES15736953T
Authority: ES
Inventors: Samuel Waksal; Zhenping Zhu; Yan Wu; Stella MARTOMO; Zhaojing Zhong; Dan Lu
Original assignee: Kadmon Corp LLC
Current assignee: Kadmon Corp LLC
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2015-01-15
Publication date: 2022-04-28
Anticipated expiration: 2035-01-15
Also published as: EP3094351B1; PT3094351T; DK3094351T3; CN113603788A; HUE057917T2; CN105263521A; EP3094351B9; US20160340429A1; ES2908264T9; SI3094351T1; JP2022019807A; CN113637692A; HRP20220214T1; JP2020058389A; JP2023099601A; CA3193936A1; US20240059775A9; EP4079321A1; WO2015109124A2; US10407502B2

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: (i) un primer dominio que comprende un anticuerpo contra PD-L1, en donde el anticuerpo comprende (a) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:121; una CDR-2H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:123; una CDR-3H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:125; una CDR- 1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:127; una CDR-2L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:128; y una CDR-3L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:129; (b) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 241, una CDR-2H que comprende SEQ ID NO: 243 y una CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245; y una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249; o (c) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 266, una CDR-2H que comprende SEQ ID NO: 243 y una CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245; y una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249; y en donde el anticuerpo se une a PD-L1 y bloquea su interacción con PD-1, (ii) un segundo dominio que se une al receptor de IL-15 ("IL-15R"), en donde el segundo dominio comprende IL- o un fragmento de unión a IL-15R del mismo, y (iii) un dominio sushi del receptor de IL-15 alfa.

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes inmunomoduladores

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona proteínas de fusión que comprenden anticuerpos que se unen específicamente a PD-L1, un dominio de unión al receptor de IL15 y un dominio sushi del receptor de IL15 alfa, moléculas de ácidos nucleicos que los codifican, y usos médicos de las mismas. Los agentes potencian la función los de linfocitos T y las células NK para aumentar la inmunidad celular y mediada por citocinas para el tratamiento de diversos trastornos relacionados con la disfunción inmunitaria que incluyen cánceres y enfermedades infecciosas.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de EE. UU. N.° 61/927.907, presentada el 15 de enero de 2014.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La muerte 1 programada (PD-1) es un miembro de la familia CD28 de receptores que comprenden CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS y BTLA (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8). PD-1 es un receptor inmunosupresor inducible regulado principalmente por incremento en linfocitos T y linfocitos B activados durante la progresión de afecciones inmunopatológicas. La interacción de PD-1 con su ligando PD-L1 produce la inhibición de la proliferación mediada por TCR y BCR y la producción de citocinas y la inducción de apoptosis de linfocitos T específicos de antígeno mediante la señalización negativa intrínseca mediada por PD-1 de un motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina. (ITIM) (Agata et al. (1996) Int. Immunol. 8:765, Unkeless y Jin. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:338-343, Okzaki et al. (2001) PNAS 98:13866-71, Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:793-800). PD-L1 es una glucoproteína de la superficie celular y un ligando importante para PD-1. PD-L1 también es inducible en tejidos linfoides y tejidos periféricos no linfoides tras la activación celular. PD-L1 está regulado por incremento en una variedad de tipos de células afectados que incluyen células cancerosas y del estroma, además de células inmunitarias, y desempeña una función activa en la inmunosupresión durante el desarrollo del deterioro de enfermedades (Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7, Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53). La regulación por incremento de PD-L1 se ha asociado a malos desenlaces clínicos en una variedad de cánceres e infección vírica (Hofmeyer et al. (2011) J. BioMed. Biotech. 2011:1-9, McDermott y Atkins. (2013) Cancer Med. 2:662-73). El bloqueo de PD-1 o PD-L1 por anticuerpo promovió la infiltración de linfocitos T CD8, la actividad de CTL y la elevada presencia de la citocina Th1 IFN-gamma en la práctica preclínica y clínica (Zhou et al. (2010) J. Immunol. 185:5082-92, Nomi et al. (2007) Clin Cancer Res. 13:2152-7, Flies et al. (2011) Yale J. Bio. Med. 48:409-21, Zitvogel y Kroemer. (2012) OncoImmunol. 1:1223-25). Se ha mostrado que el anticuerpo contra PD-L1 como agente inmunomodulador es eficaz cuando se usa como monoterapia o combinado con anticuerpos contra otras moléculas inmunosupresoras.

Sin embargo, la intervención inmunomoduladora a los factores inmunosupresores solo resuelve parcialmente los problemas asociados con una inmunidad alterada en el cáncer, la infección y otras enfermedades. Es todavía altamente deseable utilizar agentes bioterapéuticos para estimular y expandir directamente las células inmunitarias efectoras para elevar la respuesta inmunitaria innata y adaptativa debilitada hasta un nivel más eficaz para controlar el tumor y la infección. Se ha mostrado que la inmunoterapia usando citocinas que incluyen interleucinas, es decir, IL-2, IL-12, IL15, IL-21 y TNFa, GM-CSF, etc., es de algún modo eficaz en el tratamiento del cáncer y la infección, pero el desenlace clínico está limitado frecuentemente por la toxicidad sistémica asociada con las elevadas concentraciones de citocina en sangre que necesitan obtener eficacia y carecer de la especificidad de diana en las células y los tejidos afectados.

Entre las citocinas evaluadas, se ha reconocido que IL15 se dedicó a estimular linfocitos T CD8 efectores y de memoria central compuestos de un subconjunto de células CD8 específicas de antígeno para ejercer inmunidad antitumoral sin modular efectos sobre otras poblaciones de linfocitos T. Además, a diferencia de IL-2 que activa Treg, se ha mostrado que IL15 tiene la capacidad de rescatar linfocitos T de la apoptosis inducida por Treg y otras células inmunosupresoras, además de su capacidad para activar linfocitos citolíticos espontáneos (NK) y linfocitos T CD8 efectores y de memoria (Van Belle et al. (2012) PLoS One 7:e45299, Obar y Lefrancois. (2010) J. Immunol. 185:263-72, Pelletier y Girard. (2006) J Immunol 177:100-108, Elpek et al. (2010) PNAS 107:21647-21652).

En 1994 se identificó IL15 como una citocina gc basándose en su capacidad para estimular la proliferación de la línea de linfocitos T murinos CTLL-2 (Grabstein et al. (1994) Science 264:965-8, Bamford et al. (1996) PNAS 93:2897-902). La IL15 humana comparte aproximadamente el 97 % y el 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la IL15 simia y de macaco cangrejero, respectivamente. La IL15 humana y de ratón tiene 73 % de homología y son comparablemente activas en células de ratón. La IL15 es una proteína de 12,5 KD (114 aminoácidos), secretada por DC, macrófagos y células granulares como una glucoproteína de 14-15 kDa, y también un miembro de las citocinas que contienen un haz de cuatro hélices a (Andderson et al. (1995) J Biol Chem. 270:29862-9, Steel et al. (2012) Trends Pharmacol. Sci. 33:35-41). La IL15 forma normalmente un complejo con el receptor alfa de IL15 expresado en APC antes de la unión con el receptor beta de IL15 funcional y unidades gamma en linfocitos T y células NK. La IL15 se puede presentar en trans a las células sensibles que expresan CD122 y CD132 por células que expresan la citocina en sí unida a una forma de membrana de la cadena del receptor alfa (Dubois et al. (2002) Immunity 17:537-47). El dominio sushi del receptor de IL15 alfa (29,5 KD de tamaño) es un componente importante para formar un complejo con la IL15 antes del acoplamiento apropiado con el receptor p y y (Wei et al. (2001) J. Immunol, 167:277-82). Se informó que el complejo de IL15 y IL15Ra y la proteína de fusión del dominio sushi de IL15/IL15Ra eran altamente potentes para estimular linfocitos T CD8 y células NK in vitro e in vivo en comparación con IL15 sola (Mortier et al. (2005) J Biol Chem. 281:1612-19, Stoklasek et al. (2006) J. Immunol. 177:6072-80). La IL15 también induce la proliferación y diferenciación de linfocitos B humanos estimulados (Armitage et al. (1995) J Immunol. 154:483-90). Se indicó que la IL15 se opuso principalmente a la muerte celular inducida por activación (AICD) actuando para prolongar la supervivencia de los linfocitos T (Marks-Konczalik et al. (2000) PNAS 97:11445-50). La IL15 tiene una capacidad excepcional para soportar el mantenimiento de células NK y el fenotipo de memoria y linfocitos T CD8 de memoria específicos de antígeno (Ma et al. (2006) Annu Rev Immunol. 24:657-79). Por lo tanto, entre las citocinas más activas en la inmunomodulación, la IL15 tiene una capacidad única para mediar en muchos aspectos importantes de la inmunidad contra una variedad de tipos de tumor e infección vírica que incluyen VIH, VHB, VHC, LCMV, etc. (Steel et al. (2012) Trends Pharmacol. Sci. 33:35-41, Verbist y Klonowski, (2012) Cytokine. 59:467-478).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden anticuerpos que se unen a PD-L1. En las proteínas de fusión de la invención, los anticuerpos se unen a PD-L1 y bloquean la interacción con PD-1. Bloqueando la interacción de PD-L1 con PD-1, dichos anticuerpos son útiles para reducir o inhibir la inmunosupresión.

También se desvelan anticuerpos y proteínas de unión que se unen específicamente a PD-L1 y a al menos otra molécula. Los ejemplos incluyen proteínas de unión a PD-L1 que también se unen a uno o varios de otros ligandos y/o receptores, que pueden estar unidos a la membrana o ser solubles.

También se desvelan moléculas, tales como proteínas de fusión que se unen a PD-L1, que, aparte de reducir o inhibir la inmunosupresión uniéndose a PD-L1, también promueven una o más respuestas inmunitarias por interacción con otros ligandos o

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende:

(i) un primer dominio que comprende un anticuerpo contra PD-L1, en donde el anticuerpo comprende

(a) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:121; una CDR-2H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:123; una CDR-3H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:125; una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:127; una CDR-2L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:128; y una CDR-3L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:129;

(b) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 241, a CDR-2H que comprende SEq ^{ID NO: 243, y a CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245; y una CDR-1L de cadena ligera que}comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249; o

(c) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 266, a CDR-2H que comprende SEq ^{ID NO: 243, y a CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245; y una CDR-1L de cadena ligera que}comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249;

y en donde el anticuerpo se une a PD-L1 y bloquea su interacción con PD-1,

(ii) un segundo dominio que se une al receptor de IL-15 ("IL-15R"), en donde el segundo dominio comprende IL-15 o un fragmento de unión de IL-15R del mismo, y

(iii) un dominio sushi del receptor de IL-15 alfa.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende además un conector flexible que une el dominio sushi de IL-15R alfa con el fragmento de unión de IL-15 o IL-15R, opcionalmente en donde el conector flexible comprende 15 20 aminoácidos que son predominantemente serina y glicina. En realizaciones adicionales, la proteína de fusión comprende SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:323 o SEQ ID NO: 261.

En una realización, el anticuerpo contra PD-L1 comprende una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:121; una CDR-2H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:123; una CDR-3H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:125; una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:127; una CDR-2L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:128; y una CDR-3L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:129. En otra realización, el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que es al menos 85 % idéntico a SEQ ID NO:126 y/o un dominio variable de la cadena ligera que es al menos 85 % idéntico a SEQ ID NO:130. En algunas realizaciones, el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:126 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO:130. En una realización adicional, el anticuerpo contra PD-L1 comprende una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SeQ ^{ID NO:249; y una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 241, una CDR-2H que comprende SEQ ID NO: 243 y una CDR-3H que comprende SEQ ID}nO: ^{245. En otra realización, el anticuerpo contra PD-L1}comprende una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende ^{SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende}SeQ ^{ID NO:249; y una CDR-1H de cadena pesada que comprende}SEQ ID NO: 266, una CDR-2H que comprende SEQ ID NO: 243 y una CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245. En otra realización, el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que es al menos 85 % idéntico a SEQ ID NO:246 y/o un dominio variable de la cadena ligera que es al menos 85 % idéntico a SEQ ID NO:250. En algunas realizaciones, el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:246 o SEQ ID NO:267 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO:250. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende SEQ ID NO: 261.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un uso médico de la proteína de fusión de la invención en el tratamiento del cáncer. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de la invención.

receptores. Como se desvela en el presente documento, la molécula se une a PD-L1 en células diana, y también estimula una respuesta inmunitaria celular, por ejemplo, promoviendo la proliferación de linfocitos T y/o células NK. La molécula desvelada en el presente documento estimula células que responden a una interleucina o un interferón, tales como, sin limitación, IL2, IL7, IL15 e IL21. La molécula desvelada en el presente documento puede incluir una secuencia o dominio que promueve la estimulación de IL15 del receptor de IL15 (IL15R). Como se desvela en el presente documento, la molécula que promueve la estimulación de IL15R puede ser una porción de la cadena alfa de IL15R que comprende un dominio sushi. La molécula desvelada en el presente documento puede proporcionar el dominio sushi de la cadena alfa de IL15R. La molécula desvelada en el presente documento puede proporcionar un complejo de IL15 y el dominio sushi de la cadena alfa de IL15R, que puede ser covalente o no covalente. Los experimentos desvelados en el presente documento muestran que moléculas individuales que contienen tanto un dominio de unión a PD-L1 que bloquea la unión de PD-L1 a PD-1, y un dominio estimulante de IL15R, promueven una mejor respuesta inmunitaria que las moléculas separadas usadas juntas. Más particularmente, el proporcionar una molécula que proporciona un dominio de anticuerpo anti-PD-L1, así como un dominio que comprende IL15 y el dominio sushi de cadena alfa de IL15, promovió la elevada proliferación, la liberación de citocinas Th1 y las moléculas relacionadas con la actividad destructora de células NK y linfocitos T, en comparación con proporcionar los dominios en moléculas separadas.

También se desvela un anticuerpo o fragmento que se une a PD-L1, que comprende una CDR-1H de cadena pesada que tiene la secuencia X1YX2MX3 (SEQ ID NO:328) en donde X1 es A, G, M, Q, S, Y o W, X2 es A, L, M, Q, R, S, V, ^{W o Y, y X}3 ^{es A, F, L, M, S, T, V o Y, una CDR-}2 ^{H de cadena pesada que tiene SEQ ID NO:243, y una}cDr-3H ^decadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:245. Como se desvela en el presente documento, la CDR-1H de cadena pesada puede tener una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:290, SEQ ID NO:292, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:300, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:306, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:310 y SEQ ID NO:312. Como se desvela en el presente documento , el dominio variable de la cadena pesada puede ser al menos 80 %, o al menos 85 %, o al menos 90 %, o al menos 95 % idéntico a SEQ ID NO:246. Los anticuerpos pueden comprender además un dominio variable ^{de la cadena ligera que comprende una CDR-1 L que tiene SEQ ID}N^o:247, ^{una CDR-2L que tiene SEQ ID NO:248 y}una CDR-3L que tiene SEQ ID NO:249.

Como se desvela en el presente documento, el dominio variable de la cadena ligera puede ser al menos 80 %, o al menos 85 %, o al menos 90 %, o al menos 95 % idéntico a SEQ ID NO:250. También se desvela un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a PD-L1, en donde la cadena ligera comprende una CDR-1L que tiene ^{SEQ ID NO:247, una CDR-2L que tiene SEQ}iD ^{NO:248 y una CDR-3L que tiene}sEq ^{ID NO:249.}

También se desvelan conjugados de los anticuerpos, por ejemplo, y sin limitación, para agentes de obtención de imágenes, agentes terapéuticos o agentes citotóxicos.

También se desvelan composiciones que comprenden los anticuerpos y conjugados y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona una proteína de fusión capaz de unirse a PDL1, que también estimula una respuesta inmunitaria mediada por, por ejemplo, un linfocito T o un linfocito NK. En la invención, la proteína de fusión incluye una porción que se une al receptor de IL15. También se desvelan proteínas de fusión que incluyen una porción que se une a, por ejemplo, un receptor de interleucina o un receptor de interferón. Como se desvela en el presente documento, la porción de la proteína de fusión que se une a PD-L1 es un anticuerpo o fragmento de unión a PD-L1 del mismo. Como se desvela en el presente documento, la porción de unión al receptor de IL15 es IL15, cuya unión se pueden potenciar por la presencia en la proteína de fusión de un dominio alfa sushi de IL15R.

También se desvela un método de inhibición de la interacción de PD1 con PD-L1 en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento desvelado en el presente documento. También se desvela un método de inhibición de la inmunosupresión mediada por PD-L1 que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento, o una proteína de fusión desvelada en el presente documento.

También se desvela un método de estimulación de una respuesta inmunitaria contra una célula o tejido que expresa PD-L1, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento, o una proteína de fusión como se desvela en el presente documento.

Por ejemplo, la célula o tejido que expresa PD-L1 es una célula neoplásica o una célula infectada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 representa la unión a hPDL1-Fc humana (panel izquierdo superior), el bloqueo de hPDL1 a hPD1 (panel izquierdo inferior), la unión a mPDL1-Fc de ratón (panel derecho superior) y el bloqueo de mPDL1 a hPD1 (panel derecho inferior) de los anticuerpos tccR3AF8, tccR3KA11, tccR3AH4, tctR3KA8, sR3AD7 y R2^kA6.

La Figura 2 representa la unión a hPDL1-Fc humana (panel izquierdo superior), el bloqueo de hPDL1 a hPD1 (panel izquierdo inferior), la unión a mPDL1-Fc de ratón (panel derecho superior) y el bloqueo de mPDL1 a hPD1 (panel derecho inferior) de los anticuerpos sR3AD7, tccR3KB7, tccR3KA4, tccR3AF8, tccR3AD7, tccR3AH4 y tccR3KD9.

La Figura 3 representa la unión a hPDL1-Fc humana (panel izquierdo superior), el bloqueo de hPDL1 a hPD1 (panel izquierdo inferior), la unión a mPDL1-Fc de ratón (panel derecho superior) y el bloqueo de mPDL1 a hPD1 (panel derecho inferior) de los anticuerpos tccR3KF8, tccR3KD9, tccR3AD7, tccR3AD7 sR3^kF10, sR3AD7 y tccR3AF8.

La Figura 4 representa la unión a hPDL1-Fc humana (panel izquierdo superior), el bloqueo de hPDL1 a hPD1 (panel izquierdo inferior), la unión a mPDL1-Fc de ratón (panel derecho superior) y el bloqueo de mPDL1 a hPD1 (panel derecho inferior) de los anticuerpos P2^kA6, sR3AD7, tccR3AD7, tccR3KB7 y tccR3KH4.

La Figura 5 representa la unión a células PDLI-293 (arriba) y a células MDS-MB-231 (abajo) de los anticuerpos sR3AD7, tctR3KA8, tccR3KA11, tccR3AD7, tccR3KD9, tccR3AF8, tccR3KF8, tccR3KF10, tccR3AH4, tccR3KB7 y tccR3KA4.

La Figura 6 representa la unión de anticuerpos anti-PD-L1 a (A) células dendríticas derivadas de monocitos humanos, (B) estirpe celular de cáncer humano que expresa células PD-L1 MDA-MB-231 y (C) estirpe celular de ratón que expresa PD-L1 B16-F10.

La Figura 7 muestra la actividad de bloqueo funcional de anticuerpos anti-PD-L1 medida por (A) aumento en la proliferación de CD4 cuando se activa por perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1Fc, (B) aumento en la secreción de citocinas en CMSP humanas activadas por SEB y (C) aumento en la proliferación de CD4 en la reacción de linfocitos mixtos con mo-DC.

La Figura 8 muestra la activación de CD4 y CD8 cuando tanto el anticuerpo anti-PDL1 como la IL15 estaban presentes en (A) la reacción de linfocitos mixtos con mo-DC, y (B) estimulación de CD8 por perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1 Fc.

La Figura 9 muestra que las proteínas de fusión de anti-PD-L1-dominio sushi-IL15 (denominadas anti-PDL1-SD15) retienen la unión a PD-L1 como se mide por (A) ELISA en fase sólida, y (B) la unión de un CD4 activado por perlas recubiertas con aCD3.

La Figura 10 muestra que CMSP cultivadas in vitro con proteínas de fusión anti-PD-L1-SD15 produjeron un aumento en el número de células NK (A), aumento del número de células CD8 (B) y estado de activación como se mide por % de granzima B (C). No se observó efecto sobre las células CD4 (D).

La Figura 11 muestra la función de proteínas de fusión anti-PD-L1 -SD15 para activar CD8 similarmente a IL15 cuando se añadió a estimulación de CD8 in vitro en presencia de perlas recubiertas con aCD3 (A). Sin embargo, en presencia de perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1 Fc, las proteínas de fusión anti-PD-L1 -SD15 pueden aumentar la proliferación de CD8 en más de cinco veces cuando se compara con IL15 (B). cD7-SD15neg es anti-PD-L1 cD7 con IL15 no funcional que sirve de controles negativos.

La Figura 12 muestra la activación de CD8 en presencia de PD-L1Fc en células presentadoras de antígenos. La proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 cD7-SD15 estimuló CD8 en concentraciones significativamente menores como se mide por (A) el porcentaje del aumento en CD8 positivo para granzima B, y (B) aumento en las secreciones de citocinas totales. Los máximos niveles de activación de CD8 también aumentaron en CD8 activado por aCD3 y PD-L1Fc con adición de cD7-SD15 en comparación con IL15. (C) Datos sobre la proliferación de CD8 en presencia de tanto el anticuerpo anti-PD-L1 como la IL15 libre (líneas de puntos) se superponen sobre datos de la proliferación de CD8 en presencia de la proteína de fusión anti-PD-L1 -SD15 (líneas rectas).

La Figura 13 proporciona secuencias de aminoácidos de cadenas V^h(Fig. 13A1-3) y V^l(Fig. 13B1-3) de anticuerpos anti-PD-LI. Para las secuencias de V^h, las regiones recuadradas indican CDR. Para CDR-1H, las CDR de Chothia están en cursiva y las CDR de Kabat están subrayadas. Para CDR-2H, las CDR de Kabat son coextensivas con las secuencias recuadradas, con CDR de Chothia en cursiva. Para las secuencias de V^l, las regiones recuadradas indican CDR de Kabat/Chothia.

La Figura 14 muestra las secuencias de aminoácidos de SD15 (SEQ ID NO:261), que incluyen el dominio sushi de IL15R alfa e IL15, tccAD7HC-SD15 (SEQ ID NO:262) y el mutante LALA de tccAD7HC-SD15 (SEQ ID NO:263), que contiene sustituciones de alanina por dos leucinas adyacentes en las posiciones (Leu234 y Leu235) en la región constante de la cadena pesada importante para FcyRI.

La Figura 15 muestra la citotoxicidad de la proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 (CD7SD15) en comparación con la porción de unión a PD-L1 de la molécula sola (cD7) y una proteína de fusión que contiene un dominio de unión específico para KLH y el dominio de IL15 (KLHSD15). Los linfocitos T CD8 y las células tumorales MAD-MB-231 se cultivaron conjuntamente en IMDM complementado con 10 % de FBS durante 7 días. Se evaluó la actividad de destrucción de las células tumorales por la medición del número de células tumorales muertas teñidas por Viability Dye eFluor 780 en FACS.

La Figura 16 muestra que la proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 prolongó la tasa de supervivencia de ratones que llevan tumores que expresan PD-L1. Se inyectó por vía intravenosa ratones Balb/c con 2x105 células de tumor de colon murino CT26. 24 h después, los ratones recibieron administración i.p. del anticuerpo anti-PD-L1 cD7 (línea púrpura: 75 ug por dosis), proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 cD7-SD15 (línea verde: 75 ug por dosis, línea azul: 25 ug por dosis) o sD7-SD15 (línea gris: 75 ug por dosis, línea roja: 25 ug por dosis) dos veces a la semana en la primera semana, luego una vez a la semana el resto del ciclo de tratamiento. Los ratones en grupos de control recibieron un volumen igual de solución salina o disolución normal de IgG. La tasa de supervivencia se midió usando el gráfico de Kaplan-Meier.

La Figura 17 muestra la unión de dos anticuerpos anti-PDL1 madurados por afinidad a PDL1 humano soluble, PDL1 de ratón soluble y PDL1 de rata soluble, y la no unión a PDL2 humano.

La Figura 18 muestra el bloqueo de PD1 humano a PDL1 humano (panel izquierdo) y el bloqueo de PD1 de ratón a PDL1 de ratón (panel derecho) por dos anticuerpos anti-PDL1 madurados por afinidad, en comparación con su anticuerpo tcc AD7 parental.

La Figura 19 muestra que dos variantes maduradas por afinidad de anticuerpos anti-PD-L1 tccAD7 tienen mayor actividad de unión a PD-L1 que expresa células tumorales MDA-MB-231 humanas como se mide por citometría de flujo.

La Figura 20 muestra variantes maduradas por afinidad de anticuerpos anti-PD-L1 tccAD7 que tienen elevada potencia para promover la producción de citocinas Th1 IL2 (panel superior) e IFNy (panel inferior).

La Figura 21 muestra la unión de proteínas de fusión desveladas en el presente documento a células tumorales MDA-MB-231 que expresan PD-L1.

La Figura 22 muestra la actividad estimulante de proteínas desveladas en el presente documento en células de leucemia megacarioblástica humanas sensibles a IL15.

La Figura 23 muestra la unión de hPD-L1 (panel izquierdo) y la actividad de bloqueo de ligandos (panel derecho) por las proteínas de fusión desveladas en el presente documento.

La Figura 24 muestra los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño para las proteínas de fusión desveladas en el presente documento.

La Figura 25 muestra la estabilidad en suero para las proteínas de fusión desveladas en el presente documento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La interacción de PD-1 en células inmunitarias con PD-L1 inhibe la proliferación y la producción de citocinas por células inmunitarias. PD-L1 también es inducible y regulada por incremento en diversos tejidos, que incluyen cáncer. Juntos, PD-1 y PD-L1 desempeñan una función en la inmunosupresión. La invención proporciona novedosas proteínas de fusión que comprenden anticuerpos que se unen a PD-L1 y bloquean la interacción con PD-1. En las proteínas de fusión de la invención, los anticuerpos reducen o inhiben la inmunosupresión.

Los novedosos anticuerpos desvelados en el presente documento expuestos en la Tabla 1 y el listado de secuencias adjunto, que expone las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera (identificadas según los sistemas de identificación de Kabat y Chothia), así como región variable de la cadena pesada y ligera completa. Las primeras dos CDR de cadena pesada se identifican según los sistemas comunes de Kabat y Chothia, que proporcionan localizaciones distintas, pero que se solapan, para las CDR. Una comparación de las numerosas cadenas pesadas y ligeras muestra una similitud significativa entre muchas de las secuencias de CDR. Por consiguiente, cabría esperar que muchas de las CDR se pudieran mezclar y emparejar entre las secuencias.

Los anticuerpos pueden tener una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácidos. Los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden comprender uno de los dominios variables de la cadena pesada anteriormente mencionados y uno de los dominios variables de la cadena ligera anteriormente mencionados. Los anticuerpos contra PD-L1 o fragmentos de unión de los mismos como se desvela en el presente documento pueden comprender una o más CDR o uno o más dominios variables con una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, idéntica a la CDR y secuencias del dominio variable expuestas en la Tabla 1.

"Identidad" se refiere al número o porcentaje de posiciones idénticas compartidas por dos secuencias del aminoácido o de ácidos nucleicos, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesita introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. "Sustancialmente idénticas" significa una secuencia de aminoácidos que se diferencia solo por sustituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo, sustitución de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, valina por glicina, arginina por lisina, etc.) o por una o más sustituciones, deleciones, o inserciones no conservativas localizadas en las posiciones de la secuencia de aminoácidos que no destruyen la función de la proteína. Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer, en algunos casos, seleccionando sustituciones que no se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana; o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Por ejemplo, los restos que existen de forma natural se pueden dividir en grupos basándose en las propiedades de la cadena lateral; (1) aminoácidos hidrófobos (norleucina, metionina, alanina, valina, leucina y isoleucina); (2) aminoácidos hidrófilos neutros (cisteína, serina y treonina); (3) aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); (4) aminoácidos básicos (asparagina, glutamina, histidina, lisina y arginina); (5) aminoácidos que influyen en la orientación de la cadena (glicina y prolina); y (6) aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina). Las sustituciones hechas dentro de estos grupos se pueden considerar sustituciones conservativas. Los ejemplos de sustituciones incluyen, sin limitación, sustitución de valina por alanina, lisina por arginina, glutamina por asparagina, ácido glutámico por ácido aspártico, serina por cisteína, asparagina por glutamina, ácido aspártico por ácido glutámico, prolina por glicina, arginina por histidina, leucina por isoleucina, isoleucina por leucina, arginina por lisina, leucina por metionina, leucina por fenilalanina, glicina por prolina, treonina por serina, serina por treonina, tirosina por triptófano, fenilalanina por tirosina y/o leucina por valina.

Preferentemente, la secuencia de aminoácidos es al menos 80 %, o al menos 85 %, o al menos 90 %, o al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos desvelada en el presente documento. Los métodos y los programas informáticos para determinar la similitud de secuencias están públicamente disponibles, que incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387, 1984), BlAs Tp , BLASTN, FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) y el programa ALIGN (versión 2.0). También se puede usar el bien conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la similitud. El programa BLAST está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, Md. 20894; BLAST 2.0 en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). En la comparación de secuencias, estos métodos explican diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen aquellos para los que se han mejorado las características de unión por mutación directa, métodos de maduración por afinidad, presentación en fagos, o barajado de cadenas. Se pueden modificar o mejorar la afinidad y la especificidad mutando CDR y cribando sitios de unión al antígeno que tienen las características deseadas. Las CDR se mutan en una variedad de formas. Una forma es aleatorizar los restos individuales o combinaciones de restos de manera que en una población de sitios de unión al antígeno por lo demás idénticos, los veinte aminoácidos se encuentren en posiciones particulares. Alternativamente, las mutaciones se inducen mediante una variedad de restos de CDR por métodos de PCR propensa a error (véase, por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Por ejemplo, los vectores de presentación en fagos que contienen genes de la región variable de la cadena pesada y ligera se pueden propagar en cepas mutadoras de E. coli (véase, por ejemplo, Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Estos métodos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos métodos conocidos por un experto en la técnica.

Para minimizar la inmunogenicidad, se prefieren los anticuerpos que comprenden secuencias de dominio constante humano. Los anticuerpos pueden ser o pueden combinar miembros de cualquier clase de inmunoglobulinas, tales como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, y las subclases de las mismas. La clase de anticuerpos se puede seleccionar para optimizar funciones efectoras (por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC)) de anticuerpos naturales.

También se desvela el uso de fragmentos de anticuerpos de unión a PD-L1. Un Fv es el fragmento más pequeño que contiene un dominio variable de la cadena pesada y ligera completo, que incluye los seis bucles hipervariables (CDR). Al carecer de dominios constantes, los dominios variables están no covalentemente asociados. Las cadenas pesadas y ligeras se pueden conectar en una única cadena de polipéptidos (una "Fv de cadena única" o "scFv") usando un

conector que permite que los dominios Vh y Vl se asocian para formar un sitio de unión al antígeno.

Como se desvela en el presente documento, el conector puede ser (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. Puesto que los fragmentos

scFv carecen de los dominios constantes de los anticuerpos completos, son considerablemente más pequeños que

los anticuerpos completos. Los fragmentos scFv también están libres de interacciones entre dominios constantes de

la cadena pesada normales con otras moléculas biológicas que pueden ser no deseadas.

También se pueden usar fragmentos de un anticuerpo que contiene Vh, Vl y opcionalmente Cl, Ch1 , u otros dominios

constantes. Los fragmentos monovalentes de los anticuerpos generados por digestión con papaína se denominan Fab

y carecen de la región bisagra de la cadena pesada. Los fragmentos generados por digestión con pepsina,

denominados F(ab')2, retienen la bisagra de la cadena pesada y son divalentes. Dichos fragmentos también pueden

ser producidos recombinantemente. Muchos otros fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno útiles son conocidos

en la técnica, e incluyen, sin limitación, diacuerpos, triacuerpos, anticuerpos de un solo dominio, y otras formas

monovalentes y multivalentes.

También se desvelan proteínas de unión al antígeno multivalentes, que pueden estar en la forma, sin limitación, de

anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos, y proteínas que comprenden todas o parte de las

porciones de unión al antígeno de los anticuerpos. Las proteínas de unión al antígeno multivalentes pueden ser

monoespecíficas, biespecíficas o multiespecíficas. El término especificidad se refiere al número de diferentes tipos de

determinantes antigénicos a los que se puede unir una molécula particular. Si una molécula de inmunoglobulina se

une a solo un tipo de determinante antigénico, la molécula de inmunoglobulina es monoespecífica. Si la molécula de

inmunoglobulina se une a diferentes tipos de determinantes antigénicos, entonces la molécula de inmunoglobulina es

multiespecífica.

La proteína de unión a PD-L1 desvelada en el presente documento puede tener una constante de velocidad de

asociación (Kas) de al menos aproximadamente 102 M-1s-1; al menos aproximadamente 103 M-1s-1; al menos

aproximadamente 104 M-1s-1; al menos aproximadamente 105 M-1s-1; o al menos aproximadamente 106 M-1s-1, como se

mide por resonancia de plasmones superficiales.

asociación (Kas) entre 102 M-1s-1 y 103 M-1s-1; entre 103 M-1s-1 y 104 M-1s-1; entre 104 M-1s-1 y 105 M-1s-1; o entre 105 M-1s-1 y 106 M-1s-1, como se mide por resonancia de plasmones superficiales.

disociación (Kdis) de como máximo aproximadamente 10-3 s-1; como máximo aproximadamente 10-4 s-1; como máximo

aproximadamente 10-5 s-1; o como máximo aproximadamente 10-6 s-1 como se mide por resonancia de plasmones

superficiales. La proteína de unión a PD-L1 desvelada en el presente documento puede tener una constante de

velocidad de disociación (Kdis) de 10-3 s-1 a 10-4 s-1; de 10-4 s-1 a 10-5 s-1; o de 10-5 s-1 a 10 resonancia de plasmones superficiales.

La proteína de unión a PD-L1 desvelada en el presente documento pueden tener una constante de disociación (Kd)

de como máximo aproximadamente 10-7 M; como máximo aproximadamente 10-8 M; como máximo aproximadamente

10-9 M; como máximo aproximadamente 10-10 M; como máximo aproximadamente 10-11 M; como máximo

aproximadamente 10-12 M; o como máximo 10-13 M. La proteína de unión desvelada en el presente documento puede

tener una constante de disociación (Kd) por sus dianas de 10-7 M a 10-8 M; de 10-8 M a 10-9 M; de 10-9 M a 10-10 M; de

10-10 M a 10-11 M; de 10-11 M a 10-12 M; o de 10-12 M a 10-13 M.

La proteína de unión descrita en el presente documento puede ser un conjugado que comprende además un agente

de obtención de imágenes, un agente terapéutico o un agente citotóxico. El agente de obtención de imágenes puede

ser una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, marca bioluminiscente, una marca

magnética, o biotina. La radiomarca puede ser: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu o 153Sm. El agente

terapéutico o citotóxico puede ser un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una

citocina, un agente antiangiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, toxina, o un agente apoptósico. Como se

trata más adelante, las citocinas inmunoestimulantes son de particular importancia.

La invención también proporciona proteínas de fusión que se unen a PD-L1 para inhibir la inmunosupresión, que

también promueven respuestas inmunitarias por interacción con otros ligandos o receptores. Como se ejemplifica en

el presente documento, dichas proteínas de fusión combinan el dominio de unión a PD-L1 de un anticuerpo con un

dominio que estimula la función de células NK o linfocitos T. Dicho dominio estimulante se une a y estimula un receptor

que es sensible a la interleucina IL15. El dominio estimulante ejemplificado en el presente documento es un dominio

híbrido que comprende el dominio sushi de la cadena alfa de IL15R unido a la IL15 por un conector (por ejemplo,

SEQ ID NO:261). Un ejemplo de una molécula completa se expone por SEQ ID NO:262. Una molécula casi idéntica,

modificada con dos sustituciones de aminoácidos en la región entre el dominio de anticuerpo y el dominio estimulante

de IL15R, para inhibir la proteólisis en la región, se expone por SEQ ID NO:263. Como se demuestra en el presente

documento, una molécula que comprende un dominio de unión a PD-L1 que inhibe la inmunosupresión, y un segundo dominio que promueve una respuesta inmunitaria, proporciona elevada actividad de células inmunitarias, en comparación con dos moléculas distintas que proporcionan las funciones por separado.

La porción de unión a PD-L1 de la proteína de fusión es un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo. Se proporcionan varios dominios variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo novedosos y anticuerpos que los incluyen. Según la invención, la porción de unión a PD-L1 es un anticuerpo que se une a PD-L1 y bloquea la inmunosupresión. También se desvelan anticuerpos anti-PD-L1 y fragmentos, no limitados a los novedosos anticuerpos desvelados en el presente documento, así como péptidos y proteínas derivadas de PD1, el ligando natural de PD-L1.

Como se desvela en el presente documento, el dominio de unión a PD-L1- se une a un dominio que estimula la actividad de células NK y linfocitos T. El dominio comprende IL15, y se une a ella por un conector flexible, el dominio "sushi" de la cadena alfa del receptor de IL15. El dominio sushi se une a IL15 con alta afinidad y el complejo de IL15 con el dominio sushi es particularmente activo para estimular la proliferación de células NK y linfocitos T. Lo que es especialmente notable es que, como se muestra en los ejemplos, el tratamiento con un agente que combina el dominio de unión a PD-L1 en la misma molécula que el dominio estimulante de IL15 es más eficaz que el tratamiento combinado usando el dominio de unión a PD-L1 y el dominio estimulante de IL15 como moléculas separadas.

Por lo tanto, la invención contempla proteínas de fusión que comprenden un dominio que se unen a PD-L1 y bloquea la unión a PD1, y un dominio que estimula IL15R, por lo tanto, la proliferación de células inmunitarias. Como se ejemplifica, el dominio estimulante de IL15R comprende el dominio sushi de la cadena alfa de IL15R unido con IL15 por un conector flexible similar al empleado para, por ejemplo, moléculas de Fv de una sola cadena (es decir, que contiene 15-20 aminoácidos que son predominantemente serina y glicina. En la práctica, hay otros métodos que se pueden usar, que se pueden preferir, por ejemplo, para procedimientos de fabricación. Además, se reconocen las estructuras de dominio, por lo tanto, los aspectos modulares y otras características de las proteínas híbridas desveladas. Por ejemplo, el conector que une el dominio sushi con IL15 es útil para expresar el híbrido como un polipéptido, pero también se podría sustituir por otros agentes, conectores o conectores cruzados. Alternativamente, la elevada afinidad de IL15 por la porción que contiene sushi de la cadena alfa de IL15R indica que el dominio sushi e IL15 formarían un complejo estable que necesita no ser covalente. Similarmente, mientras que la proteína ejemplificada comprende una región constante de anticuerpo entera, serían suficientes otros fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo de unión a PD-L1.

También se desvela un dominio de unión a PD-L1 unido a un dominio estimulante de IL15R, dominio estimulante de IL15R que comprende el dominio sushi de la cadena alfa de IL15R o una variante del mismo e IL15 o una variante de la misma. Como se desvela en el presente documento, las variantes serían 80 %, 85 %, 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 % idénticas a las secuencias desveladas en el presente documento. Como se desvela en el presente documento, el dominio sushi de la cadena alfa de IL15R e IL15 puede formar un complejo covalente. Como se desvela en el presente documento, el dominio sushi de la cadena alfa de IL15R e IL15 puede formar un complejo no covalente. El dominio de unión a PD-L1 puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR, o el dominio variable de la cadena pesada y o ligera de un anticuerpo del mismo desvelado en el presente documento, o ser un fragmento de unión al antígeno del mismo, o una variante del mismo, tal como una variante que es 80 %, 85 %, 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 % idéntica, o un anticuerpo contra PD-L1 conocido en la técnica que bloquea la unión a PD-1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Se entiende que las proteínas de fusión que comprenden anticuerpos anti-PD-L1 de la invención, donde se usan en un mamífero con el fin de profilaxis o tratamiento, se administrarán en forma de una composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, sacarosa, polisorbato, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la estabilidad en almacén o la eficacia de los anticuerpos.

En los usos médicos de la presente invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión de la invención se administra a un mamífero en necesidad de la misma. El término "administrar", como se usa en el presente documento, significa suministrar las proteínas de fusión de la presente invención a un mamífero por cualquier método que pueda lograr el resultado buscado. Se pueden administrar, por ejemplo, por vía intravenosa o por vía intramuscular. Aunque las proteínas de fusión ejemplificadas de la invención son particularmente útiles para la administración a seres humanos, también se pueden administrar a otros mamíferos. El término "mamífero", como se usa en el presente documento, pretende incluir, pero no se limita a, seres humanos, animales de laboratorio, animales domésticos y animales de granja. "Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de proteína de fusión de la presente invención que, cuando se administra a un mamífero, es eficaz en producir el efecto terapéutico deseado, tal como inhibir la actividad de cinasa.

Las proteínas de fusión de la invención son útiles para inhibir tumores y otras enfermedades neoplásicas, así como tratar otras afecciones patológicas asociadas a la inmunosupresión. Los tumores que se pueden tratar incluyen tumores primarios, tumores metastásicos y tumores resistentes al tratamiento. Los tumores resistentes al tratamiento incluyen tumores que dejan de responder o son resistentes al tratamiento con agentes quimioterapéuticos solos, anticuerpos solos, radiación sola o combinaciones de los mismos. Los tumores resistentes al tratamiento también engloban tumores que parecen ser inhibidos por el tratamiento con dichos agentes, pero recidivan hasta cinco años, algunas veces hasta diez años o más después de que se interrumpa el tratamiento. Los anticuerpos son eficaces para tratar tumores vascularizados y tumores que no están vascularizados, o todavía no sustancialmente vascularizados.

Los ejemplos de tumores sólidos que pueden ser, por consiguiente, tratados incluyen carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, glioma y linfoma. Algunos ejemplos de dichos tumores incluyen tumores epidermoides, tumores escamosos, tales como tumores de cabeza y cuello, tumores colorrectales, tumores de próstata, tumores de mama, tumores de pulmón, que incluyen tumores de pulmón de células pequeñas y células no pequeñas, tumores pancreáticos, tumores de tiroides, tumores de ovario y tumores de hígado. Otros ejemplos incluyen sarcoma de Kaposi, neoplasias del SNC, neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas y metástasis cerebrales, melanoma, carcinomas gastrointestinales y renales, y sarcomas, rabdomiosarcoma, glioblastoma, preferentemente glioblastoma multiforme y leiomiosarcoma. Los ejemplos de cánceres de piel vascularizados para los que los antagonistas desvelados en el presente documento son eficaces incluyen carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y cánceres de piel que se pueden tratar por supresión del crecimiento de queratinocitos malignos, tales como queratinocitos malignos humanos.

Los ejemplos de tumores no sólidos incluyen leucemia, mieloma múltiple y linfoma que son insensibles a citocinas, tales como IL15. Algunos ejemplos de leucemias incluyen leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia eritrocítica o leucemia monocítica. Algunos ejemplos de linfomas incluyen linfoma de Hodgkin y no hodgkiniano.

Los anticuerpos contra PD-L1 y proteínas híbridas que estimulan a las células inmunitarias desveladas en el presente documento también se usan en el tratamiento de infecciones víricas. La expresión de PD-1 en linfocitos T se correlaciona con la carga vírica en pacientes infectados por el VIH y el VHC y se ha identificado la expresión de PD-1 como un marcador para linfocitos T CD8+ específicos de virus agotados. Por ejemplo, los linfocitos T PD-1+CD8+ muestran funciones efectoras alteradas y agotamiento de linfocitos T asociados a PD-1 que pueden ser restaurados bloqueando la interacción PD-1/PD-L1. Esto produce la recuperación de la inmunidad mediada por linfocitos T CD8+ específicos de virus, que indica que la interrupción de la señalización de PD-1 usando un anticuerpo antagonista restaura las funciones efectoras de linfocitos T. La inmunoterapia basada en el bloqueo de PD-1/PD-L1 produce la degradación de la tolerancia de linfocitos T no solo a antígenos de tumor, sino que también proporciona una estrategia para reactivar linfocitos T efectores específicos de virus y erradicar patógenos en infecciones víricas crónicas. Por consiguiente, los anticuerpos y proteínas híbridas desvelados en el presente documento son útiles para tratar infecciones víricas crónicas, que incluyen, sin limitación, VHC y VIH, y virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV).

Las proteínas de fusión de la invención pueden ser administradas ventajosamente con segundos agentes a pacientes en necesidad de las mismas. Por ejemplo, la proteína de fusión de la invención se puede administrar a un sujeto con un agente antineoplásico, con un segundo inhibidor angiogénico o con un agente antiinflamatorio o un inmunosupresor.

Los agentes antineoplásicos incluyen agentes quimioterapéuticos citotóxicos, moléculas pequeñas dirigidas y moléculas biológicas, y radiación. Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos incluyen cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, irinotecán, mecloretamina (mostaza nitrogenada), estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorubicina (adriamicina), daunorubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, interferón alfa, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, taxol y combinaciones de los mismos.

Las moléculas pequeñas dirigidas y las moléculas biológicas incluyen, sin limitación, inhibidores de componentes de las vías de transducción de señales, tales como moduladores de tirosina cinasas e inhibidores de tirosina cinasas receptoras, y agentes que se unen a antígenos específicos de tumor. Los ejemplos no limitantes de receptores del factor de crecimiento implicados en la tumorigénesis son los receptores para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR), el factor de crecimiento nervioso (NGFR) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), y receptores de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico, que incluyen EGFR (erbB1), HER2 (erbB2), erbB3 y erbB4.

Los antagonistas de EGFR incluyen anticuerpos que se unen a EGFR o a un ligando de EGFR, e inhibe la unión del ligando y/o la activación de receptores. Por ejemplo, el agente puede bloquear la formación de dímeros de receptor o heterodímero con otros miembros de la familia de EGFR. Los ligandos para EGFR incluyen, por ejemplo, EGF, anfirregulina de TGF-a, EGF que se une a heparina (HB-EGF) y beta-regulina. Un antagonista de EGFR puede unirse externamente a la porción extracelular de EGFR, que puede o puede no inhibir la unión del ligando, o internamente al dominio de tirosina cinasa. Los antagonistas de EGFR incluyen además agentes que inhiben la transducción de señales dependiente de EGFR, por ejemplo, inhibiendo la función de un componente de la vía de transducción de señales de EGFR. Los ejemplos de antagonistas de EGFR que se unen a EGFR incluyen, sin limitación, moléculas biológicas, tales como anticuerpos (y equivalentes funcionales de los mismos) específicos por EGFR, y moléculas pequeñas, tales como inhibidores sintéticos de cinasas que actúan directamente sobre el dominio citoplásmico de EGFR.

Los inhibidores de molécula pequeña y biológicos incluyen inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que incluyen gefitinib, erlotinib y cetuximab, inhibidores de HER2 (por ejemplo, trastuzumab, trastuzumab emtansina (trastuzumab-DMl; T-DM1) y pertuzumab), anticuerpos anti-VEGF y fragmentos (por ejemplo, bevacizumab), anticuerpos que inhiben CD20 (por ejemplo, rituximab, ibritumomab), anticuerpos anti-VEGFR (por ejemplo, ramucirumab (IMC-1121B), IMC-1C11 y CDP791), anticuerpos anti-PDGFR e imatinib. Los inhibidores de cinasas de molécula pequeña pueden ser específicos para una tirosina cinasa particular o ser inhibidores de dos o más cinasas. Por ejemplo, el compuesto N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-7-({[(3aR,6aS)-2-metiloctahidrociclopenta[c]pirrol-5-il]metil}oxi)-6-(metiloxi)quinazolin-4-amina (también conocido como XL647, EXEL-7647 y KD-019) es un inhibidor in vitro de varias tirosina cinasas receptoras (RTK), que incluyen EGFR, EphB4, KDR (VEGFR), Flt4 (VEGFR3) y ErbB2, y también es un inhibidor de la SRC cinasa, que participa en vías que producen insensibilidad de tumores a ciertos TKI. Como se desvela en el presente documento, el tratamiento de un sujeto en necesidad puede comprender la administración de un inhibidor de rho-cinasas de la fórmula I y la administración de KD-019.

Dasatinib (BMS-354825; Bristol-Myers Squibb, New York) es otro inhibidor de Src competitivo por sitios de ATP biodisponible por vía oral. Dasatanib también se dirige a Bcr-Abl (autorizado por la FDA para su uso en pacientes con leucemia mielógena crónica (LMC) o leucemia linfoblástica aguda (LLA) positiva para el cromosoma Filadelfia (Ph+)), así como c-Kit, PDGFR, c-FMS, EphA2 y SFK. Otros dos inhibidores de tirosina cinasa oral de Src y Bcr-Abl son bosutinib (SKI-606) y saracatinib (AZD0530).

Se puede usar un anticuerpo contra PD-L1 o conjugado desvelado en el presente documento en combinación con un agente antivírico para tratar una infección vírica crónica. Por ejemplo, para el VHC, se pueden usar los siguientes agentes. Los inhibidores de la proteasa del VHC incluyen, sin limitación, boceprevir, telaprevir (VX-950), ITMN-191, SCH-900518, TMC-435, BI-201335, MK-7009, VX-500, VX-813, BMS790052, BMS650032 y VBY376. Los inhibidores de la proteína 4B no estructural del VHC (NS4B) incluyen, pero no se limitan a, clemizol, y otros inhibidores de la unión de NS4B-ARN, que incluyen, pero no se limitan a, RBI de bencimidazol (B-RBI) y RBI de indazol (I-RBI). Los inhibidores de la proteína 5A no estructural (NS5A) del VHC incluyen, pero no se limitan a, BMS-790052, A-689, A-831, EDP239, GS5885 y PP1461. Los inhibidores de la polimerasa (NS5B) del VHC incluyen, pero no se limitan a, análogos nucleosídicos (por ejemplo, valopicitabinc, R1479, R1626, R7128), análogos nucleotídicos (por ejemplo, IDX184, PSI-7851, PSI-7977) y análogos no nucleosídicos (por ejemplo, filibuvir, HCV-796, VCH-759, VCH-916, ANA598, VCH-222 (VX-222), BI-207127, MK-3281, ABT-072, ABT-333, GS9190, BMS791325). Por lo tanto, se puede usar ribavirina o un análogo de la ribavirina, tal como raribavirina (viramidina; ICN 3142), mizoribina, merimepodib (VX-497), micofenolato mofetilo y micofenolato.

Una proteína de fusión de la invención se puede administrar a un sujeto cada día, cada dos días, cada par de días, cada tres días, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, o una vez cada dos semanas. Se pueden administrar dos, tres o cuatro dosis de una proteína de fusión de la invención a un sujeto cada día, cada par de días, cada tres días, una vez a la semana o una vez cada dos semanas. Se puede administrar una dosis de una proteína de fusión de la invención durante 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, 14 días o 21 días. Una dosis de una proteína de fusión de la invención también se puede administrar durante 1 mes, 1,5 meses, 2 meses, 2,5 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más.

Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, parenteral, intradérmica, intravítrea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, transmucosa, por vía rectal, por inhalación o por vía tópica, particularmente a los oídos, la nariz, los ojos o la piel. El modo de administración se deja a criterio del médico. En la mayoría de los casos, la administración producirá la liberación de un compuesto en la circulación sanguínea. Para el tratamiento de enfermedad ocular, se prefiere la administración intravítrea de agentes biológicos.

Puede ser conveniente administrar un compuesto localmente. Esto se puede lograr, por ejemplo, y no en un modo de limitación, por infusión local, administración tópica, por inyección, por medio de un catéter o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En dichos casos, la administración se puede dirigir selectivamente a un tejido local sin liberación sustancial de un compuesto en la circulación sanguínea.

También se puede emplear administración pulmonar, por ejemplo, por uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante, o por perfusión en un tensioactivo pulmonar de fluorocarburo o sintético. Un compuesto desvelado en el presente documento se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales, tales como triglicéridos.

Un compuesto desvelado en el presente documento se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma (véanse Langer, 1990, Science 249:1527 - 1533; Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353 - 365 (1989); Lopez Berestein, arriba, pp. 317 - 327; véase, en general, arriba).

Un compuesto desvelado en el presente documento se puede administrar en un sistema de liberación controlada (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, arriba, vol. 2, pp. 115 - 138 (1984)). Se pueden usar los ejemplos de sistemas de liberación controlada tratados en la revisión por Langer, 1990, Science 249:1527 - 1533. Como se desvela en el presente documento, se puede usar una bomba (véase Langer, arriba; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574).

Como se desvela en el presente documento, se pueden usar materiales poliméricos (véanse Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véanse también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

En toda la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Los siguientes ejemplos ilustran aún más la invención, pero no se debe interpretar que limite el alcance de la invención de ningún modo.

EJEMPLOS

Reacciones de linfocitos mixtos:

Se aislaron monocitos CD14 positivo por selección negativa de sangre completa usando el kit de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep (StemCell technologies). Se generaron células dendríticas derivadas de monocitos inmaduros (mo-DC) cultivando células CD14 positivo en IMDM complementado con 10 % de FBS con 150 ng/ml de GM-CSF y 50 ng/ml de IL-4 durante 6 a 7 días. Se aislaron negativamente las células CD4 positivo de sangre completa usando el kit de enriquecimiento de CD4 humano RosetteSep (StemCell technologies). Entonces se cocultivaron las células Mo-DC y CD4 positivo de un donante diferente en una relación 1 a 10 de células mo-DC con respecto a CD4, respectivamente. Para evaluar la función de bloqueo de los anticuerpos anti-PDL1, se añadió cantidad creciente de anticuerpos anti-PDL1 al comienzo del cocultivo. En algunos casos, también se añadió cantidad creciente de IL15 al principio del cocultivo. En el día 6 o 7, los sobrenadantes se recogieron para mediciones de IL-2 e IFN^ysecretados por ELISA. Se evaluaron por citometría de flujo el número de células CD4 y la expresión del marcador de proliferación, Ki67.

Activación de CMSP:

Se aislaron CMSP de sangre completa usando Histopaque-1077 (Sigma), se cultivaron en IMDM complementado con 10 % de FBS y se activaron por cualquiera de SEB (0,1 ug/ml), PHA (1 ug/ml) o el clon anti-CD3 HiT3a (1 ug/ml, eBioscience) durante 3 a 7 días. La unión de cualquiera de los anticuerpos anti-PDL1 o proteínas de fusión anti-PDL1 -SD15 se evaluó por citometría de flujo en CMSP activadas después de 3 días. La evaluación funcional de anticuerpos anti-PDL1 se hizo mediante la adición de una cantidad creciente de anticuerpos anti-PDL1 durante la activación de CMSP con SEB. En el día 2 o 3, se recogieron los sobrenadantes para las mediciones de IL-2 e IFNy. En el caso de proteínas de fusión anti-PDL1 -SD15, las CMSP se cultivaron en presencia de cualquiera de los anticuerpos anti-PDL1 -SD15 o anti-PDL1, sin otras activaciones. En el día 6, se recogieron las células, y se evaluaron por citometría de flujo los números de CD8 y granzima B, CD8 y perforina, y células CD4.

Activación de células CD4 y CD8:

Se aislaron negativamente células CD4 y CD8 positivo de sangre completa usando kits de enriquecimiento RosetteSep (StemCell technologies). Las células CD4 se activaron por cualquiera de perlas recubiertas con anti-CD3 o anti-CD3 y PDL1 Fc en IMDM, 10 % de FBS en presencia de anticuerpos anti-PDL1. En el día 5, se recogieron los sobrenadantes para las mediciones de IFNy por ELISA, y las células se evaluaron para la expresión del marcador de proliferación Ki67 usando citometría de flujo. Las células CD8 se activaron por perlas recubiertas con anti-CD3 y cualquiera de IL15 o proteínas de fusión anti-PDL1 -SD15. En algunos casos, se usó anti-CD3 y PDL1 Fc en lugar de perlas recubiertas con anti-CD3. En el día 6 o 7, los sobrenadantes se recogieron para las mediciones de las secreciones de IFN^yy TNFa por ELISA. Las células se recogieron para las mediciones de la activación de CD8 por marcadores de granzima B y perforina usando citometría de flujo.

Nomenclatura de proteínas de fusión de anticuerpo:

En experimentos con proteínas de fusión anti-PD-L1 IL15, se identifican nombres más cortos para las proteínas de fusión en las leyendas. La proteína de fusión tcc1D7HC-SD15 se identifica en las leyendas de la figura como cD7-SD15. La proteína de fusión tcclF8HC-SD15 se identifica en las leyendas de la figura como F8-SD15.

Anticuerpos contra PD-L1 de elevada afinidad específicos de biblioteca de presentación en fagos

Se obtuvieron anticuerpos anti-PD-LI con elevada afinidad usando una biblioteca de presentación en fagos. En un procedimiento, se inmunopurificaron Fab de fago amplificados de bibliotecas Dyax sobre cualquiera de PDL1-Fc humano recombinante (proteína de fusión de ECD de PDL1 y Fc humano, Q9NZQ7) o PDL1-Fc murino (Q9EP73) que se inmovilizaron sobre inmunotubos durante tres rondas. Se secuenciaron los clones positivos por ELISA de la ronda (R2) y la ronda 3 (R3).

En un segundo procedimiento, se inmunopurificaron Fab de fago amplificados de bibliotecas Dyax sobre PDL1-Fc humano recombinante (proteína de fusión de ECD de PDL1 y Fc humano, Q9NZQ7) para la primera ronda, y luego se inmunopurificaron sobre linfocitos T activados para la segunda ronda. Para la tercera ronda, se usaron cualquiera de los linfocitos T activados o PDL1-Fc humano recombinante para la inmunopurificación. Se secuenciaron los clones que podían unirse tanto a PDL1 -Fc soluble como a PDL1 -Fc expresado en células. Las secuencias del dominio variable de V^hy V^lde estos anticuerpos se exponen en la Fig. 13 y las filas 1-26 de la Tabla 1.

Se convirtieron clones únicos en IgG para la caracterización adicional. Los dominios variables se insertaron en el vector de expresión de Dyax pBh1. Se prepararon tanto dominios CH1-CH2-CH3 naturales como CH1-CH2-CH3 mutados (L234A y L235A, también denominados en el presente documento mutantes LALA) en el formato de IgG.

Se verificó que estos anticuerpos tenían unión específica a PD-L1 por ELISA en fase sólida (Fig. 1-4) y células HEK-293 (Fig. 5). El bloqueo de las interacciones PD-1 :PD-L1 en presencia de estos anticuerpos se determinó por ELISA en fase sólida y por células 293-HEK que expresan PD-L1. Se usó Biacore para calcular la constante de afinidad para cada anticuerpo.

También se verificó la unión de estos anticuerpos en células nativas que expresan PD-L1 uniéndose a células dendríticas derivadas de monocitos inmaduros (Figura 6A), células MDA-MB-231 de la línea de cáncer de mama que expresan PD-L1 humano (Figura 6B), células B16-F10 de la línea de tumor que expresan PD-L1 de ratón (Figura 6C), así como linfocitos T CD4 y CD8 activados humanos.

Anticuerpos anti-PD-LI funcionalmente activos bloquean la interacción PD-1 PD-L1 y aumentan la proliferación y activación de linfocitos T

Se evaluaron anticuerpos anti-PD-L1 que se unen con elevada afinidad para su función para bloquear las interacciones PD-1 PD-L1 y aumentar la proliferación de linfocitos T. Se activaron in vitro linfocitos T CD4 negativamente purificados con cualquiera de perlas recubiertas con aCD3 o aCD3 y PD-L1 Fc en presencia de anticuerpos anti-PD-L1. Las células CD4 estimuladas con perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1 Fc mostraron menor proliferación y secreciones de IFNy, así como de IL-2, en comparación con las células CD4 estimuladas con perlas recubiertas con aCD3. La adición de anticuerpos anti-PD-L1 funcionalmente activos a cultivos CD4 estimulados con perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1 Fc aumenta la proliferación de CD4 (medida por cualquiera de número o porcentaje total de CD4 del marcador de proliferación Ki67) (Figura 7A) en comparación con cultivos sin anticuerpo añadido. La adición de anticuerpos anti-PD-L1 de bloqueo funcionalmente activos a cultivos de CD4 con perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1 Fc también aumenta las secreciones de citocinas por CD4 (medidas por ELISA de IFNy e IL-2 acumulados en el sobrenadante).

Cuando las CMSP aisladas de sangre completa se estimulan con el super antígeno enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) en presencia de anticuerpos bloqueantes anti-PD-L1, se observa un aumento en las secreciones de citocinas. Se recogieron los sobrenadantes de CMSP (previamente congelados) cultivados con SEB durante 48 horas, y se midieron por ELISA IFNy e IL-2. No se observaron aumentos en los números de linfocitos T, pero se observaron aumentos significativos en los niveles de IFNy e IL-2 en cultivos de varios anticuerpos anti-PD-L1 cuando se compararon con controles donde no se añadieron anticuerpos (Figura 7B).

Además, también se observa un aumento en la proliferación y la activación de CD4 en la reacción de linfocitos mixtos (MLR) de linfocitos T CD4 y mo-DC cultivados en presencia de anticuerpos bloqueantes anti-PD-L1. Varios de los anticuerpos anti-PD-L1 aumentaron la proliferación de CD4 en MLR cuando se comparó con cultivos donde no se añadió anticuerpo (Figura 7C). Estos anticuerpos también aumentaron la secreción de IFNy e IL-2 como se evaluó por ELISA.

IL15 aumenta los efectos de anticuerpos anti-PD-L1 sobre la proliferación y activación de linfocitos T in vitro

MLR de linfocitos T CD4 y mo-DC en presencia de tanto anticuerpos bloqueantes anti-PD-L1 como la citocina IL15 produjeron aumentos significativos en la proliferación de CD4 (Figura 8A), secreciones de IFNy e IL-2 cuando se comparó con cultivos de CD4 y mo-DC con anticuerpos anti-PD-L1 solos. Se añadió IL15 en concentraciones equimolares como anticuerpos anti-PD-L1 en estos ensayos. A menores concentraciones de anticuerpo anti-PD-L1 e IL15 (0,5 nM, Figura 8A), se observó algún efecto sinérgico sobre la proliferación de CD4.

CD8 negativamente purificado de sangre completa estimulada in vitro con perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1 Fc también responde a IL15 en un modo dependiente de la dosis. La adición de IL15 a cultivos de CD8 con perlas recubiertas con aCD3 y PD-L1 Fc y anticuerpos anti-PD-L1 produjo grandes aumentos en la proliferación de CD8 (Figura 8B).

La proteína de fusión anti-PD-L1-IL5 dirige IL15 a células presentadoras de antígenos que expresan PD-L1 y aumenta la proliferación y activación de células CD8 respondedoras

Se construyó la proteína de fusión de anticuerpo anti-PD-L1 e IL15 uniendo el dominio Fc del anticuerpo con el dominio sushi de IL15R y con la propia molécula de IL15. La fusión del dominio sushi de IL15Ra, el exón 3 de IRD-11, el conector e IL15 (designado "SD15") se proporciona como SEQ ID NO:261. SD15 se añadió al extremo C de la cadena pesada de IgG convencional. La proteína de fusión con el dominio sushi de IL15Ra, el exón 3 de IRD-11, el conector y IL15 se añadió al extremo C de la cadena pesada del dominio variable de tccAD7 y el dominio variable C^h1 -C^h2-C^h3 de IgG1 (SEQ ID NO:262). La construcción también incluyó una sustitución de K a S en el extremo de cadena pesada de IgG1 (1) para disminuir la posibilidad de escisión "G-K"; (2) para añadir el sitio de clonación (BamHI) al vector.

La cadena ligera es la de un anticuerpo convencional. Tanto la cadena ligera como la cadena pesada de fusión con o sin mutante LALA se insertaron en el vector pBh1 de Dyax para la expresión.

Esta molécula de fusión se designa anti-PD-L1-dominio sushi-IL15 o anti-PD-L1-SD15. También se construyó una versión diferente de la proteína de fusión donde IL15 se unió a Fc en lugar de al dominio sushi, y como esta proteína de fusión no tuvo actividad funcional de IL15, los presentes inventores usaron esta proteína como control negativo en algunos ensayos (denominada anti-PD-L1-SD15neg).

No se observó cambio significativo cuando la unión de las proteínas de fusión anti-PD-L1-SD15 se comparó con anticuerpos anti-PD-L1 en el ensayo de ELISA de unión de PD-L1 Fc en fase sólida (Figura 9A). Se observaron algunos cambios en la afinidad de unión por células CD4 activadas que expresan PD-L1 cuando se comparó la unión de proteínas anti-PD-L1-SD15 con sus anticuerpos anti-PD-L1 originales respectivos (Figura 9B). Las proteínas anti-PD-L1-SD15 tienen menor afinidad por las células que expresa PD-L1 cuando se compara con sus anticuerpos anti-PD-L1 respectivos; aunque podría haber diferencias en la unión del anticuerpo secundario con anti-PD-L1-SD15 unido frente a anti-PD-L1 unido sobre la superficie de células.

Para evaluar la función de IL15 de proteínas de fusión anti-PD-L1-SD15, se cultivaron CMSP aisladas de sangre completa en presencia de cualquiera de las proteínas de fusión anti-PD-L1-SD15 o IL15. No se añadieron otras estimulaciones a los cultivos. Las proteínas de fusión anti-PD-L1-SD15 aumentaron el número de células NK (Fig. 10A), aumentaron la proliferación de CD8 (Fig. 10B) y la activación (medida por % de CD8 positivo para granzima B, Fig. 10C) similarmente a IL15. No se observaron aumentos significativos en los números de CD4 para todos los cultivos (Fig. 10D).

Para evaluar la actividad anti-PD-L1-SD15 en CD8, estas proteínas de fusión se añadieron a cultivos de CD8 en presencia de cualquiera de perlas recubiertas con aCD3 o aCD3 y PDL1Fc. Anti-PD-L1-SD15 aumentó significativamente la proliferación de CD8 cuando PDL1 Fc estuvo presente sobre las células presentadoras de antígenos, perlas recubiertas con aCD3 y PDL1 Fc en este caso (Figura 11 A, sin PD-L1 Fc frente a la Figura 11B, con PD-L1 Fc sobre las perlas). Además, también se observó un aumento significativo de la activación de CD8. cD7-SD15 reduce la dosis eficaz necesaria para activar CD8 como se mide por el aumento en el % de células CD8 positivo para granzima B (Figura 12A) y la secreción de IFNy (Figura 12B) en aproximadamente diez veces. cD7-SD15 también aumenta el máximo nivel de activación de CD8 cuando se compara con IL15 (Figura 12A y B). Cuando se compara con la adición de anticuerpo anti-PD-L1 IL15 más libre, la proteína de fusión anti-PD-L1 -SD15 aumentó la proliferación de CD8 hasta un nivel superior a la combinación añadida por separado (Figura 12C). Estas propiedades de proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 serán beneficiosas en el establecimiento de la inmunoterapia ya que se pueden usar menores dosis de proteína de fusión anti-PD-L1 -SD15 para lograr un mayor nivel de activación y proliferación de CD8. La elevada respuesta amplificada de CD8 a la proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 en casos en los que las células presentadoras de antígenos expresan PD-L1 será ventajosa en lograr la selectiva activación de CD8.

Citotoxicidad de la proteína de fusión anti-PD-L1-IL15

Para determinar si la proteína de fusión anti-PD-L1 -SD15 aumentará la citotoxicidad de linfocitos T CD8 inducida por IL15 para células tumorales que expresan PD-L1, se cocultivaron linfocitos T CD8 con PD-L1 humano que expresa células tumorales MAD-MB-231 en presencia de proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 o anti-KLH-SD15, que no tiene actividad de unión a células tumorales que expresan PD-L1, durante 7 días antes de la medición de la muerte celular tumoral. Se cultivaron linfocitos T CD8 humanos y las células tumorales en IMDM complementado con 10 % de FBS durante 7 días. Se evaluó la actividad de destrucción de células tumorales por la medición del número de células tumorales muertas teñidas por Viability Dye eFluor 780 en FACS. La citotoxicidad de MDA-MB-231 mediada por linfocitos T CD8 estuvo potenciada significativamente por la proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 en comparación con el tratamiento con anti-KLH-SD15 en el cocultivo (Figura 15). Además, la proteína de fusión PD-L1-SD15 cD7-SD15 aumentó significativamente la tasa de supervivencia de ratones que tenían células tumorales que expresan PD-L1 en el modelo de tumor de ratones inyectados por vía intravenosa con células de tumor de colon murino CT26 en comparación con los ratones tratados con vehículo o la proteína de fusión PD-L1-SD15 sD7-SD15, que no tiene actividad de unión a PD-L1 murino (Figura 16). Estos resultados indican que el dirigir células efectoras inmunológicas estimuladas con IL15 a sitios tumorales expresados en exceso por PD-L1 por la proteína de fusión anti-PD-L1-SD15 bifuncional tiene la ventaja de potenciar la inmunidad antitumoral, mientras que se minimizan los efectos secundarios. Este tipo de proteínas de fusión bifuncionales de anticuerpo-citocina tiene potencial como novedosos terapéuticos inmunomoduladores para lograr mayor eficacia antitumoral en el control de la progresión tumoral.

Maduración por afinidad

Se produjeron variantes de la cadena pesada de tccAD7 introduciendo sustituciones de aminoácidos en tres de las posiciones de metionina en CDR-1H y cribando para afinidad mejorada. Más particularmente, se generó una biblioteca que contenía aproximadamente 1 x 108 variantes de CDRH1 de tccAD7 en la que la primera, la segunda y la cuarta posiciones de metionina variaron simultáneamente. La biblioteca se inmunopurificó en PDL1 -Fc humano recombinante (proteína de fusión de ECD de PDL1 y Fc humano, Q9NZQ7) o PDL1 -Fc murino (Q9EP73) que se inmovilizaron sobre inmunotubos durante cuatro rondas. Se secuenciaron los clones positivos por ELISA de las rondas 3 y 4. Los clones únicos se compararon por ELISA de competición. La Tabla 4 muestra las sustituciones de aminoácidos observadas en 25 variantes obtenidas del cribado, con SEQ ID NOs: para las secuencias de CDR-1H maduradas por afinidad y dominios variables de la cadena pesada que contienen las CDR. Las secuencias de aminoácidos de estas variantes también se exponen en el listado de secuencias que se indica en la Tabla 1.5*10

Se convirtieron dos variantes, tccD7_#114 y tccD7_#102 (también denominadas respectivamente en el presente documento tccD7_#1 y tccD7_#2) en IgG y también en una forma de IgG que contenía dos sustituciones de Leu-Ala en la región bisagra para ADCC reducida, como se describe en cualquier parte en el presente documento. Los anticuerpos se expresaron y purificaron para caracterización adicional. La unión mejorada a PDL1 soluble se muestra en la Fig. 17 para las dos variantes maduradas por afinidad. La Fig. 18 muestra que las dos variantes bloquearon la unión de PD1 humano a PDL1 humano (panel izquierdo) y bloquearon la unión de PD1 de ratón a PDL1 de ratón (panel derecho). Las variantes wlao mostraron mayor actividad de unión a células MDA-MB-231 en comparación con las parentales (Fig. 19).

Se probaron las variantes maduradas por afinidad para su capacidad para promover la producción de citocinas Th1 IL2 e IFNy. Se estimularon CMSP aisladas de sangre completa con el superantígeno enterotoxina B de Staphylococcus (SEB, 0,1 ug/ml) en presencia de anticuerpos anti-PD-L1. Se recogieron sobrenadantes de CMSP cultivadas con SEB durante 7 días, y se midieron IFNy e IL-2 por ELISA. Se observaron aumentos significativos en los niveles de IFNy e IL-2 en cultivos con las variantes de anticuerpos anti-PD-L1 cD7#1 y #2 cuando se compararon con cD7 (Fig. 20).

Se construyeron varias variantes de proteína de fusión que comprendían un dominio de unión de PD-L1, un dominio sushi de IL15R a e IL15. Ciertas construcciones incluyen un conector entre el dominio sushi de IL15R a y la porción de IL15. En una construcción, se sustituyeron 11 aminoácidos del exón 3 presentes en el extremo C del dominio sushi del receptor de IL15 a con conectores "GS" de diversas longitudes. Los conectores GS incluyen SGGSGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:324; 18 aminoácidos), SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO:314; 20 aminoácidos), SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:316; 25 aminoácidos), SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:318; 30 aminoácidos), SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:320; 40 aminoácidos) y SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:322; 50 aminoácidos) en construcciones que tienen SEQ ID NOS:325, 315, 317, 319, 321 y 323, respectivamente.

Las proteínas de fusión se expresaron en células HEK293, transitoriamente o establemente, y se purificaron por cromatografía en columna de proteína A según las instrucciones del fabricante. En ciertos experimentos, para estabilizar la asociación entre los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Ig de la porción anti-PD-L1 de la molécula, se delecionó la serina carboxiterminal de la cadena ligera lambda, denominada en el presente documento por la designación "ds".

Se probaron las proteínas de fusión que contenían la variante #102 madurada por afinidad de tccAD7 con el dominio sushi e IL15 (SEQ ID NO:325) para la unión a MDA-MB-231 por citometría de flujo. Todas mostraron unión mejorada en comparación con la proteína de fusión que contiene tccAD7 (Fig. 21). También se confirmó que las proteínas de fusión que contienen la variante #102 madurada por afinidad de tccAD7 tenían actividad estimulante en células de leucemia megacarioblástica humana sensible a IL15. Las células se cultivaron con proteínas de fusión anti-PD-L1-SD15 en RPMI 1640 complementado con 10 % de FBS y 20 % de medio acondicionado de células 5637 de carcinoma de vejiga humana durante 48 horas. La proliferación celular se midió como unidades relativas de luminiscencia (URL) por el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Fig. 22).

El análisis por cromatografía de exclusión por tamaño mostró menos del 5 % de agregación (Fig. 24) y mejoró la estabilidad en suero de la proteína de fusión expresada (Fig. 25).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende:

(b) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 241, una CDR-2H que comprende SEq ID NO: 243 y una CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245; y una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249; o

(c) una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 266, una CDR-2H que comprende SEq ID NO: 243 y una CDR-3h que comprende SEQ ID NO: 245; y una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249;

y en donde el anticuerpo se une a PD-L1 y bloquea su interacción con PD-1,

(ii) un segundo dominio que se une al receptor de IL-15 ("IL-15R"), en donde el segundo dominio comprende IL-15 o un fragmento de unión a IL-15R del mismo, y

(iii) un dominio sushi del receptor de IL-15 alfa.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende además un conector flexible que une el dominio sushi del IL-15R alfa con IL-15 o un fragmento de unión de IL-15R, opcionalmente en donde el conector flexible comprende 15-20 aminoácidos que son predominantemente serina y glicina.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en donde la proteína de fusión comprende SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:323 o SEQ ID NO: 261.

4. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo contra PD-L1 comprende una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:121; una CDR-2H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:123; una CDR-3H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:125; una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:127; una CDR-2L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:128; y una CDR-3L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:129.

5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntico a SEQ ID NO:126 y/o un dominio variable de la cadena ligera que es al menos 95 % idéntico a SEQ ID NO:130.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:126 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO:130.

7. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo contra PD-L1 comprende una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249; y una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 241, una CDR-2H que comprende SEQ ID NO: 243 y una CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245.

8. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo contra PD-L1 comprende una CDR-1L de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:247, una CDR-2L que comprende SEQ ID NO:248 y una CDR-3L que comprende SEQ ID NO:249; y una CDR-1H de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 266, una CDR-2H que comprende SEQ ID NO: 243 y una CDR-3H que comprende SEQ ID NO: 245.

9. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que es al menos 85 % idéntico a SEQ ID NO:246 y/o un dominio variable de la cadena ligera que es al menos 85 % idéntico a SEQ ID NO:250.

10. La proteína de fusión de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo contra PD-L1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:246 o SEQ ID NO:267 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO:250.

11. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 o 6 a 10, en donde la proteína de fusión comprende SEQ ID NO: 261.

12. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de cáncer.

13. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-11.