BR112018005805B1 - Sais e formas sólidas de um antibiótico monobactama - Google Patents

Abstract

SAIS E FORMAS SÓLIDAS DE UM ANTIBIÓTICO MONOBACTAMA. A presente invenção refere-se a novas formas sólidas, sais e polimorfos de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2- oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi) ciclopropanocarboxílico (aqui referido como Composto X), composições farmacêuticas que os contêm e processos para sua fabricação e uso em terapia.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a sais e formas cristalinas de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi) ci- clopropanocarboxílico que são adequados para produção em escala comercial, bem como composições farmacêuticas contendo estes materiais, métodos de prepará-los e seu uso em terapia.

ANTECEDENTES

[002] Ao longo das últimas décadas, a frequência de resistência antimicrobiana e sua associação com doenças infecciosas graves au-mentaram a taxas alarmantes. A crescente prevalência de resistência entre patógenos nosocomiais é particularmente desconcertante. Das mais de 2 milhões de infecções nosocomiais (adquiridas no hospital) que ocorrem todos os anos nos Estados Unidos, 50 a 60% são causadas por cepas de bactérias resistentes a antimicrobianos. A alta taxa de resistência aos agentes antibacterianos comumente usados aumenta a morbidade, a mortalidade e os custos associados às infecções nosocomiais. Nos Estados Unidos, pensa-se que as infecções nosocomiais contribuem ou causam mais de 77.000 mortes por ano e custam aproximadamente US $ 5 a US $ 10 bilhões anualmente.

[003] As causas importantes da resistência Gram-negativa inclu em as β-lactamases (ESBLs) de espectro estendido, serina carbape- nemases (KPCs) e as metano-β-lactamases (por exemplo NDM-1) em Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Proteus mirabilis, resistência à β-lactamase de cefalosporina de terceira geração de alto nível (AmpC) entre espécies de Enterobacter e Citrobacter freundii e genes de resistência a múltiplas drogas observados em Pseudomonas, Acine- tobacter e Stenotrophomonas. O problema da resistência antibacteriana é agravado pela existência de cepas bacterianas resistentes a múltiplos antibacterianos. Por exemplo, pneumonia de Klebsiella que abriga me- talo-β-lactamase de NDM-1 carrega frequentemente serina-β-lactama- ses adicionais no mesmo plasmídeo que transporta o NDM-1.

[004] Assim, existe a necessidade de novos antibacterianos, par ticularmente compostos antibacterianos que sejam eficazes contra os micróbios resistentes a drogas existentes ou são menos suscetíveis ao desenvolvimento de novas resistências bacterianas. A presente invenção proporciona formas sólidas de tais compostos que são especialmente adequados para produção em escala comercial devido às suas propriedades de manuseamento sob condições operacionais conveni- entes para a fabricação.

[005] O PCT/US2015/022011 descreve certos antibióticos de monobactama. Um composto deste pedido que mostra uma forte atividade contra bactérias Gram-negativas, incluindo cepas que mostram resistência a outros monobactamas, é ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno) amino)óxi)ciclopropanocarboxílico aqui referido como Composto X:

[006] Para a fabricação de compostos farmacêuticos e suas for- mulações, é importante que o composto ativo seja em uma forma que possa ser convenientemente manipulada e processada de modo a ob- ter um processo de fabricação comercialmente viável, confiável e re-produtível. O composto X e muitos dos seus sais são sólidos à tempe-ratura ambiente e podem ser produzidos em várias formas sólidas, de-pendendo das condições utilizadas para produzir, purificar ou cristalizar o material. A existência de múltiplas formas sólidas, muitas vezes referidas como polimorfos, é bem conhecida por compostos farmacêuticos sólidos, e a estabilidade química e física, bem como o tratamento de propriedades de tais compostos, dependem frequentemente da forma sólida utilizada. Por conseguinte, a seleção de uma forma sólida particular da substância ativa de droga (por exemplo, uma forma de sal, forma hidratada ou solvatada ou forma polimórfica) é muitas vezes muito importante no projeto de um processo de produção confiável e reprodutível e no armazenamento, manuseio e distribuição de uma forma segura e eficaz da substância medicamentosa.

[007] Em geral, é encontrado que existem vantagens na fabrica ção de uma determinada forma de estado sólido de um ingrediente farmacêutico, e estes são descritos em "Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection and Use", P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.) (Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich). Métodos de fabricação de formas de estado sólido são também descritos em "Practical Process Research and Development", Neal G. Anderson (Academic Press, San Diego) e "Polymorphism: In the Pharmaceutical Industry", Rolf Hilfiker (Ed) (Wiley VCH).

[008] Os presentes inventores constataram certos sais e formas polimórficas do Composto X que são particularmente adequados para utilização na fabricação, armazenamento ou administração do Composto X como aqui descrito.

[009] É importante que uma droga seja estável o suficiente para evitar uma degradação significativa quando é enviada e armazenada em condições comercialmente práticas. Os inventores constataram que o Composto X em solução é de preferência utilizado e armazenado a um pH entre 4 e 6, de preferência entre 4,0 e 5,5, para máxima estabilidade na presença de umidade. A estabilidade da solução óptima é conseguida a um pH de cerca de 4,0 a 5,5. Consequentemente, a invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo o Composto X a um pH entre 4 e 6, de preferência entre 4,0 e 5,5, e mais preferivelmente a um pH de cerca de 5 ± 0,5 ou a pH de 5 ± 0,2. As composições adequadas compreendem o Composto X em uma solução aquosa, tal como uma solução de dextrose ou salina, que pode ser isotônica e pode conter outras substâncias tais como estabilizadores, antioxidantes, tampões ou modificadores de pH, nutrientes e se-melhantes. Em algumas destas modalidades, o pH desejado é conse-guido combinando o Composto X e um modificador de pH adequado para atingir o pH desejado em uma solução aquosa. Os modificadores de pH adequados incluem, mas não estão limitados a, hidróxido de sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, hidróxido de potássio, aminas tais como TRIS (tris (hidroxime- til)aminometano) e aminoácidos tais como arginina, lisina, histidina e semelhantes. Monobactamas conhecidos, incluindo aztreonam, foram formulados com arginina.

[0010] O pH adequado pode ser conseguido adicionando um mo dificador de pH a uma solução aquosa do Composto X, ou adicionando Composto X a uma solução aquosa contendo o modificador de pH. As quantidades adequadas do modificador de pH e do Composto X podem ser facilmente determinadas pelo especialista na matéria. Os mo-dificadores de pH adequados incluem hidróxido de sódio e arginina. Assim, uma solução ou suspensão do Composto X pode ser tratada com hidróxido de sódio, ou com arginina, para produzir uma solução compreendendo um sal de sódio ou um sal de arginina do Composto. Além disso, esta solução pode ser liofilizada para remover a água e quaisquer co-solventes presentes, deixando um sólido liofilizado que compreende o Composto X juntamente com o modificador do pH, ou um sal formado pelo Composto X e o modificador do pH, por exemplo, o sal de sódio ou sal de arginina do Composto X.

[0011] Além disso, de acordo com a presente invenção, é propor cionada uma série de formas sólidas do Composto X que proporcionam propriedades de manipulação adequadas para fabricação a escala industrial, juntamente com métodos de produção destes polimorfos.

[0012] As seguintes modalidades enumeradas da invenção são representativas: 1. Um sal de arginina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4- il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico. Em algumas modalidades, o sal é um sal (L)-arginina. 2. Um sal de sódio de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2- oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1-sulfoazetidin- 3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico 3. Uma forma sólida hidratada de ácido 1-(((Z)-(1-(2- aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico 4. A forma sólida hidratada de acordo com a modalidade 3, que consiste principalmente em um tri-hidrato de ácido 1-(((Z)-(1-(2- aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)- 1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico. 5. Um método para preparar a forma sólida hidratada de acordo com a modalidade 4, que compreende contatar ácido 1-(((Z)- (1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3- il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocar- boxílico com uma atmosfera com umidade relativa entre 25% e 50% a uma temperatura entre 20°C e 30°C. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4 e pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 7. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4- il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 1) que exibe pelo menos os seguintes picos de difração de raios X de pó característicos (expressos em graus 2θ): 6.6. 13/4 e 18.8. Em algumas modalidades, a Forma 1 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 8. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4- il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 2) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7,5, 19,3 e 20,0. Em algumas modalidades, a Forma 2 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 9. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4- il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 3) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7.3, 18.9 e 21.2. Em algumas modalidades, a Forma 3 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 10. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4- il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1-sulfoazetidin- 3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 4) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7,0, 8,6, 19,3 e 20,9. Em algumas modalidades, a Forma 4 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 11. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4- il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1-sulfoazetidin- 3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 5) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7,3, 9,3 e 27,8. Em algumas modalidades, a Forma 5 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 12. Uma forma cristalina de 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2- oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1-sulfoazetidin- 3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 6) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó(expressos em graus 2θ): 8,1, 9,2 e 12,8; e, opcionalmente, por picos adicionais em 21,2 e 24,7. Em algumas modalidades, a Forma 6 possui picos de XRPD adicionais como descrito abaixo. 13. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 7) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó(expressos em graus 2θ): 6,7, 7,3 e 20,3. Em algumas modalidades, a Forma 7 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 14. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1-sulfoa- zetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 8) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 6,2, 21,8 e 25,9. Em algumas modalidades, a Forma 8 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 15. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1-sulfoa- zetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 9) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 6,3, 12,6 e 22,3; e opcio-nalmente por um ou mais picos adicionais selecionados de 22,1, 23,1, 27,0 e 27,5. Em algumas modalidades, a Forma 9 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 16. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 10) que exibe pelo menos os seguintes difração de raios X de pópicos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 6,6, 11,0 e 16,5; e opcionalmente por um ou mais picos adi-cionais selecionados de 22,2 e 23,4. Em algumas modalidades, a Forma 10 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 17. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 11) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7,4, 9,7 e 29,3; e opcionalmente por um ou mais picos adicionais selecionados de picos a 17,0, 19,5, 22,2, 26,3 e 28,1. Em algumas modalidades, a Forma 11 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 18. Uma forma cristalina de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidina-3-il)metil)-1- sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico (Forma 12) que exibe, pelo menos, os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 19,0, 20,4 e 24,0; e opcionalmente por um ou mais picos adicionais selecionados de picos em 7,3, 24,7 e 27,2. Em algumas modalidades, a Forma 12 possui picos XRPD adicionais como descrito abaixo. 19. Uma composição farmacêutica compreendendo ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazo- lidina-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopro- pano carboxílico e arginina. 20. A composição farmacêutica de acordo com a reivindica-ção 19, que adicionalmente compreende um veículo farmaceuticamen- te aceitável. 21. A composição farmacêutica de acordo com a reivindica-ção 20, em que o veículo é aquoso. 22. A composição farmacêutica de acordo com a reivindica-ção 21, que está a um pH de cerca de 5,0. 23. A composição farmacêutica de acordo com a reivindica-ção 21 ou 22, que adicionalmente compreende pelo menos um excipi- ente selecionado de sacarose, frutose, trealose, manitol e lactose. 24. Um composto de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-4, ou uma sua forma cristalina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 18, para utilização em terapia. 25. O composto de acordo com a reivindicação 24, em que a terapia é o tratamento de uma infecção bacteriana Gram-negativa. 26. O composto de acordo com a reivindicação 24, em que a bactéria que causa a infecção bacteriana Gram-negativa é selecionada de bactérias Citrobacter, Enterobacter, Eschirichia, Haemophilus, Klebsiella Morganella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella e Neisseria. 27. Uso de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou uma sua forma cristalina de acordo com qual-quer uma das reivindicações 7 a 18, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção bacteriana Gram-negativa. 28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, em que a bac-téria que causa a infecção bacteriana Gram-negativa é uma espécie selecionada de bactérias Citrobacter, Enterobacter, Eschirichia, Hae mophilus, Klebsiella, Morganella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella e Neisseria. 29. Um método de tratamento para uma infecção Gram- negativa, compreendendo administrar a um indivíduo que dele necessite uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou uma forma cristalina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 18, ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-23. 30. O método de acordo com a reivindicação 29, em que a bactéria que causa a infecção bacteriana Gram-negativa é uma espécie selecionada de bactérias Citrobacter, Enterobacter, Eschirichia, Haemophilus, Klebsiella, Morganella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella ou Neisseria.

[0013] Assim, em um aspecto, a invenção proporciona uma forma cristalina do Composto X (Forma 1) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos nos graus 2θ): 6,6, 13,4 e 18,8. Em uma modalidade, a Forma 1 exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó: 6,6, 13,4, 16,6, 17,9, 18,8, 20,3, 25,1 e 28,9. Em outra modalidade, a Forma 1 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 1 ou qualquer subconjunto de pelo menos cinco picos selecionados da Lista 1. Ainda em outra modalidade, a Forma 1 exibe substancialmente o mesmo um padrão de difração de raios X de pó que o mostrado na Figura 1.

[0014] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma forma cris talina do Composto X (Forma 2) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó(expressos em graus 2θ): 7,5, 19,3 e 20,0. Em uma modalidade, a Forma 2 exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de pó de raios X: 6,7, 7,5, 13,3, 13,7, 15,3, 17,9, 18,7, 19,3 e 20,0. Em outra modalidade, a Forma 2 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 2, ou qualquer subconjunto de pelo menos cinco picos selecionados da Lista 2. Ainda em outra modalidade, a Forma 2 exibe substancialmente o mesmo um padrão de di- fração de raios X de pó que o mostrado na Figura 2.

[0015] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma forma cris talina do Composto X (Forma 3) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó(expressos em graus 2θ): 7,3, 18,9 e 21,2; e, opcionalmente, incluindo um pico em 8,3. Em uma modalidade, a Forma 3 apresenta pelo menos os seguintes picos característicos de difração de pó de raios X: 7,3, 13,9, 16,7, 18,9, 20,3, 21,2 e 24,6. Em outra modalidade, a Forma 3 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 3, ou qualquer subconjunto de pelo menos cinco picos selecionados da Lista 3. Ainda em outra modalidade, a Forma C exibe um padrão de difração de raios X de pó substancialmente o mesmo que o mostrado na Figura 4.

[0016] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma forma cris talina do Composto X (Forma 4) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó(expressos em graus 2θ): 7,0, 8,6 , 19,3 e 20,9. Em uma modalidade, a Forma 4 exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó: 7,0, 8,6, 15,2, 17,0, 18,0, 19,3, 20,9, 24,5 e 26,9. Em outra modalidade, a Forma 4 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 4, ou qualquer subconjunto de pelo menos cinco picos selecionados da Lista 4. Ainda em outra modalidade, a Forma 4 exibe substancialmente o mesmo um padrão de di- fração de raios X de pó que o mostrado na Figura 5.

[0017] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma forma cris- talina do Composto X (Forma 5) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó a seguir (expressos em graus 2θ): 7,3, 9,3 e 27,8; e, opcionalmente, incluindo um pico a 19,9. Em uma modalidade, a Forma 5 exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó: 7,3, 9,3, 16,3, 18,6, 19,2, 19,9, 21,7, 24,1, 24,9, 27,3, 27,8 e 29,8. Em outra modalidade, a Forma 5 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 5, ou qualquer subconjunto de pelo menos cinco picos selecionados da Lista 5. Ainda em outra modalidade, a Forma 5 exibe um padrão de difração de raios X de pó substancialmente o mesmo que o mostrado na Figura 6.

[0018] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma forma cris talina do Composto X (Forma 6) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó(expressos em graus 2θ): 8,1, 9,2 , 12,8, 21,2 e 24,7. Em uma modalidade, a Forma 6 exibe pelo menos os seguintes picos de difração de raios X de pó caracterís-ticos: 8,1, 9,2, 12,8, 13,9, 14,4, 16,7, 20,1, 21,2, 24,7 e 26,6. Em outra modalidade, a Forma 6 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 6, ou qualquer subconjunto de pelo menos cinco picos selecionados da Lista 6. Ainda em outra modalidade, a Forma 6 exibe substancialmente o mesmo um padrão de difração de raios X de pó que o mostrado na Figura 7.

[0019] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma forma cris talina do Composto X (Forma 7) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó a seguir (expressos nos graus 2θ): 6,7, 7,3 e 20,3. Em uma modalidade, a Forma 7 exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó: 6,7, 7,3, 17,6, 18,0, 20,3 e 24,9. Em outra modalidade, a Forma 7 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 7, ou qualquer subconjunto de pelo menos cin- co picos selecionados da Lista 7. Ainda em outra modalidade, a Forma 7 exibe um padrão de difração de raios X de pó substancialmente o mesmo que o mostrado na Figura 8.

[0020] Em um outro aspecto, o invento proporciona uma forma cristalina do Composto X (Forma 8) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó(expressos em graus 2θ): 6,2, 21,8 , e 25,9. Em uma modalidade, a Forma 8 exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó: 6,2, 17,8, 20,7, 21,8 e 25,9. Em outra modalidade, a Forma 8 exibe pelo menos os picos característicos de difração de raios X de pó mostrados na Lista 8, ou qualquer subconjunto de pelo menos cinco picos selecionados da Lista 8. Ainda em outra modalidade, a Forma 8 exibe um padrão de difração de raios X de pó substancialmente o mesmo que o mostrado na Figura 9.

[0021] Em um aspecto da invenção, os polimorfos da invenção têm propriedades cristalinas e são de preferência pelo menos 50% cristalinos, mais preferivelmente pelo menos 60% cristalinos, ainda mais preferivelmente pelo menos 70% cristalinos e mais preferivelmente pelo menos 80% cristalino. A cristalinidade pode ser estimada por técnicas convencionais de difratometria de raios X ou por técnicas espectroscópicas de infravermelho.

[0022] Em algumas modalidades, a forma sólida do Composto X compreende uma ou mais das Formas aqui descritas. Uma forma sólida do Composto X pode incluir duas ou mais destas Formas, isto é, pode ser uma mistura de duas ou mais Formas. Em algumas modalidades, uma amostra da forma sólida consiste principalmente em uma única Forma selecionada entre as Formas 1-8, o que significa que 50% ou mais do material é de uma Forma sólida. As quantidades relativas de várias Formas em uma mistura podem ser determinadas a partir de dados XRPD. Conforme descrito neste documento, algumas das Formas podem evoluir ou interconverter em condições adequadas, como Formas 4 e 5, que podem ocorrer como uma mistura e podem interconverter dependendo da umidade relativa e temperatura em que o material é mantido.

[0023] Em um aspecto da invenção, os polimorfos da invenção são de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% cristalinos.

[0024] Na presente especificação, os picos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ) são medidos usando raios X de cobre com um comprimento de onda de 1,5406 Â (alfal) e 1,5444 Â (alfa2). Os locais de pico são relatados em graus 2θ e são entendidos como submetidos a pequenas variações numéricas e, portanto, deve entender-se que os ângulos estão submetidos à variação de ± 0,2°.

[0025] As formas cristalinas da presente invenção podem existir em formas não solvatadas ou solvatadas. O termo "solvato" é aqui uti-lizado para descrever um complexo molecular compreendendo o com-posto da invenção e uma quantidade de um ou mais solventes farma- ceuticamente aceitáveis. Exemplos de solventes farmaceuticamente aceitáveis incluem etanol e água. O termo "hidrato" é utilizado quando o solvente é água. Vários polimorfos do Composto X como aqui descrito são hidratos.

[0026] Em um aspecto, a invenção proporciona uma forma salina ou cristalina aqui definida para uso em terapia. Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento por terapia, que com-preende administrar a um indivíduo que dele necessite uma quantidade farmaceuticamente aceitável de um sal ou forma cristalina de acordo com a invenção.

[0027] Em um aspecto, a invenção proporciona a utilização de um sal ou forma cristalina aqui definida na fabricação de um medicamento para uso em terapia.

[0028] Em uma modalidade, a terapia é o tratamento de uma in fecção causada por uma bactéria Gram-negativa.

[0029] A invenção também proporciona processos para a prepara ção das formas cristalinas aqui descritas. Assim, em um aspecto, a invenção proporciona um processo para a preparação de qualquer uma das Formas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 como aqui descrito compreendendo a cristalização da Forma desejada a partir de uma solução do Composto X, utilizando sistemas de solventes e condições descritos nos Exemplos aqui proporcionados.

[0030] No contexto da presente invenção, as referências aqui con tidas para "tratamento" incluem referências ao tratamento curativo, pa-liativo e profilático, a menos que existam indicações específicas para o contrário. Os termos "terapia", "terapêutica" e "terapeuticamente" devem ser interpretados da mesma maneira.

[0031] O Composto X é tipicamente administrado por injeção ou infusão e pode ser preparado para administração dissolvendo o Com-posto X em uma quantidade adequada de água ou de uma solução aquosa tal como dextrose ou solução salina, por exemplo, dextrose isotônica ou solução salina. Opcionalmente, a composição formulada pode também incluir um modificador de pH tal como hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, meglumina, TRIS ou um aminoácido (por exemplo, lisina, histidina ou arginina) em quantidade suficiente para proporcionar um pH desejado, tal como um pH entre 4 e 6. Enquanto os aminoácidos utilizados nos exemplos eram (L)-aminoácidos, um (D)-aminoácido ou uma mistura de racêmica podem ser utilizados. As composições farmacêuticas compreendendo o Composto X em solução são tipicamente ajustadas para um pH entre 4,5 e 5,5, frequentemente ou a um pH de cerca de 5, tal como entre pH 4,8 e 5.2.

[0032] Em algumas modalidades, o Composto X é formulado com um modificador de pH em solução aquosa, e depois é liofilizado para uma forma sólida para armazenamento e distribuição. Para administração, pode-se reconstituir o produto de droga liofilizado por adição de um veículo aquoso, tipicamente um veículo aquoso estéril, tal como água ou uma solução de dextrose isotônica ou salina, ou outra solução IV tal como a solução de Ringer, Ringer Láctea ou Hartmann. Conse-quentemente, a invenção também proporciona um liofilizado (um sólido preparado por liofilização) compreendendo o Composto X e um modificador de pH tal como os mencionados acima, por exemplo, (L)- arginina, (L)-lisina, meglumina, TRIS, de hidróxido de sódio. Opcio-nalmente, podem ser incluídos outros excipientes, tais como sacarose. Em uma modalidade, uma solução de Composto X e arginina (dois equivalentes) é preparada e o pH é ajustado para um pH entre 4,8 e 5,2, utilizando, por exemplo, hidróxido de sódio ou ácido clorídrico conforme necessário. A solução é então liofilizada para um sólido branco ou ligeiramente amarelo, que é estável para armazenamento e pode ser facilmente reconstituído com uma solução aquosa estéril adequada para administração intravenosa.

[0033] Em outra modalidade, é preparada uma solução de Com posto X, sacarose e arginina (dois equivalentes) em água adequada para injeção e o pH é ajustado para um pH entre 4,8 e 5,2, utilizando, por exemplo, hidróxido de sódio ou ácido clorídrico conforme necessário. A solução é então liofilizada para um sólido branco ou ligeiramente amarelo, que é estável para armazenamento e pode ser facilmente reconstituído com uma solução aquosa estéril adequada para adminis-tração intravenosa.

[0034] Os sais e formas cristalinas da presente invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com uma ou mais drogas. Geralmente, eles serão administrados como uma formulação em associação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. O termo "excipiente" é aqui utilizado para descrever qualquer ingrediente que não seja o (s) composto (s) da invenção que possa conferir um controle funcional (ou seja, controle da taxa de liberação da droga) e/ou não funcional (isto é, auxiliar de processamento ou diluen- te) característico das formulações. A escolha do excipiente depende, em grande medida, de fatores tais como o modo particular de administração, o efeito do excipiente sobre a solubilidade e a estabilidade e a natureza da forma de dosagem. As composições farmacêuticas podem também compreender um veículo, que é um material substancialmente inerte, frequentemente um líquido, utilizado para diluir o (s) ingrediente (s) ativo (s). Os veículos adequados são conhecidos na técnica e incluem água estéril e soluções estéreis de solução salina ou dextrose, por exemplo.

[0035] As composições farmacêuticas adequadas para a adminis tração das formas sólidas do Composto X e métodos para a sua pre-paração serão facilmente evidentes para os especialistas na técnica. Tais composições e métodos para a sua preparação podem ser en-contrados, por exemplo, em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a Edição (Mack Publishing Company, 1995).

[0036] Para a administração a pacientes humanos, a dose diária total do sal ou forma cristalina está tipicamente na faixa 1000 mg a 10.000 mg, ou entre 2000 mg e 8000 mg, ou entre 3000 mg e 8000 mg, ou entre 4000 mg e 6000 mg, dependendo da condição do objeto e parâmetros como o peso corporal, idade e sexo do objeto. A dose diária total pode ser administrada em uma única dose, ou pode ser dividida em duas ou mais doses e pode, a critério do médico, sair do intervalo típico aqui indicado. Tipicamente, a dosagem diária seria administrada por injeção intravenosa ou por infusão, e seria administrada em uma, duas, três ou quatro doses, que fornecem cumulativamente a dosagem diária total desejada. A infusão pode ser rápida ou pode ser realizada durante um período entre cerca de 15 minutos e 4 horas, ge-ralmente durante um período de 1-3 horas. Um esquema de dosagem típico proporcionaria três ou quatro infusões diariamente, cada uma com duração de 0,25-2 horas ou 0,25-3 horas, entre 1 a 2 ou 1 a 2,5 gramas de Composto X por dose, e uma dose diária total típica seria 3-8 gramas. Por exemplo, uma programação de dosagem pode entregar 2 gramas de Composto X por infusão, com três infusões de uma hora por dia. Alternativamente, pode ser utilizada uma única infusão de 2-6 gramas, ou 3-5 gramas durante 1 ou 1,5 ou 2 ou 2,5 ou 3 horas. As dosagens acima são baseadas em um objeto humano médio com um peso de cerca de 60kg a 70kg, e podem ser dimensionadas adequadamente para outros objetos. O médico será prontamente capaz de determinar doses para indivíduos cujo peso sai desse intervalo, como bebês e idosos.

Breve Descrição das Figuras

[0037] A invenção agora será ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes. Nos exemplos são apresentadas as seguintes figuras:

[0038] Figura 1: padrão de difração de raios X de pó da Forma 1.

[0039] Figura 2: padrão de difração de raios X de pó da Forma 2.

[0040] Figura 3: padrão de difração de raios X de pó da Forma 1 após agitação com acetona, sobreposta por XRPD para a Forma 1 para comparação.

[0041] Figura 4: padrão de difração de raios X de pó da Forma 3.

[0042] Figura 5: padrão de difração de raios X de pó da Forma 4.

[0043] Figura 6A: padrão de difração de raios X de pó da Forma 5 sobreposta sobre XPRD para a Figura 4.

[0044] Figura 6B: padrão de difração de raios X de pó da Forma 5 a partir da preparação em grande escala.

[0045] Figura 7: padrão de difração de raios X de pó da Forma 6.

[0046] Figura 8: padrão de difração de raios X de pó da Forma 7.

[0047] Figura 9: padrão de difração de raios X de pó da Forma 8.

[0048] Figura 10: padrão de difração de raios X de pó da Forma 9.

[0049] Figura 11: padrão de difração de pó de raios X da Forma 10.

[0050] Figura 12: padrão de difração de pó de raios X da Forma 11.

[0051] Figura 13: padrão de difração de raios X de pó da Forma 12.

Detalhes experimentais gerais

[0052] Cada amostra e (alguns miligramas) é colocada entre três folhas de polímero (Kapton® e/ou polipropileno). Vale ressaltar que Kapton® exibe um pico largo com uma intensidade fraca em torno de 2θ = 5,5°.

[0053] A amostra é então colocada em um difratômetro PANALYTICAL X'PERT PRO MPD configurado no modo de transmissão, e analisado utilizando as condições indicadas abaixo. As análises são realizadas entre 2 ° e 50 ° (a menos que indicado de outra forma). Radiação: CuKα Configurações do gerador: 40 kV e 40 mA Tamanho das etapas: 0,026° Etapas: 1828 Tipo de medição: varredura repetida (3 / 5 / 20 vezes)

[0054] Todos os materiais de partida, blocos de construção, rea gentes, ácidos, bases, agentes desidratantes, solventes e catalisadores utilizados para a síntese dos compostos da presente invenção são comercialmente disponíveis ou podem ser produzidos por métodos de síntese orgânica conhecidos por um especialista na matéria (Houben- Weyl 4th Ed. 1952, METHODS OF ORGANIC SYNTHESIS, Thieme, Volume 21).

Condições Gerais

[0055] Espectros de massa foram adquiridos nos sistemas LC-MS, SFC-MS ou GC-MS usando eletrospray e métodos de ionização de impacto eletrônico a partir de uma variedade de instrumentos das se-guintes configurações: sistema Water ACQUITY UPLC e equipado com um Sistema ZQ 2000 ou SQD MS em que (M+1) se refere ao íon molecular protonado das espécies químicas, (M+) se refere ao cátion de amônio quaternário não protonado, (M+Na) se refere ao íon incorporado a sódio e (M-1) se refere ao íon molecular desprotonado das espécies químicas.

[0056] Espectros de RMN foram executados nos espectrômetros de RMN Bruker AVANCE 500MHz ou Varian 400MHz usando ICON- RMN, sob o controle do programa TopSpin. Os espectros foram medidos a 298K, a menos que indicado de outra forma, e foram referenciados em relação à ressonância do solvente.

Instrumentação

[0057] Métodos de MS: Usando Sistemas de HPLC Agilent 1100 com um Espectrômetro de Massa Agilent 6110. Método 2m_acídico: Coluna: Kinetex C18 50 x 2,1 mm, 2,6 μm Temperatura da coluna: 50 °C Eluentes A: H2O, B: acetonitrila, ambos contendo 0,1% de TFA Taxa de fluxo: 1,2 mL/min Gradiente: 2% a 88% B em 1,30 min, 0,15 min a 95% de B Método 2m_acídico_polar: Coluna: Kinetex C18 50 x 2,1 mm, 2,6 μm Temperatura da coluna 50°C Eluentes A: H2O, B: acetonitrila, ambos contendo 0,1% de TFA Taxa de fluxo 1,2 mL/min Gradiente 1% a 30% de B em 1,30 min, 0,15 min a 98% de B Preparação do Composto X Intermediário A: Metanossulfonato ((2S,3S)-3-(((benzilóxi)carbonil)a- mino)-1-(2,4-dimetoxibenzil)-4-oxoazetidin-2-il) de metila.

[0058] A uma solução de carbamato de (3,3)-1-(2,4- dimetoxibenzil)-2-(hidroximetil)-4-oxoazetidin-3-ila) (5,37 g, 13,41 mmol) e TEA (3,72 mL, 26,8 mmol) em DCM a 0°C foi adicionado cloreto de metanossulfonila (MsCl) (1,15 mL, 14,75 mmol). Após agitação a 0°C durante 1 h, ele foi diluído com água / DCM e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM (2x) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas sobre Na2SO4 e concentradas in vácuo. O resíduo bruto foi retomado em to- lueno e concentrado (2x), proporcionando o composto do título como um sólido esbranquiçado. Ele foi usado como tal em reações subsequentes. LCMS: Rt = 0,86 min, m/z = 479,2 (M+1) Método 2m_acídico.

[0059] O material de partida para esta etapa pode ser feito usando as seguintes abordagens ou alguma combinação de etapas com base nessas abordagens. Em uma primeira abordagem, um aldeído quiral protegido é condensado com 2,4-dimetoxibenzilamina para formar uma imina quiral.

[0060] O aldeído quiral é conhecido e pode ser feito a partir de ácido cítrico:

[0061] A imina quiral pode ser reagida com formas protegidas de glicina tais como estas: O anidrido misto requerido para a segunda opção pode ser preparado a partir de glicina protegida com CBZ e cloroformiato de isopropila em diclorometano. (DMB se refere a um grupo 2,4-dimetoxibenzila). O dioxolano deste intermediário protegido é então hidrolisado sob condi-ções ácidas suaves e oxidado para um aldeído, o qual pode ser facil-mente reduzido com, por exemplo, boro-hidreto de sódio, para prover o álcool primário diprotegido como mostrado:

[0062] O álcool primário deste intermediário pode ser convertido em um grupo de saída, por exemplo, tratando com iodo e trifenilfosfina para produzir um iodeto primário, ou tratando com uma base e um cloreto de sulfonila para produzir, por exemplo, um mesilato ou tosilato. Este intermediário ativado reage prontamente com hidroxietilamina como mostrado na etapa 1 abaixo. Intermediário B: 3-(((2R,3S)-3-amino-4-oxoazetidin-2-il)metil) oxa- zolidin-2-ona.

Etapa 1: ((2R,3S)-1-(2,4-dimetoxibenzil)-2-(((2-hidroxietil) ami- no)metil)-4-oxoazetidin-3-ila)carbamato de benzila

[0063] A uma solução de metanossulfonato ((2S,3S)-3-(((benziló- xi)carbonil)amino)-1-(2,4-dimetoxibenzil)-4-oxoazetidin-2-ila)metila (6,43 g, 13,4 mmol) em acetonitrila (44,8 mL) foi adicionada etanolamina (8,13 mL, 134 mmol) seguida de DIEA (7,0 mL, 40 mmol). A solução foi aque-cida a 80 °C durante 20 h, após o que foi arrefecida até à temperatura ambiente, diluída com EtOAc, lavada com água, seca sobre Na2SO4 e concentrada in vácuo, para proporcionar o composto do título (4,47 g, 75%) como um branco sólido. LCMS: Rt = 0,60 min, m/z = 444,2 (M+1).

Etapa 2: ((3S,4R)-1-(2,4-dimetoxibenzil)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazoli- dina-3-il)metil)azetidin-3-il)carbamato de benzila.

[0064] A uma solução de carbamato (4R,3S)-1-(2,4-dimetoxibenzil)- 2-((2-hidroxietil)amino)metil)-4-oxoazetidin-3-ila) de benzila (4,47 g, 10,08 mmol) em clorofórmio (50 mL) foi adicionado carbonildi-imidazol (CDI) (4,90 g, 30,2 mmol). Após agitação à temperatura ambiente durante 30 min, a mistura de reação foi concentrada in vácuo. O resíduo em bruto foi purificado através de cromatografia em sílica gel (MeOH-DCM, 0-5%), proporcionando o composto do título (3,84 g, 81%) como uma espuma branca. LCMS: Rt = 0,76 min, m/z = 470,1 (M+1).

Etapa 3: ((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil) azetidin-3- ila) carbamato de benzila.

[0065] Preparado de forma análoga a uma preparação em Masta- lerz et al. J. Med. Chem. 1988, 31, 1190, utilizando (3S,4R)-1-(2,4- dimetoxibenzil)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il) car- bamato de benzila (3,84 g, 11,5 mmol) e K2HPO4 (1,852 g, 10,6 mmol) em ACN:água (2:1, 136 mL) e aquecer durante 40 min a 90 °C. Mais K2S2O8 (663 g, 2,45 mmol) e K2HPO4 (370 mg, 2,13 mmol) foram adicionados e a mistura foi aquecida durante mais 3 h. Mais K2S2O8 (332 mg, 1,23 mmol) e K2HPO4 (185 mg, 1,06 mmol) foram adicionados e aquecidos durante mais 2 h, após o que foram concentrados in vácuo, removendo a maior parte da ACN. A mistura foi diluída com salmoura / EtOAc e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com EtOAc (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em sílica gel (EtOAc-Heptano, 0-100% depois MeOH-DCM, 10%) para dar o composto do título (1,61 g, 62%) como uma espuma bege. LCMS: Rt = 0,51 min, m/z = 320,0 (M+1) Método 2m_acídico.

Etapa 4: 3-((2R,3S)-3-amino-4-oxoazetidin-2-il)metil)oxazolidin-2-1.

[0066] Preparado de acordo com Malmstrom et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 5293, utilizando ((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)azetidin-3-ila)carbamato de de benzila (96 mg, 0,30 mmol) e Pd / C 10% Degussa tipo 101 (10%, 64 mg) e hidrogénio em EtOH: MeOH (4: 1, 1,5 mL) durante 1h. O resíduo bruto foi utiliza- do como tal no etapa seguinte. LCMS: Rt = 0,11 min, m/z = 186,0 (M+1) Método 2m_acídico.

Composto X: Ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo- 2-((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3- il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico. Etapa 1: 1-(((Z)-(1-(2-((terc-butoxicarbonil) amino) tiazol-4-il)-2-oxo-2- (((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)amino)eti- lideno)amino)óxi) ciclopropanocarboxilato de benzidrila.

[0067] A uma solução de ácido (Z)-2-((1-((benzidrilóxi)carbonil) ciclopropóxi)imino)-2-(2-((terc-butoxicarbonil)amino) tiazol-4-il) acético (854 mg, 1,59 mmol) preparado de acordo com o pedido de patente publicado US2011/0190254, Intermediário B (324 mg, 1,75 mmol) e HATU (785 mg, 2,07 mmol) em DMF (7,9 mL), foi adicionado DIPEA (832 μL, 4,77 mmol). Após 1 h de agitação, foi vertida em água e extraída com EtOAc. Salmoura foi adicionada à camada aquosa e extraída mais com acetato de etila (EtOAc) (3x). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4 e concentradas in vácuo. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em sílica gel (0-10% de MeOH-DCM) para dar o composto do título (1,09 g, 97%) como uma espuma bege. LCMS: Rt = 0,97 min, m/z = 705,3 (M+1) Método 2m_acídico.

[0068] Em vez de HATU, uma variedade de outros reagentes de acoplamento pode ser utilizada, tais como qualquer uma das carbodi- imidas típicas, ou CDMT (2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina) e N- metilmorfolina para formar a ligação amida gerada no Etapa 1.

Etapa 2: Ácido (3S,4R)-3-((Z)-2-((1-((benzidrilóxi)carbonil) ciclopro- póxi) imino)-2-(2-((terc-butoxicarbonil) amino) tiazol-4-il)acetamido)- 2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil azetidina-1-sulfônico.

[0069] 1-(((terc-butoxicarbonil)amino)tiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)- 2-oxo-4-(2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)azetidin-3- il)amino)etilideno)amino)óxi) ciclopropanocarboxilato de benzidrila (1,00 g, 1,42 mmol) em DMF (7,0 mL) a 0°C foi tratada com SO3 • DMF (448 mg, 2,84 mmol). Após 2 h de agitação à temperatura ambiente, a solução foi vertida em salmoura gelada e extraída com EtOAc (3x). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4 e concentradas in vácuo, proporcionando o composto do título (assumido quantitativo) como um sólido branco. LCMS: Rt = 0,90 min, m/z = 785,2 (M+1) Método 2m_acídico.

Etapa 3: Ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2- Ácido ((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3- il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico.

[0070] A uma solução de Ácido (3S,4R)-3-((Z)-2-((1-((benzidrilóxi) carbonil) ciclopropóxi) imino)-2-(2-((terc-butoxicarbonil) amino) tiazol-4- il) acetamido)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil) azetidina-1- sulfônico (1,10 g, 1,40 mmol) em DCM (1,5 mL) a 0°C, TFA (5,39 mL, 70,0 mmol), e após 10 minutos, o banho de gelo foi removido. TFA adicional (3,24 mL, 42,0 mmol) foi adicionado após 1 hora à temperatura ambiente e a solução foi diluída com DCM e concentrada in vácuo após 30 minutos adicionais. Opcionalmente, a anisol pode ser adicionada à reação de TFA para ajudar a reduzir a formação de subprodutos, o que pode aumentar o rendimento do produto desejado nesta etapa. O resíduo em bruto foi purificado por HPLC de preparação de fase reversa (XSelect CSH, 30 x 100 mm, 5 μm, coluna C18, ACN- água com modificador de ácido fórmico a 0,1%, 60 mL/min), obtendo- se o composto do título (178 mg, 23%) como um pó branco. LCMS: Rt = 0,30 min, m/z = 518,9 (M+1) Método 2m_acídico; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,27 (d, J = 9,0 Hz, 1H) 6,92 (s, 1H) 5,23 (dd, J = 9,1, 5,7 Hz, 1H) 4,12-4,23 (m, 3H) 3,72-3,62 (m, 2H assumido, obscurecido por água) 3,61-3,52 (m, 1H assumido, obscurecido por água) 3,26 (dd, J = 14,5, 5,9 Hz, 1H) 1,36 (s, 4H). 1H RMN (400 MHz, D2O) δ 7,23 (s, 1H), 5,48 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,71-4,65 (m, 1H), 4,44 (t, J = 8,2 Hz, 2H), 3,89-3,73 (m, 3H), 3,54 (dd, J = 14,9, 4,9 Hz, 1H), 1,65-1,56 (m, 2H), 1,56-1,46 (m, 2H). O produto deste processo é amorfo. O composto X pode ser cristalizado a partir de acetona, etanol, tampão de citrato a pH 3 (50 mM) ou tampão de acetato a pH 4,5 (50 mM), além de solventes discutidos abaixo. Instrumentação DSC: Pyris Diamond DSC, gás nitrogênio (20 mL/min) TGA: Pyris 1 TGA, gás nitrogênio (20 mL/min), varredura a 10°C / min XRPD: X'Pert Pro MPD Panalytical, ânodo de Cu, 40kV a 40 mA de corrente Ânodo do tubo: (Cu) Tensão do gerador: 40 kV Corrente do tubo: 40 mA Ângulo de início [2 θ]: 3 Ângulo de fim [2 θ]: 40 Tempo de varredura 2 minutos

Forma 1 e Forma 2

[0071] O Composto X foi preparado como descrito acima e cristali zado a partir de solvente para proporcionar materiais tendo o padrão de difração de raios X de pó (XRPD) na Figura 1 ou a Figura 2. Estes representam dois lotes separados de material cristalino e são aqui re-feridos como Formas 1 e Forma 2. As Formas 1 e 2 possuem alguns picos XRPD semelhantes e o XRPD para a Forma 2 mostra linhas ampliadas, de modo que o produto identificado como Forma 2 pode conter algum material de Forma 1, ou ambas as amostras podem ser misturas de formas cristalinas. Estas duas Formas foram substancialmente anidras, contendo menos de cerca de 1% de água por peso de acordo com a análise de Karl Fischer.

[0072] O Composto X de Forma 1 (1,2 g) foi suspenso em 12 mL de acetona e agitado durante 3 dias a 20°C. A amostra não parece evoluir: enquanto ocorreu algum alargamento de linha, o XRPD do produto (Figura 3) ainda aparece geralmente consistente com a Forma 1.

[0073] A amostra que fornece o XRPD na Figura 1 exibiu uma for te exotermia durante DSC a cerca de 205 °C, e perda gradual de massa através de TGA que representa cerca de 2% de perda em 180°C.

[0074] A amostra que produziu o XRPD na Figura 2 (Forma 2) apresentou forte exotermia durante DSC a cerca de 203°C e perda de massa ligeiramente maior (3.7%) por 160°C em comparação com a Forma 1.

[0075] Lista 1: Lista de picos XRPD para Forma 1 (2Theta: os pi cos mais intensos são sublinhados)

[0076] A Forma 1 também pode ser caracterizada por um subcon junto destes picos, por exemplo, os picos em 6,6, 13,4 e 18,8.

[0077] Listas 2: Lista de picos XRPD para Forma 2 (2Theta: picos mais intensos são sublinhados)

[0078] A Forma 2 também pode ser caracterizada por um subcon junto desses picos, por exemplo, os picos a 7,5, 19,3 e 20,0.

Forma 3

[0079] Composto X da Forma 1 foi suspenso em metanol e em poucos minutos evoluiu para um produto sólido pegajoso. O produto exibiu o padrão XRPD mostrado na Figura 4, e é referido aqui coma Forma 3. Nota-se que uma forma diferente (Forma 8) foi obtida após uma maior agitação em metanol em uma escala maior, como descrito abaixo; assim, a Forma 3 pode ser uma forma transitória ou uma mistura formada à medida que a Forma 1 evolui nestas condições.

[0080] Lista 3: Listagem de pico XRPD para a Forma 3 (2Theta: os picos mais intensos são sublinhados)

[0081] A Forma 3 também pode ser caracterizada por um subcon junto destes picos, por exemplo, os picos em 7,3, 18,9 e 21,2.

Forma 4

[0082] Composto X da Forma 1 (1,2 g) foi suspenso em água (12 mL) e agitado a 20°C por 3 dias. O produto exibiu o padrão XRPD mostrado na Figura 5 e é aqui referido como Forma 4. O XRPD é de uma amostra seca com papel de filtro. A análise TGA para a Forma 4 mostra perda gradual de peso começando com cerca de 40°C e tornando-se rápida em torno de 100°C, para um platô em cerca de 60% do peso original a 120-170°C. Acima dessa temperatura, uma perda gradual de peso é vista. A perda inicial de massa é consistente com a perda de água da Forma 4, e com o DSC, que mostra uma endotermia forte na mesma faixa de temperatura e um platô a cerca de 110-180°C. Da mesma forma, a análise de sorção de vapor dinâmico (DVS) para a Forma 4 mostra uma perda rápida de cerca de 20% da massa da amostra, enquanto a umidade relativa caiu para cerca de 50%, após o qual o ciclo de umidade relativa mais baixa, depois, mais alta, depois mais baixa e depois mais alta, produziu diminuição, aumento, diminui ção e aumento correspondente da massa da amostra com uma massa mínima de cerca de 65% da original e no máximo em cerca de 80% da massa original. A Forma 4 é, portanto, uma forma hidratada, e evolui dependendo de RH. O grau de hidratação da amostra varia com a umidade relativa de uma forma anidra em umidade muito baixa, para um tri-hidrato a uma temperatura relativa de cerca de 20-50%, para um hexahidrato a uma temperatura superior a 60%. Uma amostra de Forma 4 seca a 0% de umidade relativa (RH) produz um XRPD consistente com a Forma 1.

[0083] Lista 4: Listagem de picos XRPD para a Forma 4 (2Theta: os picos mais intensos são sublinhados)

[0084] A Forma 4 também pode ser caracterizada por um subcon junto destes picos, por exemplo, os picos em 7,0, 8,6, 19,3 e 20,9.

Forma 5

[0085] Uma amostra da Forma 4 foi seca sob fluxo de ar seco por um dia, dando um pó que exibia o XRPD mostrado na Figura 6A. Este material é referido aqui como Forma 5. O DSC para a Forma 5 mostra uma exotermia afiada a cerca de 204°C, e a amostra começa a ficar preta em torno desta temperatura, indicando a decomposição. TGA mostra perda a cerca de 7% de massa entre 45°C e 160°C. A análise de Karl Fisher mostra um teor de água de 9,6% para a Forma 5, cor-respondente a um tri-hidratado, mas a amostra parece perder massa com RH abaixo de cerca de 30%; e com RH acima de 80%, ela converte para a Forma 4 dentro de um dia.

[0086] As Formas 1, 4 e 5 do Composto X parecem assim intercon- vertidas à medida que a umidade relativa varia, e pode ser uma mistura dessas formas hidratadas. A Forma 5 é uma forma preferida para o ma-nuseio a temperaturas ambiente em torno de 25°C durante a fabricação, porque cristaliza como um sólido bem-comportado que é mais estável durante o armazenamento e o manuseio do que outras formas, proporci-onando umidade relativa adequada de cerca de 20-50% de HR, de prefe-rência 30-40%, é mantida. Dentro destas faixas de RH, o material é prin-cipalmente tri-hidratado e é adequadamente bem-comportado e estável para manuseio e armazenamento sem precauções especiais.

Preparação de Grande Escala de Forma 5

[0087] Água (20 mL) e THF (40 mL) foram misturados em um fras co e o Composto X (10 g, cerca de 91% puro por HPLC) foi adicionado com agitação a 25°C para proporcionar uma solução amarela clara. Uma amostra de 20 mg da Forma 5 (vide acima) foi adicionada como uma semente, e a mistura foi agitada durante 50 minutos. O THF (140 mL) foi então adicionado lentamente, ao longo de 1 hora e a mistura foi agitada durante mais 2 horas. A suspensão foi filtrada e o bolo úmido foi lavado com água fria (<5°C), depois seco a 20-25°C durante 11 horas a uma pressão de 10 kPa (100 mbar), proporcionando 6,6 g de tri-hidrato de Forma 5 que era puro a 97,8% por HPLC. A amostra produziu o padrão XRPD mostrado na Figura 6B. Ela parece estável quando armazenada a uma umidade relativa de 25-50%, de preferência 30-40% de HR; com umidade relativa inferior ou superior, pode evoluir para diferentes estados hidratados como aqui descrito. A so- bre-secagem produz uma forma que se decompõe à temperatura am-biente dentro de algumas horas, demonstrando ainda a vantagem de estabilidade das formas hidratadas.

[0088] Lista 5: Listagem de picos XRPD para a Forma 5 (2Theta: os picos mais intensos são sublinhados)

[0089] A Forma 5 também pode ser caracterizada por um subcon junto desses picos, por exemplo, os picos em 7,3, 9,3 e 27,8; e opcio-nalmente por picos em 7,3, 9,3, 19,9 e 27,8.

[0090] A Forma 5 (tri-hidratada) pode ser caracterizada por uma es trutura de raio X de um único cristal que seja monoclínico, grupo espacial P2 (1), tendo dimensões da célula unitária a = 13.121 (4) Â; b = 7.400 (3) A; c = 25.017 (8) A (α = 90°; β = 96.037°; Y = 90°); e volume de célula unitária de 2415,6 (14) A3. Os dados para esta estrutura foram coletados em comprimento de onda 1,54178 A, 100 °K; faixa de 3.00° a 68.44°; 47822 reflexões coletadas. A estrutura de um único cristal confirma a presença de três moléculas de água por molécula de Composto X na célula unitária, com a molécula de água localizada nos canais.

Forma 6

[0091] Composto X da Forma 1 (1,2 g) foi suspenso em DMSO: água (razão 25:75 v/v, 12 mL) e agitada a 20°C durante 3 dias. Uma amostra do sólido foi coletada e seca com papel de filtro. O produto exibiu o padrão XRPD mostrado na Figura 7 e é referido aqui como Forma 6. DSC e TGA são consistentes com a perda de solvente até cerca de 130°C e novamente entre 150°C e 200°C, seguido de degradação acima de 200°C. Lista 6: Listagem de picos XRPD para a Forma 6 (2Theta: os picos mais intensos são sublinhados)

[0092] A Forma 6 também pode ser caracterizada por um subcon junto desses picos, por exemplo, os picos em 8,1, 9,2, e 12,8; e, opci-onalmente, por picos adicionais em 21,2 e 24,7.

Forma 7

[0093] O composto X da Forma 6 feito como descrito acima foi se co durante um dia sob fluxo de ar seco. O pó resultante exibiu o padrão XRPD mostrado na Figura 8 e é referido aqui como Forma 7. DSC mostra uma grande exotermia começando com cerca de 134°C e continuando a cerca de 170°C. 1H RMN mostra cerca de 2 equivalentes de DMSO presentes e um pouco de água (3,6%). A titulação de Karl Fisher confirma a presença de 3,6% de água, correspondendo a 1 equivalente. Esta Forma é, portanto, um solvato.

[0094] Lista 7: Listagem de picos XRPD para a Forma 7 (2Theta: os picos mais intensos são sublinhados)

[0095] A Forma 7 também pode ser caracterizada por um subcon- junto destes picos, por exemplo, os picos a 6,7, 7,3 e 20,3.

Forma 8

[0096] Composto X da Forma 1 (1,2 g) foi suspenso em metanol (12 mL) e agitado a 20°C durante 3 dias. Uma amostra do sólido foi coletada e produziu o padrão XRPD mostrado na Figura 9 (sem seca-gem), que é referido aqui como Forma 8. Quando uma amostra da Forma 8 foi seca sob fluxo de ar seco, os picos se ampliaram substancialmente, mas geralmente aparecem aproximadamente nas mesmas posições. O TGA para a amostra seca mostra perda gradual de massa (cerca de 4%) para 140°C, e uma perda de massa mais clara a partir de 170°C. DSC mostra uma forte exotermia em cerca de 172°C que pode estar associada à degradação da amostra.

[0097] LISTA 8: Lista de picos XRPD para a Forma 8 (2Theta: os picos mais intensos são sublinhados)

[0098] A Forma 8 também pode ser caracterizada por um subcon junto destes picos, por exemplo, os picos a 6,2, 21,8 e 25,9.

Forma 9

[0099] Composto X da Forma 3 foi suspenso em acetona e água a 25°C a 40°C. A proporção de água para acetona variou de 2:98 a 10:90. Após o equilíbrio durante 24 horas, obteve-se uma forma de hetero- solvato de baixa cristalinidade em cada caso. Enquanto o XRPD variou com a proporção de água para acetona, todas as amostras produziram espectros XRPD com corcundas largas em vez de picos afiados. A Figura 10 mostra o XRPD para uma amostra equilibrada em 10:90 água/acetona a 40°C durante 24 horas, e a tabela a seguir resume os dados XRPD para esta amostra. Esta forma sólida é aqui referida como Forma

[00100] A Forma 9 pode ser caracterizada por um subconjunto des- tes picos, por exemplo, os picos identificados na tabela acima como intensidade relativa "forte", por exemplo, picos a 6,3 e 12,6 e, opcio-nalmente, um ou mais dos picos na tabela com intensidade relativa média, tais como picos em 22,1, 22,3, 23,1, 27,0 e 27,5.

Forma 10

[00101] Composto X da Forma 1 (anidrato) foi exposto a uma umidade relativa de 43% por um dia ou mais. O produto cristalino parece ser um sesquihidrato (composto X-1,5 H2O) com base na determinação do teor de água. Nota-se que a Forma 5, o tri-hidratado, em condições se-melhantes, seria estável, no entanto, quando se inicia com o anidrato, parece equilibrar-se sob a forma de uma temperatura semelhante a estas condições e permanece naquela forma durante pelo menos 14 dias quando mantido na mesma umidade relativa. Esta forma cristalina produz o espectro XRPD mostrado na Figura 11, e é aqui referido coma Forma 10. A tabela abaixo resume os principais picos no XRPD desta amostra.

[00102] Forma 10 pode ser caracterizada pelos picos XRPD na ta bela acima com intensidades relativas médias a fortes, por exemplo, picos em 6,6, 11,0, 13,3, 15,6, 16,5, 18,6, 22,2, 23,4 e 27,4. Pode também ser caracterizada por um subconjunto destes picos, por exemplo, os picos com uma intensidade relativa de 40 ou superior, por exemplo, picos a 6,6, 11,0, 16,5, 22,2 e 23,4, ou por um subconjunto de pelo menos 3 ou 4 destes picos.

Forma 11

[00103] Composto X da Forma 5, o tri-hidrato, foi exposto a umidade relativa de 22% durante cerca de 3 dias para prover um sólido cristalino caracterizado como um di-hidrato (Composto X-2H2O) com base na aná-lise do teor de água. Este material retorna prontamente para o tri-hidrato (Forma 5) se exposto à umidade relativa acima de cerca de 40%. O di- hidrato, aqui referido como Forma 11, produziu o espectro de XRPD mostrado na Figura 12: os picos principais nesse espectro de XRPD es- tão listados na tabela a seguir.

[00104] A Forma 11 é caracterizada pelos picos XRPD nesta tabela com intensidades relativas de 20 ou superior, ou alternativamente aqueles picos com uma intensidade relativa de pelo menos 25, por exemplo, picos a 7,4, 9,7, 17,0, 19,5, 22,2, 26,3, 28,1 e 29,3, ou um subconjunto de 3, 4 ou 5 destes picos com relação intensidade de pelo menos 26 ou pelo menos 28 na tabela.

Forma 12

[00105] Composto X da Forma 5 foi exposto ao ar com uma umidade relativa de 65% durante cerca de 3 dias, proporcionando um material cristalino caracterizado como um tetra-hidrato com base na análise de conteúdo de água. Este material retorna prontamente ao tri-hidrato (Forma 5) se a umidade relativa for reduzida para cerca de 40%. O tetra-hidrato, aqui referido como Forma 12, produziu o espectro de XRPD mostrado na Figura 13: os picos principais no espectro XRPD estão listados na tabela a seguir.

[00106] Forma 12 pode ser caracterizada por picos XRPD com uma intensidade relativa de pelo menos 40 na tabela acima, isto é, picos XRPD a 7,3, 17,8, 19,0, 19,8, 20,4, 24,0, 24,7, 24,9, 27,2, 27,8 e 32,1. Alternativamente, pode ser caracterizada por um subconjunto de pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos, 5 destes picos. A Forma 12 também pode ser caracterizada pelos picos de XRPD descritos como forte intensidade relativa na tabela, isto é, picos em 7.3, 19.0, 20.4, 24.0, 24.7 e 27.2.

[00107] As amostras dos hidratos do Composto X, incluindo as Formas 5, 11 e 12, mostraram-se interconversas facilmente à medida que a umidade relativa variou de cerca de 22% a cerca de 92%. Nota- se que a 92% de umidade relativa, o Composto X parece ser uma mistura de uma forma de cristal caracterizada como hexa-hidrato misturada com o tetra-hidrato da Forma 12. Em comparação, o anidrato (Forma 1) converte-se preferivelmente em sesquihidrato à medida que a umidade relativa aumenta para 43%, e evolui para tri-hidratato e tetra- hidratado em umidades relativas mais altas.

Composições Farmacêuticas de Composto X

[00108] Composto X (500 mg) e L-arginina (332,5 mg) são combinadas em um frasco para injetáveis. Sacarose (cristalina, sacarose livre de pirogênio: 1000 mg) juntamente com água adequada para injeção (8,00 mL). O pH da solução é ajustado, se necessário, usando HCl a 1,0 N ou NaOH a 1,0 N para chegar a um pH de 5,0 ± 0,5, de preferência um pH de 5,0 ± 0,2. Isto proporciona uma solução contendo cerca de 62,5 mg/mL de Composto X como um sal de arginina. Esta solução pode ser filtrada se necessário e pode ser liofilizada para prover um sólido branco ou esbranquiçado (liofilizado). O sólido liofili- zado pode ser reconstituído com água estéril ou um veículo aquoso farmaceuticamente aceitável tal como solução salina isotônica ou dextrose para proporcionar uma solução adequada para administração intravenosa. O liofilizado deve ser armazenado em um recipiente que exclui a luz para proteger o liofilizado da fotodegradação. Este processo pode ser ampliado ou reduzido para prover doses unitárias para armazenamento e distribuição, ou material a granel que pode ser pro-cessado conforme desejado. Para aumentar a escala, o controle de temperatura é importante: o Composto X em solução deve ser mantido a uma temperatura abaixo de 10°C, de preferência entre 0°C e 8°C, e mais preferivelmente entre 2°C e 8°C, antes da adição de arginina ou outra base, como o composto é submetido à degradação hidrolítica em água na ausência de uma base ou fora da faixa de pH de 4-6.

[00109] Em uma modalidade, uma mistura de acordo com o exemplo acima é preparada como descrito utilizando o tri-hidrato (Forma 5) do Composto X em uma quantidade que contém cerca de 500 mg de Composto X anidro e é liofilizado em um frasco que é então selado para armazenamento e distribuição, de preferência usando uma tampa roscada de borracha de butila (por exemplo, tampa roscada D777), onde o liofilizado em cada frasco contém cerca de 500 mg de Composto X. Os frascos de liofilizado são armazenados em ou abaixo da temperatura ambiente até a utilização.

[00110] Uma formulação alternativa apropriada para injeção IV contém Composto X (100 mg) e 0,5N de bicarbonato de sódio (0,75 mL) e ajustador de pH, se necessário (NaOH a 1 N ou HCl a 1 N conforme necessário) para levar o pH a cerca de 5,5 (entre pH 5 e pH 6), mais uma quantidade de água para injeção suficiente para atingir uma concentração final de 100 mg/mL.

Estabilidade de Composto X

[00111] O composto X é estável em forma sólida, mas os sais do Composto X são mais estáveis em solução do que o ácido livre; assim, tornou-se importante identificar sais farmaceuticamente aceitáveis adequados para serem utilizados para administração. Os sais do Composto X foram preparados por adição de uma base (1,0 ou 2,0 equiv.) ao Composto X em água e liofilização da solução. Os sólidos assim obtidos parecem ser amorfos por XRPD. Desta forma, a tentativa de formação de sais do Composto X foi feita com hidróxido de sódio, (L)-lisina, (L)-arginina, hidróxido de cálcio, meglumina e hidróxido de magnésio. Verificou-se que os sais de sódio e os sais de arginina eram particularmente estáveis e, portanto, desejáveis como formas para administração em meios aquosos tipicamente utilizados para injeções intravenosas e infusões.

[00112] Amostras do sal dissódico e do sal de di-(L)-arginina como sólidos foram submetidas a testes de estabilidade a 25°C e 40°C. A amostra de sal de sódio era 97,2% pura por HPLC inicialmente, e após 6 semanas a 25°C, ainda era 96,2% pura. O mesmo material mantido a 40°C foi puro de 94,8% após 3 semanas e 93,6% puro após 6 semanas. As impurezas significativas que aparecem ou aumentam durante o estudo aparecem nos tempos de retenção relativos (RRT) 0,34 e 1,11 (com o composto X definido como RRT = 1).

[00113] O sal de arginina era 97,3% puro por HPLC inicialmente e era 96,3% puro após 6 semanas a 25°C. A 40°C, sua pureza caiu para 95,1% após 3 semanas e 94,2% após 6 semanas. As impurezas significativas que aparecem ou aumentam durante este estudo aparecem em tempos de retenção relativos (RRT) 1,09, 1,11 e 1,13 (com o Composto X definido como RRT = 1). Os traços de HPLC para as amostras desses estudos de estabilidade após 6 semanas a 25°C e 40°C, respectivamente, são mostrados nas Figuras 10 e 11. O traço mais baixo em cada Figura é uma amostra usada para medir o limite de quantificação (LOQ); o próximo traço acima que representa a amostra de Composto X utilizada para a formação de sal; o próximo traço acima desse é o sal da arginina após 6 semanas; e o próximo traço (superior) é para o sal de sódio após 6 semanas.

[00114] Condições HPLC para os estudos de estabilidade (Figuras 10 e 11): Sistema Agilent 1290 com detector de UV a 260 nm Coluna acquity HSS T3, 100mm x 2,1 mm ID; tamanho de partícula de 1,8 μm (fornecido por Waters) Temperatura da coluna: 40°C Fases móveis A: 0,05% de TFA em água B: 0,05% TFA em metanol Taxa de fluxo: 0,45 mL/min Gradiente (razão A/B): 97:3 durante 8 minutos; 75:25 durante 3 minutos; 0:100 durante 1 minuto.

[00115] O Composto X foi também encontrado para degradar foto- quimicamente; assim, o Composto X deve ser armazenado em recipientes escuros ou opacos para melhor vida útil. Em uma modalidade da invenção, o Composto X é embalado em um recipiente que reduz substancialmente a exposição à luz, de preferência em uma atmosfera com uma umidade relativa de 25-50% de umidade e mais preferivelmente com uma umidade relativa de 30-40% ou 30-45%.

Atividade Biológica Triagens Bacterianas e Culturas

[00116] Os isolados bacterianos foram cultivados a partir de temperatura congelada de -70°C em estoques por duas passagens durante a noite consecutivas a 35°C no ar ambiente com ágar de sangue a 5% Remel, Lenexa, Kans.). Quality control and P. aeruginosa ATCC 27853) é do American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Md.) e PAO1 foi recebido de Dr. K. Poole. Construção de cepas isogênicas de Escherichia coli Cepas NB27273-CDY0026 (parental), NB27273- CDY0033 (KPC2) e NB27273-CDY0030 (SHV12).

[00117] A cepa NB27273 (BW25113 pspB :Kmr) foi obtida a partir da coleção de inserção do transposon Keio. A cepa tem o gene pspB substituído por um marcador de resistência à canamicina (BW25113 pspB::Kmr). Esta cepa foi curada do transposon em pspB via recombinase FLP utilizando metodologia publicada. A cepa resultante, BW25113 pspB, foi utilizada como hospedeiro para vetores multicópia que expressam β-lactamases-chave. Os plasmídeos multicópias que dirigem a expressão constitutiva de β-lactamases foram estabelecidos da seguinte forma: Os genes otimizados de códon codificadores de E. coli KPC2 e SHV12 -lactamases foram criados por DNA2.0 (Palo Alto, CA). Cada um dos fragmentos sintéticos foi projetado para conter os sítios de restrição NotI e NcoI em seus terminais, permitindo a ligação em um derivado pET28a (+) digerido com NotI/NcoI para expressão proteica. As inserções nestes vetores serviram como DNA modelo para amplificação por PCR do gene que codifica KPC2 e SHV12, utilizando os pares de iniciadores E225 (tcgcCTCGAGgcgactgcgctgacgaatttgg) (SEQ ID NO: 1) e E202 (aATcGAATTCttactgaccattaacgcccaagc) (SEQ ID NO: 2) e E227 (tcgcCTCGAGgcgagcccgcaaccgctgga) (SEQ ID NO: 3) e E204 (aATcGAATTCttaacgctgccagtgctcaatc) (SEQ ID NO: 4), respec-tivamente. As sequências de nucleotídeos de códon optimizado e a informação de reconhecimento de iniciadores estão apresentadas a seguir: SHV12 ATGGGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGAAGTTCTG TTCCAGGGGCCCGCGAGCCCGCAACCGCTGGAGCAGATCAAGCA GTCTGAGAGCCAGCTGAGCGGCCGTGTGGGTATGATCGAGATGG ATCTGGCTTCCGGCCGTACGCTGACGGCATGGCGTGCCGACGAA CGTTTCCCGATGATGTCGACCTTTAAAGTTGTTCTGTGTGGTGCG GTCTTGGCACGTGTAGACGCGGGTGACGAACAACTGGAGCGCAA GATCCATTACCGCCAACAGGACTTGGTCGACTACAGCCCGGTTAG CGAAAAGCACCTGGCGGATGGCATGACCGTGGGTGAATTGTGCG CCGCTGCGATTACCATGAGCGACAATAGCGCGGCTAATCTGCTGT TGGCGACCGTTGGTGGCCCAGCGGGCTTGACCGCATTTCTGCGT CAAATCGGCGATAATGTTACGCGTCTGGATCGCTGGGAAACGGA GCTGAACGAGGCACTGCCGGGTGATGCCCGTGATACCACGACTC CTGCTAGCATGGCAGCGACCCTGCGTAAACTGCTGACCAGCCAG CGTCTGAGCGCACGTAGCCAACGCCAGCTGCTGCAATGGATGGT GGATGACCGCGTGGCGGGTCCGCTGATCCGCTCCGTCCTGCCAG CAGGCTGGTTCATTGCGGACAAAACTGGTGCCTCTAAGCGTGGTG CGCGTGGTATCGTCGCGCTGCTGGGTCCGAACAACAAAGCCGAA CGTATTGTGGTTATCTATCTGCGCGACACCCCGGCAAGCATGGCC GAGCGCAACCAGCAAATTGCGGGCATTGGTGCGGCACTGATTGA GCACTGGCAGCGTTAACGCCGGCG (SEQ ID NO:5) E227 TCGCCTCGAGGCGAGCCCGCAACCGCTGGA (SEQ ID NO:6) E204 AATCGAATTCTTAACGCTGCCAGTGCTCAATC (SEQ ID NO:7) REV. COMP. E204 GATTGAGCACTGGCAGCGTTAAGAATTCGATT (SEQ ID NO:8) KPC2 ATGGGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGAAGTTCTG TTCCAGGGGCCCGCGACTGCGCTGA CGAATTTGGTGGCCGAGCCGTTCGCGAAATTGGAGCAAGATTTTG GTGGTTCGATCGGTGTCTACGCGAT GGACACCGGTAGCGGTGCCACCGTGAGCTACCGTGCCGAAGAGC GTTTTCCGCTGTGTAGCTCTTTCAAG GGTTTTÇTGGÇÇGÇAGÇÇGTGÇTGGÇAÇGÇAGÇÇAAÇAGÇAAGÇ GGGCCTGCTGGACACCCCGATCCGTT AÇGGÇAAAAATGÇGÇTGGTTÇÇGTGGAGÇÇÇGATTAGÇGAAAAG TAÇÇTGAÇÇAÇÇGGÇATGAÇGGTGGÇ GGAGTTGAGÇGÇTGÇGGÇGGTTÇAGTATTÇÇGATAAÇGÇTGÇGG ÇAAATÇTGÇTGÇTGAAAGAAÇTGGGÇ GGTÇÇAGÇGGGTÇTGAÇGGÇTTTÇATGÇGTTÇTATTGGÇGAÇAÇÇ ACCTTTCGCTTGGACCGCTGGGAGC TGGAGCTGAACAGCGCGATTCCGGGCGACGCACGTGATACGAGC AGCCCGCGTGCAGTGACCGAGAGCCT GCAGAAGCTGACCCTGGGCAGCGCACTGGCCGCACCGCAGCGC CAACAGTTCGTCGATTGGCTGAAGGGT AACACCACCGGTAACCATCGTATTCGCGCAGCGGTCCCGGCTGA TTGGGCAGTTGGTGACAAGACTGGTA CGTGCGGCGTTTATGGTACGGCGAATGACTACGCGGTTGTTTGG CCTACGGGTCGTGCGCCGATCGTCCT GGCGGTGTATACCCGTGCTCCGAACAAAGACGATAAACACTCCGA AGÇGGTÇATÇGÇÇGÇAGÇAGÇGÇGT CTGGCCCTGGAAGGCTTGGGCGTTAATGGTCAGTAACGCCGGCG (SEQ ID NO:9) E225 TÇGÇÇTÇGAGGÇGAÇTGÇGÇTGAÇGAATTTGG (SEQ ID NO:10) E202 AATÇGAATTÇTTAÇTGAÇÇATTAAÇGÇÇÇAAGÇ (SEQ ID NO:11) REV. ÇOMP. E202 GÇTTGGGÇGTTAATGGTÇAGTAAGAATTÇGATT (SEQ ID NO:12) SUBLINHADO = DNA ENÇODING BL

[00118] Os produtos de PÇR foram então digeridos com XhoI e EcoRI e ligados ao plasmídeo digerido de forma similar pAH63-pstS (BlaP). O plasmídeo pAH63-pstS (BlaP) é um derivado do plasmídeo pAH63 (J Bacteriol: 183 (21): 6384-6393) produzido por clonagem do promotor TEM-1 (bla) e região codificante do peptídeo de sinal do plasmídeo pBAD (J Bacteriol, 1995 Jul. 177 (14): 4121-30) no plas- mídeo pAH63. Este fragmento foi amplificado por PÇR a partir de pBAD utilizando o par de iniciadores E192 (ttcaÇTGÇAGtgaacgttg- cgaagcaacggÇ) (SEQ ID NO: 13) e E194 (TÇGAggatcctcgagag- caaaaacaggaaggcaaaatgccg) (SEQ ID NO: 14), digerido com PstI e BamHI e inserido no plasmídeo pAH63 digerido de forma semelhante. Portanto, a expressão de β-lactamases a partir de construtos baseados em pAH63-pstS (BlaP) é constitutiva e a sequência de sinal é fornecida para direcionar essas proteínas para o periplasma. Os vetores baseados no plasmídeo pAH63 são utilizados para inserção no genoma em uma única cópia, no entanto, para prover níveis de expressão mais elevados para permitir uma detecção mais sensível da suscetibilidade dos compostos às β-lactamases, as inserções de expressão contidas nesses vetores foram movidas para a replicação de vetor multicópia pBAD-Kan (J Bacteriol. 1995 Jul. 177 (14): 412130). Para conseguir isso, as inserções que abrangem os genes da β- lactamase, com o promotor TEM associado e as sequências de sinal, foram amplificadas por PCR a partir de seus vetores correspondentes usando o iniciador E269 (ccgTCTAGAcggatggcctttttgcgtttc) (SEQ ID NO: 15) e E202 (aATCGAATTCttactgaccattaacgcccaagc) (SEQ ID NO: 16) para o construto KPC2 e E204 (aATcGAATTCt- taacgctgccagtgctcaatc) (SEQ ID NO: 17) para o construto SHV12. Estes fragmentos foram então digeridos com XbaI e EcoRI, e cada um foi inserido em pBAD18-kan que tinha sido digerido com as mesmas enzimas para gerar um par de vetores multicópia expressando KPC2 e SHV12, respectivamente. Estes vetores foram transformados em BW25113 pspB para gerar cepas NB27273-CDY0033 (expressando KPC2) e NB27273-CDY0030 (expressando SHV12). O vetor pBAD18-kan também contém a região do promotor TEM e a sequência do sinal (mas não possui nenhum gene intacto de β- lactamase) e foi transformado em BW25113 pspB usando protocolos padrão para gerar a cepa de controle NB27273-CDY0026. A expressão das β-lactamases foi confirmada pela verificação da suscetibilidade diminuída aos antibióticos de teste exemplares que são substratos conhecidos de KPC2 ou SHV12.

Testes de suscetibilidade

[00119] As Concentrações Inibitórias Mínimas (MIC) foram determinadas pelo método de microdiluição de caldo de acordo com as diretrizes do Instituto Clínico e de Laboratórios (CLSI). Em resumo, as culturas bacterianas frescas durante a noite foram suspensas em solução salina estéril e ajustadas para um padrão de turbidez de McFarland de 0,5. As suspensões bacterianas foram então diluídas em caldo Mueller-Hinton ajustado por cátion (MHB II, BBL) para produzir um inóculo final de aproximadamente 5x105 unidades formadoras de colônias (CFU)/mL. Uma placa mestre de antibióticos foi preparada a uma concentração equivalente a cem vezes a maior concentração final desejada em 100% de sulfóxido de dimetila (DMSO). A placa de antibiótico mestre foi então diluída por diluição em série duas vezes com uma pipeta multicanal. A série de diluição resultante dos compostos foi diluída 1:10 com água estéril levando a uma concentração final de 10% de DMSO. Um volume de 10 μL da série de diluição da droga foi transferido para placas de ensaio de 96 poços. As placas de ensaio foram inoculadas com 90 μL de suspensões bacterianas e incubadas a 35-37°C durante 20 horas. As pla-cas de ensaio foram lidas usando um leitor de placas de microtitula- ção (Molecular Devices) a 600 nm, bem como por observação visual com um espelho de leitura. A concentração mais baixa do composto que impediu o crescimento visível foi registrada como MIC. O desempenho do ensaio foi monitorado testando aztreonam contra cepas de controle de qualidade de laboratório de acordo com as diretrizes do CLSI.

[00120] Compostos de referência: para comparação, os seguintes compostos de monobactama conhecidos são aqui utilizados: Composto de referência 1: Aztreonam Composto de referência 2: Carumonam Composto de referência 3: BAL30072 Composto de referência 4: Aicuris WO2013110643 Tabela A: Concentrações Inibitórias Mínimas (MIC) contra cepas isogênicas de E. coli, portadoras de vários determinantes de re-sistência. Cepa 1: E.coli N B27273-CDY0026 (parental) Cepa 2: E.coli NB27273-CDY0033 (KPC2) Cepa 3: E.coli NB27273-CDY0030 (SHV12)

[00121] Os dados na Tabela A mostram que o Composto X tem boa potência antibacteriana contra E. coli, incluindo cepas que apresentam forte resistência a vários antibióticos conhecidos de monobactama e sulfactama.

[00122] Os dados de atividade adicionais para o Composto X são fornecidos na tabela a seguir. O Composto X foi testado na cepa de E. coli 25922 e uma de E. coli contendo KPC-2 (Cepa 2 acima, que é uma carbapenemase conhecida de Klebsiella pneumoniae) e exibiu estas Concentrações Inibitórias (MIC), em mg/mL.

Claims (15)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é um sal de (L)-arginina do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2- oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilide- no)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico.

2. Composto, caracterizado pelo fato de que é uma forma sólida liofilizada de um sal de sódio do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol- 4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoaze- tidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico.

3. Composto, caracterizado pelo fato de que é uma forma sólida hidratada do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2- (((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)ami- no)etilideno)amino)óxi)ciclopropanocarboxílico.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que consiste em 50% ou mais do material de um tri- hidrato de ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo- 4-((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)ami- no)óxi)ciclopropanocarboxílico.

5. Método para preparar a forma sólida hidratada, como de-finida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende contatar ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4- ((2-oxo-oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)ami- no)óxi)ciclopropanocarboxílico com uma atmosfera com umidade relativa entre 25% e 50% a uma temperatura entre 20°C e 30°C.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 4, e pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuti- camente aceitável.

7. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ci- clopropanocarboxílico (Forma 1) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 6,6, 13,4 e 18,8.

8. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ci- clopropanocarboxílico (Forma 2) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó seguintes (expressos em graus 2θ): 7,5, 19,3 e 20,0.

9. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ci- clopropanocarboxílico (Forma 3) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7,3, 18,9 e 21,2.

10. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ci- clopropanocarboxílico (Forma 4) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7,0, 8,6, 19,3 e 20,9.

11. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ci- clopropanocarboxílico (Forma 5) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 7,3, 9,3 e 27,8.

12. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ciclo- propanocarboxílico (Forma 6) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 8,1, 9,2 e 12,8; e, opcionalmente, por picos adicionais em 21,2 e 24,7.

13. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ci- clopropanocarboxílico (Forma 7) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 6,7, 7,3 e 20,3.

14. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de que é do ácido 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-oxo-2-(((3S,4R)-2-oxo-4-((2-oxo- oxazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etilideno)amino)óxi)ci- clopropanocarboxílico (Forma 8) que exibe pelo menos os seguintes picos característicos de difração de raios X de pó (expressos em graus 2θ): 6,2, 21,8 e 25,9.

15. Uso do composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou da forma cristalina, como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de uma infecção bac- teriana Gram-negativa.