ES2817537T3 - Sales y formas sólidas de un antibiótico monobactámico - Google Patents

Abstract

Una sal de (L)-arginina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3- il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico.

Description

DESCRIPCIÓN

Sales y formas sólidas de un antibiótico monobactámico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a sales y formas cristalinas del ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)cidopropanocarboxílico que son adecuadas para la producción a escala comercial, así como a composiciones farmacéuticas que contienen estos materiales, a su uso en terapia y a un método de preparación de una forma sólida hidratada.

Antecedentes

En las últimas décadas, la frecuencia de la resistencia antimicrobiana y su asociación con enfermedades infecciosas graves ha aumentado a tasas alarmantes. La creciente prevalencia de resistencia entre patógenos nosocomiales es particularmente preocupante. De los más de 2 millones de infecciones nosocomiales (contraídas en el hospital) que se producen cada año en Estados Unidos, del 50 al 60 % están provocadas por cepas de bacterias resistentes a los agentes antimicrobianos. La alta tasa de resistencia a los agentes antibacterianos usados habitualmente aumenta la morbilidad, la mortalidad y los costes asociados con las infecciones nosocomiales. En Estados Unidos, se cree que las infecciones nosocomiales contribuyen o provocan más de 77.000 muertes al año y cuestan entre aproximadamente 5 y 10 mil millones de dólares al año.

Las causas importantes de resistencia gramnegativas incluyen beta-lactamasas de espectro extendido (ESBL, Extended-Spectrum Beta-Lactamases), serina carbapenemasas (KPC) y metalo-p-lactamasas (por ejemplo, NDM-1) en Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli y Proteus mirabilis, cefalosporina de tercera generación de alto nivel (AmpC) de resistencia a las p-lactamasas entre especies de Enterobacter y Citrobacter freundii, y genes de resistencia a múltiples fármacos observados en Pseudomonas, Acinetobactery Stenotrophomonas. El problema de la resistencia antibacteriana se agrava por la existencia de cepas bacterianas resistentes a múltiples antibacterianos. Por ejemplo, Klebsiella pneumonia que alberga la metalo-p-lactamasa NDM-1 con frecuencia porta serina-p-lactamasas adicionales en el mismo plásmido portador de NDM-1.

Por tanto, existe la necesidad de nuevos antibacterianos, particularmente compuestos antibacterianos que son eficaces contra los microbios resistentes a fármacos existentes o que son menos susceptibles al desarrollo de nuevas resistencias bacterianas. La presente invención proporciona formas sólidas de dichos compuestos que son especialmente adecuadas para la producción a escala comercial debido a sus propiedades de manipulación en condiciones operativas convenientes para la fabricación.

La solicitud de patente no publicada número PCT/US2015/022011 describe ciertos antibióticos monobactámicos. Un compuesto en dicha solicitud que muestra una fuerte actividad contra bacterias Gramnegativas, incluyendo cepas que muestran resistencia a otros monobactámicos, es ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico, que se denomina en el presente documento Compuesto X:

Para la fabricación de compuestos farmacéuticos y sus formulaciones, es importante que el compuesto activo esté en una forma que pueda manipularse y procesarse convenientemente para obtener un proceso de fabricación comercialmente viable, fiable y reproducible. El Compuesto X y muchas de sus sales son sólidos a temperatura ambiente y pueden producirse en varias formas sólidas, dependiendo de las condiciones utilizadas para producir, purificar o cristalizar el material. La existencia de múltiples formas sólidas, a menudo denominados polimorfos, es bien conocida por los compuestos farmacéuticos sólidos y la estabilidad química y física, así como las propiedades de manipulación de dichos compuestos, a menudo dependen de la forma sólida que se utilice. En consecuencia, la selección de una forma sólida particular de la sustancia farmacéutica activa (por ejemplo, una forma de sal, forma hidratada o solvatada o forma polimórfica) es a menudo muy importante en el diseño de un proceso de producción fiable y reproducible, y en el almacenamiento, manipulación y distribución de una forma segura y eficaz de la sustancia farmacéutica.

En general, se encuentra que existen ventajas en la fabricación de una forma en estado sólido particular de un ingrediente farmacéutico, y estas se describen en "Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection and Use", P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.) (Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich). Los métodos de fabricación de formas en estado sólido también se describen en "Practical Process Research and Development", Neal G. Anderson (Academic Press, San Diego) y "Polymorphism: In the Pharmaceutical Industry", Rolf Hilfiker (Ed) (Wiley VCH).

Los presentes inventores han descubierto ciertas sales y formas polimorfas del Compuesto X que son particularmente adecuadas para su uso en la fabricación, almacenamiento o administración del Compuesto X como se describe en el presente documento.

Es importante que un fármaco sea lo suficientemente estable como para evitar una degradación significativa cuando se envía y almacena en condiciones comerciales prácticas. Los inventores han descubierto que el Compuesto X en solución se usa y se almacena preferentemente a un pH entre 4 y 6, preferentemente entre 4,0 y 5,5, para una estabilidad máxima en presencia de humedad. La estabilidad óptima de la solución se consigue a un pH de aproximadamente 4,0 a 5,5. En consecuencia, la invención desvela composiciones farmacéuticas que comprenden el Compuesto X a un pH entre 4 y 6, preferentemente entre 4,0 y 5,5, y más preferentemente a un pH de aproximadamente 5 ± 0,5 o a un pH de 5 ± 0,2. Las composiciones adecuadas comprenden el Compuesto X en una solución acuosa, tal como dextrosa o solución salina, que pueden ser isotónicas y pueden contener otras sustancias, tales como estabilizantes, antioxidantes, tampones o modificadores de pH, nutrientes y similares. En algunas de estas realizaciones, el pH deseado se logra combinando el Compuesto X y un modificador de pH adecuado para lograr el pH deseado en una solución acuosa. Los modificadores del pH adecuados incluyen hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato sódico, carbonato de potasio, hidróxido de potasio, aminas, tales como TRIS (tris(hidroximetil)aminometano) y aminoácidos, tales como arginina, lisina, histidina y similares. Los monobactámicos conocidos, incluido aztreonam, se han formulado con arginina.

Se puede conseguir un pH adecuado añadiendo un modificador del pH a una solución acuosa del Compuesto X o añadiendo el Compuesto X a una solución acuosa que contenga el modificador de pH. El experto en la técnica puede determinar fácilmente las cantidades apropiadas del modificador de pH y del Compuesto X. Los modificadores de pH adecuados incluyen hidróxido de sodio y arginina. Por tanto, una solución o suspensión del Compuesto X puede tratarse con hidróxido de sodio o con arginina, para producir una solución que comprende una sal de sodio o una sal de arginina del Compuesto. Además, esta solución se puede liofilizar para eliminar el agua y los codisolventes presentes, dejando un sólido liofilizado que comprende

el Compuesto X junto con el modificador de pH, o una sal formada por el Compuesto X y el modificador de pH, por ejemplo, la sal de sodio o la sal de arginina del Compuesto X.

Adicionalmente, según la presente invención, se proporcionan varias formas sólidas del Compuesto X que proporcionan propiedades de manipulación adecuadas para la fabricación a escala industrial, junto con métodos para producir estos polimorfos.

Las siguientes realizaciones enumeradas de la invención son representativas:

1. Una sal de (L)-arginina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico.

2. Una forma sólida liofilizada de una sal sódica de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico.

3. Una forma sólida hidratada de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico.

4. La forma sólida hidratada según la realización 3, que consiste en 50 % o más del material de un trihidrato de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico.

5. Un método para preparar la forma sólida hidratada según la realización 4, que comprende poner en contacto ácido 1-(((Z)-(1-(2-amino-tiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico, con una atmósfera que tenga una humedad relativa entre el 25 % y el 50 % a una temperatura entre 20 °C y 30 °C.

6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las realizaciones 1-4 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)cidopropanocarboxílico (Forma 1) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 6,6, 13,4 y 18,8. En algunas realizaciones, la Forma 1 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

8. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 2) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 7,5, 19,3 y 20,0. En algunas realizaciones, la Forma 2 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

9. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 3) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 7,3, 18,9 y 21,2. En algunas realizaciones, la Forma 3 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

10. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 4) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 7,0, 8,6, 19,3 y 20,9. En algunas realizaciones, la Forma 4 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

11. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 5) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 7,3, 9,3 y 27,8. En algunas realizaciones, la Forma 5 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

12. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 6) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 8,1, 9,2 y 12,8; y opcionalmente por picos adicionales a 21,2 y 24,7. En algunas realizaciones, la Forma 6 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

13. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 7) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 6,7, 7,3 y 20,3. En algunas realizaciones, la Forma 7 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

14. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 8) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 6,2, 21,8 y 25,9. En algunas realizaciones, la Forma 8 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

15. Un compuesto de acuerdo con la invención o una forma cristalina del mismo para su uso en terapia.

16. La terapia es el tratamiento de una infección bacteriana gramnegativa.

17. La bacteria que causa la infección bacteriana gramnegativa se selecciona de entre las bacterias Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Morganella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, y Neisseria.

También se desvela una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 9) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 6,3, 12,6 y 22,3; y opcionalmente por uno o más picos adicionales seleccionados entre 22,1, 23,1, 27,0 y 27,5. En algunas realizaciones, la Forma 9 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

También se desvela una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 10) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 6,6, 11,0 y 16,5; y opcionalmente por uno o más picos adicionales seleccionados entre 22,2 y 23,4. En algunas realizaciones, la Forma 10 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

También se desvela una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 11) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 7,4, 9,7 y 29,3; y opcionalmente por uno o más picos adicionales seleccionados entre los picos en 17,0, 19,5, 22,2, 26,3 y 28,1. En algunas realizaciones, la Forma 11 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

También se desvela una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)cidopropanocarboxílico (Forma 12) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 19.0, 20,4 y 24,0; y opcionalmente por uno o más picos adicionales seleccionados entre los picos en 7,3, 24,7 y 27,2. En algunas realizaciones, la Forma 12 tiene picos de XRPD adicionales como se describe a continuación.

En el presente documento se desvela una composición farmacéutica que comprende ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico y arginina.

La composición farmacéutica comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, que es acuoso.

La composición farmacéutica tiene un pH de aproximadamente 5,0.

La composición farmacéutica comprende además al menos un excipiente seleccionado entre sacarosa, fructosa, trehalosa, manitol y lactosa.

También se desvela el uso de un compuesto, o una forma cristalina del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana gramnegativa, en la que la bacteria que causa la infección bacteriana gramnegativa es una especie seleccionada entre las bacterias Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Morganella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella y Neisseria.

Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 1) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 6,6, 13,4 y 18.8. En una realización, la Forma 1 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 6,6, 13,4, 16,6, 17,9, 18,8, 20,3, 25,1 y 28,9. En otra realización, la Forma 1 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 1, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 1. En otra realización más, la Forma 1 muestra un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 1.

En otro aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 2) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 7,5, 19,3 y 20,0. En una realización, la Forma 2 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 6,7, 7,5, 13,3, 13,7, 15,3, 17,9, 18,7, 19,3 y 20,0. En otra realización, la Forma 2 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 2, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 2. En otra realización más, la Forma 2 muestra un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 2.

En otro aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 3) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 7,3, 18,9 y 21,2; y opcionalmente incluyendo además un pico en 8,3. En una realización, la Forma 3 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 7,3, 13,9, 16,7, 18,9, 20,3, 21,2 y 24,6. En otra realización, la Forma 3 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 3, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 3. En otra realización más, la Forma 3 presenta un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 4.

En otro aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 4) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 7,0, 8,6, 19,3 y 20,9. En una realización, la Forma 4 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 7.0, 8,6, 15,2, 17,0, 18,0, 19,3, 20,9, 24,5 y 26,9. En otra realización, la Forma 4 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 4, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 4. En otra realización más, la Forma 4 presenta un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 5.

En otro aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 5) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 7,3, 9,3 y 27,8; y opcionalmente incluyendo además un pico en 19,9. En una realización, la Forma 5 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 7,3, 9,3, 16,3, 18,6, 19,2, 19,9, 21,7, 24,1, 24,9, 27,3, 27,8 y 29.8. En otra realización, la Forma 5 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 5, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 5. En otra realización más, la Forma 5 presenta un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 6.

En otro aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 6) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresadosen grados 20): 8,1, 9,2, 12,8, 21,2 y 24.7. En una realización, la Forma 6 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 8,1, 9,2, 12,8, 13,9, 14,4, 16,7, 20,1,21,2, 24,7 y 26,6. En otra realización, la Forma 6 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 6, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 6. En otra realización más, la Forma 6 presenta un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 7.

En otro aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 7) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 6,7, 7,3 y 20,3. En una realización, la Forma 7 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 6,7, 7,3, 17,6, 18,0, 20,3 y 24,9. En otra realización, la Forma 7 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 7, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 7. En otra realización más, la Forma 7 presenta un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 8.

En otro aspecto, la invención proporciona una forma cristalina del Compuesto X (Forma 8) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 6,2, 21,8 y 25,9. En una realización, la Forma 8 presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo: 6,2, 17.8, 20,7, 21,8 y 25,9. En otra realización, la Forma 8 presenta al menos los picos característicos de difracción de rayos X en polvo que se muestran en la Lista 8, o cualquier subconjunto de al menos cinco picos seleccionados de la Lista 8. En otra realización más, la Forma 8 presenta un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 9.

En un aspecto de la invención, los polimorfos de la invención tienen propiedades cristalinas y son, preferentemente, al menos un 50% cristalinos, más preferentemente, al menos un 60 % cristalinos, aún más preferentemente, al menos un 70 % cristalinos y, de la forma más preferente, al menos en un 80 % cristalinos. La cristalinidad se puede estimar mediante técnicas de difractometría de rayos X convencionales o mediante técnicas espectroscópicas de infrarrojos.

En algunas realizaciones, la forma sólida del Compuesto X comprende una o más de las Formas descritas en el presente documento. Una forma sólida del Compuesto X puede incluir dos o más de estas Formas, es decir, puede ser una mezcla de dos o más Formas. En algunas realizaciones, una muestra de la forma sólida consiste principalmente en una sola forma seleccionada de las formas 1-8, lo que significa que el 50 % o más del material es de una forma sólida. Las cantidades relativas de varias Formas en una mezcla se pueden determinar a partir de los datos de XRPD. Como se describe en el presente documento, algunas de las Formas pueden evolucionar o interconvertirse en condiciones adecuadas, tales como las Formas 4 y 5, que pueden ocurrir como una mezcla, y pueden interconvertirse dependiendo de la humedad relativa y la temperatura a la que se mantiene el material.

En un aspecto de la invención, los polimorfos de la invención son del 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % a 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % cristalinos.

En la presente memoria descriptiva, los picos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20) se miden utilizando rayos X de cobre con una longitud de onda de 1,5406 A (alfa1) y 1,5444 A (alfa2). Las ubicaciones de los picos se expresan en grados 20 y se entiende que están sujetas a pequeñas variaciones numéricas y, por tanto, debe entenderse que los ángulos están sujetos a una variación de ± 0,2°.

Las formas cristalinas de la presente invención pueden existir en formas solvatadas o no solvatadas. El término "solvato" se usa en el presente documento para describir un complejo molecular que comprende un compuesto de la invención y una cantidad de uno o más disolventes farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de disolventes farmacéuticamente aceptables incluyen etanol y agua. El término "hidrato" se emplea cuando el disolvente es agua. Varios polimorfos del Compuesto X como se describen en el presente documento son hidratos.

En un aspecto, la invención proporciona una sal o forma cristalina definida en el presente documento para su uso en terapia. En otro aspecto, la invención desvela un método de tratamiento por terapia, que comprende administrar a un sujeto que necesite una cantidad farmacéuticamente aceptable de una sal o forma cristalina.

En un aspecto, la invención proporciona el uso de una sal o forma cristalina definida en el presente documento en la fabricación de un medicamento para su uso en terapia.

En una realización, la terapia es el tratamiento de una infección causada por una bacteria gramnegativa.

La invención también proporciona procesos para la preparación de las formas cristalinas descritas en el presente documento. Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un proceso para la preparación de cualquiera de las Formas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 que se describen en el presente documento, que comprende la cristalización de la Forma deseada a partir de una solución del Compuesto X, utilizando sistemas de disolvente y condiciones descritos en los Ejemplos proporcionados en el presente documento.

En el contexto de la presente invención, las referencias en el presente documento a "tratamiento" incluyen referencias a tratamiento curativo, paliativo y profiláctico, salvo que existan indicaciones específicas en contrario. Los términos "terapia, "terapéutico/a" y "terapéuticamente" deben interpretarse de la misma manera.

El Compuesto X se administra normalmente mediante inyección o infusión y se puede preparar para su administración disolviendo el Compuesto X en una cantidad adecuada de agua o de una solución acuosa tal como dextrosa o solución salina, por ejemplo, dextrosa isotónica o solución salina. Opcionalmente, la composición formulada también puede incluir un modificador de pH, tal como hidróxido de sodio, bicarbonato sódico, carbonato de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio, meglumina, TRIS o un aminoácido (por ejemplo, lisina, histidina o arginina) en cantidad suficiente para proporcionar un pH deseado, tal como un pH entre 4 y 6. Aunque los aminoácidos usados en los ejemplos fueron (L)-aminoácidos, en su lugar, podría usarse un (D)-aminoácido o una mezcla racémica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el Compuesto X en solución se ajustan normalmente a un pH entre 4,5 y 5,5, a menudo o a un pH de aproximadamente 5, tal como a un pH entre 4,8 y 5,2.

En algunas realizaciones, el Compuesto X se formula con un modificador de pH en solución acuosa y, luego, se liofiliza a una forma sólida para su almacenamiento y distribución. Para la administración, se puede reconstituir el producto farmacéutico liofilizado añadiendo un vehículo acuoso, normalmente un vehículo acuoso estéril, tal como agua o una solución salina o dextrosa isotónica, u otra solución intravenosa como la solución de Ringer, de Ringer lactato o de Hartmann. En consecuencia, la invención también proporciona un liofilizado (un sólido preparado por liofilización) que comprende el Compuesto X y un modificador de pH como los mencionados anteriormente, por ejemplo (L)-arginina, (L)-lisina, meglumina, TRIS, de hidróxido sódico. Opcionalmente, se pueden incluir otros excipientes, tales como sacarosa. En una realización, se prepara una solución de Compuesto X y arginina (dos equivalentes) y se ajusta el pH a un pH entre 4,8 y 5,2 usando, por ejemplo, hidróxido de sodio o ácido clorhídrico según sea necesario. Luego, la solución se liofiliza hasta un sólido blanco o ligeramente amarillo, que es estable al almacenamiento y se puede reconstituir fácilmente con una solución acuosa estéril adecuada para administración intravenosa.

En otra realización, una solución de Compuesto X, se prepara sacarosa y arginina (dos equivalentes) en agua apta para inyección y se ajusta el pH a un pH entre 4,8 y 5,2 utilizando, por ejemplo, hidróxido de sodio o ácido clorhídrico según sea necesario. Luego, la solución se liofiliza hasta un sólido blanco o ligeramente amarillo, que es estable al almacenamiento y se puede reconstituir fácilmente con una solución acuosa estéril adecuada para administración intravenosa.

Las sales y formas cristalinas de la presente invención pueden administrarse solas o en combinación con uno o más de otros fármacos. En general, se administrarán como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" se usa en el presente documento para describir cualquier ingrediente que no sea el o los compuestos de la invención que puede impartir un componente funcional (es decir, control de la velocidad de liberación del fármaco) y/o no funcional (es decir, auxiliar de procesamiento o diluyente) característico de las formulaciones. La elección del excipiente dependerá en gran medida de factores tales como el modo de administración en particular, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y la estabilidad y la naturaleza de la forma farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender un vehículo, que es un material sustancialmente inerte, a menudo un líquido, utilizado para diluir el o los principios activos. Los vehículos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen agua estéril y soluciones estériles de solución salina o dextrosa, por ejemplo.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la liberación de las formas sólidas del Compuesto X y los métodos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Dichas composiciones y procedimientos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a Edición (Mack Publishing Company, 1995).

Para su administración a pacientes humanos, la dosis diaria total de la sal o forma cristalina está normalmente en el intervalo de 1.000 mg a 10.000 mg, o entre 2.000 mg y 8.000 mg o entre 3.000 mg y 8.000 mg o entre 4.000 mg y 6.000 mg, dependiendo del estado del sujeto y parámetros tales como el peso corporal del sujeto, la edad y el sexo. La dosis diaria total puede administrarse en una sola dosis o puede dividirse en dos o más dosis y puede, según el criterio del médico, desviarse respecto del intervalo típico proporcionado en el presente documento. Típicamente, la dosis diaria se administraría mediante inyección intravenosa o mediante infusión, y se administraría en una, dos, tres o cuatro dosis, que proporcionan de forma acumulada la dosis diaria total deseada. La infusión puede ser rápida o puede realizarse durante un período de entre aproximadamente 15 minutos y 4 horas, habitualmente durante un período de 1-3 horas. Un programa de dosificación típico proporcionaría tres o cuatro infusiones diarias, cada una de una duración de 0,25-2 horas o 0,25-3 horas, administrando de 1 a 2 o de 1 a 2,5 gramos de Compuesto X por dosis, y una dosis diaria total típica sería de 3-8 gramos. Por ejemplo, un programa de dosificación puede administrar 2 gramos de Compuesto X por infusión, con tres infusiones de una hora al día. Como alternativa, se puede utilizar una sola infusión de 2-6 gramos o 3-5 gramos durante 1 o 1,5 o 2 o 2,5 o 3 horas. Las dosis anteriores se basan en un sujeto humano medio que tiene un peso de aproximadamente 60 kg a 70 kg y se pueden escalar adecuadamente para otros sujetos. El médico podrá determinar fácilmente dosis para sujetos cuyo peso se desvíe de este intervalo, tales como niños y ancianos.

Breve descripción de las figuras

La invención se ilustrará a continuación mediante los siguientes ejemplos. En los ejemplos se presentan las siguientes figuras:

Figura 1: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 1.

Figura 2: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 2.

Figura 3: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 1 después de agitar con acetona, superpuesto con el XRPD para la Forma 1 para comparar.

Figura 4: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 3.

Figura 5: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 4.

Figura 6A: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 5 superpuesto con el XPRD para la Figura 4.

Figura 6B: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 5 de una preparación a mayor escala.

Figura 7: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 6.

Figura 8: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 7.

Figura 9: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 8.

Figura 10: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 9.

Figura 11: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 10.

Figura 12: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 11.

Figura 13: Patrón de difracción de rayos X en polvo de la Forma 12.

Detalles experimentales generales

Cada muestra (unos miligramos) se coloca entre tres láminas de polímero (Kapton® y/o polipropileno). Cabe destacar que Kapton® exhibe un pico ancho con una intensidad débil alrededor de 20 = 5,5°.

A continuación, la muestra se coloca en un difractómetro PANALYTICAL X'PERT PRO MPD configurado en modo de transmisión y se analiza utilizando las condiciones que se indican a continuación. Los análisis se realizan entre 2° y 50° (a menos que se indique lo contrario).

Radiación: CuKa

Configuración del generador: 40 kV y 40 mA

Tamaño de etapa: 0,026°

Etapas: 1828

Tipo de medida: Escaneo repetido (3/5/20 veces)

Todos los materiales de partida, componentes básicos, reactivos, ácidos, bases, agentes deshidratantes, disolventes y catalizadores utilizados para sintetizar los compuestos de la presente invención están comercialmente disponibles o se pueden producir mediante métodos de síntesis orgánica conocidos por un experto en la técnica (Houben-Weyl 4a Ed. 1952, METHODS OF ORGANIC SYNTHESIS, Thieme, Volumen 21).

Condiciones generales

Los espectros de masas se adquirieron en sistemas LC-MS, SFC-MS o GC-MS que utilizan métodos de ionización por impacto químico y electrónico por electropulverización a partir de una variedad de instrumentos de las siguientes configuraciones: Sistema Waters ACQUITY UPLC y equipado con un sistema de EM ZQ 2000 o SQD donde (M+1) se refiere al ion molecular protonado de la especie química, (M+) se refiere al catión de amonio cuaternario no protonado, (M+Na) se refiere al ion incorporado a sodio y (M-1) se refiere al ion molecular desprotonado de la especie química. Los espectros de RMN se ejecutaron en espectrómetros de RMN Bruker AVANCE 500 MHz o Varian 400 MHz usando ICON-RMN, bajo el control del programa TopSpin. Los espectros se midieron a 298K, a menos que se indique otra cosa, y se hace referencia a ellos con respecto a la resonancia del disolvente.

Instrumentación

Métodos de EM: Uso de sistemas HPLC Agilent 1100 con un espectrómetro de masas Agilent 6110

Método 2m_acidic:

Columna Kinetex C18 50 x 2,1 mm, 2,6 pm

Temperatura de la Columna 50 °C

Eluyentes A: H²O, B: acetonitrilo, conteniendo ambos un 0,1 % de TFA

Caudal 1,2 ml/min

Gradiente del 2 % al 88 % de B en 1,30 min, 0,15 min 95 % de B

Método 2m_acidic_polar:

Columna Kinetex C1850 x 2,1 mm, 2,6 pm

Temperatura de la Columna 50 °C

Eluyentes A: H²O, B: acetonitrilo, conteniendo ambos un 0,1 % de TFA Caudal 1,2 ml/min

Gradiente del 1 % al 30 % de B en 1,30 min, 0,15 min 98 % de B

Preparación del compuesto X

Intermedio A: Metanosulfonato de ((2S,3S)-3-(((benciloxi)carbonil)amino)-1-(2,4-dimetoxibencil)-4-oxoazetidin-2-il)metilo.

A una solución de ((2S,3S)-1-(2,4-dimetoxibencil)-2- (hidroximetil)-4-oxoazetidin-3-il)carbamato de bencilo (5,37 g, 13,41 mmol) y TEA (3,72 ml, 26,8 mmol) en DCM a 0 °C se añadió cloruro de metanosulfonilo (MsCl) (1,15 ml, 14,75 mmol). Después de agitar a 0 °C durante 1 hora, se diluyó con agua/DCM y se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na²SO⁴ y se concentraron al vacío. El residuo bruto se recogió en tolueno y se concentró (2x), proporcionando el compuesto del título como un sólido blanquecino. Se utilizó como tal en reacciones posteriores. LCMS: Tr = 0,86 min, m/z = 479,2 (M+1). Método 2m_ácido.

El material de partida para esta etapa se puede hacer usando los siguientes abordajes o alguna combinación de etapas basadas en estos enfoques. En un primer abordaje, un aldehído quiral protegido se condensa con 2,4­ dimetoxibencilamina para hacer una imina quiral.

El aldehído quiral es conocido y se puede preparar a partir de ácido cítrico:

La imina quiral se puede hacer reaccionar con formas protegidas de glicina como estas:

El anhídrido mixto necesario para la segunda opción se puede preparar a partir de glicina protegida con CBZ y cloroformiato de isopropilo en diclorometano. (DMB se refiere a un grupo 2,4-dimetoxibencilo). A continuación, el dioxolano de este intermedio protegido se hidroliza en condiciones ácidas suaves y se oxida a un aldehído, que se puede reducir fácilmente con, por ejemplo, borohidruro de sodio, para proporcionar el alcohol primario di-protegido como se muestra.

El alcohol primario de este intermedio se puede convertir en un grupo saliente, por ejemplo, tratando con yodo y trifenilfosfina para producir un yoduro primario, o tratando con una base y un cloruro de sulfonilo para producir, por ejemplo, un mesilato o tosilato. Este intermedio activado reacciona fácilmente con hidroxietilamina como se muestra en la etapa 1 a continuación.

Intermedio B: 3-(((2R,3S)-3-ammo-4-oxoazet¡dm-2-il)metM)oxazol¡dm-2-ona.

Etapa 1: ((2R,3S)-1-(2,4-dimetoxibencil)-2-(((2-hidroxietil)ammo)metil)-4-oxoazetidm-3-il)carbamato de bencilo. A una solución de metanosulfonato de ((2S,3S)-3-(((benciloxi)carbonil) amino)-1-(2,4-dimetoxibencil)-4-oxoazetidin-2-il)metilo (6,43 g, 13,4 mmol) en acetonitrilo (44,8 ml) se añadió etanolamina (8,13 ml, 134 mmol) seguido de DIEA (7,0 ml, 40 mmol). La solución se calentó a 80 °C durante 20 horas, tras lo cual se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, se lavó con agua, se secó sobre Na²SO⁴, y se concentró al vacío, para obtener el compuesto del título (4,47 g, 75 %) como un sólido blanco. LCMS: Tr = 0,60 min, m/z = 444,2 (M+1).

Etapa 2: ((3S,4R)-1-(2,4-dimetoxibencil)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidm-3-il)metil)azetidm-3-il) carbamato de bencilo. A una solución de ((2R,3S)-1-(2,4-dimetoxibencil)-2- (((2-hidroxietil)amino)metil)-4-oxoazetidin-3-il)carbamato de bencilo (4,47 g, 10,08 mmol) en cloroformo (50 ml) se añadió carbonildiimidazol (CDI) (4,90 g, 30,2 mmol). Después de agitar a ta durante 30 min, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (MeOH-DCM, 0-5 %), proporcionando el compuesto del título (3,84 g, 81 %) en forma de una espuma de color blanco. LCMS: Tr = 0,76 min, m/z = 470,1 (M+1).

Etapa 3: ((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidm-3-il)metil) azetidin-3-il)carbamato de bencilo. Preparado de forma análoga a una preparación en Mastalerz et al. Chem. 1988, 31, 1190, usando ((3S,4r )-1-(2,4-dimetoxibencil)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)carbamato de bencilo (3,84 g, 8,18 mmol), K²S²O⁸ (3,10 g, 11,5 mmol) y K²HPO⁴ (1,852 g, 10,6 mmol) en ACN:agua (2:1, 136 ml) y calentando durante 40 minutos a 90 °C. Se añadió más K²S²O⁸ (663 g, 2,45 mmol) y K²HPO⁴ (370 mg, 2,13 mmol) t la mezcla se calentó durante 3 horas más. Se añadió más K²S²O⁸ (332 mg, 1,23 mmol) y K²HPO⁴ (185 mg, 1,06 mmol) y se calentó durante 2 horas adicionales, tras lo cual se concentró al vacío, eliminando la mayor parte del ACN. La mezcla se diluyó con salmuera/EtOAc y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3x) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na²SO⁴. El residuo en bruto se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc-heptano, 0-100 %, después MeOH-DCM, 10 %) para producir el compuesto del título (1,61 g, 62 %) como una espuma beige. LCMS: Tr = 0,51 min, m/z = 320,0 (M+1). Método 2m_ácido.

Etapa 4: 3-(((2R,3S)-3-ammo-4-oxoazetidm-2-il)metil)oxazolidm-2-ona. Preparado según Malmstrom et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 5293, utilizando ((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il) metil)azetidin-3-il)carbamato de bencilo (96 mg, 0,30 mmol) y Pd/C al 10 % Degussa tipo 101 (10 %, 64 mg) e hidrógeno en EtOH:MeOH (4:1, 1,5 ml) durante 1 hora. El residuo en bruto se usó como tal en la etapa siguiente. LCMS: Tr = 0,11 min, m/z = 186,0 (M+1). Método 2m_ácido.

Compuesto X: Ácido 1-(((Z)-(1-(2-ammotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidm-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico.

Etapa 1: 1-(((Z)-(1-(2-((íerc-butoxicarboml)ammo)tiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidm-3-il)metil)azetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxilato de benzhidrilo. A una solución de ácido (Z)-2-((1-((benzhidriloxi) carbonil)ciclopropoxi)imino)-2-(2-((terc-butoxicarbonil)amino)tiazol-4-il)acético (854 mg, 1,59 mmol) preparado según la solicitud de patente publicada US2011/0190254, intermedio B (324 mg, 1,75 mmol) y HATU (785 mg, 2,07 mmol) en DMF (7,9 ml), se añadió DIPEA (832|jl, 4,77 mmol). Después de 1 h de agitación, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. Se añadió salmuera a la capa acuosa y se extrajo adicionalmente con acetato de etilo (EtOAc) (3x). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na²SO⁴ y se concentraron al vacío. El residuo en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0-10 % de MeOH-DCM) para producir el compuesto del título (1,09 g, 97 %) como una espuma beige. LCMS: Tr = 0,97 min, m/z = 705,3 (M+1). Método 2m_ácido. En lugar de HATU, se pueden utilizar otros diversos reactivos de acoplamiento, tal como cualquiera de las carbodiimidas típicas, o CDMt (2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina) y N-metilmorfolina para formar el enlace amida generado en la etapa 1.

Etapa 2: Ácido (3S,4R)-3-((Z)-2-((1-((benzhidriloxi)carbonil) ciclopropoxi)imino)-2-(2-((terc-butoxicarbonil) amino)tiazol-4-il)acetamido )-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)azetidin-1-sulfónico. El 1-(((Z)-(1-(2-((terc-butoxicarbonil)amino)tiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxilato de benzhidrilo (1,00 g, 1,42 mmol) en DMF (7,0 ml) a 0 °C se trató con SO³ • DMF (448 mg, 2,84 mmol). Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, la solución se vertió en salmuera helada y se extrajo con EtOAc (3x). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na²SO⁴ y se concentraron al vacío, proporcionando el compuesto del título (cuantitativo supuesto) en forma de un sólido de color blanco. LCMS: Tr = 0,90 min, m/z = 785,2 (M+1). Método 2m_ácido.

Etapa 3 : Ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico.

A una solución de ácido (3S,4R)-3-((Z)-2-((1-((benzh¡driloxi)carboml)ddopropox¡)¡m¡no)-2-(2-((tercbutoxicarbonil)amino)tiazol-4-il)acetamido)-2-oxo-4-((2-oxooxazolidin-3-il)metil)azetidin-1-sulfónico (1,10 g, 1,40 mmol) en DCM (1,5 ml) a 0 °C, se añadió TFA (5,39 ml, 70,0 mmol) y después de 10 minutos, se retiró el baño de hielo. Se añadió TFA adicional (3,24 ml, 42,0 mmol) después de 1 hora a temperatura ambiente y la solución se diluyó con DCM y se concentró al vacío después de 30 minutos más. Opcionalmente, se puede añadir anisol a la reacción de TFA para ayudar a reducir la formación de subproductos, lo que puede aumentar el rendimiento del producto deseado en esta etapa. El residuo en bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (XSelect CSH, 30 x 100 mm, 5 pm, columna C18; ACN-agua con modificador de ácido fórmico al 0,1 %, 60 ml/min), proporcionando el compuesto del título (178 mg, 23 %) en forma de un polvo de color blanco. LCMS: Tr = 0,30 min, m/z = 518,9 (M+1) Método 2m_ácido; RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 89,27 (d, J = 9,0 Hz, 1 H) 6,92 (s, 1 H) 5,23 (dd, J = 9,1, 5,7 Hz, 1 H) 4,12-4,23 (m, 3 H) 3,72 -3,62 (m, 2H asumido; oscurecido por agua) 3,61-3,52 (m, 1h asumido; oscurecido por agua) 3,26 (dd, J = 14,5, 5,9 Hz, 1H) 1,36 (s, 4H). RMN 1H (400 MHz, D²O) 87,23 (s, 1H), 5,48 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,71-4,65 (m, 1H), 4,44 (t, J = 8,2 Hz, 2H), 3,89-3,73 (m, 3H), 3,54 (dd, J = 14,9; 4,9 Hz, 1H), 1,65-1,56 (m, 2H), 1,56­ 1,46 (m, 2H). El producto de este proceso es amorfo. El compuesto X se puede cristalizar en acetona, etanol, tampón citrato a pH 3 (50 mM) o tampón acetato a pH 4,5 (50 mM), además de los disolventes que se describen a continuación.

Instrumentación

DSC: Pyris Diamond DSC, Gas nitrógeno (20 ml/min)

TGA: Pyris 1 TGA, Gas nitrógeno (20 ml/min), escaneado a 10 °C/min

XRPD: X'Pert Pro MPD Panalytical, Ánodo de Cu, 40 kV a 40 mA de corriente

Ánodo de tubo: (Cu)

Tensión del generador: 40 kV

Corriente del tubo: 40 mA

Ángulo de inicio [20]: 3

Ángulo final [20]: 40

Tiempo de escaneo 2 minutos

Forma 1 y Forma 2

El compuesto X se preparó como se ha descrito anteriormente y se cristalizó en disolvente para proporcionar materiales que tienen el patrón de difracción de rayos X en polvo (XRPD) en la Figura 1 o Figura 2. Estos representan dos lotes separados de material cristalino y se denominan en el presente documento Forma 1 y Forma 2. Las formas 1 y 2 tienen algunos picos de XRPD similares, y la XRPD de la forma 2 muestra líneas ensanchadas, por lo que el producto identificado como Forma 2 puede contener algún material de Forma 1, o ambas muestras pueden ser mezclas de formas cristalinas. Estas dos formas eran sustancialmente anhidras, que contienen menos de aproximadamente 1 % de agua en peso según el análisis de Karl Fischer.

El compuesto X de la Forma 1 (1,2 g) se suspendió en 12 ml de acetona y se agitó durante 3 días a 20 °C. La muestra no parece evolucionar: al tiempo que se produjo un ensanchamiento de la línea, el XRPD del producto (Figura 3) todavía parece generalmente consistente con la Forma 1.

La muestra que da el XRPD en la Figura 1 presentó una fuerte exotermia durante la DSC a aproximadamente 205 °C y una pérdida gradual de masa a través de TGA que asciende a aproximadamente un 2 % de pérdida por 180 °C.

La muestra que produjo el XRPD en la Figura 2 (Forma 2) mostró una fuerte exotermia durante la DSC a aproximadamente 203 °C y una pérdida de masa ligeramente mayor (3,7 %) en 160 °C en comparación con la Forma 1.

Lista 1: Listado de picos de XRPD para la Forma 1 (2Theta: los picos más intensos están subrayados) 1 6J3

2 11,1

3 13,4

4 14,4

5 15,2

6 16,6

7 17,9

8 18,8

9 20,3

10 22,5

11 23,3

12 25,1

13 27,7

14 28,9

15 30,2

La Forma 1 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 6,6, 13,4 y 18,8.

Lista 2: Listado de picos de XRPD para la Forma 2 (2Theta: los picos más intensos están subrayados)

1 6,7

2 L 5

3 11,3

4 13,3

5 13,7

6 15,3

7 17,9

8 18,7

9 19,3

10 20,0

11 22,8

12 24,8

13 27,9

La Forma 2 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 7,5, 19,3 y 20,0.

Forma 3

El compuesto X de la Forma 1 se suspendió en metanol y en unos pocos minutos se convirtió en un producto sólido pegajoso. El producto mostró el patrón de XRPD que se muestra en la Figura 4 y se denomina en el presente documento Forma 3. Obsérvese que se obtuvo una forma diferente (Forma 8) después de agitar durante más tiempo en metanol a mayor escala, tal como se describe continuación; por tanto, la Forma 3 puede ser una forma transitoria o una mezcla formada a medida que la Forma 1 evoluciona en estas condiciones.

Lista 3: Listado de picos de XRPD para la Forma 3 (2Theta: los picos más intensos están subrayados)

1 6,6

2 L 3

3 8,3

4 12,7

5 13,3

6 13,9

7 16,7

8 18,9

9 20,3

10 21,2

11 22,2

12 23,9

13 24,6

14 25,1

15 27,2

16 28,0

La Forma 3 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 7,3, 18,9 y 21,2.

Forma 4

El Compuesto X de la Forma 1 (1,2 g) se suspendió en agua (12 ml) y se agitó a 20 °C durante 3 días. El producto mostró el patrón de XRPD que se muestra en la Figura 5 y se denomina en el presente documento Forma 4. El XRPD es de una muestra secada con papel de filtro. El análisis de TGA para la Forma 4 muestra una pérdida gradual de peso que comienza alrededor de los 40 °C y se vuelve rápida alrededor de los 100 °C, a una meseta en aproximadamente el 60 % del peso original a 120-170 °C. Por encima de esa temperatura, se observa una pérdida gradual de peso. La pérdida temprana de masa es consistente con la pérdida de agua de la Forma 4, y con la DSC, que muestra una fuerte endotermia en el mismo intervalo de temperatura y una meseta en aproximadamente 110-180 °C. De forma similar, el análisis de absorción dinámica de vapor (DVS) para la Forma 4 muestra una pérdida rápida de aproximadamente el 20 % de la masa de la muestra a medida que la humedad relativa se redujo a aproximadamente un 50 %, después de lo cual, el ciclo de humedad relativa más baja, más alta, más baja y luego más alta produjo la correspondiente disminución, incremento, disminución e incremento de la masa de la muestra con una masa mínima de aproximadamente el 65 % de la original y máxima de aproximadamente el 80 % de la masa original. La Forma 4 es, por tanto, una forma hidratada y evoluciona dependiendo de la HR. El grado de hidratación de la muestra varía con la humedad relativa de una forma anhidra a muy baja humedad, a un trihidrato a una HR de aproximadamente 20-50 %, a un hexahidrato a una HR superior al 60 %. Una muestra de la Forma 4 secada al 0 % de humedad relativa (HR) produce un XRPD consistente con la Forma 1.

Lista 4: Listado de picos de XRPD para la Forma 4 (2Theta: los picos más intensos están subrayados)

1 LO

2 8J3

3 13,7

4 15,2

5 16,1

6 17,0

7 18,0

8 19,3

9 20.9

10 24,5

11 26,9

La Forma 4 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 7,0, 8,6, 19,3 y 20,9.

Forma 5

Se secó una muestra de la Forma 4 bajo flujo de aire seco durante un día, lo que dio un polvo que mostró el XRPD mostrado en la Figura 6A. Este material se denomina en el presente documento Forma 5. La DSC para la Forma 5 muestra una fuerte exotermia a aproximadamente 204 °C, y la muestra comienza a tornarse negra aproximadamente a esta temperatura, lo que indica descomposición. El TGA muestra aproximadamente un 7 % de pérdida de masa entre 45 °C y 160 °C. El análisis de Karl Fisher muestra un contenido de agua del 9,6 % para la Forma 5, correspondiente a un trihidrato, pero la muestra parece perder masa a una HR por debajo de aproximadamente el 30 %; y con una HR superior al 80 %, se convierte a la Forma 4 en un día.

Por tanto, las Formas 1, 4 y 5 del Compuesto X parecen interconvertirse cuando se varía la humedad relativa, y puede ser una mezcla de estas formas hidratadas. La Forma 5 es una forma preferida para manipular a temperaturas ambiente de aproximadamente 25 °C durante la fabricación, dado que cristaliza como un sólido de buen comportamiento que es más estable durante el almacenamiento y la manipulación que otras formas, proporcionó una humedad relativa adecuada de alrededor del 20-50 % de humedad relativa, preferentemente 30-40 %, se mantenga. Dentro de estos intervalos de HR, el material es principalmente trihidrato y se comporta adecuadamente y es estable para su manipulación y almacenamiento sin precauciones especiales.

Preparación a mayor escala de la Forma 5

Se mezclaron agua (20 ml) y THF (40 ml) en un matraz y se añadió el Compuesto X (10 g, aproximadamente 91 % de pureza mediante HPLC) con agitación a 25 °C para proporcionar una solución de color amarillo claro. Se añadió una muestra de 20 mg de la Forma 5 (véase anteriormente) como semilla y la mezcla se agitó durante 50 minutos. A continuación se añadió lentamente THF (140 ml), durante 1 hora y la mezcla se agitó durante 2 horas más. La suspensión se filtró y la torta húmeda se lavó con agua fría (<5 °C), después se secó a 20-25 °C durante 11 horas a una presión de 100 mbares, proporcionando 6,6 g de trihidrato de la Forma 5 con una pureza del 97,8 % mediante HPLC. La muestra produjo el patrón de XRPD que se muestra en la Figura 6B. Parece estable cuando se almacena a un 25-50 % de humedad relativa, preferentemente 30-40 % de HR; a menor o mayor humedad relativa, puede evolucionar a diferentes estados hidratados como se describe en el presente documento. El secado excesivo produce una forma que se descompone a temperatura ambiente en unas pocas horas, lo que demuestra además la ventaja de estabilidad de las formas hidratadas.

Lista 5: Listado de picos de XRPD para la Forma 5 (2Theta: los picos más intensos están subrayados)

1 L 3

2 SL3

3 12,0

4 13,6

5 15,8

6 16,3

7 18,0

8 18.6

9 19,2

10 19,9

11 20,2

12 21,7

13 23,0

14 23,5

15 24,1

16 24,9

17 27,3

18 27.8

19 29,8

La Forma 5 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 7,3, 9,3 y 27,8; y opcionalmente por picos a 7,3, 9,3, 19,9 y 27,8.

La Forma 5 (trihidrato) se puede caracterizar alternativamente por una estructura de rayos X monocristalina que es monoclínica, grupo espacial P2 (1), que tiene dimensiones de celda unitaria a = 13,121 (4) Á; b= 7,400(3) Á; c = 25,017(8) Á (a = 90°; p = 96,037°; y = 90°); y volumen de celda unitaria de 2415,6 (14) A3. Los datos para esta estructura se recopilaron a una longitud de onda de 1,54178 A, 100 °K; intervalo theta de 3,99° a 68,44°; 47822 reflexiones recogidas. La estructura monocristalina confirma la presencia de tres moléculas de agua por molécula del Compuesto X en la celda unitaria, con la molécula de agua ubicada en los canales.

Forma 6

El Compuesto X de la Forma 1 (1,2 g) se suspendió en DMSO:agua (relación 25:75 v/v, 12 ml) y se agitó a 20 °C durante 3 días. Se recogió una muestra del sólido y se secó con papel de filtro. El producto mostró el patrón de XRPD que se muestra en la Figura 7 y se denomina en el presente documento Forma 6. La DSC y el TGA son consistentes con pérdida de disolvente hasta aproximadamente 130 °C y nuevamente entre 150 °C y 200 °C, seguido de degradación por encima de 200 °C.

Lista 6: Listado de picos de XRPD para la Forma 6 (2Theta: los picos más intensos están subrayados)

1 6,6

2 8A

3 9_¿

4 12,8

5 13,9

6 14,4

7 16,7

8 17,8

9 19,4

10 20,1

11 21,2

12 24,7

13 26,6

14 27,3

La Forma 6 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 8,1, 9,2 y 12,8; y opcionalmente por picos adicionales a 21,2 y 24,7.

Forma 7

El Compuesto X de la Forma 6 preparado como se ha descrito anteriormente se secó durante un día bajo flujo de aire seco. El polvo resultante exhibió el patrón de XRPD que se muestra en la Figura 8 y se denomina en el presente documento Forma 7. La DSC muestra una gran exotermia que comienza aproximadamente a 134 °C y continúa hasta aproximadamente 170 °C. La RMN 1H muestra aproximadamente 2 equivalentes de DMSO presentes y algo de agua (3,6 %). La valoración de Karl Fisher confirma la presencia de un 3,6 % de agua, correspondiente a 1 equivalente. Por tanto, esta forma es un solvato.

Lista 7: Listado de picos de XRPD para la Forma 7 (2Theta: los picos más intensos están subrayados)

1 6J_

2 1A

3 9,2

4 10,6

5 12,8

6 14,4

7 16,0

8 17,6

9 18,0

10 19,5

11 20,0

12 20,3

13 24,9

14 27,0

15 27,6

La Forma 7 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 6,7, 7,3 y 20,3.

Forma 8

El Compuesto X de la Forma 1 (1,2 g) se suspendió en metanol (12 ml) y se agitó a 20 °C durante 3 días. Se recogió una muestra del sólido y se produjo el patrón de XRPD que se muestra en la Figura 9 (sin secar), que se denomina en el presente documento Forma 8. Cuando se secó una muestra de la Forma 8 con un flujo de aire seco, los picos se ensancharon sustancialmente pero generalmente aparecen en aproximadamente las mismas posiciones. El TGA para la muestra seca muestra una pérdida gradual de masa (aproximadamente del 4 %) hasta 140 °C y una pérdida de masa más pronunciada a partir de aproximadamente 170 °C. La DSC muestra una fuerte exotermia a aproximadamente 172 °C que puede estar asociada con la degradación de la muestra.

Lista 8: Listado de picos de XRPD para la Forma 8 (2Theta: los picos más intensos están subrayados)

1

2 12,5

3 16,8

4 17,8

5 19,5

6 20,7

7 21,8

8 25,9

La Forma 8 también se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos en 6,2, 21,8 y 25,9.

Forma 9

El Compuesto X de la Forma 3 se suspendió en acetona y agua a una temperatura de 25 °C a 40 °C. La relación de agua a acetona se varió de 2:98 a 10:90. Después de equilibrar durante 24 horas, en cada caso se obtuvo una forma hetero-solvato de baja cristalinidad. Mientras que el XRPD varió con la proporción de agua a acetona, todas las muestras produjeron espectros de XRPD con jorobas anchas en lugar de picos agudos. La Figura 10 muestra el XRPD para una muestra equilibrada en 10:90 de agua/acetona a 40 °C durante 24 horas, y la siguiente tabla resume los datos de XRPD para esta muestra. Esta forma sólida se denomina en el presente documento Forma 9.

La Forma 9 se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos identificados en la tabla anterior como intensidad relativa "fuerte", por ejemplo, picos en 6,3 y 12,6 y, opcionalmente, uno o más de los picos en la tabla que tienen intensidad relativa media, tales como los picos en 22,1,22,3, 23,1, 27,0 y 27,5

Forma 10

El Compuesto X de la Forma 1 (anhidro) se expuso a una humedad relativa del 43 % durante un día o más. El producto cristalino parece ser un sesquihidrato (Compuesto X-1,5 H²O) basado en la determinación del contenido de agua. Obsérvese que la Forma 5, el trihidrato, en condiciones similares sería estable, sin embargo, al comenzar con el anhidrato, parece equilibrarse como sesquihidrato en estas condiciones y permanece en esa forma durante al menos 14 días cuando se mantiene a la misma humedad relativa. Esta forma cristalina produce el espectro de XRPD que se muestra en la Figura 11, y se denomina en el presente documento Forma 10. La siguiente tabla resume los picos principales en el XRPD de esta muestra.

La Forma 10 se puede caracterizar por los picos de XRPD en la tabla anterior que tienen intensidades relativas de medias a fuertes, por ejemplo, los picos en 6,6, 11,0, 13,3, 15,6, 16,5, 18,6, 22,2, 23,4 y 27,4. También se puede caracterizar por un subconjunto de estos picos, por ejemplo, los picos tienen una intensidad relativa de 40 o más, por ejemplo, los picos en 6,6, 11,0, 16,5, 22,2 y 23,4, o por un subconjunto de al menos 3 o 4 de estos picos.

Forma 11

El Compuesto X de la Forma 5, el trihidrato, se expuso a una humedad relativa del 22 % durante aproximadamente 3 días para proporcionar un sólido cristalino caracterizado como un dihidrato (Compuesto X-² H²O) basado en el análisis del contenido de agua. Este material vuelve fácilmente al trihidrato (Forma 5) si se expone a una humedad relativa superior al 40 %. El dihidrato, referido en el presente como Forma 11, produjo el espectro de XRPD que se muestra en la Figura 12: los picos principales en ese espectro de XRPD se enumeran en la siguiente tabla.

La Forma 11 se caracteriza porque los picos de XRPD en esta tabla que tienen intensidades relativas de 20 o más, o, alternativamente, los picos que tienen una intensidad relativa de al menos 25, por ejemplo, picos en 7,4, 9,7, 17,0, 19,5, 22,2, 26,3, 28,1 y 29,3, o un subconjunto de 3, 4 o 5 de estos picos que tienen una intensidad relativa de al menos 26 o al menos 28 en la tabla.

Forma 12

El Compuesto X de la Forma 5 se expuso al aire con una humedad relativa del 65 % durante aproximadamente 3 días, proporcionando un material cristalino caracterizado como un tetrahidrato basado en el análisis del contenido de agua. Este material vuelve fácilmente al trihidrato (Forma 5) si la humedad relativa se reduce a aproximadamente el 40 %. El tetrahidrato, referido en el presente como Forma 12, produjo el espectro de XRPD que se muestra en la Figura 13: los picos principales en ese espectro de XRPD se enumeran en la siguiente tabla.

La Forma 12 se puede caracterizar por picos de XRPD que tienen una intensidad relativa de al menos 40 en la tabla anterior, es decir, los picos de XRPD en 7,3, 17,8, 19,0, 19,8, 20,4, 24,0, 24,7, 24,9, 27,2, 27,8 y 32,1. Como alternativa, se puede caracterizar por un subconjunto de al menos 3, o al menos 4, o al menos 5 de estos picos. La Forma 12 también se puede caracterizar por los picos de XRPD descritos como fuerte intensidad relativa en la tabla, es decir, los picos en 7,3, 19,0, 20,4, 24,0, 24,7 y 27,2.

Se demostró que las muestras de los hidratos del Compuesto X, incluidas las Formas 5, 11 y 12, se interconvertían fácilmente ya que la humedad relativa variaba de aproximadamente 22 % a aproximadamente 92 %. Obsérvese que al 92% de humedad relativa, el Compuesto X parece ser una mezcla de una forma cristalina caracterizada como hexahidrato mezclado con el tetrahidrato de la Forma 12. En comparación, el anhidrato (Forma 1) se convierte preferentemente en un sesquihidrato cuando la humedad relativa aumenta al 43 % y evoluciona a trihidrato y tetrahidrato a humedades relativas más altas.

Composiciones farmacéuticas del Compuesto X

El Compuesto X (500 mg) y L-arginina (332,5 mg) se combinan en un vial. Se añade sacarosa (sacarosa cristalina, apirógena: 1.000 mg) junto con agua apta para inyección (8,00 ml). Se ajusta el pH de la solución, si fuera necesario, usando HCl 1,0N o NaOH 1,0N, para llegar a un pH de 5,0 ± 0,5, preferentemente un pH de 5,0 ± 0,2. Esto proporciona una solución que contiene aproximadamente 62,5 mg/ml de Compuesto X como una sal de arginina. Esta solución se puede filtrar si es necesario y se puede liofilizar para proporcionar un sólido blanco o blanquecino (liofilizado). El sólido liofilizado se puede reconstituir con agua estéril o un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina isotónica o dextrosa, para proporcionar una solución adecuada para la administración intravenosa. El liofilizado debe almacenarse en un recipiente que excluya la luz para proteger al liofilizado de la fotodegradación. Este proceso se puede escalar hacia arriba o hacia abajo para proporcionar dosis unitarias para almacenamiento y distribución, o material a granel que se puede procesar posteriormente según se desee. Para escalar, el control de la temperatura es importante: El Compuesto X en solución debe mantenerse a una temperatura inferior a 10 °C, preferentemente entre 0 °C y 8 °C y, más preferentemente, entre 2 °C y 8 °C, antes de la adición de arginina u otra base, ya que el compuesto está sujeto a degradación hidrolítica en agua en ausencia de una base o fuera del intervalo de pH de 4-6.

En una realización, se prepara una mezcla de acuerdo con el ejemplo anterior como se describe usando el trihidrato (Forma 5) del Compuesto X en una cantidad que contiene aproximadamente 500 mg de Compuesto X anhidro, y se liofiliza en un vial que luego se sella para almacenamiento y distribución, preferentemente usando un tapón de goma de butilo (por ejemplo, tapón D777), donde el liofilizado en cada vial contiene aproximadamente 500 mg de Compuesto X. Los viales de liofilizado se almacenan a temperatura ambiente o por debajo de ella hasta su uso.

Una formulación alternativa adecuada para inyección intravenosa contiene Compuesto X (100 mg) y bicarbonato de sodio 0,5 N (0,75 ml) y un ajustador de pH si es necesario (NaOH 1 N o HCl 1 N según sea necesario) para llevar el pH a aproximadamente 5,5 (entre pH 5 y pH 6), más una cantidad de agua para inyección suficiente para alcanzar una concentración final de 100 mg/ml.

Estabilidad del Compuesto X

El Compuesto X es estable en forma sólida, pero las sales del Compuesto X son más estables en solución que el ácido libre; por tanto, se volvió importante identificar las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas para usar en la administración. Las sales del Compuesto X se prepararon añadiendo una base (1,0 o 2,0 equiv.) al Compuesto X en agua y liofilizando la solución. Los sólidos así obtenidos parecen ser amorfos por XRPD. De esta manera, se intentó la formación de sales del Compuesto X con hidróxido de sodio, (L)-lisina, (L)-arginina, hidróxido de calcio, meglumina e hidróxido de magnesio. Se descubrió que las sales de sodio y las sales de arginina eran particularmente estables y, por tanto, deseables como formas de administración en medios acuosos típicamente usados para inyecciones e infusiones intravenosas.

Las muestras de la sal disódica y la sal de di-(L)-arginina como sólidos se sometieron a pruebas de estabilidad a 25 °C y 40 °C. La muestra de sal de sodio tenía una pureza del 97,2 % por HPLC inicialmente y después de 6 semanas a 25 °C, todavía tenía una pureza del 96,2 %. El mismo material mantenido a 40 °C tenía una pureza del 94,8 % después de 3 semanas y una pureza del 93,6 % después de 6 semanas. Las impurezas significativas que aparecen o aumentan durante el estudio aparecen en tiempos de retención relativa (TRR) 0,34 y 1,11 (con el Compuesto X definido como TRR = 1).

La sal de arginina tenía una pureza del 97,3 % por HPLC inicialmente y tenía una pureza del 96,3 % después de 6 semanas a 25 °C. A 40 °C, su pureza cayó al 95,1 % después de 3 semanas y al 94,2 % después de 6 semanas. Las impurezas significativas que aparecen o aumentan durante este estudio aparecen en tiempos de retención relativos (TRR) 1,09, 1,11 y 1,13 (con el Compuesto X definido como TRR = 1). Los trazados de h PlC para las muestras de estos estudios de estabilidad después de 6 semanas a 25 °C y 40 °C, respectivamente, se muestran en las Figuras 10 y 11. El trazado inferior de cada figura es una muestra utilizada para medir el límite de cuantificación (LOQ); el siguiente trazado encima que representa la muestra de Compuesto X se usó para la formación de sal; y el siguiente trazado encima de ese es para la sal de sodio después de 6 semanas; y el siguiente trazado (arriba) es para la sal de sodio después de 6 semanas.

Condiciones de HPLC para los estudios de estabilidad (Figuras 10 y 11):

Sistema Agilent 1290 con detector UV a 260 nm

Columna Acquity HSS T3, 100 mm x 2,1 mm DI; Tamaño de partícula de 1,8 pm (suministrado por Waters) Temp. de columna: 40 °C

Fases móviles

A: TFA al 0,05 % en agua

B: TFA al 0,05 % en metanol

Caudal: 0,45 ml/min

Gradiente (relación A/B): 97:3 durante 8 minutos; 75:25 durante 3 minutos; 0:100 durante 1 minuto

También se descubrió que el Compuesto X se degradaba fotoquímicamente; por lo tanto, el Compuesto X debe almacenarse en recipientes oscuros u opacos para una mejor vida útil. En una realización de la invención, el Compuesto X está empaquetado en un recipiente que reduce sustancialmente la exposición a la luz, preferentemente en una atmósfera a una humedad relativa de 25-50 % de humedad y, más preferentemente, a una humedad relativa de 30-40 % o 30-45 %.

Actividad biológica

Cribado y cultivos bacterianos

Los aislados bacterianos se cultivaron a partir de cepas congeladas a -70 °C mediante dos pases nocturnos consecutivos a 35 °C en aire ambiente en agar sangre al 5 % (Remel, Lenexa, Kans.). Control de calidad y P. aeruginosa ATCC 27853) procede de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; Rockville, Md) y PAO1 se recibió del Dr. K. Poole.

Construcción de cepas isogénicas de Escherichia coli Cepas NB27273-CDY0026 (parental), NB27273-CDY0033 (KPC2) y NB27273-CDY0030 (SHV12)

La cepa NB27273 (BW25113 pspB::Kmr) se obtuvo de la colección de inserciones de transposones Keio. La cepa tiene el gen pspB reemplazado por un marcador de resistencia a la kanamicina (BW25113 pspB::Kmr). Esta cepa se curó del transposón en pspB a través de recombinasa FLP usando la metodología publicada. La cepa resultante, BW25113 pspB, se usó como hospedador para vectores multicopia que expresan beta-lactamasas clave. Los plásmidos multicopia que dirigen la expresión constitutiva de las beta-lactamasas se establecieron de la siguiente manera: Los genes sintéticos de codones optimizados que codifican las KPC2 y SHV12 -lactamasas de E. coli se prepararon mediante DNA2.0 (Palo Alto, CA). Cada uno de los fragmentos sintéticos fue diseñado para contener sitios de restricción de Notl y Ncol en sus extremos, permitiendo la ligadura en un derivado de pET28a (+) digerido con Notl/Ncol para la expresión de proteínas. Las inserciones en estos vectores sirvieron como ADN molde para la amplificación por PCR del gen codificante de KPC2 y SHV12, utilizando los pares de cebadores E225 (tcgcCTCGAGgcgactgcgctgacgaatttgg) (SEQ ID NO:1) y E202 (aatcGAATTCttactgaccattaacgcccaagc) (SEQ ID NO:2) y E227 (tcgcCTCGAGgcgagcccgcaaccgctgga) (SEQ ID NO:3) y E204 (aatcGAATTCttaacgctgccagtgctcaatc) (SEQ ID NO:4), respectivamente. A continuación, se muestran las secuencias de nucleótidos de codones optimizados y la información relevante de reconocimiento de cebadores:

SHV12

ATGGGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGC

GAGCCCGCAACCGCTGGAGCAGATCAAGCAGTCTGAGAGCCAGCTGAGCGGCCGTGTGG

GTATGATCGAGATGGATCTGGCTTCCGGCCGTACGCTGACGGCATGGCGTGCCGACGAA

CGTTTCCCGATGATGTCGACCTTTAAAGTTGTTCTGTGTGGTGCGGTCTTGGCACGTGT

AGACGCGGGTGACGAACAACTGGAGCGCAAGATCCATTACCGCCAACAGGACTTGGTCG

ACTACAGCCCGGTTAGCGAAAAGCACCTGGCGGATGGCATGACCGTGGGTGAATTGTGC

GCCGCTGCGATTACCATGAGCGACAATAGCGCGGCTAATCTGCTGTTGGCGACCGTTGG

TGGCCCAGCGGGCTTGACCGCATTTCTGCGTCAAATCGGCGATAATGTTACGCGTCTGG

ATCGCTGGGAAACGGAGCTGAACGAGGCACTGCCGGGTGATGCCCGTGATACCACGACT

CCTGCTAGCATGGCAGCGACCCTGCGTAAACTGCTGACCAGCCAGCGTCTGAGCGCACG

TAGCCAACGCCAGCTGCTGCAATGGATGGTGGATGACCGCGTGGCGGGTCCGCTGATCC

GCTCCGTCCTGCCAGCAGGCTGGTTCATTGCGGACAAAACTGGTGCCTCTAAGCGTGGT

GCGCGTGGTATCGTCGCGCTGCTGGGTCCGAACAACAAAGCCGAACGTATTGTGGTTAT

CTATCTGCGCGACACCCCGGCAAGCATGGCCGAGCGCAACCAGCAAATTGCGGGCATTG

GTGCGGCACTGATTGAGCACTGGCAGCGTTAACGCCGGCG (SEQ ID NO:5)

E227 TCGCCTCGAGGCGAGCCCGCAACCGCTGGA (SEQ ID NO:6)

E204 AATCGAATTCTTAACGCTGCCAGTGCTCAATC (SEQ ID NO:7)

COMP. INV. E204 GATTGAGCACTGGCAGCGTTAAGAATTCGATT (SEQ ID NO:8)

KPC2

ATGGGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGCGACTGCGCTGA

CGAATTTGGTGGCCGAGCCGTTCGCGAAATTGGAGCAAGATTTTGGTGGTTCGATCGGTGTCTACGCGAT

GGACACCGGTAGCGGTGCCACCGTGAGCTACCGTGCCGAAGAGCGTTTTCCGCTGTGTAGCTCTTTCAAG

GGTTTTCTGGCCGCAGCCGTGCTGGCACGCAGCCAACAGCAAGCGGGCCTGCTGGACACCCCGATCCGTT

ACGGCAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGAGCCCGATTAGCGAAAAGTACCTGACCACCGGCATGACGGTGGC

GGAGTTGAGCGCTGCGGCGGTTCAGTATTCCGATAACGCTGCGGCAAATCTGCTGCTGAAAGAACTGGGC

GGTCCAGCGGGTCTGACGGCTTTCATGCGTTCTATTGGCGACACCACCTTTCGCTTGGACCGCTGGGAGC

TGGAGCTGAACAGCGCGATTCCGGGCGACGCACGTGATACGAGCAGCCCGCGTGCAGTGACCGAGAGCCT

GCAGAAGCTGACCCTGGGCAGCGCACTGGCCGCACCGCAGCGCCAACAGTTCGTCGATTGGCTGAAGGGT

AACACCACCGGTAACCATCGTATTCGCGCAGCGGTCCCGGCTGATTGGGCAGTTGGTGACAAGACTGGTA

CGTGCGGCGTTTATGGTACGGCGAATGACTACGCGGTTGTTTGGCCTACGGGTCGTGCGCCGATCGTCCT

GGCGGTGTATACCCGTGCTCCGAACAAAGACGATAAACACTCCGAAGCGGTCATCGCCGCAGCAGCGCGT

CTGGCCCTGGAAGGCTTGGGCGTTAATGGTCAGTAACGCCGGCG (SEQ ID NO:9)

E225 TCGCCTCGAGGCGACTGCGCTGACGAATTTGG (SEQ ID NO:10)

E202 AATCGAATTCTTACTGACCATTAACGCCCAAGC (SEQ ID NO:11)

COMP. INV. E202 GCTTGGGCGTTAATGGTCAGTAAGAATTCGATT (SEQ ID NO:12)

SUBRAYADO = ADN CODIFICANTE DE BL

Después, se digirieron los productos de PCR con Xhol y EcoRI, y se ligaron en el plásmido pAH63-pstS(BlaP) digerido de manera similar. El plásmido pAH63-pstS(BlaP) es un derivado del plásmido pAH63 (J Bacteriol:183(21): 6384­ 6393) creado mediante la clonación del promotor TEM-1 (bla) y la región codificante del péptido señal del plásmido pBAD (J Bacteriol. Julio de 1995. 177(14):4121-30) en el plásmido pAH63. Este fragmento se amplificó por PCR a partir de pBAD usando el par de cebadores E192 (ttcaCTGCAGtgaacgttgcgaagcaacggC) (SEQ iD NO:13) y E194 (TCGAggatcctcgagagcaaaaacaggaaggcaaaatgccg) (SEQ ID NO:14), se digirió con Pstl y BamHI, y se insertó en el plásmido digerido de manera similar pAH63. Por lo tanto, la expresión de beta-lactamasas a partir de construcciones basadas en pAH63-pstS(BlaP) es constitutiva y se proporciona la secuencia señal para dirigir estas proteínas al periplasma. Los vectores basados en el plásmido pAH63 se usan para la inserción en el genoma en una sola copia, sin embargo, para proporcionar niveles de expresión más altos que permitan una detección más sensible de la susceptibilidad de los compuestos a las beta-lactamasas, se trasladaron las inserciones de expresión contenidas en estos vectores al vector multicopia replicativo pBAD-Kan (J Bacteriol. Julio de 1995. 177(14):4121-30). Para conseguir esto, las inserciones que abarcan los genes de beta-lactamasa, con el promotor de TEM asociado y las secuencias de señal, se amplificaron por PCR a partir de sus vectores correspondientes utilizando el cebador E269 (ccgTCTAGAcggatggcctttttgcgtttc) (SEQ ID NO: 15) y E202 (aatcGAATTCttactgaccattaacgcccaagc) (SEQ ID NO:16) para la construcción KPC2 y E204 (aatcGAATTCttaacgctgccagtgctcaatc) (SEQ ID NO:17) para la construcción SHV12. A continuación, estos fragmentos se digirieron con Xbal y EcoRI, y cada uno se insertó en pBAD18-kan que había sido digerido con las mismas enzimas para generar un par de vectores multicopia que expresaran KPC-2 y SHV12, respectivamente. Estos vectores se transformaron en BW25113 pspB para generar las cepas NB27273-CDY0033 (que expresan KPC2) y NB27273-CDY0030 (que expresan SHV12). El vector pBAD18-kan también contiene la región promotora de TEM y la secuencia de señal, (pero carece de cualquier gen intacto de beta-lactamasa) y se transformaron en BW25113 pspB usando protocolos convencionales para generar la cepa de control NB27273-CDY0026. La expresión de las beta-lactamasas se confirmó verificando la reducción de la susceptibilidad a los antibióticos de prueba de ejemplo que son sustratos conocidos de KPC-2 o SHV12.

Prueba de susceptibilidad

Se determinaron las Concentraciones Mínimas Inhibidoras (CMI) mediante el método de microdilución en caldo de acuerdo con las pautas del Clinical and Laboratories Institute (CLSI). En resumen, se suspendieron cultivos bacterianos recién preparados durante la noche en solución salina estéril y se ajustaron a un patrón de turbidez de 0,5 McFarland. Las suspensiones bacterianas se diluyeron en caldo Mueller-Hinton ajustado con cationes (MHB II; BBL) para producir un inóculo final de aproximadamente 5 x 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. Se preparó una placa maestra de antibióticos a una concentración equivalente a cien veces la concentración final más alta deseada en dimetilsulfóxido al 100 % (DMSO). La placa antibiótica maestra se diluyó luego mediante dilución doble en serie con una pipeta multicanal. La serie de diluciones resultante de compuestos se diluyó 1:10 con agua estéril, dando lugar a una concentración final de DMSO del 10 %. Se transfirió un volumen de 10 pl de la serie de dilución del fármaco a placas de ensayo de 96 pocillos. En las placas de ensayo se inocularon 90 pl de suspensiones bacterianas y se incubaron a 35-37 °C durante 20 horas. Las placas de ensayo se leyeron usando un lector de placas de microtitulación (Molecular Devices) a 600 nm, así como mediante observación visual con un espejo de lectura. La concentración más baja del compuesto que evitó el crecimiento visible se registró como la CIM. El rendimiento del ensayo se controló probando aztreonam contra cepas de control de calidad de laboratorio de acuerdo con las pautas del CLSI.

Compuestos de referencia: a efectos de comparación, los siguientes compuestos monobactámicos conocidos se utilizan en el presente documento:

Compuesto de referencia 1: Aztreonam

Compuesto de referencia 2: Carumonam

Compuesto de referencia 3: BAL30072

Compuesto de referencia 4: Aicuris WO2013110643

Tabla A: Concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) contra cepas isogénicas de E. coli, portadoras de varios determinantes de resistencia.

Cepa 1: E. coli NB27273-CDY0026 (parental)

Cepa 2: E. coli NB27273-CDY0033 (KPC2)

Cepa 3: E. coli NB27273-CDY0030 (SHV12)

Los datos de la Tabla A muestran que el Compuesto X tiene una buena potencia antibacteriana contra E. coli, incluyendo cepas que muestran una fuerte resistencia a varios antibióticos conocidos monobactámicos y sulfactam. En la siguiente tabla se proporcionan datos de actividad adicionales para el Compuesto X. El Compuesto X se probó en la cepa 25922 de E. coli y una E. coli que contenía KPC-2 (cepa 2 anterior, que es una carbapenemasa conocida de Klebsiella pneumoniae) y mostró estas concentraciones inhibidoras (CMI), en mg/ml.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una sal de (L)-arginina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminot¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡din-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)cidopropanocarboxílico.

2. Una forma sólida liofilizada de una sal sódica de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazet¡d¡n-3-¡l)am¡no)et¡l¡den)am¡no)ox¡)c¡clopropanocarboxíl¡co.

3. Una forma sólida hidratada de ácido ^ (((Z H I-^ -a m in o tia z o M -il^ -o x o ^ -^ ^S ^R ^-o x o ^ -^ -o x o o x a z o lid in ^ -¡l)met¡l)-1-sulfoazet¡d¡n-3-¡l)am¡no)et¡l¡den)am¡no)ox¡)c¡dopropanocarboxíl¡co.

4. La forma sólida hidratada según la reivindicación 3, que consiste en 50 % o más del material de un trihidrato de ácido ^(((ZH I-p-am inotiazoM -il^-oxo^-^^S ^R ^-oxo^-^-oxooxazo lid in^-iO m eti^-l-su lfoazetid in -B -¡l)am¡no)et¡l¡den)am¡no)ox¡)ddopropanocarboxíl¡co.

5. Un método para preparar la forma sólida hidratada según la reivindicación 4, que comprende poner en contacto ácido ^(((ZH l-^-am ino -tiazoM -il^-oxo^-^^S ^R ^-oxo^-^-oxooxazo lid in^-iO m eti^-l-su lfoaze tid in -B -i^amino^tNiden^mino^xOdclopropanocarboxílico, con una atmósfera que tenga una humedad relativa entre el 25 % y el 50 % a una temperatura entre 20 °C y 30 °C.

6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Una forma cristalina de ácido ^ (((Z H I-^ -a m in o tia zo M -il^ -oxo ^-^^S ^R ^-o xo^-^ -oxo o xazo lid in ^ -iO m e til)-l-sulfoazetidin^-iOammo^tiliden^mino^xOdclopropanocarboxílico (Forma 1) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 6,6. 13,4 y 18,8.

8. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-am¡not¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 2) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 7,5, 19,3 y 20,0.

9. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-am¡not¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 3) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 7,3, 18,9 y 21,2.

10. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-am¡not¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 4) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 7,0, 8,6, 19,3 y 20,9.

11. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-am¡not¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 5) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 7,3, 9,3 y 27,8

12. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-am¡not¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazet¡d¡n-3-¡l)am¡no)et¡l¡den)am¡no)ox¡)ddopropanocarboxíl¡co (Forma 6) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 8,1, 9,2 y 12,8; y opcionalmente por picos adicionales a 21,2 y 24,7.

13. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-am¡not¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazet¡d¡n-3-¡l)am¡no)et¡l¡den)am¡no)ox¡)ddopropanocarboxíl¡co (Forma 7) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 6,7, 7,3 y 20,3.

14. Una forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-am¡not¡azol-4-¡l)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxooxazol¡d¡n-3-¡l)met¡l)-1-sulfoazet¡d¡n-3-¡l)am¡no)et¡l¡den)am¡no)ox¡)ddopropanocarboxíl¡co (Forma 8) que presenta al menos los siguientes picos característicos de difracción de rayos X en polvo (expresados en grados 20): 6,2, 21,8 y 25,9.

15. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una forma cristalina del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, para su uso en terapia.