ES2900823T3 - Composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico - Google Patents

Composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico que comprende un conjugado de fármaco de péptido insulinotrópico preparado mediante la unión covalente de un péptido insulinotrópico y una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico como ingrediente activo, en donde el péptido insulinotrópico se selecciona del grupo que consiste en exendina-4, un derivado de exendina-4 preparado mediante la deleción del grupo amino N-terminal de la exendina-4, un derivado de exendina-4 preparado mediante la sustitución del grupo amino N-terminal de la exendina-4 por un grupo hidroxilo, un derivado de exendina-4 preparado mediante la modificación del grupo amino N-terminal de la exendina-4 con un grupo dimetilo, y un derivado de exendina-4 preparado mediante la deleción del carbono alfa del residuo de histidina N-terminal de la exendina-4 y el grupo amino N-terminal unido al carbono alfa, y el polímero no peptidílico se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol-propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter poliviniletílico, polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos, en donde el polímero no peptidílico está unido a un residuo de lisina en la posición 27 del péptido insulinotrópico; y en donde la enfermedad del hígado graso no alcohólico se selecciona del grupo que consiste en esteatosis simple, enfermedades del hígado graso provocadas por inanición, fibrosis hepática y cirrosis hepática.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico [Campo técnico]
La presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que incluye un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada que puede usarse para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico. En particular, la presente descripción se refiere a un conjugado de péptido insulinotrópico en el que un péptido insulinotrópico, un polímero no peptidílico y una región Fc de inmunoglobulina se unen covalentemente entre sí para aumentar notablemente la semivida en sangre, para prevenir eficazmente la acumulación de triglicéridos, y el uso del mismo en la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico.
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos.
[Antecedentes]
La enfermedad del hígado graso no alcohólico se refiere a un amplio espectro de enfermedades que van desde la esteatosis simple, que no se acompaña de una respuesta inflamatoria en un paciente sin consumo excesivo de alcohol, hasta la fibrosis hepática y la cirrosis hepática, que son el resultado de la progresión de la esteatosis simple y muestran inflamación hepatocelular.
La enfermedad del hígado graso no alcohólico puede clasificarse en enfermedades del hígado graso no alcohólico primarias y secundarias en dependencia de la causa patológica. La primaria es provocada por hiperlipidemia, diabetes, obesidad o similares, que es una característica del síndrome metabólico. La secundaria es un resultado de causas nutricionales (pérdida súbita de peso corporal, inanición, cirugía de derivación intestinal), diversos fármacos, sustancias tóxicas (hongos venenosos, toxinas bacterianas), causas metabólicas y otros factores.
Se conoce que la incidencia de la enfermedad del hígado graso no alcohólico primaria en la que la diabetes y la obesidad, que son características importantes del síndrome metabólico, son un factor primario, está en aproximadamente el 50 % de los pacientes diabéticos, aproximadamente el 76 % de los pacientes con obesidad y la mayoría de los pacientes diabéticos obesos (Gupte P y otros, 2004). Además, cuando se realiza una biopsia de hígado en pacientes diabéticos y obesos con un nivel elevado de alanina aminotransferasa (ALT), la incidencia de la esteatohepatitis está en el intervalo de 18 a 36 % (Braillon A y otros, 1985).
Actualmente, no existe un método establecido para determinar la causa de la enfermedad del hígado graso no alcohólico. Esto se debe a que la incidencia de la enfermedad del hígado graso no alcohólico se asocia con una variedad de factores tales como la diabetes, la obesidad, las enfermedades de las arterias coronarias y los hábitos de vida. Existen algunos informes sobre los efectos de los fármacos contra la diabetes o la obesidad sobre la enfermedad del hígado graso. El orlistat, que se usa como un fármaco oral contra la obesidad, mostró mejoras histológicas del hígado en pacientes con esteatohepatitis (Hussein y otros, 2007), y la metformina mostró disminuciones en los niveles en sangre de enzimas hepáticas e inflamación y fibrosis necrótica hepática en pacientes con enfermedad del hígado graso no alcohólico sin manifestación de diabetes (Bugianesi y otros, 2005). Además, los fármacos de la clase de la tiazolidindiona (TZD), que son agonistas de PPAR (receptor activado por proliferador de peroxisomas), inhiben la acumulación de grasa en el hígado y los músculos, y muestran acciones antifibróticas directas sobre el hígado en modelos animales de enfermedades del hígado graso no alcohólico (Galli A y otros, 2002).
Mientras tanto, el péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) es un péptido endógeno presente en el cuerpo y es una hormona secretada por las células L intestinales en respuesta a la estimulación por los nutrientes o el nivel de glucosa en sangre en el intestino. El GLP-1 tiene una variedad de actividades fisiológicas, lo que incluye la regulación del nivel de glucosa en sangre mediante la estimulación de la secreción de insulina, la proliferación de células p pancreáticas, la inhibición de la motilidad del tracto gastrointestinal superior y la inhibición del apetito. Recientemente, se encontró expresión del receptor de GLP-1 en hepatocitos y el GLP-1 muestra buenos efectos en el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico mediante la activación de la quinasa-1 dependiente de fosfoinositida (PDK-1) y la proteína quinasa C-Z (PKC -Z) que son proteínas principales en la vía de señalización de la insulina a través del receptor GLP-1 de los hepatocitos (Gupta NA y otros, 2010). El GLP-1 también funciona para reducir la acumulación de ácidos grasos o proteger a los hepatocitos de la muerte provocada por el estrés del retículo endoplásmico mediante la activación tanto de la autofagia mediada por chaperona (CMA) como de la macroautofagia (Sharma S y otros, 2011). Un estudio reciente informó que el GLP-1 promueve la oxidación de lípidos hepáticos para prevenir la acumulación de grasa hepática y promueve las acciones de la insulina (Svegliati-Baroni G y otros, 2011). Estos numerosos informes sugieren que el derivado de GLP-1 puede ser un candidato importante para el desarrollo de un agente profiláctico y terapéutico para la enfermedad del hígado graso no alcohólico.
Sin embargo, el principal obstáculo para el uso de GLP-1 como agente terapéutico para el hígado graso no alcohólico es su corta semivida en sangre (semivida máxima: 2 minutos). Se atribuye a la pérdida de los títulos de GLP-1 mediante la escisión entre el 8vo aminoácido (Ala) y el 9no aminoácido (Asp) por una dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) en el cuerpo. Por lo tanto, se han realizado diversas investigaciones sobre un análogo de GLP-1 que tiene resistencia a la DPP IV y se han realizado ensayos para la sustitución de Ala8 por Gly (Deacon y otros, 1998; Burcelin y otros, 1999), o por Leu o D-Ala (Xiao y otros, 2001), lo que aumenta de esta manera la resistencia a la DPP IV, mientras se mantiene la actividad. El aminoácido N-terminal His7 de GLP-1 es fundamental para la actividad de GLP-1 y sirve como un objetivo de la DPP IV. En consecuencia, la patente de los Estados Unidos núm. 5,545,618 describe que el extremo N se modifica con un grupo alquilo o acilo, y Gallwitz y otros describen que la 7ma His se sometió a N-metilación o alfa-metilación, o que la His completa se sustituye por imidazol para incrementar la resistencia a la DPP IV y mantener la actividad fisiológica.
Además de estas modificaciones, una exendina-4, que es un análogo de GLP-1 purificado a partir de la glándula salival de un monstruo de gila (patente de los Estados Unidos núm. 5,424,686), tiene resistencia a la DPP IV y mayor actividad fisiológica que GLP-1. Como resultado, tuvo una semivida in vivo de 2 a 4 horas, un período de tiempo más largo que el de GLP-1. Sin embargo, con solo el método de incrementar la resistencia a la DPP IV, la actividad fisiológica no se mantiene suficientemente y, por ejemplo, en el caso de una exendina-4 (exenatida) disponible comercialmente, debe inyectarse en un paciente dos veces al día. Esta frecuencia es todavía difícil para los pacientes. El péptido preparado para mejorar el problema es la exendina-4 que es resistente a la DPP IV, que tiene una semivida en sangre de 2 a 4 horas. Aunque su semivida en sangre es más larga que la de GLP-1, también debe inyectarse cada día.
El documento US 2010/0330108 A1 describe una composición para tratar enfermedades relacionadas con la obesidad que comprende un conjugado de péptido insulinotrópico, más particularmente, una composición para tratar enfermedades relacionadas con la obesidad que comprende un conjugado preparado mediante la unión covalente del péptido insulinotrópico con una sustancia portadora a través de un enlazador no peptidílico, y un método para tratar enfermedades relacionadas con la obesidad mediante el uso del mismo.
Xiaokun Ding y otros, Hepatology, vol. 43, núm. 1, 1 de enero de 2006, páginas 173-181, describe el tratamiento de la esteatosis hepática en ratones ob/ob mediante el uso de la exendina-4. Se trataron ratones ob/ob, o sus compañeros de camada magros, con exendina-4 [10 pg/kg o 20 pg/kg] durante 60 días. Los ratones ob/ob mantuvieron una reducción en el peso neto ganado durante el tratamiento con exendina-4. La glucosa sérica y la esteatosis hepática se redujeron significativamente en ratones ob/ob tratados con exendina-4. La exendina-4 mejoró la sensibilidad a la insulina en ratones ob/ob, según lo calculado mediante la evaluación del modelo de homeostasis. La medición de sustancias reactivas tiobarbitúricas como marcador de estrés oxidativo se redujo significativamente en ratones ob/ob tratados con exendina-4. Finalmente, los hepatocitos tratados con GLP-1 dieron como resultado un incremento significativo en la producción de AMPc así como también una reducción en la expresión del ARNm de la estearoil-CoA desaturasa 1 y de genes asociados con la síntesis de ácidos grasos; sucedió lo contrario para los genes asociados con la oxidación de ácidos grasos.
Jinmi Lee y otros, PLoS ONE, vol. 7, núm. 2, 17 de febrero de 2012 (2012-02-17), página e31394, analiza si los efectos beneficiosos del tratamiento con exendina-4 sobre el hígado graso están mediados a través de Sirt1 en ratones C578L/6J obesos inducidos por una dieta alta en grasas (HF) y modelos de cultivo celular relacionados. El tratamiento con exendina-4 disminuyó el peso corporal y los niveles de ácidos grasos (FA) y triglicéridos libres en suero en ratones C578U6J obesos inducidos por HF. El análisis histológico mostró que la exendina-4 revirtió la acumulación hepática de lípidos inducida por HF y la inflamación. El tratamiento con exendina-4 incrementó la expresión de ARNm y proteínas de Sirt1 y su factor aguas abajo, AMPK, in vivo y también indujo los genes asociados con la oxidación de FA y el metabolismo de la glucosa. Además, se observó un incremento significativo en la expresión hepática de ARNm de Lkb1 y Nampt en los grupos tratados con exendina-4. También se observó un incremento de la expresión de fosfo-Foxol y GLUT2, que están implicados en el metabolismo hepático de la glucosa. En células HepG2 y Huh7, las expresiones de ARNm y proteínas de GLP-1 R se incrementaron mediante el tratamiento con exendina-4 de una manera dependiente de la dosis. La exendina-4 potenció la expresión de proteínas de Slrt1 y fosfo-AMPKa en células HepG2 tratadas con ácido palmítico 0,4 mM. También se encontró que Sirt1 era un regulador aguas arriba de AMPK en los hepatocitos. Un hallazgo de este estudio fue la observación de que la expresión de GLP-1 R es proporcional a la concentración de exendina-4 y que la exendina-4 podría atenuar el hígado graso mediante la activación de Sirt1.
El documento US 2010/0105877 A1 describe un conjugado de péptido insulinotrópico que tiene una duración alterada de la eficacia y la estabilidad in vivo, que comprende un péptido insulinotrópico, un polímero no peptídico y una región Fc de inmunoglobulina, que están unidos covalentemente entre sí, y un uso de los mismos. El conjugado de péptido insulinotrópico tiene una actividad in vivo que se mantiene relativamente alta y tiene una semivida en sangre incrementada.
[Descripción]
[Problema Técnico]
En consecuencia, los presentes autores usaron un método para unir de manera específica de sitio una región Fc de inmunoglobulina, un polímero no peptidílico y un péptido insulinotrópico mediante un enlace covalente para maximizar los efectos de incrementar la semivida en sangre del péptido insulinotrópico y mantener la actividad in vivo. Como resultado, los presentes autores encontraron que el método incrementó notablemente la semivida en sangre del conjugado peptídico y proporcionó una semivida en sangre mucho más larga que el método de fusión en marco conocido. Los presentes autores también encontraron que el conjugado preparado mediante unión específica de sitio de la Fc de inmunoglobulina a un grupo amino o un grupo tiol presente en un residuo de aminoácido distinto al extremo N del péptido insulinotrópico mantiene títulos más altos que un conjugado preparado mediante el enlace en el extremo N del péptido insulinotrópico. En consecuencia, se confirmó que el conjugado muestra excelentes efectos terapéuticos sobre la enfermedad del hígado graso no alcohólico aunque se administra con menos frecuencia que las formulaciones de exendina-4 conocidas, lo que completa de esta manera la presente descripción.
[Solución técnica]
Un objeto de la presente descripción es proporcionar un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada que mantiene una semivida in vivo prolongada y previene eficazmente la acumulación de triglicéridos y, por tanto, es útil para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico.
[Efectos ventajosos]
El conjugado de péptido insulinotrópico, de acuerdo con la presente descripción, mantiene la actividad in vivo del péptido a un nivel relativamente alto, tiene una semivida en sangre notablemente incrementada y activa eficazmente las principales proteínas implicadas en la lipólisis para prevenir la acumulación de triglicéridos, lo que resulta de esta manera útil para la prevención y el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico.
[Descripción de los dibujos]
La FIGURA 1 muestra imágenes del tejido hepático de ratón ob/ob que se administró con el conjugado de exendina-4 de acción prolongada de acuerdo con una modalidad de la presente descripción (tinción de hematoxilina y eosina, tinción de H-E, área teñida de púrpura: tejido hepático normal, área teñida de blanco: gota de lípido); y
La FIGURA 2 muestra un gráfico de la acumulación de triglicéridos intrahepáticos en ratones obesos inducidos por dieta alta en grasas que se administraron con el conjugado deexendina-4 de acción prolongada de acuerdo con una modalidad de la presente descripción (#: un incremento significativo al 99 % de confianza, en comparación con un grupo con dieta normal (p<0,01), *: una disminución significativa al 99 % de confianza, en comparación con un grupo de dieta alta en grasas (p<0,01)).
[Mejor modo]
En un aspecto, para lograr los objetos anteriores, una modalidad de la descripción se refiere a una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico que incluye un conjugado de fármaco de péptido insulinotrópico, que se prepara mediante la unión covalente de un péptido insulinotrópico y una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico, como ingrediente activo. En la composición farmacéutica de la presente descripción, el péptido insulinotrópico se selecciona del grupo que consiste en exendina-4, un derivado de exendina-4 preparado mediante la deleción del grupo amino N-terminal de la exendina-4, un derivado de exendina-4 preparado mediante la sustitución del grupo amino N-terminal de la exendina-4 por un grupo hidroxilo, un derivado de exendina-4 preparado mediante la modificación del grupo amino N-terminal de la exendina-4 con un grupo dimetilo y un derivado de exendina-4 preparado mediante la deleción del carbono alfa del residuo de histidina N-terminal de la exendina-4 y el grupo amino N-terminal unido al carbono alfa. El polímero no peptidílico se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol-propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter poliviniletílico, polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos.
El péptido insulinotrópico de la presente descripción es un péptido que posee una función insulinotrópica para promover la síntesis y la expresión de insulina en una célula beta pancreática. Estos péptidos incluyen precursores, derivados, fragmentos, variantes o similares, y preferentemente, GLP (péptido similar al glucagón)-1, exendina-3, exendina-4 o similares.
El GLP-1 es una hormona secretada por el intestino delgado. En general, promueve la biosíntesis y secreción de insulina, inhibe la secreción de glucagón y promueve la absorción de glucosa en las células. En el intestino delgado, un precursor del glucagón se descompone en tres péptidos, es decir, glucagón, GLP-1 y GLP-2. Aquí, el GLP-1 significa GLP-1 (1-37), que originalmente está en la forma que no tiene función insulinotrópica. Pero después se procesa y se convierte en la forma activada GLP-1 (7-37). La secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-37) es la siguiente:
GLP-1(7-37)
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EPIAW LVKGR G
El derivado de GLP-1 significa un péptido que muestra una homología de secuencia de aminoácidos de al menos 80 % con la de GLP-1, puede estar en la forma químicamente modificada y muestra una función insulinotrópica al menos equivalente o mayor que la de GLP-1.
El fragmento de GLP-1 significa la forma en la que uno o más aminoácidos se añaden o eliminan en el extremo N o el extremo C del GLP-1 nativo, y el aminoácido añadido es posiblemente un aminoácido que no es de origen natural (por ejemplo, aminoácido de tipo D).
La variante de GLP-1 significa un péptido que posee una función insulinotrópica que tiene una o más secuencias de aminoácidos diferentes de las del GLP-1 nativo.
La exendina-3 y la exendina-4 son péptidos insulinotrópicos que consisten en 39 aminoácidos que tienen una homología de secuencia de aminoácidos del 53 % con GLP-1. Las secuencias de aminoácidos de la exendina-3 y la exendina-4 son las siguientes:
Exendina-3
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
Exendina-4
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
El derivado de exendina significa un péptido que tiene al menos 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con la exendina nativa, que puede tener algunos grupos en el residuo de aminoácido sustituidos químicamente, y muestra una función insulinotrópica al menos equivalente o mayor que la de la exendina nativa.
El fragmento de exendina significa un fragmento que tiene uno o más aminoácidos añadidos o eliminados en el extremo N o el extremo C de la exendina nativa, y el aminoácido añadido es posiblemente un aminoácido que no es de origen natural (por ejemplo, aminoácido de tipo D).
La variante de exendina significa un péptido que posee una función insulinotrópica que tiene una o más secuencias de aminoácidos diferentes de las de la exendina nativa.
En una modalidad específica, el péptido insulinotrópico nativo usado en la presente descripción y el péptido insulinotrópico modificado pueden sintetizarse mediante el uso de un método de síntesis en fase sólida y la mayoría de los péptidos nativos, lo que incluye el péptido insulinotrópico nativo, pueden producirse mediante una tecnología de recombinación.
Además, el péptido insulinotrópico usado en la presente descripción puede unirse al polímero no peptidílico en diversos sitios.
El conjugado preparado en la presente descripción puede tener una actividad que varía en dependencia de los sitios de unión del péptido insulinotrópico.
Por ejemplo, puede acoplarse con el extremo N y con otro extremo, lo que incluye el extremo C, respectivamente, lo que indica una diferencia en la actividad in vitro. El grupo aldehído reactivo se une selectivamente al extremo N a un pH bajo y puede unirse a un residuo de lisina para formar un enlace covalente a un pH alto, por ejemplo, pH 9,0. Se permite que se produzca una reacción de pegilación con pH variable y después puede usarse una columna de intercambio iónico para separar un isómero posicional de la mezcla de reacción.
Si el péptido insulinotrópico va a acoplarse en un sitio distinto al extremo N, que es un sitio importante para la actividad in vivo, puede introducirse un grupo tiol reactivo en el sitio del residuo de aminoácido a modificar en la secuencia de aminoácidos nativa para formar un enlace covalente mediante el uso de un enlazador de maleimida en el polímero no peptidílico.
Si el péptido insulinotrópico va a acoplarse en un sitio distinto al extremo N, que es un sitio importante para la actividad in vivo, puede introducirse un grupo amino reactivo en el sitio del residuo de aminoácido a modificar en la secuencia de aminoácidos nativa para formar un enlace covalente mediante el uso de un enlazador de aldehído en el polímero no peptidílico.
Cuando se usa el enlazador de aldehido en el polímero no peptidílico, se hace reaccionar con un grupo amino en el extremo N y el residuo de lisina, y puede usarse una forma modificada del péptido insulinotrópico para incrementar selectivamente el rendimiento de la reacción. Por ejemplo, solo un grupo amino a hacerse reaccionar puede retenerse en un sitio deseado, mediante el uso de un método de bloqueo del extremo N, un método de sustitución de residuo de lisina, un método para introducir un grupo amino en un extremo carboxilo, o similares, lo que aumenta de esta manera el rendimiento de las reacciones de pegilación y acoplamiento. Los métodos para proteger el extremo N incluyen dimetilación, así como también metilación, desaminación, acetilación, etc., pero no se limitan a dichos métodos de alquilación.
En una modalidad preferida de la descripción, el conjugado de péptido insulinotrópico de la presente descripción es un conjugado de péptido insulinotrópico en el que una región Fc de inmunoglobulina se une específicamente a un grupo amino distinto de los del extremo N del péptido insulinotrópico.
En una modalidad específica, los presentes autores indujeron una pegilación de una exendina-4 nativa a pH 9,0 para acoplar selectivamente el PEG al residuo de lisina del péptido insulinotrópico. Alternativamente, los derivados de exendina-4 que tienen el extremo N eliminado o protegido pueden sintetizarse para acoplarse. La pegilación en el extremo N puede bloquearse mediante la deleción del grupo alfa amino de la histidina N-terminal o mediante la modificación de la histidina N-terminal con dos grupos metilo. Dicha modificación N-terminal no influye en la actividad in vitro (Tabla 1).
A diferencia del acoplamiento N-terminal de la exendina-4, el acoplamiento en el residuo de lisina mantuvo la actividad in vitro en aproximadamente un 6 % (Tabla 1). Además, el conjugado de exendina-4-PEG-Fc de inmunoglobulina preparado en la presente descripción mostró una semivida en sangre notablemente aumentada de 60 ~70 horas, lo que indica una duración de la eficacia inesperadamente alta. Por lo tanto, la reducción del título también se minimizó mediante el acoplamiento al residuo de lisina que no afecta a la actividad, y por tanto podría prepararse una nueva formulación de exendina-4 de acción prolongada capaz de mantener su actividad in vivo.
La región Fc de inmunoglobulina es segura para su uso como portadora de un fármaco debido a que es un polipéptido biodegradable que se metaboliza in vivo. Además, la región Fc de inmunoglobulina tiene un peso molecular relativamente bajo en comparación con las moléculas de inmunoglobulina completas y, por tanto, es ventajosa para la preparación, purificación y rendimiento del conjugado. Dado que la región Fc de inmunoglobulina no contiene un fragmento Fab cuya secuencia de aminoácidos difiere de acuerdo con las subclases de anticuerpos y que, por tanto, es altamente no homogénea, puede esperarse que la región Fc de inmunoglobulina pueda incrementar en gran medida la homogeneidad de las sustancias y ser menos antigénica.
El término "región Fc de inmunoglobulina" como se usa en la presente descripción, se refiere a la región constante de la cadena pesada 2 (Ch2) y la región constante de la cadena pesada 3 (Ch3) y excluye las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, la región constante de la cadena pesada 1 (Ch1) y la región constante de la cadena ligera 1 (Cl1) de la inmunoglobulina. Puede incluir además una región bisagra en la región constante de la cadena pesada. Además, la región Fc de inmunoglobulina de la presente descripción puede contener una parte o la totalidad de la región Fc, lo que incluye la región constante de la cadena pesada 1 (Ch1) y/o la región constante de la cadena ligera 1 (Cl1), excepto para las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, siempre que tenga efectos sustancialmente similares o mejores que la proteína nativa. Además, la región Fc de inmunoglobulina puede ser un fragmento que tiene una deleción en una porción relativamente larga de la secuencia de aminoácidos de Ch2 y/o Ch3. Es decir, la región Fc de inmunoglobulina de la presente descripción puede incluir 1) un dominio Ch1, un dominio Ch2, un dominio Ch3 y un dominio Ch4, 2) un dominio Ch1 y un dominio Ch2, 3) un dominio Ch1 y un dominio Ch3, 4) un dominio Ch2 y un dominio Ch3, 5) una combinación de uno o más dominios y una región bisagra de inmunoglobulina (o una porción de la región bisagra) y 6) un dímero de cada dominio de las regiones constantes de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera.
La región Fc de inmunoglobulina de la presente descripción incluye una secuencia de aminoácidos nativa y un derivado de secuencia (mutante) de la misma. Un derivado de la secuencia de aminoácidos es una secuencia que es diferente de la secuencia de aminoácidos nativa debido a una deleción, una inserción, una sustitución conservadora o no conservadora o combinaciones de las mismas de uno o más de los residuos de aminoácidos. Por ejemplo, en una Fc de IgG, los residuos de aminoácidos que se conoce son importantes en la unión en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 o 327 a 331, pueden usarse como un objetivo adecuado para la modificación. Además, son posibles otros diversos derivados, que incluyen uno en el que se elimina una región capaz de formar un enlace disulfuro, o se eliminan determinados residuos de aminoácidos en el extremo N de una forma de Fc nativa o se le añade un residuo de metionina. Además, para eliminar las funciones efectoras, puede producirse una deleción en un sitio de unión al complemento, tal como un sitio de unión a C1q y un sitio de ADCC. Las técnicas para preparar dichos derivados de secuencia de la región Fc de inmunoglobulina se describen en las publicaciones de patente internacional núms. WO 97/34631 y WO 96/32478.
Los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, que no alteran generalmente la actividad de las moléculas, se conocen en la técnica (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, Nueva York, 1979). Los intercambios que se producen más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, en ambas direcciones. La región Fc, si se desea, puede modificarse mediante fosforilación, sulfatación, acrilación, glicosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación y similares.
Los derivados de Fc mencionados anteriormente son derivados que tienen una actividad biológica idéntica a la región Fc de la presente descripción o una estabilidad estructural mejorada frente al calor, pH o similares.
Además, estas regiones Fc pueden obtenerse a partir de formas nativas aisladas de seres humanos y otros animales, lo que incluye vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas, o pueden ser recombinantes o derivadas de las mismas, obtenidas a partir de células de animales o microorganismos transformados. En la presente descripción, pueden obtenerse a partir de una inmunoglobulina nativa mediante el aislamiento de inmunoglobulinas completas de organismos humanos o animales y su tratamiento con una enzima proteolítica. La papaína digiere la inmunoglobulina nativa en las regiones Fab y Fc, y el tratamiento con pepsina da como resultado la producción de fragmentos pF'c y F(ab)2. Estos fragmentos pueden someterse a cromatografía de exclusión por tamaño para aislar Fc o pF'c.
Preferentemente, una región Fc derivada de humano es una región Fc de inmunoglobulina recombinante que se obtiene a partir de un microorganismo.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede estar en forma de cadenas de azúcar nativas, cadenas de azúcar aumentadas en comparación con una forma nativa, o cadenas de azúcar disminuidas en comparación con la forma nativa, o puede estar en una forma desglicosilada. El aumento, la disminución o la eliminación de las cadenas de azúcar de la Fc de inmunoglobulina puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como un método químico, un método enzimático y un método de ingeniería genética mediante el uso de un microorganismo. La eliminación de las cadenas de azúcar de una región Fc da como resultado una fuerte disminución de la afinidad de unión al complemento (clq) y una disminución o pérdida de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o la citotoxicidad dependiente del complemento, de manera que no induce respuestas inmunitarias innecesarias in vivo. A este respecto, una región Fc de inmunoglobulina en una forma desglicosilada o aglicosilada puede ser más adecuada para el objeto de la presente descripción como un portador de fármaco.
Como se usa en la presente descripción, el término "desglicosilación" se refiere a la eliminación enzimática de restos de azúcar de una región Fc y el término "aglicosilación" significa que una región Fc se produce en una forma no glicosilada por un procariota, preferentemente, E. coli.
Si bien la región Fc de inmunoglobulina puede derivarse, preferentemente, de seres humanos, también puede derivarse de otros animales, lo que incluye vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas. Además, la región Fc de inmunoglobulina puede ser una región Fc que se deriva de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, o que se obtiene mediante combinaciones de las mismas o híbridos de las mismas. Preferentemente, se deriva de IgG o IgM, que se encuentran entre las proteínas más abundantes en la sangre humana, y con la máxima preferencia, se derivan de IgG, que se conoce que potencia las semividas de las proteínas de unión a ligando.
Por otra parte, el término "combinación", como se usa en la presente descripción, significa que los polipéptidos que codifican regiones Fc de inmunoglobulina monocatenarias del mismo origen se unen a un polipéptido monocatenario de un origen diferente para formar un dímero o multímero. Es decir, puede formarse un dímero o multímero a partir de dos o más fragmentos seleccionados del grupo que consiste en los fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD y Fc de IgE.
Como se usa en la presente descripción, el término "híbrido" significa que las secuencias que codifican dos o más regiones Fc de inmunoglobulina de diferente origen están presentes en una región Fc de inmunoglobulina monocatenaria. En la presente descripción, son posibles diversos tipos de híbridos. Es decir, los híbridos de dominio pueden estar compuestos por uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE y Fc de IgD, y pueden incluir la región bisagra.
Por otro lado, la IgG puede dividirse en subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y la presente descripción puede incluir combinaciones e híbridos de las mismas. Se prefieren las subclases IgG2 e IgG4, y se prefiere más la región Fc de IgG4 que rara vez tiene funciones efectoras tales como CDC (citotoxicidad dependiente del complemento).
Es decir, como portadora de fármaco de la presente descripción, la región Fc de inmunoglobulina que más se prefiere es una región Fc no glicosilada derivada de IgG4 humana. La región Fc derivada de humano se prefiere más que una región Fc no derivada de humano, ya que puede actuar como un antígeno en el cuerpo humano y provocar respuestas inmunitarias no deseadas, tales como la producción de un nuevo anticuerpo contra el antígeno.
El término "polímero no peptidílico", como se usa en la presente descripción, se refiere a un polímero biocompatible que incluye dos o más unidades repetitivas unidas entre sí mediante cualquier enlace covalente, lo que excluye un enlace peptídico.
El polímero no peptidílico que puede usarse en la presente descripción puede seleccionarse del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter poliviniletílico, polímeros biodegradables tales como PLA (ácido poliláctico) y PLGA (ácido poliláctico-glicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos, de los cuales el preferido es el polietilenglicol. Además, se incluyen en el alcance de la presente descripción derivados de los mismos que se conocen bien en la técnica y que se preparan fácilmente por los expertos en la técnica.
El enlazador peptídico que se usa en la proteína de fusión obtenida mediante un método convencional de fusión en marco tiene inconvenientes en el sentido de que es fácilmente escindido in vivo por una enzima proteolítica y, por tanto, no puede obtenerse como se esperaba un efecto suficiente de aumento de la semivida en sangre del fármaco activo mediante un portador. Sin embargo, en la presente descripción, un polímero que tiene resistencia a la enzima proteolítica puede usarse para mantener que la semivida en sangre del péptido sea similar a la del portador. Por lo tanto, cualquier polímero no peptidílico a usar en la presente descripción puede usarse sin ninguna limitación, siempre que sea un polímero que tenga la función mencionada anteriormente, es decir, un polímero que tenga resistencia a la enzima proteolítica in vivo. El polímero no peptidílico tiene, preferentemente, un peso molecular en el intervalo de 1 a 100 kDa, y preferentemente, de 1 a 20 kDa. Además, el polímero no peptidílico de la presente descripción, unido a la región Fc de inmunoglobulina, puede ser un polímero o una combinación de diferentes tipos de polímeros.
El polímero no peptidílico usado en la presente descripción tiene un grupo reactivo capaz de unirse a la región Fc de inmunoglobulina y al fármaco proteico.
El polímero no peptidílico tiene un grupo reactivo en ambos extremos, que se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un grupo aldehído reactivo, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida. El derivado de succinimida puede ser propionato de succinimidilo, hidroxi succinimidilo, succinimidil carboximetilo o carbonato de succinimidilo. En particular, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo en ambos extremos, es eficaz para unirse en ambos extremos con un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina con reacciones no específicas mínimas. Un producto final generado mediante alquilación reductora a través de un enlace aldehído es mucho más estable que cuando está unido mediante un enlace amida. El grupo reactivo aldehído se une selectivamente al extremo N a un pH bajo, y puede unirse a un residuo de lisina para formar un enlace covalente a un pH alto, por ejemplo, a pH 9,0.
Los grupos reactivos en ambos extremos del polímero no peptidílico pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, el polímero no peptidílico puede poseer un grupo maleimida en un extremo y en el otro extremo puede poseer un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído. Cuando se usa un polietilenglicol que tiene un grupo hidroxi reactivo en ambos extremos del mismo como el polímero no peptidílico, el grupo hidroxi puede activarse a diversos grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas, o un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo modificado disponible comercialmente puede usarse para preparar el conjugado de péptido insulinotrópico de la presente descripción.
En otra modalidad, la presente descripción proporciona un método para preparar un conjugado de péptido insulinotrópico que incluye las etapas de:
(1) unir covalentemente un polímero no peptidílico que tiene un grupo reactivo de aldehído, maleimida o derivado de succinimida en ambos extremos del mismo, con un grupo amino o grupo tiol de un péptido insulinotrópico; (2) aislar un conjugado que incluye el péptido insulinotrópico de la mezcla de reacción de (1), en el que el polímero no peptidílico está unido covalentemente a un sitio distinto del extremo amino; y
(3) unir covalentemente una región Fc de inmunoglobulina al otro extremo del polímero no peptidílico del conjugado aislado para producir un conjugado de péptido que tiene la región Fc de inmunoglobulina y el péptido insulinotrópico, que están unidos a cada extremo del polímero no peptidílico.
El término "conjugado", como se usa en la presente descripción, se refiere a un intermediario preparado mediante la unión covalente del polímero no peptidílico con el péptido insulinotrópico y posteriormente la región Fc de inmunoglobulina se une al otro extremo del polímero no peptidílico en el conjugado.
En una modalidad preferida, la presente descripción proporciona un método de preparación que incluye las etapas de:
(1) unir covalentemente un polímero no peptidílico que tiene un grupo reactivo aldehido en ambos extremos del mismo con el residuo de lisina de exendina-4;
(2) aislar un conjugado que incluye exendina-4 de la mezcla de reacción de (1), en el que el polímero no peptidílico está unido covalentemente al residuo de lisina; y
(3) unir covalentemente una región Fc de inmunoglobulina al otro extremo del polímero no peptidílico del conjugado aislado para producir un conjugado de proteína que incluye la región Fc de inmunoglobulina y exendina-4, que están unidas a cada extremo del polímero no peptidílico. Con mayor preferencia, el polímero no peptidílico y el residuo de lisina de exendina-4 en (1) se unen a pH 9,0 o superior.
El conjugado de péptido insulinotrópico de la presente descripción activa proteínas principales de la ruta de señalización de la insulina a través del receptor de GLP-1 y, por tanto, puede usarse para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico. En particular, el conjugado de péptido insulinotrópico de la presente descripción incrementa la actividad de PKC-Z (proteína quinasa C-Z) que regula la actividad enzimática implicada en la lipólisis y mantiene la actividad in vivo del péptido insulinotrópico conocido que incrementa la expresión de Glut2 (proteína transportadora de glucosa -2), y aumenta la semivida en sangre del péptido insulinotrópico, lo que aumenta notablemente de esta manera la duración de la eficacia in vivo. En consecuencia, pueden obtenerse excelentes efectos terapéuticos sobre la enfermedad del hígado graso no alcohólico con menos frecuencia de administración que las formulaciones conocidas.
En la presente descripción, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) incluye las enfermedades del hígado graso no alcohólico primarias y secundarias, y más específicamente significa la enfermedad del hígado graso no alcohólico provocada por hiperlipidemia primaria, diabetes u obesidad. Por ejemplo, la enfermedad del hígado graso no alcohólico incluye esteatosis simple, enfermedades del hígado graso provocadas por desnutrición, inanición, obesidad y diabetes, esteatohepatitis y la fibrosis hepática y cirrosis hepática que se producen debido a la progresión de estas enfermedades.
La composición farmacéutica que incluye el conjugado de péptido insulinotrópico de la presente descripción puede incluir además un portador farmacéuticamente aceptable. Para la administración oral, el portador farmacéuticamente aceptable puede incluir un aglutinante, un lubricante, un desintegrante, un excipiente, un solubilizante, un agente dispersante, un estabilizante, un agente de suspensión, un agente colorante y un perfume. Para preparaciones inyectables, el portador farmacéuticamente aceptable puede incluir un agente tampón, un agente conservante, un analgésico, un solubilizante, un agente isotónico y un estabilizante. Para preparaciones para la administración tópica, el portador farmacéuticamente aceptable puede incluir una base, un excipiente, un lubricante y un agente conservante. La composición farmacéutica de la presente descripción puede formularse en una variedad de formas de dosificación en combinación con los portadores farmacéuticamente aceptables mencionados anteriormente. Por ejemplo, para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en comprimidos, grageas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes u obleas. Para las preparaciones inyectables, la composición farmacéutica puede formularse en una ámpula como una forma de dosificación de dosis única o una forma de dosificación unitaria, tal como un recipiente multidosis. La composición farmacéutica también puede formularse en soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas y preparaciones de acción prolongada.
Por otra parte, los ejemplos del portador, el excipiente y el diluyente adecuados para las formulaciones farmacéuticas incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma arábiga, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceites minerales. Además, las formulaciones farmacéuticas pueden incluir además rellenos, agentes anticoagulantes, lubricantes, humectantes, perfumes y antisépticos.
El conjugado de acuerdo con la presente descripción es útil para prevenir o tratar la enfermedad del hígado graso no alcohólico. En consecuencia, una composición farmacéutica que incluya el conjugado puede administrarse para el tratamiento de la enfermedad.
El término "administración", como se usa en la presente descripción, significa la introducción de una sustancia predeterminada en un paciente mediante un determinado método adecuado. El conjugado de la presente descripción puede administrarse a través de cualquiera de las vías comunes, siempre que pueda alcanzar un tejido deseado. Se contemplan una variedad de modos de administración, lo que incluyen por vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intrarrectal, pero la presente descripción no se limita a estos modos de administración ejemplificados. Sin embargo, dado que los péptidos se digieren tras la administración oral, los ingredientes activos de una composición para administración oral deben recubrirse o formularse para su protección contra la degradación en el estómago. Preferentemente, la presente composición puede administrarse en una forma inyectable. Además, la composición farmacéutica puede administrarse mediante el uso de un determinado aparato capaz de transportar los ingredientes activos hacia una célula objetivo.
La composición farmacéutica de la presente descripción puede determinarse mediante varios factores relacionados, lo que incluye los tipos de enfermedades a tratar, las vías de administración, la edad, el sexo, el peso y la gravedad de la enfermedad del paciente, así como también mediante los tipos de fármaco como un componente activo. Dado que la composición farmacéutica de la presente descripción tiene una duración excelente de eficacia y título in vivo, puede reducir notablemente la frecuencia de administración y la dosis de las sustancias farmacéuticas de la presente descripción.
Además, la composición farmacéutica de la presente descripción puede usarse individualmente o en combinación con operación quirúrgica, terapia hormonal, terapia con fármacos y reguladores de la respuesta biológica para prevenir y tratar la enfermedad del hígado graso no alcohólico.
En un aspecto de la presente descripción, se refiere al uso de la composición farmacéutica en la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado no alcohólico.
[Modo]
En lo adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo con fines ilustrativos, y la descripción no pretende limitarse por estos Ejemplos. Ejemplo 1. Prueba de actividad in vitro de la exendina-4 de acción prolongada
Una variedad de derivados de exendina-4 de acción prolongada usados en este experimento se prepararon de la misma manera que en la patente coreana núm. 10-1058315 de los presentes autores.
Se usó un método para medir la actividad celular in vitro para medir la eficacia de la preparación de acción prolongada de exendina-4. En la medición de la actividad in vitro, se usó RIN-m5F, que se conoce como célula de insulinoma de rata. Debido a que esta célula tiene un receptor GLP-1, se usa comúnmente en los métodos para medir la actividad in vitro de la familia GLP-1. RIN-m5F se trató con GLP-1, exendina-4 y materiales de prueba a concentraciones variables. Los valores de EC50 se determinaron mediante la medición de la aparición de AMPc, que son moléculas de señalización en las células, provocadas por los materiales de prueba, y se compararon entre sí. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
[Tabla 1]
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Como se muestra en la Tabla 1, cuando el polímero no peptidílico se unió al residuo de lisina distinto del extremo N de la exendina-4 nativa, el título in vitro se mantuvo en 6,3 % y la semivida en sangre aumentó notablemente hasta aproximadamente 70 horas.
Ejemplo 2. Efectos sobre la formación del hígado graso en un modelo de animal obeso de ratón ob/ob
<2-1> División de animales de experimentación
Se adquirieron ratones ob/ob hembras de 5 semanas de edad (C57BL/6JHamSlc-ob/ob, 24-34 g) de Slc, Japón. El ratón ob/ob es un modelo animal usado comúnmente en las pruebas de eficacia de formulaciones contra la obesidad y contra la diabetes. Se alimentaron libremente con alimento sólido para animales de experimentación, que se esterilizó mediante radiación (fabricante: Picolab Rodent Diet, nombre del producto: 5053), y tuvieron acceso libre a agua del grifo esterilizada por irradiación UV filtrada en una botella de agua. Se mantuvieron en un sistema de alojamiento que cumplía con los requisitos del estándar de GLP en un ciclo luz-oscuridad de 12 h (la luz se enciende a las 6:00 am y se apaga a las 6:00 pm) de acuerdo con las directrices estándar de cuidado animal. Posteriormente, se seleccionaron ratones ob/ob sanos y se aclimataron a las condiciones de laboratorio durante 1 semana. Después, se realizó la administración del fármaco y los ratones se dividieron en 4 grupos y se administraron de la siguiente manera.
Grupo 1 (control negativo): inyección subcutánea de SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA CON FOSFATO DE DULBECCO (Sigma) una o más veces por semana a un volumen de administración de 5 ml/kg
Grupo 2 (control positivo): inyección subcutánea de 10,8 nmol/kg de BYETTA todos los días a un volumen de administración de 5 ml/kg
Grupo 3 (3,7 nmol/kg de grupo tratado con derivado de exendina-4 de acción prolongada): inyección subcutánea de 3,7 nmol/kg de derivado de exendina-4 de acción prolongada (HM11260C) una vez a la semana a un volumen de administración de 5 ml/kg
Grupo 4 (8,2 nmol/kg de grupo tratado con derivado de exendina-4 de acción prolongada): inyección subcutánea de 8,2 nmol/kg de derivado de exendina-4 de acción prolongada (HM11260C) una vez a la semana a un volumen de administración de 5 ml/kg
BYETTA (Eli Lilly) es la exendina-4 nativa, y el derivado de exendina-4 de acción prolongada (HM11260C) es un conjugado CA exendina-4-PEG-Fc preparado mediante la unión de imidazoacetil-exendina-4 con la eliminación del carbono alfa del primer aminoácido histidina a la región Fc a través de PEG, descrita en la patente coreana núm. 10­ 1058315.
Cada grupo se administró con una solución salina o fármacos durante 7 semanas y se analizaron sus efectos sobre la formación del hígado graso.
<2-2> Efectos del derivado de exendina-4 de acción prolongada sobre la formación del hígado graso
Para examinar los efectos de los derivados de exendina-4 de acción prolongada de acuerdo con la presente descripción sobre la formación del hígado graso en ratones ob/ob, se realizó el siguiente experimento. Los fármacos se administraron en los grupos divididos en el Ejemplo <2-1>, y los hígados se tomaron de los ratones ob/ob, y una parte de los mismos se fijó en formaldehído al 4 % y se embebió en parafina, seguido de tinción de H-E. Los resultados se muestran en la FIGURA 1.
Como se muestra en la FIGURA 1, las características patológicas del hígado graso se observaron claramente en el grupo de control negativo tratado con un vehículo, mientras que se observó una notable reducción dependiente de la dosis de las características patológicas del hígado graso en el grupo experimental tratado con el derivado de exendina-4 de acción prolongada de la presente descripción. También se encontró que el derivado de exendina-4 de acción prolongada de la presente descripción mostró excelentes efectos terapéuticos sobre el hígado graso incluso con una dosis más baja, en comparación con el control positivo BYETTA.
Ejemplo 3. Efectos sobre la acumulación de triglicéridos intrahepáticos en ratones obesos inducidos por dieta alta en grasas
<3-1> División de animales de experimentación
Se estabilizaron ratones C57BL/6 de 6 semanas de edad y se dividieron en dos grupos, y recibieron una dieta normal que contenía un 10 % de grasa y una dieta alta en grasas que contenía un 60 % de grasa durante 12 semanas (fabricante: Research diets Inc., nombre del producto: D12492). Por tanto, se prepararon y usaron para los experimentos ratones normales y ratones obesos inducidos por dieta alta en grasas. Se mantuvieron en un sistema de alojamiento que cumplía con los requisitos del estándar de GLP en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas (la luz se enciende a las 6:00 am y se apaga a las 6:00 pm) de acuerdo con las directrices estándar de cuidado animal. Posteriormente, se seleccionaron ratones obesos inducidos por dieta alta en grasas y se aclimataron a las condiciones del laboratorio durante 1 semana. Después, se realizó la administración del fármaco y los ratones se dividieron en 4 grupos y se administraron de la siguiente manera.
Grupo 1 (grupo de dieta normal): inyección subcutánea de SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA CON FOSFATO DE DULBECCO (Sigma) una o más veces a la semana a un volumen de administración de 5 ml/kg
Grupo 2 (grupo de dieta alta en grasas): inyección subcutánea de SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA CON FOSFATO d E DULBECCO (Sigma) una o más veces a la semana a un volumen de administración de 5 ml/kg Grupo 3 (grupo de dieta alta en grasas tratado con 3 nmol/kg de derivado de exendina-4 de acción prolongada): inyección subcutánea de 3 nmol/kg de derivado de exendina-4 de acción prolongada (HM11260C) una vez a la semana a un volumen de administración de 5 ml/kg
Grupo 4 (grupo de dieta alta en grasas tratado con 10 nmol/kg de derivado de exendina-4 de acción prolongada): inyección subcutánea de 10 nmol/kg de derivado de exendina-4 de acción prolongada (HM11260C) una vez a la semana a un volumen de administración de 5 ml/kg
Cada grupo se administró con una solución salina o fármacos durante 2 semanas y se analizó la cantidad de triglicéridos acumulados en el tejido hepático.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico que comprende un conjugado de fármaco de péptido insulinotrópico preparado mediante la unión covalente de un péptido insulinotrópico y una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico como ingrediente activo, en donde el péptido insulinotrópico se selecciona del grupo que consiste en exendina-4, un derivado de exendina-4 preparado mediante la deleción del grupo amino N-terminal de la exendina-4, un derivado de exendina-4 preparado mediante la sustitución del grupo amino N-terminal de la exendina-4 por un grupo hidroxilo, un derivado de exendina-4 preparado mediante la modificación del grupo amino N-terminal de la exendina-4 con un grupo dimetilo, y un derivado de exendina-4 preparado mediante la deleción del carbono alfa del residuo de histidina N-terminal de la exendina-4 y el grupo amino N-terminal unido al carbono alfa, y
el polímero no peptidílico se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol-propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter poliviniletílico, polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos, en donde el polímero no peptidílico está unido a un residuo de lisina en la posición 27 del péptido insulinotrópico; y en donde la enfermedad del hígado graso no alcohólico se selecciona del grupo que consiste en esteatosis simple, enfermedades del hígado graso provocadas por inanición, fibrosis hepática y cirrosis hepática.
2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región Fc de inmunoglobulina y el péptido insulinotrópico están unidos en ambos extremos del polímero no peptidílico, respectivamente.
3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero no peptidílico es polietilenglicol.
4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región Fc de inmunoglobulina está aglicosilada.
5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región Fc de inmunoglobulina está compuesta por uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste en dominios CH1, CH2, CH3 y CH4.
6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la región Fc de inmunoglobulina incluye además una región bisagra.
7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc que se deriva de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, opcionalmente, en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4, y opcionalmente, en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4 humana no glicosilada.
8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo reactivo del polímero no peptidílico se selecciona del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida.
9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el derivado de succinimida se selecciona del grupo que consiste en propionato de succinimidilo, succinimidil carboximetilo, hidroxisuccinimidilo y carbonato de succinimidilo.
10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero no peptidílico tiene grupos aldehído reactivos en ambos extremos del mismo.
11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el conjugado de fármaco de péptido insulinotrópico aumenta la actividad de PKC-Z (proteína quinasa C-Z) que regula la actividad enzimática implicada en la lipólisis.
12. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el conjugado de fármaco de péptido insulinotrópico aumenta la expresión de Glut2 (proteína transportadora de glucosa-2) implicada en la lipólisis.
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