ES2871899T3 - Péptidos antiinflamatorios y composición que comprende a los mismos - Google Patents

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Abstract

Un péptido con actividad antiinflamatoria, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en: la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO:108.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos antiinflamatorios y composición que comprende a los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos antiinflamatorios y a composiciones que comprenden a los mismos. Antecedentes de la invención
La inflamación es un tipo de defensa biológica como un medio de protección del cuerpo frente al daño de tejidos biológicos que podría ocasionarse mediante estímulos físicos externos, estímulos químicos tales como la exposición a diversos alérgenos, o la invasión de microorganismos que incluyen bacterias, hongos y virus.
La vía de la ciclooxigenasa (COX) o la vía de la lipooxigenasa (LOX) se pueden usar para señalizar la inflamación, que produce prostaglandina, tromboxano, etc. Una vez que se ha propagado la señal inflamatoria, uno de los muchos cambios que pueden tener lugar en el cuerpo es la expansión del vaso sanguíneo para un elevado suministro de sangre alrededor de la inflamación para concentrar células sanguíneas tales como neutrófilos requeridos para la respuesta inflamatoria. Sin embargo, se pueden dar enfermedades inflamatorias si una respuesta de defensa biológica anómala tiene lugar de forma excesiva. Para evitar esto, los fármacos que suprimen las respuestas inflamatorias excesivas reprimiendo las enzimas utilizadas en las vías de señalización inflamatoria (por ejemplo, COX-1, COX-2, 5-LOX, 12-lOx etc.) están en desarrollo.
Según el tiempo de respuesta, la inflamación se clasifica como inflamación aguda (respuesta inmediata, respuesta inespecífica, de varios días a varias semanas), inflamación crónica (respuesta retardada, respuesta específica, varias semanas o más), inflamación subaguda (una etapa intermedia entre la inflamación aguda y la inflamación crónica, características de un producto mixto de mononuclear y polimorfonuclear).
Además, aparte de los factores peptídicos, los factores tales como prostaglandina, leucotrieno, los factores lipídicos que incluyen el factor activador de plaquetas (PAF), la enzima sintética del factor de inflamación, los radicales libres tales como NO (óxido nítrico), muchos tipos de moléculas de adhesión celular, el sistema inmunitario y los factores de coagulación pueden provocar la inflamación.
Una vez que una célula se daña debido a los agentes causales conocidos de la inflamación tales como factores biológicos externos (microbios, virus, parásitos), factores físicos (estímulos mecánicos, calor, radiación, electricidad) y factores químicos, se libera histamina y cinina. La histamina y cinina liberadas darán como resultado la angiectasia, una permeabilidad capilar y concentración de macrófagos aumentadas en el sitio de inflamación, y provoca un aumento del flujo sanguíneo, edema, migración de inmunocitos y anticuerpos, dolor y generación de calor.
Los tratamientos para la inflamación usados en la actualidad son fármacos sintéticos tales como ibuprofeno, antihistamínicos, esteroides, cortisona, agentes inmunosupresores y agonistas inmunitarios; que solo alivian temporalmente la inflamación. Estos fármacos no curan fundamentalmente la inflamación, y tienen efectos secundarios tales como reacción de hipersensibilidad y deterioro del sistema inmunitario,
Por lo tanto, para un alivio eficaz de la inflamación, se están haciendo investigaciones para desarrollar una sustancia que inhiba la expresión de las proteínas inflamatorias mencionadas anteriormente. Sin embargo, han surgido problemas en las sustancias antiinflamatorias que se han desarrollado anteriormente. Se han desarrollado diversas categorías de fármacos antiinflamatorios que incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID, del inglés Non-steroidal Antiinflammatory Drugs) y fármacos antiinflamatorios esteroideos (SAID, del inglés Steroidal Antiinflammatory Drugs); pero no solo estos fármacos a menudo provocan efectos secundarios tras su uso, sino que tampoco curan fundamentalmente la inflamación. Por lo tanto, hay una necesidad actual por fármacos antiinflamatorios que son factibles tanto físicamente como económicamente. Como ejemplo, en inflamaciones agudas o crónicas tales como artritis reumatoide crónica, no solo los fármacos antiinflamatorios no esteroideos suprimen la actividad enzimática de COX-2, sino que también se sabe que suprimen la actividad de COX-1, provocando efectos secundarios tales como trastornos gastrointestinales.
La presente invención se completó ya que los presentes inventores han descubierto que los péptidos que provienen de la telomerasa pueden tener propiedades antiinflamatorias.
Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo péptido.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar el polinucleótido que codifica el nuevo péptido.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un péptido que tiene actividad antiinflamatoria.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición antiinflamatoria que usa el presente péptido como principio activo.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición cosmética que usa el presente péptido como un principio activo.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que usa el presente péptido como un principio activo.
Sumario de la invención
En una realización, la presente invención se refiere a un péptido con actividad antiinflamatoria, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en: la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO: 108.
En otra realización, el péptido mencionado anteriormente se origina a partir de telomerasa humana.
En otra realización, el péptido mencionado anteriormente es para su uso como un medicamento.
En otra realización, el péptido mencionado anteriormente es para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad inflamatoria.
En una realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido seleccionado del grupo que consiste en: la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO: 108.
En una realización de la presente invención se proporciona una composición antiinflamatoria que comprende un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 108 como un principio activo. En otra realización, la composición antiinflamatoria mencionada anteriormente es para el uso en un procedimiento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad inflamatoria, en donde la composición es una composición farmacéutica.
En otra realización, la composición antiinflamatoria mencionada anteriormente es para su uso en la reducción o la prevención de inflamación de la piel, en donde la composición es una composición cosmética.
En otra realización, la enfermedad inflamatoria mencionada anteriormente se selecciona del grupo que consiste en (1) enfermedad inflamatoria general o localizada (por ejemplo, alergias; enfermedad por inmunocomplejo; fiebre del heno; choque hipersensible; choque por endotoxina; caquexia, hipertermia; granulomatosis; o sarcoidosis); (2) enfermedades relacionadas con el aparato digestivo (por ejemplo, apendicitis; úlcera gástrica; úlcera duodenal; peritonitis; pancreatitis; colitis ulcerosa, aguda o isquémica; colangitis; colecistitis, esteatorrea, hepatitis, enfermedad de Crone; o enfermedad de Whipple); (3) enfermedades relacionadas con la piel (por ejemplo, psoriasis; quemaduras; quemaduras solares; dermatitis; verrugas urticantes o habones); (4) enfermedades relacionadas con el sistema vascular (por ejemplo, angiitis; vasculitis; endocarditis; arteritis; aterosclerosis; tromboflebitis; pericarditis; insuficiencia cardíaca congestiva; miocarditis; isquemia miocárdica; periarteritis nodosa; estenosis recurrente; enfermedad de Buerger; o fiebre reumática); (5) enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma; epiglotitis; bronquitis; enfisema; rinitis; fibrosis quística; neumonitis intersticial; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); síndrome de distrés respiratorio del adulto; coniosis; alveolitis; bronquiolitis; faringitis; pleuritis; o sinusitis); (6) enfermedades relacionadas con los huesos, articulaciones, músculos y tejidos conectivos (por ejemplo, granuloma eosinófilo; artritis; artralgia; osteomielitis; dermatomiositis; fascitis; enfermedad de Paget; gota; periodontitis; artritis reumatoide; miastenia grave; espondilitis anquilosante; o sinovitis); (7) trastornos urogenitales (por ejemplo, epididimitis; vaginitis; prostatitis; o uretritis); (8) enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer; meningitis; encefalitis; esclerosis múltiple; infarto cerebral; embolia cerebral; síndrome de Guillain-Barre; neuritis; neuralgia; lesión de la médula espinal; parálisis; o uveítis); (9) enfermedades infecciosas por virus (por ejemplo, virus de la gripe; virus respiratorio sincicial; VIH; virus de la hepatitis B; de hepatitis C; o virus herpes) (por ejemplo, fiebre del dengue; o septicemia), infección fúngica (por ejemplo, candidiasis); o bacteriana, por parásitos, e infecciones microbianas similares (por ejemplo, bacteriemia diseminada; malaria; oncocercosis; o amebiasis); (10) enfermedades autoinmunes (por ejemplo, tiroiditis; lupus; síndrome de Goodpasture; rechazo a aloinjerto; enfermedad de injerto frente a huésped; o diabetes); y (11) cáncer o enfermedad tumoral (por ejemplo, linfoma de Hodgkin).
En una realización de la presente invención, se proporciona un kit para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias que comprende: un péptido seleccionado del grupo que consiste en: la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO: 108 e instrucciones que incluyen al menos uno de administración de la dosis, vía de administración, frecuencia de administración e indicaciones del péptido o de la composición.
En algunas realizaciones de la presente invención, el péptido es la SEQ ID NO: 51.
En algunas realizaciones de la presente invención, el péptido es la SEQ ID NO: 108.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, un péptido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 108 tiene una eficacia sobresaliente tanto en la supresión de la inflamación como en los medios profilácticos. Por lo tanto, la composición que comprende los péptidos de la presente invención se puede usar como composición farmacéutica antiinflamatoria o como composición de cosmética, a su vez, para tratar y prevenir una variedad de diferentes tipos de enfermedades inflamatorias.
Referencias
KR2012-0130996A
KR2012-0133661A
KR2011-0060940A
US2011-0150873A1
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Dahlgren KN y col., J. Biol. Chem. 277:32046-32053, 2002.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 a la FIG. 16 son los resultados de la selección sistemática de los efectos de inhibición de TNF-a sobre monocitos.
La FIG. 17 a la FIG. 35 son los resultados de la selección sistemática de los efectos de inhibición de TNF-a sobre la línea celular THP-1.
Las FIG. 36 a 108 son los resultados de los análisis por transferencia de western de los péptidos seleccionados que presentan acumulación de HMGB1 en la célula.
Descripción detallada de la invención
Dado que la presente invención puede tener adaptabilidad para diversas transformaciones y ejemplos de aplicación práctica, a continuación se da una descripción más detallada de la presente invención. No obstante, esto no significa que limite la forma de la aplicación práctica; debería entenderse que la intención es incluir el concepto y el alcance de la tecnología en todas las transformaciones, equivalentes a alternativas. En la descripción de la presente invención, si se considera que cualquier descripción detallada sobre la técnica anterior deteriora los principios fundamentales de la presente invención, la descripción se omitirá.
Un telómero es conocido como una secuencia repetitiva de material genético en los extremos de los cromosomas que evita que los cromosomas se dañen o se fusionen con otros cromosomas. La longitud de un telómero se acorta con cada división celular, y después de un determinado número de divisiones celulares, la longitud del telómero se acorta de manera extrema hasta el punto en el que la célula deja de dividirse y muere. Por otra parte, se sabe que la elongación de los telómeros prolonga la esperanza de vida de una célula. Por ejemplo, las células cancerosas excretan una enzima llamada telomerasa, que evita el acortamiento de los telómeros, dando así como resultado la proliferación de células cancerosas. La presente invención se llevó a cabo tras el descubrimiento de péptidos derivados de la telomerasa con efectos antiinflamatorios.
En una realización de la presente invención, se proporciona un péptido con actividades antiinflamatorias. El péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:51 y 108.
Los péptidos descritos en la SEQ ID NO:1 a la SEQ ID NO:161 son como en la siguiente tabla 1. La SEQ ID NO:162 enumera el orden de la proteína telomerasa humana de longitud completa. La SEQ ID NO:163 enumera el péptido derivado de la telomerasa que consiste en una secuencia de 16 aminoácidos.
Tabla 1
Figure imgf000004_0001
continuación
Figure imgf000005_0001
continuación
Figure imgf000006_0001
continuación
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(continuación)
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continuación
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En una realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que codifica un péptido con actividades antiinflamatorias. El polinucleótido codifica un péptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51 y 108. El polinucleótido mencionado anteriormente permite la producción de los péptidos en grandes cantidades. Por ejemplo, el cultivo de vectores que incluyen polinucleótidos que codifican péptidos que permiten la producción de péptidos en grandes cantidades. En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, los términos “homología” e “identificación de secuencia” se usan de manera intercambiable para indicar el grado de solapamiento de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos (o si fuese relevante: ácido nucleico).
Salvo que se indique de otro modo, la expresión “identidad de secuencia” para péptidos tal como se usa en el presente documento se refiere a la identidad de secuencia calculada como (nre f - nd¡f)-100/nref, en la que nd if es el número total de restos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean de tal manera que un número máximo de aminoácidos son idénticos, y en la que nre f es el número de restos en la secuencia más corta. Por lo tanto, la secuencia de ADN agtcagtc tendrá la identidad de secuencia del 75 % con la secuencia aatcaatc (nd f=2 y ne =8).
En algunas realizaciones, la identidad de secuencia se determina mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85:2444, usando el algoritmo CLUSTAL W de Thompson y col., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group). El algoritmo BLAST (Altschul y col., 1990, Mol. Biol. 215:403-10) para el cual se puede obtener el programa informático del National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/) también se puede usar. Cuando se usa cualquiera de los algoritmos mencionados anteriormente, se usan los parámetros por defecto para la longitud de "ventana", penalización de hueco, etc.
En una realización de la presente invención, los cambios en la secuencia de aminoácidos pertenecen a la modificación de las características físicas y químicas del péptido. Por ejemplo, la transformación de los aminoácidos se puede realizar mejorando la estabilidad térmica del péptido, alterando la especificidad del sustrato y cambiando el pH óptimo.
En una realización de la presente invención, un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico que pueden ser moléculas de ADN o de ARN espontáneas o artificiales, bien de cadena simple o de cadena doble. La molécula de ácido nucleico puede ser de uno o más ácidos nucleicos del mismo tipo (por ejemplo, que tienen una misma secuencia de nucleótidos) o de ácidos nucleicos de diferentes tipos. Las moléculas de ácido nucleico comprenden uno o más ADN, ADNc, ADN señuelo, ARN, ARNsi, ARNmi, ARNsh, ARNst, ARNpno, ARNpn PNA, oligómero antisentido, plásmido y otros ácidos nucleicos modificados, pero sin limitación a estos.
Una proteína HMGB1 se conoce como una citocina. Primero se somete a acetilación y translocación al citoplasma mediante estimulación externa. Después se secreta fuera de la célula, cumpliendo, por lo tanto, el papel de citocina causante de la inflamación. Dado que cuando se tiene una inflamación debido a tal actividad, la proteína HMGB1 se secreta fuera de la célula, y los pacientes con enfermedades inflamatorias tales como síndrome de Churg-Strauss, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren presentarán elevados niveles séricos de HMGB1. Por lo tanto, si el núcleo contiene grandes cantidades de HGMB1 incluso cuando hay un estímulo que provoca la inflamación, es sugerente del hecho de que HMGB1 no se está secretando fuera de la célula, lo que significa que se está suprimiendo la inflamación.
En una realización de la presente invención, cuando se trata una célula con un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos cualquiera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:51 y 108, la cantidad de HGMB1 dentro del núcleo aumenta. Esto representa que los péptidos mencionados anteriormente tienen excelentes efectos preventivos o supresores de la inflamación.
Además, en realizaciones específicas de la presente invención, un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos cualquiera seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID nO:51 y 108 tiene la ventaja de que tiene alta viabilidad debido a su baja toxicidad dentro de una célula.
En la presente invención, una "enfermedad inflamatoria" es una indicación amplia que se refiere a cualquier enfermedad que designa una inflamación como una causa principal o una inflamación causada por la enfermedad. Específicamente, una enfermedad inflamatoria incluye (1) enfermedad inflamatoria general o localizada (por ejemplo, alergias; enfermedad por inmunocomplejo; fiebre del heno; choque hipersensible; choque por endotoxina; caquexia, hipertermia; granulomatosis; o sarcoidosis); (2) enfermedades relacionadas con el aparato digestivo (por ejemplo, apendicitis; úlcera gástrica; úlcera duodenal; peritonitis; pancreatitis; colitis ulcerosa, aguda o isquémica; colangitis; colecistitis, esteatorrea, hepatitis, enfermedad de Crone; o enfermedad de Whipple); (3) enfermedades relacionadas con la piel (por ejemplo, psoriasis; quemaduras; quemaduras solares; dermatitis; verrugas urticantes o habones); (4) enfermedades relacionadas con el sistema vascular (por ejemplo, angiitis; vasculitis; endocarditis; arteritis; aterosclerosis; tromboflebitis; pericarditis; insuficiencia cardíaca congestiva; miocarditis; isquemia miocárdica; periarteritis nodosa; estenosis recurrente; enfermedad de Buerger; o fiebre reumática); (5) enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma; epiglotitis; bronquitis; enfisema; rinitis; fibrosis quística; neumonitis intersticial; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); síndrome de distrés respiratorio del adulto; coniosis; alveolitis; bronquiolitis; faringitis; pleuritis; o sinusitis); (6) enfermedades relacionadas con los huesos, articulaciones, músculos y tejidos conectivos (por ejemplo, granuloma eosinófilo; artritis; artralgia; osteomielitis; dermatomiositis; fascitis; enfermedad de Paget; gota; periodontitis; artritis reumatoide; miastenia grave; espondilitis anquilosante; o sinovitis); (7) trastornos urogenitales (por ejemplo, epididimitis; vaginitis; prostatitis; o uretritis); (8) enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer; meningitis; encefalitis; esclerosis múltiple; infarto cerebral; embolia cerebral; síndrome de Guillain-Barre; neuritis; neuralgia; lesión de la médula espinal; parálisis; o uveítis); (9) enfermedades infecciosas por virus (por ejemplo, virus de la gripe; virus respiratorio sincicial; VIH; virus de la hepatitis B; de hepatitis C; o virus herpes) (por ejemplo, fiebre del dengue; o septicemia), infección fúngica (por ejemplo, candidiasis); o bacteriana, por parásitos, e infecciones microbianas similares (por ejemplo, bacteriemia diseminada; malaria; oncocercosis; o amebiasis); (10) enfermedades autoinmunes (por ejemplo, tiroiditis; lupus; síndrome de Goodpasture; rechazo a aloinjerto; enfermedad de injerto frente a huésped; o diabetes); y (11) cáncer o enfermedad tumoral (por ejemplo, linfoma de Hodgkin), pero sin limitación a estos.
Tratar el componente inflamatorio de tales enfermedades ha sido la principal meta de las industrias farmacéuticas globales durante varias décadas, y se han desarrollado una amplia variedad de tratamientos útiles. Los ejemplos incluyen los corticoesteroides (un rango de agentes naturales, semisintéticos y sintéticos diseñados para simular el efecto del cortisol, que incluye la prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, fluticasona, etcétera), inhibidores de ciclooxigenasa (no selectivos o selectivos de cox-1, tales como indometacina, sulfasalazina y aspirina, y más recientemente selectivos de cox-2, tales como celecoxib), bloqueantes de leucotrieno (tales como monteleukast) y anti-TNF (tales como anticuerpos neutralizantes monoclonales modificados, que incluyen infliximab (Remicade™) y adalimumab (Humira™), proteínas de fusión del receptor de TNF, tales como etanercept (Enbrel™), así como los inhibidores de la síntesis de TNF-a de moléculas pequeñas como la talidomida).
En una realización de la presente invención, se proporciona una composición antiinflamatoria que comprende un péptido como principio activo. El péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID No :51 y 108.
En una realización de la presente invención, la composición antiinflamatoria puede contener de 0,1 pg/mg a 1 mg/mg, específicamente de 1 pg/mg a 0,5 mg/mg, más específicamente de 10 pg/mg a 0,1 mg/mg de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:51 y 108. Cuando el péptido está contenido dentro del rango mencionado anteriormente, toda la seguridad y estabilidad de la composición puede ser satisfactoria y apropiada en términos de rentabilidad.
En una realización de la presente invención, la composición puede tener aplicación con todos los animales, incluyendo el ser humano, perro, pollo, cerdo, vaca, oveja, cobaya y mono.
En una realización de la presente invención, la composición médica es para el uso de tratamiento o profilaxis de la enfermedad inflamatoria con un principio activo que se compone de un péptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:51 y 108. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica se puede administrar por vía oral, rectal, transdérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, en médula ósea, epidural o subcutánea.
Las formas de administración oral pueden ser, aunque sin limitación, comprimidos, píldoras, cápsulas blandas o duras, gránulos, polvos, solución o emulsión. Las formas de administración no oral pueden ser, aunque sin limitación, inyecciones, infusiones intravenosas, lociones, pomadas, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, supositorio, parche o pulverizador.
En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica, si es necesario, puede contener aditivos, tales como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromatizantes o edulcorantes. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica se puede fabricar mediante procedimientos convencionales de la industria en la materia.
En una realización de la presente invención, el principio activo de la composición médica puede variar de acuerdo con la edad, el sexo, el peso, la patología y el estado del paciente, la vía de administración o el criterio del médico. La dosificación basada en estos factores se determina dentro de los niveles por los expertos en la materia, y la dosis diaria por ejemplo puede ser, aunque sin limitación, de 0,1 pg / kg / día a 1 g / kg / día, específicamente de 1 pg / kg / día a 10 mg / kg / día, más específicamente de 10 pg / kg / día a 1 mg / kg / día, más específicamente de 50 pg / kg / día a 100 pg / kg / día. En una realización de la presente invención, La composición farmacéutica puede administrarse, aunque sin limitación, de 1 a 3 veces al día.
En una realización de la presente invención, se proporciona una composición externa de la piel para la reducción o la prevención de inflamación de la piel. La composición externa de la piel puede contener un principio activo que es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID NO:51 y 108.
En otra realización de la presente invención, se proporciona una composición de cosmético para la reducción o la prevención de inflamación de la piel. La composición de cosmético puede contener un principio activo que es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51 y 108.
En una realización de la presente invención, la composición de aplicación externa o la composición de cosmético se puede proporcionar en todas las formas apropiadas para aplicaciones tópicas. Por ejemplo, las formas se pueden proporcionar como soluciones, emulsiones obtenidas mediante la dispersión de fase de aceite en agua, emulsión obtenida mediante la dispersión de agua en fase oleosa, suspensión, sólido, gel, polvo, pasta, espuma o aerosol. Estas formas se pueden fabricar mediante procedimientos convencionales de la industria en la materia.
En una realización de la presente invención, la composición de cosmético puede incluir, dentro de los niveles que no perjudicarán al efecto principal, otros ingredientes que pueden aumentar de forma deseable el efecto principal. En una realización de la presente invención, la composición de cosmético puede incluir adicionalmente, hidratantes, agentes emolientes, tensioactivos, absorbentes de UV, conservantes, fungicidas, antioxidantes, agente de ajuste de pH, pigmentos orgánicos o inorgánicos, aromáticos, agente refrigerante o antitranspirante. La relación de formulación de los principios activos mencionados anteriormente la pueden decidir los expertos en la materia dentro de los niveles que no perjudicarán el fin y los efectos de la presente invención, y la relación de formulación basada en el peso total de la composición de cosmético puede ser del 0,01 al 5 % en peso, específicamente del 0,01 al 3 % en peso.
En una realización de la presente invención, se proporciona una composición alimenticia para la prevención o la supresión de la inflamación. La composición alimenticia puede contener un principio activo que es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51 y 108.
En una realización de la presente invención, la composición alimenticia no se limita a las formas, pero por ejemplo puede ser formas de gránulos, polvo, líquido y sólido. Cada forma puede estar formada con ingredientes usados comúnmente en la industria elegidos de manera apropiada por los expertos en la materia, además del principio activo, y pueden aumentar el efecto con otros ingredientes.
La decisión para la dosificación del principio activo mencionado anteriormente está dentro del nivel de los expertos en la materia, y la dosificación diaria puede ser, por ejemplo, de 1 |jg / kg / día a 10 mg / kg / día, más específicamente de 10 jg / kg / día a 1 mg / kg / día, más específicamente de 50 jg / kg / día a 100 jg / kg / día, pero no se limita a estos números y puede variar de acuerdo con la edad, el estado de salud, las complicaciones y otros diversos factores.
En una realización de la presente invención, se proporciona un uso de prevención o tratamiento de enfermedad inflamatoria con un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:51 y 108.
En una realización de la presente invención, se proporciona el procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad inflamatoria con aplicación en pacientes de los péptidos mencionados anteriormente.
En una realización de la presente invención, se proporciona un kit para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias. El kit puede contener: un péptido con actividad antiinflamatoria o una composición que comprende el péptido, en la que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos cualquiera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ iD NO:51 y 108; e instrucciones que incluyen al menos uno de administración de la dosis, vía de administración, frecuencia de administración e indicaciones del péptido o de la composición.
Los términos usados en el presente documento pretenden ser usado para describir las realizaciones, no para limitar la presente invención. Los términos sin números delante no son para limitar la cantidad, sino para mostrar que puede haber más de una cosa del término usado. Las expresiones "que incluye", "que tiene", "que consiste" y "que comprende" se interpretarán abiertamente (es decir, "que incluye pero no se limita a").
Se usa la mención de un intervalo de números en lugar de indicar números separados dentro del intervalo, de manera que salvo que se indique de manera explícita, cada número se puede leer como números separados integrados en el presente documento. Los valores finales de todos los intervalos se incluyen en el intervalo y se pueden combinar de forma independiente.
Salvo que se indique otra cosa o claramente se contradiga por el contexto, todos los procedimientos mencionados en el presente documento se pueden realizar en el orden apropiado. El uso de cualquier realización y toda realización, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, que use "como ~"), salvo que se incluya en las reivindicaciones, se usa para describir más claramente la presente invención, no para limitar el ámbito de la presente invención. Cualquier lenguaje en el presente documento fuera de las reivindicaciones no debería de interpretarse como una necesidad de la presente invención. Salvo que definan de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado que normalmente entiende un experto en la materia a la que pertenece la invención.
Las realizaciones preferidas de la presente invención son el mejor modo conocido por los inventores para realizar la presente invención. Puede resultar claro para los expertos en la técnica después de leer las declaraciones antes de las variaciones en las realizaciones preferidas. Los presentes inventores esperan que los expertos en la materia puedan usar las variaciones de forma adecuada y que la presente invención se lleve a cabo de otras formas que las enumeradas en el presente documento. Por lo tanto, la presente invención, según lo permitido por la ley de patentes, incluye equivalentes y variaciones de la misma, de los puntos clave de la invención indicada en las reivindicaciones adjuntas. Además, todas las variaciones posibles dentro de cualquier combinación de los componentes mencionados anteriormente se incluyen en la presente invención, salvo que se indique explícitamente lo contrario o se contradiga por el contexto.
Se sabe que el factor de necrosis tumoral (TNF), particularmente TNF-a, se libera desde las células inflamatorias y provoca diversas reacciones citotóxicas, reacciones inmunológicas y reacciones inflamatorias. Se sabe que el TNF-a está implicado en la aparición y en la prolongación de muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunes y que además provoca septicemia y choque séptico cuando se libera a la sangre y actúa de forma sistémica. Dado que el TNF-a es un factor asociado ampliamente con el sistema inmunitario de un ser vivo, el desarrollo de agentes que inhiben el TNF-a se lleva a cabo de forma activa. El TNF-a se biosintetiza en una forma activa y llega a ser una forma activa mediante la escisión por proteasa; la enzima responsable de la activación se llama enzima convertidora de factor de necrosis tumoral (TACE). Por lo tanto, una sustancia que inhibe esta TACE puede tratar, mejorar o prevenir enfermedades, afecciones patológicas, afecciones anómalas, problemas, síntomas adversos y similares atribuidos al TNF-a.
La proteína de alta movilidad del grupo Box-1 (HMGB1) existe en altas concentraciones en el timo, en los nódulos linfáticos, en los testículos y en el hígado fetal, y salvo en las células del hígado y del cerebro, normalmente existe dentro del núcleo. Dicha proteína HMGN1 tiene 3 dominios que consisten en A-box, B-box y C-terminal.
Tracey y col., 1999 documentaron que la proteína HMGB1 tiene un papel como una citocina que induce inflamación, y el mecanismo de inducción de inflamación de dicha HMGB1 es mediante un estímulo externo que provoca la acetilación de HMGB1 que, entonces, se desplaza desde el núcleo hasta el citoplasma. Después, se sabe que se secreta fuera de la célula, o se secreta fuera de la célula en necrosis. (Bonaldi T y col., EMBO J, (22)5551-60, 2003). La invención se describe adicionalmente mediante las figuras, los siguientes ejemplos y experimentos, que son únicamente para el fin de ilustrar realizaciones específicas de la presente invención, y no para interpretarlos de ningún modo como limitantes del ámbito de la invención.
Ejemplo 1
Síntesis de PEP-1 y medición de actividades antiinflamatorias de PEP-1 (SEQ ID NO:1)
Experimento 1. Síntesis de PEP-1 (SEQ ID NO:1)
Se sintetizó un péptido comprendido por 16 aminoácidos con la estructura química 1 como a continuación que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (PEP-1) que deriva de la telomerasa humana:
<Est ruct ura Quí mi ca 1>
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La SEQ ID NO:1 (PEP-1) se sintetizó de acuerdo con el procedimiento existente de síntesis de péptidos en fase sólida. En detalle, los péptidos se sintetizaron acoplando cada aminoácido del extremo C-terminal a través de síntesis de péptidos en fase sólida de Fmoc, SPPS, usando ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon ROK). Los péptidos con su primer aminoácido en el extremo C-terminal que se une a la resina se utilizaron de la siguiente manera: NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Resina de tritilo
NH2-Ala-2-cloro-Resina de tritilo
NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-Resina de tritilo
Todos los materiales de aminoácidos para sintetizar el péptido estaban protegidos por Fmoc en el extremo N-terminal, y los restos de aminoácidos estaban protegidos por Trt, Boc, t-Bu (t-butiléster), Pbf (2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofuran-5-sulfonilo) que se puede disolver en ácido. Tal como:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Ácido mercaptoacético.
HBTU[2-(hexafluorofosfato de 1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetametilaminio] / HOBt [N-Hidroxibenzotriazol] /NMM [4-Metilmorfolina] se usaron como los reactivos de acoplamiento. Se usó la piperidina en DMF al 20 % para eliminar el Fmoc. Con el fin de eliminar la protección de los restos o de separar el péptido sintetizado de la resina, se usó la mezcla de escisión [TFA (ácido trifluoroacético) /TIS (triisopropilsilano) / e Dt (etanoditiol) / H2O=92,5/2,5/2,5/2,5]. Se sintetizó el péptido utilizando el andamiaje de fase sólida combinado con el aminoácido de partida con la protección de aminoácidos, haciendo reaccionar los aminoácidos correspondientes por separado, lavando con disolvente y desprotegiendo, y repitiendo el procedimiento. Después de cortar el péptido sintetizado de la resina, se purificó mediante HPLC y se verificó la síntesis mediante MS y después se liofilizó.
El procedimiento de síntesis específico de PEP1 se describe a continuación.
1) Acoplamiento
Fusionar el aminoácido (8 equivalentes) protegido con NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Resina de tritilo, y el agente de acoplamiento HBTU(8 equiv.)/HOBt(8 equiv.)/NMM(16 equiv.) y añadir a DMF, después dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, después lavar con DMF, MeOH y DMF en ese orden.
2) Desprotección de Fmoc
Añadir piperidina al 20 % en DMF y dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos 2 veces, después lavar con DMF, MeOH y DMF en ese orden.
3) Hacer el marco básico del péptido repitiendo las reacciones 1 y 2 repetidamente.
4) Escisión: Añadir la mezcla de escisión al péptido sintetizado por completo y separar el péptido de la resina. 5) Añadir éter dietílico refrigerante a la mezcla obtenida, y luego centrifugar para precipitar el péptido recogido.
6) Tras la purificación mediante Prep-HPLC, comprobar el peso molecular mediante LC/MS y liofilizar para producirlo en forma de polvo.
Experimento 2: Medición de la actividad antiinflamatoria de PEP 1
Cultivo de líneas celulares
Las células de macrófago Raw 264.7 (KCBL, 40071) de Korea Cell Bank se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; PAA, Austria) que contiene suero bovino fetal al 10 % (FBS; Gibco Laboratories), 100 unidades/ml de estreptomicina, y penicilina (Gibco Laboratories) a 37 °C con CO2 al 5 %. Las células Raw264.7 se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 106 células/ml y se dejó incubar toda la noche. Al día siguiente, se reemplazó el medio con medio reciente y se añadieron a las células 5 pg/ml de péptido (obtenido tal como se describe en el ejemplo del Experimento 1). Después de 30 minutos de incubación de las células con el péptido se añadieron 50 pl de LPS (hasta una concentración final de 1 pg/ml) y las células se incubaron durante 24 horas adicionales. La muestra experimental con la inducción de respuesta inflamatoria se trató con 1 pg/ml ml de lipopolisacárido (LPS; Sigma, EE.UU.) y la muestra experimental se trató con solución salina tamponada con fosfato (PBS; a pH 7,2). Se recolectaron muestras de sobrenadante de cada afección en tubos eppendorf y se sometieron a análisis adicionales.
Experimento 2-1. Análisis del nivel de NO
El nivel de óxido nítrico (NO) se midió en las células Raw 264.7 (1 x 106 células/ml) usando el sistema del reactivo de Griess (Promega, EE.UU.). Se añadió medio de cultivo de 50 pl a una placa de 96 pocillos y se añadió solución de reactivo de Griess I (NED) y reactivo de Griess II (solución de sulfaniliamida) en la misma cantidad. Tras incubar 10 minutos las células con los reactivos, se midió la densidad óptica a 540 nm en 30 minutos usando un lector de microplaca (Molecular Devices, EE.UU.). Se calculó la concentración de NO usando una curva estándar (0-100 j M) de nitrito de sodio.
Tal como se muestra en la Tabla 3, a continuación, la estimulación de las células con LPS aumentó la expresión de NO, pero en cotratamiento con LPS y Pép1, el nivel de expresión del NO mencionado anteriormente se redujo. El NO se produce durante la inflamación, y el resultado de que Pép1 redujo el nivel de NO al 65% del control apoya el efecto antiinflamatorio de Pép1.
Tabla 3. La medición del efecto antiinflamatorio de PEP1 derivado de telomerasa humana
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Experimento 2-2. Análisis del efecto inhibidor de citocina
Para investigar el efecto de PEP1 en la inhibición de la producción de citocina proinflamatoria, las células RAW 264.7 se pretrataron con PEP 1 a una concentración de 5 jg/ml, se expusieron con LPS a una concentración de 1 jg/ml, y las células se incubaron adicionalmente durante 24 horas. Las muestras de sobrenadante que contienen el medio de cultivo celular se recolectaron y se analizaron los niveles de citocina usando kits de ELISA (eBioscience, San Diego).
Las placas de 96 pocillos se recubrieron con 100 j l de anticuerpos de captura (diluidos en tampón de recubrimiento hasta la concentración recomendada por el protocolo del fabricante) toda la noche a 4 °C. Después, tras lavar las placas 5 veces, se añadieron 200 j l de diluyentes de ensayo a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente para el bloqueo. Tras lavar cada pocillo con tampón de lavado cinco veces, la muestra de cultivo celular o cada muestra de proteína estándar de citocina se diluyó y se añadieron 100 j l de cada en cada pocillo. La placa que contenía las muestras se incubó toda la noche a 4 °C.
Después, tras lavar la placa cinco vece con el tampón de lavado, se añadieron 100 j l de anticuerpo secundario conjugado con avidina y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
Tras la incubación con el anticuerpo secundario, se lavó la placa cinco veces y se incubó con 100 j l de avidina-HRP (BD Bioscience) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras lavar la placa siete veces, se añadieron 100 j l de solución TMB (Pierce) y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 50 j l de 2N H2SO4 en cada pocillo. Se midió la densidad óptica a 450 nm usando un lector de microplaca. Se realizó el análisis estadístico mediante análisis de la varianza usando el procedimiento de ANOVA del programa SPSS, y se verificó la significación entre los análisis usando la prueba del rango múltiple de Duncan.
Experimento 2-3. Medición de la secreción de IL-6
Tal como se muestra en la Tabla 4, a continuación, el tratamiento solo con LPS aumentó la secreción de citocina IL-6 (interleucina-6). Sin embargo, el cotratamiento con LPS y PEP-1 mostró una reducción en el nivel de secreción de citocina proinflamatoria IL-6. Lo más importante, tras el tratamiento con PEP-1, el nivel de secreción de citocina proinflamatoria se redujo en más del 70 %, lo que indica un fuerte efecto antiinflamatorio de Pép1.
Tabla 4. Inhibición de la producción de citocina IL-6 mediante PEP-1
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Experimento 2-4. Inhibición de la expresión de HMGB1, TNF-a, COX-2
El nivel de expresión de proteína se determinó mediante análisis por transferencia de Western. Las células cultivadas en medio que contenía PEP-1 se lavaron con PBS, se trataron con tripsina-EDTA al 0,05 % y se recolectaron mediante centrifugación. Las células recolectadas se disolvieron en un volumen apropiado de tampón de lisis. Los sedimentos intracelulares se sedimentaron mediante centrifugación y la misma cantidad de proteína de cada muestra se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. La proteína separada se transfirió a la membrana de nitrocelulosa (Schleicherand Schuell, Keene, NH, EE.UU.), después se ensayó el anticuerpo específico para cada proteína. La membrana se incubó con solución ECL (quimioluminiscencia mejorada) (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, EE.UU.), se expuso a rayos X y se analizó el nivel de expresión de proteínas de acuerdo con el nivel de exposición mostrado en la película de rayos X.
Se realizó el análisis por transferencia de Western para determinar el efecto inhibidor de Ppép1 sobre el la expresión de proteína de citocina. Tal como se muestra en la Tabla 5, a continuación, la estimulación de las células con LPS aumentó la expresión de citocinas; HMGB1, TNF-a y COX. Sin embargo, si las células se trataban con LPS y Pép1, el nivel de expresión de citocinas proinflamatorias mencionado anteriormente se reducía. El resultado que muestra que el tratamiento con Pép1 redujo los niveles de citocina proinflamatoria en más del 70 % proporciona una fuerte evidencia que mantiene el efecto antiinflamatorio de Pép1.
Tabla 5. La medición del efecto inhibidor de Pép1 sobre el nivel de expresión de citocina proinflamatoria.
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Ejemplo 2
Efecto inhibidor de TNF-a de los péptidos de la serie PEP RIA (SEQ ID NO: 1 a 161)
Basándose en los resultados del Ejemplo 1 en el que la SEQ ID NO:1 (PEP1) tiene el efecto inhibidor de TNF-a, se llevó a cabo un experimento usando los péptidos de las SEQ ID NO:1 a 161 para confirmar su efecto inhibidor de TNF-a. La síntesis de péptidos de la SEQ ID NO:1 a 161 usó el mismo procedimiento mencionado anteriormente en el Ejemplo 1 (procedimiento usado para la síntesis de PEP1), pero los aminoácidos añadidos eran diferentes.
Experimento 1: cultivo celular
La capa de PBMC (células mononucleares de la sangre periférica) se separó de las muestras de sangre (50 ml) recolectadas en sujetos sanos usando la solución de separación Biocoll (Biochrom AG, Berlín, Alemania). Las PBMC recolectadas se enriquecieron en medio RPMI 1640 que contiene suero humano al 20 % durante 30 minutos, y después se transfirieron a una placa de cultivo celular de poliestireno de 100 mm recubierta con suero humano para incubación durante 2 horas a 37 °C, en incubador con CO2 al 5 %. Los monocitos se desprendieron de la parte inferior de la placa usando PBS frío y se incubaron hasta alcanzar el número de 1 x 105 células/pocillo en placas de 96 pocillos con medio RPMI 1640 (suplementado con penicilina-estreptomicina; 100 mg/ml, suero humano; 20 %) toda la noche.
Experimento 2: Análisis del efecto inhibidor de TNF-a en monocitos que derivan de PBMC
Se realizó un ELISA para averiguar cómo influyen los péptidos de la serie PEP RIA en el nivel de TNF-a. Los monocitos que derivan de PBMC se incubaron hasta alcanzar el número de 1 x 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y después se trataron con LPS (lipopolisacárido; 10 ng/ml, Sigma) durante 2 horas. Para los monocitos que se lavaron tres veces con PBS, se añadió medio de cultivo OPTI-MEM para inducir la inanición de las células durante una hora, se extrajeron 4 pM del péptido y se incubaron durante 2 horas. Hubo tres grupos de control negativo. El primer grupo no se trató con nada. El segundo grupo se trató con estrógeno (en este experimento, se usó el estradiol como un tipo de estrógeno). El tercer grupo se trató con LPS (10 ng/ml) o con LPS (10 ng/ml) así como con estrógeno (20 nM). Se usó el PEP1 que fue confirmado que tenía actividad inhibidora de TNF-a como un control positivo para medir la actividad de inhibición de TNF-a. Después de la incubación, se midió el TNF-a siguiendo el manual del kit de ELISA (R&D, Minneapolis, MN, EE.UU.). Los detalles del procedimiento de cuantificación se pueden hallar en el Experimento 2.2 del Ejemplo 1.
Usando el procedimiento indicado anteriormente, se seleccionaron sistemáticamente los péptidos con efecto inhibidor de TNF-a. Los monocitos que derivan de PBMC se estimularon con LPS (10 ng/ml), que es endotoxina, durante 2 horas y se indujo inanición añadiendo OPTI-MEM durante 1 hora. Después de esto, se trataron 4 pM de 161 péptidos y se incubaron durante 2 horas. Se midió la cantidad de TNF-a en el medio de cultivo celular usando ELISA, y se seleccionaron sistemáticamente los péptidos con efecto inhibidor de TNF-a mediante comparación en los controles negativo y positivo (FIG. 1 a FIG. 16).
Lo siguiente son los péptidos que mostraron efecto inhibidor de TNF-a cuando se compararon con el grupo de control que se trató con solo LPS: SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 a 21, SEQ ID NO:23 a SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39 a SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47 a SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55 a SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63 a SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84 a SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 99 a SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO:107 a SEQ ID NO:109, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO:120 a SEQ ID NO:122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO:129 a SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:142 a SEQ ID NO:144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO:149, y SEQ ID NO:155 a SEQ ID NO:159.
Además, lo siguiente son los péptidos que mostraron efecto inhibidor de TNF-a cuando se compararon con el grupo de que se trató con LPS y estrógeno: SEQ ID NO:15 a SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:23 a SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:31 a SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:39 a SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO:51 a SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55 a SEQ ID NO:58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:65 a SEQ ID NO:68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:73 a SEQ ID NO:79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO:84 a SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:8=90 a SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:101 a SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:107 a SEQ ID NO:109, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO:129 a SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:142 a SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO:149, y SEQ ID NO:157 a SEQ ID NO:159.
Experimento 3: Análisis de péptidos que afectan al nivel de TNF-a en la línea celular THP1
El experimento se llevó a cabo usando la línea celular THP-1 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE.UU) que es de leucemia monocítica aguda.
Las células THP-1 se incubaron hasta alcanzar el número de 1 x 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos con medio RPMI 1640 durante 24 horas, seguido por la adición de 100 pM de PMA (forbol-12-miristato 13-acetato) para la diferenciación en macrófagos. Tras la diferenciación de THP-1 en macrófagos mediante PMA durante un día, se trató con LPS durante 2 horas y se lavó. Después siguió la inanición durante una hora y el tratamiento con PEP1. Las células THP-1 diferenciadas mediante PMA se trataron con LPS (lipopolisacárido; 10 ng/ml, Sigma) durante 2 horas, seguido por 2 veces de lavado con PBS. A las células se les añadió medio de cultivo OPTI-MEM para inducir la inanición de las células durante una hora, y se extrajo 1 pM de 161 péptidos y se incubó durante una hora. Después de la incubación, se midió el nivel de TNF-a usando el kit de ELISA y se seleccionaron sistemáticamente los péptidos que reducen el nivel de TNF-a (FIG. 17 a FIG. 35).
Como resultado, los péptidos de la SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:32 a SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55 a SEQ ID NO:60, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72 a SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84 a SEQ ID NO:92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO:99 a SEQ ID NO:112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO:127 a SEQ ID NO:144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO:151 y SEQ ID NO:153 a SEQ ID NO:161 parecieron reducir el nivel de TNF-a en comparación con el grupo de control tratado solo con LPS.
Además, SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 a SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:33 a SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO:157 y SEQ ID NO:159 se seleccionaron como péptidos que reducen el nivel de expresión de TNF-a en comparación con el del grupo tratado con LPS y estrógeno.
Ejemplo 3
Efectos de los péptidos (SEQ ID NO:1 a 161) sobre la inflamación por proteína ¡5-amiioide
La HMGB1 primero se somete a acetilación y translocación al citoplasma mediante estimulación externa. Después se secreta fuera de la célula, cumpliendo, por lo tanto, el papel de citocina causante de la inflamación. Dado que cuando se tiene una inflamación debido a tal actividad, la proteína HMGB1 se secreta desde la célula, y los pacientes con enfermedades inflamatorias tales como síndrome de Churg-Strauss, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren presentarán elevados niveles séricos de HMGB1. Por lo tanto, si el núcleo contiene grandes cantidades de HGMB1 incluso cuando hay un estímulo que provoca la inflamación, es sugerente del hecho de que HMGB1 no se está secretando fuera de la célula, lo que significa que se está suprimiendo la inflamación.
Experimento 1. Cultivo celular
Las células PC12 no diferenciadas (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.) se mantuvieron en crecimiento de fase logarítmica en placas de poli-1-lisina (Sigma, Saint Louis, MO, USA) de 100 mm precubiertas (Corning, PA, EE.UU.) en medio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, EE.UU.) que contienen suero de caballo al 10 % inactivado por calor, suero bovino fetal al 5 % inactivado por calor, 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina. Los cultivos se incubaron a 37 °C en una atmósfera húmeda con CO2 al 5 %. Los cultivos se cultivaron hasta una confluencia del 50 % y se recolectaron en solución salina equilibrada de Hank sin Ca2+/Mg2+ que contiene EDTA 1 mM. Las células se colocaron a una densidad de 1 x 106 células/placa de 100 mm y se incubaron durante 24 horas. Para la diferenciación neuronal, las células PC12 se sometieron a inanición de suero durante 12 horas (medio RPMI 1640 que contiene 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina sin suero de caballo o suero bovino fetal); después, las células se mantuvieron en medio sin suero. Después de dos días, se reemplazó el medio con medio reciente sin suero. En el día tres, se añadió NGF (50 ng/ml, Sigma, Saint Louis, MO, EE.Uu .) al medio, y los cultivos se mantuvieron durante tres días adicionales. Tras la diferenciación, las células nPC12 se incubaron con pamiloide 20 pM con varias concentraciones de los péptidos [0 (control), 1, 10 y 50 pM] durante 48 horas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido con actividad antiinflamatoria, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en: la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO:108.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido se origina de la telomerasa humana.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para su uso como un medicamento.
4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad inflamatoria.
5. Un polinucleótido que codifica un péptido seleccionado del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 108.
6. Una composición antiinflamatoria que comprende un péptido seleccionado del grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 108 como un principio activo.
7. La composición antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en un procedimiento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad inflamatoria, en la que la composición es una composición farmacéutica.
8. La composición antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en la reducción o la prevención de la inflamación de la piel, en la que la composición es una composición de cosmético.
9. La composición antiinflamatoria para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en (1) enfermedad inflamatoria general o localizada (por ejemplo, alergias; enfermedad por inmunocomplejo; fiebre del heno; choque hipersensible; choque por endotoxina; caquexia, hipertermia; granulomatosis; o sarcoidosis); (2) enfermedades relacionadas con el aparato digestivo (por ejemplo, apendicitis; úlcera gástrica; úlcera duodenal; peritonitis; pancreatitis; colitis ulcerosa, aguda o isquémica; colangitis; colecistitis, esteatorrea, hepatitis, enfermedad de Crohn; o enfermedad de Whipple); (3) enfermedades relacionadas con la piel (por ejemplo, psoriasis; quemaduras; quemaduras solares; dermatitis; verrugas urticantes o habones); (4) enfermedades relacionadas con el sistema vascular (por ejemplo, angiitis; vasculitis; endocarditis; arteritis; aterosclerosis; tromboflebitis; pericarditis; insuficiencia cardíaca congestiva; miocarditis; isquemia miocárdica; periarteritis nodosa; estenosis recurrente; enfermedad de Buerger; o fiebre reumática); (5) enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma; epiglotitis; bronquitis; enfisema; rinitis; fibrosis quística; neumonitis intersticial; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); síndrome de distrés respiratorio del adulto; coniosis; alveolitis; bronquiolitis; faringitis; pleuritis; o sinusitis); (6) enfermedades relacionadas con los huesos, articulaciones, músculos y tejidos conectivos (por ejemplo, granuloma eosinófilo; artritis; artralgia; osteomielitis; dermatomiositis; fascitis; enfermedad de Paget; gota; periodontitis; artritis reumatoide; miastenia grave; espondilitis anquilosante; o sinovitis); (7) trastornos urogenitales (por ejemplo, epididimitis; vaginitis; prostatitis; o uretritis); (8) enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer; meningitis; encefalitis; esclerosis múltiple; infarto cerebral; embolia cerebral; síndrome de Guillain-Barre; neuritis; neuralgia; lesión de la médula espinal; parálisis; o uveítis); (9) enfermedades infecciosas por virus (por ejemplo, virus de la gripe; virus respiratorio sincicial; VIH; virus de la hepatitis B; de hepatitis C; o virus herpes) (por ejemplo, fiebre del dengue; o septicemia), infección fúngica (por ejemplo, candidiasis); o bacteriana, por parásitos, e infecciones microbianas similares (por ejemplo, bacteriemia diseminada; malaria; oncocercosis; o amebiasis); (10) enfermedades autoinmunes (por ejemplo, tiroiditis; lupus; síndrome de Goodpasture; rechazo a aloinjerto; enfermedad de injerto frente a huésped; o diabetes); y (11) cáncer o enfermedad tumoral (por ejemplo, linfoma de Hodgkin).
10. Un kit para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias que comprenden: un péptido seleccionado del grupo que consiste en: la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO: 108.
11. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, el péptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, el polinucleótido de la reivindicación 5, la composición antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 6, o la composición antiinflamatoria para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el péptido es la SEQ ID NO: 51.
12. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, el péptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, el polinucleótido de la reivindicación 5, la composición antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 6, o la composición antiinflamatoria para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el péptido es la SEQ ID NO: 108.
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