KR20140012385A - 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 염증질환 치료용 조성물 - Google Patents

항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 염증질환 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 텔로머라제 펩티드II를 유효성분으로 포함하는 염증질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 펩티드는 염증을 매개하는 단백질의 발현을 증가 시킴으로써 효과적인 항염증 활성을 나타내며, 세포독성이 거의 없는 안정성이 뛰어난 염증질환 치료용 조성물이다. 따라서 다양한 염증성 질환 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 염증질환 치료용 조성물{Anti-inflammatory Peptides and Pharmaceutical Composition Containing Thereof}
본 발명은 항염증 활성을 갖는 펩티드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 염증질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증은 외부의 물리화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등의 감염, 허혈(post-ischemic), 독성 또는 자가면역 반응에 의한 생체 조직의 손상에 대한 국소적인 방어보호 반응으로 혈액성분이 손상된 조직으로 빠져나와 생기는 현상이다(Nathan, C., Nature 420:846-852(2002)). 일반적으로 이 과정은 감염 후의 회복 또는 치료가 이루어지지만, 이런 과정들이 과도하게 일어나거나 적절한 조절을 받지 못한다면 염증반응으로 인한 조직 손상 및 만성염증성 질환을 야기할 수도 있다.
염증 신호는 사이클로옥시게나제(COX) 경로 또는 리폭시게나제(LOX) 경로를 통하여 만들어지며, 염증신호에 의해 프로스타글란딘, 류코트리엔 또는 트롬복산 등이 생성되며, 염증신호에 의해 생체 내에서는 여러가지 변화가 일어나는데, 염증이 필요한 부위의 혈관이 확장되어 혈액공급이 왕성하게 되도록 하여 세균을 잡아먹는 호중구 등의 염증반응에 필요한 혈액세포를 공급하는 반응이 일어난다.
상기와 같이 염증 신호에 의한 방어 반응이 비정상적으로 과도하게 일어나면, 다양한 염증성 질환들이 나타나게 된다.
현재, 염증 억제 약물의 개발은 염증신호를 만드는 경로의 효소(예를 들어, COX-1, COX-2, 5-LOX 또는 12-LOX 등)를 억제하여 경로를 차단함으로써 염증반응을 억제하는 약물들이 개발되고 있다. 일례로, LOX는 염증반응 외에 기관지 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 아토피성 피부염, 건선 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
항염증 약물은 주로, 비스테로이드성 항염증제(NSAID)와 스테로이드성 항염증제(SAID)를 비롯한 다양한 기전의 항염증 약물들이 개발되어 알려져 있다. 이들은 부작용이 있을 뿐 만 아니라, 염증반응의 근본적인 치료에는 유효하지 않기에 좀 더 효과적이고, 안전성이 높으며, 경제적인 의약품의 개발이 필요하다.
대한민국 공개특허 제 2007-0090890호
Biochim Biophys Acta. 2010;1799(1-2):149-56.
본 발명의 목적은 광범위한 염증 질환에 사용할 수 있으면서, 세포독성이 낮아 안전성이 뛰어난 염증 질환 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
상기목적을 달성하기 위한, 본 발명은 텔로머라제 펩티드(이하 '펩티드 II'라고 칭함)를 유효성분으로 포함하는 염증질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 조성물은 포유류 정상세포에 대하여, 광범위한 염증반응에 작용할 수 있으며, 세포 내 독성이 낮아 생체 내 높은 안전성을 갖는 것이 특징이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 염증 질환 치료용 조성물은 염증 질환을 매개하는 단백질의 발현을 조절함으로써 항염증 효과가 광범위하게 나타내는 것이다. 특히, 염증 반응을 조절하고 있음이 알려진 단백질 중에서 HMGB1(High-mobility group protein B1) (Biochim Biophys Acta, 2010;1799(1-2):149-56), HSP70, HSP90(The FASEB Journal vol. 25 no. 8 2700-2710 ), Ki67, PI3K, pAkt, pGSK-3β, HSTF-1, Bcl-2, ADD153(Molecular Cardiology 2012 125, 1014-1026), i-NOS(Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 120 (2010) 76-85), e-NOS, Pyk2(AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY CELL AND MOLECULAR BIOLOGY VOL 42 2010 491-497), MAPK(Endocrine Reviews 22(2): 153-183), Bax, cytochrom-C 또는 caspase 3의 발현량을 조절하는 것이 특징 중의 하나이다.
항염증 활성은 염증 HMGB1(High-mobility group protein B1) 단백질의 생성을 증가시키는 것으로부터 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 펩티드 II는 텔로머라제를 구성하는 수많은 펩티드 중 30개의 아미노산(660-689)잔기로 이루어진 서열(ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRA; 서열번호 1)을 로 이루어진 합성한 '합성 펩티드'이다.
본 발명에서의 '염증질환'은 국소전신 또는 염증 자체 또는 염증 관련 질환을 의미한다. (1) 위장관계 질환(예를 들어, 충수염; 소화성 궤양; 위궤양; 십이지장 궤양; 복막염; 췌장염; 궤양성, 급성 및 허혈성 대장염; 후두개염; 담관염; 담낭염; 소아 지방 변증; 간염; 크론병; 장염; 및 휘플병); (2) 전신 또는 국소 염증 질환(예를 들어, 천식; 알레르기; 과민성 쇼크; 면역 복합체 질환; 기관 허혈; 재관류 손상; 기관 괴사; 고초열; 부패증(sepsis); 패혈증(septicemia); 내독소 쇼크; 악액질(cachexia); 초 이상 고열; 호산성 육아종; 육아종증 및 유육종증); (3)비뇨생식계 질환(예를 들어, 부고환염; 질염; 전립선염 및 요도염); (4)호흡계 질환(예를 들어, 기관지염; 기종(emphysema); 비염; 낭포성 섬유증; 간질성폐렴; 만성폐쇄성 질환(COPD); 성인 호흡 장애 증후군; 진폐증; 폐포염; 세기관지염; 인두염; 늑막염 및 부비강염); (4)다양한 바이러스(예를 들어, 인플루엔자; 호흡기 세포 융합 바이러스; HIV; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스 및 헤르페스 바이러스)에 의한 감염으로부터 발생하는 질환, 박테리아에 의한 감염으로부터 발생하는 질환(예를 들어, 산재성 균혈증; 댕기열), 진균에 의한 감염으로부터 발생하는 질환(예를 들어, 칸디다증) 및 원생 기생충 및 다세포 기생체에 의한 감염으로부터 발생하는 질병(예를 들어, 말라리아; 사상충증; 아메바증 및 포충낭); (5)피부과학적 질병 및 피부 병상(예를 들어, 건선; 화상; 피부염; 피부근염; 햇볕 화상; 담마진성 사마귀 및 팽진); (6)심혈관계 및 관련 조직에 관계된 질병(예를 들어, 혈관염; 맥관염; 심내막염; 동맥염; 죽상 동맥경화증; 혈전 정맥염; 심막염; 울혈성 심부전; 심근염; 심근 허혈증; 결절성 동맥 주위염; 재발 협착증 및 류머티즘열); (7)중추 또는 말초 신경계 및 관련 조직에 관계된 질병(예를 들어, 알츠하이머병; 수막염; 뇌염; 다발성 경화증; 뇌경색; 뇌색전증; 길라메-바 증후군(Guillame-Barresyndrome); 신경염; 신경통; 척수 외상; 마비 및 포도막염); (8)뼈, 관절, 근육 및 결합 조직 관련 질병(예를들어, 다양한 관절염 및 관절통; 골수염; 근막염; 패젯병; 통풍; 치주 질환; 류머티즘성 관절염; 및 윤활막염);(9)기타 자가 면역성 질환 및 염증 질환(예를 들어, 중증 근무력증, 갑상선염, 전신 홍반성 루프스병, 구드패스츄어 증후군, 버셋 증후군, 동종 이식 거부 반응, 이식편 대 숙주 병, 강직성 척추염, 버거씨병, 제1형 당뇨병, 및 레티어 증후군(Retier's syndrome)); 및 (10)다양한 암, 종양 및 증식성 질환(예를 들어, 호지킨병)에 대한 염증 반응 또는 면역 숙주 반응을 포함한다.
본 발명의 염증질환 치료용 조성물은 상기한 염증 질환을 매개하는 단백질의 발현을 조절함으로써 항염증 효과가 광범위하게 나타내는 것이다. 특히 염증 반응을 조절하고 있음이 알려진 단백질 중에서 염증에 의해 감소되었던 HMGB1(Biochim Biophys Acta. 2010;1799(1-2):149-56) 단백질의 발현량을 펩티드II의 투여에 의해 다시 증가되는 것이 특징이다.(도 1 참조)
상기 염증질환 치료용 조성물은 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다.
본 발명의 염증질환 치료용 조성물은 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다. 본 발명의 염증질환 치료용 조성물은 피내주사, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 또는 장관 등의 방법으로 투여가 가능하지만 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 염증질환 치료용 조성물의 투여량은 환자의 연령, 병증의 정도, 체중, 또는 병리학적 소견에 따라 다르게 처방될 수 있으며, 바람직하게는 상기 염증질환 치료용 조성물에 포함되는 텔로머라제 펩티드 II의 유효 용량은 0.01 내지 10㎎/kg 체중이고, 바람직하게는 0.5 내지 1㎎/kg 체중이며, 1일 1회 내지 3회 투여 될수 있다.
본 발명은 항염증 활성을 갖는 텔로머라제 펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 조성물은 항염증관련 단백질의 발현을 조절하는 것이 특징이며, 광범위한 염증성 질환 치료에서 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 세포독성이 낮아 안전성(safty)이 높은 효과가 있는 것이 특징이므로 산업적 이용가능성이 매우 높다.
도 1은 20μM 베타 아밀로이드 단백질에 의해 손상된 신경줄기세포에 1, 10, 및 50μM 펩티드 II를 처리한 후, 세포로부터 단백질을 추출하여 HMGB1 단백질의 발현의 변화를 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (+) 표시는 20μM 베타 아밀로이드 단백질을 처리하였음을 의미하며, anti-actin의 양이 일정하게 발현 되는 것으로부터 실험이 잘 이루어졌음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 펩티드 합성 및 분리정제
서열번호 1로 기재된 펩티드는 Fmoc (9-fluorenyl-methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩티드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 결합(coupling)에 의한 펩티드 사슬의 연장은 결합(coupling) 시약인 N-하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole, HOBt) 및 디시클로헥시카보디이미드(dicyclohexycarbodiimide, DCC)를 사용하였다. 각 펩티드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Ala-OH을 결합(coupling) 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸 피롤리돈(piperidine/N-methyl pyrolidone, NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고, NMP 및 디크로메탄(dichoromethane, DCM)으로 여러 번 씻어준 다음, 30분동안 질소 가스로 건조하였다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid)-TIS(thioanisole)-H2O-에탄디티올(ethanedithiol) (90/3/5/2, V/V/V/V, 8㎖) 용액을 가하고 교반하여 끓여주었다. 여과에 의해 펩티드는 추출되었고, 수지는 FA/TIS/H2O/EDT 용액과 함께 세척하였다 최종 산물은 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제를 완료한 순수한 펩티드는 MALDI 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 합성되었음을 확인하였다.
실시예 2. 본 발명 펩티드II 처리에 따른 HMGB 단백질의 발현량 변화 분석 실시.
(1) 신경줄기세포의 배양
임신 13일째 rat 배아의 머리에서 대뇌피질을 분리한 후 다음과 같은 배양조건에서 일주일간 Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)를 처리하여 신경줄기세포를 확보하였다.
(2) 웨스턴 블랏 실험을 통한 HMGB1 단백질의 발현량 변화 분석 실시.
상기 배양된 신경줄기세포 중에서, 20μM 베타 아밀로이드 단백질에 의해 손상된 신경줄기세포에 1, 10, 및 50μM 펩티드 II를 처리한 후, 세포로부터 단백질을 추출하여 HMGB1 단백질의 발현의 변화를 웨스턴 블랏으로 분석하였다.
추출 키트(Tissue Extraction Reagents II kit; Biosource International 사)를 사용하여 급속히 동결되고 -70℃ 에서 보존된 세포로부터 단백질을 추출하였다. 전체 세포 파쇄물을 8~10% 트리스-글리신 SDS-PAGE로 분리하였고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 이동시켰다. 막을 0.05% Tween 20이 있는 5% 탈지 우유를 함유하는 TBS로 블로킹하였고, 0.05% Tween 20을 함유하는 TBS (TBST)로 세척하였고, 1차 항체와 함께 4℃ 에서 밤새 배양하였다. 1차 항체로서 항 HMGB1 항체를 사용하였다. 신경세포의 세포질 내에서 베타-아밀로이드 단백질 처리 후, 감소되었던 HMGB1이 텔로머라제 펩티드II의 처리에 의해 증가하는 것은 텔로머라제 펩티드II가 신경세포 사멸에 의한 HMGB1의 감소를 억제하여 HMGB1 단백질의 발현량을 증가시키는 것을 확인 하였다. 이 결과로부터 본 발명의 펩티드 II가 항염증 기능을 가지고 있음을 입증하였다. (도 1참조)
<110> KIM, Sang Jae <120> Anti-inflammatory Peptides and Pharmaceutical Composition Containing Thereof <130> 12P_0719 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> telomerase peptide <400> 1 Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala 20 25 30

Claims (6)

  1. 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 1로 기재된 펩티드.
  2. 제 1항에 따른 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 염증질환은 천식, 비염, 피부염, 아토피성 피부염, 관절염, 류머티스성 관절염, 위염, 장염, 신장염, 간염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, PGE 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염 및 습진 다발성 경화증 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 염증질환 치료용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 펩티드의 유효량은 0.01 내지 10㎎/kg 체중인 것을 특징으로 하는 염증질환 치료용 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 펩티드는 HMGB1, HSP70, HSP90, Ki67, PI3K, pAkt, pGSK-3β, HSTF-1, Bcl-2, ADD153, i-NOS, e-NOS, Pyk2, MAPK, Bax, cytochrom-C 또는 caspase 3 단백질의 발현량을 조절하는 것을 특징으로 하는 염증질환 치료용 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 염증질환 치료용 조성물.
KR1020120079096A 2012-07-20 2012-07-20 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 염증질환 치료용 조성물 KR20140012385A (ko)

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