CN110075277A - 用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病的药学组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的药学组合物，其包括通过共价连接促胰岛素释放肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区制备的缀合物。本发明的组合物维持肽的体内活性在相对高的水平，并且显著增加血液半衰期，从而预防是非酒精性脂肪肝疾病的典型特征的甘油三酯积聚。最后，其可期望用于预防和治疗非酒精性脂肪肝疾病。

Description

用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病的药学组合物
本申请是分案申请，原申请的申请日为2013年3月8日、申请号为2013800131410、发明名称为“用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病的药学组合物”。
技术领域
本发明涉及包括长效促胰岛素释放肽缀合物的药学组合物，其可用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病。尤其，本发明涉及促胰岛素释放肽缀合物，其中促胰岛素释放肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区彼此共价连接，以便显著增加血液半衰期，有效防止甘油三酯积聚，并且涉及其在预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病中的用途。
背景技术
非酒精性脂肪肝疾病指范围从单纯脂肪变性到肝纤维化和肝硬化的宽范围疾病，所述单纯脂肪变性在没有过度摄入酒精的患者中不伴随炎症反应，所述肝纤维化和肝硬化由单纯脂肪变性的进展导致并且显示肝细胞炎症。
非酒精性脂肪肝疾病取决于病理学原因可划分为原发性和继发性非酒精性脂肪肝疾病。原发性脂肪肝疾病由是代谢综合症特征的高血脂症、糖尿病、肥胖等造成。继发性脂肪肝疾病是营养原因(突然体重下降、饥饿、肠改道手术)、各种药物、毒性物质(有毒蘑菇、细菌毒素)、代谢原因和其他因素的结果。
已知其中是代谢综合症重要特征的糖尿病和肥胖症是原发性因素的原发性非酒精性脂肪肝疾病的发病率为大约50％的糖尿病患者、大约76％的肥胖患者，并且大部分是肥胖糖尿病患者(Gupte P等，2004)。此外，当对具有增加水平的丙氨酸转氨酶(ALT)的糖尿病和肥胖患者进行肝活组织检查时，脂肪性肝炎的发病率范围为18％至36％(Braillon A等，1985)。
目前，没有成熟的方法用于确定非酒精性脂肪肝疾病的原因。这是因为非酒精性脂肪肝疾病的发病率与各种因素比如糖尿病、肥胖、冠状动脉疾病和生活方式习惯相关。有关于抗糖尿病或肥胖药物对脂肪肝疾病的影响的一些报道。用作口服抗肥胖药物的奥尔利司他(orlistat)在具有脂肪性肝炎(steatohepatitis)的患者中展示肝的组织学改进(Hussein等，2007)，并且二甲双胍在未展现糖尿病的非酒精性脂肪肝疾病患者中展示肝酶血液水平的下降和肝坏死性炎症和纤维化的下降(Bugianesi等，2005)。此外，噻唑烷二酮(TZD)类药物——其是PPAR(过氧化物酶体增殖体-激活的受体)显效剂——抑制在肝和肌肉中脂肪的积聚，并且对非酒精性脂肪肝疾病的动物模型中的肝展示直接抗纤维作用(Galli A等，2002)。
同时，类胰高血糖素肽-1(GLP-1)是身体中存在的内源肽并且是响应肠中养分或血糖水平的刺激从肠道L细胞分泌的激素。GLP-1具有各种生理学活性，包括通过刺激胰岛素分泌、胰腺β细胞增殖、抑制上胃肠道运动和抑制食欲来调节血糖水平。最近，GLP-1受体表达出现在肝细胞中，并且GLP-1经肝细胞的GLP-1受体通过活化是胰岛素信号传导途径中的主要蛋白质的磷酸肌醇-依赖性激酶-1(PDK-1)和蛋白质激酶C-(PKC-)，对治疗非酒精性脂肪肝疾病显示出好的效果(Gupta NA等，2010)。GLP-1也用于通过活化分子伴侣蛋白介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)(CMA)和巨自噬二者减少脂肪酸积聚或防止肝细胞由内质网应力造成的死亡(Sharma S等，2011)。最近研究报道GLP-1促进肝脂质氧化，以防止肝脂肪积聚和促进胰岛素作用(Svegliati-Baroni G等，2011)。这些许多报道提出GLP-1衍生物可能是用于开发非酒精性脂肪肝疾病的预防剂和治疗剂的重要候选物。
但是，使用GLP-1作为非酒精性脂肪肝的治疗剂的主要障碍是其短的血液半衰期(最大半衰期：2分钟)。这归因于经由身体中第8位氨基酸(Ala)和第9位氨基酸(Asp)之间被二肽基肽酶IV(dipeptidyl pepdidase IV)(DPP IV)切割，GLP-1滴度的丢失。所以，已经对具有DPP IV抗性的GLP-1类似物进行了各种研究，并且已经进行了试验用于用Gly取代Ala8(Deacon等，1998；Burcelin等，1999)取代Ala8，或用Leu或D-Ala取代Ala8(Xiao等，2001)，从而增加对DPP IV的抗性，同时保持活性。GLP-1的N-末端氨基酸His7对于GLP-1活性是至关重要的并且用作DPP IV的靶标。因此，美国专利号5,545,618描述N-末端被烷基或酰基修饰，并且Gallwitz等描述第7位His进行N-甲基化，或α-甲基化，或整个His用咪唑取代，以增加对DPP IV的抗性并且维持生理学活性。
除了这些修饰，毒蜥外泌肽(exendin)-4——其是从希拉毒蜥(gila monster)的唾液腺纯化的GLP-1类似物(美国专利号5,424,686)——具有对DPP IV的抗性和比GLP-1更高的生理学活性。结果，其体内半衰期是2至4个小时，是比GLP-1更长的时间周期。但是，利用仅仅用于增加对DPP IV抗性的方法，不足以维持生理学活性，并且例如，在商业上可获得的毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽(exenatide))的情况下，其需要每天两次注入患者。该频率对于患者仍是困难的。为改善该问题制备的肽是抗DPP IV的毒蜥外泌肽-4，其具有2至4个小时的血液半衰期。尽管其血液半衰期比GLP-1的更长，但是其也需要每天注入。
发明内容
技术问题
因此，本发明人使用通过共价键位点特异性连接免疫球蛋白Fc区、非肽基聚合物和促胰岛素释放肽的方法，以便最大化增加促胰岛素释放肽的血液半衰期并且保持体内活性的作用。结果，本发明人发现，该方法显著增加肽缀合物的血液半衰期，并且提供比已知的框内融合方法长得多的血液半衰期。本发明人也发现，通过位点特异性连接免疫球蛋白Fc至促胰岛素释放肽的氨基酸残基处而不是N-末端处出现的氨基或硫羟基团制备的缀合物比通过在促胰岛素释放肽的N-末端处连接制备的缀合物保持更高的滴度。因此，确认缀合物对非酒精性脂肪肝疾病显示卓越的疗效，即使其比已知的毒蜥外泌肽-4剂型较不频繁地施用，从而完成本发明。
技术方案
本发明的目的是提供长效促胰岛素释放肽缀合物，其维持延长的体内半衰期和有效防止甘油三酯积聚，并且因此用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病。
有益效果
根据本发明的促胰岛素释放肽缀合物维持肽的体内活性在相对高的水平，具有显著增加的血液半衰期，和有效活化参与脂分解的主要蛋白质，以防止甘油三酯积聚，从而用于预防和治疗非酒精性脂肪肝疾病。
附图说明
图1显示施用根据本发明一种实施方式的长效毒蜥外泌肽-4缀合物的ob/ob小鼠的肝组织的图像(苏木精&伊红染色，H&E染色，紫色染色的区域：正常肝组织，白色染色的区域：脂质滴)；和
图2显示施用根据本发明一种实施方式的长效毒蜥外泌肽-4缀合物的高脂肪诱导的-肥大小鼠中的肝内甘油三酯积聚的图(#：与正常饮食组相比，在99％置信度显著增加(p<0.01)，*：与高脂肪饮食组相比，在99％置信度显著下降(p<0.01))。
具体实施方式
在一个方面中，为实现上述目标，一种实施方式涉及用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病的药学组合物，其包括作为活性成分的促胰岛素释放肽药物缀合物，其通过经非肽基聚合物共价连接促胰岛素释放肽和免疫球蛋白Fc区制备。
在本发明的药学组合物中，促胰岛素释放肽选自毒蜥外泌肽-4、通过缺失毒蜥外泌肽-4的N-末端氨基制备的毒蜥外泌肽-4衍生物、通过用羟基基团取代毒蜥外泌肽-4的N-末端氨基制备的毒蜥外泌肽-4衍生物、通过用二甲基修饰毒蜥外泌肽-4的N-末端氨基制备的毒蜥外泌肽-4衍生物，和通过缺失毒蜥外泌肽-4的N-末端组氨酸残基的α-碳和与α-碳连接的N-末端氨基制备的毒蜥外泌肽-4衍生物。
非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和其组合。
本发明的促胰岛素释放肽是具有促胰岛素释放功能以促进胰腺β细胞中胰岛素的合成和表达的肽。这些肽包括前体、衍生物、片段、变体或类似物，并且优选GLP(类胰高血糖素肽)-1、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4或类似物。
GLP-1是由小肠分泌的激素。一般而言，其促进胰岛素的生物合成和分泌、抑制胰高血糖素的分泌，并且促进细胞中的葡萄糖吸收。在小肠中，胰高血糖素前体分解成三种肽，即，胰高血糖素、GLP-1和GLP-2。这里，GLP-1意思是GLP-1(1-37)，其起初是以没有促胰岛素释放功能的形式。但是其然后被处理并且转化成活化的GLP-1(7-37)形式。GLP-1(7-37)的氨基酸序列如下：
GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EPIAW LVKGR G
GLP-1衍生物意思是展示与GLP-1至少80％氨基酸序列同源性的肽，其可以是化学修饰的形式，并且展示至少等于或大于GLP-1的促胰岛素释放功能。
GLP-1片段意思是其中在天然GLP-1的N-末端或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸并且添加的氨基酸可能是非天然存在的氨基酸(例如，D-型氨基酸)的形式。
GLP-1变体意思是具备促胰岛素释放功能的肽，其具有不同于天然GLP-1的一个或多个氨基酸序列。
毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4是由与GLP-1具有53％氨基酸序列同源性的39个氨基酸组成的促胰岛素释放肽。毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列如下：
毒蜥外泌肽-3(SEQ ID NO:2)
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO:3)
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
毒蜥外泌肽衍生物意思是与天然毒蜥外泌肽具有至少80％氨基酸序列同源性的肽，其在氨基酸残基上可具有一些基团被化学取代，并且展示至少等于或大于天然毒蜥外泌肽的促胰岛素释放功能。
毒蜥外泌肽片段意思是在天然毒蜥外泌肽的N-末端或C-末端具有一个或多个添加的或缺失的氨基酸的片段，并且添加的氨基酸可能是非天然存在的氨基酸(例如，D-型氨基酸)。
毒蜥外泌肽变体意思是具备促胰岛素释放功能的肽，其具有不同于天然毒蜥外泌肽的一个或多个氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本发明使用的天然促胰岛素释放肽和修饰的促胰岛素释放肽可使用固相合成方法合成并且大部分天然肽，包括天然促胰岛素释放肽，可通过重组技术产生。
此外，本发明使用的促胰岛素释放肽可在不同的位点上结合至非肽基聚合物。
本发明中制备的缀合物可具有取决于促胰岛素释放肽的结合位点而改变的活性。
例如，其可分别与N-末端，和其他末端包括C-末端偶联，其显示不同的体外活性。醛反应基团选择性在低pH结合至N-末端并且可结合至赖氨酸残基以在高pH例如pH 9.0形成共价键。允许以不同的pH进行聚乙二醇化反应并且离子交换柱可然后用于从反应混合物分离位置异构体。
如果促胰岛素释放肽在N-末端——其是对体内活性重要的位点——之外的位点被偶联，那么反应性硫羟基团可引入至天然氨基酸序列中待修饰的氨基酸残基的位点，以便使用在非肽基聚合物处的马来酰亚胺连接体形成共价键。
如果促胰岛素释放肽在N-末端——对于体内活性重要的位点——之外的位点偶联，反应性胺基团可引入至天然氨基酸序列中待修饰的氨基酸残基的位点，以便使用在非肽基聚合物处的醛连接体形成共价键。
当使用在非肽基聚合物处的醛连接体时，其与在N-末端的胺基团和赖氨酸残基反应，并且修饰形式的促胰岛素释放肽可用于选择性增加反应产率。例如，使用N-末端封闭方法、赖氨酸残基取代方法、用于在羧基末端引入胺基团的方法等仅仅一个待反应的胺基团可保留在期望的位点上，从而增加聚乙二醇化反应和偶联反应的产率。用于保护N-末端的方法包括二甲基化，以及甲基化、脱氨基、乙酰化等，但不限于此类烷基化方法。
在一种优选的实施方式中，本发明的促胰岛素释放肽缀合物是其中免疫球蛋白Fc区特异性结合至促胰岛素释放肽的N-末端处之外的胺基团的促胰岛素释放肽缀合物。
在一种具体的实施方式中，本发明人在pH 9.0引起天然毒蜥外泌肽-4的聚乙二醇化，以选择性地将PEG偶联至促胰岛素释放肽的赖氨酸残基。可选地，可合成使N-末端缺失或受保护的毒蜥外泌肽-4衍生物以被偶联。在N-末端的聚乙二醇化可通过缺失N-末端组氨酸的α胺基团或通过用两个甲基修饰氮末端组氨酸而封闭。这种N-末端修饰不影响体外活性(表1)。
不像毒蜥外泌肽-4的N-末端偶联，在赖氨酸残基处的偶联保持体外活性在大约6％(表1)。此外，本发明中制备的毒蜥外泌肽-4-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物展示60～70小时的显著增加的血液半衰期，指示出人意料的高持久性效力。所以，通过偶联至不影响活性的赖氨酸残基也使滴度下降被最小化，并且因此可制备能够保持其体内活性的新型长效毒蜥外泌肽-4制剂。
免疫球蛋白Fc区用作药物载体是安全的，因为其是体内代谢的生物可降解的多肽。而且，免疫球蛋白Fc区与整个免疫球蛋白分子相比具有相对低的分子量，并且因此其对于缀合物的制备、纯化和产率是有利的。因为免疫球蛋白Fc区不包含其氨基酸序列根据抗体亚类不同并且因此是高度非同源性的Fab片段，可预测免疫球蛋白Fc区可大大增加物质的同种性并且是较小抗原的。
如本文所使用，术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)并且不包括重链和轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)、和轻链恒定区1(CL1)。其可进一步包括在重链恒定区的铰链区。而且，除了重链和轻链的可变区，本发明的免疫球蛋白Fc区可包含部分或所有的Fc区，包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，只要其具有基本上与天然蛋白质类似或更好的效果。而且，免疫球蛋白Fc区可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分具有缺失的片段。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可包括1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或一部分铰链区)的组合，和6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。
本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fc中，已知对于在位置214至238、297至299、318至322，或327至331的结合重要的氨基酸残基可用作适当的用于修饰的靶标。而且，其他各种衍生物是可能的，包括其中能够形成二硫键的区域被缺失或某些氨基酸残基在天然Fc形式的N-末端被去除，或向其添加甲硫氨酸残基的衍生物。此外，为了去除效应器功能，缺失可发生在补体-结合位点，比如C1q-结合位点和ADCC位点。国际专利公开号WO97/34631和WO96/32478公开了制备免疫球蛋白Fc区的此类序列衍生物的技术。
本领域已知在蛋白质和肽中氨基酸交换，其一般不改变分子活性(H.Neurath，R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常发生的交换是双方向的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly。
如果期望，Fc区可通过磷酸化、硫酸盐化、丙烯酸化(acrylation)、糖基化、甲基化、法呢基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等等修饰。
前面提到的Fc衍生物是具有与本发明Fc区相同的生物活性或针对热、pH等改善的结构稳定性的衍生物。
另外，这些Fc区可从由人和其他动物包括母牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠和豚鼠分离的天然形式获得，或可以是获得自转化动物细胞或微生物的重组体或其衍生物。本文，它们可通过从人或动物有机体分离整个免疫球蛋白并且用蛋白水解酶处理它们，获得自天然免疫球蛋白。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab和Fc区，并且胃蛋白酶处理引起pF'c和F(ab)2片段的产生。这些片段可进行尺寸排阻色谱以分离Fc或pF'c。
优选地，人源的Fc区是获得自微生物的重组体免疫球蛋白Fc区。
另外，免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链，或与天然形式相比减少的糖链的形式，或可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可通过本领域常见方法实现，比如化学方法、酶方法和使用微生物的基因工程方法。从Fc区去除糖链导致对补体(c1q)的结合亲和力急剧下降并且抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性或补体-依赖性细胞毒性下降或损失，从而在体内不诱导不必要的免疫应答。在这点上，以去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可作为药物载体更适于本发明的目的。
如本文所使用，术语“去糖基化”指从Fc区酶学上去除糖部分，术语“无糖基化”意思是通过原核生物，优选地大肠杆菌以非糖基化的形式产生Fc区。
尽管免疫球蛋白Fc区可优选地源自人，但是其也可源自其他动物包括母牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠和豚鼠。另外，免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区，或通过其组合物或其混合体制造的Fc区。优选地，其源自IgG或IgM——其是人血液中最丰富的蛋白质之一，并且最优选地源自IgG——其已知增强配体-结合蛋白的半衰期。
另一方面，术语“组合”，如本文所使用，意思是编码相同起源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽连接至不同起源的单链多肽，以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或更多个片段形成。
如本文所使用，术语“混合体”意思是编码不同起源的两个或更多个免疫球蛋白Fc区的序列出现在单链免疫球蛋白Fc区中。在本发明中，各种类型的混合体是可能的。即，结构域混合体可由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的一至四个结构域组成，并且可包括铰链区。
另一方面，IgG可分成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明可包括其组合物和混合体。优选的是IgG2和IgG4亚类，并且最优选的是IgG4的Fc区，其很少有效应器功能，比如CDC(补体依赖性细胞毒性)。
即，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fc区是源自人IgG4的非糖基化的Fc区。人源的Fc区比非人源的Fc区更优选，所述非人源的Fc区可作为人体中的抗原并且造成非期望的免疫应答，比如针对该抗原产生新的抗体。
如本文所使用，术语“非肽基聚合物”指包括通过除了肽键的任何共价键彼此连接的两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物。
可用于本发明的非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物，比如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-甘醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸，和其组合，其优选的是聚乙二醇。而且，本领域熟知的并且本领域技术人员容易制备的其衍生物包括在本发明的范围内。
用于通过常规的框内融合方法获得的融合蛋白的肽连接体具有的缺点是，其容易在体内被蛋白水解酶切割，并且因此不能如期望的获得足够的通过载体增加活性药物血液半衰期的效果。但是，在本发明中，具有对蛋白水解酶抗性的聚合物可用于维持肽的血液半衰期与载体的类似。所以，可以使用本发明使用的任何非肽基聚合物而没有任何限制，只要其是具有前面提到的功能的聚合物，即，具有对体内蛋白水解酶抗性的聚合物。优选地，非肽基聚合物具有1至100kDa范围的分子量，和优选地1至20kDa。而且，与免疫球蛋白Fc区连接的本发明的非肽基聚合物可以是一种聚合物或不同类型聚合物的组合。
本发明使用的非肽基聚合物具有能够结合至免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物的反应基团。
非肽基聚合物在两个末端具有反应基团，其优选地选自反应性乙醛基(aldehydegroup)、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基丙酸酯、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基、或琥珀酰亚胺基碳酸酯。尤其，当非肽基聚合物在两个末端具有反应性乙醛基时，其在两个末端与生理活性多肽和具有最小非特异性反应的免疫球蛋白连接是有效的。经醛键通过还原性烷基化产生的终产物比当通过酰胺键连接时稳定得多。醛反应基团选择性地在低pH下结合至N-末端并且在高pH例如在pH 9.0下可结合至赖氨酸残基以形成共价键。
在非肽基聚合物两个末端的反应基团可以相同或不同。例如，非肽聚合物可在一端具有马来酰亚胺基团并且在另一端其可具有乙醛基、丙醛基或丁醛基。当在其两个末端具有反应性羟基基团的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，羟基基团可通过已知的化学反应被活化成各种反应基团，或可使用具有商业上可获得的修饰的反应基团的聚乙二醇，以便制备本发明的促胰岛素释放肽缀合物。
在另一实施方式中，本发明提供制备促胰岛素释放肽缀合物的方法，其包括下述步骤：
(1)共价连接在其两个末端具有醛、马来酰亚胺或琥珀酰亚胺衍生物的反应基团的非肽基聚合物与促胰岛素释放肽的胺基团或硫羟基团；
(2)从(1)的反应混合物分离包括促胰岛素释放肽的缀合物，其中非肽基聚合物共价连接至氨基末端之外的位点；和
(3)共价连接免疫球蛋白Fc区至分离的缀合物的非肽基聚合物的另一末端，从而产生具有连接至非肽基聚合物的各自末端的免疫球蛋白Fc区和促胰岛素释放肽的肽缀合物。
如本文所使用，术语“缀合物”指通过共价连接非肽基聚合物与促胰岛素释放肽制备的中间体，并且随后免疫球蛋白Fc区连接至缀合物中非肽基聚合物的另一末端。
在一种优选的实施方式中，本发明提供了制备方法，其包括下述步骤：
(1)共价连接在其两个末端具有醛反应基团的非肽基聚合物与毒蜥外泌肽-4的赖氨酸残基；
(2)从(1)的反应混合物分离包括毒蜥外泌肽-4的缀合物，其中非肽基聚合物共价连接至赖氨酸残基；和
(3)共价连接免疫球蛋白Fc区至分离的缀合物的非肽基聚合物的另一末端，从而生产蛋白质缀合物，其包括连接至非肽基聚合物的各自末端的免疫球蛋白Fc区和毒蜥外泌肽-4。更优选地，(1)中的非肽基聚合物和毒蜥外泌肽-4的赖氨酸残基在pH 9.0或更高pH下被连接。
本发明的促胰岛素释放肽缀合物经GLP-1受体活化胰岛素信号传导途径的主要蛋白质，并且因此可用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病。尤其，本发明的促胰岛素释放肽缀合物增加PKC-ζ(蛋白质激酶C-ζ)的活性，其调节参与脂分解的酶活性并且维持已知增加Glut2(葡萄糖载体蛋白质-2)表达的促胰岛素释放肽的体内活性，并且增加促胰岛素释放肽的血液半衰期，从而显著增加体内效力的持续时间。因此，可用比已知剂型较低的施用频率获得对非酒精性脂肪肝疾病的卓越治疗效果。
在本发明中，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)包括原发性和继发性非酒精性脂肪肝疾病，并且更具体地意思是由原发性高血脂症、糖尿病或肥胖造成的非酒精性脂肪肝疾病。例如，非酒精性脂肪肝疾病包括单纯脂肪变性；营养不良、饥饿、肥胖和糖尿病造成的脂肪肝疾病；脂肪性肝炎；以及由于这些疾病的进展发生的肝纤维化和肝硬化。
包括本发明的促胰岛素释放肽缀合物的药学组合物可进一步包括药学上可接受的载体。为了口服施用，药学上可接受的载体可包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和香料。为了可注射的制剂，药学上可接受的载体可包括缓冲剂、防腐剂、镇痛药、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部施用的制剂，药学上可接受的载体可包括碱、赋形剂、润滑剂和防腐剂。本发明的药学组合物可配制成与前述提到的药学上可接受的载体组合的各种药物剂型。例如，对于口服施用，药学组合物可配制成片剂、含锭、胶囊、酏剂、悬液、糖浆剂或糯米纸囊剂。对于可注射的制剂，药学组合物可配制成作为单次剂量给药形式或单位给药形式的安瓿，比如多剂量容器。药学组合物也可配制成溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊和长效制剂。
另一方面，适于药物制剂的载体、赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。另外，药物制剂可进一步包括填充剂、抗凝结剂、润滑剂、致湿物、香料和抗菌剂。
根据本发明的缀合物用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病。因此，包括缀合物的药学组合物可被施用用于治疗该疾病。
如本文所使用，术语“施用”意思是通过某些适当的方法将预定的物质引入至患者体内。本发明的缀合物可经任何常见的路径施用，只要其能够到达期望的组织。考虑各种施用的模式，包括腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内，但是本发明不限于这些示例性的施用模式。然而，因为当口服施用时肽被消化，用于口服施用的组合物的活性成分应被加以包覆或配制为防止在胃中的降解。优选地，本组合物可以以可注射的形式施用。另外，药学组合物可使用能够将活性成分运输至靶细胞的某些装置施用。
本发明的药学组合物可通过数个相关的因素确定，所述因素包括待治疗疾病的类型、施用路径、患者的年龄、性别、体重和疾病的严重性、以及作为活性组分的药物的类型。因为本发明的药学组合物具有卓越的体内效力的持续时间和滴度，其可显著降低本发明药学药物的施用频率和剂量。
此外，本发明的药学组合物可单独或与外科手术操作、激素疗法、药物疗法和生物应答调节剂组合使用，以便预防和治疗非酒精性脂肪肝疾病。
在本发明的一个方面中涉及药学组合物在制备用于预防或治疗非酒精性肝疾病的药物中的用途。
实施例
下文，参考下述实施例更详细描述本发明。但是，这些实施例仅仅是用于示意性目的，并且本发明不打算被这些实施例限制。
实施例1.测试长效毒蜥外泌肽-4的体外活性
以与本发明人韩国专利号10-1058315中相同的方式制备该实验使用的各种长效毒蜥外泌肽-4衍生物。
使用用于测量体外细胞活性的方法，以便测量毒蜥外泌肽-4的长效制剂的效力。在体外活性测量中，使用称为大鼠胰岛素瘤细胞的RIN-m5F。因为该细胞具有GLP-1受体，其通常在测量GLP-1家族的体外活性的方法中使用。用不同浓度的GLP-1、毒蜥外泌肽-4和测试材料处理RIN-m5F。通过测量由测试材料引起的细胞中的信号传导分子cAMP的发生测定EC50值，并且彼此比较。结果总结在表1中。
表1
测试材料 血液半衰期(hr) 体外滴度(％)
毒蜥外泌肽-4 0.7 100
毒蜥外泌肽-4(N)-PEG-Fc 61.5 <0.2
毒蜥外泌肽-4(Lys27)-PEG-Fc 70.5 6.3
毒蜥外泌肽-4(N)-PEG-Fc：通过经PEG连接毒蜥外泌肽-4的N-末端和Fc区制备的缀合物。
毒蜥外泌肽-4(Lys27)-PEG-Fc：通过经PEG连接毒蜥外泌肽-4的第27位赖氨酸残基和Fc区制备的缀合物。
如表1中所显示，当非肽基聚合物连接至天然毒蜥外泌肽-4的N-末端之外的赖氨酸残基时，体外滴度保持在6.3％，并且血液半衰期显著增加至约70小时。
实施例2.对肥大动物模型ob/ob小鼠中脂肪肝形成的作用
<2-1>实验动物的分组
雌性5周大ob/ob小鼠(C57BL/6JHamSlc-ob/ob，24-34g)购买自日本的Slc。ob/ob小鼠是通常用于抗肥胖和抗糖尿病剂型的效力测试中的动物模型。它们自由进食通过辐射灭菌的用于实验动物的固体饲料(制造商：Picolab Rodent Diet，产品名：5053)，并且自由饮食水瓶中过滤的、UV照射-灭菌的自来水。根据动物护理标准指南(animal carestandard guidelines)，它们保持在符合GLP标准要求以12小时暗-亮循环(在上午6:00打开灯并且在下午6:00关闭)的箱子系统中。其后，选择健康的ob/ob小鼠并且使之适应实验室条件1周。然后，进行药物施用，并且小鼠分成4组和如下给药。
组1(阴性对照)：以5ml/kg的施用体积皮下注射DULBECCO的PHOSPHATE BUFFEREDSALINE(Sigma)一周一次或更多次
组2(阳性对照)：以5ml/kg的施用体积每天皮下注射10.8nmol/kg的BYETTA
组3(3.7nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物-处理组)：以5ml/kg的施用体积皮下注射3.7nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物(HM11260C)每周一次
组4(8.2nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物-处理组)：以5ml/kg的施用体积皮下注射8.2nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物(HM11260C)每周一次
BYETTA(Eli Lilly)是天然毒蜥外泌肽-4，并且长效毒蜥外泌肽-4衍生物(HM11260C)是通过经PEG将去除第一个氨基酸组氨酸的α碳的咪唑乙酰基-毒蜥外泌肽-4连接至Fc区制备的CA毒蜥外泌肽-4-PEG-Fc缀合物，如韩国专利号10-1058315中描述。
每个组施用盐水溶液或药物7周，并且分析它们对脂肪肝形成的作用。
<2-2>长效毒蜥外泌肽-4衍生物对脂肪肝形成的作用
为了检查根据本发明的长效毒蜥外泌肽-4衍生物对ob/ob小鼠中脂肪肝形成的作用，进行下述实验。将药物施用至实施例<2-1>划分的组中，和从ob/ob小鼠中取出肝，并且其一部分固定在4％甲醛中并且嵌入石蜡内，随后H&E染色。结果显示在图1中。
如图1中所显示，在用媒介物处理的阴性对照组中清楚地观察到脂肪肝的病理学特征，而在用本发明的长效毒蜥外泌肽-4衍生物处理的实验组中观察到显著的脂肪肝病理性特征的剂量依赖性降低。也发现，与阳性对照BYETTA比较，本发明的长效毒蜥外泌肽-4衍生物显示甚至用更低的剂量对脂肪肝卓越的疗效。
实施例3.对高脂肪诱导的-肥大小鼠中肝内甘油三酯积聚的作用
<3-1>实验动物的分组
使6周大C57BL/6小鼠稳定并且分成两个组，并且接收包含10％脂肪的正常饮食和包含60％脂肪的高脂肪饮食12周(制造商：Research diets Inc.，产品名：D12492)。因此，准备正常小鼠和高脂肪诱导的-肥大小鼠，并且用于实验。根据动物护理标准指南，它们保持在符合GLP标准要求以12小时暗-亮循环(在上午6:00打开灯并且在下午6:00关闭)的箱子系统中。其后，选择健康的高脂肪诱导的-肥大小鼠并且使之适应实验室条件1周。然后，进行药物施用，并且小鼠分成4组和如下施用。
组1(正常饮食组)：以5ml/kg的施用体积皮下注射DULBECCO的PHOSPHATEBUFFERED SALINE(Sigma)一周一次或更多次
组2(高脂肪饮食组)：以5ml/kg的施用体积皮下注射DULBECCO的PHOSPHATEBUFFERED SALINE(Sigma)一周一次或更多次
组3(用3nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物处理的高脂肪饮食组)：以5ml/kg的施用体积皮下注射3nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物(HM11260C)每周一次
组4(用10nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物处理的高脂肪饮食组)：以5ml/kg的施用体积皮下注射10nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物(HM11260C)每周一次
每个组施用盐水溶液或药物2周，并且分析肝组织中积聚的甘油三酯的量。
<3-2>测量高脂肪诱导的-肥大小鼠中的肝内甘油三酯积聚
从实施例<3-1>划分的组中取出肝，它们是施用或不施用长效毒蜥外泌肽-4衍生物的高脂肪诱导的-肥大小鼠，并且测定肝内甘油三酯浓度。如图2中所显示，高脂肪饮食组的肝内甘油三酯浓度是172.3mg/g，其比低脂肪饮食组(114.0mg/g)更高，但是用3nmol/kg的长效毒蜥外泌肽-4衍生物处理的高脂肪饮食组显示93mg/g的甘油三酯水平，与高脂肪饮食组相比显示46％的下降。这些结果提示本发明的长效毒蜥外泌肽-4衍生物对非酒精性脂肪肝疾病的具有疗效。
<110>韩美科学株式会社
<120>用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病的药学组合物
<130> OPA13019
<150> KR 10-2012-0024632
<151> 2012-03-09
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223> GLP-1
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Pro Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽-3
<400> 2
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽-4
<400> 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35

Claims (15)

1.促胰岛素释放肽药物缀合物在制备用于治疗非酒精性脂肪肝疾病的药物中的用途，在所述促胰岛素释放肽药物缀合物中促胰岛素释放肽经非肽基聚合物共价连接至免疫球蛋白Fc区，
其中所述促胰岛素释放肽选自毒蜥外泌肽-4、通过缺失毒蜥外泌肽-4的N-末端胺基团制备的毒蜥外泌肽-4衍生物、通过用羟基基团取代毒蜥外泌肽-4的N-末端胺基团制备的毒蜥外泌肽-4衍生物、通过用二甲基修饰毒蜥外泌肽-4的N-末端胺基团制备的毒蜥外泌肽-4衍生物，和通过缺失毒蜥外泌肽-4的N-末端组氨酸残基的α-碳和与所述α-碳连接的N-末端胺基团制备的毒蜥外泌肽-4衍生物，
并且所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和其组合，
所述非肽基聚合物连接至所述促胰岛素释放肽的第27位赖氨酸残基，和
所述非酒精性脂肪肝疾病选自单纯脂肪变性、营养不良或饥饿造成的脂肪肝疾病、肝纤维化和肝硬化。
2.根据权利要求1所述用途，其中所述免疫球蛋白Fc区和所述促胰岛素释放肽的胺基团或硫羟基团分别连接至所述非肽基聚合物的两个末端。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述免疫球蛋白Fc区是无糖基化的。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的一至四个结构域组成。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包括铰链区。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述免疫球蛋白Fc区是源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的Fc区。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述免疫球蛋白Fc区是人非糖基化的IgG4 Fc区。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述非肽基聚合物的反应基团选自乙醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺衍生物。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述琥珀酰亚胺衍生物选自琥珀酰亚胺基丙酸、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟基琥珀酰亚胺基、和琥珀酰亚胺基碳酸酯。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述非肽基聚合物在其两个末端具有反应性醛基。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述促胰岛素释放肽药物缀合物增加调节参与脂分解的酶活性的PKC-ζ(蛋白质激酶C-ζ)的活性。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述促胰岛素释放肽药物缀合物增加参与脂分解的Glut2(葡萄糖载体蛋白质-2)的表达。
15.根据权利要求1所述的用途，其中所述促胰岛素释放肽是4-咪唑并乙酰基毒蜥外泌肽-4，并且所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE042585T2 (hu) 2011-06-17 2019-07-29 Hanmi Science Co Ltd Oxintomodulint és immunglobulin-fragmentumot tartalmazó konjugátum és alkalmazása
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
SG10201602801YA (en) 2012-11-06 2016-05-30 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
EP3098235A4 (en) 2014-01-20 2017-10-18 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting insulin and use thereof
AR100639A1 (es) * 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
CN108136276B (zh) * 2015-09-24 2023-02-28 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物
BR112019005637A2 (pt) 2016-09-23 2019-07-30 Hanmi Pharm Ind Co Ltd análogos da insulina com afinidade reduzida para o receptor de insulina e seu uso
KR101906333B1 (ko) 2016-12-07 2018-10-11 고려대학교 산학협력단 지방간의 진단 또는 치료를 위한 류신 지퍼 단백질의 용도
KR101964743B1 (ko) 2017-01-19 2019-08-14 울산대학교 산학협력단 Gnpat을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 또는 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물
US11752216B2 (en) 2017-03-23 2023-09-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
CN109248323B (zh) * 2017-07-14 2023-09-08 杭州先为达生物科技有限公司 酰化的glp-1衍生物
EP3437651A1 (en) * 2017-08-03 2019-02-06 Université de Strasbourg Peptides for treatment and prevention of nonalcoholic fatty liver disease
KR102174436B1 (ko) * 2017-08-17 2020-11-04 주식회사 엘지화학 불용성 안료 화합물의 정성분석방법
EP3823659A4 (en) 2018-07-19 2022-06-22 D&D Pharmatech Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH A POLYPEPTIDE
KR20200135618A (ko) 2019-05-23 2020-12-03 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR102177304B1 (ko) * 2018-07-23 2020-11-10 제이투에이치바이오텍 (주) 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN110151980B (zh) * 2019-06-30 2022-12-09 中国药科大学 Glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂药物中的应用
KR102315866B1 (ko) * 2020-03-24 2021-10-21 한국원자력의학원 섬유화 질환 복합 치료제 개발

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101646451A (zh) * 2007-01-05 2010-02-10 韩美药品工业株式会社 使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物
CN101878036A (zh) * 2007-11-29 2010-11-03 韩美药品工业株式会社 包含促胰岛素释放肽缀合物的治疗肥胖相关疾病的药物组合物

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
US5424686A (en) 1994-04-20 1995-06-13 Philips Electronics North America Corporation Negative-resistance-compensated microwave buffer
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US8263084B2 (en) * 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
BRPI0416933A (pt) * 2003-11-25 2007-01-16 Novo Nordisk As composto, composição farmacêutica, método para tratar uma doença, uso de um composto, e, métodos para aumentar a respiração mitocondrial em um paciente, e para reduzir a quantidade de espécies de oxigênio reativas em um paciente
WO2007022518A2 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. New uses of glucoregulatory proteins
US20100033010A1 (en) * 2007-03-06 2010-02-11 Bridgestone Corporation Rubber track
US8326420B2 (en) * 2008-07-11 2012-12-04 Medtronic, Inc. Associating therapy adjustments with posture states using stability timers
WO2010011096A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
EP2248449A1 (en) * 2009-05-08 2010-11-10 Koninklijke Philips Electronics N.V. Kitchen appliance
WO2011109787A1 (en) * 2010-03-05 2011-09-09 Conjuchem, Llc Methods of administering insulinotropic peptides
KR101382593B1 (ko) * 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101646451A (zh) * 2007-01-05 2010-02-10 韩美药品工业株式会社 使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物
CN101878036A (zh) * 2007-11-29 2010-11-03 韩美药品工业株式会社 包含促胰岛素释放肽缀合物的治疗肥胖相关疾病的药物组合物

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