JP6837480B2

JP6837480B2 - モノバクタム抗生物質の塩および固体形態

Info

Publication number: JP6837480B2
Application number: JP2018515607A
Authority: JP
Inventors: オーバン，エリック; カサレズ，アンソニー; フィッシュ，アンドレアス; リ，ヅァィシン; リンドヴァル，ミカ; アーンストモーザー，ハインツ; ムッツ，ミカエル; レック，フォルカート; ウルリヒリエベセール，ベルント; スチョエンハインツ，マーク; セチュラマン，ヴィジェイ; ローウェルシモンズ，ロバート
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2016-09-20
Publication date: 2021-03-03
Anticipated expiration: 2036-09-20
Also published as: CA2999794A1; RU2018114480A3; EA037569B1; MA42946A; SI3353175T1; EP3353175A4; KR20180054816A; EP3353175B1; MA42946B1; HRP20201423T1; CN108137573A; AU2016327264B2; US20180273522A1; EA202092620A1; EA201890771A1; CY1123509T1; RS60805B1; LT3353175T; PT3353175T; CN108137573B

Description

本発明は、実生産規模の製造に適した１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の塩および結晶形態、ならびにこれらの物質を含有する医薬組成物、それらを調製する方法、および治療におけるそれらの使用に関する。

ここ数十年にわたって、抗微生物薬耐性の頻度およびその重篤な感染症との関連性が、憂慮すべきほどの速度で高まった。院内病原体の間でますます蔓延する耐性は特に当惑するほどである。米国で毎年起こる２００万を超える院内（病院で獲得された）感染のうち、５０〜６０％は、細菌の抗微生物薬耐性株によって起こる。よく使用される抗細菌剤に対する耐性率が高いことによって、院内感染に関連する罹患率、死亡率、およびコストが増加する。米国では、院内感染によって、１年当たり７７，０００人を超える死亡がもたらされるまたは引き起こされると考えられ、毎年約５０億ドル〜１００億ドルが必要とされる。

グラム陰性菌の耐性の重要な原因としては、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、およびプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）における広域スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）、セリンカルバペネマーゼ（ＫＰＣ）およびメタロ−β−ラクタマーゼ（例えば、ＮＤＭ−１）、エンテロバクター属（Enterobacter）菌種およびサイトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）中における高レベル第三世代セファロスポリン（ＡｍｐＣ）β−ラクタマーゼ耐性、ならびにシュードモナス属（Pseudomonas）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、およびステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）において認められる多剤耐性遺伝子が挙げられる。抗細菌薬耐性の問題は、複数の抗細菌薬に対して耐性を示す細菌株の存在によって複雑になる。例えば、ＮＤＭ−１型のメタロ−β−ラクタマーゼをもつ肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）は、ＮＤＭ−１を保有する同じプラスミド上にしばしば追加のセリン−β−ラクタマーゼを保有する。

したがって、既存の薬剤耐性微生物に対して有効であるか、または新たな細菌耐性を発生させにくい、新規な抗細菌薬、特に抗細菌性化合物が必要とされている。本発明は、そのような化合物の、好都合な製造操作条件下におけるそれらの取扱い特性のために特に実生産規模の製造に適した固体形態を提供する。

未公開の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２２０１１号には、いくつかのモノバクタム抗生物質が記載されている。他のモノバクタムに対する耐性を示す株を含めて、グラム陰性細菌に対して強い活性を示す、その出願に記載の１つの化合物は、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸であり、本明細書においては化合物Ｘと呼ぶ。

医薬化合物およびそれらの製剤を製造するには、商業的に実現可能で、確実で、かつ再現性のある製造方法を得るために、活性化合物は、好都合な取扱いおよび加工をすることができる形態であることが重要である。化合物Ｘおよびその塩の多くは、室温で固体であり、物質を生成、精製または結晶化するために使用される条件に応じて、様々な固体形態で生成することができる。しばしば多形体と呼ばれる、複数の固体形態が存在していることは、固体の医薬化合物で周知であり、化学的および物理的安定性ならびにそのような化合物の取扱い特性は、どの固体形態が使用されるかによって決まることが多い。したがって、活性原薬の特定の固体形態（例えば、塩の形態、水和物または溶媒和物の形態、または多形体）の選択は、確実で再現性のある生成方法の設計、ならびに安全で有効な形態の原薬の貯蔵、取扱いおよび流通において非常に重要であることが多い。

一般的に、特定の固体状態の形態の医薬成分を製造することが有利であることが見出され、これらは"Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection and Use", P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.) (Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich)に記載されている。固体状態の形態を製造する方法はまた、"Practical Process Research and Development", Neal G. Anderson (Academic Press, San Diego)および"Polymorphism: In the Pharmaceutical Industry", Rolf Hilfiker (Ed) (Wiley VCH)にも記載されている。

本発明者らは、本明細書に記載されている化合物Ｘの製造、貯蔵または投与における使用に特に適した化合物Ｘのいくつかの塩および多形体の形態を発見した。

医薬品は、商業的に実施可能な条件下で輸送および貯蔵されるとき著しい分解を防止するほど十分に安定していることが重要である。本発明者らは、溶液状態の化合物Ｘが、湿気の存在下で最大の安定性を得るには、４と６の間、好ましくは４．０と５．５の間のｐＨで使用および貯蔵されることが好ましいことを発見した。最適な溶液安定性は、約４．０〜５．５のｐＨで達成される。したがって、本発明は、ｐＨ４と６の間に、好ましくは４．０と５．５の間、より好ましくは約５±０．５のｐＨまたは５±０．２のｐＨの化合物Ｘを含む医薬組成物を提供する。適切な組成物は、等張性でありうるデキストロースまたは生理食塩水などの水溶液中に化合物Ｘを含み、安定剤、抗酸化剤、緩衝剤またはｐＨ調整剤、栄養剤など他の物質を含有することができる。これらの実施形態の一部において、所望のｐＨは、化合物Ｘと、水溶液において所望のｐＨを達成するのに適したｐＨ調整剤とを組み合わせることによって達成される。適切なｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）などのアミン、およびアルギニン、リシン、ヒスチジンなどのアミノ酸などが挙げられるが、これらに限定されない。アズトレオナムを含めて、公知のモノバクタムはアルギニンと共に製剤化されたものであった。

適切なｐＨは、化合物Ｘの水溶液にｐＨ調整剤を添加すること、またはｐＨ調整剤を含有する水溶液に化合物Ｘを添加することによって達成することができる。ｐＨ調整剤および化合物Ｘの適切な量は、当業者が容易に決定することができる。適切なｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウムおよびアルギニンが挙げられる。したがって、化合物Ｘの溶液または懸濁液を水酸化ナトリウムまたはアルギニンで処理して、化合物のナトリウム塩またはアルギニン塩を含む溶液を生成することができる。さらに、この溶液を凍結乾燥して、存在している水およびいずれの共溶媒も除去すると、化合物ＸをｐＨ調整剤と共に含み、または化合物ＸおよびｐＨ調整剤によって形成された塩、例えば化合物Ｘのナトリウム塩もしくはアルギニン塩を含む凍結乾燥した固体を残留させることができる。

さらに、本発明に従って、工業規模の製造に適した取扱い特性をもたらす化合物Ｘの複数の固体形態を、これらの多形体を生成する方法と共に提供する。

以下に列挙する本発明の実施形態は代表的なものである。
１．１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸のアルギニン塩。一部の実施形態において、塩は（Ｌ）−アルギニン塩である。
２．１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸のナトリウム塩。
３．１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の固体形態の水和物。
４．主として、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の３水和物からなる、実施形態３に記載の固体形態の水和物。
５．実施形態４に記載の固体形態の水和物を調製する方法であって、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸を、２０℃と３０℃の間の温度で２５％と５０％の間の相対湿度を有する雰囲気と接触させるステップを含む方法。
６．実施形態１から４のいずれか１つに記載の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
７．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．６、１３．４、および１８．８を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム１）。一部の実施形態において、フォーム１は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
８．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．５、１９．３、および２０．０を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム２）。一部の実施形態において、フォーム２は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
９．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、１８．９、および２１．２を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム３）。一部の実施形態において、フォーム３は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１０．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．０、８．６、１９．３、および２０．９を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム４）。一部の実施形態において、フォーム４は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１１．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、９．３、および２７．８を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム５）。一部の実施形態において、フォーム５は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１２．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：８．１、９．２、および１２．８、ならびに場合によって２１．２および２４．７における追加のピークを示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム６）。一部の実施形態において、フォーム６は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１３．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．７、７．３、および２０．３を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム７）。一部の実施形態において、フォーム７は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１４．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．２、２１．８、および２５．９を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム８）。一部の実施形態において、フォーム８は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１５．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．３、１２．６、および２２．３、ならびに場合によって２２．１、２３．１、２７．０および２７．５から選択される１つまたは複数の追加のピークを示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム９）。一部の実施形態において、フォーム９は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１６．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．６、１１．０、および１６．５、ならびに場合によって２２．２および２３．４から選択される１つまたは複数の追加のピークを示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム１０）。一部の実施形態において、フォーム１０は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１７．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．４、９．７、および２９．３、ならびに場合によって１７．０、１９．５、２２．２、２６．３および２８．１におけるピークから選択される１つまたは複数の追加のピークを示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム１１）。一部の実施形態において、フォーム１１は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１８．少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：１９．０、２０．４、および２４．０、ならびに場合によって７．３、２４．７、および２７．２におけるピークから選択される１つまたは複数の追加のピークを示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶形態（フォーム１２）。一部の実施形態において、フォーム１２は、下記のような追加のＸＲＰＤピークを有する。
１９．１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸およびアルギニンを含む医薬組成物。
２０．薬学的に許容される担体をさらに含む、１９．に記載の医薬組成物。
２１．担体が水性である、２０．に記載の医薬組成物。
２２．約５．０のｐＨである、２１．に記載の医薬組成物。
２３．スクロース、フルクトース、トレハロース、マンニトール、およびラクトースから選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含む、２１．または２１．に記載の医薬組成物。
２４．治療における使用のための、１．から４．のいずれか１つに記載の化合物または７．から１８．のいずれか１つに記載のその結晶形態。
２５．治療が、グラム陰性細菌感染症の処置である、２４．に記載の化合物。
２６．グラム陰性細菌感染症を起こす細菌が、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、モルガネラ属（Morganella）、モラクセラ属（Moraxella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、シゲラ属（Shigella）、およびナイセリア属（Neisseria）の細菌から選択される、２４．に記載の化合物。
２７．１．から４．のいずれか１つに記載の化合物、または７．から１８．のいずれか１つに記載のその結晶形態の、グラム陰性細菌感染症の処置のための医薬の製造における使用。
２８．グラム陰性細菌感染症を起こす細菌が、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、モルガネラ属（Morganella）、モラクセラ属（Moraxella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、シゲラ属（Shigella）、およびナイセリア属（Neisseria）の細菌から選択される種である、２７．に記載の使用。
２９．グラム陰性感染症に対する処置方法であって、それを必要とする対象に、１．から４．のいずれか１つに記載の化合物、または７．から１８．のいずれか１つに記載の結晶形態、または１９．から２３．のいずれか１つに記載の医薬組成物の治療上有効量を投与するステップを含む方法。
３０．グラム陰性細菌感染症を起こす細菌が、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、モルガネラ属（Morganella）、モラクセラ属（Moraxella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、シゲラ属（Shigella）、またはナイセリア属（Neisseria）の細菌から選択される種である、２９．に記載の方法。

フォーム１の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム２の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。アセトンを加えて撹拌した後のフォーム１の粉末Ｘ線回折パターンを、比較のためにフォーム１のＸＲＰＤに重ね合わせて示す図である。フォーム３の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム４の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム５の粉末Ｘ線回折パターンを図４のＸＰＲＤの上に重ね合わせて示す図であるより大きい調製規模で得られたフォーム５の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム６の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム７の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム８の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム９の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム１０の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム１１の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。フォーム１２の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。

したがって、一態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．６、１３．４、および１８．８を示す化合物Ｘの結晶形態（フォーム１）を提供する。一実施形態において、フォーム１は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：６．６、１３．４、１６．６、１７．９、１８．８、２０．３、２５．１、および２８．９を示す。別の実施形態において、フォーム１は、少なくとも、リスト１に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト１から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォーム１は、図１に示されるものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

別の態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．５、１９．３および２０．０を示す化合物Ｘの結晶形態（フォーム２）を提供する。一実施形態において、フォーム２は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：６．７、７．５、１３．３、１３．７、１５．３、１７．９、１８．７、１９．３および２０．０を示す。別の実施形態において、フォーム２は、少なくとも、リスト２に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト２から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォーム２は、図２に示されるものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

別の態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、１８．９、および２１．２を示し、場合によって、８．３におけるピークをさらに含む化合物Ｘの結晶形態（フォーム３）を提供する。一実施形態において、フォーム３は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、１３．９、１６．７、１８．９、２０．３、２１．２、および２４．６を示す。別の実施形態において、フォーム３は、少なくとも、リスト３に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト３から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォームＣは、図４に示すものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

別の態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．０、８．６、１９．３および２０．９を示す化合物Ｘの結晶形態（フォーム４）を提供する。一実施形態において、フォーム４は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：７．０、８．６、１５．２、１７．０、１８．０、１９．３、２０．９、２４．５、および２６．９を示す。別の実施形態において、フォーム４は、少なくとも、リスト４に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト４から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォーム４は、図５に示すものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

別の態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、９．３、および２７．８を示し、場合によって、１９．９におけるピークをさらに含む化合物Ｘの結晶形態（フォーム５）を提供する。一実施形態において、フォーム５は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、９．３、１６．３、１８．６、１９．２、１９．９、２１．７、２４．１、２４．９、２７．３、２７．８および２９．８を示す。別の実施形態において、フォーム５は、少なくとも、リスト５に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト５から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォーム５は、図６に示すものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

別の態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：８．１、９．２、１２．８、２１．２、および２４．７を示す化合物Ｘの結晶形態（フォーム６）を提供する。一実施形態において、フォーム６は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：８．１、９．２、１２．８、１３．９、１４．４、１６．７、２０．１、２１．２、２４．７、および２６．６を示す。別の実施形態において、フォーム６は、少なくとも、リスト６に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト６から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォーム６は、図７に示すものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

別の態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．７、７．３および２０．３を示す化合物Ｘの結晶形態（フォーム７）を提供する。一実施形態において、フォーム７は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：６．７、７．３、１７．６、１８．０、２０．３、および２４．９を示す。別の実施形態において、フォーム７は、少なくとも、リスト７に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト７から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォーム７は、図８に示すものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

別の態様において、本発明は、少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．２、２１．８、および２５．９を示す化合物Ｘの結晶形態（フォーム８）を提供する。一実施形態において、フォーム８は、少なくとも以下に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク：６．２、１７．８、２０．７、２１．８、および２５．９を示す。別の実施形態において、フォーム８は、少なくとも、リスト８に示す特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク、またはリスト８から選択される少なくとも５つのピークの任意のサブセットを示す。さらに別の実施形態において、フォーム８は、図９に示すものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを示す。

本発明の一態様において、本発明の多形体は結晶特性を有し、好ましくは少なくとも５０％結晶質、より好ましくは少なくとも６０％結晶質、さらにより好ましくは少なくとも７０％結晶質、最も好ましくは少なくとも８０％結晶質である。結晶化度は、従来のＸ線回折技法によりまたは赤外分光技法により推定することができる。

一部の実施形態において、化合物Ｘの固体形態は、本明細書に記載されるフォームの１つまたは複数を含む。化合物Ｘの固体形態は、これらのフォームの２つ以上を含むことができ、すなわち、２つ以上のフォームの混合物とすることができる。一部の実施形態において、固体形態の試料は主に、フォーム１〜８から選択される単一のフォームからなり、これは、物質の５０％以上が１つの固体フォームであることを意味する。混合物中の様々なフォームの相対量は、ＸＲＰＤデータから決定することができる。本明細書に記載されているように、フォームの一部は、適切な条件下で発展または相互変換することができる。具体的には、フォーム４および５は混合物として生ずることができ、物質が維持される相対湿度および温度に応じて相互変換することができる。

本発明の一態様において、本発明の多形体は、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％結晶質である。

本明細書において、（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピークは、波長１．５４０６Å（α１）および１．５４４４Å（α２）の銅Ｘ線を使用して測定される。ピークの位置は２θの角度で報告され、小さな数的変動の影響を受けると理解されており、したがって、角度は±０．２°の変動の影響を受けると理解されるべきである。

本発明の結晶形態は、非溶媒和または溶媒和の形態で存在することができる。本明細書では、用語「溶媒和物」は、本発明の化合物およびある量の１つまたは複数の薬学的に許容される溶媒を含む分子複合体を記載するために使用される。薬学的に許容される溶媒の例としては、エタノールおよび水が挙げられる。溶媒が水であるとき、用語「水和物」が使用される。本明細書に記載されている化合物Ｘのいくつかの多形体は水和物である。

一態様において、本発明は、治療における使用のための本明細書で定義される塩または結晶形態を提供する。別の態様において、本発明は、治療による処置方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に許容される量の本発明による塩または結晶形態を投与するステップを含む方法を提供する。

一態様において、本発明は、本明細書で定義される塩または結晶形態の、治療における使用のための医薬の製造における使用を提供する。

一実施形態において、治療は、グラム陰性細菌によって起こる感染症の処置である。

本発明は、本明細書に記載される結晶形態の調製方法も提供する。したがって、一態様において、本発明は、本明細書に記載されているフォーム１、２、３、４、５、６、７、および８のいずれかの調製方法であって、本明細書に示されている実施例に記載されている溶媒系および条件を使用して、化合物Ｘの溶液から、所望のフォームを結晶化させるステップを含む方法を提供する。

本発明の文脈において、本明細書では「処置」への言及は、異なった特段の指示がない限り、治癒的、待機的および予防的処置への言及を包含する。用語「治療」、「治療の」および「治療上」は、同じように解釈されるべきである。

化合物Ｘは、典型的には注射または輸注により投与され、投与するには、化合物Ｘを適量の水またはデキストロースもしくは生理食塩水、例えば等張性デキストロースもしくは生理食塩水などの水溶液に溶解することによって調製することができる。場合によって、製剤組成物は、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、メグルミン、ＴＲＩＳ、またはアミノ酸（例えば、リシン、ヒスチジン、またはアルギニン）などのｐＨ調整剤も、４と６の間のｐＨなど所望のｐＨをもたらすのに十分な量を含むことができる。実施例で使用されるアミノ酸は（Ｌ）−アミノ酸であったが、代わりに（Ｄ）−アミノ酸またはラセミ混合物を使用することもできた。溶液状態の化合物Ｘを含む医薬組成物は、典型的には４．５と５．５の間のｐＨ、またはしばしば４．８と５．２の間のｐＨなど約５のｐＨに調整される。

一部の実施形態において、化合物Ｘを、ｐＨ調整剤と共に水溶液中に製剤化し、次いで凍結乾燥して、貯蔵および流通のための固体形態を得る。投与するためには、水性担体、典型的には水または等張性デキストロースもしくは生理的食塩水などの無菌水性担体、あるいはリンゲル液、乳酸リンゲル液、もしくはハルトマン液などの他のＩＶ溶液を添加することによって、凍結乾燥医薬品を再構成することができる。したがって、本発明は、化合物Ｘおよび上記のものなどのｐＨ調整剤、例えば、（Ｌ）−アルギニン、（Ｌ）−リシン、メグルミン、ＴＲＩＳ、または水酸化ナトリウムを含む凍結乾燥物（凍結乾燥によって調製された固体）も提供する。場合によって、スクロースなどの他の賦形剤を含むことができる。一実施形態において、化合物Ｘおよびアルギニン（２当量）の溶液を調製し、必要に応じて、例えば水酸化ナトリウムまたは塩酸を使用して、ｐＨを４．８と５．２の間のｐＨに調整する。次いで、溶液を凍結乾燥して、白色またはやや黄色の固体を得る。その固体は、貯蔵に対して安定したものであり、静脈内投与に適した無菌水溶液で容易に再構成することができる。

別の実施形態において、注射に適した、水中の化合物Ｘ、スクロース、およびアルギニン（２当量）の溶液を調製し、必要に応じて、例えば水酸化ナトリウムまたは塩酸を使用して、ｐＨを４．８と５．２の間のｐＨに調整する。次いで、溶液を凍結乾燥して、白色またはやや黄色の固体を得る。その固体は、貯蔵に対して安定したものであり、静脈内投与に適した無菌水溶液で容易に再構成することができる。

本発明の塩および結晶形態は、単独でまたは１つもしくは複数の他の薬物と組み合わせて投与することができる。一般的に、それらは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に製剤として投与される。本明細書では、用語「賦形剤」は、機能的（すなわち、薬物放出速度を制御する）特性および／または非機能的（すなわち、加工助剤または希釈剤）特性を製剤に付与することができる、本発明の化合物（単数または複数）以外の任意の成分を記載するために使用される。賦形剤の選択は、特定の投与方法、溶解性および安定性に及ぼす賦形剤の効果、ならびに剤形の性質などの要因に大いに依存する。医薬組成物は担体も含むことができ、それは、活性成分（単数または複数）を希釈するために使用される実質的に不活性な物質であり、液体であることが多い。適切な担体は当技術分野において公知であり、例えば、滅菌水および生理食塩水またはデキストロースの滅菌溶液が挙げられる。

化合物Ｘの固体形態の送達に適した医薬組成物およびそれらの調製方法は、当業者に容易に明らかである。そのような組成物およびそれらの調製方法は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)でみることができる。

ヒト患者に投与する場合、塩または結晶形態の合計の１日用量は、対象者の状態ならびに対象者の体重、年齢、および性別などのパラメータに応じて、典型的には１０００ｍｇ〜１０，０００ｍｇの範囲、または２０００ｍｇと８０００ｍｇの間、または３０００ｍｇと８０００ｍｇの間、または４０００ｍｇと６０００ｍｇの間である。合計の１日用量を単回用量として投与することができ、または２つ以上の用量に分割することができ、医師の判断で、本明細書に記載の典型的な範囲を超えることがある。典型的には、１日投与量は、静脈内注射または輸注により送達され、１、２、３または４回投与され、累積的に所望の１日総投与量を与える。輸注は急速輸注とすることができ、または約１５分と４時間の間にわたって、通常は１〜３時間にわたって輸注することができる。典型的な投与計画では、輸注を１日３回または４回行い、各回の輸注は０．２５〜２時間または０．２５〜３時間続き、１回の投与当たり１〜２ｇまたは１〜２．５ｇの化合物Ｘを送達し、典型的な合計の１日用量は３〜８ｇである。例えば、投与計画により、１時間の輸注を１日３回行って、輸注１回当たり２ｇの化合物Ｘを送達することができる。あるいは、２〜６ｇまたは３〜５ｇを１または１．５または２または２．５または３時間かけて、単回輸注することもできる。上記の投与量は、体重が約６０ｋｇ〜７０ｋｇの平均的ヒト対象者に基づいており、他の対象者の場合、適宜増減することができる。医師は、乳児や高齢者など、体重がこの範囲外である対象者の用量を容易に決定することができる。

次に、本発明を、以下に示す非限定的な実施例によって説明する。実施例において、上記の図を示す。

［実施例］
一般実験の詳細
各試料（数ミリグラム）を３枚のポリマー箔（Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）および／またはポリプロピレン）の間に置く。Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）が２θ＝５．５°辺りで強度の弱いブロードなピークを示すことに留意する価値がある。

次いで、試料を、伝送モードで構成されたＰＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬＸ’ＰＥＲＴＰＲＯＭＰＤ回折計に配置し、以下に示した条件を用いて分析する。分析は、（別段の記載がない限り）２°と５０°の間で行われる。
放射線：ＣｕＫα
発生器設定：４０ｋＶおよび４０ｍＡ
ステップサイズ：０．０２６°
ステップ：１８２８
測定タイプ：反復走査（３／５／２０回）

本発明の化合物を合成するために利用された出発物質、構成要素、試薬、酸、塩基、脱水剤、溶媒、および触媒はすべて、市販のものであり、または当業者に公知の有機合成法で生成することができる（Houben-Weyl 4th Ed. 1952, METHODS OF ORGANIC SYNTHESIS, Thieme, Volume 21）。

一般条件
質量スペクトルは、ＬＣ−ＭＳ、ＳＦＣ−ＭＳ、またはＧＣ−ＭＳシステムを用いて、エレクトロスプレーイオン化、化学イオン化および電子衝撃イオン化法を利用して、以下の構成：ＺＱ２０００またはＳＱＤＭＳシステムを装備したＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣシステムの様々な装置から得られた。ここで（Ｍ＋１）は、化学種のプロトン化分子イオンを指し、（Ｍ＋）は、非プロトン化第四級アンモニウムカチオンを指し、（Ｍ＋Ｎａ）は、ナトリウムが組み込まれたイオンを指し、（Ｍ−１）は、化学種の脱プロトン化分子イオンを指す。

ＮＭＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥ５００ＭＨｚまたはＶａｒｉａｎ４００ＭＨｚＮＭＲ分光計を用いて、ＩＣＯＮ−ＮＭＲを利用して、ＴｏｐＳｐｉｎプログラムの制御下で実行した。スペクトルは、別段の指示がない限り、２９８Ｋで測定し、溶媒共鳴と比較して記載した。

計測装置
ＭＳ方法：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステムをＡｇｉｌｅｎｔ６１１０ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒと共に使用
方法２ｍ＿酸性：
カラムＫｉｎｅｔｅｘＣ１８５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ
カラム温度５０℃
溶離液Ａ：Ｈ₂Ｏ、Ｂ：アセトニトリル、両方とも０．１％のＴＦＡを含有。
流速１．２ｍＬ／分
勾配１．３０分で２％から８８％Ｂ、０．１５分９５％Ｂ
方法２ｍ＿酸性＿極性：
カラムＫｉｎｅｔｅｘＣ１８５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ
カラム温度５０℃
溶離液Ａ：Ｈ₂Ｏ、Ｂ：アセトニトリル、両方とも０．１％のＴＦＡを含有。
流速１．２ｍＬ／分
勾配１．３０分で１％から３０％Ｂ、０．１５分９８％Ｂ

化合物Ｘの調製
中間体Ａ：（（２Ｓ，３Ｓ）−３−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−１−（２，４−ジメトキシベンジル）−４−オキソアゼチジン−２−イル）メチルメタンスルホネート

ベンジル（（２Ｓ，３Ｓ）−１−（２，４−ジメトキシベンジル）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソアゼチジン−３−イル）カルバメート（５．３７ｇ、１３．４１ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（３．７２ｍＬ、２６．８ｍｍｏｌ）をＤＣＭに溶かした０℃の溶液に、メタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）（１．１５ｍＬ、１４．７５ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で１時間撹拌した後、水／ＤＣＭで希釈し、層を分離した。水性層をＤＣＭで（２回）抽出し、有機層を合わせて、塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、真空中で濃縮した。粗残留物をトルエンに吸収させ、濃縮して（２回）、オフホワイト色の固体の表題化合物が得られた。その化合物をそのまま後続の反応で使用した。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．８６分、ｍ／ｚ＝４７９．２（Ｍ＋１）、方法２ｍ＿酸性。

このステップの出発物質は、以下に示す手法またはこれらの手法に基づくステップの何らかの組合せを利用して製造することができる。第１の手法において、保護されたキラルアルデヒドと２，４−ジメトキシベンジルアミンを縮合させて、キラルイミンを合成する。

キラルアルデヒドは公知であり、クエン酸から製造することができる。

キラルイミンは、これらのようなグリシンの保護された形態と反応することができる。

第２の選択肢に必要な混合無水物は、ジクロロメタン中におけるＣＢＺ保護グリシンおよびクロロギ酸イソプロピルから調製することができる。（ＤＭＢは、２，４−ジメトキシベンジル基を指す）。次いで、この保護された中間体のジオキソランを穏やかな酸性条件下で加水分解し、酸化して、アルデヒドを得る。そのアルデヒドは、例えば水素化ホウ素ナトリウムで容易に還元されて、以下に示す２カ所保護された第一級アルコールを与えることができる。

この中間体の第一級アルコールを、例えばヨウ素およびトリフェニルホスフィンで処理して、第一級ヨウ化物を生成することによって、または塩基およびスルホニルクロリドで処理して、例えばメシレートもしくはトシレートを生成することによって、脱離基に変換することができる。この活性化された中間体は、以下のステップ１に示されているようにヒドロキシエチルアミンと容易に反応する。

中間体Ｂ：３−（（（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−オキソアゼチジン−２−イル）メチル）オキサゾリジン−２−オン

ステップ１：ベンジル（（２Ｒ，３Ｓ）−１−（２，４−ジメトキシベンジル）−２−（（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）−４−オキソアゼチジン−３−イル）カルバメート。（（２Ｓ，３Ｓ）−３−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−１−（２，４−ジメトキシベンジル）−４−オキソアゼチジン−２−イル）メチルメタンスルホネート（６．４３ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４４．８ｍｌ）中の溶液に、エタノールアミン（８．１３ｍｌ、１３４ｍｍｏｌ）と、その後に続いてＤＩＥＡ（７．０ｍｌ、４０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を８０℃に２０時間加熱し、それから室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、真空中で濃縮して、白色固体の表題化合物（４．４７ｇ、７５％）を得た。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．６０分、ｍ／ｚ＝４４４．２（Ｍ＋１）。

ステップ２：ベンジル（（３Ｓ，４Ｒ）−１−（２，４−ジメトキシベンジル）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−３−イル）カルバメート。ベンジル（（２Ｒ，３Ｓ）−１−（２，４−ジメトキシベンジル）−２−（（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）−４−オキソアゼチジン−３−イル）カルバメート（４．４７ｇ、１０．０８ｍｍｏｌ）のクロロホルム（５０ｍｌ）中の溶液に、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（４．９０ｇ、３０．２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ−ＤＣＭ、０〜５％）によって精製し、白色発泡体の表題化合物（３．８４ｇ、８１％）を得た。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．７６分、ｍ／ｚ＝４７０．１（Ｍ＋１）．

ステップ３：ベンジル（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−３−イル）カルバメート。Mastalerz et al. J. Med. Chem. 1988, 31, 1190における調製と同様にして、ＡＣＮ：水（２：１、１３６ｍＬ）中のベンジル（（３Ｓ，４Ｒ）−１−（２，４−ジメトキシベンジル）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−３−イル）カルバメート（３．８４ｇ、８．１８ｍｍｏｌ）、Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₈（３．１０ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＨＰＯ₄（１．８５２ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を使用し、９０℃で４０分間加熱して調製した。さらに、Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₈（６６３ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＨＰＯ₄（３７０ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をもう３時間加熱した。さらに、Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₈（３３２ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＨＰＯ₄（１８５ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２時間加熱し、それから真空中で濃縮し、ＡＣＮの大部分を除去した。混合物を塩水／ＥｔＯＡｃで希釈し、層を分離した。水性層をＥｔＯＡｃで（３回）抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ−ヘプタン、０〜１００％、次いでＭｅＯＨ−ＤＣＭ、１０％）によって精製して、ベージュ色発泡体の表題化合物（１．６１ｇ、６２％）を得た。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．５１分、ｍ／ｚ＝３２０．０（Ｍ＋１）、方法２ｍ＿酸性。

ステップ４：３−（（（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−オキソアゼチジン−２−イル）メチル）オキサゾリジン−２−オン。Malmstrom et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 5293に従って、ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ（４：１、１．５ｍＬ）中のベンジル（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−３−イル）カルバメート（９６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ１０％Ｄｅｇｕｓｓａ型１０１（１０％、６４ｍｇ）および水素を１時間使用して調製した。粗残留物をそのまま以下に示すステップで使用した。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．１１分、ｍ／ｚ＝１８６．０（Ｍ＋１）、方法２ｍ＿酸性。

化合物Ｘ：１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸。
ステップ１：ベンズヒドリル１−（（（Ｚ）−（１−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）チアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボキシレート。米国特許出願公開第２０１１／０１９０２５４号明細書に従って調製された（Ｚ）−２−（（１−（（ベンズヒドリルオキシ）カルボニル）シクロプロポキシ）イミノ）−２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）チアゾール−４−イル）酢酸（８５４ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）、中間体Ｂ（３２４ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（７８５ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（７．９ｍＬ）中の溶液に、ＤＩＰＥＡ（８３２μＬ、４．７７ｍｍｏｌ）を添加した。１時間撹拌した後、その混合物を水に注ぎ込み、ＥｔＯＡｃで抽出した。塩水を水性層に添加し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）でさらに（３回）抽出した。有機層を合わせて、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、真空中で濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜１０％ＭｅＯＨ−ＤＣＭ）によって精製して、ベージュ色発泡体の表題化合物（１．０９ｇ、９７％）を得た。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．９７分、ｍ／ｚ＝７０５．３（Ｍ＋１）、方法２ｍ＿酸性。

ＨＡＴＵの代わりに、典型的なカルボジイミドのいずれか、またはＣＤＭＴ（２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）およびＮ−メチルモルホリンなど他の様々なカップリング試薬を使用して、ステップ１で生じるアミド結合を形成することができる。

ステップ２：（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（Ｚ）−２−（（１−（（ベンズヒドリルオキシ）カルボニル）シクロプロポキシ）イミノ）−２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）チアゾール−４−イル）アセトアミド）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−１−スルホン酸。０℃におけるＤＭＦ（７．０ｍＬ）中のベンズヒドリル１−（（（Ｚ）−（１−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）チアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボキシレート（１．００ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）をＳＯ₃・ＤＭＦ（４４８ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ）で処理した。室温で２時間撹拌した後、溶液を氷冷塩水に注ぎ込み、ＥｔＯＡｃで（３回）抽出した。有機層を合わせて、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、真空中で濃縮し、白色固体の表題化合物（推定定量的収率）を得た。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．９０分、ｍ／ｚ＝７８５．２（Ｍ＋１）、方法２ｍ＿酸性。

ステップ３：１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸。

０℃における（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（Ｚ）−２−（（１−（（ベンズヒドリルオキシ）カルボニル）シクロプロポキシ）イミノ）−２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）チアゾール−４−イル）アセトアミド）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）アゼチジン−１−スルホン酸（１．１０ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．５ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（５．３９ｍＬ、７０．０ｍｍｏｌ）を添加し、１０分後、氷浴を取り外した。室温で１時間経過した後、さらにＴＦＡ（３．２４ｍＬ、４２．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液をＤＣＭで希釈し、さらに３０分経過した後、真空中で濃縮した。場合によって、アニソールをＴＦＡ反応物に添加して、副生物の形成を低減する助けとなることができ、このステップにおける所望の生成物の収率を上げることができる。粗残留物を逆相分取ＨＰＬＣ（ＸＳｅｌｅｃｔＣＳＨ、３０×１００ｍｍ、５μｍ、Ｃ１８カラム；０．１％ギ酸改質剤を含む、ＡＣＮ−水、６０ｍＬ／分）によって精製し、白色粉末の表題化合物（１７８ｍｇ、２３％）を得た。ＬＣＭＳ：Ｒ_t＝０．３０分、ｍ／ｚ＝５１８．９（Ｍ＋１）、方法２ｍ＿酸性；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.27 (d, J = 9.0 Hz, 1H) 6.92 (s, 1H) 5.23 (dd, J = 9.1, 5.7 Hz, 1H) 4.12-4.23 (m, 3H) 3.72-3.62 (m, 2H 推定; 水により不明確) 3.61-3.52 (m, 1H推定; 水により不明確) 3.26 (dd, J = 14.5, 5.9 Hz, 1H) 1.36 (s, 4H). ¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ7.23 (s, 1H), 5.48 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.71-4.65 (m, 1H), 4.44 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 3.89-3.73 (m, 3H), 3.54 (dd, J = 14.9, 4.9 Hz, 1H), 1.65-1.56 (m, 2H), 1.56-1.46 (m, 2H).本方法の生成物は非晶質である。化合物Ｘは、以下に述べる溶媒に加えて、アセトン、エタノール、クエン酸緩衝液（ｐＨ３）（５０ｍＭ）、または酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（５０ｍＭ）から結晶化することができる。

計測装置
ＤＳＣ：ＰｙｒｉｓＤｉａｍｏｎｄＤＳＣ、窒素ガス（２０ｍＬ／分）
ＴＧＡ：Ｐｙｒｉｓ１ＴＧＡ、窒素ガス（２０ｍＬ／分）、１０℃／分で走査
ＸＲＰＤ：Ｘ’ＰｅｒｔＰｒｏＭＰＤＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｃｕアノード、電流４０ｍＡで４０ｋＶ
管アノード：（Ｃｕ）
発生器電圧：４０ｋＶ
管電流：４０ｍＡ
開始角［２θ］：３
終了角［２θ］：４０
走査時間２分

フォーム１およびフォーム２
化合物Ｘを上記のように調製し、溶媒から結晶化して、図１または図２の粉末Ｘ線回折パターン（ＸＲＰＤ）を有する物質を得た。これらは、結晶質物質の別々の２バッチを表し、本明細書ではフォーム１およびフォーム２と呼ばれる。フォーム１および２は、同様のいくつかのＸＲＰＤピークを有し、フォーム２のＸＲＰＤは幅の広がったラインを示し、したがって、フォーム２であると同定された生成物はいくらかのフォーム１物質を含有することがあり、または両試料は結晶形態の混合物でありうる。これらの２つのフォームは、水をＫａｒｌＦｉｓｈｅｒ分析によれば約１重量％未満しか含有せず、実質的に無水であった。

フォーム１の化合物Ｘ（１．２ｇ）を１２ｍＬのアセトンに懸濁し、２０℃で３日間撹拌した。試料は発展するようにみえない。いくらかのラインの幅広化が起こったが、生成物のＸＲＰＤ（図３）は、やはりフォーム１と概して一致していると思われる。

図１のＸＲＰＤをもたらす試料は、約２０５℃でのＤＳＣにおいて強い発熱線を示し、ＴＧＡによる質量の徐々の損失は、１８０℃によって約２％の損失になった。

図２のＸＲＰＤをもたらした試料（フォーム２）は約２０３℃でのＤＳＣにおいて強い発熱線を示し、フォーム１と比較して、１６０℃による質量損失（３．７％）が若干高かった。

フォーム１は、これらのピークのサブセット、例えば６．６、１３．４および１８．８におけるピークによって特徴付けることもできる。

フォーム２は、これらのピークのサブセット、例えば７．５、１９．３および２０．０におけるピークによって特徴付けることもできる。

フォーム３
フォーム１の化合物Ｘをメタノールに懸濁し、数分以内に、粘着性の固体生成物に発展した。生成物は、図４に示されるＸＲＰＤパターンを示し、本明細書ではフォーム３と呼ばれる。下記のように、より大きな規模においてメタノール中でより長く撹拌した後、異なる形態（フォーム８）が得られたことから、フォーム３は、これらの条件下でフォーム１が発展するにつれて形成される過渡的な形態または混合物でありうることに留意されたい。

フォーム３は、これらのピークのサブセット、例えば７．３、１８．９および２１．２におけるピークによって特徴付けることもできる。

フォーム４
フォーム１の化合物Ｘ（１．２ｇ）を水（１２ｍＬ）に懸濁し、２０℃で３日間撹拌した。生成物は、図５に示されるＸＲＰＤパターンを示し、本明細書ではフォーム４と呼ばれる。ＸＲＰＤは、ろ紙で乾燥させた試料に由来する。フォーム４のＴＧＡ分析から、約４０℃において重量の損失が徐々に始まり、約１００℃において急速になり、１２０〜１７０℃において元の重量の約６０％でプラトーに達することが明らかである。その温度を超えると、重量の徐々な損失がみられる。質量の早期損失は、フォーム４からの水の損失と一致し、また同じ温度範囲において強い吸熱線、および約１１０〜１８０℃においてプラトーを示すＤＳＣと一致する。同様に、フォーム４の動的水蒸気収着（ＤＶＳ）分析は、相対湿度が約５０％まで下がるにつれて試料質量の約２０％が急速に損失し、その後、相対湿度の降下、次いで上昇、次いで降下、次いで上昇というサイクルによって、相応して試料質量の低下、増加、低下、増加が起こり、元の質量の約６５％で最低であり、元の質量の約８０％で最大であったことを示す。したがって、フォーム４は水和物の形態であり、ＲＨに応じて発展する。試料の水和の程度は、相対湿度で異なり、非常に低い湿度における無水の形態から、約２０〜５０％のＲＨにおける３水和物、６０％を超えるＲＨにおける６水和物まである。相対湿度（ＲＨ）０％で乾燥させたフォーム４の試料は、フォーム１と一致するＸＲＰＤを示す。

フォーム４は、これらのピークのサブセット、例えば７．０、８．６、１９．３および２０．９におけるピークによって特徴付けることもできる。

フォーム５
フォーム４の試料を乾燥気流下で１日乾燥し、図６Ａに示されるＸＲＰＤを示す粉末を得た。この物質は、本明細書ではフォーム５と呼ばれる。フォーム５のＤＳＣは、約２０４℃においてシャープな発熱線を示し、試料は、この温度辺りで黒変が始まり、これは分解を示唆する。ＴＧＡは、４５℃と１６０℃の間で約７％の質量損失を示す。ＫａｒｌＦｉｓｈｅｒ分析は、フォーム５の含水率が９．６％であり、３水和物に相当することを示すが、試料は、約３０％未満のＲＨにおいて質量を損失するようにみえ、８０％を超えるＲＨにおいて、１日以内にフォーム４に変換する。

したがって、化合物Ｘのフォーム１、４および５は、相対湿度が変化するにつれて相互変換するようにみえ、これらの水和物の形態の混合物でありうる。フォーム５は、製造時における約２５℃の周囲温度での取扱いに対して好ましい形態である。というのは、約２０〜５０％ＲＨ、好ましくは３０〜４０％ＲＨの適切な相対湿度が維持されているという条件で、貯蔵および取扱い時において他の形態よりも安定な挙動の良好な固体として結晶化するからである。これらのＲＨ範囲内で、物質は主に３水和物であり、取扱いおよび貯蔵に対して、特別に注意することなく、挙動が良好で、安定であることが好適である。

フォーム５の調製規模の拡大
水（２０ｍＬ）およびＴＨＦ（４０ｍＬ）をフラスコ中で混合し、２５℃で撹拌しながら、化合物Ｘ（１０ｇ、ＨＰＬＣによる純度約９１％）を添加すると、黄色透明溶液が得られた。２０ｍｇのフォーム５試料（上記を参照のこと）を種として添加し、混合物を５０分間撹拌した。次いで、ＴＨＦ（１４０ｍＬ）を１時間かけてゆっくり添加し、混合物をもう２時間撹拌した。懸濁液をろ過し、湿ケーキを冷たい（＜５℃の）水で洗浄し、次いで２０〜２５℃、圧力１００ｍｂａｒで１１時間乾燥すると、フォーム５の３水和物が６．６ｇ得られ、そのＨＰＬＣによる純度は９７．８％であった。試料は、図６Ｂに示されるＸＲＰＤパターンを示した。それは、２５〜５０％の相対湿度、好ましくは３０〜４０％ＲＨで貯蔵されるとき、安定と思われる。相対湿度がそれより低いか、または高いと、本明細書に記載されている様々な水和状態に発展する可能性がある。過乾燥によって、室温で数時間以内に分解する形態が生成される。これは、水和物の形態の安定性が有利であることをさらに示している。

フォーム５は、これらのピークのサブセット、例えば７．３、９．３、および２７．８におけるピークと、場合によって、７．３、９．３、１９．９および２７．８におけるピークによって特徴付けることもできる。

あるいは、フォーム５（３水和物）は、単斜晶系で空間群Ｐ２（１）であり、ａ＝１３．１２１（４）Å；ｂ＝７．４００（３）Å；ｃ＝２５．０１７（８）Å（α＝９０°；β＝９６．０３７°；γ＝９０°）の単位格子寸法；および２４１５．６（１４）Å³の単位格子体積を有する単結晶Ｘ線構造によって特徴付けることができる。この構造のデータは、波長１．５４１７８Å、１００°Ｋ；θ範囲３．９９°〜６８．４４°；収集反射数４７８２２で収集した。単結晶構造によって、単位格子中に化合物Ｘの１分子当たり水３分子が存在し、水分子はチャネルに位置していることが確認される。

フォーム６
フォーム１の化合物Ｘ（１．２ｇ）をＤＭＳＯ：水（比２５：７５（ｖ／ｖ）、１２ｍＬ）に懸濁し、２０℃で３日間撹拌した。固体の試料を回収し、ろ紙で乾燥した。生成物は、図７に示されるＸＲＰＤパターンを示し、本明細書ではフォーム６と呼ばれる。ＤＳＣおよびＴＧＡは、約１３０℃まで、さらに１５０℃と２００℃の間における溶媒損失、続いて２００℃超における分解と一致している。

フォーム６は、これらのピークのサブセット、例えば８．１、９．２、および１２．８におけるピークと、場合によって、２１．２および２４．７における追加のピークによって特徴付けることもできる。

フォーム７
上記のように製造されたフォーム６の化合物Ｘを乾燥気流下で１日乾燥した。得られた粉末は、図８に示されるＸＲＰＤパターンを示し、本明細書ではフォーム７と呼ばれる。ＤＳＣは、約１３４℃に始まり、約１７０℃まで続く大きな発熱線を示す。¹ＨＮＭＲは、存在しているＤＭＳＯが約２当量であり、水が若干（３．６％）であることを示している。ＫａｒｌＦｉｓｈｅｒ滴定によって、１当量に相当する３．６％の水が存在していることが確認される。したがって、この形態は溶媒和物である。

フォーム７は、これらのピークのサブセット、例えば６．７、７．３および２０．３におけるピークによって特徴付けることもできる。

フォーム８
フォーム１の化合物Ｘ（１．２ｇ）をメタノール（１２ｍＬ）に懸濁し、２０℃で３日間撹拌した。固体の試料は回収され、（乾燥することなく）図９に示されるＸＲＰＤパターンを示した。それを本明細書ではフォーム８と呼ぶ。フォーム８の試料を乾燥気流下で乾燥すると、実質的ではあるが概して幅広化したピークが、同じ位置付近で現れる。乾燥させた試料のＴＧＡは、１４０℃までの質量の徐々な損失（約４％）、および約１７０℃で始まる質量のより急な損失を示す。ＤＳＣは、約１７２℃において、試料の分解を伴う可能性がある強い発熱線を示す。

フォーム８は、これらのピークのサブセット、例えば６．２、２１．８および２５．９におけるピークによって特徴付けることもできる。

フォーム９
フォーム３の化合物Ｘを、アセトンおよび水に２５℃〜４０℃で懸濁した。水とアセトンの比は、２：９８から１０：９０まで様々であった。２４時間平衡化した後、いずれの場合にも低結晶化度のヘテロ溶媒和の形態が得られた。ＸＲＰＤは水のアセトンに対する割合で異なったが、試料はすべて、シャープなピークではなくブロードな隆起のあるＸＲＰＤスペクトルを示した。図１０は、１０：９０の水／アセトン中、４０℃で２４時間平衡化した試料のＸＲＰＤを示し、この試料のＸＲＰＤデータを以下の表にまとめる。この固体形態は、本明細書ではフォーム９と呼ばれる。

フォーム９は、これらのピークのサブセット、例えば、上記の表中で「強い」相対強度であると同定されたピーク、例えば６．３および１２．６におけるピークと、場合によって、２２．１、２２．３、２３．１、２７．０および２７．５におけるピークなど、表中で中程度の相対強度を示すピークの１つまたは複数によって特徴付けることができる。

フォーム１０
フォーム１の化合物Ｘ（無水物）を４３％の相対湿度に１日以上曝露した。結晶質の生成物は、含水率の決定に基づいてセスキ水和物（化合物Ｘ・１．５Ｈ₂Ｏ）であるようである。３水和物であるフォーム５は、同様の条件下であれば安定であるが、無水物から始めると、これらの条件下でセスキ水和物として平衡化するようにみえ、同じ相対湿度で維持されると少なくとも１４日間その形態のままであることに留意されたい。この結晶形態は、図１１に示されるＸＲＰＤスペクトルを示し、本明細書ではフォーム１０と呼ばれる。この試料のＸＲＰＤにおける主ピークを以下の表にまとめる。

フォーム１０は、上記の表中で中程度〜強い相対強度を有するＸＲＰＤピーク、例えば６．６、１１．０、１３．３、１５．６、１６．５、１８．６、２２．２、２３．４および２７．４におけるピークによって特徴付けることができる。またフォーム１０は、これらのピークのサブセット、例えば４０以上の相対強度を有するピーク、例えば６．６、１１．０、１６．５、２２．２、および２３．４におけるピーク、またはこれらのピークの少なくとも３つもしくは４つのサブセットによって特徴付けることもできる。

フォーム１１
３水和物であるフォーム５の化合物Ｘを、２２％の相対湿度に約３日間曝露して、含水率分析に基づいて２水和物（化合物Ｘ・２Ｈ₂Ｏ）と特徴付けられた結晶質固体を得た。この物質は、約４０％を超える相対湿度に曝露された場合、３水和物（フォーム５）に容易に戻る。本明細書ではフォーム１１と呼ばれる２水和物は、図１２に示されるＸＲＰＤスペクトルを示した。そのＸＲＰＤスペクトルにおける主ピークを以下の表に列挙する。

フォーム１１は、この表中で２０以上の相対強度を有するＸＲＰＤピーク、あるいは少なくとも２５の相対強度を有するそれらのピーク、例えば７．４、９．７、１７．０、１９．５、２２．２、２６．３、２８．１、および２９．３におけるピーク、または表中で少なくとも２６もしくは少なくとも２８の相対強度を有するこれらのピークの３つ、４つもしくは５つのサブセットによって特徴付けられる。

フォーム１２
フォーム５の化合物Ｘを、相対湿度６５％の空気に約３日間曝露して、含水率分析に基づいて４水和物と特徴付けられた結晶質物質を得た。この物質は、相対湿度を約４０％に下げた場合、３水和物（フォーム５）に容易に戻る。本明細書ではフォーム１２と呼ばれる４水和物は、図１３に示されるＸＲＰＤスペクトルを示した。そのＸＲＰＤスペクトルにおける主ピークを以下の表に列挙する。

フォーム１２は、上記の表中で少なくとも４０の相対強度を有するＸＲＰＤピーク、すなわち７．３、１７．８、１９．０、１９．８、２０．４、２４．０、２４．７、２４．９、２７．２、２７．８および３２．１におけるＸＲＰＤピークによって特徴付けることができる。あるいは、フォーム１２は、これらのピークの少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つのサブセットによって特徴付けることができる。フォーム１２は、表中で強い相対強度と記載されたＸＲＰＤピーク、すなわち７．３、１９．０、２０．４、２４．０、２４．７、および２７．２におけるピークによって特徴付けることもできる。

フォーム５、１１および１２を含めて、化合物Ｘの水和物の試料は、相対湿度が約２２％から約９２％までであるとき容易に相互変換することが示された。相対湿度９２％において、化合物Ｘは、６水和物がフォーム１２の４水和物と混合されていると特徴付けられる結晶形態の混合物であるようであることに留意されたい。比較すると、無水物（フォーム１）は優先的に、相対湿度が４３％に上がるにつれてセスキ水和物に変換し、より高い相対湿度で３水和物および４水和物に発展する。

化合物Ｘの医薬組成物
化合物Ｘ（５００ｍｇ）およびＬ−アルギニン（３３２．５ｍｇ）をバイアル中で混合する。サッカロース（結晶質、パイロジェンフリーのスクロース：１０００ｍｇ）を、注射に適した水（８．００ｍＬ）と共に添加する。必要であれば、１．０ＮＨＣｌまたは１．０ＮＮａＯＨを使用して、溶液のｐＨを、５．０±０．５のｐＨ、好ましくは５．０±０．２のｐＨに達するように調整する。これによって、約６２．５ｍｇ／ｍＬの化合物Ｘをアルギニン塩として含有する溶液が得られる。この溶液を、必要であればろ過することができ、凍結乾燥して、白色またはオフホワイト色の固体（凍結乾燥物）を得ることができる。凍結乾燥させた固体を、滅菌水、または等張性生理食塩水もしくはデキストロースなどの薬学的に許容される水性担体で再構成して、静脈内投与に適した溶液を得ることができる。凍結乾燥物は、光劣化から凍結乾燥物を保護するために光を排除する容器に貯蔵すべきである。この方法をスケールアップまたはダウンして、貯蔵および流通のための単位投与量、または所望通りにさらに加工することができるバルク物質を得ることができる。スケールアップの場合、温度制御が重要である。溶液状態の化合物Ｘは、塩基の非存在下または４〜６のｐＨ範囲を超えて水中で加水分解を受けるので、アルギニンまたは他の塩基を添加する前に１０℃未満、好ましくは０℃と８℃の間、より好ましくは２℃と８℃の間の温度で維持されるべきである。

一実施形態において、上記の例による混合物は、無水の化合物Ｘを約５００ｍｇ含有する量の化合物Ｘの３水和物（フォーム５）を使用して、記載のように調製され、バイアル中で凍結乾燥され、次いで貯蔵および流通のために、好ましくはブチルゴム栓（例えば、Ｄ７７７栓）を用いて密封される。ここで、各バイアル中の凍結乾燥物は約５００ｍｇの化合物Ｘを含有する。凍結乾燥物のバイアルは、使用するまで室温以下で貯蔵される。

ＩＶ注射に適した代替の製剤は、化合物Ｘ（１００ｍｇ）および０．５Ｎ炭酸水素ナトリウム（０．７５ｍＬ）、必要であれば、ｐＨを約５．５（ｐＨ５とｐＨ６の間）にするためのｐＨ調整剤（必要に応じて、１ＮＮａＯＨまたは１ＮＨＣｌ）に加えて、最終濃度１００ｍｇ／ｍｌを達成するのに十分な量の注射用水も含有する。

化合物Ｘの安定性
化合物Ｘは固体形態で安定であるが、化合物Ｘの塩は溶液状態で遊離酸より安定である。したがって、投与に使用するのに適した薬学的に許容される塩を同定することが重要になった。塩基（１．０または２．０当量）を水中の化合物Ｘに添加し、溶液を凍結乾燥することによって、化合物Ｘの塩を調製した。こうして得られた固体は、ＸＲＰＤにより非晶質であるようである。このように、水酸化ナトリウム、（Ｌ）−リシン、（Ｌ）−アルギニン、水酸化カルシウム、メグルミン、および水酸化マグネシウムを用いて、化合物Ｘの塩の形成を試みた。ナトリウム塩およびアルギニン塩は特に安定であり、したがって典型的には静脈内注射および輸注に使用される水性媒体中の投与形態として望ましいことがわかった。

固体としてのジナトリウム塩およびジ−（Ｌ）−アルギニン塩の試料を、２５℃および４０℃における安定性試験にかけた。ナトリウム塩の試料は、最初にＨＰＬＣによる純度９７．２％であり、２５℃で６週間後、やはり純度９６．２％であった。４０℃で保持した同じ物質は、３週間後に純度９４．８％であり、６週間後に純度９３．６％であった。研究時に出現または増加する顕著な不純物は、相対保持時間（ＲＲＴ）０．３４および１．１１において現れる（化合物ＸはＲＲＴ＝１と定義される）。

アルギニン塩は、最初にＨＰＬＣによる純度９７．３％であり、２５℃で６週間後、純度９６．３％であった。４０℃では、その純度は、３週間後に９５．１％まで下がり、６週間後に９４．２％まで下がった。この研究時に出現または増加する顕著な不純物は、相対保持時間（ＲＲＴ）１．０９、１．１１および１．１３において出現する（化合物ＸはＲＲＴ＝１と定義される）。それぞれ２５℃および４０℃で６週間経過した後のこれらの安定性研究による試料のＨＰＬＣトレースを図１０および図１１に示す。各図における下方トレースは、定量下限（ＬＯＱ）を測定するために使用される試料である。その上の次のトレースは塩形成に使用される化合物Ｘの試料を表す。その上の次のトレースは６週間後のアルギニン塩のための試料であり、次の（最上）トレースは６週間後のナトリウム塩のためのものである。

安定性研究（図１０および図１１）のＨＰＬＣ条件
２６０ｎｍにおけるＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２９０システム
ＡｃｑｕｉｔｙＨＳＳＴ３カラム、１００ｍｍ×２．１ｍｍＩＤ；粒径１．８μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社から供給）
カラム温度：４０℃
移動相
Ａ：水中０．０５％ＴＦＡ
Ｂ：メタノール中０．０５％ＴＦＡ
流速：０．４５ｍＬ／分
勾配（Ａ／Ｂ比）：８分間９７：３；３分間７５：２５；１分間０：１００

化合物Ｘは、光化学的に分解することもわかった。したがって、化合物Ｘは、最良の貯蔵寿命のために暗色または不透明容器に貯蔵されるべきである。本発明の一実施形態において、化合物Ｘは、露光を実質的に低減する容器に、好ましくは湿度２５〜５０％の相対湿度、より好ましくは３０〜４０％または３０〜４５％の相対湿度の雰囲気中で包装されている。

生物活性
細菌スクリーンおよび培養
−７０℃の凍結ストックから、３５℃、周囲空気中、５％血液寒天（Remel, Lenexa, Kans.）上での２夜連続の継代によって、細菌分離株を培養した。品質対照の緑膿菌（P. aeruginosa）（ATCC 27853）は米国菌培養収集所（American Type Culture Collection）（ATCC; Rockville, Md.）から入手し、ＰＡＯ１はＤｒ．Ｋ．Ｐｏｏｌｅから受領した。

大腸菌（Escherichia coli）同質遺伝子系統である系統ＮＢ２７２７３−ＣＤＹ００２６（親）、ＮＢ２７２７３−ＣＤＹ００３３（ＫＰＣ２）およびＮＢ２７２７３−ＣＤＹ００３０（ＳＨＶ１２）の構築
系統ＮＢ２７２７３（ＢＷ２５１１３ｐｓｐＢ：：Ｋｍ^r）は、Ｋｅｉｏトランスポゾン挿入コレクションから得た。系統は、カナマイシン耐性マーカーに置換されたｐｓｐＢ遺伝子を有する（ＢＷ２５１１３ｐｓｐＢ：：Ｋｍ^r）。この系統は、公開された方法を用いて、ＦＬＰレコンビナーゼによってｐｓｐＢにおけるトランスポゾンをキュアした。得られた系統ＢＷ２５１１３ｐｓｐＢを、重要なβ−ラクタマーゼを発現する多コピー型ベクターの宿主として使用した。β−ラクタマーゼの構成的発現を指示する多コピー型プラスミドは、以下の通り樹立された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＰＣ２およびＳＨＶ１２−ラクタマーゼをコードする合成コドン最適化遺伝子は、ＤＮＡ２．０（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）によって作製された。合成フラグメントのそれぞれは、それらの終端にＮｏｔＩおよびＮｃｏＩ制限部位を含むように設計され、ＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ消化ｐＥＴ２８ａ（＋）誘導体の中に連結され、タンパク質発現が可能になった。これらのベクターにおけるインサートは、プライマー対Ｅ２２５（ｔｃｇｃＣＴＣＧＡＧｇｃｇａｃｔｇｃｇｃｔｇａｃｇａａｔｔｔｇｇ）（配列番号１）およびＥ２０２（ａａｔｃＧＡＡＴＴＣｔｔａｃｔｇａｃｃａｔｔａａｃｇｃｃｃａａｇｃ）（配列番号２）およびＥ２２７（ｔｃｇｃＣＴＣＧＡＧｇｃｇａｇｃｃｃｇｃａａｃｃｇｃｔｇｇａ）（配列番号３）およびＥ２０４（ａａｔｃＧＡＡＴＴＣｔｔａａｃｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｃｔｃａａｔｃ）（配列番号４）をそれぞれ使用して、ＫＰＣ２およびＳＨＶ１２をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型ＤＮＡとして働く。コドン最適化ヌクレオチド配列および関連するプライマー認識情報を以下に示す。

ＳＨＶ１２

ＫＰＣ２

次いで、ＰＣＲ生成物をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同様に消化させたプラスミドｐＡＨ６３−ｐｓｔＳ（ＢｌａＰ）の中に連結させた。プラスミドｐＡＨ６３−ｐｓｔＳ（ＢｌａＰ）は、ＴＥＭ−１（ｂｌａ）プロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域をプラスミドｐＢＡＤ（J Bacteriol. 1995 Jul. 177(14):4121-30）からプラスミドｐＡＨ６３にクローニングすることによって作製されたプラスミドｐＡＨ６３の誘導体（J Bacteriol:183(21): 6384-6393）である。このフラグメントを、プライマー対Ｅ１９２（ｔｔｃａＣＴＧＣＡＧｔｇａａｃｇｔｔｇｃｇａａｇｃａａｃｇｇＣ）（配列番号１３）およびＥ１９４（ＴＣＧＡｇｇａｔｃｃｔｃｇａｇａｇｃａａａａａｃａｇｇａａｇｇｃａａａａｔｇｃｃｇ）（配列番号１４）を使用して、ｐＢＡＤからＰＣＲ増幅させ、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化させ、同様に消化させたプラスミドｐＡＨ６３に挿入した。したがって、ｐＡＨ６３−ｐｓｔＳ（ＢｌａＰ）ベースのコンストラクトからのβ−ラクタマーゼの発現は構成的発現であり、シグナル配列は、これらのタンパク質をペリプラズムに向けるようにもたらされる。プラスミドｐＡＨ６３ベースのベクターは、単一コピーでゲノムへの挿入のために使用されるが、より高い発現レベルをもたらして、β−ラクタマーゼに対する化合物の感受性をより感受性高く検出することができ、これらのベクターに含まれている発現インサートを複製的な多コピー型ベクターｐＢＡＤ−Ｋａｎに移動させた（J Bacteriol. 1995 Jul. 177(14):4121-30）。これを実施するには、β−ラクタマーゼ遺伝子を関連ＴＥＭプロモーターおよびシグナル配列で包囲するインサートを、ＫＰＣ２コンストラクトにはプライマーＥ２６９（ｃｃｇＴＣＴＡＧＡｃｇｇａｔｇｇｃｃｔｔｔｔｔｇｃｇｔｔｔｃ）（配列番号１５）およびＥ２０２（ａａｔｃＧＡＡＴＴＣｔｔａｃｔｇａｃｃａｔｔａａｃｇｃｃｃａａｇｃ）（配列番号１６）、ならびにＳＨＶ１２コンストラクトにはプライマーＥ２０４（ａａｔｃＧＡＡＴＴＣｔｔａａｃｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｃｔｃａａｔｃ）（配列番号１７）を使用して、それらの対応するベクターからＰＣＲ増幅させた。次いで、これらのフラグメントをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、それぞれを、同じ酵素で消化させて、それぞれＫＰＣ２およびＳＨＶ１２を発現する一対の多コピー型ベクターを生成したｐＢＡＤ１８−ｋａｎに挿入した。これらのベクターをＢＷ２５１１３ｐｓｐＢに転換して、系統ＮＢ２７２７３−ＣＤＹ００３３（ＫＰＣ２を発現）およびＮＢ２７２７３−ＣＤＹ００３０（ＳＨＶ１２を発現）を生成した。ｐＢＡＤ１８−ｋａｎベクターはＴＥＭプロモーター領域およびシグナル配列も含み、（無傷β−ラクタマーゼ遺伝子に欠けるが）、対照系統ＮＢ２７２７３−ＣＤＹ００２６を生成するための標準プロトコールを用いて、ＢＷ２５１１３ｐｓｐＢに転換した。β−ラクタマーゼの発現は、ＫＰＣ２またはＳＨＶ１２の公知の基質である例示的試験抗生物質に対する感受性の低下を検証することによって確認された。

感受性試験
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ガイドラインに従って微量液体希釈法で決定した。要するに、新鮮な終夜細菌培養物を無菌生理食塩水に懸濁し、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度標準に調整した。次いで、細菌懸濁液をカチオン調整ミュラー・ヒントンブロス（ＭＨＢＩＩ；ＢＢＬ）中で希釈して、約５×１０⁵コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの最終接種物を得た。抗生物質のマスタープレートを、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、所望の最高最終濃度の１００倍に等しい濃度で調製した。次いで、マルチチャネルピペットを使用して、２倍段階希釈法で抗生物質マスタープレートを希釈した。化合物の得られた希釈系列を滅菌水で１：１０に希釈し、最終濃度１０％ＤＭＳＯを導いた。薬物の希釈系列の１０μＬの量を９６ウェルアッセイプレートに移した。アッセイプレートに９０μＬの細菌懸濁液を播種し、３５〜３７℃で２０時間インキュベートした。マイクロタイタープレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を６００ｎｍで使用し、読取ミラーで目視観察することによって、アッセイプレートを読み取った。目に見える増殖を防止した化合物の最低濃度をＭＩＣとして読み取った。アッセイの実行は、ＣＬＳＩのガイドラインに従って、実験品質対照系統に対するアズトレオナムを試験することによってモニターした。

参照化合物：比較のために、本明細書では、以下に示す公知のモノバクタム化合物を使用する。
参照化合物１：アズトレオナム

参照化合物２：カルモナム

参照化合物３：ＢＡＬ３００７２

参照化合物４：Ａｉｃｕｒｉｓ社、国際公開第２０１３１１０６４３号パンフレット

表Ａのデータから、化合物Ｘは、公知のいくつかのモノバクタムおよびスルバクタム（sulbactam）抗生物質に対して強い耐性を示す系統を含めて、大腸菌（E. coli）に対して良好な抗細菌力価を有することが明らかである。

化合物Ｘの追加の活性データを以下の表に示す。化合物Ｘを、大腸菌（E. coli）系統２５９２２およびＫＰＣ−２を含む大腸菌（E. coli）（肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）に由来する公知のカルバペネマーゼである上記の系統２）について試験し、これらの阻止濃度（ＭＩＣ）を単位ｍｇ／ｍＬで示した。

Claims

１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の（Ｌ）−アルギニン塩。
１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸のナトリウム塩。
１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の固体形態の水和物。
１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の３水和物を含む、組成物。
請求項４に記載の組成物を調製する方法であって、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸を、２０℃と３０℃の間の温度で２５％と５０％の間の相対湿度を有する雰囲気と接触させるステップを含む方法。
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物又は請求項４に記載の組成物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．６、１３．４、および１８．８を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム１）。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．５、１９．３、および２０．０を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム２）。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、１８．９、および２１．２を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム３）。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．０、８．６、１９．３、および２０．９を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム４）。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：７．３、９．３、および２７．８を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム５）。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：８．１、９．２、および１２．８、ならびに場合によって２１．２および２４．７における追加のピークを示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム６）。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．７、７．３、および２０．３を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム７）。
少なくとも以下に示す特徴的な（２θの角度で表される）粉末Ｘ線回折ピーク：６．２、２１．８、および２５．９を示す、１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸の結晶（フォーム８）。
１−（（（Ｚ）−（１−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−オキソ−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−２−オキソ−４−（（２−オキソオキサゾリジン−３−イル）メチル）−１−スルホアゼチジン−３−イル）アミノ）エチリデン）アミノ）オキシ）シクロプロパンカルボン酸およびアルギニンを含む医薬組成物。
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物、請求項４に記載の組成物または請求項７から１４のいずれか一項に記載のその結晶を含む、医薬組成物。
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物、請求項４に記載の組成物または請求項７から１４のいずれか一項に記載のその結晶の、グラム陰性細菌感染症の処置のための医薬の製造における使用。
グラム陰性感染症を処置するための医薬組成物であって、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物、請求項４に記載の組成物または請求項７から１４のいずれか一項に記載の結晶の治療上有効量を含む医薬組成物。