BR112015001593B1 - Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração e método para a preparação da dita formulação líquida - Google Patents

Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração e método para a preparação da dita formulação líquida Download PDF

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Abstract

formulação líquida de insulina e péptido insulinotrópico de longa atuação. a presente invenção diz respeito a uma formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa atuação, a qual compreende insulina que é um peptídeo fisiologicamente ativo, peptídeo insulinotrópico, estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e uma agente isotônico; e a um método para a preparação da formulação líquida. a formulação líquida da presente invenção não contém albumina do soro humano e fatores potencialmente tóxicos para o corpo, pelo que apresenta uma excelente estabilidade ao armazenamento para o conjugado de insulina e o conjugado de peptídeo insulinotrópico a concentrações elevadas, sem apresentar o risco de contaminação viral.

Description

[001] A presente invenção diz respeito a uma formulação líquida de uma combinação de insulina e peptídeo insulinotrópico de longa duração, a qual compreende insulina e peptídeo insulinotrópico que são peptídeos fisiologicamente ativos, e estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e uma agente isotônico; e a um método para a preparação da formulação líquida.
TÉCNICA ANTERIOR
[002] A insulina é um peptídeo secretado por células beta pancreáticas e desempenha um papel central no controle da glicose no sangue no corpo. Caso a quantidade de insulina segregada seja deficitária ou caso a insulina segregada não atue adequadamente no corpo, então o nível de glicose no sangue será elevado, provocando uma doença metabólica designada por diabetes. Quando a insulina não é segregada adequadamente ou quando não funciona adequadamente no corpo, em nível de glicose no corpo é aumentado sem regulação e este tipo de diabetes é designado por diabetes de tipo II. A diabetes de tipo I é causada quando o pâncreas não produz insulina suficiente para regular o aumento de glicose no sangue. A diabetes de tipo II é normalmente tratada através da administração de agentes hipoglicêmicos orais que são constituídos, principalmente, por compostos químicos, sendo, por vezes, possível administrar insulina a alguns dos pacientes. Por outro lado, para o tratamento de diabetes de tipo I, a administração de insulina é essencial.
[003] O tratamento de insulina amplamente utilizado consiste em uma injeção de insulina antes e após as refeições. A insulina encontra-se disponível comercialmente em uma formulação para injeção parenteral, que é administrada por via subcutânea em princípio, e, dependendo da duração do tratamento, o método de administração pode ser diferente. A administração de insulina por injeção é mais eficaz na redução do nível de glicose no sangue em comparação com a medicina oral, e pode ser aplicada em segurança em situações em que o fármaco oral não pode ser utilizado. Além disso, a injeção por via parenteral de insulina não possui um limite de dose, no entanto, uma vez que tem de ser administrada continuamente três vezes ao dia, esta presenta desvantagens tais como provocar uma aversão a agulhas, um método de administração difícil, sintomas de hipoglicemia e sintomas de aumento de peso devido a administração prolongada de insulina. Em particular, o aumento de peso faz aumentar o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares e pode perturbar a função regulatória do corpo quanto ao nível de glicose no sangue. Entretanto, têm vindo a ser feitas tentativas para maximizar o efeito terapêutico de um fármaco peptídico de insulina que mantenha um nível elevado de fármaco durante um período de tempo longo, após a administração do fármaco ao corpo. Assim sendo, foi desenvolvida, produzida e comercializada uma insulina de longa duração. Como exemplos de tais fármacos de longa duração refere-se Lantus (insulina-glargina; Sanofi Aventis) e Levemir (insulina-detemir; Novo Nordisk). Ao contrário da insulina Hagedorn protamina neutral (NPH), os fármacos de longa duração apresentam um risco inferior de hipoglicemia durante o estado hipnoidal. Em particular, o Levemir alivia o sintoma do aumento de peso. No entanto, o método de administração que envolve uma ou duas injeções por dia permanece como desvantagem.
[004] Entretanto, um peptídeo 1 de tipo glucagon (GLP-1), que é um tipo de peptídeo insulinotrópico, é uma hormônio de incretina segregada a partir de células L do íleo e do intestino grosso. A função principal de GLP-1 é aumentar a secreção de insulina para estabelecer uma secreção de insulina dependente de glicose no corpo, prevenindo assim uma hipoglicemia. Com este efeito, o GLP-1 pode ser aplicado para tratar a diabetes de tipo 2. No entanto, visto que o período de meia-vida no soro de GLP-1 é tão curto como 2 minutos, este possui uma elevada limitação para ser desenvolvido em um fármaco. Assim sendo, foi desenvolvido e produzido um novo agonista de GLP-1, designado por exendina- 4. A exendina-4 é um agonista de GLP-1 produzida na glândula salivar do monstro-de-gila. Além do mais, a exendina-4 é resistente a dipeptidil-peptidase- 4 (DPP-IV) e possui uma atividade fisiológica superior à de GLP-1. Assim, a exendina-4 possui um período de meia-vida com uma duração de 2 a 4 horas no corpo, que é bastante mais longo do que o período de GLP-1 (registo de patentes norte-americanas No. US 5 424 286). No entanto, uma duração suficiente de atividade fisiológica do fármaco não pode ser alcançada meramente pelo aumento de resistência contra DPPIV. Por exemplo, a exendina-4 usualmente disponível (exenatida) tem de ser administrada duas vezes ao dia ao paciente por injeção, apresentando ainda as desvantagens de provocar vômitos e náuseas.
[005] Assim sendo, como método para manter a atividade do fármaco proteico e melhorar a sua estabilidade no corpo e simultaneamente para se resolver os problemas supramencionados, as presentes requerentes sugeriram anteriormente o desenvolvimento de um conjugado de proteína de longa duração por ligação de um polipeptídio fisiologicamente ativo conhecido a uma região Fc de imunoglobulina através de ligação covalente, utilizando um polímero não peptídico como ligador (linker) (registo de patentes de invenção coreanas No. 10-0725315). Em particular, confirmou-se previamente que cada conjugado de insulina de longa duração e conjugado de exendina-4 de longa duração tinha aumentado notavelmente a durabilidade in vivo (registo de patentes de invenção coreanas No. 10-1058290 e publicação No. 10-2011-0134210). No entanto, caso seja administrada uma quantidade terapeuticamente eficaz de insulina ou de exendina-4 para manter um nível estável de glicose no sangue; então tal pode provocar um aumento de peso ou sintomas de vómito e de náuseas. Assim sendo, existe uma grande procura pelo desenvolvimento de um método terapêutico que possam reduzir a dosagem de fármaco e frequência, proporcionando um excelente efeito terapêutico para a diabetes.
DESCRIÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[006] Perante estes antecedentes, para se tentar proporcionar uma formulação líquida estável de uma combinação de um conjugado de insulina de longa duração e um conjugado de um peptídeo insulinotrópico de longa duração, a qual possa armazenar a combinação dos dois conjugados sem apresentar um risco de contaminação viral para um período de tempo alargado, as requerentes da presente invenção aumentaram a estabilidade da combinação dos dois conjugados por meio da utilização de um estabilizador que compreende um tampão, um álcool de açúcar, cloreto de sódio como agente isotônico, e um tensoativo não iônico, e desenvolveram uma formulação líquida estável e eficaz em termos custos, completando assim a presente invenção.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[007] Um objeto da presente invenção consiste em proporcionar uma formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, a qual compreende insulina e peptídeo insulinotrópico que são peptídeos fisiologicamente ativos, e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e um agente isotônico.
[008] Outro objeto da presente invenção consiste em proporcionar um método para a preparação da formulação líquida.
[009] Outro objeto da presente invenção consiste em proporcionar uma composição farmacêutica para a prevenção ou para o tratamento de diabetes, a qual compreende insulina e um peptídeo insulinotrópico.
[010] Outro objeto da presente invenção consiste em proporcionar um método para o tratamento de diabetes, o qual compreende a administração da composição a um sujeito que sofra de diabetes.
EFEITOS VANTAJOSOS
[011] A combinação de um conjugado de insulina de longa duração e um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração da presente invenção apresenta um excelente efeito terapêutico para o tratamento de diabetes. Além do mais, uma formulação líquida de uma combinação de um conjugado de insulina de longa duração e um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração da presente invenção compreende um estabilizador que compreende um tampão, um álcool de açúcar, um agente isotônico e um tensoativo não iônico, mas não contém albumina do soro de humano e outros fatores potencialmente tóxicos para o corpo, pelo que não apresenta assim um risco de contaminação viral. Além disso, a formulação líquida proporciona uma excelente estabilidade ao armazenamento para o conjugado de insulina de longa duração e para o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração que apresentam um pelo molecular superior e uma durabilidade in vivo aumentada em comparação com a forma nativa, visto ser constituída por insulina ou peptídeo insulinotrópico e pela região Fc de imunoglobulina. Em particular, a presente invenção proporciona uma formulação líquida estável para uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração. Tal formulação líquida da presente invenção é uma formulação simples que proporciona uma excelente estabilidade ao armazenamento, sendo assim mais eficaz em termos de custos quando comparada com outras formulações com estabilizadores ou liofilizadas. Além disso, a presente formulação líquida pode manter a atividade da proteína no corpo durante um longo período de tempo, em comparação com outras formulações convencionais de insulina e peptídeo insulinotrópico, podendo assim ser utilizada como uma formulação de fármaco eficaz.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[012] A figura 1 mostra os resultados da monitorização da geração de precipitação para as formulações de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração preparadas nas composições da tabela 3, a 40°C durante 1 semana.
[013] A figura 2 mostra os resultados da análise por IE-HPLC do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico, os quais foram preparados nas composições da tabela 4 e armazenados a 40°C durante 4 semanas.
[014] A figura 3 mostra os resultados da análise por RP-HPLC do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico, os quais foram preparados nas composições da tabela 4 e armazenados a 40°C durante 4 semanas.
[015] A figura 4 mostra os resultados da monitorização da geração de precipitação de proteína em cada uma das formulações combinadas com composições diferentes, comparativamente com uma formulação em separado.
MELHOR FORMA DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[016] Um aspecto da presente invenção proporciona uma formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, a qual compreende insulina e o peptídeo insulinotrópico, os quais são peptídeos fisiologicamente ativos, e um estabilizador isento e albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e um agente isotônico. A formulação líquida da presente invenção é caracterizada pelo fato de a insulina e o peptídeo insulinotrópico serem coadministrados.
[017] A insulina pode estar compreendida em uma formulação líquida sob a forma de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um conjugado de insulina de longa duração, em que a insulina está ligada a uma região Fc de imunoglobulina. O peptídeo insulinotrópico pode estar compreendido em uma formulação líquida sob a forma de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, em que o peptídeo insulinotrópico está ligado a uma região Fc de imunoglobulina.
[018] Tal como aqui utilizada, a expressão “conjugado de insulina de longa duração" designa um conjugado em que uma insulina fisiologicamente ativa, a qual inclui derivados, variantes, precursores e fragmentos, é ligada a uma região Fc de imunoglobulina, e pode designar um conjugado que tem uma duração in vivo aumentada da atividade fisiológica quando comparado com a insulina nativa. Tal como aqui utilizado, um “conjugado de insulina de longa duração” designa a insulina ligada com uma região Fc de imunoglobulina através de um ligador não peptídico ou um ligador peptídico. Tal como aqui utilizada, a expressão “conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração” designa um conjugado, em que um peptídeo insulinotrópico fisiologicamente ativo, que inclui um derivado, uma variante, um precursor e um fragmento, é ligado com uma região Fc de imunoglobulina e pode designar um conjugado que tem uma duração in vivo aumentada da atividade fisiológica em comparação com a do peptídeo insulinotrópico nativo.
[019] Tal com aqui utilizado, um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração designa o peptídeo insulinotrópico ligado a uma região Fc de imunoglobulina através de um ligador não peptídico ou um ligador peptídico.
[020] Tal como aqui utilizado, o termo “de longa duração” designa um aumento da duração da atividade fisiológica em comparação com a de um peptídeo nativo. O termo “conjugado” designa uma forma do peptídeo, em que a insulina ou o peptídeo insulinotrópico está ligado com uma região Fc de imunoglobulina.
[021] O conjugado de insulina de longa duração ou conjugado de peptídeo insulinotrópico da presente invenção tem um efeito com uma durabilidade aumentada em comparação com a da insulina nativa ou do peptídeo insulinotrópico nativo. O tipo do conjugado de insulina de longa duração ou conjugado de peptídeo insulinotrópico inclui uma forma de insulina ou de peptídeo insulinotrópico gerada por modificação, substituição, adição ou deleção de aminoácidos a partir de uma insulina nativa ou de um peptídeo insulinotrópico nativo; um conjugado em que a insulina ou o peptídeo insulinotrópico está ligado com um polímero biodegradável, tal como PEG; um conjugado em que a insulina ou o peptídeo insulinotrópico está ligado com uma proteína com uma elevada durabilidade, tal como albumina ou imunoglobulina; um conjugado em que a insulina ou o peptídeo insulinotrópico está ligado com um ácido gordo que tem uma afinidade de ligação co-albumina no corpo; ou uma forma de insulina ou de peptídeo insulinotrópico que é coberta com uma nanopartícula biodegradável, embora não seja limitada a estas.
[022] O conjugado de insulina ou de peptídeo insulinotrópico de longa duração utilizado na presente invenção é preparado por ligação da insulina ou do peptídeo sintetizado com uma região Fc de imunoglobulina. O método para a ligação dos dois pode ser a reticulação de insulina ou do peptídeo insulinotrópico com uma região Fc de imunoglobulina através de um polímero não peptídico ou através da produção de uma proteína de fusão na qual a insulina ou o peptídeo insulinotrópico e uma região Fc de imunoglobulina são ligados por recombinação genética.
[023] Tal como aqui utilizado, o termo “insulina” designa um peptídeo que é secretado pelo pâncreas em resposta a níveis elevados de glicose no sangue no corpo para transportar a glicose para o fígado, músculos ou tecido adiposo, transformá-la em glicogênio e interromper a utilização de gordura como fonte de energia, funcionando assim para controlar a glicose no sangue. Este peptídeo inclui insulina nativa, insulina basal, bem como os seus agonistas, precursores, derivados, fragmentos e variantes.
[024] Tal como aqui utilizada, a expressão “insulina nativa” é um hormônio que é secretado pelo pâncreas para promover a absorção de glicose, mas que inibe a quebra de gordura nas células, funcionando assim como controle do nível de glicose no sangue. A insulina é gerada através do processamento do seu precursor, proinsulina, que não tem uma função de regulação do nível de glicose no sangue. As sequências de aminoácidos de insulina são as seguintes:
[025] Cadeia alfa:
[026] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu- Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO. 1)
[027] Cadeia beta:
[028] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr- Leu-Val-Cys-Gly- Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO. 2)
[029] Tal como aqui utilizado, a “insulina basal” diz respeito a um peptídeo regulador das alterações do nível normal de glicose no sangue durante cada dia, e como exemplos de tais peptídeos refere-se levemir, lantus e degludec. Tal como aqui utilizado, “agonista de insulina” designa um composto que se liga ao receptor intrínseco de insulina, apresentando a mesma atividade biológica que a insulina, independentemente de diferenças estruturais com insulina. Tal como aqui utilizado, o termo “variante de insulina” designa um peptídeo que possui uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes em relação à insulina nativa, a qual possui uma função de regulação do nível de glicose no sangue no corpo. O derivado de insulina pode ser preparado por meio de uma ação de substituição adição, supressão e modificação de alguns aminoácidos a partir da insulina nativa ou de uma sua combinação. Tal como aqui utilizado, um “derivado de insulina” designa um peptídeo que possui pelo menos 80% de homologia de sequência de aminoácidos com a insulina nativa, que pode ter alguns grupos no resíduo de aminoácidos substituído (v.g., alfa-metilação, alfa-hidroxilação), suprimido (v.g., desaminação) ou modificado (e.g., N-metilação) quimicamente, e possui uma função de regulação do nível de glicose no sangue no corpo. Tal como aqui utilizado, o termo “fragmento de insulina” designa um fragmento que possui um ou mais aminoácidos adicionados ou suprimidos no terminal N ou no terminal C da insulina nativa, em que é possível adicionar aminoácidos que não ocorrem naturalmente (v.g., aminoácido de tipo D). O fragmento de insulina possui uma função de regulação do nível de glicose no sangue no corpo.
[030] Cada um dos métodos utilizados para a preparação dos agonistas, derivados, fragmentos e variantes de insulina pode ser aplicado individualmente ou em combinação. Por exemplo, o âmbito da presente invenção compreende um peptídeo que tenha uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes daqueles do peptídeo nativo e que tenha o resíduo aminoácido do terminal N desaminado, embora apresentando ainda uma função de regulação do nível de glicose no corpo.
[031] A insulina utilizada na presente invenção pode ser produzida através de uma tecnologia de recombinação ou sintetizada através de uma síntese em fase sólida. Além disso, a insulina utilizada na presente invenção pode estar ligada com um polímero não peptídico. Tal polímero não peptídico pode ser utilizado como ligador na presente invenção. Através da ligação de insulina com um polímero não peptídico como ligador, a estabilidade da insulina pode ser melhorada, mantendo a sua atividade. É possível aplicar um peptídeo como ligador através da utilização de uma técnica de recombinação genética.
[032] Tal como aqui utilizado, o termo “polímero não peptídico” designa um polímero biocompatível constituído por uma ou mais unidades de repetição, em que as unidades de repetição estão ligadas entre si através de um tipo qualquer de ligação covalente, mas não por uma ligação peptídica. Na presente invenção, o “polímero não peptídico” pode ser utilizado de um modo inter-permutável com o termo “ligador não peptídico”.
[033] O polímero não peptídico que é possível utilizar na presente invenção é selecionado entre o conjunto constituído por polímeros biodegradáveis, tais como polietileno-glicol, polipropileno-glicol, copolímeros de etileno-glicol e propileno-glicol, polióis polioxietilados, álcool polivinílico, polissacáridos, dextrano, éter polivinil-etílico, ácido poliláctico (PLA) e ácido poliláctico-glicólico (PLGA); polímeros de lipídeos; quitinas; ácido hialurônico; e uma sua combinação. De preferência, utiliza-se polietileno-glicol como polímero não peptídico. O âmbito da presente invenção também compreende os seus derivados que são bem conhecidos na especialidade e os derivados que possam ser facilmente preparados utilizando as técnicas disponíveis na especialidade.
[034] O ligador peptídico utilizado em uma proteína de fusão, a qual é preparada por um método de fusão na moldura convencional, tem uma limitação que consiste no fato de poder ser facilmente clivado por meio de uma protease no corpo, pelo que não pode assim aumentar o período de meia-vida do fármaco ativo no soro tanto como no caso da utilização de um veículo. No entanto, na presente invenção, o período de meia-vida no soro do peptídeo pode ser mantido em um nível semelhante ao do caso em que um veículo é utilizado, por meio da utilização de um polímero resistente a protease. Assim sendo, o polímero não peptídico que é possível utilizar na presente invenção inclui qualquer tipo de polímeros não peptídico, desde que tenha a função supramencionada, isto é, que seja resistente a protease. O polímero não peptídico possui um peso molecular compreendido entre 1 e 100 kDa e, de preferência, entre 1 e 20 kDa. Além disso, o polímero não peptídico da presente invenção, o qual está ligado a uma região Fc de imunoglobulina, pode ser um tipo individual de polímeros ou uma combinação de tipos diferentes de polímeros.
[035] O polímero não peptídico utilizado na presente invenção pode ter um grupo funciona que pode estar ligado a uma região Fc de imunoglobulina e a um fármaco proteico. Os grupos funcionais do polímero não peptídico em ambos os terminais são preferencialmente selecionados entre o conjunto constituído por um grupo aldeído reativo, um grupo propionaldeído, um grupo butil-aldeído, um grupo maleimida e um derivado de succinimida. O derivado de succinimida pode ser propionato de succinimidilo, hidroxi-succinimidilo, carboximetil-succinimidilo ou carbonato de succinimidilo. Em particular, quando o polímero não peptídico tem grupos aldeído reativos em ambos os terminais, tal pode minimizar as ligações não específicas e pode tornar efetiva a ligação do polímero não peptídico com um polipeptídio fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina, em cada extremidade. Um produto final gerado por alquilação redutiva que forme uma ligação aldeído é muito mais estável do que aqueles ligados por uma ligação amida. Um grupo funcional aldeído liga-se seletivamente ao terminal N a pH baixo e forma uma ligação covalente com um resíduo lina a pH elevado, por exemplo, a um valor de pH de 9,0.
[036] Os grupos funcionais nos dois terminais do polímero não peptídico podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptídico pode ter um grupo maleimida em um terminal e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butil-aldeído no outro terminal. Quando se utiliza um polietileno-glicol com um grupo hidroxi em ambos os terminais como polímero não peptídico, o grupo hidroxi pode ser ativado para vários grupo funcionais por reações químicas conhecidas ou então pode ser utilizado um polietileno-glicol comercialmente disponível com um grupo funcional modificado para preparar o conjugado de insulina de longa duração da presente invenção.
[037] De preferência, o polímero não peptídico pode estar ligado ao terminal N da cadeia beta de insulina.
[038] A insulina da presente invenção pode ser modificada com um polímero não peptídico.
[039] Quando se desenvolve um conjugado de insulina de longa duração utilizando um fragmento de imunoglobulina, caso um polipeptídio fisiologicamente ativo seja modificado com PEG para aumentar a durabilidade do fármaco sem causar hipoglicemia, então tal pode reduzir o título. No entanto, a redução do título constitui uma vantagem do conjugado de insulina de longa duração e, assim, a insulina modificada com PEG pode ser combinada com uma região Fc de imunoglobulina através de um polímero não peptídico. O tipo polímero não peptídico que é possível utilizar em modificações de insulina é idêntico ao descrito antes e, de preferência, é polietileno-glicol (PEG). Na insulina modificada com PEG, o PEG é seletivamente ligado ao terminal N da cadeia alfa de insulina ou a um resíduo específico da cadeia beta. Um PEG que modifica a insulina compreende, de preferência, um grupo aldeído ou um grupo succinilo no terminal e, mais preferencialmente, um grupo succinilo.
[040] O método de preparação e o efeito do conjugado de insulina de longa duração da invenção encontram-se descritos nas publicações de patentes de invenção coreanas nos. 10-2011-0134210, 10-2011-0134209 e 10-20110111267. Os especialistas na matéria podem preparar o conjugado de insulina de longa duração utilizado na presente invenção consultando estas referências. Além disso, as requerentes da presente invenção descobriram anteriormente um método para a preparação do conjugado de insulina de longa duração por mono- PEGilação do terminal N da região Fc de imunoglobulina, ligando este à primeira fenilalanina da cadeia beta de insulina.
[041] Tal como aqui utilizado, o termo “peptídeo insulinotrópico” designa umas propriedades que tem a função de segregar insulina e que pode estimular a síntese ou expressão de insulina em células β pancreáticas. De preferência, o peptídeo insulinotrópico é um peptídeo 1 de tipo glucagon (GLP-1), GLP-2, exendina-3 ou exendina-4, mas não é limitado a estes. O peptídeo insulinotrópico inclui um peptídeo insulinotrópico nativo, bem como os seus precursores, agonistas, derivados, fragmentos e variantes.
[042] Um derivado do peptídeo insulinotrópico da presente invenção pode designar um derivado gerado por supressão do grupo amino do terminal N (ou grupo amina) do peptídeo insulinotrópico (isto é, derivado desamino-histidilo); um derivado gerado por substituição de um grupo amino do peptídeo insulinotrópico por um grupo hidroxilo (isto é, derivado beta-hidroxi- imidazopropionilo); um derivado gerado por modificação do grupo amino do peptídeo insulinotrópico com dois grupos metilo (isto é, derivados dimetil- histidilo); um derivado gerado por substituição do grupo amino do terminal N do peptídeo insulinotrópico por um grupo carboxilo (isto é, derivado betacarboxi- imidazopropionilo); ou um derivado gerado por remoção da carga positiva do grupo amino do peptídeo insulinotrópico por supressão do carbono alfa do resíduo histidina no terminal N, deixando apenas um grupo imidazoacetilo (derivado imidazoacetilo). Além disso, o âmbito da presente invenção inclui outras formas de derivados com modificações no grupo amino do terminal N.
[043] Na presente invenção, o derivado do peptídeo insulinotrópico é, de preferência, um derivado gerado por modificação química do grupo amino do terminal N ou do resíduo aminoácido de exendina-4 e, mais preferencialmente, um derivado de exendina-4 em que o grupo amino alfa ou o grupo carbono alfa presente no carbono alfa do resíduo histidina, que é o primeiro aminoácido do terminal N de exendina-4, é substituído ou suprimido. Ainda mais preferencialmente, o derivado de peptídeo insulinotrópico é uma desamino- histidilexendina-4 (DA-exendina-4) que é gerada por supressão do grupo amino no terminal N de exendina-4; uma beta-hidroxi-imidazopropionil-exendina-4 (HY- exendin-4) que é gerada por substituição de exendina-4 por um grupo hidroxilo ou um grupo carboxilo; uma beta-carboxiimidazopropionil-exendina-4 (CX- exendina-4); uma dimetil-histidil-exendina-4 (DM-exendin-4) que é gerada por modificação de exendina-4 com dois grupos metilo; ou uma imidazoacetil- exendina-4 (CA-exendina-4) que é gerada por supressão do carbono alfa do resíduo histidina no terminal N.
[044] O GLP-1 é um hormônio segregada pelo intestino delgado e atua normalmente para estimular a biossíntese e secreção de insulina, suprime a secreção de glucagon e promove a absorção de glicose para dentro da célula. Um precursor de glucagon no intestino delgado é degradado em três peptídeos, que são glucagon, GLP-1 e GLP-2. Aqui, o GLP-1 designa GLP-1 (1-37) que não tem uma função para segregar insulina, mas quando é processado para formar o GLP-1 (7-37), este fica ativo. A sequência de aminoácidos de GLP-1 (7-37) é a seguinte: GLP-1(7-37): HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (SEQ ID No.3)
[045] Tal como aqui utilizado, o termo “derivado de GLP-1" designa um peptídeo que possui pelo menos 80% de homologia de sequência com o GLP-1 nativo e pode ser uma forma quimicamente modificada, demonstrando em simultâneo pelo menos a mesma atividade de secreção de insulina ou uma atividade melhorada. Tal como aqui utilizado, o termo “fragmento de GLP-1" designa uma forma de peptídeo em que um ou mais aminoácidos são adicionados ou suprimidos no terminal N ou no terminal C do GLP-1 nativo, em que os aminoácidos adicionados podem ser aminoácidos que não ocorrem naturalmente (v.g., aminoácido de tipo D). Tal como aqui utilizado, o termo “conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração” designa o peptídeo que possui uma durabilidade aumentada dos efeitos quando comparado com o peptídeo insulinotrópico nativo. O conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração pode estar em uma forma em que um aminoácido do peptídeo insulinotrópico nativo é modificado, substituído, adicionado ou suprimido; uma forma de conjugado em que a insulina está ligada a um polímero biodegradável, tal como PEG; uma forma de conjugado em que a insulina está ligada a uma proteína que possui uma elevada durabilidade, tal como albumina, imunoglobulina, e um seu fragmento; uma forma de conjugado em que o peptídeo insulinotrópico está ligado a um ácido gordo que possui uma afinidade de ligação com albumina no corpo; ou uma forma de peptídeo insulinotrópico que está coberto com nanopartículas biodegradáveis, embora o tipo de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração não esteja limitado à presente invenção.
[046] Tal como aqui utilizado, o termo “variante de GLP-1” designa um pt que possui uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes do GLP-1 nativo e que possui a função de segregar insulina.
[047] A exendina-3 e a exendina-4 são o peptídeo insulinotrópico constituído por 39 aminoácidos, que possui 53% de homologia de sequência de aminoácidos com o GLP-1. As sequências de aminoácidos de exendina-3 e de exendina-4 são a seguir apresentadas: Exendina-3: HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID No. 4) Exendina-4: HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID No. 5)
[048] O agonista de exendina designa uma substância que tem a mesma bioatividade que exendina por ligação ao receptor de exendina in vivo, independentemente da sua semelhança estrutural com exendina. Um derivado de exendina designa um peptídeo que apresenta pelo menos 80% de homologia de sequência com exendina nativa e pode ter alguns grupos de resíduos aminoácidos substituídos (v.g., alfa-metilação e alfa-hidroxilação), suprimidos (v.g., desaminação) ou modificados (v.g., N-metilação) quimicamente, e esse derivado de exendina tem uma função de segregar insulina.
[049] O fragmento de exendina designa uma forma de peptídeo em que um ou mais aminoácidos são adicionados ou suprimidos no terminal N ou no terminal C de exendina nativa, em que é possível adicionar aminoácidos que não ocorrem naturalmente (v.g., aminoácido de tipo D) e tal fragmento de exendina tem uma função de segregar insulina.
[050] A variante de exendina é um peptídeo que tem uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes da exendina nativa e tem uma função de segregar insulina. A variante de exendina compreende um peptídeo gerado pela substituição do 12° aminoácido de exendina-4, lisina, por serina ou arginina. É possível utilizar método para a preparação de cada agonista, derivado, fragmento e variante de exendina, individualmente ou em combinação. Por exemplo, o âmbito do peptídeo insulinotrópico compreende o peptídeo insulinotrópico que tem uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes do peptídeo nativo e o resíduo aminoácido do terminal N desaminado. O peptídeo insulinotrópico nativo e o peptídeo insulinotrópico modificado utilizados na presente invenção podem ser sintetizados por meio de uma síntese em fase sólida. Além disso, a maioria dos peptídeos nativos, incluindo peptídeos insulinotrópico nativos, podem ser produzidos por um método de recombinação.
[051] O conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração utilizado na presente invenção tem uma forma de um peptídeo insulinotrópico ligado a um fragmento de imunoglobulina, tal como Fc de imunoglobulina, através de um ligador não peptídico ou de um ligador peptídico, utilizando uma técnica de recombinação genética. O ligador não peptídico é o mesmo que o anteriormente descrito. O conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração é preparado utilizando um fragmento de imunoglobulina tal como para o conjugado de insulina de longa duração. O conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração mantém a atividade fisiológica do peptídeo insulinotrópico existente, tal como a promoção da síntese e da secreção de insulina, a supressão do apetite, a indução de perda de peso, o aumento da sensibilidade das células beta face à glicose no soro, a promoção a proliferação de células beta, o atraso do esvaziamento gástrico e a supressão de glucagon, e tem ainda uma durabilidade in vivo aumentada dos efeitos devido ao aumento do período de meia-vida no soro do peptídeo insulinotrópico. Assim, o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração é eficaz no tratamento de diabetes e de obesidade.
[052] Para a preparação do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração utilizado na presente invenção, é possível referir as seguintes referências: registo de patente de invenção coreana No. 10-0725315, publicação de patente de invenção coreana No. 10-2009-0008151 e registo de patente de invenção coreana No. 10-1058290. Os especialistas na matéria podem preparar o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração utilizando na presente invenção em conformidade com as referências anteriores.
[053] Além do mais, as requerentes da presente invenção desenvolveram anteriormente um método para a preparação de um conjugado de exendina-4 de longa duração por ligação, em primeiro lugar, de PEG ao resíduo lisina (Lys) de imidazo-acetil-exendina-4 (CA exendin-4) e ligação de exendina-4 modificada com PEG a um Fc de imunoglobulina.
[054] A insulina e o peptídeo insulinotrópico utilizados na presente invenção são ligados com um veículo através de um polímero não peptídico como ligador. O veículo que é possível utilizar na presente invenção pode ser selecionado entre o conjunto constituído por uma região Fc de imunoglobulina, albumina, transferrina e PEG e é, de preferência, uma região Fc de imunoglobulina.
[055] Cada um dos conjugados de insulina de longa duração e conjugados de peptídeo insulinotrópico de longa duração da presente invenção tem a insulina ou o peptídeo insulinotrópico ligado à região Fc de imunoglobulina através de um ligador não peptídico, que tem durabilidade e estabilidade. Na presente invenção, o Fc de imunoglobulina pode ser utilizado de um modo inter- permutável com fragmento de imunoglobulina.
[056] Além disso, visto que a região Fc de imunoglobulina possui um peso molecular relativamente baixo em comparação com a molécula completa de imunoglobulina, a sua utilização pode ser benéfica para a preparação e purificação do conjugado, bem como para a obtenção de um elevado rendimento. Além do mais, a região Fc de imunoglobulina não contém um fragmento Fab, que é bastante heterogêneo devido a sequências de aminoácidos diferentes de acordo com as subclasses de anticorpos, pelo que poderá se esperado que a região Fc de imunoglobulina apresente uma homogeneidade aumentada e seja menos antigénica.
[057] Tal como aqui utilizada, a expressão “região Fc de imunoglobulina” designa uma proteína que contém a região constante 2 da cadeia pesada (CH2) e a região constante 3 da cadeia (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, a região constante 1 da cadeia pesada (CH1) e a região constante 1 da cadeia leve (CL1) da imunoglobulina. Pode ainda incluir uma região de dobra na região constante da cadeia pesada. Além disso, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode conter uma parte ou a totalidade da região Fc, incluindo a região constante 1 da cadeia pesada (CH1) e/ou a região constante 1 da cadeia leve (CL1), exceto para as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, desde que tenha uma função fisiológica substancialmente semelhante ou melhor do que a proteína nativa. Além disso, pode ser um fragmento que apresenta uma supressão em uma porção relativamente longa da sequência de aminoácidos de CH2 e/ou CH3. Isto é, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode compreender (1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, (2) um domínio CH1 e um domínio CH2, (3) um domínio CH1 e um domínio CH3, (4) um domínio CH2 e um domínio CH3, (5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região de dobra de imunoglobulina (ou uma porção da região de dobra), e (6) um dímero de cada domínio das regiões constantes da cadeia pesada e da região constante da cadeia leve.
[058] Além disso, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção inclui uma sequência de aminoácidos nativa e um seu derivado de sequência (mutante). Um derivado de sequência de aminoácidos tem uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos nativa devido a uma deleção, uma inserção, uma substituição não conservadora ou conservadora ou suas combinações, de um ou de mais resíduos aminoácidos. Por exemplo, em um Fc de IgG, os resíduos que se sabe que são importantes para ligação, nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, podem ser utilizados como um alvo adequado para modificação.
[059] Além disso, há diversos outros derivados possíveis, incluindo derivados que têm uma deleção de uma região capaz de formar uma ponte dissulfureto, uma supressão de diversos resíduos aminoácidos no terminal N de uma forma de Fc nativa ou uma adição do resíduo metionina ao terminal N de uma forma de Fc nativa. Além do mais, para se remover funções efetoras, pode ocorrer uma supressão em um local de ligação do complemento, tal como uma local e ligação de C1q e um local de citotoxicidade mediado por células dependente do anticorpo (ADCC). As técnicas para a preparação de tais derivados de sequência da região Fc de imunoglobulina encontram-se descritas nos documentos WO 97/34631 e WO 96/32478.
[060] As permutas de aminoácidos em proteínas e peptídeos, que não alteram normalmente a atividade das moléculas, são conhecidas na especialidade (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As permutas que ocorrem mais comummente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em ambas as direções. Se desejado, a região Fc pode ser modificada por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e semelhantes.
[061] Os derivados de Fc supramencionados são derivados que têm uma atividade biológica idêntica à da região Fc da presente invenção ou uma estabilidade estrutura melhorada, por exemplo, contra calor, pH ou semelhantes.
[062] Além do mais, tais regiões Fc podem ser obtidas a partir de formas nativas isoladas a partir de seres humanos ou de outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias, ou podem ser seus recombinantes ou derivados, obtidos a partir de células animais ou de microrganismos transformados. Neste caso, podem ser obtidos a partir de uma imunoglobulina nativa por isolamento de imunoglobulinas completas a partir de seres humanos ou de organismos animais e seu tratamento subsequente com uma enzima proteolítica. A papaína digere a imunoglobulina nativa em regiões Fab e Fc regiões, e o tratamento com pepsina resulta na produção de fragmentos pF’c e F(ab)2. Estes fragmentos podem ser submetidos, por exemplo, a cromatografia de exclusão por tamanho para isolar Fc ou pF’c. De preferência, uma região Fc proveniente de humano é uma região Fc imunoglobulina recombinante que é obtida a partir de um microrganismo.
[063] Além do mais, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode estar na forma de ter cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas em comparação com uma forma nativa ou cadeias de açúcar reduzidas em comparação com a forma nativa, ou podem estar em uma forma deglicosilada. O aumento, diminuição ou remoção das cadeias de açúcar de Fc de imunoglobulina Fc pode ser efetuado por métodos habituais na especialidade, tais como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética utilizando um microrganismo. A remoção de cadeias de açúcar a partir de uma região Fc resulta em uma diminuição acentuada na afinidade de ligação ao completo (c1q) e em uma diminuição ou perda na citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo ou citotoxicidade dependente do complemento, não induzindo assim trespostas imunes desnecessárias in vivo. A este respeito, uma região Fc de imunoglobulina em uma forma deglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada para o objeto da presente invenção como veículo de fármaco.
[064] O termo “deglicosilação”, tal como aqui utilizado, designa remover enzimaticamente resíduos açúcar a partir de uma região Fc e o termo “aglicosilação” designa que uma região Fc é produzida de uma forma não glicosilada por um procariota, de preferência E. coli.
[065] Entretanto, a região Fc de imunoglobulina pode ser proveniente de humanos ou de animais, tais como vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsters, ratos, cobaias e, de preferência, humanos.
[066] Além disso, a região Fc de imunoglobulina pode ser uma região Fc que é proveniente de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, ou que é feita por combinação ou um seu híbrido. De preferência, é proveniente de IgG ou IgM, que estão entre as proteínas mais abundantes no sague humano e, mais preferencialmente, proveniente de IgG, que se sabe que aumenta o período de meia-vida de proteínas de ligação a ligandos.
[067] O termo “combinação”, tal como aqui utilizado, significa que polipeptídios que codificam a região Fc de cadeia única de imunoglobulinas de uma mesma origem estão ligadas a um peptídeo de cadeia simples de uma origem diferente para formar um dímero ou multímero. Isto é, um dímero ou um multímero pode ser formado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados entre o conjunto constituído por fragmentos de Fc de IgG, Fc de IgA, fc de IgM, Fc de IgD Fc e Fc de IgE.
[068] O termo “híbrido”, tal como aqui utilizado, significa que estão presentes sequências que codificam duas ou mais regiões Fc de imunoglobulinas de origem diferente em uma Fc de cadeia individual de imunoglobulina. De acordo com a presente invenção, são possíveis diversos tipos de híbridos. Isto é, os domínios híbridos podem ser constituídos por um a quatro domínios selecionados entre o conjunto constituído por CH1, CH2, CH3 e CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE e Fc de IgD, e podem incluir a região da dobra.
[069] Por outro lado, a IgG é dividida nas subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e a presente invenção inclui suas combinações ou híbridos. São preferidas as subclasses IgG2 e IgG4, sendo mais preferida a região Fc de IgG4 que raramente possui funções efetoras, tais como a citotoxicidade dependente do complemento (CDC).
[070] Como veículo de fármaco da presente invenção, a região Fc de imunoglobulina mais preferida é uma região Fc não glicosilada proveniente IgG4 humana. A região Fc proveniente de humano é mais preferida a uma região Fc proveniente de não-humano, que pode atuar como antígeno no corpo humano e pode provocar respostas imunes indesejadas, tais como a produção de um novo anticorpo contra o antígeno.
[071] A formulação líquida de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração da presente invenção compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração. A concentração de conjugado de insulina de longa duração utilizada na presente invenção está compreendida entre 0,1 mg/mL e 200 mg/mL e, de preferência, entre 10 mg/mL e 200 mg/mL. A concentração de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração utilizada na presente invenção está compreendida entre 0,1 mg/mL e 200 mg/mL e, de preferência, entre 0,5 mg/mL e 150 mg/mL. A formulação líquida de conjugado de insulina de longa duração e de conjugado de peptídeo insulinotrópico da presente invenção a concentração elevada compreende o conjugado de insulina e o conjugado de peptídeo insulinotrópico em uma concentração elevada por dose, e em comparação com a formulação líquida existente em uma concentração reduzida. Assim, pode proporcionar, de um modo estável, a insulina ao corpo, permitindo a coadministração de conjugado de insulina e de conjugado de peptídeo insulinotrópico em uma concentração elevada, bem como o seu armazenamento de um modo estável sem ocorrência de precipitação, ao contrário da formulação líquida existente.
[072] Tal como aqui utilizado, o termo “estabilizador” designa uma substância que permite um armazenamento estável do conjugado de insulina de longa duração e do peptídeo insulinotrópico de longa duração. O termo “estabilização” designa que a perda de um ingrediente ativo é inferior a uma determina quantidade, tipicamente inferior a 10%, durante um determinado período de tempo e sob condições de armazenamento específicas. Uma formulação é considerada uma formulação estável quando a pureza residual do conjugado de insulina de longa duração e do peptídeo insulinotrópico de longa duração é 90% ou superior e, mais preferencialmente, está compreendida entre 92% e 95%, após ter sido armazenada a 5°C±3°C durante 2 anos, a 25°C±2°C durante 6 meses ou a 40°C±2°C durante 1 a 2 semanas. Quando às proteínas semelhantes ao conjugado de insulina de longa duração ou peptídeo insulinotrópico de longa duração, a estabilidade de armazenamento é importante para proporcionar uma dosagem precisa, bem como para suprimir a formação potencial de substâncias antigénicas contra o conjugado de insulina de longa duração e peptídeo insulinotrópico de longa duração. Durante o armazenamento, uma perda de 10% do conjugado de insulina de longa duração ou do peptídeo insulinotrópico de longa duração é aceitável para uma administração substancial, salvo quando cause a formação de agregados ou fragmentos na composição, dando origem à formação de compostos antigénicos.
[073] O estabilizador da presente invenção compreende, de preferência, um tampão, um álcool de açúcar, um cloreto de sódio como agente isotônico e um tensoativo não iônico para estabilizar a combinação do conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, podendo ainda compreender metionina.
[074] O tampão atua para manter o pH da solução de modo a evitar uma alteração brusca do pH na formulação líquida para assim estabilizar uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração. O tampão pode incluir um sal alcalino (sais de fosfato, hidrogeno-fosfato ou di-hidrogeno-fosfato de sódio ou potássio), citrato de sódio/ácido cítrico, acetato de sódio/ácido acético e qualquer outro tampão para pH farmaceuticamente aceitável conhecido na especialidade, e uma sua combinação. O exemplo preferido de tal tampão compreende um tampão citrato, um tampão acetato e um tampão fosfato. Entre estes, é preferido o tampão de acetato e sódio ou o tampão de citrato de sódio. A concentração de ácido acético que constitui o tampão de acetato de sódio está preferencialmente compreendida entre 5 mM e 100 mM e, mais preferencialmente, entre 5 mM e 50 mM de um volume total da solução. O pH do tampão é, de preferência, de 4,0 a 8,0, mais preferencialmente, de 5,0 a 7,0 e, ainda mais preferencialmente, de 5,0 a 6.5.
[075] O álcool de açúcar atua para aumentar a estabilidade de uma combinação do conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração. Na presente invenção, a concentração de álcool de açúcar está preferencialmente compreendida entre 1% e 20% (p/v) de um volume total de formulação e, mais preferencialmente, entre 1% e 15% (p/v) de um volume total de formulação. Como exemplos de álcool de açúcar úteis na presente invenção refere-se manitol e sorbitol, constituindo o manitol o exemplo preferido.
[076] O agente isotônico tem o efeito de manter a pressão osmótica adequada quando a combinação do conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração em solução é injetada no corpo. Além disso, o agente isotônico tem um efeito de estabilizar ainda a combinação em solução. Tipicamente, o agente isotônico é um sal inorgânico solúvel em água, incluindo cloreto de sódio, sulfato de sódio, citrato de sódio e, de preferência, cloreto de sódio. O teor em agente isotônico pode ser ajustado de um modo adequado em conformidade com o tipo e a quantidade dos componentes incluídos na formulação de modo que a formulação líquida que compreende a totalidade da mistura possa ser uma solução isotônica. A concentração de um tal agente isotônico pode estar compreendida entre 0,5 mg/mL e 30 mg/mL de um volume total da solução, mas não está limitada a estes.
[077] O tensoativo não iônico reduz a tensão superficial da solução de proteína para prevenir a absorção ou a agregação das proteínas em uma superfície hidrofóbica. Como exemplos de tensoativos não iônicos úteis na presente invenção refere-se polissorbatos, poloxâmeros e suas combinações, sendo preferidos os polissorbatos. Entre os tensoativos não iônicos de polissorbatos encontram-se o polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60 e polissorbato 80. O tensoativo não iônico mais preferido é o polissorbato 20.
[078] É inadequada a utilização de um tensoativo não iônico em uma concentração elevada em um formulação líquida, sendo tal devido ao fato do tensoativo não iônico em uma concentração elevada induzir efeitos de interferência durante a medição da concentração de proteína e a determinação da estabilidade da proteína através de métodos analíticos, tais como espectroscopia UV ou focalização isoelétrica, provocando assim dificuldades na avaliação da estabilidade das proteínas de um modo preciso. Assim sendo, de preferência, a formulação líquida da presente invenção compreende o tensoativo não iônico em uma concentração reduzida inferior a 0,2%(p/v) e, mais preferencialmente, de 0,001% até 0,05%(p/v).
[079] A metionina contida no estabilizador da presente invenção tem um efeito de estabilizar ainda mais uma proteína alvo, por meio da supressão da formação de impurezas, as quais podem ocorrer devido à oxidação da proteína em solução. A concentração de metionina está compreendida entre 0,005% e 0,1 % (p/v) de um volume total da solução e, de preferência, entre 0,01% e 0,1% (p/v) de um volume total de solução.
[080] De acordo com um exemplo da presente invenção, demonstrou-se que quando se adicionou cloreto de sódio como agente isotônico na presença de tampão, álcool de açúcar e tensoativo não iônico, a estabilidade durante o armazenamento de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração aumentou significativamente. Tal indica que a utilização de cloreto de sódio como agente isotônico, em simultâneo com tampão, álcool de açúcar e tensoativo não iônico, induz um efeito sinergístico, proporcionando assim uma elevada estabilidade a uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração.
[081] É preferido que o estabilizador da presente invenção não contenha albumina. Uma vez que a albumina do soro humana disponível enquanto estabilizador de proteínas é produzida a partir de soro humano, existe sempre a possibilidade desta estar contaminada com vírus patogénicos de origem humana. A gelatina ou a albumina do soro de bovino podem causar doenças ou podem estar aptas para induzir uma resposta alérgica em alguns pacientes. Isento de proteínas heterólogas, tais como albuminas do soro de origem humana ou animal ou de gelatina purificada, o estabilizador da presente invenção não apresenta qualquer possibilidade de causar contaminação viral.
[082] Além disso, o estabilizador da presente invenção pode ainda compreender açúcares, poli-álcoois ou aminoácidos neutros. Como exemplos preferidos de açúcares, que podem ainda ser adicionados para aumentar a estabilidade ao armazenamento de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, refere-se monossacáridos, tais como manose, glicose, fucose e xilose, e polissacáridos, tais como lactose, maltose, sacarose, rafinose e dextrano. Como exemplo preferidos de poli-álcoois refere-se propileno-glicol, polietileno-glicol de baixo peso molecular, glicerol, polipropileno-glicol de baixo peso molecular e uma sua combinação.
[083] A formulação líquida da presente invenção pode ainda compreender outras substâncias e materiais conhecidos na especialidade, para além dos anteriormente descritos tampão, agente isotônico, álcool de açúcar tensoativo não iônico, desde que o efeito da presente invenção não seja afetado.
[084] A formulação líquida isenta de albumina da combinação a concentração elevada da presente invenção, que proporciona estabilidade a uma combinação desconjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico, não apresenta um risco de contaminação viral, proporcionando uma excelente estabilidade ao armazenamento com uma formulação simples, pelo que a formulação da presente invenção pode ser fornecida de um modo mais eficaz em termos de custo, comparativamente com outra formulação de estabilizador ou formulação liofilizada.
[085] Além disso, uma vez que a formulação líquida da presente invenção compreende o conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico, a qual tem uma duração amentada da atividade fisiológica em comparação com a de um peptídeo nativo, esta pode ser utilizada com uma formulação eficaz de fármaco visto que mantém a atividade da proteína no corpo durante um período de tempo mais longo em comparação com a formulação convencional de insulina e peptídeo insulinotrópico. Além do mais, a formulação líquida da presente invenção proporciona uma excelente estabilidade ao armazenamento para armazenar uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico a concentração elevada.
[086] De preferência, a formulação líquida a presente invenção pode compreender o conjugado de insulina de longa duração, em que a inulina e o peptídeo insulinotrópico estão ligados a um fragmento de imunoglobulina através de polietileno-glicol; peptídeo insulinotrópico de longa duração; e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão acetato, manitol, polissorbato 20 e cloreto de sódio. Além disso, a formulação líquida pode anda compreender metionina.
[087] Como um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação da formulação líquida da presente invenção.
[088] Uma formulação líquida estável de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e de conjugado de peptídeo insulinotrópico pode ser preparada através da geração de um conjugado de insulina e peptídeo insulinotrópico de longa duração e mistura do conjugado de insulina e propriedades insulinotrópico de longa duração gerado com um estabilizado que compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e um agente isotônico.
[089] Como um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou para o tratamento de diabetes, que compreende o conjugado de insulina e o conjugado de peptídeo insulinotrópico.
[090] A composição da presente invenção é caracterizada pelo fato de permitir a coadministração do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração.
[091] Quando o conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração são coadministrados, o conjugado de insulina de longa duração atua em um receptor de insulina e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração atua em um receptor de peptídeo 1 de tipo glucagon, em simultâneo. Assim a coadministração dos dois conjugados pode reduzir o nível de glicose no sangue de um modo mais eficaz apresentando alterações estáveis, em comparação com as administrações em separado dos dois conjugados. Além do mais, quando os conjugados são coadministrados, tal reduz o risco de hipoglicemia, que é possível observar da administração de insulina por si só, reduz o peso corporal e também reduz a dosagem total de insulina por compreender o peptídeo insulinotrópico. Além disso, a dosagem do peptídeo insulinotrópico, tal como exendina-4, pode ser reduzida, pelo que a coadministração apresenta a vantagem de reduzir os efeitos secundários, tais como náuseas e vômitos, que é possível observar quando a exendina-4 é administrada por si só. A utilização do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração pode aumentar significativamente o período de meia-vida e a durabilidade in vivo do fármaco, sendo, por tal motivo, benéfica para o tratamento de diabetes uma vez que reduz a frequência de administração para um paciente crónico que necessita da administração todos os dias, melhorando assim a qualidade de vida do paciente. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção apresenta uma excelente durabilidade e título in vivo, e a sua utilização pode reduzir significativamente a dosagem através da utilização de um método de coadministração.
[092] O conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração podem ser administrados em simultâneo, sucessivamente ou na ordem inversa. Além do mais, podem ser administrados simultaneamente sob a forma de uma combinação dos dois em uma quantidade eficaz. De preferência, o conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração podem ser colocados em um único recipiente e depois coadministrados.
[093] Além do mais, a composição para a coadministração do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração da presente invenção pode estar sob a forma de um estojo para o tratamento de diabetes preparado em um recipiente único. Um tal estojo pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável e um manual de instruções para a utilização do estojo.
[094] A murganhos hiperglicêmicos induzidos com estreptozotocina (STZ) coadministrou-se o conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração e monitorizou-se as alterações no nível de glicose no sangue. Assim sendo, quando os conjugados foram coadministrados, as alterações no nível de glicose no sangue foram mais estáveis do que no caso de serem administrados em separado. Em uma outra experiência, efetuou-se a coadministração, no modelo de diabetes de tipo 2 em murganhos, de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração uma vez por semana e comparou-se a diferença entre o nível de glicose no sangue em jejum antes e após a administração. Como resultado, a coadministração apresentou um efeito superior na regulação do nível de glicose no sangue, em comparação com a administração em separado dos dois conjugados, e não se observou o aumento de peso após a administração de insulina, confirmando assim que a coadministração pode reduzir os efeitos secundários de ganho de peso devido a insulina.
[095] Tal como aqui utilizado, o termo “diabetes” designa uma doença metabólica em que a secreção de insulina está em falta ou em que a insulina não consegue atuar adequadamente. Através da coadministração da composição da presente invenção a um sujeito é possível tratar a diabetes por regulação do nível de glicose no sangue.
[096] Tal como aqui utilizado, o termo “prevenção” designa todas as ações que previnam ou retardem o início de diabetes por meio da coadministração da composição da presente invenção. O termo “tratamento” designa todas as ações que possam aliviar ou alterar beneficamente os sintomas de diabetes por meio da coadministração da composição da presente invenção. O tratamento de diabetes pode ser aplicado a quaisquer mamíferos que possam desenvolver diabetes, sendo posso referir como exemplos de tais mamíferos os seres humanos e primatas, bem como animais de criação, tais como vacas, porcos, ovelhas, cavalos, cães e gatos, sem limitações, e, de preferência, seres humanos.
[097] Tal como aqui utilizado, o termo “administração” designa a introdução de uma quantidade predeterminada de uma substância em um paciente através de um determinado método adequado. As composições podem ser administradas por qualquer uma das vias convencionais, desde que esta seja capaz de atingir um tecido alvo. As vias de administração incluem a administração por via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intra-retal, não estando limitadas a estas. No entanto, visto que os peptídeos são digeridos durante a administração por via oral, os ingredientes ativos de uma composição para administração pro via oral têm de ser revestidos ou formulados para proteção contra a degradação no estômago. De preferência, o conjugado pode ser administrado sob uma forma injetável. Além do mais, as composições podem ser administradas utilizando determinados aparelhos capazes de transportar os ingredientes ativos para uma célula alvo.
[098] Além do mais, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser determinada por diversos fatores, incluindo os tipos de doença a tratar, as vias de administração, a idade, o género e o peso do paciente, e a gravidade da doença, bem como dos tipos de componentes ativos no fármaco.
[099] Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender veículos farmaceuticamente aceitáveis. Tal como aqui utilizado, o termo “veículo farmaceuticamente aceitável” designa um veículo ou diluente que não interrompa a atividade fisiológica e as propriedades do composto administrado sem estimular um sujeito. Para a administração por via oral, como veículo farmaceuticamente aceitável refere-se um aglutinante, um lubrificante, um agente de desintegração, um excipiente, um solubilizador, um agente de dispersão, um estabilizador, um agente de suspensão, um corante e um aroma. Para uma formulação injetável, o veículo farmaceuticamente aceitável pode compreender um agente de tamponamento, um agente conservante, um analgésico, um solubilizador, um agente isotônico e um estabilizador. Para formulações para a administração por via tópica, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir uma base, um excipiente, um lubrificante e um conservante. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada sob diversas formas por adição dos veículos farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, para a administração por via oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes ou pastilhas. Para as preparações injetáveis, a composição farmacêutica pode ser formulada em uma ampola de dose individual ou em um recipiente de doses múltiplas. A composição farmacêutica também pode ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas e formulações de libertação prolongada.
[100] Como um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a prevenção ou para o tratamento de diabetes, o qual compreende a administração da composição que compreende o conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração a um sujeito que pode vir a ter diabetes ou que já sofre de diabetes.
[101] No passo de administração, o conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração podem ser coadministrados, em que uma quantidade eficaz adequada dos conjugados é combinada e administrada em simultâneo.
[102] A composição da presente invenção que compreende o conjugado de insulina de longa duração e o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração pode reduzir eficazmente o nível de glicose no sangue mesmo com uma redução na frequência de administração e não causa efeitos secundários, tais como aumento de peso, podendo assim ser utilizada eficazmente para a prevenção ou para o tratamento de diabetes.
Modo da invenção
[103] Seguidamente, a presente invenção irá ser descrita mais minuciosamente por referência aos exemplos. No entanto, estes exemplos tem um fim meramente ilustrativo, não se pretendendo que a invenção esteja limitada por estes exemplos.
Exemplo 1: avaliação da estabilidade do conjugado de insulina de longa duração
[104] O conjugado de insulina de longa duração foi desenvolvido como uma estratégia para aumentar o período de meia-vida no soro do fármaco e evitar a hipoglicemia no corpo. Assim, o conjugado de insulina, que é normalmente gerado por uma conjugação específica para um local de uma região Fc de imunoglobulina, polímero não peptídico, e insulina através de ligações covalentes, aumentou notoriamente o período de meia-vida no soro e reduziu o risco de hipoglicemia.
[105] Para se avaliar a estabilidade de um tal conjugado de insulina de longa duração, preparou-se as soluções nas composições da tabela 1 e armazenou-se a 40°C durante 2 semanas, e analisou-se a estabilidade do peptídeo nela contido por cromatografia de permuta iónica (IE-HPLC).
[106] Neste momento, os fatores principais que contribuem para a estabilidade do peptídeo foram fixados com sendo o pH, o tipo e a concentração do tampão, o tipo de agente isotônico, a concentração de álcool de açúcar constituído por manitol, o tipo de tensoativo, a concentração de tensoativo constituído por polissorbato 20, a presença ou ausência de outros aditivos e a co-adição de metionina e de cloreto de sódio. A concentração do conjugado de insulina de longa duração em cada composição foi de 61,1 mg/mL e utilizou-se as seguintes formulações para o ensaio.
[107] O IE-HPLC(%) da tabela 1 representa um valor de % de área/% de área no início que demonstra a pureza residual do conjugado de insulina de longa duração, em comparação com a pureza inicial. Tabela 1 Tabela 2
[108] Tal como apresentado na tabela 2, o conjugado de insulina de longa duração foi o mais estável na formulação líquida que compreende um tampão constituído por acetato de sódio, um agente isotônico que consiste em cloreto de sódio, um álcool de açúcar que consiste em manitol, e um tensoativo que consiste em polissorbato 20, a um valor de pH compreendido entre 5,6 ou 6,0.
Exemplo 2: avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração
[109] Para se confirma a solubilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração a vários valores de pH e em função da presença de um estabilizador, preparou-se diferentes formulações líquidas de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração nas composições seguintes apresentadas na tabela 3 e armazenou-se a 40°C durante 1 semana. A seguir, comparou-se a estabilidade do conjugado por monitorização da precipitação de proteína por observação visual sem o auxílio de instrumentos. Em cada composição, a concentração do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração foi de 10 mg/mL e a experiência foi efetuada utilizando estas formulações. Tabela 3
[110] A duração (em dias) da ausência de precipitação na figura 1 representa o tempo durante o qual não ocorreu a precipitação de proteína após o armazenamento da formulação a 40°C. Tal como apresentado antes, com acetato de sódio, pH 5,0 a 5.4 (#1, #2 e #3), ou composto 5% (p/v) de manitol (#5), a precipitação de proteína ocorreu ao fim de 4 dias no armazenamento. No entanto, quando o valor de pH foi de 5,6 e se adicionou 10% (p/v) de manitol à formulação, a solubilidade aumentou e a precipitação não ocorreu durante 7 dias (figura 1).
Exemplo 3: avaliação da estabilidade de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração
[111] Com base em formulações líquidas individuais, comparou-se a estabilidade de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração. Além disso, determinou-se como a adição de cloreto de sódio e de metionina, que são importantes para a estabilização do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, respectivamente, afetam a estabilidade de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração.
[112] Preparou-se formulações líquidas de conjugado de insulina de longa duração, conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração ou uma combinação dos dois, com as composições seguintes apresentadas na tabela 4 e armazenou-se a 40°C durante 4 semanas. Depois, efetuou-se o teste de estabilidade na formulação da combinação dos dois conjugados e comparou-se com o dos conjugados individualmente através de monitorização da precipitação de proteína e através da utilização de cromatografia de permuta iónica (IE- HPLC), cromatografia de exclusão por tamanho (SE-HPLC) e cromatografia líquida de elevado rendimento de fase inversa (RP-HPLC).
[113] A concentração do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração (controle-1, #1 a #4) e do conjugado de insulina de longa duração (controle-2, #1 a #4) em cada formulação líquida foi de 10 mg/mL e 61,1 mg/mL, respectivamente.
[114] Tabela 4
[115] Nas figuras 2 a 3, a análise por IE-HPLC e por RP-HPLC apresentou o valor de % de área&% de área de início, que representa a pureza residual do conjugado de insulina de longa duração e do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, em comparação com a pureza inicial. Entre estes, a figura 2 mostra os resultados da análise por IE-HPLC e por RP-HPLC para o conjugado de insulina de longa duração, ao passo que a figura 3 mostra os resultados da análise por IE-HPLC e por RP-HPLC para o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração.
[116] Tal como apresentado antes, quando a estabilidade de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração é comparada com a do conjugado de insulina de longa duração ou do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, concluiu-se que o conjugado de insulina de longa duração apresentava uma pureza e uma estabilidade semelhantes nas formulações combinadas (formulações #3 e #4) e nas formulações em separado (figura 2).
[117] No entanto, quando se incluiu 0,01% (p/v) de metionina na formulação líquida que compreende acetato de sódio 10 mM, pH 6,00, cloreto de sódio 10 mg/mL, 10% (p/v) de manitol e 0,02% (p/v) de polissorbato 20 (isto é, a formulação #4), a estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração melhorou comparativamente com a formulação que não tinha metionina (figura 3). Tal poderá ser devido ao fato da metionina atuar de forma a prevenir a oxidação do conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração. A comparação com a formulação separada de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração não pode ser realizada devido à quantidade excessiva de precipitação.
[118] Tal como apresentado na figura 4, a formulação em separado de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração apresentava precipitação de proteína ao fim de 2 semanas, ao passo que a formulação de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração (formulações #3 e #4) têm uma solubilidade aumentada e, nestes casos, a precipitação foi suprimida durante um período de tempo relativamente mas longo, até 4 semanas.
[119] Estes resultados suportam que a composição da formulação líquida da presente invenção pode manter uma estabilidade elevada de uma combinação de conjugado de peptídeo insulinotrópico e conjugado de insulina a concentração elevada.
Exemplo 4: avaliação da estabilidade de um combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração em função das concentrações de agente isotônico e de álcool de açúcar
[120] A estabilidade de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração foi comparada entre a combinação dos conjugados em uma formulação líquida que compreende 4,8 a 6,7 mg/mL de cloreto de sódio como agente isotônico, 1% a 2% (p/v) de manitol como álcool de açúcar, e manitol e a combinação na formulação líquida confirmada no exemplo 2 (acetato de sódio 10 mM, pH 6,0, 10 mg/mL de cloreto de sódio, 10% (p/v) de manitol, 0,02% (p/v) de polissorbato 20, 0,01% (p/v) de metionina).
[121] Preparou-se uma formulação líquida de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração nas composições seguintes apresentadas na tabela 5 e armazenou-se a 25°C durante 4 semanas. Depois, examinou-se a estabilidade dos conjugados por IE-HPLC, SE-HPLC e RP-HPLC.
[122] Os dados de IE-HPLC(%) e RP-HPLC(%) das tabelas 6 e 7 representam o valor de % de área/% de área no início, os quais mostram a pureza residual de uma combinação de conjugado de insulina de longa duração e conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, em comparação com a pureza inicial. Entre estes, a tabela 6 mostra os resultados da análise por IE- HPLC e por RP-HPLC do conjugado de insulina de longa duração, ao passo que a tabela 7 mostra os resultados da análise por IE-HPLC e RP-HPLC no conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração. Tabela
[123] Tabela 6
[124] Tabela 7
[125] Tal como apresentado antes, quando a concentração de cloreto de sódio foi reduzida até 4,8 mg/mL e a concentração de manitol foi reduzida até 1% a 2% (p/v) (formulações #1 e #2) e quando a concentração de cloreto de sódio foi reduzida até 6,7 ,8 mg/mL e a concentração de manitol foi reduzida até 1% a 2% (p/v) (formulações #3 e #4), comparativamente com a formulação líquida confirmada no exemplo 2 (acetato de sódio 10 mM, pH 6,0, 10 mg/mL de cloreto de sódio, 10% (p/v) de manitol, 0,02% (p/v) de polissorbato 20, 0,01% (p/v) de metionina), todas as quatro formulações testadas apresentaram uma estabilidade elevada semelhante à da formulação líquida confirmada no exemplo 3.
[126] Estes resultados suportam que se a composição de formulação líquida da presente invenção compreender cloreto de sódio como agente isotônico e manitol como álcool de açúcar, mesmo quando a concentração de cloreto de sódio e a concentração como as álcool de açúcar são reduzidas, estes podem proporcionar o mesmo grau de estabilidade a uma combinação do conjugado de insulina e do conjugado de peptídeo insulinotrópico.
[127] Com base na descrição anterior, será evidente para os especialistas na matéria que podem ser feitas várias modificações e alterações sem, no entanto, se afastar do âmbito e espírito da invenção. Assim sendo, faz-se observar que a variante anterior não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O âmbito da invenção é definido pelas reivindicações anexas em vez da descrição que as precede, pelo que todas as alterações e modificações que estejam abrangidas por estas metas e limites, ou equivalentes a estas metas e limites, estão abrangidas pelas reivindicações.

Claims (28)

1. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, caracterizada por compreender um conjugado de insulina de longa duração, um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e um agente isotônico; em que um conjugado de insulina de longa duração está na forma em que uma insulina está ligada à região Fc de uma imunoglobulina; um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração está na forma em que um peptídeo insulinotrópico está ligado à região Fc de uma imunoglobulina; em que cada uma da insulina no conjugado de insulina de longa duração e do peptídeo insulinotrópico no conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração está ligada à região Fc da imunoglobulina por um polietilenoglicol; e a faixa de pH do tampão está compreendida entre 5,0 e 6,5.
2. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a insulina ter a mesma sequência de aminoácidos da insulina nativa.
3. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o peptídeo insulinotrópico ser selecionado do grupo constituído por peptídeo 1 de tipo glucagon (GLP-1), peptídeo 2 de tipo glucagon (GLP-2), exendina-3 e exendina-4.
4. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a variante de peptídeo insulinotrópico ser uma imidazoacetil- exendina-4.
5. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a região Fc de imunoglobulina ser uma região Fc proveniente de IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.
6. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a região Fc de imunoglobulina ser um híbrido de domínios que apresenta diferentes origens provenientes de imunoglobulinas selecionadas do grupo constituído por IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
7. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a região Fc de imunoglobulina ser um dímero ou um multímero constituído por imunoglobulinas de cadeias simples constituídas por domínios com a mesma origem.
8. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a região Fc de imunoglobulina ser uma região Fc de IgG4.
9. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a região Fc de imunoglobulina ser uma região Fc de IgG4 aglicosilada humana.
10. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a concentração do conjugado de insulina de longa duração em uma quantidade farmaceuticamente eficaz estar compreendida entre 10 mg/mL e 200 mg/mL e a concentração de conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração estar compreendida entre 0,5 mg/mL e 150 mg/mL.
11. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o álcool de açúcar ser um ou mais selecionados do grupo constituído por manitol e sorbitol.
12. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a concentração do álcool de açúcar estar compreendida entre 1% (p/v) e 15% (p/v) com base no volume total da formulação.
13. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o tampão ser um tampão citrato, tampão acetato ou tampão fosfato.
14. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o tampão ser tampão citrato ou tampão acetato.
15. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o tampão ser tampão acetato.
16. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a concentração de tampão estar compreendida entre 5 e 50 mM com base no volume total da formulação.
17. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a faixa de pH do tampão estar compreendida entre 5,0 e 6,5.
18. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a faixa de pH do tampão estar compreendida entre 5,6 e 6,5.
19. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente isotônico ser selecionado do grupo constituído por cloreto de sódio, sulfato de sódio e citrato de sódio.
20. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a concentração de agente isotônico estar compreendida entre 0,5 mg/mL e 30 mg/mL.
21. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o tensoativo não iônico ser um polissorbato ou poloxâmero.
22. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por a concentração do tensoativo não iônico estar compreendida entre 0,001% (p/v) e 0,05% (p/v).
23. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o estabilizador compreender ainda metionina.
24. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por a concentração de metionina estar compreendida entre 0,005% (p/v) e 0,1% (p/v) com base no volume total da formulação.
25. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o estabilizador compreender ainda uma ou mais substâncias selecionadas do grupo constituído por açúcares, poliálcoois e aminoácidos.
26. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender um conjugado de insulina de longa duração e um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração, em que a insulina e o peptídeo insulinotrópico estão, cada um deles, ligados a um fragmento de imunoglobulina através de polietileno-glicol, e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende tampão acetato, manitol, polissorbato 20 e cloreto de sódio.
27. Formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada por compreender ainda metionina.
28. Método para a preparação de formulação líquida de uma combinação de insulina e de peptídeo insulinotrópico de longa duração, caracterizado por compreender um conjugado de insulina de longa duração, um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e um agente isotônico, em que o método compreende misturar o conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração com um estabilizador, que compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico e um agente isotônico, em que um conjugado de insulina de longa duração está na forma em que uma insulina está ligada à região Fc de uma imunoglobulina; um conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração está na forma em que um peptídeo insulinotrópico está ligado à região Fc de uma imunoglobulina; em que cada uma da insulina no conjugado de insulina de longa duração e do peptídeo insulinotrópico no conjugado de peptídeo insulinotrópico de longa duração está ligada à região Fc da imunoglobulina por um polietilenoglicol; e a faixa de pH do tampão está compreendida entre 5,0 e 6,5.
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