ES2928152T3

ES2928152T3 - Forma cristalina de un inhibidor de beta-lactamasa y método de preparación de la misma

Info

Publication number: ES2928152T3
Application number: ES18884744T
Authority: ES
Inventors: Cheng Li; Zhigang Huang; Charles Z Ding; Weidong Li
Original assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: EP3719020A4; CA3084099A1; CN111417633B; EP3719020B1; JP2021504416A; WO2019105479A1; US20200385385A1; CA3084099C; EP3719020A1; CN111417633A; JP6974614B2; US11180501B2

Abstract

En la presente divulgación se describe una forma de cristal de un inhibidor de β-lactamasa y un método de preparación del mismo, así como una aplicación de la forma de cristal en la preparación de un fármaco inhibidor de β-lactamasa. (YO) (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Forma cristalina de un inhibidor de p-lactamasa y método de preparación de la misma

Esta solicitud reivindica el beneficio de la siguiente solicitud:

CN201711251386.3, Fecha de presentación: 1 de diciembre de 2017.

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a una nueva clase de inhibidores de p-lactamasa, divulga específicamente un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Antecedentes de la invención

Hay varios mecanismos por los cuales las bacterias desarrollan resistencia a los antibióticos p-lactámicos, y uno de los principales mecanismos es la producción de enzimas que pueden hidrolizar el anillo p-lactámico y así inactivar los antibióticos. Las bacterias también pueden alterar selectivamente el objetivo de los antibióticos. Por ejemplo, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina ha desarrollado resistencia múltiple que está asociada con la producción de nuevas PBP2a, aumento de la síntesis de PBP y disminución de la afinidad por el fármaco. La plactamasa puede unirse rápidamente a ciertos antibióticos p-lactámicos resistentes a enzimas, lo que permite que el fármaco permanezca en el espacio periplásmico de la membrana citoplásmica y no alcance el objetivo para ejercer un efecto antibacteriano. Además, la membrana externa de las bacterias G no es fácilmente permeable a ciertos antibióticos p-lactámicos, lo que da como resultado una resistencia inespecífica de bajo nivel. También hay algunos sistemas de exocitosis activa en la membrana citoplásmica de las bacterias, por los cuales las bacterias liberan activamente fármacos al exterior. Por lo tanto, la combinación de un antibiótico p-lactámico y un inhibidor de plactamasa es el método clínicamente más eficaz. Las bacterias pueden producir diversos tipos de p-lactamasas, que se pueden clasificar en cuatro clases: A, B, C y D según sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos. Las enzimas de las clases A, B y D catalizan la hidrólisis con serina como sitio activo, y las enzimas de la clase B escinden el anillo por uno o más átomos de metal en el sitio activo.

El primer inhibidor de la p-lactamasa de alta actividad bien conocido es el clavulanato de potasio, y su combinación con amoxicilina todavía está de moda en el mercado hasta la fecha. Otros dos importantes inhibidores de la plactamasa en el mercado son sulbactam y tazobactam. Estos tres fármacos tienen en común un anillo p-lactámico muy activo en sus estructuras, que es el sitio activo de estos inhibidores. Aunque estos tres fármacos están de moda en el mercado, su espectro antibacteriano es muy estrecho. Solo son eficaces sobre las p-lactamasas de clase A y D, pero son completamente ineficaces en las enzimas de clase C y las enzimas KPC que representan un papel importante en las enzimas de clase A.

En febrero de 2015, la FDA aprobó un nuevo inhibidor de la p-lactamasa denominado avibactam (NXL-104). Este fármaco que contiene una nueva estructura diazabicíclica tiene un espectro antibacteriano más amplio que los tres inhibidores de la p-lactamasa de la generación anterior descritos anteriormente. Las patentes de los inhibidores de la p-lactamasa, incluyendo WO2009133442, WO2009091856, WO2010126820, WO2012086241, WO2013030733, WO2013030735, WO2013149121, WO2013149136, WO2013180197, WO20140191268, WO2014141132, WO2014135931, WO2015063653, WO2015110885 y US20140296526, han divulgado un gran número de nuevos compuestos diazabicíclicos, entre los que MK-7655 y OP-0595 son dos nuevos fármacos que han entrado en etapa de ensayo clínico. MK-7655 ha entrado en la etapa de ensayo clínico de Fase III y OP-0595 ha entrado en la etapa de ensayo clínico de Fase I. OP-0595 tiene excelente actividad in vitro y es propiedad de Roche Pharmaceuticals. Por lo tanto, los inhibidores diazabicíclicos serán una nueva dirección para el desarrollo de inhibidores de p-lactamasas.

Contenido de la invención

Una forma cristalina A del compuesto de fórmula (I), en la que el patrón de difracción de rayos X en polvo de la misma comprende picos de difracción característicos en el siguiente ángulo 20: 16,053 ± 0,2°, l6,53 ± 0,2°, 22,782 ± 0,2° y 25,742 ± 0,2 °.

Una forma cristalina A del compuesto de fórmula (I), en la que el patrón de difracción de rayos X en polvo de la misma comprende picos de difracción característicos en el siguiente ángulo 20: 16,053 ± 0,2°, 16,53 ± 0,2°, 18,501 ± 0,2°, 21,302 ± 0,2 °, 21,778 ± 0,2°, 22,782 ± 0,2°, 25,742 ± 0,2° y 27,833 ± 0,2°.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el patrón de XRPD de la forma cristalina A es como se muestra en la Fig. 1.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, los datos analíticos del patrón de XRPD de la forma cristalina A se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la curva de calorimetría diferencial de barrido de la forma cristalina A tiene un pico exotérmico a 221,11 ± 3°C.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el patrón de DSC de la forma cristalina A es como se muestra en la Fig. 2.

Se puede ver en el patrón de DSC que hay un pico exotérmico cerca de 221,11°C.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la curva de análisis termogravimétrico de la forma cristalina A tiene una pérdida de peso del 0,5689% a 194,61 ± 3°C.

El patrón de TGA muestra que la forma cristalina A tiene una pérdida de peso de 0,5689% cuando se calienta hasta 194,61°C, y comienza a producirse una gran pérdida de peso después de calentarse hasta 200°C. La forma cristalina A no contiene agua de cristalización ni disolvente de cristalización y tiene buena estabilidad térmica.

El patrón de DVS de la misma es como se muestra en la Fig. 4. Los resultados muestran que la forma cristalina A tiene un aumento de peso higroscópico de 0,2910% a 25°C/80% de HR, mostrando que la forma cristalina A tiene una baja higroscopicidad.

La presente divulgación también proporciona un método para preparar una forma cristalina A del compuesto de fórmula (I), que comprende:

(a) añadir el compuesto de fórmula (I) a un disolvente y calentar hasta 55-60°C hasta que se disuelva por completo;

(b) enfriar lentamente hasta 0°C con agitación;

(c) agitar durante 10-16 horas para la cristalización;

(d) filtrar y secar por succión;

en donde, el disolvente es agua pura.

La presente divulgación también proporciona un uso de la forma cristalina A que se describe anteriormente o la forma cristalina preparada por el método que se describe anteriormente en la fabricación de un inhibidor de p-lactamasa para tratar una infección bacteriana.

Efecto técnico

La presente divulgación se caracteriza principalmente por la introducción de una cadena lateral completamente nueva de un grupo guanidinoxi en el anillo diazabicíclico. En comparación con un grupo amino, el grupo guanidinoxi tiene más sitios de enlaces de hidrógeno, lo que proporciona mejores propiedades fisicoquímicas, como la solubilidad en agua. Por otro lado, el grupo guanidinoxi tiene un pKa de 8,83, que está cerca del pKa de un grupo amino (como el grupo amino terminal en la cadena lateral de la lisina con un pKa de 8,95), y es mucho más pequeño que el pKa de un grupo guanidino convencional (como el de la arginina con un pKa de 12,48), por lo tanto, el compuesto puede mantener la misma estabilidad química que OP-0595. Los datos experimentales de la actividad in vivo e in vitro del compuesto proporcionado en la presente divulgación también muestran que el compuesto de fórmula (I) tiene una ventaja sobre OP-0595 en la actividad. La forma cristalina descrita en la presente divulgación tiene ventajas técnicas tales como una fácil preparación, buena estabilidad y es menos propensa a la transformación polimórfica y es beneficiosa para la posterior producción y aplicación de fármacos.

Definiciones y explicaciones

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y expresiones usados en este documento tienen los siguientes significados. Un término o expresión específicos no deben considerarse indefinidos o poco claros en ausencia de una definición particular, sino que deben entenderse en el sentido ordinario. Cuando aparezca un nombre comercial en este documento, se pretende hacer referencia a su correspondiente artículo o el ingrediente activo del mismo.

Los compuestos intermedios de la presente divulgación se pueden preparar mediante diversos métodos sintéticos conocidos por los expertos en la técnica, incluidas las realizaciones descritas a continuación, las realizaciones formadas mediante la combinación de las realizaciones descritas a continuación con otros métodos de síntesis química y alternativas equivalentes bien conocidas para los expertos en la técnica. Realizaciones preferidas incluyen, pero no se limitan a, las realizaciones de la presente divulgación.

Las reacciones químicas de las realizaciones de la presente divulgación se llevan a cabo en un disolvente adecuado, y el disolvente debe ser adecuado para el cambio químico y los reactivos y materiales requeridos para ello de la presente divulgación. Para obtener los compuestos de la presente divulgación, a veces es necesario que los expertos en la técnica modifiquen o seleccionen los pasos sintéticos o los esquemas de reacción en función de las realizaciones existentes.

La presente invención se describirá específicamente a continuación por medio de realizaciones, pero el alcance de la presente invención no se limita a las mismas.

Todos los disolventes usados en la presente divulgación están disponibles comercialmente y pueden usarse directamente sin purificación adicional.

La presente divulgación emplea las siguientes abreviaturas: MW representa microondas; ta representa la temperatura ambiente; ac representa solución acuosa; DCM representa diclorometano; THF representa tetrahidrofurano; DMSO representa dimetilsulfóxido; NMP representa W-metilpirrolidona; EtOAc representa acetato de etilo; EtOH representa etanol; MeOH representa metanol; dioxano representa 1,4-dioxano; HOAc representa ácido acético; Boc representa f-butoxicarbonilo, Cbz representa benciloxicarbonilo, siendo ambos grupos protectores de amino; Boc2O representa bicarbonato de di-ferc-butilo; DIPEA representa diisopropiletilamina; TEA o Et³N representa trietilamina; BnNH2 representa bencilamina; PMBNH2 representa p-metoxibencilamina; KOAc representa acetato de potasio; NaOAc representa acetato de sodio; Cs²CO³representa carbonato de cesio; K2CO3 representa carbonato de potasio; NaHCO³representa bicarbonato de sodio; Na²SO⁴representa sulfato de sodio; piridina representa piridina; NaOH representa hidróxido de sodio; TEA o Et³N representa trietilamina; NaH representa hidruro de sodio; LiHMDS representa bis(trimetilsilil)amida de litio; /-PrMgBr representa bromuro de isopropilmagnesio; f-BuOK representa f-butóxido de potasio; f-BuONa representa f-butóxido de sodio; PD²(dba)³representa tris(dibencilidenacetona)dipaladio; Pd(PPh³)⁴representa trifenilfosfina-paladio; Pd(dppf)ChCH2Cl2 representa dicloruro de [1,1'-bis(difenilfosfina)ferroceno]paladio.diclorometano; Pd(AcO)2 representa acetato de paladio; Pd(PPh3)2Cl2 representa dicloruro de bis(trifenilfosfina)paladio; Pd(PPh³)³Cl representa cloruro de tris(trifenilfosfina)rodio; Pd(OH)2 representa hidróxido de paladio; Xantphos representa 4,5-bis(difenilfosfina)-9,9-dimetilxanteno; Xphos representa 2 diciclohexilfosfo-2',4',6'-triisopropilbifenilo; BINAP representa (±)-2,2'-bis-(difenilfosfino)-1,1 '-binaftaleno; Xantphos representa 4,5-bis-(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno; Xphos-Pd-G1 representa cloro(2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropil-1,1'-bifenil)[2-(2-aminoetil)fenil)]paladio(II); Xphos-PD-G2 representa cloro(2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropil-1,1 '-bifenil)[2-(2'-amino-1, 1 '-bifenilo)]paladio(II); Xphos-Pd-G3 representa metanosulfonato(2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropil-1, 1 '-bifenil)[2-(2'-amino-1, 1 '-bifenil)]paladio(II); I2 representa yodo; LiCl representa cloruro de litio; HCl representa ácido clorhídrico; ácido maleico representa ácido maleico.

Los compuestos se nombran manualmente o mediante el programa ChemDraw®, y los compuestos disponibles comercialmente usan sus nombres de directorio de proveedores.

El instrumento y el método de análisis de la presente divulgación:

1.1 Difractómetro de rayos X en polvo (XRPD)

Modelo de instrumento: difractómetro de rayos X Bruker D8 advance

Método de detección: se usaron alrededor de 10-20 mg de la muestra para la detección por XRPD.

Los parámetros detallados de XRPD fueron los siguientes:

Tubo de rayos X: Cu, ka, (A = 1,54056 A).

Voltaje del tubo de rayos X: 40 kV, corriente del tubo de rayos X: 40 mA

Rendija de divergencia: 0,60 mm

Rendija detectora: 10,50 mm

Rendija antidispersión: 7,10 mm

Intervalo de escaneo: 4-40 grados

Tamaño de paso: 0,02 grados

Tiempo de paso: 0,12 segundos

Velocidad de rotación de la bandeja de muestra: 15 rpm

1.2 Calorímetro diferencial de barrido (DSC)

Modelo de instrumento: calorímetro diferencial de barrido TA Q2000

Método de detección: las muestras (alrededor de 1 mg) se colocaron en un crisol de aluminio de DSC para la detección y se calentaron de 30°C a 300°C con una velocidad de calentamiento de 10°C/min en condiciones de 50 ml/min de N2.

1.3 Analizador Termogravimétrico (TGA)

Modelo de instrumento: analizador termogravimétrico TA Q5000

Método de detección: las muestras (de 2 mg a 5 mg) se colocaron en un crisol de platino de TGA para la detección y se calentaron desde temperatura ambiente hasta 210°C con una velocidad de calentamiento de 10°C/min en condiciones de 25 ml/min de N2.

1.4 Sorción dinámica de vapor (DVS)

Modelo de instrumento: analizador de sorción dinámica de vapor SMS DVS Advantage

Condiciones de detección: las muestras (10 mg a 15 mg) se colocaron en una bandeja de muestras de DVS para la detección.

Los parámetros de DVS detallados son los siguientes:

Temperatura: 25°C

Equilibrio: dm/dt = 0,01%/min (más corto: 10 min, más largo: 180 min)

Secado: 120 minutos a 0% de HR

Gradiente de HR (%) para la prueba: 10%

Intervalo de gradiente de HR (%) para la prueba: 0%-90%-0%

La higroscopicidad se evaluó usando las siguientes escalas:

* Aumento de peso higroscópico a 25 ± 1°C y 80 ± 2% de HR

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es el patrón de XRPD medido por radiación Cu-Ka de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I).

La Fig. 2 es el patrón de DSC de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I).

La Fig. 3 es el patrón de TGA de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I).

La Fig. 4 es el patrón de DVS de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I).

La Fig.5 muestra los resultados de prueba del compuesto de fórmula (I) sobre Klebsiellapneumoniae productora de p-lactamasa tipo KPC..

Descripción detallada de la realización preferida

Para comprender mejor el contenido de la presente divulgación, las siguientes realizaciones ilustran adicionalmente la presente divulgación, pero la presente divulgación no se limita a ellas.

Realización 1: Síntesis del compuesto de fórmula (I)

Paso 1:

La materia prima 1-A (50 g, 26,62 mmol), W-hidroxiftalimida (8,69 g, 53,24 mmol) y trietilamina (6,73 g, 66,55 mmol) se disolvieron en 100 ml de W,W-dimetilformamida. La solución de reacción se calentó hasta 50°C y se agitó durante 16 horas. La solución de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, se vertió en 100 ml de agua de hielo con agitación y se filtró por succión. El sólido obtenido se lavó tres veces con 10 ml de agua fría y se secó para obtener el compuesto 1-B.

Paso 2:

El compuesto 1-B (6,0 g, 17,03 mmol) se suspendió en 400 ml de diclorometano y 150 ml de metanol y se añadió a esto hidrato de hidracina al 85% (1,71 g, 34,06 mmol, 1,66 ml). La solución de reacción se agitó a 25°C durante 18 horas y se filtró. La torta de filtración obtenida se lavó con 50 ml de acetato de etilo y el filtrado se concentró hasta sequedad. El residuo obtenido se suspendió con 40 ml de éter de petróleo/acetato de etilo (3:1), luego se filtró y se suspendió dos veces más. Los filtrados obtenidos se combinaron y concentraron para dar el compuesto 1-C.

Paso 3:

El compuesto 1-C (980 mg, 10,64 mmol) se disolvió en 50 ml de diclorometano y se enfrió hasta -10°C, luego se añadió trietilamina (1,08 g, 10,64 mmol, 1,47 ml) con una jeringa, seguido de la adición gota a gota de una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (2,32 g, 10,64 mmol) en 30 ml de diclorometano. La solución de reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente (25°C) y se agitó durante 20 horas. Después de la concentración, el residuo se purificó mediante una columna de gel de sílice (mezcla de acetato de etilo/éter de petróleo, el gradiente era 30%-50%) para obtener el compuesto 1-D.

Paso 4:

El compuesto 1-D (300 mg, 1,56 mmol), ácido (2S,5R)-6-benciloxi-7-oxi-1,6-diazabiciclo[3.2.1]oct-2-carboxílico (431,23 mg, 1,56 mmol) (el método de síntesis hace referencia a la patente WO2012172368A1), EDCI (388,77 mg, 2,03 mmol), HOBt (274,02 mg, 2,03 mmol) y diisopropiletilamina (201,62 mg, 1,56 mmol, 272,46 pl) se añadieron secuencialmente a 20 ml de diclorometano. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente (25°C) durante 20 horas, se diluyó con 30 ml de diclorometano, se lavó dos veces con 15 ml de agua y una vez con 15 ml de salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. El filtrado se concentró hasta sequedad. El producto bruto obtenido se purificó mediante una columna de gel de sílice (mezcla de acetato de etilo/éter de petróleo, el gradiente era 30%-50%) para obtener el compuesto 1-E.

Paso 5:

El compuesto 1-E (760,00 mg, 1,69 mmol) se disolvió en diclorometano (7,00 ml), seguido de la adición de ácido trifluoroacético (3,08 g, 27,01 mmol, 2,00 ml) a 20°C. La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas, se concentró, se diluyó con acetato de etilo (50 ml), se lavó con bicarbonato de sodio saturado (50 ml) y se lavó una vez con salmuera saturada (50 ml). La fase orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró para dar el compuesto 1-F.

Paso 6:

El compuesto 1-F (200,00 mg, 570,83 pmol) y (E)-(tere-butoxicarbonil)amino(metileno)carbamato de tere-butilo (177,16 mg, 570,83 pmol) se disolvieron en acetonitrilo (2 ml). La solución de reacción se agitó a 20°C durante 16 horas. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se concentró. El residuo obtenido se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (elución en gradiente de acetato de etilo/éter de petróleo = 0-2/1) para obtener el compuesto 1-G.

Paso 7:

El compuesto 1-G (300,00 mg, 506,21 pmol) se disolvió en isopropanol (3,00 ml)/agua (3,00 ml), seguido de la adición de paladio sobre carbono húmedo (50,00 mg, 10%). La mezcla se agitó a 18-28°C durante 2 horas en atmósfera de hidrógeno y se filtró para obtener una solución del compuesto 1-H en isopropanol/agua, que se utilizó directamente en la siguiente reacción.

Paso 8:

Se añadieron complejo de trióxido de azufre-trimetilamina (69,24 mg, 497,49 pmol) y trietilamina (10,07 mg, 99,50 pmol, 13,79 pl) a una solución del compuesto 1-H (250,00 mg, 497,49 pmol) en isopropanol (3,00 ml)/agua (3,00 ml). La mezcla obtenida se agitó a 18-28°C durante 16 horas. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se lavó con acetato de etilo/éter de petróleo (2/1,6 ml, dos veces). Se recogió la fase acuosa y se añadió hidrogenosulfato de tetrabutilamonio (168,43 mg, 496,07 pmol). La mezcla obtenida se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 horas y se extrajo con acetato de etilo (15 ml, dos veces). El extracto obtenido se lavó con salmuera saturada (10 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró para obtener el compuesto 1-I.

Paso 9:

El compuesto 1-I (200,00 mg, 242,71 pmol) se disolvió en diclorometano anhidro (2,00 ml), la solución se enfrió a 0°C en atmósfera de nitrógeno, se añadió ácido trifluoroacético (1,54 g, 13,51 mmol, 1,00 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 2 horas, luego se agitó a 25°C durante otras 4 horas. Luego, la solución de reacción se concentró bajo la atmósfera. El residuo obtenido se suspendió tres veces con acetonitrilo (2 ml) para obtener un producto bruto, que se purificó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución para obtener el compuesto de fórmula (I).

RMN ¹H (400 MHz, D2O) 4,15 (s, 1H), 4,10-4,08 (m, 2H), 4,03-3,99 (m, 3H), 3,26 (d, j= 12 Hz, 1H), 3,09 (d, j= 12 Hz, 1H), 2,13-1,99 (m, 2H), 1,94-1,74 (m, 2H); CLEM (ESI) m/z: 383,1(M+1).

Realización 2: Preparación de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)

1,4 kg del compuesto de fórmula (I) en 7 l de agua pura se calentaron hasta 55-60°C, después de la disolución completa, la solución se enfrió lentamente hasta 0°C con agitación y se agitó durante 12 horas para la cristalización. La mezcla se filtró y se secó por succión para obtener la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I).

Realización 3: Estudio de higroscopicidad de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)

Material experimental: la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)

Método experimental: se colocó una muestra (10-15 mg) en una bandeja de muestra de DVS para análisis y se analizó mediante el método de sorción dinámica de vapor (DVS).

Resultado experimental: aumento de peso higroscópico AW = 0,2910%

Conclusión experimental: la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) tiene baja higroscopicidad y la XPRD muestra que la forma cristalina no ha cambiado.

Realización 4: Estudio sobre el polimorfismo del compuesto de fórmula (I)

Material experimental: el compuesto de fórmula (I)

Método experimental:

1. Se pesaron tres muestras de aproximadamente 35 mg del compuesto de fórmula (I) y se colocaron en botellas de vidrio de borosilicato de 1,5 ml, respectivamente, seguido de la adición de 200 pl de disolvente (véase la Tabla 2 para el esquema de disolventes). La mezcla obtenida se mezcló uniformemente con ultrasonidos y luego se colocó en un oscilador termostático, se agitó a 40°C en la oscuridad durante 2 días y se centrifugó rápidamente. El sólido obtenido se sometió a detección por XRPD (producto húmedo) y luego se secó en un secador de vacío a 30°C durante aproximadamente 15 horas. El producto seco obtenido se sometió a detección por XPRD (producto seco).

Tabla 2: Esquema de disolventes 1 para el estudio del polimorfismo del compuesto de fórmula (I)

2. Se pesaron tres muestras de aproximadamente 35 mg del compuesto de fórmula (I) y se colocaron en botellas de vidrio de borosilicato de 1,5 ml, respectivamente, seguido de la adición de 600 pl de un disolvente (véase la Tabla 3 para el esquema de disolventes). La mezcla obtenida se mezcló uniformemente con ultrasonidos y luego se colocó en un oscilador termostático, se agitó a 40°C en la oscuridad durante 2 días. Luego, las muestras se colocaron en una campana extractora y se evaporaron hasta sequedad. Las muestras obtenidas se sometieron a detección por XRPD (producto húmedo). Las muestras se colocaron en un secador de vacío y se secaron a 30°C durante aproximadamente 15 horas. Las muestras secadas obtenidas se sometieron a detección por XRPD (producto seco).

Tabla 3: Esquema de disolventes 2 para el estudio del polimorfismo del compuesto de fórmula (I)

Resultados experimentales: véanse la Tabla 2 y la Tabla 3.

Conclusión experimental: No se ha observado ninguna forma cristalina nueva después de la suspensión y la evaporación, y la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) es estable.

Realización 5: Prueba de solubilidad de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)

Material experimental: la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)

Método experimental: se pesaron aproximadamente 2,0 mg de muestra y se colocaron en una botella de vidrio de borosilicato de 1,5 ml, seguido de la adición de los siguientes disolventes con una pistola de pipeteo, respectivamente, y se realizó el tratamiento ultrasónico apropiado para la disolución. La prueba se llevó a cabo a temperatura ambiente y la disolución se detectó a simple vista.

Resultados experimentales: véase la Tabla 5.

Conclusión experimental: la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) tiene una baja solubilidad en diversos disolventes orgánicos y tiene cierta solubilidad en agua y disolventes alcohólicos.

Tabla 4: Esquema de disolventes para la prueba de solubilidad de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)

Tabla 5: Resultados de la prueba de solubilidad de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)

* La suspensión de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) en etanol-agua (relación en volumen 3:1) se disolvió y se convirtió en una solución transparente después de aproximadamente 15 horas.

Realización 6: Ensayo in vitro de concentración inhibidora sinérgica (CIS) contra aislados clínicos chinos Objetivo experimental:

Este experimento fue diseñado para evaluar la actividad inhibidora del compuesto de fórmula (I) frente a la carbapenemasa principal.

Método experimental:

La concentración inhibitoria mínima (CIM) del compuesto de fórmula (I) frente a cepas productoras de carbapenemasa clínicamente aisladas se determinó mediante el método de microdilución del caldo.

1. Prueba de sensibilidad a fármacos: la CIM de fármacos antibacterianos de uso común contra bacterias clínicamente aisladas se determinó mediante el método de microdilución del caldo según el método de prueba de sensibilidad antimicrobiana descrito en la edición de 2016 del documento del U. S. Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI).

2. Cepas: 8 cepas productoras de carbapenemasa KPC-2, 8 cepas productoras de metaloenzimas NDM-1, 6 cepas productoras de carbapenemasa oXa y todas las cepas eran Klebsiella pneumoniae aislada clínicamente.

3. Concentración: concentración de los fármacos antibacterianos: 0,06 pg/ml-128 pg/ml, 12 concentraciones en total; la concentración de inhibidor enzimático se fijó en 4 pg/ml.

4. Cepas de control de calidad: las cepas de control de calidad para la prueba de sensibilidad a fármacos incluían Escherichia coli ATCC 25922 y ATc C 35218.

Resultados experimentales:

Conclusión:

La combinación del compuesto de fórmula (I) y un antibiótico exhibió una fuerte actividad antibacteriana contra Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa de tipo KPC-2, NDM-1 u OXA-181 clínicamente aislada. Especialmente para las bacterias productoras de carbapenemasa de tipo NDM-1, la actividad inhibidora del compuesto (1) fue significativamente mejor que la de avibactam.

Realización 7: modelo de infección pulmonar en ratones

Objetivo experimental:

Este experimento fue diseñado para determinar si el compuesto de fórmula (I) tiene efectos farmacológicos en un modelo de infección pulmonar en ratones y evaluar adicionalmente si el compuesto de fórmula (I) tiene una ventaja significativa sobre el compuesto de referencia OP-0595 en efecto farmacológico.

Materiales experimentales:

Ratones hembra CD-1 de aproximadamente 7 semanas de edad, con un peso de 26-28 g; se inyectó ciclofosfamida a una dosis de 150 mg/kg 4 días antes de la infección y 100 mg/kg adicionales 1 día antes de la infección; la bacteria para la infección fue Klebsiella pneumoniae (ATCC ^bAA-1705, KPC-2). El compuesto de fórmula (I) y el compuesto de referencia OP-0595 se sintetizaron en el laboratorio.

Procedimiento experimental:

Se infectaron ratones hembra CD-1 con Klebsiella pneumoniae por instilación intranasal. A cada ratón se le instilaron 50 pl de líquido bacteriano a través de la cavidad nasal a una dosis de 3,14E+07 UFC por ratón. A las 2 h, 4 h, 6 h y 8 h después de la infección, cada grupo de ratones se trató con un compuesto correspondiente o una combinación de compuestos mediante inyección intraperitoneal.

A las 10 h después de la infección, los ratones de los grupos 1,2 y 3 fueron sacrificados y los pulmones se extirparon y se colocaron en tubos de centrífuga de 50 ml que contenían 10 ml de solución salina normal estéril, los tubos se colocaron en hielo húmedo y se transfirieron al laboratorio BSL-2 para el recuento de UFC. A las 20 h después de la infección, los ratones de los grupos 4, 5 y 6 fueron sacrificados y tratados según el mismo procedimiento.

Los pulmones se trituraron con un homogeneizador IKAT10 (la velocidad máxima fue de 20S, repetida una vez). El homogeneizado se diluyó en forma de gradiente y se colocó en forma de puntos sobre una placa de agar de triptonasoja. La placa se colocó en una incubadora a 37°C para la incubación bacteriana. Después de 24 horas, la placa se extrajo y se contó el número de colonias individuales cultivadas en cada homogeneizado con una dilución en gradiente en la placa, y se calculó la cantidad de carga bacteriana en el pulmón de cada ratón.

Esquema experimental:

Tabla 7: Evaluación de la eficacia del compuesto de fórmula (I) y el compuesto de referencia OP-0595 en el modelo de infección del músculo del muslo de ratón

Resultados experimentales:

Según el esquema experimental en la Tabla 7, los resultados del efecto farmacológico se muestran en la Fig. 5. Puede verse en la figura de los resultados del efecto farmacológico que la cantidad de carga bacteriana en el grupo del compuesto de fórmula (I) en el modelo de ratón se redujo entre 0,5 y 1,5 logs en comparación con el grupo de referencia del compuesto OP-0595 en dos dosis diferentes. El compuesto de fórmula (I) es significativamente más potente que el compuesto de referencia OP-0595.

El experimento de inhibición bacteriana in vitro, el experimento de inhibición enzimática in vitro y el experimento del efecto farmacológico in vivo evaluaron la realización desde diferentes aspectos. El compuesto de fórmula (I) en la realización muestra ventajas significativas sobre el compuesto de referencia OP-0595. En la situación actual en la que se necesitan urgentemente nuevos fármacos clínicos para combatir las infecciones bacterianas resistentes a los fármacos cada vez más graves, el compuesto de la realización es una clase de fármacos con un gran potencial para resolver este problema. Se puede predecir que en comparación con el compuesto de referencia actualmente preferido, OP-0595, el compuesto de fórmula (I) puede mostrar un mejor efecto clínico en la futura aplicación clínica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una forma cristalina A del compuesto de fórmula (I), en la que el patrón de difracción de rayos X en polvo de la misma comprende picos de difracción característicos en el siguiente ángulo 20: 16,053 ± 0,2°, 16,53 ± 0,2°, 22,782 ± 0,2° y 25,742 ± 0,2 °,

2. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en la reivindicación 1, en la que el patrón de difracción de rayos X en polvo de la misma comprende picos de difracción característicos en el siguiente ángulo 20: 16,053 ± 0,2°, 16,53 ± 0,2°, 18,501 ± 0,2°, 21,302 ± 0,2°, 21,778 ± 0,2°, 22,782 ± 0,2°, 25,742 ± 0,2° y 27,833 ± 0,2°.

3. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en la reivindicación 2, en la que el patrón de XRPD de la misma es como se muestra en la Fig. 1.

4. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la curva de calorimetría diferencial de barrido de la misma tiene un pico exotérmico a 221,11 ± 3°C.

5. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en la reivindicación 4, en la que el patrón de DSC de la misma es como se muestra en la Fig. 2.

6. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la curva de análisis termogravimétrico de la misma tiene una pérdida de peso de 0,5689% producida a 194,61 ± 3°C.

7. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en la reivindicación 6, en la que el patrón de TGA de la misma es como se muestra en la Fig. 3.

8. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el patrón de DVS de la misma es como se muestra en la Fig. 4.

9. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) tiene un aumento de peso higroscópico de 0,2910% a 25°C/80% de HR.

10. Un método para preparar una forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en la reivindicación 1, que comprende:

(a) añadir el compuesto de fórmula (I) a un disolvente y calentar hasta 55-60°C hasta que se disuelva por completo; (b) enfriar lentamente hasta 0°C con agitación;

(c) agitar durante 10-16 horas para la cristalización;

(d) filtrar y secar por succión;

en donde el disolvente es agua pura;

11. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) preparada por el método que se define en la reivindicación 10, para uso como un inhibidor de p-lactamasa para el tratamiento de una infección bacteriana.

12. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) preparada por el método que se define en la reivindicación 10, para uso como un inhibidor de p-lactamasa para el tratamiento de una infección por bacterias productoras de carbapenemasa.

13. La forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) preparada por el método que se define en la reivindicación 10, para uso como un inhibidor de p-lactamasa para el tratamiento de una infección por Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa KPC-2, Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa NDM-1 o Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa OXA-181.