ES2785033T3

ES2785033T3 - Uso de PDCD1LG1 y CXCL9 como marcadores para el pronóstico del cáncer

Info

Publication number: ES2785033T3
Application number: ES18159684T
Authority: ES
Inventors: Jérôme Galon; Franck Pages; Wolf-Herman Fridman
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes
Priority date: 2005-10-19
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2020-10-05
Anticipated expiration: 2026-09-28
Also published as: EP2420839A2; EP2420839A3; ES2374783T3; ES2674560T3; EP2420839B1; EP2420840B1; EP2420837B1; US20190178892A1; ES2398907T3; EP2420836A2; ES2469102T3; ES2469103T3; EP1943520A1; ES2480690T3; EP2241891A1; EP2420841B1; EP2241891B1; EP2733493B1; JP5256038B2; EP2420837A3

Abstract

Un método in vitro para el pronóstico de pacientes para la progresión de un cáncer, método que comprende las etapas siguientes: a) cuantificar, en una muestra de tejido tumoral de dicho paciente, al menos dos marcadores biológicos indicativos del estado de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente frente al cáncer; y b) comparar el valor obtenido en la etapa a) para dichos al menos dos marcadores biológicos con un valor de referencia predeterminado para los mismos marcadores biológicos; valor de referencia predeterminado que se correlaciona con un pronóstico específico de progresión de dicho cáncer, en donde dichos al menos dos marcadores biológicos comprenden PDCD1LG1 y CXCL9.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de PDCD1LG1 y CXCL9 como marcadores para el pronóstico del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del pronóstico del resultado de un cáncer en un paciente.

Más precisamente, esta invención se refiere al pronóstico del resultado de un cáncer en un paciente, pronóstico que se basa en la cuantificación de uno o varios marcadores biológicos que son indicativos de la presencia de, o alternativamente el nivel de, la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente contra dicho cáncer.

Antecedentes de la invención

Dado que el cáncer es la segunda causa de mortalidad, en particular en Europa y en los Estados Unidos, se están invirtiendo una gran cantidad de esfuerzos y recursos económicos en el desarrollo de estrategias terapéuticas nuevas. Sin embargo, la necesidad de herramientas de diagnóstico y pronóstico fiables es una etapa limitante de la aplicación exitosa de una terapia del cáncer. La mejor forma de manifestarlo es mediante el hecho de que la mayor parte de los marcadores de cáncer conocidos actualmente son muy poco fiables.

Hasta la fecha, los tumores malignos se clasifican generalmente según el sistema TNM. El sistema de clasificación TNM (para “Tumor-Node-Metastasis”) utiliza el tamaño del tumor, la presencia o ausencia de tumores en ganglios linfáticos regionales, y la presencia o ausencia de metástasis distantes, para asignar un estadio al tumor (AJCC Cancer Staging Manual, Lippincott, 5a edición, págs. 171-180, 1997). El estadio asignado se utiliza como base para la selección de una terapia apropiada y para propósitos de pronóstico. Cuando se aplica para la estadificación de cánceres colorrectales, el sistema TNM permite la distinción entre (T) el grado de invasión de la pared intestinal, que varía de T0 a T4, (N) el grado de implicación de ganglios linfáticos, que oscila entre N0 y N3 y (M) el grado de metástasis, que varía de M0 a M1.

Para cánceres colorrectales, se puede asignar un estadio al tumor también según la clasificación de Duke. La clasificación de Duke permite la distinción, como mínimo, entre cuatro estadios de tumor principales, respectivamente (A) tumor confinado en la pared del intestino, (B) extensión del tumor a través de la pared del intestino, (C) implicación de ganglios regionales y (D) existencia de metástasis distantes.

Sin embargo, las clasificaciones clínicas anteriores, aunque son útiles, son imperfectas y no permiten un pronóstico fiable del resultado de los cánceres. Esto es particularmente cierto para los cánceres asignados como Clase B de Duke, que presentan una gravedad muy variable.

En lugar de la estadificación clínica convencional, en la técnica se han dado a conocer un gran número de marcadores biológicos, incluyendo genes y proteínas, que serían potencialmente útiles para el diagnóstico o el pronóstico de una gran variedad de cánceres. De forma destacable, se han descrito diversos métodos para proporcionar patrones de expresión génica que serían potencialmente útiles como herramientas para el diagnóstico o pronóstico del cáncer, incluyendo para el diagnóstico o pronóstico de cánceres colorrectales.

En este contexto, diversos trabajos de la técnica anterior se dirigieron hacia la demostración de una relación entre (i) la presencia de, o el nivel de expresión de, diversos marcadores biológicos de la respuesta inmune del huésped y (ii) la existencia de un cáncer o el estadio de desarrollo de un cáncer, principalmente con el objetivo de descifrar los mecanismos que subyacen a la evasión de la respuesta inmune por parte de los tejidos tumorales, y eventualmente con el objetivo de sugerir estrategias de inmunoterapia contra el cáncer adecuadas.

De forma ilustrativa, Nistico et al. (1999, Int. J. Cancer, Vol. 84: 598-603) sugirieron la existencia de una respuesta inmune espontánea contra el producto del oncogén erbB-2 en una paciente con cáncer de mama positivo para HLA-A2, cuya eficacia sería dependiente de la expresión de la molécula HLA de clase I del tumor y de la localización de linfocitos T CD3+, es decir, en tejido intratumoral (IT) o peritumoral (PT). Según estos autores, estos resultados podrían dar lugar a la identificación de nuevos parámetros que podrían ser útiles para definir estrategias inmunoterapéuticas más específicas y más efectivas contra el cáncer de mama.

Philips et al. (2004, British Journal of Surgery , Vol. 91: 469-475) han demostrado que los linfocitos infiltrantes de tumor en el cáncer colorrectal con inestabilidad de microsatélites estaban activados y eran citotóxicos, mediante el ensayo de (i) las relaciones de ARNm de CD8/CD3 y (ii) la producción de CD3, CD4, CD8, IL-2Ra y la proteína Granzima B en el tejido tumoral, aunque no existía una correlación significativa entre los números de copia del ARNm de los marcadores de las células T y los recuentos inmunohistoquímicos. Estos autores sugirieron que, en el cáncer colorrectal con inestabilidad de microsatélites, se podían producir péptidos mutados inmunogénicos, que inducirían una respuesta inmune antitumoral, y concluían que dicho modelo de cáncer podría ayudar en la comprensión de las interacciones huésped-tumor, notablemente con el objetivo de mejorar las estrategias inmunoterapéuticas.

Maki et al. (2004, J. Gastroenterology and Hepatology, Vol. 19: 1348-1356) habían mostrado una alteración del sistema inmune celular en pacientes con carcinoma hepatocelular, que se evaluaba por una expresión reducida de las proteínas CD3Z y CD28 por parte de las células T, así como por una actividad incrementada de la caspasa-3 en las células T con modulación descendente por CD28, sugiriendo la existencia de apoptosis de células T en pacientes con HCC. Según estos autores, se podría establecer una nueva modalidad de terapia inmune antitumoral, que estaría dirigida a la activación de dichas células T y a evitar su apoptosis. Grujil et al. (1999, British Journal of Cancer, Vol. 79 (7/8): 1127-1132) también habían informado acerca de una expresión reducida de CD3Z en células T infiltrantes de carcinoma cervical. Estos autores sugirieron que, con el fin de que las estrategias de vacunación fueran exitosas, debería ser esencial identificar y contrarrestar, en primer lugar, los mecanismos que dan lugar a esta pérdida de CD3Z.

La alteración de la respuesta inmune del huésped, mediante la evaluación de la expresión de las proteínas CD3, CD4, CD8 y ligando Fas en linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), también se mostró en pacientes con carcinoma oral (Reichert et al. (2002, Clinical Cancer Research, Vol. 8: 3137-3145). Prado-García et al. (2005, Lung Cancer, Vol. 47: 361-371) que realizaron observaciones similares, habían estudiado los mecanismos de evasión de adenocarcinoma de pulmón midiendo los porcentajes de células CD3+, CD4+ y CD8+ en sangre periférica y efusión pleural, y adicionalmente la expresión de proteínas CD27, CD28, CD45RO, CD45RA, granzima A, Fas y perforina en los subconjuntos de células T CD8+. Estos autores habían encontrado un bloqueo de la respuesta inmune y sugirieron que eran necesarios estudios adicionales para entender los diversos mecanismos mediante los cuales las células de adenocarcinoma inhiben las células T CD8+ en los procesos de iniciación, crecimiento e invasión del carcinoma de pulmón, con el objetivo de desarrollar tratamientos mejorados para enfermedades malignas de pulmón.

Kuss et al. (2003, British Journal of Cancer, Vol. 88: 223-230) que realizaron observaciones similares, determinaron un subconjunto extendido de células T efectoras CD8+CD45RO-CD27 dotadas de una señalización TcR disfuncional, en pacientes con carcinoma de células escamosas. Estos autores sugirieron estudios adicionales para confirmar directamente la hipótesis que uniría los defectos de señalización observados con la apoptosis y la rápida renovación de linfocitos en pacientes con cáncer.

Además, Valmori et al. (2002, Cancer Research, Vol. 62: 1743-1750) han descubierto la presencia de un subconjunto de células T PBL CD45RA+CCR7-CD8+ que tiene una actividad citolítica en pacientes con melanoma. Estos autores sugirieron que una vacunación antitumoral mejorada debería estar dirigida hacia la estimulación y mantenimiento de dicha respuesta inmune efectora en un estadio temprano de la evolución de la enfermedad, en un momento en el que dicha respuesta podría ser efectiva para erradicar la enfermedad residual mínima y para evitar recidivas.

Los trabajos anteriores que se han descrito anteriormente describen la utilización de numerosos marcadores biológicos de la respuesta inmune en el curso de la comprensión de los mecanismos de la respuesta inmune contra diversos cánceres. Sin embargo, estos trabajos anteriores no proporcionan datos relacionados con una relación estadística significativa entre (i) la presencia de, o el nivel de expresión de, estos marcadores biológicos y (ii) un pronóstico del resultado de la enfermedad.

Otros estudios han presentado datos que establecen una correlación estadística entre la expresión de marcadores biológicos de la respuesta inmune del huésped y el resultado de diversos cánceres.

De forma ilustrativa, Ishigami et al. (2002, Cancer, Vol. 94 (5): 1437-1442) mostraron que la expresión reducida de CD3-Z se correlacionaba de forma negativa con la implicación de los ganglios linfáticos, la profundidad de la invasión, y el estadio clínico del carcinoma gástrico. De forma destacable, estos autores habían mostrado que una expresión reducida de CD3-Z se correlacionaba con una tasa de supervivencia a los 5 años reducida de los pacientes, pero solo para pacientes a los que se les había diagnosticado “Estadio IV” de carcinoma gástrico.

Oshokiri et al. (2003, Journal of Surgical Ontology, Vol. 84: 224-228) mostraron una unión estadística entre la infiltración de un nido de células cancerígenas por células T CD8+ y la supervivencia de pacientes afectados con carcinoma del conducto biliar extrahepático (EBDC). Estos autores mostraron que la inmunoreactividad de las células T CD8+ intratumorales demostraba una correlación significativa con (i) menos metástasis en los ganglios linfáticos, (ii) invasión venosa y perineural reducida, y (iii) valores de estadificación pTNM mejores. De este modo, estos autores mostraron que el nivel de infiltración de células T CD8+ se correlacionaba bien con el método clínico-patológico pTNM convencional y que dicho marcador biológico era fiable para la predicción de la supervivencia de pacientes con EBDC.

Además, Diederischen et al. (2003, Cancer Immunol. Immunother., Vol. 52: 423-428) mostraron que los pacientes colorrectales con relaciones bajas CD4+/ CD8+ en TIL tenían una evolución clínica mejor, con una supervivencia significativamente mayor a los 5 años, independientemente del estadio de Dukes y la edad.

De forma adicional, Zhang et al. (2003, New England Journal of Medicine, Vol. 348 (3): 203-213) mostraron, mediante inmunotinción para CD, que la presencia o ausencia de células T intratumorales se correlaciona con el resultado clínico de carcinoma de ovario avanzado después de quimioterapia citorreductora y adyuvante. Estos resultados se obtuvieron a través de ensayos de inmunotinción de criosecciones de tumor con anticuerpos monoclonales contra CD3, CD4, CD8, CD83, CD45, CD45RO, CD19, CD57 y CD11c, así como a través de citometría de flujo de células procedentes de muestras de tumor frescas utilizando anticuerpos monoclonales contra HLADR, CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD45, IgG1 e IgG2a. Estos autores habían detectado la presencia o ausencia de células T infiltrantes de tumor CD3+ dentro de islotes de células de tumor y en estroma peritumoral. Estos autores han descubierto que los pacientes cuyos tumores contenían células T tenían tanto una duración media de (i) supervivencia libre de progresión y (ii) supervivencia total que era estadísticamente superior a la de pacientes cuyos tumores no contenían células T. Estos autores sugirieron validar adicionalmente la utilización de la detección de células T intratumorales en la clasificación y tratamiento de pacientes con carcinoma de ovario.

Aunque los trabajos de la técnica anterior reportados anteriormente describen una buena correlación entre (i) la presencia de, o el nivel de, algunos marcadores biológicos de la respuesta inmune y (ii) el resultado de cánceres, los resultados de la mayor parte de estos estudios de la técnica anterior también muestran que la utilización de dichos marcadores biológicos se consideraba exclusivamente como una confirmación de una estadificación del cáncer con métodos de estadificación clínico-patológicos convencionales, o como una información adicional a dichos métodos de estadificación de cáncer convencionales. Por ejemplo, se encontró que el marcador biológico utilizado por Ishigami et al. (2002, Supra) era utilizable exclusivamente en pacientes con carcinoma gástrico a los que ya se les había diagnosticado como “Estadio IV” de la enfermedad. De forma similar, Zhang et al. (2003, Supra) concluyeron que eran necesarios estudios prospectivos para validar la detección de células T (CD3+) intratumorales en la clasificación y tratamiento de pacientes con carcinoma de ovario. De forma similar, Diederichsen et al. (2003, Supra) describieron la relación CD4+/CD8+ como un marcador biológico que tenía un valor de pronóstico de supervivencia en cáncer colorrectal: Sin embargo, estos autores no sugirieron que dicho marcador biológico podría ser suficiente por sí mismo para el pronóstico del cáncer, sin datos de estadificación simultáneos generados mediante métodos de estadificación clínico-patológicos convencionales.

Solo Oshikiri et al. (2003, Supra) consideraron que el marcador biológico que habían utilizado, concretamente la infiltración de un nido de células cancerosas por células T CD8+, consistiría un marcador fiable para una supervivencia más larga de pacientes con EBDC, dado que, de forma destacable, dicho marcador se correlacionaba bien con valores de estadificación pTNM. Sin embargo, Oshikiri et al. solo utilizaron dicho marcador biológico como una confirmación de una estadificación del cáncer anterior mediante un método de estadificación clínico-patológico convencional. Adicionalmente, los valores de correlación estadística encontrados por Oshikiri et al. (2003) entre (a) el número de células T CD8+ intratumorales y (b) diversos parámetros clínicos como (i) menores metástasis en ganglios linfáticos (P=0,005) , (ii) invasión venosa reducida (P=0,0021), (iii) invasión perineural reducida (P=0,0083) y (iv) valores de estadificación pTNM mejores (P=0,0356), fueron objetivamente demasiado bajos para sugerir a los expertos en la técnica que utilizaran este marcador biológico para un pronóstico del cáncer exacto y fiable sin la utilización concomitante de los datos de la estadificación clínica-patológica convencional.

Por lo tanto, no existe ninguna descripción en la técnica de métodos fiables para el pronóstico del cáncer que utilicen exclusivamente marcadores biológicos de la respuesta inmune adaptativa del huésped, sin la necesidad de datos clínico-patológicos concomitantes generados mediante métodos de estadificación del cáncer convencionales.

Además, actualmente, no existe ningún marcador fiable disponible que permita la predicción del resultado del cáncer, en pacientes con cáncer colorrectal en un estadio temprano (estadio I/II).

Ohshima et al. (2003, Leuk Lymphoma, 44(2):329-336) describen la expresión del receptor de quimioquina CXCR3 y su ligando, mig, en linfomas gástricos y de la zona marginal tiroidea.

Weng et al. (2003, American Association for Cancer Research. Proceedings of the Annual meeting, AACR, US, 44: 558) describen la expresión diferencial de CXCL9 (mig), CXCL10(IP-10) y CXCR3 durante la inmunoterapia adoptiva.

Kunz et al. (1999, J Pathol, 189(4) :552-558) encontraron que la fuerte expresión del linfoatrayente quimioquina CXC Mig está asociada a una fuerte infiltración de células T en el melanoma maligno humano.

Teruya-Feldstein et al. (1997, Blood, 90(10): 4099-4105) relatan el papel de Mig e IP-10 en la necrosis tisular y el daño vascular asociados con la enfermedad linfoproliferativa positiva para el virus de Epstein-Barr.

Según Saudemont et al. (2005, Blood, American Society of Hematology, US, 105(6): 2428-2435), las células NK que son activadas por CXCL10 pueden matar a las células tumorales durmientes que son resistentes a la lisis mediada por CTL y pueden expresar B7-H1 que estimula a las células T.

Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad de métodos mejorados para el pronóstico del resultado de cánceres, incluyendo cánceres colorrectales, que estadifiquen la enfermedad de una forma más precisa y más fiable que los métodos disponibles actualmente, que son esencialmente, si no exclusivamente, métodos de estadificación clínicopatológicos.

De forma destacable, la disponibilidad de métodos de pronóstico mejorados permitiría una selección mejor de los pacientes para tratamientos terapéuticos apropiados, incluyendo antes y después de cirugía. De hecho, para un gran número de cánceres que incluyen cánceres colorrectales, la selección de un tratamiento terapéutico adecuado después de la cirugía está guiada por los datos histopatológicos proporcionados por el análisis del tejido tumoral reseccionado. De forma ilustrativa, para los cánceres colorrectales, los tratamientos de quimioterapia adyuvante se prescriben en la mayor parte de los casos cuando se diagnostica la implicación de ganglios linfáticos, dada la toxicidad de dicho tratamiento y su carencia de beneficios para los demás pacientes.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro como se define en las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

La figura 1 ilustra los resultados de la expresión de genes relacionados inflamatorios, inmunosupresores e inmune adaptativos en una serie de 75 cánceres colorrectales según el estado VELIPI y la recidiva. Los niveles de expresión de ARNm relativos se normalizaron al nivel de ARNm 18S para cada muestra. Los niveles se representan por las veces de incremento (%) en comparación con el grupo de referencia de pacientes positivos para invasión (VELIPI+) que experimentaban recidiva. **: P<0,05 en comparación con el grupo de referencia.

La figura 2 muestra la media ± SEM de células CD45RO+/mm2 en los diferentes grupos de pacientes (estadios N y M, según la estadificación TNM AJCC/UICC, na: no aplicable). Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando un ensayo de Mann-Whitney. * Representa diferencias significativas (P<0,05).

La figura 3 muestra las curvas de Kaplan-Meier de supervivencia total (OS) y supervivencia libre de enfermedad (DFS) en CD45RO-hi (>250 células CD45RO+/mm2, n=176, línea superior), y en CD45RO-Io (<250 células CD45RO+/mm2, n=160, línea inferior).

La figura 4 muestra una comparación de las densidades de población inmune en el centro (CT) y en el margen invasivo (IM) de los tumores de pacientes con recidiva (histograma negro) o sin recidiva (histograma blanco).

Figura 5. La significancia de todos los puntos de corte se representó en función del número de CD3CT/mm2 (negro), y CD3IM/mm2 (verde) para la supervivencia total. También se representan los puntos de corte para el 25, 50 y 75 % de la cohorte para las dos regiones. Los valores de P por encima de la línea horizontal (P=0,05) son todos significativos.

La figura 6 muestra la representación de la mediana de la DFS de pacientes con densidades altas (histogramas inferiores) o bajas (histogramas superiores) de células inmunes adaptativas en cada región del tumor (CT o IM).

La figura 7 muestra las curvas de Kaplan-Meier para la duración de DFS (7A) y OS (7B) según la presencia de densidad alta de CD3 en el centro del tumor (CD3cthí) y densidad alta de CD3 en el margen invasivo (CD3imhí) (gris oscuro) , CD3ct alta y CD3im baja (gris claro) , CD3ct baja y CD3im alta (negro claro) , y CD3ct baja y CD3im baja (negro oscuro), en 415 pacientes con cáncer colorrectal (ensayo estadístico de rango logarítmico, P<10-4 para OS y DFS; ** P<10-4, * P<0,05). La figura 7C muestra los análisis combinados de las regiones del tumor de marcadores inmunes adaptativos. Se representa la mediana de la DFS de pacientes con densidades altas (histogramas inferiores) o bajas (histogramas superiores) de células inmunes adaptativas en las dos regiones del tumor (CT más IM).

Figura 8

(8a): curvas de Kaplan-Meier para la duración de la DFS según los estadios de Dukes (Dukes A: línea roja (n=75), B: verde (n=137), C: azul (n=99), y D: negra (n=95)) en 415 pacientes con cáncer colorrectal.

(8b): curvas de Kaplan-Meier para la duración de la DFS según los estadios de Dukes (tal como en 8a) y la presencia de CD3ct baja más CD3im baja (líneas gruesas, n=93) o CD3ct alta más CD3im alta (líneas delgadas, n=109).

(8c): curvas de Kaplan-Meier para la duración de la DFS según los estadios de Dukes y la presencia de CD3ct baja más CD3im baja más CD45ROct baja más CD45ROim baja (líneas gruesas, n=25) o c D3ct alta más CD3im alta más CD45ROct alta más CD45ROim alta (líneas delgadas, n=87). ** P<10-4.

(8d): curvas de Kaplan-Meier para la duración de la OS según los estadios de Dukes y la presencia de CD3CT baja más CD3im baja más CD45ROct baja más CD45ROim baja (líneas gruesas, n=25) o c D3ct alta más CD3im alta más CD45ROct alta más CD45ROim alta (líneas delgadas, n=87).

Figura 9: valores de P de rango logarítmico para la duración de la DFS según la presencia de densidad alta de CD3+ (CD3HI, grupo A) y densidad baja de CD3+ (CD3LO, grupo B) en el centro del tumor (negro), y en el margen invasivo del tumor (gris). Se representan las densidades de células CD3+ (célula/mm2), y el número de pacientes en cada grupo (A y B). Los valores de P son significativos para un intervalo grande de puntos de corte (50-1.000 células/mm2 en el centro del tumor, y 80-1.300 células/mm2 en el margen invasivo del tumor). Los resultados obtenidos son fácilmente reproducibles por otros grupos como un gran intervalo de valores de punto de corte, (centrado en el punto de corte con un valor de P mínimo que se determinó) y discriminan el resultado de paciente.

Figura 10: (Fig. 10-A) Curvas de Kaplan-Meier para la duración de la supervivencia libre de enfermedad según los estadios UICC-TNM (Estadios I: línea roja (n=75), II: verde (n=137), III: azul (n=99), y IV: negra (n=95)) en pacientes con CRC. (Fig. 10-B) Las curvas de Kaplan-Meier ilustran la duración de la supervivencia libre de enfermedad según los estadios UICC-TNM (tal como en el panel A) y respecto a la densidad de células CD3+ en regiones de tumor combinadas (CD3ctLoCD3Lo, líneas gruesas, n=93; CD3cthíCD3imhí, líneas delgadas, n=109). El subgrupo de pacientes que no parecían tener una reacción inmune coordinada in situ en regiones del tumor (Hi/Lo o Lo/Hi para densidades de células CD3+) presentaban curvas de Kaplan-Meier similares a la cohorte entera. (Fig. 10-C) Las curvas de Kaplan-Meier ilustran la duración de la supervivencia libre de enfermedad según los estadios UICC-TNM y respecto a la densidad de células CD3+ y CD45RO+ en regiones de tumor combinadas (CD3ctLoCD3imLo más CD45RO^ctL^oCD45RO^imL^o, líneas gruesas, n=16; CD3^ctHⁱCD3^imHⁱmás CD45RO^ctHⁱCD45RO^imHⁱ, líneas delgadas, n=88). Los valores de punto de corte fueron 250, 640, 60, y 190 para CD3^ct, CD3^im, CD45RO^ct, y CD45RO^im, respectivamente. Ensayo estadístico de rango logarítmico, ** P<10-4.

Figura 11: se representan las curvas de Kaplan-Meier que Ilustran la duración de la supervivencia libre de enfermedad (A), supervivencia específica de enfermedad (B), y supervivencia total (C) según la organización de las células CD8+ dentro de las regiones del tumor (CT e IM). La presencia de densidades altas de células CD8+ en las dos regiones del tumor (CD8-CT/IM-hi, rojo), de densidades heterogéneas de células CD8+ en las dos regiones del tumor (CD8-CT/IM-het, verde), de densidades bajas de células CD8+ en las dos regiones del tumor (CD8-CT/IM-lo, negro), en pacientes con un estadio I/II de cáncer de colon (Izquierda) y cáncer de recto (derecha) (ensayo estadístico de rango logarítmico, P<0,001 para todas las comparaciones).

Figura 12. Se representan las curvas de Kaplan-Meier que Ilustran la duración de la supervivencia libre de enfermedad (A), supervivencia específica de enfermedad (B), y supervivencia total (C) según la organización de las células CD45RO+ dentro de las regiones del tumor (CT e IM). La presencia de densidades altas de células CD45RO+ en las dos regiones del tumor (CD8-CT/IM-hi, rojo), de densidades heterogéneas de células CD45RO+ en las dos regiones del tumor (CD45RO-CT/IM-het, verde), de densidades bajas de células CD45RO+ en las dos regiones del tumor (CD45RO-CT/IM-Io, negro), en pacientes con estadio I/II de cáncer de colon (Izquierda) y cáncer de recto (derecha) (ensayo estadístico de rango logarítmico, P<0,001 para todas las comparaciones).

Figura 13: se representan curvas de Kaplan-Meier que Ilustran la duración de la supervivencia libre de enfermedad según la organización de las células CD45RO+ y CD8+ dentro de las regiones del tumor (CT e IM). La presencia de densidades altas de células CD45RO+ y CD8+ en las dos regiones del tumor (CD45RO/CD8-CT/IM-hi, rojo), de densidades heterogéneas de células CD45RO+ y CD8+ en las dos regiones del tumor (CD45RO/CD8-CT/IM-het, verde), de densidades bajas de células CD45RO+ y CD8+ en la región CT (CD45RO-CT-Io/CD8-CT-Io, azul), de densidades bajas de células CD45RO+ y CD8+ en las dos regiones del tumor (CD45RO/CD8-CT/IM-Io, negro), en 272 pacientes con estadio I/II de cáncer colorrectal (ensayo estadístico de rango logarítmico, P<0,001 para todas las comparaciones). Se representa toda la cohorte de pacientes con estadio I/II de cáncer colorrectal (línea negra punteada).

Por lo tanto, >95% de los pacientes CD45RO/CD8-CT/IM-hi estaban libres de la enfermedad después de 18 años, mientras que el 0% de pacientes CD45RO/CD8-CT/IM-Io estaban libres de la enfermedad después de solo 2 años.

Figura 14: curvas de Kaplan-Meier que Ilustran la duración de la supervivencia libre de enfermedad según el nivel de expresión génica de 6 marcadores (p DCD1LG1, VEGF, TNFRSf6b , IRF1, IL18RA, SELL). Se representan cuatro combinaciones. (ensayo estadístico de rango logarítmico, P<0,001 para todas las comparaciones).

Descripción detallada de la invención

La presente Invención proporciona un método nuevo para el pronóstico del resultado de un cáncer en un paciente, basándose dicho método nuevo en la detección y/o la cuantificación, en el sitio del tumor, de uno o más marcadores biológicos Indicativos de la presencia de, o alternativamente el nivel de, la respuesta Inmune adaptativa de dicho paciente contra dicho cáncer.

Ahora se ha demostrado de forma sorprendente, según la Invención, que una determinación precisa de la respuesta Inmune adaptativa in situ hacia cánceres malignos, y especialmente, hacia cánceres colorrectales, se puede utilizar como el único parámetro para la predicción del resultado clínico posterior de pacientes con cáncer, Independientemente de la extensión de la Invasión del tumor local y la diseminación a ganglios linfáticos regionales.

Esta correlación estadísticamente altamente significativa entre (I) el nivel de la respuesta Inmune adaptativa del paciente en el sitio del tumor y (II) el resultado de la enfermedad es tanto más sorprendente teniendo en cuenta que según el conocimiento de la técnica anterior, la presencia de células Inmunes Infiltrantes en cánceres de mamíferos suponía resultados altamente variables, que oscilaban desde procesos Inflamatorios perjudiciales hasta respuestas Inmunes adaptativas beneficiosas.

Además, dicha correlación altamente significativa que se ha descubierto de forma sorprendente según la Invención permite ahora la determinación del pronóstico del resultado de un cáncer en un paciente sin una necesidad adicional de datos clínico-patológicos que son proporcionados por los métodos de estadificación del cáncer clínico-patológicos convencionales conocidos en la técnica, tales como los procedimientos de Dukes o Grují.

Tal como se detallará adicionalmente, cuando se ha determinado una correlación estadística entre (I) la presencia de, o el nivel de, uno o más marcadores biológicos de la respuesta Inmune adaptativa, tal como se describe en la memoria descriptiva y (II) el resultado real del cáncer en los pacientes, que abarca la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y la supervivencia total (OS), se han obtenido según la Invención valores de P superiores a 10-8, que se pueden comparar con valores de P de 5 x 10-2 a 1 x 10-3 que se han descrito en diversos trabajos de la técnica anterior, tales como, de forma Ilustrativa, los de Zhang et al. (2003, Supra), Diederischen et al. (2003, Supra) u Oshikiri et al. (2003, Supra).

El solicitante ha descubierto que existe una relación altamente significativa (por ejemplo, valores de P bajos) entre (i) el tipo, densidad, y localización de células inmunes dentro de los tumores y (ii) el resultado clínico de los pacientes, que abarca la DFS y OS. Esta correlación altamente significativa se ha descubierto cuando se utilizaban, para el ensayo de marcadores biológicos de la respuesta inmune adaptativa, bien (i) ensayos de inmunoquímica o (ii) análisis de la expresión génica.

Mediante el análisis de marcadores biológicos de la respuesta inmune adaptativa mediante el análisis de la expresión génica en la totalidad de una muestra de tejido tumoral, se encontró un elevado número de combinaciones significativas de marcadores, incluyendo numerosas combinaciones significativas de al menos dos marcadores, con valores de P de aproximadamente 10-4, o inferiores.

De forma importante, en la presente memoria se ha identificado una agrupación dominante de genes comodulados para la inmunidad adaptativa de Th1, agrupación que incluye TBX1 (factor de transcripción 21 de la caja T), IRF1 (factor regulador de interferón 1), IFNG (interferón gamma), CD3Z (CD3Z), CD8, GNLY (granulisina) y GZMB (granzima B). Además, se ha encontrado una correlación inversa entre la expresión de estos genes y la recurrencia tumoral.

Otra agrupación de genes altamente significativa incluye PDCD1LG1, VEGF, TNFRSF6B, IRF1, IL8RA Y SELL.

Mediante el análisis de marcadores biológicos de la respuesta inmune adaptativa mediante análisis inmunohistoquímico bien (i) en el centro del tumor (CT), (ii) en el entorno celular que rodea el tumor, que puede también denominarse el “margen invasivo” (IM) o (iii) tanto en CT como en IM, también se encontraron numerosas combinaciones significativas de marcadores. Los valores de correlación estadística más altos se encontraron cuando los marcadores biológicos se cuantificaron tanto en el centro del tumor (CT) como en el margen invasivo (IM).

En primer lugar, se ha descubierto que existe una alta correlación entre una densidad alta de células T en el sitio del tumor y un resultado favorable de la enfermedad. En particular, se ha mostrado que un resultado positivo del cáncer está altamente correlacionado con la cuantificación de una densidad alta de células CD3+, células CD8+, células CD45RO+ o células Granzima-B+ en el sitio del tumor, bien en la parte central del tumor o en el margen invasivo del mismo.

En segundo lugar, se ha descubierto que la determinación de la presencia de densidades altas de células CD3+, células CD8+, células CD45RO+ o células Granzima-B+ en el sitio del tumor está altamente correlacionada con una recurrencia reducida del cáncer y/o una recurrencia retardada del cáncer y/o una ausencia de recurrencia del cáncer.

En tercer lugar, se ha descubierto que la determinación de la presencia de densidades altas de células CD3+, células CD8+, células CD45RO+ o células Granzima-B+ en el sitio del tumor está altamente correlacionada con metástasis distantes concomitantes reducidas, o una ausencia de metástasis distantes concomitantes (estadios M).

En cuarto lugar, se ha descubierto que la determinación de la presencia de densidades altas de células CD3+, células CD8+, células CD45RO+ o células Granzima-B+ en el sitio del tumor está altamente correlacionada con metástasis tempranas reducidas, o una ausencia de metástasis tempranas (VE o LI o PI).

En quinto lugar, se ha descubierto que la determinación de la presencia de densidades altas de células CD3+, células CD8+, células CD45RO+ o células Granzima-B+ en el sitio del tumor está altamente correlacionada con una invasión reducida de los ganglios linfáticos regionales con células tumorales (estadios N).

En sexto lugar, se ha descubierto que la determinación de la presencia de densidades altas de células CD3+, células CD8+, células CD45RO+ o células Granzima-B+ en el sitio del tumor está altamente correlacionada con una invasión reducida a través de la pared intestinal (estadios T).

De forma más general, se ha descubierto que la ausencia de diseminación temprana del tumor que se manifiesta mediante embolia tumoral en estructuras linfovasculares y perineurales está asociada marcadamente con la presencia de una respuesta inmune in situ fuerte, ilustrándose dicha respuesta inmune fuerte, de forma destacable, por las densidades altas de células inmunes encontradas en el sitio del tumor, así como por el alto nivel de expresión de diversos genes asociados con la inmunidad en el sitio del tumor.

Adicionalmente, se ha descubierto según la invención, que la detección de una respuesta inmune adaptativa fuerte en dos regiones distintas del tumor, el centro del tumor (CT) más el margen invasivo del tumor (IM), estaba altamente correlacionada con un tiempo largo de supervivencia libre de enfermedad y de supervivencia total de los pacientes, y era significativamente más informativa para el pronóstico de la progresión del cáncer de un paciente.

De forma importante, en la presente memoria se ha descubierto una correlación elevada entre (i) la densidad celular de un tipo específico de células que forma el sistema inmune, tal como se ensaya en un ensayo inmunohistoquímico utilizando un único marcador biológico, y (ii) la DFS u OS, con valores de P de al menos tan bajos como 10-7, cuando dicho marcador biológico se ensaya tanto en el centro del tumor (CT) como en el margen invasivo (IM).

De forma general; se ha descubierto según la invención, que el tipo, la densidad y la localización de las células inmunes en los pacientes con cáncer, tal como se ensaya a través de la presencia de, o el nivel de, marcadores biológicos de la respuesta inmune adaptativa, tiene un valor de pronóstico que es superior e independiente de aquellos de métodos de estadificación del cáncer clínico-patológicos convencionales, entre los que se incluyen las clasificaciones de Dukes y la UICC-TNM.

Aún de forma más específica, la presente invención proporciona ahora métodos de pronóstico y medios técnicos para la predicción del resultado de un cáncer en un paciente, en particular para cánceres en un estadio temprano de la enfermedad, que se ha probado que son mucho más exactos que los métodos de estadificación del cáncer clínicopatológicos convencionales, y más especialmente para cánceres clasificados inicialmente como Estadio I/III, según la clasificación de Dukes.

Por lo tanto, se ha descubierto según la invención, que la detección de una respuesta inmune adaptativa fuerte en el sitio del tumor estaba altamente correlacionada con un tiempo largo de supervivencia libre de enfermedad (DFS) y tiempo largo de supervivencia total (OS) de los pacientes.

Por lo tanto, un primer objeto de la presente invención consiste en un método in vitro según la reivindicación 1.

De forma inesperada, se ha descubierto, según la invención, que una respuesta inmune adaptativa fuerte coordinada se correlaciona con un pronóstico del cáncer igualmente favorable.

También de forma inesperada, se ha descubierto que dicha correlación encontrada según la invención, era independiente de la invasión del tumor a través de la pared intestinal y la extensión a los ganglios linfáticos locales (clasificación de Dukes A, B, C).

En cambio, se ha descubierto, de forma sorprendente, que una respuesta inmune adaptativa in situ débil se correlaciona con un mal pronóstico, incluso en pacientes con una invasión del tumor mínima (clasificación A de Dukes).

Por lo tanto, los criterios utilizados según el método de pronóstico del cáncer de la invención, concretamente el estado de la respuesta inmune adaptativa del paciente con cáncer, parece que no son solo diferentes de los de la clasificación T, N, M y de Dukes, sino que también son más precisos en la predicción de la enfermedad (intervalo libre de enfermedad y tiempo de supervivencia).

Por lo tanto, se ha descubierto por primera vez, según la invención, que la medición del nivel de la respuesta inmune adaptativa de un paciente con cáncer se puede utilizar como la única medición para la predicción del resultado de la enfermedad cancerosa, sin ningún requisito de datos adicionales, y particularmente, sin ningún requisito de datos clínico-patológicos aportados por métodos de estadificación del cáncer convencionales.

De hecho, aunque varios trabajos de la técnica anterior habían apuntado la posible relevancia del marcador o marcadores de la respuesta inmune adaptativa para el pronóstico del cáncer, dichos trabajos anteriores solo contenían datos que podrían utilizarse como confirmación o como información adicional de los datos del pronóstico proporcionados por los métodos de estadificación del cáncer convencionales. De este modo, ningún trabajo de la técnica anterior describió ni sugirió ningún método de pronóstico del cáncer in vitro fiable o reproducible, que se basara exclusivamente en la medición de uno o más marcadores biológicos indicativos de la respuesta inmune adaptativa de los pacientes con cáncer.

También se ha descubierto que la detección de una respuesta inmune adaptativa fuerte en el sitio del tumor era un marcador fiable para una pluralidad de cánceres, tales como cánceres de colon, así como cánceres de recto.

La realización del método de pronóstico del cáncer de la invención también puede indicar, con más precisión que los métodos de la técnica anterior, los pacientes con un riesgo elevado de recurrencia del tumor, los cuales pueden beneficiarse de terapia adyuvante, que incluye la inmunoterapia.

Tal y como se pretende en la presente memoria, la expresión “pronóstico de la progresión de un cáncer” abarca el pronóstico, en un paciente en el que ya se ha diagnosticado la existencia de un cáncer, de diversos eventos, que incluyen:

(i) las posibilidades de existencia de metástasis;

(ii) las posibilidades de existencia de recurrencia loco-regional del cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal; y

(iii) las posibilidades de existencia de un tiempo largo libre de enfermedad (DFS) y/o un tiempo largo de supervivencia total (OS); es decir, un tiempo de DFS o un tiempo de OFS de 5 años o más después de los ensayos con el método de pronóstico in vitro según la invención.

Tal y como se pretende en la presente memoria, una “muestra de tejido tumoral” abarca (i) un tumor primario global (como una totalidad), (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido a partir del tejido que rodea directamente al tumor, pudiendo denominarse dicho tejido más específicamente “margen invasivo” del tumor, (iv) islotes linfoides muy cercanos al tumor, (v) los ganglios linfáticos localizados muy cerca del tumor, (vi) una muestra de tejido tumoral recogida antes de la cirugía (para el seguimiento de pacientes después del tratamiento, por ejemplo), y (vii) una metástasis distante.

Preferiblemente, cuando la etapa a) consiste en el análisis de la expresión de uno o más genes, es decir, uno o más marcadores biológicos pertinentes, entonces la cuantificación de la expresión de dichos uno o más genes se realiza a partir de la muestra de tejido tumoral completa.

Preferiblemente, cuando la etapa a) consiste en la evaluación de las densidades de las células inmunes específicas, por ensayos inmunohistoquímicos para uno o más marcadores biológicos expresados en células, entonces la cuantificación de dichos uno o más marcadores biológicos se realiza separadamente en al menos dos muestras de tejido tumoral distintas, entre las muestras de tejido tumoral numeradas (i) a (vi) anteriormente. Lo más preferiblemente, según esta realización, la cuantificación de dicho uno o más marcadores biológicos se realiza separadamente tanto (i) en el centro del tumor (CT) como (ii) en el margen invasivo (IM).

Una muestra de tejido tumoral, independientemente de si se obtiene a partir del centro del tumor, del margen invasivo del tumor, o de los ganglios linfáticos más cercanos, engloba trozos o cortes de tejido que se han retirado del centro del tumor o del margen invasivo que rodea el tumor, incluyendo después de una resección quirúrgica del tumor o después de la recogida de una muestra tisular para biopsia, para una cuantificación adicional de uno o varios marcadores biológicos, de forma destacable, mediante métodos de histología o inmunohistoquímica, mediante métodos de citometría de flujo y mediante métodos de análisis de la expresión de genes o proteínas, incluyendo el análisis genómico y proteómico. Se apreciará que las muestras de tejido tumoral se pueden utilizar en el método de pronóstico del cáncer de la presente invención. En estas realizaciones, el nivel de expresión del marcador biológico se puede evaluar mediante la evaluación de la cantidad (por ejemplo, la cantidad o concentración absoluta) del marcador biológico en una muestra de tejido tumoral, por ejemplo, un frotis de tejido tumoral obtenido a partir de un paciente. La muestra de células, por supuesto, puede someterse a una variedad de técnicas preparativas y de almacenamiento posteriores a la recogida muy conocidas (por ejemplo, extracción de ácidos nucleicos y/o proteínas, fijación, almacenamiento, congelación, ultrafiltración, concentración, evaporación, centrifugación, etc.) antes de evaluar la cantidad de marcador biológico en la muestra. Asimismo, los frotis de tejido tumoral también pueden someterse a técnicas preparativas y de almacenamiento posteriores a la recogida, por ejemplo, fijación.

Tal y como se pretende en la presente memoria, la “respuesta inmune adaptativa” engloba la presencia o la actividad, incluyendo el nivel de actividad, de células del sistema inmune del paciente con cáncer huésped localmente en el sitio del tumor.

Tal y como se pretende en la presente memoria, la expresión “la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente contra dicho tumor” engloba cualquier respuesta inmune adaptativa de dicho paciente a través de la acción directa (dependiente de TCR) o indirecta (independiente de TCR), o de ambas, hacia dicho cáncer.

La respuesta inmune adaptativa significa la respuesta inmune específica del paciente con cáncer huésped contra el tumor y engloba la presencia de, o el número de, o alternativamente la actividad de, células implicadas en la respuesta inmune específica del huésped que incluye:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los linfocitos T engloban linfocitos T cooperadores, que incluyen subgrupos de células de linfocitos T cooperadores Th1 y Th2.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los linfocitos T también engloban linfocitos T citotóxicos.

Inmunidad adaptativa

En comparación con la inmunidad innata, la inmunidad adquirida (adaptativa) se desarrolla cuando el cuerpo se expone a varios antígenos y construye una defensa que es específica de ese antígeno.

La respuesta inmune adaptativa es específica de antígeno y puede tardar días o más tiempo en desarrollarse. Los tipos de células con papeles críticos en la inmunidad adaptativa son células presentadoras de antígeno que incluyen macrófagos y células dendríticas. La estimulación de subtipos de células T, la activación de células B y la producción de anticuerpos, dependientes de antígeno, y la activación de macrófagos y de células NK desempeñan papeles importantes en la inmunidad adaptativa. La respuesta inmune adaptativa también incluye el desarrollo de memoria inmunológica, un proceso que continúa desarrollándose toda la vida y aumenta las futuras respuestas a un antígeno dado.

Los linfocitos, un tipo especial de glóbulos blancos, contienen subgrupos, los linfocitos B y T, que son elementos clave en las respuestas inmunes adquiridas. Los linfocitos B (también denominados células B) producen anticuerpos. Los anticuerpos se unen a un antígeno específico y facilitan que los fagocitos destruyan el antígeno. Los linfocitos T (células T) atacan a los antígenos directamente, y aportan control de la respuesta inmune. Se desarrollan células B y células T que son específicas de UN tipo de antígeno. Cuando existe exposición a un antígeno diferente, se forman células B y células T diferentes.

A medida que los linfocitos se desarrollan, normalmente aprenden a reconocer los tejidos del mismo cuerpo (propios), como diferentes de los tejidos y partículas que no se encuentras normalmente en el cuerpo (no propios). Una vez se forman las células B y células T, algunas de estas células se multiplicarán y aportarán “memoria” al sistema inmune. Esto permite al sistema inmune responder de forma más rápida y más eficaz la próxima vez que un individuo se expone al mismo antígeno, y en muchos casos evitarán que el individuo se ponga enfermo. Por ejemplo, la inmunidad adaptativa explica por qué un individuo que ha tenido varicela se denomina “inmune” a sufrir de nuevo varicela.

Sistema inmune adaptativo

El sistema inmune adaptativo, también denominado el sistema inmune adquirido, explica el hecho interesante de que cuando la mayor parte de los mamíferos sobreviven a una infección inicial por un patógeno, generalmente se vuelven inmunes a una enfermedad posterior provocada por el mismo patógeno. Este hecho lo explota la medicina moderna mediante la utilización de las vacunas. El sistema inmune adaptativo se basa en células inmunes denominadas leucocitos (o glóbulos blancos) que son producidos por células madre en la médula ósea. El sistema inmune se puede dividir en dos partes. Muchas especies, entre las que se incluyen los mamíferos, tienen el siguiente tipo:

El sistema inmune humoral, que actúa contra las bacterias y virus en los líquidos corporales (tales como la sangre). Sus medios primarios de acción son las inmunoglobulinas, también denominadas anticuerpos, que son producidos por las células B (B significa que se desarrollan en la médula ósea).

El sistema inmune celular, que se encarga de otras células que son infectadas por virus. Esto lo realizan las células T, también denominadas linfocitos T (T significa que se desarrollan en el timo). Hay dos tipos principales de células T :

Las células T citotóxicas (células TC) reconocen a las células infectadas utilizando los receptores de las células T para probar la superficie de otras células. Si reconocen una célula infectada, liberan granzimas para señalar a esa célula para que se vuelva apoptótica (“se suicide”), matando, de este modo, esa célula y cualquier virus que esté en proceso de creación.

Las células T cooperadoras (células TH) interaccionan con los macrófagos (que ingieren material peligroso) y también producen citoquinas (interleuquinas) que inducen la proliferación de las células B y T.

Además, existen células T reguladoras (células Treg) que son importantes para regular la inmunidad mediada por células.

Células T citotóxicas: una célula T citotóxica (o TC) es una célula T (un tipo de glóbulo blanco) que tiene en su superficie receptores de antígeno que se pueden unir a fragmentos de antígenos expuestos por las moléculas MHC de clase I de células tumorales y células somáticas infectadas por virus. Una vez activadas por un complejo MHC-antígeno, las células TC liberan la proteína perforina, que forma poros en la membrana plasmática de la célula diana; esto provoca que el agua y los iones fluyan hacia el interior de la célula diana, haciendo que ésta se expanda y eventualmente se lise. Las TC también liberan granzima, una serina proteasa, que puede entrar en las células diana a través del poro formado por la perforina e inducir apoptosis (muerte celular). La mayor parte de las células TC presentan en su superficie celular la proteína CD8, que tiene atracción por partes de la molécula MHC de clase I. Esta afinidad mantiene a la célula TC y la célula diana unidas íntimamente entre sí durante la activación específica de antígeno. Las células TC con proteína CD8 en su superficie se denominan células T CD8+.

Células T cooperadoras (o TH): una célula T cooperadora (o TH) es una célula T (un tipo de glóbulo blanco) que tiene en su superficie receptores de antígeno que se pueden unir a fragmentos de antígenos expuestos por las moléculas MHC de clase II que se encuentran sobre las células presentadoras de antígeno (APC) profesionales. Una vez unida al antígeno, la célula TH prolifera y se diferencia en células TH activadas y células TH de memoria. Las células TH activadas secretan citoquinas, proteínas o péptidos que estimulan a otros linfocitos; la más común es la interleuquina-2 (IL-2), que es un potente factor de crecimiento de las células T. Las células TH activadas, que proliferan, se pueden diferenciar en dos subtipos principales de células, células Th1 y Th2. Estos subtipos se definen sobre la base de las citoquinas específicas producidas. Las células Th1 producen interferón gamma e interleuquina 12, mientras que las células Th2 producen interleuquina-4, interleuquina-5 e interleuquina-13. Las células TH de memoria son específicas del primer antígeno que encuentran y se pueden llamar durante la segunda respuesta inmune. La mayor parte de las células TH presentan en la superficie celular la proteína CD4, que tiene atracción hacia partes de la molécula MHC de clase II. Esta afinidad mantiene a la célula TH y la célula diana unidas íntimamente entre sí durante la activación específica de antígeno. Las células TH con la proteína CD4 en su superficie se denominan células T CD4+. La disminución en el número de células T CD4+ es el mecanismo primario mediante el cual el VIH causa el SIDA.

Otras definiciones de términos relevantes

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión “sitio del tumor” significa el propio tejido tumoral, así como el tejido que se encuentra en contacto íntimo con el tejido tumoral, que incluye el margen invasivo del tumor y los ganglios linfáticos regionales que son los más cercanos al tejido tumoral o al margen invasivo del tumor.

Tal y como se pretende en la presente memoria, el “estado” de la respuesta inmune adaptativa engloba (i) la existencia de una respuesta inmune específica contra el cáncer en el sitio del tumor así como (ii) el nivel de dicha respuesta inmune específica.

Tal y como se pretende en la presente memoria, un “marcador biológico” consiste en cualquier parámetro detectable, mensurable o cuantificable que sea indicativo del estado de la respuesta inmune adaptativa del paciente con cáncer contra el tumor. Un marcador se vuelve un “marcador biológico” con el objetivo de llevar a cabo el método de pronóstico del cáncer de la invención cuando se encuentra una buena correlación estadística entre (i) un incremento o una disminución del valor de la cuantificación para dicho marcador y (ii) la progresión del cáncer real observada en los pacientes. Para calcular los valores de correlación para cada marcador ensayado y, por lo tanto, determinar la relevancia estadística de dicho marcador como un “marcador biológico”, según la invención, se puede utilizar uno cualquiera de los métodos estadísticos conocidos por un experto en la técnica. De forma ilustrativa, se pueden utilizar métodos estadísticos que utilizan las curvas de Kaplan-Meier y/o análisis unifactorial usando el ensayo de rango logarítmico y/o un modelo de riesgos proporcionales de Cox, tal como se muestra en los ejemplos de la presente memoria. Cualquier marcador para el cual se determine un valor de P inferior a 0,05, e incluso preferentemente, inferior a 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 o 10-7 (según análisis unifactorial y multifactorial (por ejemplo, ensayo de rango logarítmico y ensayo de Cox, respectivamente) consiste en un “marcador biológico” utilizable en el método para el pronóstico del cáncer de la invención.

Los marcadores biológicos incluyen la presencia de, o el número o densidad de, células del sistema inmune en el sitio del tumor.

Los marcadores biológicos también incluyen la presencia de, o la cantidad de, proteínas producidas de forma específica por células del sistema inmune en el sitio del tumor.

Los marcadores biológicos también incluyen la presencia de, o la cantidad de, cualquier material biológico que sea indicativo del nivel de expresión de genes relacionados con el aumento de una respuesta inmune específica del huésped, en el sitio del tumor. De este modo, los marcadores biológicos incluyen la presencia de, o la cantidad de, ARN mensajero (ARNm) transcrito a partir de ADN genómico que codifica proteínas que se producen específicamente por células del sistema inmune, en el sitio del tumor.

Los marcadores biológicos incluyen de esta forma antígenos de superficie que son expresados específicamente por células del sistema inmune, incluyendo por los linfocitos B, linfocitos T, monocitos/macrófagos, células dendríticas, células NK, células NKT, y células NK-DC, que se reclutan en el sitio del tumor o en su proximidad cercana, incluyendo en el margen invasivo del tumor y en los ganglios linfáticos más cercanos, o, alternativamente, el ARNm que codifica dichos antígenos de superficie.

De forma ilustrativa, los antígenos de superficie de interés utilizados como marcadores biológicos pueden incluir CD3, CD4, CD8 y CD45RO que son expresados por las células T o subconjuntos de células T

Por ejemplo, si la expresión del antígeno CD3, o la expresión del ARNm del mismo, se utiliza como un marcador biológico, la cuantificación de este marcador biológico, en la etapa a) del método según la invención, es indicativa del nivel de la respuesta inmune adaptativa del paciente que implica a todos los linfocitos T y células NKT.

Por ejemplo, si la expresión del antígeno CD8, o la expresión del ARNm del mismo, se utiliza como un marcador biológico, la cuantificación de este marcador biológico, en la etapa a) del método según la invención, es indicativa del nivel de la respuesta inmune adaptativa del paciente que implica a los linfocitos T citotóxicos.

Por ejemplo, si la expresión del antígeno CD45RO, o la expresión del ARNm del mismo, se utiliza como un marcador biológico, la cuantificación de este marcador biológico, en la etapa a) del método según la invención, es indicativa del nivel de la respuesta inmune adaptativa del paciente que implica a los linfocitos T de memoria o linfocitos T efectores de memoria.

De forma ilustrativa adicional, las proteínas utilizadas como marcadores biológicos también pueden incluir proteínas citolíticas producidas específicamente por células del sistema inmune, como perforina, granulisina y también granzima-B.

Descripción del método in vitro para el pronóstico del cáncer

Etapa a) del método

Al final de la etapa a) del método según la invención, se obtiene un valor de cuantificación para cada uno de los marcadores biológicos que se utilizan.

Tal y como se ha especificado anteriormente, las realizaciones específicas de la etapa a) incluyen:

(i) cuantificación de uno o más marcadores biológicos mediante métodos inmunoquímicos, que engloban la cuantificación de uno o más marcadores de proteína de interés mediante métodos inmunohistoquímicos in situ en una muestra de tejido tumoral, por ejemplo, utilizando anticuerpos dirigidos específicamente contra cada uno de dichos uno o más marcadores de proteína. En determinadas realizaciones, los valores de cuantificación resultantes consisten en la densidad de las células que expresan cada uno de los marcadores de proteína en la muestra de tejido tumoral que se está analizando.

(ii) cuantificación de uno o más marcadores biológicos mediante el análisis de la expresión génica, que engloba la cuantificación de uno o más ARNm marcadores de interés, por ejemplo, llevando a cabo un análisis por PCR, PCR en tiempo real Taqman.

De este modo, en determinadas realizaciones del método, la etapa a) consiste en cuantificar, en una muestra de tejido tumoral, las células que expresan un marcador biológico específico de la respuesta inmune adaptativa. Generalmente, se ensaya una combinación de al menos dos marcadores biológicos. En estas realizaciones de la etapa a) del método, el valor obtenido al final de la etapa a) consiste en el número o la densidad de células del sistema inmune, o subconjuntos de células del mismo, que están contenidas en dicha muestra de tejido tumoral y que expresan un marcador biológico específico, por ejemplo, entre la combinación de marcadores biológicos. En estas realizaciones, lo que se obtiene al final de la etapa a) consiste en los valores de la densidad celular encontrados para cada marcador biológico incluido en la combinación de marcadores. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la densidad de las células de interés puede expresarse como el número de estas células de interés que se cuenta por una unidad de área superficial de muestra de tejido, por ejemplo, como el número de estas células de interés que se cuenta por cm2 o mm2 de área superficial de muestra de tejido. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la densidad de las células de interés también puede expresarse como el número de estas células de interés por una unidad de volumen de muestra, por ejemplo, como el número de células de interés por cm3 de muestra. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la densidad de las células de interés también puede consistir en el porcentaje de un subconjunto de células específico (por ejemplo, células T CD3+) por células totales o subpoblación de células total (ajustado al 100 %). Por ejemplo, en una realización del método, las células se recogen en primer lugar por dispersión mecánica de la muestra de tejido tumoral y las células de interés se cuentan entonces por citometría de flujo, opcionalmente después de marcarlas, por ejemplo, por anticuerpos específicos de antígeno de superficie marcados, antes de determinar la densidad celular. Los inventores creen que la alta relevancia estadística que han encontrado entre (i) los valores de cuantificación de los marcadores biológicos de interés, y (ii) el resultado de la enfermedad cancerosa, cuando dichos valores de cuantificación se evalúan por métodos inmunohistoquímicos puede explicarse al menos por:

- un método de cuantificación altamente preciso para cada marcador, como la numeración de las células que expresan el marcador por área superficial de un corte de tejido tumoral, como se realiza a partir de una pluralidad de diversas áreas superficiales de dicho corte de tejido tumoral; y

- una cuantificación separada combinada de dicho marcador en más de un tipo de muestra de tejido, por ejemplo, una cuantificación combinada de dicho marcador biológico tanto (i) en el centro del tumor (CT) como (ii) en el margen invasivo (IM), entendiéndose que se calcula entonces la relevancia estadística, por ejemplo, por análisis multifactorial, empezando a partir de la combinación de los valores de cuantificación que se miden.

En determinadas otras realizaciones del método, la etapa a) consiste en la cuantificación, en una muestra de tejido tumoral, del nivel de expresión de uno o más genes marcadores de la respuesta inmune adaptativa (por ejemplo, la cantidad de los ARNm específicos correspondientes). En general, se lleva a cabo la evaluación del nivel de expresión para una combinación de al menos dos genes marcadores. En estas realizaciones de la etapa a) del método, lo que se obtiene al final de la etapa a) consiste en los valores del nivel de expresión encontrados para cada una de las proteínas marcadoras producidas de forma específica por células del sistema inmune, que se incluyen en la combinación de marcadores.

Dicho nivel de expresión también se puede expresar como cualquier unidad arbitraria que refleje la cantidad de ARNm que codifica dicha proteína de interés que se ha detectado en la muestra de tejido, tal como la intensidad de una señal radioactiva o de fluorescencia emitida por el material de ADNc generado mediante análisis por PCR del contenido de ARNm de la muestra de tejido, incluyendo por análisis por PCR en tiempo real del contenido de ARNm de la muestra de tejido.

De forma alternativa, dicho nivel de expresión se puede expresar como cualquier unidad arbitraria que refleje la cantidad de la proteína de interés que se ha detectado en la muestra de tejido, tal como la intensidad de una señal radioactiva o de fluorescencia emitida por un anticuerpo marcado unido de forma específica a la proteína de interés. De forma alternativa, el valor obtenido al final de la etapa a) puede consistir en una concentración de una o más proteínas de interés que se podría medir mediante varios métodos de detección de proteínas bien conocidos en la técnica, tales como ELISA, SELDI-TOF, FACS o transferencia Western.

En determinadas realizaciones de la etapa a) del método de pronóstico del cáncer según la invención, el o los marcadores biológicos se cuantifican separadamente en una, o más de una, muestra de tejido tumoral del paciente con cáncer, seleccionada del grupo que consiste en (i) un tumor primario global (como un todo), (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente al tumor, tejido que puede denominarse más específicamente el "margen invasivo" del tumor (iv) los ganglios linfáticos localizados muy próximos al tumor, (v) una biopsia tumoral realizada antes de la cirugía (para el seguimiento de pacientes después del tratamiento, por ejemplo), y (vi) una metástasis distante. En estas realizaciones, el valor de cuantificación que se obtiene al final de la etapa a), para cada una de las muestras de tejido tumoral (i), (ii) o (iii), se compara, en la etapa b) del método, con los valores de referencia correspondientes determinados previamente para cada una de las muestras de tejido tumoral (i) a (vi), respectivamente. La obtención, en la etapa a) del método, de más de un valor de cuantificación para cada marcador biológico que se usa, permite un pronóstico final del cáncer más exacto que cuando solo se determina un valor de cuantificación por marcador biológico.

En otras realizaciones del método de pronóstico del cáncer según la invención, se obtienen valores de cuantificación para más de un marcador biológico, en la etapa a) del método. En estas realizaciones, la etapa b) se lleva a cabo comparando, para cada marcador biológico utilizado, (i) el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para este marcador biológico con (ii) el valor de referencia predeterminado para el mismo marcador biológico.

En realizaciones adicionales del método de pronóstico del cáncer según la invención, la etapa a) se lleva a cabo obteniendo los valores de cuantificación para más de una muestra de tejido tumoral para un único marcador biológico y la etapa a) se lleva a cabo obteniendo valores de cuantificación para más de un marcador biológico, comparándose, a continuación, dichos valores de cuantificación, en la etapa b), con los valores de referencia predeterminados correspondientes.

En realizaciones preferidas del método de pronóstico in vitro de la invención, la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en:

a1) cuantificar el dicho al menos un marcador biológico en una sección de tejido tumoral por inmunodetección, separadamente tanto (i) en el centro del tumor (CT) como (ii) en el margen invasivo (IM); y

a2) cuantificar el dicho al menos un marcador biológico en la muestra de tejido tumoral completa por análisis de la expresión génica.

Según una primera realización específica del método de pronóstico in vitro de la invención, la etapa a1) se realiza cuantificando al menos dos marcadores biológicos distintos, separadamente tanto (i) en el centro del tumor (CT) como (ii) en el margen invasivo (IM).

Cuando, en el método in vitro de la invención, la etapa a) consiste en la etapa a1), entonces la etapa b) se realiza comparando (i) cada valor de cuantificación obtenido para el mismo marcador biológico, respectivamente en CT e IM con (ii) los valores de referencia correspondientes, respectivamente para CT e IM.

Según una segunda realización específica del método de pronóstico in vitro de la invención, la etapa step a2) se realiza cuantificando al menos cinco marcadores biológicos distintos en la muestra de tejido completa.

Cuando, en el método in vitro de la invención, la etapa a) consiste en la etapa a2), entonces la etapa b) se realiza comparando (i) cada valor de cuantificación obtenido para cada marcador biológico de dicha combinación de al menos cinco marcadores biológicos distintos.

Etapa b) del método

En la etapa b) del método, para cada marcador biológico utilizado, el valor que se obtiene al final de la etapa a) se compara con un valor de referencia para el mismo marcador biológico, y cuando se requiere, con valores de referencia para el centro del tumor (CT) y el margen invasivo (IM), para dicho mismo marcador biológico. De este modo, se predetermina dicho valor de referencia para el mismo marcador biológico y ya se sabe que es indicativo de un valor de referencia que es pertinente para la discriminación entre un nivel bajo y un nivel alto de la respuesta inmune adaptativa de un paciente contra el cáncer, para dicho marcador biológico. Dicho valor de referencia predeterminado para dicho marcador biológico se correlaciona con un buen pronóstico del cáncer, o, a la inversa, se correlaciona con un mal pronóstico del cáncer.

Primera realización ilustrativa para la predeterminación de un valor de referencia

Cada valor de referencia para cada marcador biológico se puede predeterminar llevando a cabo un método que comprende las etapas de:

a) proporcionar al menos una colección de muestras de tejido tumoral seleccionadas del grupo que consiste en:

i) una colección de muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer clasificados como Tis, o T1, o T2, o T3 o T4 y N0, o N1, o N2, o N3 y M0 o M1, y sin metástasis temprana (VE o LI o PI) o con metástasis temprana, que se han sometido a un tratamiento contra el cáncer, y posteriormente no han tenido una recidiva del cáncer ni una recurrencia del cáncer después del tratamiento contra el cáncer;

ii) una colección de muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer clasificados como Tis, o T1, o T2, o T3 o T4 y N0, o N1, o N2, o N3 y M0 o M1, y sin metástasis temprana (VE o LI o PI) o con metástasis temprana, que se han sometido a un tratamiento contra el cáncer, y posteriormente han tenido recidivas del cáncer o recurrencias después del tratamiento contra el cáncer.

b) cuantificar, para cada muestra de tejido tumoral que está comprendida en una colección de muestras de tejido tumoral proporcionadas en la etapa a), dicho marcador biológico, por lo cual se obtiene una colección de los valores de cuantificación para dicho marcador biológico y para dicha colección de muestras de tejido tumoral;

c) calcular, a partir de dicha colección de valores de cuantificación obtenidos al final de la etapa b), el valor de cuantificación promedio para dicho marcador biológico, por lo cual se obtiene un valor de referencia predeterminado para dicho marcador biológico que se correlaciona con un pronóstico del cáncer específico.

El “tratamiento contra el cáncer” al que se hace referencia en la definición de la etapa a) anterior se refiere a cualquier tipo de terapia del cáncer a la que se han sometido los pacientes con cáncer previamente a la recolección de las muestras de tejido tumoral, entre las que se incluyen la radioterapia, quimioterapia y cirugía, por ejemplo, resección quirúrgica del tumor.

Según el método para obtener los valores de referencia predeterminados anteriores, se puede obtener más de un valor de referencia predeterminado para un único marcador biológico. Por ejemplo, para un único marcador biológico, el método anterior permite la determinación de al menos cuatro valores de referencia predeterminados para el mismo marcador biológico, respectivamente un valor de referencia predeterminado calculado a partir del valor de cuantificación promedio obtenido cuando se empieza, en la etapa a), con cada una de las colecciones (i) y (ii) de muestras de tejido tumoral que se han descrito anteriormente.

Segunda realización ilustrativa para la predeterminación de un valor de referencia

Los valores de referencia utilizados para la comparación en la etapa b) del método también pueden consistir en valores de “punto de corte” que se pueden determinar tal como se describe a continuación.

Cada valor de referencia (“punto de corte”) para cada marcador biológico se puede predeterminar llevando a cabo un método que comprende las etapas de:

a) seleccionar un marcador biológico para el cual se va a determinar un valor de referencia;

b) proporcionar una colección de muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer;

c) proporcionar, para cada muestra tumoral proporcionada en la etapa b), información relacionada con el resultado clínico real para el paciente con cáncer correspondiente;

d) proporcionar una serie de valores de cuantificación arbitrarios para dicho marcador biológico seleccionado en la etapa a);

e) cuantificar dicho marcador biológico en cada muestra de tejido tumoral contenida en la colección proporcionada en la etapa b);

f) clasificar dichas muestras de tumor en dos grupos para un valor de cuantificación arbitrario específico proporcionado en la etapa c), respectivamente:

(i) un primer grupo que comprende muestras de tumor que presentan un valor de cuantificación para dicho marcador que es inferior a dicho valor de cuantificación arbitrario contenido en dicha serie de valores de cuantificación;

(ii) un segundo grupo que comprende muestras de tumor que presentan un valor de cuantificación para dicho marcador que es superior a dicho valor de cuantificación arbitrario contenido en dicha serie de valores de cuantificación; mediante lo cual se obtienen dos grupos de muestras de tumor para dicho valor de cuantificación específico, en donde las muestras de tumor de cada grupo se enumeran de forma separada;

g) calcular la significancia estadística entre (i) el valor de cuantificación para dicho marcador biológico obtenido en la etapa e) y (ii) el resultado clínico real de los pacientes de los cuales provienen las muestras de tumor contenidas en el primer y segundo grupo definidos en la etapa f);

h) repetir las etapas f) y g) hasta que se ensaye cada valor de cuantificación arbitrario proporcionado en la etapa d); i) establecer que dicho valor de referencia (valor de “punto de corte”) consiste en el valor de cuantificación arbitrario para el cual se ha calculado la significancia estadística más alta (el más significativo) en la etapa g).

El método anterior consiste en establecer un valor de “punto de corte” en la mediana de los conjuntos de datos y se describe con detalle en los ejemplos de la presente memoria.

Tal y como se ha descrito anteriormente, dicho método permite establecer un valor de “punto de corte” único que permite la discriminación entre un pronóstico del resultado malo y bueno. En la práctica, tal y como se describe en los ejemplos de la presente memoria, generalmente se obtienen valores de significancia estadística elevados (por ejemplo, valores de P bajos) para un intervalo de valores de cuantificación arbitrarios sucesivos, y no solo para un único valor de cuantificación arbitrario. De este modo, en una realización alternativa del método para la determinación de los valores de “punto de corte” anteriores, se establece de forma arbitraria un valor de significancia estadística mínimo (umbral mínimo de significancia, por ejemplo, umbral máximo de valor de P) y se retiene el intervalo de valores de cuantificación arbitrarios para los cuales el valor de significancia estadística calculado en la etapa g) es superior (más significativo, por ejemplo, valor de P inferior), mediante lo cual se proporciona un intervalo de valores de cuantificación. Dicho intervalo de valores de cuantificación consiste en un valor de “punto de corte” según la invención. Según esta realización específica de un valor de “punto de corte”, se puede determinar un pronóstico del resultado clínico malo o bueno comparando, en la etapa b) del método de pronóstico de la invención, el valor obtenido en la etapa a) con el intervalo de valores que delimitan dicho valor de “punto de corte”, para un marcador biológico específico. En determinadas realizaciones, un valor de punto de corte que consiste en un intervalo de valores de cuantificación para el marcador biológico considerado, consiste en un intervalo de valores centrados en el valor de cuantificación para el cual se encuentra el valor de significancia estadística más alto (por ejemplo, en general, el valor de P mínimo que se encuentra).

En determinadas realizaciones preferidas del método para la predeterminación de un valor de punto de corte que se ha descrito anteriormente, dicho marcador biológico consiste en la densidad de células que expresan un marcador de proteína específico en la muestra de tumor. De forma adicional, para un único marcador de proteína, se pueden determinar los valores de punto de corte para al menos dos marcadores biológicos distintos, respectivamente (i) un primer valor de punto de corte determinado para un primer marcador biológico que consiste en la densidad de células que expresan dicho marcador de proteína en el centro del tumor (CT) y (ii) un segundo valor de punto de corte determinado para un segundo marcador biológico que consiste en la densidad de células que expresan dicho marcador de proteína en el margen invasivo (IM).

En determinadas realizaciones preferidas de la etapa c) del método para la determinación de los valores de punto de corte anteriores, dicha información relacionada con el resultado clínico real de los pacientes se selecciona del grupo que te en (i) la duración de la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y (ii) la supervivencia total (OS).

De hecho, para llevar a cabo el método de pronóstico del cáncer según la invención, se prefiere la disponibilidad de un valor de referencia predeterminado para más de un marcador biológico. De este modo, en general, se determina al menos un valor de referencia predeterminado para una pluralidad de marcadores biológicos indicativos del estado de la respuesta inmune adaptativa contra el cáncer que se engloban en la presente memoria, simplemente repitiendo uno cualquiera de los métodos para la obtención de valores de referencia predeterminados que se han descrito anteriormente, para una pluralidad de marcadores biológicos.

Por ejemplo, en determinadas realizaciones en donde el marcador biológico consiste en un antígeno de superficie expresado por células del sistema inmune, como el antígeno CD3, y en donde en la etapa a) del método de pronóstico del cáncer se lleva a cabo un análisis por citometría de flujo de la densidad de las células CD3+ en el sitio del tumor, el valor de referencia predeterminado puede consistir en el valor de la densidad celular, incluyendo el porcentaje de células específicas (por ejemplo, CD3+) por células totales o subpoblación de células totales (ajustado al 100 %), que se correlaciona con un mal pronóstico del cáncer, por ejemplo, recidivas o recurrencias, tiempo corto de supervivencia, etc., o, por el contrario, puede consistir en el valor de la densidad celular que se correlaciona con un buen pronóstico del cáncer, por ejemplo, ausencia de metástasis temprana, ausencia total de metástasis o tiempo largo de supervivencia libre de enfermedad.

En determinadas realizaciones, el valor de referencia predeterminado consiste en un valor de “punto de corte”, tal como se ha descrito ya anteriormente, valor de "punto de corte" que consiste en un valor de cuantificación promedio para el marcador biológico de interés que discrimina entre un mal pronóstico del cáncer y un buen pronóstico del cáncer. De forma ilustrativa, para el cáncer colorrectal humano, se ha descubierto, cuando se utiliza análisis inmunohistoquímico de células CD3+ en el sitio del tumor como el marcador biológico, que el valor de referencia de punto de corte predeterminado puede ser aproximadamente 300 células CD3+/mm2 para una muestra de tejido tumoral recogida del centro del tumor, y que el valor de referencia de punto de corte predeterminado puede ser aproximadamente 600 células CD3+/mm2 para una muestra de tejido tumoral recogida del margen de invasión. En otras realizaciones en donde el valor de punto de corte consiste en un intervalo de valores que delimitan valores de cuantificación de CD3+ altos y bajos, dicho valor de punto de corte varía óptimamente de 50 células CD3+/mm2 a 1.000 células CD3+/mm2 para una cuantificación en el centro del tumor (CT) y de 80 células CD3+/mm2 a 1.300 células CD3+/mm2 para una cuantificación en el margen invasivo (IM).

Los valores de punto de corte óptimos basados en ensayos de rango logarítmico, para las densidades celulares de CD3, CD8, CD45RO, GZMB fueron 370, 80, 80, 30 células/mm2 en el centro del tumor, respectivamente, y 640, 300, 190, 60 células/mm2 en el margen invasivo, respectivamente, como se muestra en los ejemplos de la presente memoria.

Según las realizaciones anteriores, se obtiene un mal pronóstico del cáncer si el valor de cuantificación generado para el marcador biológico CD3+ es inferior al valor de referencia de punto de corte predeterminado, cuando la comparación se lleva a cabo en la etapa b) del método. A la inversa, se obtiene un buen pronóstico del cáncer si el valor de cuantificación generado para el marcador biológico CD3+ es superior al valor de referencia de punto de corte predeterminado, cuando la comparación se lleva a cabo en la etapa b) del método.

Tercera realización ilustrativa para la predeterminación de un valor de referencia

También, de forma ilustrativa, en realizaciones en las que el marcador biológico consiste en el nivel de expresión de un gen relacionado con la respuesta inmune del cuerpo humano, el valor de referencia predeterminado puede consistir en el valor de la expresión génica que se correlaciona con un mal pronóstico del cáncer, por ejemplo, recidivas o recurrencias, tiempo de supervivencia corto, etc., o, al contrario, puede consistir en el valor de la expresión génica que se correlaciona con un buen pronóstico del cáncer, por ejemplo, ausencia total de metástasis o tiempo de supervivencia libre de enfermedad largo. El valor de la expresión génica puede expresarse como cualquier unidad arbitraria. Por ejemplo, el valor de la expresión génica puede expresarse como la diferencia (deltaCT) entre (i) la cantidad del ARNm específico del marcador biológico y (ii) la cantidad de un ARNm no relacionado, encontrado en la muestra de tejido tumoral, tal como por ejemplo el ARNm 18S ribosómico. De forma ilustrativa, para el cáncer colorrectal humano, la diferencia entre (i) la cantidad del ARNm específico del marcador biológico y (ii) la cantidad de un ARNm no relacionado puede asignarse arbitrariamente para consistir en el deltaCT y en la media de todos los valores del grupo de referencia (por ejemplo, para pacientes que han experimentado etapas tempranas de procesos de metástasis (VELIPI) y recidivas, ajustado a "100%"). En estas realizaciones, el valor de cuantificación generado para un ARNm específico de un gen particular, en la etapa a) del método, es mayor del 100 %, entonces se obtiene un mejor pronóstico del cáncer que con el valor de referencia predeterminado. Por ejemplo, esto se muestra en los ejemplos de la presente memoria, cuando se usa de forma destacada ARNm específico de CD8a, ARNm específico de GZM-B y ARNm específico de GNLY.

Comparación o comparaciones llevadas a cabo en la etapa b)

Tal y como ya se ha especificado, y tal y como se muestra en los ejemplos de la presente memoria, la etapa b) del método de pronóstico in vitro de la invención consiste en comparar, para cada marcador biológico ensayado, respectivamente:

(i) el valor de cuantificación encontrado en la etapa a) para dicho marcador biológico; y

(ii) el valor de referencia correspondiente que ya se ha predeterminado para dicho marcador biológico.

Cuando dos o más marcadores biológicos se cuantifican en la etapa a), entonces la etapa b) consiste en dos o más etapas de comparación del tipo que se ha definido anteriormente.

Además, cuando un marcador biológico específico se cuantifica en la etapa a) en diversas localizaciones del tumor, y especialmente de forma separada tanto en el centro del tumor (CT) como en el margen invasivo (IM), entonces la etapa b) comprende para dicho marcador biológico específico el mismo número de etapas de comparación que el número de localizaciones del tumor en donde dicho marcador biológico específico se cuantifica. Especialmente para las situaciones en las que se cuantifica un marcador biológico específico de forma separada tanto en el CT como en el IM en la etapa a), entonces la etapa b) comprende, para dicho marcador biológico específico, dos etapas de comparación, respectivamente:

(i) una primera etapa de comparación entre el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para dicho marcador biológico en el CT, con el valor de referencia predeterminado en el CT para dicho marcador biológico; y

(ii) una segunda etapa de comparación entre el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para dicho marcador biológico en el IM, con el valor de referencia predeterminado en el IM para dicho marcador biológico.

De este modo, la etapa b) comprende el mismo número de etapas de comparación únicas que el número de valores de cuantificación que se obtienen en la etapa a).

Dicha etapa de comparación b), independientemente de si la etapa a) consiste en la etapa a1) (métodos inmunológicos) o en la etapa a2) (análisis de la expresión génica) tal y como se ha definido anteriormente, también comprende, preferentemente, el cálculo de una relevancia estadística de la pluralidad de valores de cuantificación de marcador medidos en la etapa a), después de su comparación con los valores de referencia correspondientes, por ejemplo, utilizando un ensayo de rango logarítmico de P, tal y como se describe en los ejemplos de la presente memoria.

De forma más simple, dicha etapa de comparación b) puede incluir una clasificación de los valores de cuantificación medidos en la etapa a), para cada marcador biológico, y opcionalmente también para cada tipo de tejido tumoral ensayado, en dos grupos, respectivamente: (i) un primer grupo denominado “Hi” cuando el valor de cuantificación para dicho marcador biológico, opcionalmente en dicho tipo de tejido tumoral, es superior al valor de referencia correspondiente predeterminado y (ii) un segundo grupo denominado “Lo” cuando el valor de cuantificación para dicho marcador biológico, opcionalmente en dicho tipo de tejido tumoral, es inferior al valor de referencia correspondiente predeterminado. Si el resultado de la etapa de comparación b) consiste exclusivamente en valores “Hi” para cada marcador ensayado, entonces se determina un pronóstico del resultado favorable para dicho cáncer. A la inversa, si el resultado de la etapa de comparación b) consiste exclusivamente en valores “Lo” para cada marcador ensayado, entonces se determina un pronóstico del resultado malo para dicho cáncer. Se determinan conclusiones intermedias para pacientes “heterogéneos”, en los que, en la etapa de comparación b), los valores de cuantificación “Hi” se encuentran para uno o más de los marcadores biológicos ensayados y los valores de cuantificación “Lo” se encuentran para los marcadores restantes de la combinación de marcadores biológicos ensayados, tal como se describe en los ejemplos de la presente memoria.

Los inventores creen que una razón adicional para explicar la elevada relevancia estadística del método de pronóstico in vitro según la invención, para predecir el resultado de un cáncer, consiste en el tamaño de las cohortes de pacientes que se han ensayado, que proporciona unos valores de referencia muy exactos, por ejemplo, valores de “punto de corte” muy exactos; permitiendo una discriminación reproducible y exacta entre pacientes con pronóstico bueno y pacientes con pronóstico malo.

De este modo, en una realización de las más preferidas del método in vitro según la invención, el valor de referencia predeterminado para cada marcador biológico específico, y opcionalmente el tipo de tejido tumoral, que se utiliza en la etapa de comparación b) se calcula en base a los valores de cuantificación para dicho marcador, y opcionalmente dicho marcador en dicho tipo de tejido tumoral, que se miden previamente en muestras de tejido tumoral que provienen de una gran población de individuos con cáncer.

La exactitud de un valor de referencia predeterminado específico aumenta con el número de muestras de tejido que se utilizan para obtener los valores de cuantificación para un marcador biológico específico y, de este modo, para calcular un valor promedio (el valor de referencia predeterminado) que se asocia con un resultado del cáncer específico. De este modo, otra explicación para la elevada exactitud del método de pronóstico in vitro según la invención también reside en la elevada relevancia de los valores de referencia predeterminados, con los cuales se comparan los valores de cuantificación, en la etapa b) del método. De la forma más preferente, en vista de la obtención de valores de referencia predeterminados altamente relevantes para cada marcador biológico de interés, dichos valores de referencia predeterminados consisten en el valor promedio de una pluralidad de valores de cuantificación de dicho marcador medidos en muestras de tejido que provienen de la misma pluralidad de pacientes con cáncer que experimentaron un resultado clínico específico.

De la forma más preferente, para evaluar unos valores de referencia predeterminados exactos, dichos valores de referencia se predeterminan a partir de al menos 50 valores de cuantificación, para un marcador biológico específico, utilizando, de este modo, muestras de tejido que provienen de al menos 50 pacientes con cáncer que han experimentado un resultado clínico malo o bueno específico, por ejemplo, DFS u OFS de más de 5 años después del diagnóstico. En realizaciones preferidas, se obtiene un valor de referencia predeterminado de al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 o más valores de cuantificación para un marcador biológico específico.

De forma ilustrativa, los valores de referencia predeterminados descritos en los ejemplos de la presente memoria se han obtenido a partir de muestras de tejido que provienen de una cohorte de aproximadamente 500 pacientes con cáncer.

La posibilidad según la invención de ensayar grandes cohortes de pacientes, es decir, un gran número de muestras de tejido, se proporcionó de forma destacada por la utilización de la técnica de micromatrices de tejido que se detalla con más detalle en la presente memoria descriptiva.

En los ejemplos de la presente memoria se describen con total detalle realizaciones específicas de los métodos utilizados para llevar a cabo la etapa b).

Etapa c) opcional del método

El método de pronóstico in vitro del cáncer de la invención puede comprender adicionalmente una etapa c) en la que se proporciona el resultado del pronóstico per se.

De este modo, el método de pronóstico del cáncer de la invención puede comprender una etapa c) adicional en la que, dependiendo del marcador o marcadores biológicos utilizados:

(i) se determina un buen pronóstico de un paciente para la progresión del cáncer, sin recidiva del cáncer o sin recurrencia del cáncer, cuando el valor o valores de cuantificación obtenidos en la etapa a) para un marcador biológico específico, o una combinación específica de marcadores biológicos, es superior a, o inferior a, respectivamente, el valor o valores de referencia predeterminados correspondientes; o bien

(ii) se determina un mal pronóstico de un paciente para la progresión del cáncer, con recidiva del cáncer o con recurrencia del cáncer, cuando el valor o valores de cuantificación obtenidos en la etapa a) para un marcador biológico específico, o una combinación específica de marcadores biológicos, es superior a, o inferior a, dicho valor o valores de referencia predeterminados correspondientes;

De forma alternativa, el método de pronóstico del cáncer de la invención puede comprender una etapa c) adicional en la que, dependiendo del marcador o marcadores biológicos utilizados:

(i) se determina un buen pronóstico de un paciente para la progresión del cáncer, con un valor alto de supervivencia libre de enfermedad (DFS) o un valor alto de supervivencia total (OS), cuando el valor o los valores de cuantificación obtenidos en la etapa a) para un marcador biológico específico, o una combinación específica de marcadores biológicos, es superior a, o inferior a, el valor o valores de referencia predeterminados correspondientes; o bien (ii) se determina un mal pronóstico de un paciente para la progresión del cáncer, con un valor bajo de supervivencia libre de enfermedad (DFS) o un valor bajo de supervivencia total (OS), cuando el valor o los valores de cuantificación obtenidos en la etapa a) para un marcador biológico específico, o una combinación específica de marcadores biológicos, es superior a, o inferior a, respectivamente, dicho valor o valores de referencia predeterminados correspondientes;

Habitualmente, para la mayor parte de los marcadores biológicos utilizados en la presente memoria, el valor de cuantificación aumenta con un incremento de la respuesta inmune adaptativa contra el cáncer. Por ejemplo, cuando el marcador biológico que se cuantifica en la etapa a) consiste en una proteína o un gen que se expresan específicamente por células del sistema inmune, el valor de cuantificación de dicho marcador aumenta con el nivel de la respuesta inmune adaptativa contra el cáncer del paciente ensayado. Por lo tanto, cuando se lleva a cabo la etapa b) del método de pronóstico del cáncer de la invención, se determina un buen pronóstico cuando el valor de cuantificación para un marcador biológico específico que se obtiene en la etapa a) es superior al valor de referencia predeterminado correspondiente, de forma destacada en realizaciones en las que el valor de referencia predeterminado consiste en un valor de punto de corte. A la inversa, se determina un mal pronóstico cuando el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para un marcador biológico específico es inferior al valor de referencia predeterminado correspondiente, de forma destacada en realizaciones en las que el valor de referencia predeterminado consiste en un valor de punto de corte.

En los ejemplos de la presente memoria se describen con total detalle realizaciones específicas de los métodos utilizados para llevar a cabo la etapa c).

Combinaciones de marcadores biológicos

Cuando se lleva a cabo el método de pronóstico del cáncer con más de un marcador biológico, el número de marcadores biológicos distintos que se cuantifican en la etapa a) es habitualmente inferior a 100 marcadores distintos, y en la mayor parte de las realizaciones, inferior a 50 marcadores distintos.

De forma ventajosa, cuando se busca el cribado de muestras con un alto rendimiento, el método de pronóstico del cáncer de la invención se lleva a cabo utilizando hasta 20 marcadores biológicos distintos.

Cuanto más elevado es el número de marcadores biológicos distintos que se cuantifican en la etapa a) del método, más exacto será el pronóstico final del cáncer.

El número de marcadores biológicos distintos que es necesario para obtener un pronóstico del cáncer exacto y fiable, utilizando el método de pronóstico in vitro de la invención, puede variar de forma destacada según el tipo de técnica de cuantificación que se lleva a cabo en la etapa a).

De forma ilustrativa, se descubrió una significancia estadística alta con una combinación de un número pequeño de marcadores biológicos, cuando la etapa a) se lleva a cabo mediante detección inmunohistoquímica in situ de marcadores de proteína de interés, dado que la cuantificación separada de dichos marcadores se lleva a cabo tanto en el centro del tumor (CT) como en el margen invasivo (IM). De forma ilustrativa, se obtuvo una significancia estadística alta con una combinación de dos a diez marcadores biológicos, tal como se describe en los ejemplos de la presente memoria. Sin pretender la vinculación a ninguna teoría particular, los inventores creen que la relevancia estadística alta (valor de P inferior a 10-3) para el pronóstico del cáncer se consigue cuando la etapa a) se lleva a cabo utilizando un método inmunohistoquímico para la cuantificación del marcador biológico, y utilizando una combinación de tres marcadores biológicos distintos, o más.

Adicionalmente de forma ilustrativa, también se descubrió una significancia estadística alta con un número pequeño de marcadores biológicos, cuando la etapa a) se lleva a cabo mediante el análisis de la expresión génica de marcadores de genes de interés, aunque la técnica de análisis de la expresión génica se lleva a cabo en la totalidad de la muestra de tumor. En la tabla 4 se muestran de forma destacada realizaciones ilustrativas de varias combinaciones altamente significativas de dos marcadores de genes. Sin pretender la vinculación a ninguna teoría particular, los inventores creen que la relevancia estadística alta (valor de P inferior a 10-3) se consigue cuando la etapa a) se lleva a cabo utilizando un análisis de la expresión génica para la cuantificación del marcador biológico, y utilizando una combinación de diez marcadores biológicos distintos, y más preferentemente, una combinación de quince marcadores biológicos distintos, de la forma más preferente, veinte marcadores biológicos distintos, o más.

Tal y como se muestra en los ejemplos de la presente memoria, se puede obtener un pronóstico fiable del cáncer cuando se cuantifica un único marcador biológico en la etapa a) del método, tal como se ilustra, por ejemplo, con la cuantificación de los marcadores biológicos CD3+, CD8+, CD45RO, GZM-B, GLNY, TBX21, IRF1 , IFNG, CXCL9 y CXCL10.

De este modo, en realizaciones preferidas del método de pronóstico del cáncer según la invención, la muestra de tejido tumoral a la que se hace referencia en la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en (i) un tumor primario global (como una totalidad), (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente el tumor, tejido que puede denominarse más específicamente el “margen invasivo” del tumor, (iv) los ganglios linfáticos localizados en la zona más próxima del tumor, (v) una biopsia de tumor realizada antes de la cirugía (para el seguimiento de pacientes después del tratamiento, por ejemplo) y (vi) una metástasis distante.

De la forma más preferente, cuando el método de pronóstico in vitro de la invención se lleva a cabo con marcadores biológicos que consisten en las densidades de células que expresan proteínas específicas, entonces la etapa a) se lleva a cabo mediante técnicas inmunohistoquímicas y se miden las densidades celulares (i) en el centro del tumor (CT), (ii) en el margen invasivo (IM) o (iii) separadamente tanto en el CT como en el IM.

De la forma más preferente, cuando el método de pronóstico in vitro de la invención se lleva a cabo con marcadores biológicos que consisten en el nivel de expresión de genes de interés, entonces la etapa a) se lleva a cabo mediante métodos de análisis de la expresión génica, como análisis por PCR Taqman en tiempo real, empezando a partir del tejido tumoral completo que se recogió inicialmente del paciente con cáncer, por ejemplo, un tejido tumoral que se origina de una resección tumoral durante una operación quirúrgica.

Preferentemente, al menos un marcador biológico adicional indicativo del estado de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente contra el cáncer, se cuantifica en la etapa a), que puede consistir en al menos un marcador biológico expresado por una célula del sistema inmune seleccionada del grupo que consiste en linfocitos B, linfocitos T, monocitos/macrófagos, células dendríticas, células NK, células NKT, y células NK-DC.

Preferentemente, dicho al menos un marcador biológico adicional, que se cuantifica en la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en:

(i) el número o la densidad de células del sistema inmune contenidas en la muestra de tejido tumoral y que expresan dicho arcador biológico, generalmente, un marcador de proteína; y

(ii) el nivel de expresión de un ácido nucleico de interés en la muestra de tejido tumoral, generalmente la cantidad de ARNm codificado por un marcador génico específico.

En determinadas realizaciones del método, dicho al menos un marcador biológico adicional consiste en la densidad de linfocitos T presentes en el sitio del tumor.

En determinadas otras realizaciones, dicho al menos un marcador biológico adicional consiste en el valor de cuantificación de una proteína expresada por las células del sistema inmune presentes en el sitio del tumor.

En realizaciones adicionales del método, dicho al menos un marcador biológico adicional consiste en el valor de cuantificación de la expresión de un gen expresado específicamente por células del sistema inmune presentes en el sitio del tumor.

Una lista de los marcadores biológicos preferidos que pueden usarse para llevar a cabo el método de pronóstico del cáncer de la invención se listan en las Tablas 2, 4, 8, 9 y 10. Las Tablas 2, 9 y 10 contienen, para cada marcador biológico que se lista, el número de acceso a sus secuencias de ácido nucleico y aminoácidos, según está disponible en la base de datos Internacional GenBank.

Aunque el método de pronóstico del cáncer según la invención se ha ensayado para el cáncer colorrectal, dicho método se puede aplicar a una amplia variedad de cánceres. Sin pretender la vinculación a ninguna teoría particular, los inventores creen que el método de pronóstico del cáncer de la invención se puede llevar a cabo de forma exitosa para pronosticar la progresión de cualquier cáncer que se desarrolle a partir de un tumor central al que tienen acceso las células del sistema inmune.

De este modo, el método de pronóstico del cáncer según la invención es potencialmente útil para determinar el pronóstico de pacientes para la progresión de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer adrenocortical, cáncer anal, cáncer del conducto biliar (por ejemplo, cáncer perihilar, cáncer del conducto biliar distal, cáncer del conducto biliar intrahepático), cáncer de vejiga, cáncer de huesos (por ejemplo, osteoblastoma, osteocondroma, hemangioma, fibroma condromixoide, osteosarcoma, condrosarcoma, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, tumor de célula gigante del hueso, cordoma, linfoma, mieloma múltiple), cáncer de cerebro y del sistema nervioso central (por ejemplo, meningioma, astocitoma, oligodendrogliomas, ependimoma, gliomas, meduloblastoma, ganglioglioma, Schwannoma, germinoma, craniofaringioma), cáncer de mama (por ejemplo, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobular infiltrante, carcinoma lobular in situ, ginecomastia), enfermedad de Castleman (por ejemplo, hiperplasia de nódulo linfático gigante, hiperplasia de nódulo linfático angiofolicular), cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer endometrial (por ejemplo, adenocarcinoma endometrial, adenocantoma, adenocarcinoma papilar seroso, célula clara), cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar (adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de célula pequeña), tumores carcinoides gastrointestinales (por ejemplo, coriocarcinoma, corioadenoma destruens), enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (por ejemplo, cáncer de célula renal), cáncer laríngeo e hipofaríngeo, cáncer de hígado (por ejemplo, hemangioma, adenoma hepático, hiperplasia nodular focal, carcinoma hepatocelular), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña), mesotelioma, plasmacitoma, cáncer de seno de la cavidad nasal y paranasal (por ejemplo, estesioneuroblastoma, granuloma de línea media), cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma (por ejemplo, rabdomiosarcoma embrionario, rabdomiosarcoma alveolar, rabdomiosarcoma pleomórfico), cáncer de glándula salivar, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, cáncer de piel sin melanoma), cáncer de estómago, cáncer testicular (por ejemplo, seminoma, cáncer de célula germinal no seminoma), cáncer de timo, cáncer tiroideo (por ejemplo, carcinoma folicular, carcinoma anaplásico, carcinoma poco diferenciado, carcinoma medular tiroideo, linfoma tiroideo), cáncer vaginal, cáncer vulvar, y cáncer uterino (por ejemplo, leiomiosarcoma uterino).

Como se resalta en las reivindicaciones, el método según la invención implica al menos dos marcadores biológicos que comprenden PDCD1LG1 y CXCL9. De forma ilustrativa, el al menos un marcador biológico adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en los siguientes marcadores biológicos:

(i) Marcadores biológicos variados

ICAM-2/CD102, 4-1BB/TNFRSF9, IFN-gamma R1, IFN-gamma R2, B7-1/CD80, IL-1 RI, IL-2 R alfa, BLAME/SLAMF8, IL-2 R beta, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, IL-7 R alfa, CCR9, CXCR1/IL-8 RA, CD2, CD3épsilon, CD3zeta, CD3gamma, CD4, CD4+/45RA-, IL-12 R beta 1, CD4+/45RO-, IL-12 R beta 2, CD4+/CD62L-/CD44, CD4+/CD62L+/CD44IL-17, CD5, Integrina alfa 4/CD49d, CD6, Integrina alfa E/CD103, CD8, Integrina alfa M/CD11 b, CD8+/45RA-, Integrina alfa X/CD11c, CD8+/45RO-, Integrina beta 2/CD18, CD27/TNFRSF7, LAG-3, CD28, LAIR1, CD30/TNFRSF8, LAIR2, CD31/PECAM-1, Ligando CD40/TNFSF5, NCAM-L1, CD43, NTB-A/SLAMF6, CD45, CD83, CD84/SLAMF5, RANK/TNFRSF11A, L-Selectina, CD229/SLAMF3, SIRP beta 1, CD69, SLAM, Cadena gamma Común/IL-2 R gamma, CRACC/SLAMF7, CX3CR1, CXCR3, CXCR4, CXCR6, TNF RI/TNFRSF1A, TNF RII/TNFRSF1B, Fas/TNFRSF6, Ligando Fas/TNFSF6, TSLP, TSLP R, ICAM-1/CD54, IL-2, IFN-gamma, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13,

(ii) Marcadores biológicos de células Th1/Th2:

Il-2R Cadena beta Común, Cadena gamma Común/IL-2 R gamma, IFN-gamma, IFN-gamma R1, IL-12, IFN-gamma R2, IL-12 R beta 1, IL-2, IL-12 R beta 2, IL-2 R alfa, IL-2 R beta, IL-24, TNF RI/TNFRSF1A, TNF RII/TNFRSF1B, IL-4 R, TNF-beta/TNFSF1 B,

(iii) Marcadores biológicos de la familia de los interferones:

IFN alfa, IFN beta, IFN-alfa/beta R1, IFN-alfa/beta R2, IFN-gamma R1, IFN-gamma R2, IFN-alfa A, IFN-alfa/beta R2, IFN-alfa B2, IFN-beta, IFN-alfa C, IFN-gamma, IFN-alfa D, IFN-alfa G, IFN-omega, IFN-alfa H2,

(iv) Marcadores biológicos de la familia de receptores de cadena gamma común:

Cadena gamma Común/IL-2 R gamma, IL-7 R alfa, IL-2, IL-9, IL-2 R alfa, IL-9 R, IL-2 R beta, IL-15, IL-15 R alfa, IL-21, IL-7,IL-21 R,IL-31,

(v) Marcadores biológicos de quimioquinas y receptores CX3C:

Ligandos quimioquina CX3C, CX3CL1/Fractalkina,

Receptores de quimioquina CX3C, CX3CR1,

(vi) Marcadores biológicos de quimioquinas y receptores CXC,

Ligandos quimioquina CXC, CXCL13/BLC/BCA-1, CXCL11/I-TAC, CXCL14/BRAK, CXCL8/IL-8, CINC-1, CXCL10/IP-10/CRG-2, CINC-2, CINC-3, CXCL16, CXCL15/Lungkina, CXCL5/ENA, MIG, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, GRO, CXCL4/PF4, CXCL1/GRO alfa, CXCL12/SDF-1, CXCL2/GRO beta, Quimioquina-1 de Timo, CXCL3/GRO gamma, Receptores de Quimioquina CXC, CXCR6, CXCR3, CXCR1/IL-8 RA, CXCR4, CXCR2/IL-8 RB, CXCR5,

(vii) Marcadores biológicos de quimioquinas y receptores CC,

Ligandos quimioquina CC, CCL21/6Cquina, CCL12/MCP-5, CCL6/C10, CCL22/MDC, CCL28, CCL3L1/MIP-1 alfa Isoforma LD78 beta, CCL27/CTACK, CCL3/MIP-1 alfa, CCL24/Eotaxina-2, CCL4/MIP-1 beta, CCL26/Eotaxina-3, CCL15/MIP-1 delta, CCL11/Eotaxina, CCL9/10/MIP-1 gamma, CCL14a/HCC-1, MIP-2, CCL14b/HCC-3, CCL19/MIP-3 beta, CCL16/HCC-4, CCL20/MIP-3 alfa, CCL1/I-309/TCA-3, CCL23/MPIF-1, MCK-2, CCL18/PARC, CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2, CCL17/TARC, CCL7/MCP-3/MARC, CCL25/TECK, CCL13/MCP-4CC, Receptores de Quimioquina, CCR1, CCR7, CCR2, CCR8, CCR3, CCR9, CCR4, D6, CCR5, HCR/CRAM-A/B, CCR6 (viii) Marcadores biológicos de inhibidores de quimioquina CC

CCI, Homólogos de Quimioquina Virales CC, MCV-tipo-II, MIP-II, MIP-I, MIP-III

(ix) Marcadores biológicos de quimioquinas y receptores C

La subfamilia C (gamma) carece del primer y tercer residuos de cisteína. La linfotactina (también conocida como SCM1 alfa) y SCM-1 beta son actualmente los dos únicos miembros de la familia. Ambos tienen actividad quimiotáctica para linfocitos y células NK.

Ligandos Quimioquina C, XCL1/Linfotactina

Receptores de Quimioquina C, XCR1

(x) Marcadores biológicos de otras interleuquinas

IL-12, IL-12 R beta 1, IL-12 R beta 2, IL-27, IL-15, IL-31

En la presente memoria descriptiva, el nombre de cada uno de los distintos marcadores biológicos de interés hace referencia al nombre reconocido internacionalmente del gen correspondiente, tal como se encuentra en las bases de datos de secuencias de genes y secuencias de proteínas reconocidas internacionalmente, que incluyen la base de datos del HUGO Gene Nomenclature Committee, que está disponible particularmente en la siguiente dirección de Internet: http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/index.html.

En la presente memoria descriptiva, el nombre de cada uno de los diversos marcadores biológicos de interés también puede hacer referencia al nombre reconocido internacionalmente del gen correspondiente, tal como se encuentra en la base de datos de secuencias de genes y secuencias de proteínas Genbank reconocida internacionalmente.

Mediante estas bases de datos de secuencias reconocidas internacionalmente, un experto en la técnica puede recuperar las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos correspondientes a cada uno de los marcadores biológicos de interés descritos en la presente memoria.

En realizaciones aún adicionales del método, como ya se ha mencionado anteriormente, los valores de cuantificación para una combinación de marcadores biológicos se obtienen en la etapa a) del método de pronóstico del cáncer de la invención.

Por lo tanto, el método de pronóstico del cáncer de la invención puede llevarse a cabo con una combinación de marcadores biológicos. El número de marcadores biológicos usado solo está limitado por el número de marcadores biológicos distintos de interés que están disponibles de forma práctica en el momento de llevar a cabo el método. Sin embargo, un número demasiado alto de marcadores biológicos incrementará significativamente la duración del método sin mejorar significativamente de forma simultánea la determinación del pronóstico final.

Habitualmente, en las realizaciones en las que se lleva a cabo el método de pronóstico del cáncer de la invención con una combinación de marcadores biológicos, no se cuantifican más de 50 marcadores biológicos distintos en la etapa a). En la mayor parte de las realizaciones, se cuantifica una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50 marcadores biológicos distintos. Sin embargo, como ya se ha mencionado previamente en la presente memoria descriptiva, el número de marcadores combinados que se requieren para conseguir una relevancia estadística alta (por ejemplo, P inferior a 10-3), dependerá del tipo de técnica para cuantificar dicha combinación de marcadores biológicos, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro.

En determinadas realizaciones del método de pronóstico in vitro de la invención, en las que la etapa a) se lleva a cabo mediante la cuantificación de marcadores biológicos con técnicas inmunohistoquímicas, la utilización de una combinación de un número bajo de marcadores puede ser suficientemente informativa, específicamente si los marcadores biológicos se cuantifican de forma separada, tanto en el centro del tumor (CT) como en el margen invasivo (IM).

En determinadas otras realizaciones del método de pronóstico in vitro de la invención, en las que la etapa a) se lleva a cabo mediante la cuantificación de marcadores biológicos con técnicas de análisis de la expresión génica, se requiere generalmente la utilización de una combinación de un número superior de marcadores, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 marcadores biológicos distintos.

En más realizaciones adicionales del método, el dicho al menos un marcador biológico adicional se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD8, GZMB, CD45RO, GLNY, TBX21, IRF1, IFNG, CXCL10, CD4, CXCR3, CXCR6, IL-18, IL-18Rbeta, Fractalkina, IL-23, IL-31, IL-15, IL-7, MIG, Perforina, TCRap, TCRy5, LAT, ZAP70, CD5 y CD2. Estos marcadores biológicos se cuantifican preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, por métodos inmunoquímicos, incluyendo métodos inmunohistoquímicos in situ. Los valores de cuantificación pueden expresarse como la densidad media de células que expresan una proteína marcadora de interés contenida por área superficial de una sección de tejido de la muestra del tejido tumoral.

De forma ilustrativa, una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 marcadores biológicos adicionales distintos se cuantifica en la etapa a), marcadores biológicos que se seleccionan del grupo que consiste en CD3, CD8, GZMB, CD45RO, GLNY, TBX21, IRF1, IFNG, CXCL10, c D4, CXCR3, CXCR6, IL-18, IL-18Rbeta, Fractalkina, IL-23, IL-31, IL-15, IL-7, MIG, Perforina, TCRap, TCRy5, LAT, ZAP70, CD5 y CD2. La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con técnicas inmunohistoquímicas.

De forma ilustrativa adicional, una combinación de 2 o más marcadores distintos adicionales que puede cuantificarse en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención puede seleccionarse de 2 o más marcadores biológicos adicionales que se seleccionan del grupo que consiste en c Cr 5, CR7, CD103, CD119, CD120a, CD120b, CD122, CD127, CD134, CD14, CD152, CD154, CD178, CD183, CD184, CD19, CD1a, CD210, CD25, CD26, CD27, CD28, CD3, CD32, CD4, CD44, CD45, CD45Ra, CD45Ro, CD47, CD49d, CD5, CD54, CD56, CD62L, CD69, CD7, CD8, CD80, CD83, CD86, CD95, CD97, CD98, CXCR6, GITR, HLA-DR, ICOS, IFNyRII, IL-18Ra, KIR-NKAT2, PD1, TCRap y TGFRII. La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con técnicas inmunohistoquímicas. En la Tabla 3 de la presente memoria está contenida una lista de anticuerpos dirigidos específicamente contra cada una de estas proteínas marcadoras.

Más adicionalmente, las combinaciones de al menos dos marcadores biológicos adicionales engloban combinaciones de dos o más marcadores biológicos distintos seleccionados del grupo de marcadores biológicos que comprende los siguientes marcadores biológicos: factor de transcripción 21 de la caja T (T-bet), factor regulador 1 del interferón (IRF-1), IFNy, CD3Z, CD8, granulisina (GLNY) y granzima B (GZMB). La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con técnicas inmunohistoquímicas.

De forma ilustrativa, la combinación de dos marcadores biológicos adicionales puede seleccionarse del grupo que consiste en CD8A-TBX21, CD3Z-CD8A, CD3Z-TBX21, B7H3-TGFB1, IFNG-TBX21, CD4-CD8A, CD8A, IFNG, CD4-TBX21, CD3Z-CD4, CD4-TGFB1, CD8A-GLNY, IFNG-IRF1, GLNY-IFNG, IRF1-TBX21, IL8-PTGS2, GLNY-TBX21, CD3Z-GLNY, CD3Z-IFNG, GZMB-IFNG, GLNY-IRF1, IL10-TGFB1, CD8A-IL10, CD4-IL10, CD8A-GZMB, GZMB-TBX21, CD3Z-GZMB, CD4-IRF1, GNLY-GZMB, B7H3-IL10, CD4-GZMB, GZMB-IRF1, IL10-TBX21, CD4-IFNG, B7H3-CD4, CD8A-TGFB1, CD3Z-IL10 y CD4-GNLY. La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con técnicas de análisis de la expresión génica.

Otras combinaciones de dos marcadores biológicos adicionales que pueden usarse, opcionalmente con uno o más marcadores biológicos distintos, se listan en la Tabla 4 de la presente memoria. La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con métodos de análisis de la expresión génica.

Otras combinaciones más de al menos dos marcadores adicionales que pueden usarse, opcionalmente con uno o más marcadores biológicos distintos, se listan en la Tabla 8 de la presente memoria. La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con métodos de análisis de la expresión génica.

Otras combinaciones más de al menos dos marcadores biológicos adicionales engloban combinaciones de dos o más marcadores biológicos distintos seleccionados del grupo de marcadores biológicos que se listan en la in Tabla 9 de la presente memoria, que comprende los siguientes marcadores biológicos: 18s, ACE, ACTB, AGTR1 , AGTR2, APC, APOA1, ARF1, AXIN1, BAX, BCL2, BCL2L1, CXCR5, BMP2, BRCA1, BTLA, C3, CASP3, CASP9, CCL1, CCL11, CCL13, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCNB1, CCND1, CCNE1, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCRL2, CD154 , CD19, CD1a, CD2, CD226, CD244, PDCD1LG1, CD28, CD34, CD36, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40LG, CD5, CD54, CD6, CD68, CD69, CLIP, CD80, CD83, SLAMF5, CD86, CD8A, CDH1, CDH7, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CEACAM1, COL4A5, CREBBP, CRLF2, CSF1, CSF2, CSF3, CTLA4, CTNNB1, CTSC, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CYP1A2, CYP7A1, DCC, DCN, DEFA6, DICER1, DKK1, Dok-1, Dok-2, DOK6, DVL1, E2F4, EBI3, ECE1, ECGF1, EDN1, EGF, EGFR, EIF4E , CD105, ENPEP, ERBB2, EREG, FCGR3A, CGR3B, FN1, FOXP3, FYN, FZD1, GAPD, GLI2, GNLY, GOLPH4, GRB2, GSK3B, GSTP1, GUSB, GZMA, GZMB, GZMH, GZMK, HLA-B, HLA-C, HLA-, MA, HLA-DMB, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DPA1, HLA-DQA2, HLA-DRA, HLX1, HMOX1, HRAS, HSPB3, HUWE1, ICAM1, ICAM-2, ICOS, ID1, ifna1, ifna17, ifna2, ifna5, ifna6, ifna8, IFNAR1, IFNAR2, IFNG, IFNGR1, IFNGR2, IGF1, IHH, IKBKB, IL10, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL17, IL17R, IL17RB, IL18, IL1A, IL1B, IL1R1, IL2, IL21, IL21R, IL23A, IL23R, IL24, IL27, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL31RA, IL4, IL4RA, IL5, IL6, IL7, IL7RA, IL8, CXCR1, CXCR2, IL9, IL9R, IRF1, ISGF3G, ITGA4, ITGA7, integrina, alfa E (antígeno CD103, linfocito mucosal humano, antígeno 1; polipéptido alfa), Gen hCG33203, ITGB3, JAK2, JAK3, KLRB1, KLRC4, KLRF1, KLRG1, KRAS, LAG3, LAIR2, LEF1, LGALS9, LILRB3, LRP2, LTA, SLAMF3, MADCAM1, MADH3, MADH7,MAF, MAP2K1, MDM2 , MICA, MICB, MKI67, MMP12, MMP9, MTA1, MTSS1, MYC, MYD88, MYH6, NCAM1, NFATC1, NKG7, NLK, NOS2A, P2X7, PDCD1, PECAM-, CXCL4, PGK1, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, PLAT, PML, PP1A, CXCL7, PPP2CA, PRF1, PROM1, PSMB5, PTCH, PTGS2, PTP4A3, PTPN6, PTPRC, RAB23, RAC/RHO , RAC2, RAF, RB1, RBL1, REN, Drosha, SELE, SELL, SELP, SERPINA1, SFRP1, SIRP beta 1, SKI, SLAMF1, SLAMF6, SLAMF7, SLAMF8, SMAD2, SMAD4, SMO, SMOH, SMURF1, SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6, SOCS7, SOD1, SOD2, SOD3, SOS1, SOX17, CD43, ST14, STAM, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, STK36, TAP1, TAP2, TBX21, TCF7, TERT, TFRC, TGFA, TGFB1, TGFBR1, TGFBR2, TIMP3, TLR1, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF11A, TNFRSF18, TNFRSF1A, TNFRSF1B, OX-40, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10, TNFSF6, TOB1, TP53, TSLP, VCAM1, VEGF, WIF1, WNT1, WNT4, XCL1, XCR1, ZAP70 y ZIC2. La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con métodos de análisis de la expresión génica.

Las combinaciones preferidas más adicionales de al menos dos marcadores biológicos adicionales engloban combinaciones de dos o más marcadores biológicos distintos seleccionados del grupo que comprende los siguientes marcadores biológicos: TNFRSF6B, CEACAM1, CD8A, PTGS2, BIRC5, SELL, INDO, IRAK4, TNF, TNFRSF10A, MMP7, LILRB3, CD3Z, TNFRSF8, GAPD, CXCL10, EBAG9, IL8, STAT1, CXCR3, TGFB1, ICOS, CD97, IL18RAP, CXCR6, ART1, IRF1, B7H3, ACE, IL18R1, TBX21, IL18, PDCD1, IFNG, GNLY, GATA3, VEGF, GZMB, LAT, CD4, IRTA2, IL10, TNFSF4, THSD1 y PDCD1LG2. La cuantificación de este grupo de marcadores biológicos se lleva a cabo preferentemente, en la etapa a) del método de pronóstico in vitro de la invención, con métodos de análisis de la expresión génica.

Cualquier combinación de al menos dos marcadores biológicos adicionales seleccionados del grupo de marcadores biológicos que se describe en la presente memoria descriptiva está englobada por la invención.

En determinadas realizaciones del método, se usa una combinación de dos marcadores biológicos adicionales en la etapa a), que también puede denominarse en la presente memoria un "conjunto" de marcadores biológicos.

Un conjunto específico de marcadores biológicos adicionales, que puede cuantificarse mediante técnicas de análisis de la expresión génica, consiste en el conjunto que consiste en los siguientes marcadores biológicos: VEGF, TNFRSF6B, IRF1, IL8RA y SELL.

Métodos generales para la cuantificación de marcadores biológicos

Para llevar a cabo el método de pronóstico del cáncer de la invención se puede utilizar uno cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica para la cuantificación de tipos celulares, un marcador biológico de tipo proteína o de tipo ácido nucleico englobado en la presente memoria. De este modo, se puede aplicar fácilmente una cualquiera de las técnicas estándares y no estándares (emergentes) muy conocidas en la técnica para la detección y cuantificación de una proteína o un ácido nucleico en una muestra.

Dichas técnicas incluyen la detección y cuantificación de marcadores biológicos de tipo ácido nucleico con sondas o cebadores nucleicos.

Dichas técnicas también incluyen la detección y cuantificación de marcadores biológicos de tipo proteína con cualquier tipo de molécula ligando que se une específicamente a los mismos, entre las que se incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos seleccionados para unirse a través del método bien conocido Selex) y anticuerpos que incluyen fragmentos de anticuerpo. En determinadas realizaciones en las que el marcador biológico de interés consiste en una enzima, estos métodos de detección y cuantificación también pueden incluir la detección y cuantificación de la actividad enzimática correspondiente.

De forma destacada, actualmente hay anticuerpos disponibles para la mayor parte, si no para todos, los marcadores biológicos descritos en la presente memoria descriptiva, entre los que se incluyen los marcadores biológicos que se listan en la Tabla 2.

Además, en situaciones en las que no hay todavía un anticuerpo disponible para un marcador biológico determinado, o en situaciones en las que se busca la producción de anticuerpos adicionales para un marcador biológico determinado, con las técnicas convencionales se pueden obtener fácilmente anticuerpos para dichos marcadores biológicos determinados, entre las que se incluyen la generación de hibridomas productores de anticuerpos. En este método, se sintetiza o se aísla una proteína o un péptido que comprende la totalidad de una proteína marcadora biológica, o un segmento de la misma (por ejemplo, mediante purificación a partir de una célula en la cual se expresa o mediante transcripción y traducción de un ácido nucleico que codifica la proteína o el péptido in vivo o in vitro utilizando métodos conocidos). Un vertebrado, preferentemente un mamífero tal como un ratón, rata, conejo u oveja, se inmuniza utilizando la proteína o el péptido. El vertebrado puede, opcionalmente (y preferentemente) inmunizarse al menos una vez más con la proteína o el péptido, de modo que el vertebrado muestra una respuesta inmune robusta frente a la proteína o el péptido. Del vertebrado inmunizado se aíslan esplenocitos y se fusionan con una línea celular inmortalizada para formar hibridomas, utilizando cualquiera de una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. A continuación, los hibridomas formados de esta manera se criban utilizando métodos estándares para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con la proteína marcadora biológica o un fragmento de la misma. La invención también abarca hibridomas preparados mediante este método y anticuerpos preparados utilizando dichos hibridomas. También se pueden utilizar anticuerpos policlonales.

La expresión de un marcador biológico de la invención se puede evaluar mediante cualquiera de una gran variedad de métodos bien conocidos para la detección de la expresión de un ácido nucleico transcrito o proteína. Entre los ejemplos no limitativos de dichos métodos se incluyen métodos inmunológicos para la detección de proteínas secretadas, de la superficie celular, citoplasmáticas o nucleares, métodos de purificación de proteínas, ensayos de función o actividad proteica, métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ácidos nucleicos.

En una realización preferida, la expresión de un marcador se evalúa utilizando un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo radiomarcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo, anticuerpo unido a esqueleto polimérico, o anticuerpo marcado con enzima) , un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o ligando de un par proteína-ligando {por ejemplo, biotina-estreptavidina}), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple, un dominio hipervariable de un anticuerpo aislado, etc.) que se une específicamente con una proteína marcadora o un fragmento de la misma, incluyendo una proteína marcadora que ha experimentado toda o una parte de su modificación normal posterior a la traducción.

En otra realización preferida, la expresión de un marcador se evalúa mediante la preparación de ARNm/ADNc (es decir, un polinucleótido transcrito) a partir de células en una muestra de tejido tumoral de un paciente, y mediante la hibridación del ARNm/ADNc con un polinucleótido de referencia que es un complemento de un ácido nucleico marcador, o un fragmento del mismo. Opcionalmente, el ADNc puede amplificarse utilizando cualquiera de una variedad de métodos de reacción en cadena de la polimerasa anteriormente a la hibridación con el polinucleótido de referencia; preferentemente, no se amplifica.

En una realización relacionada, una mezcla de polinucleótidos transcritos obtenida a partir de la muestra se pone en contacto con un sustrato que tiene fijado a él un polinucleótido complementario a, u homólogo a, al menos una parte (por ejemplo, como mínimo, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, o más residuos de nucleótidos) de un ácido nucleico marcador biológico. Si los polinucleótidos complementarios a u homólogos a son detectables de forma diferencial sobre el sustrato (por ejemplo, detectables utilizando diferentes cromóforos o fluoróforos, o fijados a diferentes posiciones seleccionadas), se pueden evaluar de forma simultánea los niveles de expresión de una pluralidad de marcadores utilizando un sustrato único (por ejemplo, una micromatriz de “chip génico” de polinucleótidos fijados en posiciones seleccionadas). Cuando se utiliza un método de evaluación de la expresión de un marcador que implica la hibridación de un ácido nucleico con otro, se prefiere que la hibridación se lleve a cabo en condiciones de hibridación astringentes.

Un método ejemplar para la detección y/o cuantificación de una proteína o ácido nucleico marcadores biológicos en una muestra de tejido tumoral implica la obtención de una muestra de tejido tumoral (por ejemplo, (i) un tumor primario global (como una totalidad), (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente el tumor, tejido que puede denominarse más específicamente el “margen invasivo” del tumor, (iv) los ganglios linfáticos localizados en la zona más próxima del tumor, (v) una biopsia de tumor realizada antes de la cirugía (para el seguimiento de pacientes después del tratamiento, por ejemplo) , y (vi) una metástasis distante, de un paciente con cáncer. Dicho método incluye etapas adicionales de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico, o ADNc). De este modo, los métodos de detección de la invención pueden utilizarse para detectar ARNm, proteína, ADNc, o ADN genómico, por ejemplo, en una muestra de tejido tumoral in vitro. Por ejemplo, entre las técnicas in vitro para la detección de ARNm se incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Entre las técnicas in vitro para la detección de una proteína marcadora biológica se incluyen ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Además, las técnicas in vivo para la detección de una proteína marcadora incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo marcado dirigido contra la proteína o un fragmento de la misma. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y localización en un sujeto se puede detectar mediante técnicas de imagenología estándares.

Un principio general de dichos ensayos de detección y/o cuantificación implica la preparación de una muestra o mezcla de reacción que puede contener un marcador biológico, y una sonda, en condiciones adecuadas y durante un tiempo suficiente para permitir que el marcador y la sonda interaccionen y se unan, formando de este modo un complejo que se puede retirar y/o detectar en la mezcla de reacción.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término “sonda” se refiere a cualquier molécula que es capaz de unirse selectivamente a una molécula diana escogida específicamente, por ejemplo, un transcrito de nucleótido o una proteína codificada por o correspondiente a un marcador biológico. Las sondas se pueden sintetizar por un experto en la técnica, o pueden obtenerse a partir de preparaciones biológicas adecuadas. Para el objetivo de detección de la molécula diana, las sondas se pueden diseñar específicamente para ser marcadas, tal como se describe en la presente memoria. Entre los ejemplos de moléculas que se pueden utilizar como sondas se incluyen, pero no están limitadas a, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos, y moléculas orgánicas.

Estos ensayos de detección y/o cuantificación de un marcador biológico se pueden llevar a cabo de diversas maneras.

Por ejemplo, un método para llevar a cabo dicho ensayo implicaría anclar la sonda sobre un soporte de fase sólida, al que también se hace referencia como sustrato, y detectar complejos de marcador diana/sonda anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En una realización de dicho método, se puede anclar una muestra de un sujeto, en la que se va a ensayar la cuantificación del marcador biológico, sobre un soporte transportador o de fase sólida. En otra realización, es posible la situación inversa, en la que la sonda se puede anclar a una fase sólida y una muestra de un sujeto se puede dejar reaccionar como un componente no anclado del ensayo.

Existen muchos métodos establecidos para anclar componentes de un ensayo a una fase sólida. Entre éstos se incluyen, sin limitación, moléculas marcadoras o de sonda que están inmovilizadas mediante la conjugación de biotina y estreptavidina. Dichos componentes de ensayos biotinilados se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) utilizando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, un kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.), e inmovilizado en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). En determinadas realizaciones, las superficies con componentes del ensayo inmovilizados se pueden preparar previamente y almacenarse.

Otros vehículos adecuados o soportes en fase sólida para dichos ensayos incluyen cualquier material capaz de unir la clase de molécula a la que pertenece el marcador o la sonda. Entre los soportes o vehículos bien conocidos se incluyen, pero no están limitados a, vidrio, poliestireno, nailon, polipropileno, nailon, polietileno, dextrano, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabbros, y magnetita.

Con el fin de llevar a cabo ensayos con las estrategias mencionadas anteriormente, el componente no inmovilizado se añade a la fase sólida después de que el segundo componente se ancle. Después de completarse la reacción, se pueden eliminar los componentes que no han formado complejos (por ejemplo, mediante lavado) en condiciones tales que cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la fase sólida. La detección de los complejos marcador/sonda anclados a la fase sólida se puede conseguir en numerosos métodos indicados en la presente memoria.

En una realización preferida, la sonda, cuando es el componente del ensayo no anclado, se puede marcar con el objetivo de la detección y lectura del ensayo, bien directamente o indirectamente, con marcadores detectables que se discuten en la presente memoria y que son bien conocidos por un experto en la técnica.

También es posible detectar directamente la formación del complejo marcador/sonda sin manipulación o marcado adicional de cada componente (marcador o sonda), por ejemplo, utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., Pat. de EE. UU. No. 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., Pat. de EE. UU. No. 4.868.103). Se selecciona un marcador de fluoróforo sobre la primera molécula “donadora” de tal modo que, tras la excitación con luz incidente con la longitud de onda adecuada, su energía fluorescente emitida será absorbida por un marcador fluorescente en una segunda molécula “aceptora”, que a su vez es capaz de emitir fluorescencia debido a la energía absorbida. De forma alternativa, la molécula de proteína “donadora” puede simplemente utilizar la energía de fluorescencia natural de los residuos de triptófano. Los marcadores se seleccionan de forma que emitan diferentes longitudes de onda de luz, de modo que el marcador de la molécula “aceptora” se puede diferenciar del de la “donadora”. Dado que la eficacia de la transferencia de energía entre los marcadores está relacionada con la distancia que separa las moléculas, se pueden evaluar las relaciones espaciales entre las moléculas. En una situación en la cual tiene lugar la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente del marcador de la molécula “aceptora” en el ensayo debe ser máxima. De forma conveniente, se puede medir un evento de unión FRET a través de medios de detección fluorométricos estándar bien conocidos en la técnica (por ejemplo, utilizando un fluorímetro).

En otra realización, la determinación de la capacidad de una sonda de reconocer un marcador se puede conseguir sin marcar cada componente del ensayo (sonda o marcador) utilizando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) en tiempo real (véase, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Tal y como se utiliza en la presente memoria, el “BIA” o la “resonancia de plasmón superficial” es una tecnología para el estudio de interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los elementos que interaccionan (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) dan como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (SPR)), que da lugar a una señal detectable que se puede utilizar como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

De forma alternativa, en otra realización, se pueden llevar a cabo ensayos de diagnóstico y pronóstico análogos con marcador y sonda como solutos en una fase líquida. En dicho ensayo, el marcador y la sonda que forman un complejo se separan de los componentes que no forman un complejo por cualquiera de una diversidad de técnicas estándares, entre las que se incluyen, pero no están limitadas a: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis e inmunoprecipitación. En la centrifugación diferencial, los complejos de marcador/sonda se pueden separar de los componentes del ensayo que no forman un complejo a través de una serie de etapas de centrifugación, debido a un equilibrio de sedimentación diferente de los complejos basado en sus tamaños y densidades diferentes (véase, por ejemplo, Rivas, G., y Minton, A. P., 1993, Trends Biochem Sci. 18 (8):284-7). También se pueden utilizar técnicas cromatográficas estándar para separar las moléculas que forman un complejo de las que no forman un complejo. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel separa moléculas en base a su tamaño, y a través de la utilización de una resina de filtración en gel adecuada en un formato de columna, por ejemplo, el complejo relativamente más grande se puede separar de los componentes relativamente más pequeños que no forman un complejo. De forma similar, las propiedades de carga relativamente diferentes del complejo marcador/sonda si se compara con los componentes que no forman un complejo se pueden explotar para diferenciar el complejo de los componentes que no forman un complejo, por ejemplo, a través de la utilización de resinas de cromatografía de intercambio iónico. Los expertos en la técnica conocen bien dichas resinas y técnicas cromatográficas (véase, por ejemplo, Heegaard, N. H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11 (1 -6):141 -8; Hage, D. S., y Tweed, S. A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 oct. 10; 699 (1-2):499-525). También se puede utilizar la electroforesis en gel para separar los componentes del ensayo que forman un complejo de los componentes no unidos (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987-1999). En esta técnica, los complejos de proteína o ácido nucleico se separan en base al tamaño o la carga, por ejemplo. Con el fin de mantener la interacción de unión durante el proceso electroforético, habitualmente se prefieren materiales de la matriz de gel y condiciones no desnaturalizantes en ausencia de un agente reductor. También se puede utilizar la técnica SELDI-TOF sobre una matriz o lechos acoplados con la superficie activa, o no, o superficie recubierta con anticuerpo, o lechos.

El experto en la técnica conocerá bien las condiciones adecuadas para el ensayo particular y los componentes del mismo.

En una realización particular, el nivel de ARNm marcador se puede determinar tanto en formatos in situ como in vitro en una muestra biológica utilizando métodos conocidos en la técnica. El término “muestra biológica” se pretende que incluya tejidos, células, fluidos biológicos y aislados de los mismos, aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Muchos métodos de detección de la expresión utilizan ARN aislado. Para los métodos in vitro, se puede utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm para la purificación de ARN de cáncer colorrectal (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York 1987-1999). De forma adicional, se puede procesar fácilmente un gran número de muestras de tejido utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento del ARN de etapa única de Chomczynski (1989, Pat. de EE. UU. No. 4.843.155).

El ARNm aislado se puede utilizar en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero no están limitados a, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa y matrices de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de los niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridar con el ARNm codificado por el gen que se está detectando. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones astringentes con un ARNm o ADN genómico que codifica un marcador de la presente invención. En la presente memoria se describen otras sondas adecuadas para utilizarse en los ensayos de pronóstico de la invención. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el marcador en cuestión se está expresando.

En un formato, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, haciendo pasar el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como de nitrocelulosa. En un formato alternativo, la sonda o sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la sonda o sondas, por ejemplo, en una matriz de chip génico Affymetrix. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos de detección del ARNm conocidos para utilizarlos en la detección del nivel de ARNm codificado por los marcadores de la presente invención.

Un método alternativo para la determinación del nivel del marcador ARNm en una muestra implica el proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, mediante PCRrt (la realización experimental presentada en Mullis, 1987, Pat. de EE. UU. No. 4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), replicación en secuencia automantenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Replicasa Q-Beta (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), replicación por círculos rodantes (Lizardi et al., Pat. de EE. UU. No.

5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido por la detección de las moléculas amplificadas mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico, si dichas moléculas están presentes con valores muy bajos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden hibridar con regiones 5' o 3' de un gen (cadenas más y menos, respectivamente, o viceversa) y contener una región corta en el medio. En general, los cebadores de amplificación tienen aproximadamente de 10 a 30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. En condiciones adecuadas y con los reactivos adecuados, dichos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.

Para los métodos in situ, no es necesario aislar el ARNm del cáncer colorrectal antes de la detección. En dichos métodos, una muestra de células o de tejido se prepara/procesa mediante métodos histológicos conocidos. A continuación, la muestra se inmoviliza sobre un soporte, habitualmente un portaobjetos de vidrio y, a continuación, se pone en contacto con una sonda que puede hibridar con un ARNm que codifica el marcador.

Como una alternativa para hacer determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluto del marcador, las determinaciones se pueden basar en el nivel de expresión normalizado del marcador. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador comparando su expresión con la expresión de un gen que no es un marcador, por ejemplo, un gen constitutivo que se expresa de forma constitutiva. Entre los genes adecuados para la normalización se incluyen genes constitutivos, tales como el gen de actina, gen 18S ribosómico, gen GAPD, o genes específicos de células epiteliales. Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de un paciente, con otra muestra, por ejemplo, una muestra que no es de cáncer colorrectal, o entre muestras de diferentes fuentes.

De forma alternativa, el nivel de expresión se puede proporcionar como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, se determina el nivel de expresión del marcador para 10 o más muestras de aislados de células normales frente a aislados de células cancerosas, preferentemente 50 o más muestras, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión medio de cada uno de los genes ensayados en el número de muestras mayor y este se utiliza como un nivel de expresión de línea de base para el marcador. A continuación, el nivel de expresión del marcador determinado para la muestra de ensayo (nivel de expresión absoluto) se divide por el valor de expresión medio obtenido para ese marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.

Tal y como ya se ha mencionado anteriormente en la presente memoria descriptiva, un agente preferido para la detección y/o la cuantificación de una proteína marcadora biológica cuando se lleva a cabo un método de pronóstico del cáncer de la invención es un anticuerpo que se une de forma específica a dicha proteína marcadora biológica o a un fragmento de la misma, preferentemente un anticuerpo con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab').sub.2). El término “marcado”, con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende englobar tanto un marcaje directo de la sonda o del anticuerpo por acoplamiento (es decir, unión de forma física) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo; así como un marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Entre los ejemplos de marcaje indirecto se incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado de forma fluorescente y el marcaje terminal de una sonda de ADN con biotina, de manera tal que puede detectarse con estreptavidina marcada de forma fluorescente.

Para determinar si una muestra contiene una proteína marcadora biológica que se une a un anticuerpo dado se pueden emplear una variedad de formatos. Entre los ejemplos de dichos formatos se incluyen, pero no están limitados a, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), análisis por transferencia Western y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos conocidos de detección y/o cuantificación de proteínas/anticuerpos para su utilización en el método de pronóstico del cáncer según la invención.

En un formato, se pueden utilizar anticuerpos, o fragmentos o derivados de anticuerpo, en métodos tales como transferencias Western, SELDI-TOF (llevado a cabo con lechos acoplados a anticuerpo o matriz) o técnicas de inmunofluorescencia para detectar las proteínas expresadas. En dichas utilizaciones, es preferible generalmente inmovilizar bien el anticuerpo o las proteínas sobre un soporte sólido. Entre los soportes de fase sólida o los vehículos adecuados se incluye cualquier soporte capaz de unir un antígeno o un anticuerpo. Entre los soportes o vehículos bien conocidos se incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabbros y magnetita.

Un experto en la técnica conocerá muchos otros vehículos adecuados para la unión de un anticuerpo o antígeno, y será capaz de adaptar dicho soporte para su utilización con la presente invención. Por ejemplo, una proteína aislada de cáncer colorrectal se puede ensayar en un gel de electroforesis de poliacrilamida e inmovilizarla en un soporte de fase sólida, tal como nitrocelulosa. A continuación, el soporte se puede lavar con tampones adecuados seguido de tratamiento con el anticuerpo marcado de forma detectable. A continuación, el soporte de fase sólida se puede lavar con el tampón una segunda vez para eliminar el anticuerpo no unido. A continuación, se puede detectar la cantidad de marcaje unido sobre el soporte sólido mediante medios convencionales.

A continuación, se describen los métodos más preferidos para la cuantificación de un marcador biológico para el objetivo de llevar a cabo el método de pronóstico del cáncer de la invención.

Cuantificación de marcadores biológicos por micromatrices de tejido

En determinadas realizaciones, un marcador biológico, o un conjunto de marcadores biológicos, se puede cuantificar con uno cualquiera de los métodos de micromatrices de tejido conocidos en la técnica.

Las micromatrices de tejido se producen mediante un método de relocalización del tejido a partir de bloques de parafina histológica convencional, de modo que se puede ver el tejido de múltiples pacientes o bloques en el mismo portaobjetos. Esto se realiza utilizando una aguja para hacer una biopsia de secciones histológicas estándares y colocando el núcleo en una matriz sobre un bloque de parafina como recipiente. Esta técnica fue descrita originariamente por Wan en 1987 (Wan, Fortuna y Furmanski; Journal of Immunological Methods). En determinadas realizaciones de las micromatrices de tejido, los núcleos de tejido se colocan en posiciones específicas fijadas espacialmente en un bloque. Kononen et al. (Nature Medicine en 1998) describen la técnica de forma destacada.

La técnica de la matriz de tejido implica adquirir muestras cilíndricas mínimas, pequeñas, de especímenes de tejido embebidas en parafina. A continuación, estos cilindros se exponen en una rejilla de alta densidad, sistemática en otro bloque de parafina.

Por ejemplo, se obtienen muestras de tejido tumoral, incluyendo las que están en forma de muestras de biopsia (i) del centro del tumor, (ii) del margen invasivo o (iii) de los ganglios linfáticos regionales, de bloques de tejido de tumor, embebidos en parafina, fijados en formalina, a partir de un número adecuado de individuos. Éstas se transfieren a un bloque de TMA. Se pueden generar múltiples bloques de TMA al mismo tiempo. Cada bloque de TMA se puede seccionar hasta 300 veces, con todos los trozos de TMA resultantes con los mismos tejidos en las mismas posiciones de coordenadas. Los trozos individuales se pueden utilizar para una variedad de análisis moleculares, tales como la tinción H&E para establecer la morfología del tejido, hibridación de ARNm in situ, inmunohistoquímica de proteínas o análisis del ADN para determinar alteraciones genéticas.

Dado que estas muestras de tejido tumoral cilíndricas son pequeñas (0,4-1 mm de diámetro x 3-4 mm de altura), se pueden exponer hasta mil tejidos en un único bloque de parafina mientras se minimiza el daño y el requerimiento de tejido. Además, estos bloques de parafina se pueden cortar de forma transversal en cientos de secciones de micromatrices de tejido, las cuales, a continuación, se pueden utilizar para diferentes análisis genéticos.

Además de la velocidad aumentada de los análisis, las micromatrices de tejido también pueden asegurar la reproducibilidad y fiabilidad del método de pronóstico del cáncer según la invención, ya que se manipulan, preparan y tiñen cientos de muestras de tejido diferentes de una manera virtualmente idéntica, paralela, todos en el mismo portaobjetos (Kallioniemi, O.; Wagner, U.; Kononen, J. y Sauter, G. Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer. Human Molecular Genetics (2001), 10, 657-662.).

Habitualmente, las áreas representativas del tumor se retiran de bloques de tejido tumoral embebido en parafina, mediante lo cual se obtienen muestras de tejido tumoral. A continuación, dichas muestras de tejido tumoral se transfieren a otro bloque de parafina receptor en el que estas muestras se puntean. A continuación, los puntos de muestra de tejido que se exponen en dicho bloque de parafina receptor se cortan en secciones, habitualmente secciones de 2-5 gm, para análisis posterior.

Habitualmente, para un análisis posterior, se incuba en primer lugar una sección delgada de la matriz, concretamente la micromatriz de tejido, con anticuerpos marcados dirigidos contra un marcador biológico de interés. Después del lavado, los anticuerpos marcados que se unen a dicho marcador biológico de interés se revelan mediante la técnica adecuada, dependiendo del tipo de marcaje que transporta el anticuerpo marcado, por ejemplo, marcaje radioactivo, fluorescente o enzimático. También se puede llevar a cabo el marcaje múltiple de forma simultánea, especialmente en realizaciones en las que se utiliza más de un anticuerpo específico de proteína, para el objetivo de cuantificar más de un marcador biológico.

En los ejemplos de la presente memoria se describen realizaciones ilustrativas de cuantificación de marcadores biológicos utilizando micromatrices de tejido.

Cuantificación de marcadores biológicos por inmunohistoquímica en portaobjetos de tejido convencionales (especímenes embebidos en parafina o congelados)

En determinadas realizaciones, un marcador biológico, o un conjunto de marcadores biológicos, se pueden cuantificar con uno cualquiera de los métodos de inmunohistoquímica conocidos en la técnica.

A continuación, el análisis se puede llevar a cabo sobre (i) un tumor primario global (como una totalidad), (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente el tumor, tejido que se puede denominar más específicamente “margen invasivo” del tumor y (iv) los ganglios linfáticos localizados en la zona más próxima del tumor, (vi) una metástasis distante

Los análisis también, y preferentemente, se pueden llevar a cabo en regiones de tumor combinadas (definidas anteriormente).

Habitualmente, para un análisis posterior, se incuba en primer lugar una sección delgada del tumor, con anticuerpos marcados dirigidos contra un marcador biológico de interés. Después del lavado, los anticuerpos marcados que se unen a dicho marcador biológico de interés se revelan mediante la técnica adecuada, dependiendo del tipo de marcaje que transporta el anticuerpo marcado, por ejemplo, marcaje radioactivo, fluorescente o enzimático. También se puede llevar a cabo el marcaje múltiple de forma simultánea.

Cuantificación de marcadores biológicos por métodos de citometría de flujo

En determinadas realizaciones, un marcador biológico, o un conjunto de marcadores biológicos, se puede cuantificar con uno cualquiera de los métodos de citometría de flujo conocidos en la técnica.

Por ejemplo, en primer lugar, se extraen células contenidas en la muestra de tejido tumoral que se está ensayando mediante dispersión mecánica y se preparan suspensiones de células en un medio líquido.

A continuación, las células obtenidas de este modo se incuban durante el periodo de tiempo adecuado con anticuerpos dirigidos específicamente contra el marcador o marcadores biológicos que se van a cuantificar.

Después del lavado de la suspensión de células, con el fin de eliminar los anticuerpos no unidos, las células resultantes se analizan llevando a cabo una citometría de flujo, en vista de la cuantificación del porcentaje del número total de células presente en la suspensión de células que expresan cada uno de dicho o dichos marcadores biológicos.

En los ejemplos de la presente memoria se describen realizaciones ilustrativas de la cuantificación de marcadores biológicos utilizando métodos de citometría de flujo.

Cuantificación de marcadores biológicos por amplificación de ácidos nucleicos

En determinadas realizaciones, un marcador biológico, o un conjunto de marcadores biológicos, se pueden cuantificar con uno cualquiera de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica.

A continuación, el análisis se puede llevar a cabo sobre (i) un tumor primario global (como una totalidad), (ii) una muestra de tejido del centro del tumor (CT), (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente el tumor, tejido que se puede denominar más específicamente el “margen invasivo” del tumor, (iv) los ganglios linfáticos localizados en la zona más próxima del tumor y (vi) una metástasis distante

Los análisis también, y preferentemente, se pueden llevar a cabo en regiones de tumor combinadas (definidas anteriormente) después de la microdisección del tumor.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método altamente sensible y potente para dicha cuantificación de marcadores biológicos.

Para llevar a cabo uno cualquiera de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos que sea adecuado para cuantificar un marcador biológico cuando se lleva a cabo el método de pronóstico del cáncer de la invención, se requieren un par de cebadores que hibriden específicamente con el ARNm diana o con el ADNc diana.

Se puede diseñar un par de cebadores que hibridan específicamente con el marcador biológico de ácido nucleico diana de interés mediante uno cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica.

En determinadas realizaciones, para cada uno de los marcadores biológicos de la invención, al menos un par de cebadores específicos, así como la sonda de ácido nucleico de detección correspondiente, ya se han referenciado y descrito totalmente en la base de datos pública de cebadores de PCR cuantitativa (“Quantitative PCR primer database”), de forma destacada en la siguiente dirección de Internet: hftp://Ipgws.nci.nih.gov/cgibin/Primer-Viewer.

En otras realizaciones, se puede diseñar un par específico de cebadores utilizando el método descrito en la Patente de EE. UU. No. 6.892.141 de Nakae et al.

En la técnica se conocen muchas adaptaciones específicas de la técnica de PCR, tanto para detecciones cualitativas como cuantitativas. En particular, se conocen métodos que utilizan tintes fluorescentes para detectar y cuantificar los productos de PCR amplificados. También se ha descrito previamente la amplificación y detección in situ, también conocida como PCR homogénea. Véase, por ejemplo, Higuchi et al., (Kinetics PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions, Bio/Technology, vol. 11, págs. 1026-1030 (1993)), lshiguro et al., (Homogeneous quantitative Assay of Hepatitis C Virus RNA by Polymerase Chain Reaction in the Presence of a Fluorescent Intercalater, Anal. Biochemistry 229, págs. 20-213 (1995)), y Wittwer et al., (Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid cycle DNA Amplification, Biotechniques, vol. 22, págs. 130-138 (1997.))

También se han desarrollado un gran número de otros métodos para cuantificar ácidos nucleicos (Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975; Sharp, P. A., et al., Methods Enzymol. 65: 750-768, 1980; Thomas, P. S., Proc. Nat. Acad. Sci., 77: 5201-5205, 1980). Más recientemente, se han desarrollado métodos de PCR y RT-PCR que son capaces de medir la cantidad de un ácido nucleico en una muestra. Una estrategia, por ejemplo, mide la cantidad de producto de PCR en la fase log de la reacción antes de la formación de mesetas de productos de reacción (Kellogg, D. E., et al., Anal. Biochem. 189: 202-208 (1990); y Pang, S., et al., Nature 343: 85-89 (1990)). Habitualmente, se utiliza una secuencia de genes contenida en todas las muestras en una cantidad relativamente constante para la normalización de la eficiencia de la amplificación de muestras. Esta estrategia, sin embargo, presenta varios inconvenientes. El método requiere que cada muestra tenga cantidades de entrada iguales del ácido nucleico y que la eficiencia de la amplificación entre las muestras sea idéntica hasta el momento del análisis. Además, es difícil utilizar los métodos convencionales de cuantificación por PCR, tales como electroforesis en gel o hibridación por captura en placas para determinar que todas las muestras se analizan, de hecho, durante la fase log de la reacción, tal como requiere el método.

Otro método denominado PCR-cuantitativa competitiva (QC), como el nombre sugiere, se basa en la inclusión de un competidor como control interno en cada reacción (Becker-Andre, M., Meth. Mol. Cell Biol. 2: 189-201 (1991); Piatak, M. J., et al., BioTechniques 14: 70-81 (1993); y Piatak, M. J., et al., Science 259: 1749-1754 (1993)). La eficiencia de cada reacción se normaliza con respecto al competidor interno. Habitualmente, se añade una cantidad conocida de competidor interno a cada muestra. El producto de PCR diana desconocido se compara con el producto de PCR de competidor conocido para obtener una cuantificación relativa. Una dificultad de esta estrategia general se basa en el desarrollo de un control interno que se amplifica con la misma eficiencia que la molécula diana.

Por ejemplo, el método de amplificación de ácidos nucleicos que se utiliza puede consistir en el análisis por PCR cuantitativa en tiempo real.

La PCR en tiempo real o cuantitativa (QPCR) permite la cuantificación de cantidades de partida de moldes de ADN, ADNc, o ARN. La QPCR se basa en la detección de una molécula informadora fluorescente que aumenta a medida que el producto de PCR se acumula con cada ciclo de amplificación. Las moléculas informadoras fluorescentes incluyen tintes que se unen a ADN de doble cadena (es decir, SYBR Verde I) o sondas específicas de secuencia (es decir, balizas moleculares o sondas Taqman®).

Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos preferidos son los métodos de amplificación por PCR cuantitativa, incluyendo el método de PCR cuantitativa multiplex tal como la técnica descrita en la Solicitud de Patente publicada de EE. UU. n° US 2005/0089862, de Therianos et al.

De forma ilustrativa, para la cuantificación de marcadores biológicos de la invención, las muestras de tejido tumoral se congelan de forma instantánea inmediatamente después de la recogida de la biopsia. A continuación, se aísla y cuantifica el ARN total de una “muestra de tejido tumoral” (i) un tumor primario global (como una totalidad), (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente el tumor, tejido que se puede denominar de forma más específica “margen invasivo” del tumor, (iv) los ganglios linfáticos localizados en la zona más próxima del tumor, (v) una biopsia de tumor llevada a cabo antes de la cirugía (para el seguimiento de los pacientes después del tratamiento, por ejemplo), y (vi) una metástasis distante. A continuación, cada muestra del ARN extraído y cuantificado se transcribe de forma inversa y el ADNc resultante se amplifica por PCR, utilizando un par de cebadores específicos para cada marcador biológico que se cuantifica. Se utilizan pares de cebadores de control simultáneamente como controles, tales como pares de cebadores que hibridan específicamente con ADNc de 18S y ADNc de GADPH, o cualquier otro gen constitutivo bien conocido.

En los ejemplos de la presente memoria se describen realizaciones ilustrativas de cuantificación de marcadores biológicos utilizando métodos de amplificación de ácidos nucleicos.

Kits para el pronóstico del cáncer

La invención puede basarse en la utilización de un kit para evaluar el pronóstico de un cáncer en un paciente (por ejemplo, en una muestra tal como una muestra de tejido tumoral de un paciente). El kit comprende una pluralidad de reactivos, cada uno de los cuales es capaz de unirse específicamente a un ácido nucleico o proteína que es un marcador biológico. Los reactivos adecuados para unirse a una proteína marcadora incluyen anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y semejantes. Los reactivos adecuados para unirse a un ácido nucleico marcador (por ejemplo, un ADN genómico, un ARNm, un ARNm sometido a corte y empalme, un ADNc, o semejantes) incluyen ácidos nucleicos complementarios. Por ejemplo, los reactivos de ácido nucleico pueden incluir oligonucleótidos (marcados o no marcados) fijados a un sustrato, oligonucleótidos marcados que no están unidos a un sustrato, pares de cebadores de PCR, sondas de balizas moleculares, y semejantes.

De este modo, el método reivindicado puede utilizar un kit para el pronóstico de la progresión de un cáncer en un paciente, kit que comprende medios para cuantificar al menos un marcador biológico indicativo del estado de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente contra el cáncer.

El kit puede comprender opcionalmente componentes adicionales útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. Como ejemplo, el kit puede comprender fluidos (por ejemplo, tampón SSC) adecuados para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios o para la unión de un anticuerpo a una proteína a la que se une específicamente, uno o más compartimentos de muestra, un material que contiene instrucciones que describen el rendimiento del método de pronóstico del cáncer de la invención, y semejantes.

Kits que comprenden anticuerpos

En determinadas realizaciones, el kit comprende uno o una combinación o un conjunto de anticuerpos, estando cada clase de anticuerpos dirigida específicamente contra un marcador biológico descrito en la presente memoria.

Un kit de anticuerpos puede comprender 2 a 20 clases de anticuerpos, estando cada clase de anticuerpos dirigida específicamente contra un marcador biológico de la invención. Por ejemplo, un kit de anticuerpos puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 clases de anticuerpos, estando cada clase de anticuerpos dirigida específicamente contra un marcador biológico como se define en la presente memoria.

En determinadas otras realizaciones, el kit comprende uno o una combinación o un conjunto de pares de ligandos o moléculas solubles específicas que se unen a uno o más de los marcadores biológicos de la invención.

Kits que comprenden cebadores de ácido nucleico

En determinadas otras realizaciones, el kit comprende uno o una combinación o un conjunto de pares de cebadores, hibridando cada clase de par de cebadores específicamente con un marcador biológico de la invención.

Un kit de cebadores puede comprender 2 a 20 clases de pares de cebadores, hibridando cada clase de par de cebadores específicamente con un marcador biológico de la invención. Por ejemplo, un kit de cebadores puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 clases de pares de cebadores, hibridando cada clase de par de cebadores específicamente con un marcador biológico como se define en la presente memoria.

De forma destacada, al menos un par de cebadores específicos, así como la sonda de ácido nucleico de detección correspondiente, que hibrida específicamente con un marcador biológico de interés, ya ha sido referenciado y descrito totalmente en la base de datos pública de cebadores de PCR cuantitativa (“Quantitative PCR primer database”), de forma destacada en la siguiente dirección de Internet: http://Ipgws.nci.nih.gov/cgi-bin/PrimerViewer.

Monitorización de los tratamientos anticancerosos

La monitorización de la influencia de agentes (por ejemplo, compuestos farmacéuticos) en el nivel de expresión de un marcador biológico de la invención puede aplicarse para la monitorización del estado de la respuesta inmune adaptativa del paciente con el tiempo. Por ejemplo, la efectividad de un agente para afectar la expresión de un marcador biológico puede monitorizarse durante los tratamientos de sujetos que reciben tratamientos anticancerosos.

En una realización preferida, se proporciona un método para monitorizar la efectividad del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro candidato a fármaco) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra antes de la administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de uno o más marcadores biológicos seleccionados de la invención en la muestra anterior a la administración; (iii) obtener una o más muestras después de la administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión del o de los marcadores biológicos en las muestras posteriores a la administración; (v) comparar el nivel de expresión del o de los marcadores biológicos en la muestra anterior a administración con el nivel de expresión del o de los marcadores en la muestra o muestras posteriores a la administración; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto de acuerdo con esto. Por ejemplo, la expresión disminuida del gen o genes del marcador biológico durante el curso del tratamiento puede ser indicativa de una dosificación ineficaz y la conveniencia de incrementar la dosificación. A la inversa, una expresión incrementada del gen o genes del marcador biológico puede ser indicativa de un tratamiento eficaz y no se necesita cambiar la dosificación.

Como ya se ha mencionado previamente en la presente memoria descriptiva, la realización del método de pronóstico del cáncer de la invención puede indicar, con más precisión que los métodos de la técnica anterior, aquellos pacientes con alto riesgo de recurrencia del tumor que pueden beneficiarse de terapia adyuvante, incluyendo inmunoterapia.

Por ejemplo, si, al final del método de pronóstico del cáncer de la invención, se determina un buen pronóstico de ausencia de metástasis o un pronóstico de un periodo largo de tiempo de supervivencia libre de enfermedad, entonces el tratamiento anticanceroso posterior no comprenderá ninguna quimioterapia adyuvante.

Sin embargo, si, al final del método de pronóstico del cáncer de la invención, se determina un mal pronóstico con metástasis o un mal pronóstico con un periodo corto de tiempo de supervivencia libre de enfermedad, entonces se administra al paciente la composición apropiada de quimioterapia adyuvante.

Además, si, al final del método de pronóstico del cáncer de la invención, se determina un mal pronóstico con metástasis o un mal pronóstico con un periodo corto de tiempo de supervivencia libre de enfermedad, entonces se administra al paciente la composición inmunoestimulante apropiada, incluyendo una composición farmacéutica que comprende una citoquina o quimioquina inmunoestimulante, incluyendo interleuquinas.

Las citoquinas o quimioquinas inmunoestimulantes preferidas se seleccionan del grupo que consiste en IL-1a, IL-1 b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, G-CSF, IL-15, GM-CSF, IFN-g, CXCL9, CXCL10, Fractalkina, MIG, IFNa, IL-18, IL-12, IL-23 e IL-31.

De acuerdo con esto, la presente descripción proporciona un método para adaptar un tratamiento del cáncer en un paciente con cáncer, en el que dicho método comprende las etapas de:

a) llevar a cabo en al menos una muestra de tejido tumoral recogida de dicho paciente, el método de pronóstico del cáncer que se describe en la presente memoria;

b) adaptar el tratamiento del cáncer de dicho paciente con cáncer mediante la administración a dicho paciente de una quimioterapia adyuvante o una terapia inmunoestimulante si se determina un mal pronóstico del cáncer al final de la etapa a).

Otro objetivo consiste en un kit para monitorizar la efectividad del tratamiento (adyuvante o neoadyuvante) de un sujeto con un agente, kit que comprende medios para cuantificar al menos un marcador biológico indicativo del estado de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente contra el cáncer.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante, sin estar de ninguna manera limitada a, los ejemplos siguientes.

Ejemplos

A. Material y métodos de los ejemplos

Material y métodos de los ejemplos 1 a 4.

A.1. Pacientes y base de datos

Se revisaron todos los casos de cáncer colorrectal (n=959) que se sometieron a una resección primaria del tumor en el Hospital Laennec/HEGP entre 1986 y 2004. El tiempo de observación en esta cohorte no seleccionada fue el intervalo entre el diagnóstico y el último contacto (muerte o último seguimiento). Los datos se controlaron en el último seguimiento para los pacientes que no habían tenido recidiva o que habían muerto. La duración media del seguimiento fue de 44,5 meses. Seis pacientes de los que se había perdido el seguimiento se excluyeron del análisis. Se puntuaron los descubrimientos histopatológicos y clínicos según el sistema de estadificación UICC-TNM (Sobin LH, Wittekind C, (eds). UICC TNM classification of malignant tumors. 6a ed. Nueva York: Wiley-Liss, 2002), tal como se describe en la Tabla 1. Se definió la invasión metastásica temprana como la presencia de embolia vascular (VE), invasión linfática (LI), o invasión perineural (PI). Un tumor positivo para VELIPI tenía al menos uno de estos descubrimientos patológicos, mientras que un tumor negativo para VELIPI no tenía ninguno de estos tres descubrimientos. Los estados TNM y VELIPI de los tumores se determinaron a partir de informes histopatológicos en el momento de la resección. Se construyó una base de datos segura basada en Web, TME.db (Tumor MicroEnvironment Database), en un tercer nivel de arquitectura utilizando Java-2 Enterprise-Edition (J2EE) para integrar los conjuntos de datos clínicos, y los resultados de tecnologías de alto rendimiento.

Los registros de 959 pacientes con cáncer colorrectal que se habían sometido a una resección primaria en e1Hospital Laennec/HEGP entre 1986 y 2004 se revisaron de forma retrospectiva representando una cohorte de pacientes no seleccionados, continua y prospectiva. En la Tabla 1 se detallan los parámetros histopatológicos convencionales, que incluyen el estadio TNM de AJCC/UICC, estadio de Dukes, tipo de tumor, y grado de diferenciación, embolias linfovasculares, invasión del tumor perineural (VELIPI). Se registraron los datos sobre quimioterapia adyuvante y paliativa. Se administró quimioterapia adyuvante basada en 5-fluorouracilo (FU) a 327 pacientes (57 pacientes con estadio II de la enfermedad, 136 con estadio III de la enfermedad y 134 con estadio IV de la enfermedad).

Se llevó a cabo una vigilancia de los pacientes posterior a la cirugía en el Laennec/HEGP y hospitales asociados, para todos los pacientes, según las prácticas generales para los pacientes con cáncer de colon, que incluyen examen físico, recuentos sanguíneos, ensayos de función hepática, antígeno carcinoembrionario en suero, ultrasonografía y tomografía computarizada abdominal, y rayos X de los pulmones. Se realizó una colonoscopia un año después de la resección y posteriormente una vez cada tres años si todo era normal. Si se sospechaba que había recidiva del tumor, el paciente se sometió a revisión intensiva, que incluía tomografía computarizada abdominal, imagenología por resonancia magnética, rayos X del pecho, colonoscopia y biopsia, cuando era aplicable.

Los descubrimientos clínicos, tratamiento, informe histopatológico y datos del seguimiento se recogieron de forma prospectiva y se actualizaron (mediante A.B) y se incluyeron en la TME.db. La base de datos es accesible bajo solicitud a zlatko.trajanoski@tugraz.at. El tiempo de observación fue el intervalo entre el diagnóstico y el último contacto (muerte o último seguimiento). Los datos se fueron controlando en el último seguimiento para pacientes sin recidiva, o muerte. La duración media del seguimiento fue de 44,5 meses. Los valores mín:máx hasta la progresión/muerte o último seguimiento fueron (0:214) meses, respectivamente. Seis pacientes de los que se había perdido el seguimiento se excluyeron del análisis. El tiempo hasta la recurrencia o tiempo libre de enfermedad se definió como el periodo de tiempo desde la fecha de la cirugía hasta la fecha confirmada de recidiva del tumor para pacientes con recidiva y desde la fecha de la cirugía hasta la fecha del último seguimiento para pacientes libres de enfermedad.

A.2. Histopatología

Todas las secciones H&E de los tumores de cada paciente se reevaluaron a ciegas por dos patólogos (D.D., T.M.) o dos investigadores (F.P., J.G.) especializados en la patología del cáncer de colon, para cada uno de los siguientes: (a) infiltrado linfoide tumoral (b) reacción linfoide en el margen invasivo (de 10 a 20 campos analizados por paciente). Las densidades de estos infiltrados inmunes se puntuaron independientemente por los investigadores, como débil (puntuación 1), moderada (puntuación 2), o fuerte (puntuación 3), tal y como se describe a continuación.

Trescientos setenta y siete tumores seleccionados al azar de los 415 tumores evaluados según TMA se reevaluaron en cuanto a la densidad de células inmunes. La revisión de las secciones de tejido se llevó a cabo de forma independiente por dos patólogos (D.D., T.M.) o dos investigadores (F.P., J.G.) especializados en la patología del cáncer de colon. Se analizó un número medio de cuatro secciones de tumor primario. Los campos analizados se seleccionaron como representativos de la región y estaban lejos de material necrótico o abscesos. Los infiltrados inmunes se puntuaron de la siguiente manera:

(a) infiltrados linfoides tumorales:

La densidad de los infiltrados linfoides tumorales se cuantificó contando los linfocitos redondos pequeños distribuidos dentro del epitelio tumoral y el estroma peritumoral en cinco campos de potencia media (microscopio Nikon, objetivo x 20). La densidad de infiltrado inmune puntuada como 1 (débil), 2 (moderada) o 3 (fuerte), se observó en el 16 %, 62 % y 22 % de las series, respectivamente.

(b) reacción linfoide en el margen invasivo:

El punto de corte de linfocitos colindantes con el punto más profundo del avance del tumor (margen invasivo) se consideró como destacado (puntuación 3), no destacado (puntuación 2) o ausente (puntuación 1). La reacción linfoide puntuada como 1,2 o 3, se observó en el 18 %, 60 % y 22 % de las series, respectivamente.

(c) ganglios linfoides que rodean la periferia del tumor:

La reacción linfoide de tipo Crohn se definió como agregados linfoides (a menudo con centros germinales) que rodeaban la periferia de un carcinoma invasivo, encontrados habitualmente en la interfase de la muscular propia externa y el tejido fibroadiposo pericólico, no asociados con ninguna mucosa (por ejemplo, origen diverticular) o ganglio linfático preexistente. Se requirieron dos agregados linfoides grandes en una sección para la presencia de esta característica (puntuación 2). Más de dos agregados linfoides grandes se refirieron a la puntuación 3, mientras que solo uno o una ausencia de agregados linfoides se puntuó como 1. La densidad de los ganglios linfoides puntuada como 1,2 o 3, se observó en el 38 %, 39 % y 23 % de las series, respectivamente.

Análisis por PCR Taqman en tiempo real

Se extrajo el ARN total de 100 especímenes de tumor congelados seleccionados al azar a partir de la cohorte de 959 casos; se analizó la expresión génica de 75 muestras, de suficiente calidad y cantidad, utilizando PCR Taqman en tiempo real cuantitativa (Matrices de baja densidad) y el sistema de PCR robótico 7900 (Applied-Biosystems, Foster City, CA), tal como se describe a continuación.

Se congelaron de forma inmediata muestras de tejido durante los 15 minutos siguientes a la cirugía y se almacenaron en N2 líquido. Se extrajo el ARN de especímenes de tumor congelados seleccionados al azar (n=100) de la cohorte. Se aisló el ARN total mediante homogeneización con un kit de aislamiento RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Se evaluaron la integridad y la cantidad del ARN en un bioanalizador-2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Setenta y cinco muestras tenían una calidad y cantidad de ARN suficiente para el análisis con matriz de baja densidad. Todas estas muestras, representativas de la cohorte, se evaluaron por análisis de la expresión génica. Se llevaron a cabo experimentos de RT-PCR según las instrucciones del fabricante (Applied-Biosystems, Foster City, CA). Se realizó una PCR TaqMan en tiempo real cuantitativa utilizando matrices de baja densidad y el sistema de PCR en tiempo real robótico 7900 (Applied-Biosystems) (véase la lista de genes en la Tabla 2 para más detalles). Los cebadores y sondas de 18S y GAPDH se utilizaron como controles internos. Los datos se analizaron utilizando el software SDS v2.2 (Applied-Biosystems).

Se congelaron de forma inmediata muestras de tejido durante los 15 minutos siguientes a la cirugía y se almacenaron en N2 líquido. Se extrajo el ARN de especímenes de tumor congelados seleccionados al azar (n=100) de la cohorte (n=959). Se aisló el ARN total mediante homogeneización con un kit de aislamiento RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Se evaluaron la integridad y la cantidad del ARN en un bioanalizador-2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Setenta y cinco muestras tenían una calidad y cantidad de ARN suficiente para el análisis con matriz de baja densidad. Todas estas muestras, representativas de la cohorte, se evaluaron por análisis de la expresión génica. Se llevaron a cabo experimentos de RT-PCR según las instrucciones del fabricante (Applied-Biosystems, Foster City, CA). Se realizó una PCR TaqMan en tiempo real cuantitativa utilizando matrices de baja densidad y el sistema de PCR en tiempo real robótico 7900 (Applied-Biosystems) (véase la lista de genes en la Tabla 2 para más detalles). Los cebadores y sondas de 18S y GAPDH se utilizaron como controles internos. Los datos se analizaron utilizando el software SDS v2.2 (Applied-Biosystems).

Análisis por citometría de flujo a gran escala

Se extrajeron células por dispersión mecánica de 39 muestras de tumor fresco. Todas las células (incluyendo las células tumorales) se analizaron mediante citometría de flujo. Las células de la mucosa normal de un sitio que estaba lejos del tumor fresco también se analizaron. Las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos contra los marcadores de células inmunes (véase la Tabla 3 para la lista de anticuerpos). Los análisis se llevaron a cabo con un citómetro de flujo de cuatro colores FACScalibur y un software CellQuest (Becton Dickinson, San Diego, CA). Las subpoblaciones inmunes se midieron como un porcentaje del número total de todas las células y un porcentaje del número total de células CD3+. Se aplicó un agrupamiento jerárquico de vinculación promedio y los resultados se presentaron utilizando el programa GENESIS (Sturn A, Quackenbush J, Trajanoski Z. Genesis: cluster analysis of microarray data. Bioinformatics 2002; 18(1): 207-8; Galon J, Franchimont D, Hiroi N, et al. Gene profiling reveals unknown enhancing and suppressive actions of glucocorticoids on immune cells. Faseb J 2002; 16(1): 61-71; software disponible en http://www.genome.tugraz.at).

Construcción de una micromatriz de tejido

Utilizando un instrumento de matriz de tejido (Beecher Instruments, ALPHELYS, Plaisir, Francia), se retiraron dos áreas representativas del tumor (centro y margen invasivo) (perforaciones de 0,6 mm y 1 mm de diámetro, respectivamente) a partir de bloques de tejido embebidos en parafina que se prepararon en el momento de la resección. De los carcinomas colónicos que se reseccionaron entre 1990 y 2003, el 50 por ciento (415) se seleccionaron al azar para la construcción de micromatrices de tejido. En base a los descubrimientos patológicos T, N, M, VELIPI, los pacientes con estos tumores fueron representativos de toda la cohorte. Los núcleos de tejido expuestos en bloques de parafina receptores se cortaron en secciones de 5 gm para la tinción de hematoxilina de Harris (HE) e inmunohistoquímica.

Inmunohistoquímica

Después de la recuperación de antígenos y la detención de la actividad de la peroxidasa endógena, se incubaron las secciones (60 minutos a temperatura ambiente) con anticuerpos monoclonales contra CD45RO y CD3 (Neomarkers, Fremont, CA). Se aplicaron el sistema Envision+ (esqueleto polimérico conjugado a enzima acoplado con anticuerpos secundarios) y cromógeno DAB (Dako, Copenhague, Dinamarca). Las secciones de tejido se contratiñeron con hematoxilina de Harris. Como controles negativos se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón del mismo isotipo. Se analizaron los portaobjetos con una terminal de análisis por imagen (Spot Browser®, ALPHELYS). Se obtuvieron las imágenes de puntos de alta resolución policromáticas (740x540 píxeles, resolución 1,181 qm/píxel) (aumento x100 veces). Se registraron las mediciones como el número de células positivas por unidad de superficie de tejido

Análisis estadístico

Se utilizaron curvas de Kaplan-Meier para evaluar la influencia de signos patológicos de invasión metastásica temprana (VELIPI) sobre la supervivencia total y libre de enfermedad. Se calculó la significancia de diversos parámetros clínicos mediante análisis unifactorial utilizando el ensayo de rango logarítmico (Tabla 1). Se utilizó el modelo de riesgos proporcionales de Cox para ensayar la influencia simultánea sobre la supervivencia (total y libre de enfermedad) de todos las covariables encontradas significativas en el análisis unifactorial. Se utilizaron los mismos ensayos para evaluar el efecto de la densidad de CD45RO (número de células/mm2) sobre la supervivencia total y libre de enfermedad, solo o junto con las covariables de estadificación del tumor, ganglio y metástasis (T, N, M). El ensayo t Anova y el ensayo de Wilcoxon-Mann-Whitney fueron los ensayos paramétricos y no paramétricos utilizados para identificar marcadores con una expresión significativamente diferente entre los tumores positivos para VELIPI y negativos para VELIPI. Se determinó la normalidad del logaritmo de los niveles de expresión génica y de las densidades de CD45RO utilizando el ensayo de Shapiro. Se utilizó el ensayo de Wilcoxon para evaluar la significancia de la diferencia entre las supervivencias medias entre diferentes grupos de pacientes. Todos los ensayos fueron bilaterales. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se informó de todos los valores de P sin ajustes de corrección múltiples. Todos los análisis se realizaron con el software estadístico R y Statview.

Material y métodos del ejemplo 5

A.3. Pacientes y bases de datos

Se revisaron los registros de 415 pacientes con cáncer colorrectal (CRC) que se sometieron a resección primaria de su tumor en los Hospitales Laennec-HEGP entre 1990 y 2003. Estos 415 pacientes de los hospitales Laennec-HEGP fueron el principal objeto de nuestro estudio (Tabla 11-S1).

Se disponía de muestras de tumor embebidas en parafina de 150 pacientes consecutivos a los que se les había diagnosticado CRC en el hospital Avicenne entre 1996 y 2001. Finalmente, se evaluaron para los análisis de supervivencia 119 pacientes de estas series de validación, cuyo seguimiento no se había perdido y con muestras de biopsia de las 2 regiones tumorales (puntos de micromatriz de tejido). Estos 119 pacientes (12, 33, 48, y 26 pacientes con estadios I, II, III, y IV de UICC-TNM, respectivamente) del hospital Avicenne fueron el primer conjunto de validación.

Se seleccionaron muestras de tumor congeladas de 75 pacientes de los hospitales Laennec-HEGP para el análisis de la expresión génica. Estos pacientes son diferentes de la serie principal de 415 pacientes. A partir de esta serie de 75 pacientes (6, 17, 24, y 28 pacientes con estadios I, II, III, y IV de UICC-TNM, respectivamente), se evaluaron para los análisis de supervivencia muestras de tumor embebidas en parafina de 69 pacientes, con muestras disponibles de biopsia de las 2 regiones de tumor (puntos de micromatriz de tejido). Estos 69 pacientes de los hospitales Laennec-HEGP fueron el segundo conjunto de validación.

El tiempo de observación en estas cohortes fue el intervalo entre el diagnóstico y el último contacto (muerte o último seguimiento). Los datos se controlaron en el último seguimiento para los pacientes sin recidiva, o muerte. La duración media del seguimiento de la serie principal fue de 45,3 meses. Los valores mín:máx hasta la progresión/muerte o último seguimiento fueron (0:166) meses, respectivamente. El tiempo hasta la recurrencia o tiempo libre de enfermedad se definió como el intervalo desde la fecha de la cirugía hasta la fecha de recidiva de tumor confirmada para pacientes con recidiva y desde la fecha de la cirugía hasta la fecha del último seguimiento para pacientes libres de enfermedad. Los descubrimientos histopatológicos y clínicos se puntuaron según el sistema de estadificación UICC-TNM (L. Sobin, C. Wittekind, TNMclassification of malignant tumors. 6a, Ed. (Wiley-Liss, Nueva York, 2002). La vigilancia de los pacientes después de la cirugía se realizó en el Laennec-HEGP, Avicenne y hospitales asociados para todos los pacientes según la práctica general para pacientes con CRC. Se administró quimioterapia adyuvante a los pacientes con estadio III de CRC, con estadio II de alto riesgo de CRC, y quimioterapia paliativa a pacientes con cánceres colorrectales avanzados (estadio IV) y a pacientes sin resección completa del tumor. La quimioterapia adyuvante se basó en fluorouracilo (FU). Los datos de seguimiento se recogieron de forma prospectiva y se actualizaron. Se construyó una base de datos segura basada en Web, TME.db (Tumor MicroEnvironment Database disponible bajo petición), en un tercer nivel de arquitectura utilizando Java-2 Enterprise-Edition (J2EE) para integrar los datos clínicos y los datos de tecnologías de alto rendimiento.

A. 4. Histopatología

Análisis de PCR Taqman en tiempo real

Se llevó a cabo un análisis de PCR Taqman en tiempo real tal como se ha descrito en el apartado de Material y Métodos de los Ejemplos 1 a 4 anteriores.

Construcción de micromatriz de tejido

Se realizó la construcción de una micromatriz de tejido tal como se ha descrito en el apartado de Material y Métodos de los Ejemplos 1 a 4 anteriores.

Inmunoquímica

Se incubaron secciones de micromatrices de tejido (60 minutos a temperatura ambiente) con anticuerpos monoclonales contra CD3 (SP7), CD8 (4B11), Cd45Ro (OPD4), GZMB (GrB-7), citoqueratina (AE1AE3) y citoqueratina-8 (Neomarkers, Fremont, CA). Se aplicaron el sistema Envision+ (esqueleto polimérico conjugado a enzima acoplado con anticuerpos secundarios) y cromógeno DAB (Dako, Copenhague, Dinamarca). Se revelaron tinciones dobles con anticuerpos secundarios conjugados con fosfato y cromógeno FastBlue. Para tinciones simples, se contratiñeron secciones de tejido con hematoxilina de Harris. Como controles negativos se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón del mismo isotipo. Se analizaron los portaobjetos con una terminal de análisis por imagen (Spot Browser®, ALPHELYS). Se obtuvieron las imágenes de puntos de alta resolución policromáticas (740x540 píxeles, resolución 1,181 gm/píxel) (aumento x100 veces). Se registró la densidad como el número de células positivas por unidad de área superficial de tejido. Para cada duplicado, se utilizó la densidad media para el análisis estadístico.

Para cada tumor, el duplicado de puntos mostró un buen nivel de homogeneidad de densidades de células teñidas en cada región del tumor (CT e IM). Estaban presentes densidades heterogéneas de los infiltrados inmunes (HiLo y LoHi) entre regiones del tumor (CT/IM) en el 37 %, 33 %, 47 %, 36 % de los tumores en los que se había evaluado las densidades de células CD3, CD8, CD45RO y GZMB, respectivamente.

Análisis estadístico

Para visualizar la matriz de correlación presentada en la Figura 1 y para llevar a cabo el agrupamiento jerárquico no centrado de Pearson se utilizó un software de agrupamiento Genesis (J. Galon et al., 2002, Faseb J, Vol. 16: 61). Se utilizó el paquete pvcluster R para validar los agrupamientos encontrados.

Se utilizaron los estimadores de Kaplan Meier de supervivencia para visualizar las curvas de supervivencia y para obtener los estimadores de la media, percentil 75 y proporciones de supervivencia a los 2, 4 y 5 años para la OS y DFS. El ensayo de rango logarítmico se utilizó para comparar la supervivencia libre de enfermedad y total entre pacientes en diferentes grupos. Para los marcadores medidos con RT-PCR, el nivel de expresión medio se tomó como punto de corte para dicotomizar las variables. Para los cuatro marcadores estudiados adicionalmente en dos regiones diferentes (CT e IM) utilizando TMA (CD3, CD45RO, CD8, GZM) se aplicó la estrategia del “valor de p mínimo” para obtener el punto de corte que proporcionaba la mejor separación entre los grupos de pacientes en relación con su resultado de supervivencia libre de enfermedad. Los valores de punto de corte para las densidades de células CD3, CD8, CD45RO, GZMB fueron 370, 80, 80, 30 células/mm2 en el centro del tumor y 640, 300, 190 y 60 células/mm2 en el margen invasivo, respectivamente. Dado que los valores de P obtenidos de este modo podrían presentar una sobrevaloración severa, los valores de P de rango logarítmico de DFS se corrigieron utilizando la fórmula propuesta por Altman et al. (D.G. Altman et al., 1994, J. Natl Cáncer Inst, Vol. 86: 829). De forma adicional, los valores de P de rango logarítmico de la DFS y OS se calcularon utilizando una validación cruzada 2 veces posterior (D. Faraggi et al., 1996, Stat Med, Vol. 15: 2203). Se realizaron 100 repeticiones (con y sin estratificar las variables de agrupamiento). Los valores de p medios se resumen en las Tablas 13-14 (S4-S5) y 16-17 (S7-S8).

Se aplicó un modelo de riesgos proporcionales de Cox multifactorial al marcador de regiones combinadas CD3ctCD3im para determinar su proporción de riesgo después del ajuste mediante marcadores tumorales histopatológicos tradicionales. El modelo de Cox se aplicó solo a pacientes con estadios I, II, III de UICC-TNM para garantizar una función de riesgo de línea de base común. Las proporciones de riesgos a partir del modelo de DFS se corrigieron utilizando un factor de contracción estimado de la validación cruzada “dejando uno fuera” tal como sugirieron Hollander et al. (N. Hollander et al., 2004, Stat Med, Vol. 23: 1701). En las Tablas 14-15 y 18-19 se presentan los modelos que utilizan la mediana como punto de corte. Adicionalmente, los marcadores de interés fueron un factor de pronóstico independiente cuando se consideraban los marcadores de interés en su escala continua original (no se muestran los datos).

En todo el texto, un valor de P<0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis se llevaron a cabo con el software estadístico R (paquete de supervivencia) y Statview.

B. Resultados

Ejemplo 1: correlación entre el resultado clínico y la respuesta inmune adaptativa

1.1 Invasión metastásica temprana y resultado clínico

La significancia del pronóstico de la presencia de embolia vascular (VE), invasión linfática (LI), e invasión perineural (PI), que delineaba la invasión metastásica temprana (VELIPI), se investigó mediante análisis unifactorial de los 959 pacientes con cáncer colorrectal. VE, LI, PI, y VELIPI así como el estadio T, N, M influyeron significativamente en la supervivencia libre de enfermedad y total (P<0,001) (Tabla 1).

Las tasas de supervivencia libre de enfermedad a los cinco años fueron del 32,4 por ciento entre pacientes con tumores negativos para VELIPI, y del 12,1 por ciento entre pacientes con tumores positivos para VELIPI, respectivamente. También se observaron diferencias en la duración mediana de la supervivencia libre de enfermedad (3,3 frente a 26,9 meses para tumores positivos para VELIPI y negativos para VELIPI, respectivamente, P<0,001). Se encontró un patrón similar para la supervivencia total (Tabla 1).

Además, la presencia de más de un signo de invasión metastásica temprana confirió un pronóstico peor que un único signo. Las curvas de Kaplan-Meier sugirieron una supervivencia total y supervivencia libre de enfermedad más largas en pacientes con tumores negativos para VELIPI que en pacientes con tumores positivos para VELIPI (ensayo de rango logarítmico, P<0,001). VE, LI, o PI se correlacionaban con los estadios N y M (P<0,001 para todas las comparaciones). La influencia de todas las covariables significativas sobre la supervivencia se ensayó simultáneamente utilizando un modelo de riesgos proporcionales de Cox. El análisis multifactorial, ajustando a la estadificación TNM, confirmó que el estado VELIPI se asociaba de forma significativa e independiente a un pronóstico mejor (P=0,04 y P=0,01 para supervivencia total y libre de enfermedad, respectivamente). Ajustando para la estadificación de Dukes, el estado VELIPI se asoció independientemente con un pronóstico mejor (P=0,007 y P=0,002 para la supervivencia total y libre de enfermedad, respectivamente).

1.2 Infiltración de células inmunes, inflamación, invasión metastásica temprana y pronóstico

Se evaluaron tumores colorrectales (n=377) de histopatológicamente para un infiltrado de células inmunes dentro del tumor y en el margen invasivo.

La presencia de un infiltrado inmune fuerte (puntuación 3) se asoció con tumores negativos para VELIPI.

Se midieron los ARNm para moléculas proinflamatorias e inmunosupresoras en 75 tumores colorrectales mediante PCR en tiempo real cuantitativa con matriz de baja densidad. No se encontró ninguna asociación significativa entre el contenido de ARNm para los mediadores proinflamatorios (IL-8, VEGF, CEACAM-1, MMP-7, Cox-2 y trombospondina-1), o para moléculas inmunosupresoras (TGFp, IL-10, B7-H3, y CD32b) y el estado VELIPI o la recidiva (Figura 1 y datos no mostrados).

Las células T se diferencian en células Th1 o Th2 después de la expresión de T-bet o GATA-3, respectivamente. Las respuestas inmunes protectoras están mediadas por células T de memoria efectoras con el fenotipo CD8+, CD45RO+, CCR7-, CD62L-, perforina+, granulisina+, granzima-B+. Estas células ejercen una función efectora inmediata tras la estimulación con antígeno mediante la liberación de mediadores citotóxicos. Tal y como se muestra en la Figura 1, CD8a, granulisina, y granzima-B aumentaron en tumores negativos para VELIPI y aumentaron aún más en los tumores de pacientes que no habían sufrido recidiva, en comparación con los tumores positivos para VELIPI de pacientes que habían sufrido recidiva (P<0,05).

Además, los tumores negativos para VELIPI de pacientes que no habían sufrido recidiva tenían un aumento significativo de los mediadores de Th1, T-bet, IRF-1, e IFN-y en comparación con tumores positivos para VELIPI de pacientes que habían sufrido recidiva (P<0,05). En cambio, el factor de transcripción de Th2, GATA-3, no aumentó en ningún grupo de pacientes (Figura 1).

Ejemplo 2: Fenotipos de células inmunes infiltrantes en el tumor

Se analizaron las subpoblaciones de células inmunes de 39 cánceres de colon recién reseccionados mediante una citometría de flujo a gran escala. Para refinar el análisis, se midieron 410 combinaciones diferentes de marcadores superficiales mediante FACS, y los resultados se representaron desde la expresión mínima hasta la máxima.

Las células T, células B, células NK, células NKT, y macrófagos se analizaron en relación con el estado VELIPI de los tumores. Las células T CD3+ fueron las células inmunes infiltrantes en el tumor más prevalentes. Las células T CD3+, CD3+CD4+, y CD3+CD8+ aumentaron significativamente (aumento de 2,6, 2,5, 4,9 veces, respectivamente, P<0,05) en tumores negativos para VELIPI en comparación con tumores positivos para VELIPI.

El análisis a gran escala de los marcadores fenotípicos y funcionales de las subpoblaciones de células T (porcentaje de células positivas en la población total aislada del tumor y dentro de la población de células T CD3+) reveló una diferencia significativa (P<0,05) entre tumores negativos para VELIPI y positivos para VELIPI para 65 combinaciones diferentes de marcadores. El agrupamiento jerárquico (Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95 (25): 14863-8) mostró un patrón homogéneo en tumores positivos para VELIPI, mientras que se pudieron distinguir dos subgrupos de tumores negativos para VELIPI.

Todos los marcadores (CD45RO, CD45RA, CD27, CD28, CCR7, CD127) del proceso de diferenciación de las células T de células sin estimular a células T de memoria efectoras estaban presentes en el agrupamiento de marcadores expresados de forma diferencial. Los marcadores de la migración (CD62L-, CCR7-, CD103, CD49d, CXCR3) y de la activación (HLA-DR, CD98, CD80, CD86, CD134) de las células T también se expresaron de forma diferencial entre los tumores negativos para VELIPI y positivos para VELIPI.

Los resultados han mostrado que las células T sin estimular (CD3+CCR7+) eran raras en los tumores. Por el contrario, en la ruta de diferenciación desde células T de memoria tempranas (CD45RO+CCR7-CD28+CD27+) hasta células T de memoria efectoras (CD45RO+CCR7-CD28-CD27-), se detectaron todas las subpoblaciones. En comparación con los tumores positivos para VELIPI, los tumores negativos para VELIPI tenían, de forma significativa, más de estas células T (P<0,05). Los resultados muestran la elevada proporción de células T CD8+ maduras en los tumores negativos para VELIPI. Al contrario que en los tumores, la mucosa normal distante de los mismos pacientes, no mostraba diferencias en las subpoblaciones de células T CD8+ según el estado VELIPI.

Ejemplo 3: Células T de memoria efectoras y supervivencia

Se realizó un análisis inmunohistoquímico sobre micromatrices de tejido preparadas a partir de 415 cánceres colorrectales. La tinción con un anticuerpo anti-CD3 reveló la presencia de células T tanto dentro del tumor como en el margen invasivo del mismo. Se contaron las células CD45RO+ mediante un software de imagen automático. Un estudio de validación mostró una correlación estrecha entre los recuentos de células ópticos y automáticos (R2=0,914, P<0,001).

Los tumores negativos para VELIPI contenían números elevados de células CD45RO en comparación con los tumores positivos para VELIPI (P=0,02). Además, una densidad alta de células T de memoria estaba asociada con tumores negativos para ganglios linfáticos (N-) y negativos para metástasis (M-) (P<0,001).

Los estadios avanzados de invasión de ganglios linfáticos (N2, N3) estaban asociados con densidades bajas de CD45RO en los tumores (Figura 2).

El análisis de riesgos proporcionales de Cox multifactorial mostró que M (P<0,001), N (P=0,002), y T (P=0,004), así como CD45RO (P=0,02) eran factores de pronóstico de supervivencia total independientes. Las curvas de Kaplan-Meier sugirieron una supervivencia total y supervivencia libre de enfermedad más largas (Figura 3A, 3B) en pacientes con tumores que contenían una densidad alta de CD45RO que en pacientes con densidad baja (ensayo de rango logarítmico, P<0,001). Los pacientes cuyos tumores contenían una densidad alta de CD45RO tenían una supervivencia libre de enfermedad mediana de 36,5 meses y una supervivencia total mediana de 53,2 meses, en comparación con los 11,1 y 20,6 meses, respectivamente, entre pacientes con densidad baja de CD45RO (P<0,001 para todas las comparaciones) (Figura 3A, 3B). Las tasas de supervivencia total (Figura 3A) y supervivencia libre de enfermedad (Figura 3B) a los cinco años fueron del 46,3 y 43,1 por ciento entre pacientes con tumores que contenían una densidad alta de CD45RO y 23,7 y 21,5 por ciento entre pacientes con tumores que contenían baja densidad de CD45RO.

Los resultados de los Ejemplos 1 a 3 anteriores muestran que existe una relación entre signos patológicos de invasión metastásica temprana (embolia vascular (VE), invasión linfática (LI), e invasión perineural (PI), denominadas colectivamente VELIPI) y el resultado en 959 cánceres colorrectales.

También se ha mostrado la existencia de una asociación entre el estado VELIPI del tumor y la evidencia de una respuesta inmune dentro del tumor. En particular, un análisis de 39 cánceres colorrectales mostró que la presencia de células T de memoria efectoras intratumorales, definidas por los marcadores CD3, CD8, CD45RO, CCR7, CD28, y CD27, se asociaba con tumores negativos para VELIPI. El análisis de 415 tumores colorrectales mostró que una densidad alta de células CD45RO+ infiltrantes se correlacionaba con un buen resultado clínico.

En la serie de 959 cánceres colorrectales de la presente memoria, una embolia detectada mediante un examen patológico meticuloso mostraba una asociación independiente significativa entre el estado VELIPI y la supervivencia total.

En los ejemplos 1 a 3 anteriores, no se encontraron diferencias significativas en el contenido de ARNm para moléculas proinflamatorias e inmunosupresoras en tumores positivos para VELIPI y negativos para VELIPI, o en tumores de pacientes que tuvieron o no recidiva. Estos descubrimientos sugieren que la inflamación no es un factor en la invasión metastásica temprana.

En cambio, había un incremento de ARNm para productos y marcadores de células T efectoras Th1 (CD8, T-bet, IRF-1, IFN-y, granulisina, y granzima-B), y este incremento estaba asociado con una supervivencia prolongada y carencia de signos patológicos de invasión metastásica temprana.

Utilizando micromatrices de tejido, en los ejemplos 1 a 3 anteriores se mostró la asociación entre un elevado número de células T CD45RO+ y la ausencia de invasión linfovascular y perineural (P<0,002). Los tumores que contenían una densidad alta de células T de memoria efectoras se asociaron con una supervivencia libre de enfermedad y total más largas que para tumores que carecían de dichas células (P<0,001). La presencia de células T de memoria positivas para CD45RO en el tumor fue un factor de pronóstico independiente.

En los ejemplos 1 a 3, la medición cuantitativa de alto rendimiento de las diferencias celulares y moleculares entre cánceres colorrectales permitió una caracterización detallada del microentorno del tumor, y la identificación de asociaciones con el resultado clínico. Los resultados experimentales muestran que el microentorno del tumor y la respuesta inmune del huésped tienen una importancia principal en la progresión del tumor.

De este modo, en los Ejemplos 1 a 3 anteriores se ha mostrado que el análisis unifactorial mostró diferencias significativas en la supervivencia libre de enfermedad y total según la presencia o ausencia de signos histológicos de invasión metastásica temprana (P<0,001). Mediante el análisis de Cox multifactorial, el estadio patológico (T, N, M) (P<0,001) y la invasión metastásica temprana (P=0,04) se asociaron de forma independiente con la supervivencia. Los tumores que carecían de signos de invasión metastásica temprana tenían infiltrados de células inmunes y ARNm aumentado para productos de las células T efectoras Th1 (CD8, T-bet, IRF-1, IFN-y, granulisina, y granzima-B).

Por el contrario, no se expresaron de forma diferencial ni mediadores proinflamatorios ni moléculas inmunosupresoras. En los tumores con o sin signos tempranos de invasión metastásica, existieron diferencias significativas para 65 combinaciones de marcadores de células T, y el agrupamiento jerárquico mostró que los marcadores de la migración, activación y diferenciación de las células T estaban aumentados en tumores que carecían de estos signos.

Estos tumores contenían números aumentados de células T positivas para CD8, que variaban de células T de memoria tempranas (CD45RO+CCR7-CD28+CD27+) a células T de memoria efectoras (CD45RO+CCR7-CD28-CD27-). La presencia de células CD45RO+ de memoria infiltrantes, evaluada mediante inmunohistoquímica, se correlacionó con signos de invasión metastásica temprana, estadio patológico y supervivencia.

Por lo tanto, se ha mostrado que los signos de una respuesta inmune dentro de los cánceres colorrectales están asociados con la ausencia de evidencia patológica de invasión metastásica temprana y supervivencia prolongada.

Ejemplo 4: Correlación entre (i) respuesta inmune adaptativa y (i) tiempos de recurrencia y supervivencia

Se investigó la orientación funcional de la respuesta del huésped en los cánceres colorrectales mediante PCR cuantitativa en tiempo real a través de la evaluación de 18 genes relacionados con la inmunidad. Estos genes se expresaban de forma variable entre los 75 tumores estudiados.

Los análisis de correlación realizados entre todos los genes (que representaban 153 ensayos de correlación) mostraron 70 combinaciones significativas (P<0,05) que incluían 39 combinaciones altamente significativas (P<0,0001) (véase la Tabla 4).

Se generó una matriz de correlación, seguida de agrupamiento jerárquico no supervisado que ofrecía una forma conveniente de visualizar patrones de similitud y diferencia entre todas las correlaciones. Esto permitió la identificación de un agrupamiento dominante de genes co-modulados, compuesto por genes relacionados con Th1 (Tbet, IRF-1, IFNy) e inmunoadaptativos (CD3Z, CD8, GLNY, GZMB), y dos agrupamientos que se refieren a mediadores proinflamatorios e inmunosupresores.

Los patrones de expresión de las agrupaciones eran casi exclusivos mutuamente en los tumores. Los niveles de expresión de los genes del agrupamiento TH1/adaptativo se correlacionaban de forma inversa con recidiva, mientras que no pasó con los otros (VEGF, MMP-7, Cox-2, IL-8, Survivina, CEACAM1, TRAIL-R, B7H3, IL-10, TGFb).

Una estructura de árbol jerárquica clasificando los 75 cánceres colorrectales según los niveles de ARNm de los genes de la agrupación TH1/adaptativo (de niveles de expresión máximos a mínimos) mostró tasas de recurrencia progresivas del 20 % al 80 %, (ensayo exacto de Fisher comparando el grupo 1 y el grupo 2, P=0,016). Los pacientes con un patrón homogéneo aumentado de expresión génica TH1/adaptativo en el tumor se asociaron con el mejor pronóstico.

En conjunto, estos datos proporcionaron una evidencia de un efecto beneficioso de la inmunidad TH1/adaptativa in situ sobre el resultado clínico.

A continuación, los resultados finales celulares de los perfiles de expresión génica inmunoadaptativa se evaluaron mediante un análisis de micromatrices de tejido basado en inmunohistoquímica de 415 tumores.

Además, la distribución de la respuesta inmune adaptativa in situ se exploró estudiando el centro del tumor (CT) junto con el margen invasivo (IM).

En las dos regiones del tumor, la inmunotinción de los linfocitos T totales (CD3), efectores de células T CD8 y la molécula citotóxica asociada (GZMB), y células T de memoria (CD45RO) mostró un amplio espectro de densidades de células inmunes positivas entre todas las muestras ensayadas.

Las 6.640 inmunotinciones correspondientes se analizaron con una terminal de análisis por imagen especializada para la cuantificación de la señal (puntos capturados), permitiendo mediciones precisas de densidad celular.

Un estudio de validación mostró una correlación estrecha entre los recuentos de células ópticos y automáticos (R2>0,9, P<0,001 para todos los marcadores).

Las distribuciones de las células inmunes en regiones específicas se analizaron en relación con el resultado clínico. Los tumores de pacientes sin recidiva tenían una densidad de células inmunes (CD3, CD8. CD45RO, GZMB) dentro de cada región del tumor (CT o IM) significativamente más alta (todos P<0,003), que los tumores de pacientes con recidiva (Fig. 4).

Sobre la base de una cuantificación de la señal por ordenador, se creó un medio para ensayar los valores de punto de corte de las densidades de las células teñidas (para todos los marcadores en las dos regiones del tumor) para la discriminación de los pacientes en cuanto a tiempos de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia total (1.600 ensayos de rango logarítmico). Esto permitió definir los valores de punto de corte óptimos de las densidades de las células inmunes (CD3, CD8, CD45RO, GZMB), y mostrar que había un intervalo grande de valores de punto de corte en las dos regiones del tumor que eran significativos (Figura 5). Según estos valores de punto de corte, se observó que los infiltrados de células inmunes (densidades altas o bajas para CD3, CD8, CD45RO, GZMB) en cada región del tumor (CT o IM) distinguieron de forma marcada a los pacientes (n=415) en grupos con supervivencia libre de enfermedad (DFS) mediana diferente (Fig. 5). Los ensayos de rango logarítmico fueron altamente significativos para todos los marcadores estudiados en las dos regiones del tumor para la DFS (valores de P que variaban de 1,5 x 10-4 a 1,4 x 10-8) (Fig. 5 y Tabla 5) y para la OS (Tabla 6).

Adicionalmente, se investigó si la distribución estructural de las poblaciones de células inmunes dentro del tumor (CT/IM) podría influir en el pronóstico. Se analizaron las curvas de Kaplan-Meier para la DFS y OS para pacientes con densidades altas y bajas de CD3 en las dos regiones del tumor. Esto mostró que las densidades de CD3ct/CD3im altas daban como resultado una supervivencia total y libre de enfermedad significativamente mejores, en comparación con una densidad alta de CD3 en una única región (P<0,0001) (Fig. 7A, 7B). El análisis combinado de las regiones CT más IM aumentó aún más las diferencias de medianas de DFS entre pacientes con densidades altas y bajas para todos los marcadores inmunes adaptativos (valores de P que variaban de 3,7 x 10-7 a 5,2 x10-11), en comparación con el análisis único de regiones CT o IM (Fig. 6 y Fig. 7C). De este modo, la DFS mediana para pacientes bajos y altos fue de 5,9 frente a 45,9 meses para CD3ct, de 12,9 frente a 47,8 meses para CD3im (Fig. 6), y de 5,9 frente a 66,2 meses para CD3ct/CD3im, respectivamente (Fig. 7C y Tabla 4). Si se toman conjuntamente, estas observaciones indican que los tiempos de supervivencia libre de enfermedad y total se pueden predecir sobre la base de la distribución arquitectónica y de la amplitud de la respuesta inmune adaptativa coordinada in situ en distintas regiones del tumor.

El pronóstico del cáncer colorrectal se basa actualmente en criterios histopatológicos de invasión tumoral. Los modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox ajustados para estadios de TNM y diferenciación del tumor mostraron que la densidad de CD3ct/CD3im era un pronosticador independiente de la supervivencia libre de enfermedad y total (P=2,8 x10-6, P=3,0 x10-3, respectivamente) (Tabla 5). De forma destacable, las densidades de CD3ct/CD3im fue el parámetro más significativo asociado con la supervivencia libre de enfermedad y tuvo un valor de P mejor que el de los estadios T y N para el análisis de la supervivencia total. Además, todos los marcadores inmunes adaptativos también presentaron un valor de pronóstico independiente ajustado a los estadios TNM y a la diferenciación del tumor para la supervivencia libre de enfermedad y total (Tabla 7).

La estadificación convencional del cáncer colorrectal no tiene en cuenta la marcada variabilidad de los resultados que existe dentro de cada estadio. Dado que la naturaleza y la amplitud de la respuesta inmune in situ mantenía un valor de pronóstico independiente fuerte, investigamos si la evaluación de esta respuesta inmune coordinada podría predecir aún mejor los resultados de los pacientes en cada estadio. Estratificamos a los pacientes según la clasificación de Dukes (Fig. 8a) y mostraron una influencia de CD3ct/CD3im en todos los estadios de la enfermedad (Fig. 8b).

De manera inesperada, descubrimos que una respuesta inmune adaptativa fuerte coordinada in situ se correlacionaba con un pronóstico igualmente favorable, independientemente de la invasión del tumor a través de la pared intestinal y de la extensión a los ganglios linfáticos locales (Clasificación de Dukes A, B, C). A la inversa, una respuesta inmune adaptativa débil in situ se correlacionaba con un pronóstico muy malo, incluso en pacientes con una invasión tumoral mínima (clasificación de Dukes A y B) (Fig. 8b).

En los ejemplos 1 a 3 anteriores, se demostró que la ausencia de signos tempranos de diseminación tumoral (invasión linfovascular y perineural) y de invasión de los ganglios linfáticos estaba asociada con la presencia de una densidad fuerte de células T de memoria efectoras intratumorales (Tem).

En el presente ejemplo, también se determina si la evaluación adicional de la densidad de las células de memoria (CD45RO+) respecto a la densidad de células T CD3+ en las dos regiones del tumor también discrimina a los pacientes con riesgo de recurrencia tumoral. CD3ct/CD3im/CD45ROct/CD45ROim estratificaron a los pacientes de forma destacada en dos grupos con riesgo alto y bajo de recurrencia tumoral (Fig. 8c). Sorprendentemente, las densidades bajas de estos marcadores en las dos regiones del tumor revelaron un resultado similar para los pacientes con estadio C, B e incluso A de Dukes, en comparación con los pacientes con metástasis distante concomitante (D de Dukes).

En la presente memoria, utilizando la medición cuantitativa de alto rendimiento de parámetros inmunes celulares y moleculares, se caracterizaron las fuerzas inmunológicas en el microentorno del carcinoma colorrectal humano.

Sea cual sea el papel de la inmunovigilancia y formación, los presentes datos demuestran claramente el concepto de que una vez los carcinomas colorrectales humanos se vuelven detectables clínicamente, la inmunidad antitumoral natural in situ desempeña un papel principal en el control de la recurrencia del tumor después de la escisión quirúrgica.

Las respuestas inmunes adaptativas beneficiosas in situ no estaban restringidas a pacientes con una invasión del tumor mínima, lo que indica que las fuerzas inmunológicas in situ podían persistir junto con la progresión del tumor. La posibilidad no puede excluir que los linfocitos intratumorales modifican el estroma del tumor o las células tumorales, o ambos, de tal forma que atenúan la capacidad metastásica de las células tumorales.

Sin embargo, la correlación de la expresión de los marcadores inmunes adaptativos in situ, moléculas asociadas a Th1 y mediadores citotóxicos con una incidencia de la recurrencia del tumor baja aporta una evidencia del rechazo mediado de forma inmune de células tumorales persistentes después de la cirugía.

De esta forma, el buen valor de pronóstico asociado con la presencia in situ de una densidad alta de células T de memoria (células positivas para CD45RO), probablemente es el resultado de las propiedades de tráfico críticas y de la capacidad de protección antitumoral de larga duración de estas células, tal como se muestra en un modelo en ratones18.

La presente evaluación de la respuesta inmune adaptativa in situ que se realiza utilizando mediciones cuantitativas de densidades de células inmunes tanto en el centro como en el margen del tumor, reveló la importancia de una respuesta inmune adaptativa coordinada para controlar la recurrencia del tumor.

De forma inesperada, los criterios inmunológicos que se utilizan en la presente memoria no solo tuvieron un valor de pronóstico que era superior e independiente a los de las clasificaciones TNM y Dukes, sino que también se correlacionaba con un pronóstico igualmente favorable independientemente de la invasión del tumor.

Se muestra que el tiempo hasta la recurrencia y el tiempo de supervivencia total están gobernados más por el estado de la respuesta inmune adaptativa local que por la presencia de la diseminación del tumor a través de la pared intestinal y hacia el ganglio o ganglios linfáticos regionales.

Esta nueva información tiene diversas implicaciones importantes y puede cambiar la comprensión de la evolución de un carcinoma, que incluye el carcinoma colorrectal. Además, los criterios que se han utilizado, deberían conducir a una reevaluación de la clasificación utilizada actualmente del carcinoma colorrectal, e indica con más precisión, a los pacientes con riesgo alto de recurrencia del tumor, que se podrían beneficiar de la terapia adyuvante (que incluye inmunoterapia).

La utilidad de la inmunohistoquímica, combinada con la disponibilidad de un conjunto extenso de anticuerpos contra los marcadores inmunes, debería facilitar la aplicación de nuestra estrategia a otros tumores.

Ejemplo 5: resultados adicionales relativos a la correlación entre (i) respuesta inmune adaptativa y (i) tiempos de recurrencia y supervivencia

Se llevaron a cabo análisis genómicos y de inmunotinción in situ sobre 75 y 415 pacientes, respectivamente (Tabla 11 - S1). Los datos se introdujeron en una base de datos especializada Tumoral MicroEnvironment (TME.db; acceso disponible bajo petición). Usamos PCR en tiempo real cuantitativa para evaluar los niveles de expresión de genes inmunes relacionados con la inflamación, inmunidad adaptativa de T colaboradora 1 (Tm) e inmunosupresión. Estos genes mostraron patrones de expresión variables en los 75 tumores estudiados. Los análisis de correlación que se llevaron a cabo entre todos los genes mostraron 39 combinaciones altamente significativas (P<0,0001) (Tabla 4). Se identificó una agrupación dominante de genes co-modulados para la inmunidad adaptativa de Th1 (factor de transcripción 21 de la caja T (T-bet), factor 1 regulador del interferón (IRF-1), IFNy, CD3Z, CD8, granulisina (GLNY), granzima B (GZMB)). Una estructura en árbol jerárquica clasificando a los pacientes según los niveles de expresión de los genes de esta agrupación reveló una correlación inversa entre la expresión de estos genes y la recurrencia del tumor (valor de P comparando los grupos de pacientes, todos P<0,05). Estos datos muestran que la inmunidad adaptativa de Th1 tiene un efecto beneficioso sobre el resultado clínico.

A continuación, se utilizaron micromatrices de tejido para investigar la respuesta inmune adaptativa in situ en el centro del tumor (CT) y en el margen invasivo (IM) de 415 CRC. Se cuantificó la inmunotinción de los linfocitos T totales (CD3), células T CD8 efectoras y su molécula citotóxica asociada (GZMB), y células T de memoria (CD45RO) utilizando una terminal de análisis por imagen especializada. Los tumores de pacientes sin recurrencia tenían unas densidades de células inmunes (CD3, CD8, GZMB, CD45RO) dentro de cada región del tumor (CT, IM), superiores a las de pacientes cuyos tumores habían recurrido, tal como se observó anteriormente en el Ejemplo 4 anterior. En cada región del tumor (CT, IM) y para cada marcador (CD3, CD8, GZMB, CD45RO) había una correlación estadísticamente significativa entre la densidad de las células inmunes y el resultado de los pacientes para un intervalo grande de valores de punto de corte (Fig. 9 - S5). En particular, utilizando el punto de corte que rindió el valor de P mínimo para la supervivencia libre de enfermedad, las densidades de las células CD3+, CD8+, GZMB+, y CD45RO+ en cada región del tumor (CT e IM) permitió estratificar a los pacientes en grupos con supervivencia libre de enfermedad diferente estadísticamente (valores de P corregidos después (23), que variaban de 1,0 x 10-2 a 4,8 x10-6) y supervivencia total (valores de P que variaban de 5,5 x 10-3 a 7,9 x 10-8) (y Tablas 12, 13 - S3, S4). Los reanálisis de los datos utilizando 100 repeticiones de validaciones cruzadas 2 veces después (24) (Tablas 12, 13 -S3, S4) o estableciendo el punto de corte en la mediana de los conjuntos de datos (Tablas 14, 15 - S5, S6), proporcionó resultados concordantes en cuanto al valor de pronóstico de cada parámetro inmune.

A continuación, se investigó si el análisis combinado de regiones del tumor podría mejorar la predicción de la supervivencia de los pacientes. Para todos los marcadores de la inmunidad adaptativa (CD3, CD8, GZMB y CD45RO), los análisis combinados de las regiones CT más IM (HiHi frente a LoLo) aumentaron las diferencias en los tiempos de supervivencia libre de enfermedad y total entre los pacientes, comparado con el análisis de una región única (Hi frente a Lo) (Tablas 12-15 - S3-S6). Los datos también se analizaron utilizando una validación cruzada 2 veces después (24) (100*CV para cada marcador), mostrando diferencias altamente significativas (Tablas 12, 13 - S3, S4). CD3ct/CD3im se asoció con los valores de P más pequeños para el análisis de supervivencia libre de enfermedad y total (P=7,6 x 10-8 y P=4,0 x 10-7, respectivamente) (Tablas 12, 13 - S3, S4). Para confirmar estos resultados, se analizó una cohorte adicional de pacientes diferente de la primera serie y una tercera cohorte de CRC de otro hospital. Para cada cohorte, se determinaron los valores de punto de corte medianos para CD3ct/CD3im (50 % de los pacientes con una densidad alta y 50 % de los pacientes con una densidad baja). Las dos cohortes independientes confirmaron los datos obtenidos en la primera serie. Todos los análisis estadísticos también se realizaron en el subgrupo de pacientes sin metástasis distante concomitante (estadios I, II, y III de UICC-TNM). Para CD3ct/im, CD8ct/im y CD45ROct/im se observaron valores de P significativos para los análisis de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia total (Tablas 16-19 - S7-S10).

Se determinó si estos criterios inmunes podrían discriminar el resultado de pacientes en cada fase de la progresión del cáncer. Los pacientes se estratificaron según la clasificación UICC-TNM (25) (Fig. 10A). Una reacción inmune in situ fuerte en las dos regiones del tumor se correlacionaba con un pronóstico favorable independientemente de la extensión local del tumor y de la invasión a ganglios linfáticos regionales (estadios I, II, y III). A la inversa, una reacción inmune in situ débil en las dos regiones del tumor se correlacionaba con un mal pronóstico incluso en pacientes con una invasión del tumor mínima (estadio I) (Fig. 10B). Recientemente, demostramos la importancia de la densidad de células T de memoria CD45RO+ en la limitación de la diseminación del tumor de CRC (22). Descubrimos que los pacientes con densidades bajas de células CD3+ y células T de memoria CD45RO+ en las dos regiones del tumor (CT e IM) tenían un pronóstico muy malo, similar a los pacientes con metástasis distante concomitante (estadio IV) (FIG. 10C). En el análisis multifactorial, después de ajustar para la invasión del tumor (estadio T), la diferenciación del tumor y la invasión de ganglios linfáticos (estadio N), la densidad de CD3ct/CD3im (HiHi, heterogénea, LoLo) se mantuvo como un factor de pronóstico independiente con la proporción de riesgos más elevada y el valor de P más bajo en el análisis de supervivencia libre de enfermedad (HR de 2,391; P=1,4 x 10-6 corregida después (26)) (Tabla 20 - S11). La densidad de CD3ct/CD3im fue el único parámetro independiente asociado con la supervivencia total (HR de 1,89 P= 1,2 x 10-5) (Tabla 21 - S12). Los parámetros histopatológicos no se asociaron más a la supervivencia libre de enfermedad y total en pacientes con densidades altas o bajas coordinadas de los marcadores inmunes en las dos regiones del tumor (HiHi frente a LoLo) (Tablas 20 y 21 - S11 y S12).

Además, tal y como se muestra en las figuras 11 y 12, el método de pronóstico in vitro según la invención puede llevarse a cabo de forma exitosa para el pronóstico de varios tipos de cánceres, tal y como se ilustra por la predicción del resultado de cánceres de colon y recto.

También de forma adicional, tal y como se ilustra en la Figura 13, se ha probado que el método de pronóstico in vitro según la invención es altamente fiable para el pronóstico del resultado de cánceres en pacientes que padecen cánceres en un estadio temprano.

También de forma adicional, tal y como ilustra en la Figura 14, se ha mostrado que el método de pronóstico in vitro según la invención permite un pronóstico exacto del resultado de cánceres, utilizando, como el uno o más marcadores biológicos, una combinación o un conjunto de seis marcadores biológicos, concretamente PDCD1LG1, VEGF, TNFRSF6B, IRF1, IL8RA y SELL, que se cuantificaron mediante un método de análisis de la expresión génica, de forma más precisa, análisis por PCR en tiempo real.

En resumen, los resultados presentados en el Ejemplo 5 muestran que una vez que los c R c humanos se vuelven detectables clínicamente, la respuesta inmune adaptativa juega un papel en la prevención de la recurrencia del tumor.

Se descubrió una correlación positiva entre la presencia de marcadores para la polarización de TH1, células T citotóxicas y de memoria y una incidencia baja de la recurrencia del tumor.

De este modo, en la presente memoria se encontró que el tipo, la densidad, y la localización de las células inmunes en los CRC tenía un valor de pronóstico que era superior e independiente a los de la clasificación de UICC-TNM (L. Sobin et al., 2002, TNMclassification of malignant tumors. 6a, ed., Wiley-Liss, Nueva York). Estos resultados muestran que el tiempo hasta la recurrencia y el tiempo de supervivencia total están gobernados principalmente por el estado de la respuesta inmune adaptativa local.

La nueva herramienta inmunológica proporcionada por la presente invención puede dar lugar a la revisión de los indicadores actuales del resultado clínico y puede ayudar a identificar a los pacientes con riesgo alto que son los que más se podrían beneficiar de la terapia adyuvante.

RC; colon derecho, TC: colon transverso, LC: colon izquierdo, SC: colon sigmoide, R: recto VE: embolia vascular, LI: invasión linfática, PI: invasión perineural

* valor P ensayo de rango logarítmico

Tabla 2: lista de genes

Tabla 3: lista de anticuerpos

Tabla 4: análisis de correlación

Genes Correlación IC 95 % valor P CD8A- TBX21 0,902 (0,848 / 0,938) <0,0001 CD3Z - CD8A 0,797 (0,694 / 0,868) <0,0001 CD3Z- TBX21 0,784 (0,676 / 0,859) <0,0001 B7H3- TGFB1 0,760 (0,643 / 0,843) <0,0001 IFNG - TBX21 0,759 (0,635 / 0,844) <0,0001 CD4 - CD8A 0,738 (0,612 / 0,828) <0,0001 CD8A - IFNG 0,728 (0,592 / 0,823) <0,0001 CD4 - TBX21 0,727 (0,597 / 0,820) <0,0001 CD3Z - CD4 0,719 (0,586 / 0,815) <0,0001 CD4 - TGFB1 0,678 (0,531 / 0,786) <0,0001 CD8A- GNLY 0,671 (0,522 / 0,781) <0,0001 IFNG - IRF1 0,664 (0,505 / 0,779) <0,0001 GNLY - IFNG 0,663 (0,505 / 0,779) <0,0001 IRF1 - TBX21 0,656 (0,502 / 0,770) <0,0001 IL8 - PTGS2 0,643 (0,485 / 0,761) <0,0001 GNLY- TBX21 0,627 (0,464 / 0,749) <0,0001 CD3Z - IRF1 0,617 (0,451 / 0,742) <0,0001 CD8A - IRF1 0,617 (0,451 / 0,742) <0,0001 CD3Z - GNLY 0,613 (0,446 / 0,739) <0,0001 CD3Z - IFNG 0,605 (0,428 / 0,737) <0,0001 GZMB - IFNG 0,604 (0,422 / 0,739) <0,0001 GNLY - IRF1 0,597 (0,425 / 0,727) <0,0001 IL10 - TGFB1 0,596 (0,424 / 0,726) <0,0001 CD8A - IL10 0,586 (0,411 / 0,719) <0,0001 CD4 - IL10 0,583 (0,408 / 0,717) <0,0001 CD8A- GZMB 0,574 (0,392 / 0,713) <0,0001 GZMB - TBX21 0,548 (0,359 / 0,693) <0,0001 CD3Z - GZMB 0,538 (0,347 / 0,687) <0,0001 CD4 - IRF1 0,520 (0,330 / 0,670) <0,0001 GNLY- GZMB 0,520 (0,324 / 0,673) <0,0001 B7H3 - IL10 0,517 (0,326 / 0,668) <0,0001 C D 4- GZMB 0,507 (0,309 / 0,663) <0,0001 GZMB - IRF1 0,504 (0,305 / 0,661) <0,0001 IL10 - TBX21 0,494 (0,297 / 0,650) <0,0001 CD4 - IFNG 0,493 (0,289 / 0,655) <0,0001 B7H3 - CD4 0,475 (0,275 / 0,636) <0,0001 CD8A - TGFB1 0,466 (0,264/ 0,628) <0,0001 CD3Z - IL10 0,459 (0,255 / 0,623) <0,0001 CD4 - GNLY 0,454 (0,250 / 0,619) <0,0001 TBX21 - TGFB1 0,433 (0,226 / 0,603) 0,0001 GNLY - IL10 0,413 (0,202/ 0,587) 0,0002 CD3Z - TGFB1 0,398 (0,185 / 0,575) 0,0004 IFNG - IL10 0,390 (0,168 / 0,575) 0,0009 B7H3 - VEGF 0,371 (0,155 / 0,554) 0,0011 Tabla 4: análisis de correlación

Genes Correlación IC 95 % valor P B7H3 - IL8 0,370 (0,152 / 0,553) 0,0012 CEACAM1 - IRF1 0,359 (0,140 / 0,544) 0,0017 IL10 - IRF1 0,355 (0,136 / 0,541) 0,0019 IRF1 - VEGF 0,351 (0,131 / 0,538) 0,0022 B7H3 - MMP7 0,335 (0,112 / 0,526) 0,0038 B7H3- PTGS2 0,333 (0,112 / 0,523) 0,0037 IRF1 - TGFB1 0,333 (0,111 / 0,523) 0,0038 IL10 - PTGS2 0,325 (0,103 / 0,517) 0,0047 GZMB - IL10 0,320 (0,092 / 0,517) 0,0066 CD4 - VEGF 0,316 (0,093 / 0,509) 0,0062 GZMB - TGFB1 0,306 (0,076 / 0,504) 0,0097 IL8 - MMP7 0,295 (0,068 / 0,493) 0,0116 TBX21 - VEGF 0,294 (0,069 / 0,491) 0,0113 CEACAM1- VEGF 0,292 (0,066 / 0,489) 0,0119 TGFB1 - VEGF 0,290 (0,065 / 0,488) 0,0124 BIRC5 - IRF1 0,265 (0,037 / 0,466) 0,0234 GNLY - TGFB1 0,257 (0,029 / 0,460) 0,0278 PTGS2- TGFB1 0,257 (0,028 / 0,459) 0,0281 MMP7 - VEGF 0,251 (0,020 / 0,456) 0,0332 IFNG - TGFB1 0,239 (0,001 / 0,452) 0,0492 IRF1 - TNFRSF10A 0,238 (0,009 / 0,444) 0,042 BIRC5 - PTGS2 0,224 (-0,007 / 0,431) 0,0571 IL8 - TGFB1 0,223 (-0,007 / 0,431) 0,0578 B7H3 - IRF1 0,222 (-0,009 / 0,430) 0,059 MMP7 - TGFB1 0,221 (-0,012 / 0,430) 0,0622 B7H3 - CD8A 0,216 (-0,015 / 0,425) 0,0664 GZMB - VEGF 0,209 (-0,028 / 0,423) 0,0829 CD3Z - VEGF 0,207 (-0,024 / 0,418) 0,0784 IFNG - IL8 0,206 (-0,034 / 0,424) 0,0922 CD3Z - CEACAM1 0,204 (-0,027 / 0,415) 0,0836 CD8A - VEGF 0,203 (-0,028 / 0,414) 0,0846 IL10 - IL8 0,196 (-0,036 / 0,408) 0,0967 BIRC5 - IFNG 0,195 (-0,045 / 0,414) 0,111 GZMB - IL8 0,194 (-0,043 / 0,410) 0,1087 B7H3 - TBX21 0,191 (-0,041 / 0,403) 0,1056 B7H3 - CD3Z 0,188 (-0,044 / 0,401) 0,1109 CD4 - MMP7 0,181 (-0,052 / 0,397) 0,1274 CEACAM1- TBX21 0,174 (-0,059 / 0,388) 0,1416 GNLY- PTGS2 0,173 (-0,059 / 0,388) 0,1435 MMP7 - PTGS2 0,162 (-0,073 / 0,379) 0,1748 BIRC5 - GZMB 0,161 (-0,077 / 0,381) 0,1842 B7H3 - GZMB 0,160 (-0,078 / 0,381) 0,1862 CD4 - TNFRSF10A 0,160 (-0,072 / 0,377) 0,176 IFNG - TNFRSF10A 0,156 (-0,086 / 0,380) 0,2048 Tabla 4: análisis de correlación

Genes Correlación IC 95 % valor P GNLY - TNFRSF10A 0,153 (-0,079 / 0,370) 0,1957 TBX21 - TNFRSF10A 0,147 (-0,086 / 0,365) 0,2157 BIRC5 - IL8 0,145 (-0,088 / 0,363) 0,2225 TNFRSF10A - VEGF 0,136 (-0,097 / 0,355) 0,2518 B7H3- TNFRSF10A 0,135 (-0,098 / 0,355) 0,2541 CD8A- TNFRSF10A 0,134 (-0,099 / 0,354) 0,2577 GZMB - PTGS2 0,134 (-0,104 / 0,358) 0,2702 CEACAM1- TNFRSF10A 0,133 (-0,100 / 0,352) 0,2641 B7H3 - IFNG 0,126 (-0,116 / 0,353) 0,3088 IFNG - VEGF 0,123 (-0,119 / 0,351) 0,3177 CD3Z- TNFRSF10A 0,117 (-0,117 / 0,338) 0,3269 BIRC5 - CEACAM1 0,109 (-0,124 / 0,331) 0,3597 GNLY - IL8 0,106 (-0,128 / 0,328) 0,3754 IFNG - PTGS2 0,106 (-0,136 / 0,336) 0,3903 GZMB - TNFRSF10A 0,104 (-0,135 / 0,331) 0,3942 CEACAM1 - IFNG 0,093 (-0,148 / 0,325) 0,4506 B7H3 - GNLY 0,090 (-0,143 / 0,313) 0,4514 BIRC5 - GNLY 0,088 (-0,145 / 0,311) 0,4628 CEACAM1- GZMB 0,087 (-0,151 / 0,316) 0,4736 CEACAM1- GNLY 0,082 (-0,151 / 0,306) 0,4911 IL10 - MMP7 0,081 (-0,153 / 0,307) 0,499 IL8 - VEGF 0,078 (-0,155 / 0,303) 0,5132 BIRC5 - MMP7 0,077 (-0,157 / 0,304) 0,5192 CD8A- CEACAM1 0,076 (-0,157 / 0,801) 0,5232 TGFB1 - TNFRSF10A 0,071 (-0,162 / 0,296) 0,5538 BIRC5 - VEGF 0,065 (-0,168 / 0,291) 0,5855 IRF1 - PTGS2 0,064 (-0,169 / 0,289) 0,594 IRF1 - MMP7 0,063 (-0,171 / 0,290) 0,6012 PTGS2 - VEGF 0,063 (-0,170 / 0,289) 0,5995 CEACAM1 - MMP7 0,035 (-0,199 / 0,264) 0,7742 IL10 - TNFRSF10A 0,032 (-0,199 / 0,261) 0,786 IL8 - IRF1 0,021 (-0,211 / 0,249) 0,8633 C D 4- CEACAM1 0,014 (-0,217 / 0,243) 0,9088 BIRC5 - TBX21 0,013 (-0,218 / 0,242) 0,9124 IFNG - MMP7 0,009 (-0,231 / 0,249) 0,9402 CD3Z - MMP7 0,005 (-0,227 / 0,236) 0,968 CEACAM1- PTGS2 -0,001 (-0,231 / 0,229) 0,9923 IL10 - VEGF -0,004 (-0,234 / 0,226) 0,9721 CD8A- PTGS2 -0,008 (-0,238 / 0,222) 0,9448 GZMB - MMP7 -0,008 (-0,244 / 0,229) 0,947 IL8 - TNFRSF10A -0,017 (-0,246 / 0,214) 0,8892 GNLY- VEGF -0,023 (-0,252 / 0,208) 0,8484 PTGS2 - TBX21 -0,036 (-0,264 / 0,196) 0,7631 MMP7 - TBX21 -0,049 (-0,277 / 0,185) 0,6844 Tabla 4: análisis de correlación

Genes Correlación IC 95 % valor P BIRC5 - CD8A -0,051 (-0,278 / 0,181) 0,6675 CD3Z- PTGS2 -0,051 (-0,278 / 0,181) 0,6683 BIRC5 - CD3Z -0,054 (-0,280 / 0,179) 0,6528 B7H3- CEACAM1 -0,063 (-0,289 / 0,169) 0,5972 PTGS2- TNFRSF10A -0,066 (-0,292 / 0,166) 0,5782 CD8A - MMP7 -0,086 (-0,311 / 0,149) 0,4739 B7H3 - BIRC5 -0,095 (-0,318 / 0,138) 0,4236 CD4 - IL8 -0,101 (-0,323 / 0,133) 0,3987 CEACAM1 - IL8 -0,101 (-0,323 / 0,132) 0,3979 CD4 - PTGS2 -0,111 (-0,333 / 0,122) 0,3494 CEACAM1 - IL10 -0,111 (-0,333 / 0,122) 0,3495 IL8 - TBX21 -0,131 (-0,350 / 0,102) 0,2714 BIRC5 - IL10 -0,134 (-0,353 / 0,099) 0,2583 CD8A - IL8 -0,163 (-0,378 / 0,070) 0,1701 MMP7 - TNFRSF10A -0,217 (-0,427 / 0,015) 0,0668 BIRC5 - TGFB1 -0,218 (-0,426 / 0,013) 0,0643 BIRC5 - CD4 -0,231 (-0,438 / -0,001) 0,0489 CEACAM1- TGFB1 -0,239 (-0,445 / -0,010) 0,0413 GNLY - MMP7 -0,241 (-0,448 / -0,010) 0,0408 BIRC5 - TNFRSF10A -0,243 (-0,448 / -0,014) 0,0378 CD3Z - IL8 -0,258 (-0,461 / -0,030) 0,0272

Tabla 5

Tabla 6 Tabla 7: análisis de riesgo proporcional multifactorial para DFS

Variable* Relación de riesgo IC 95% P Estadio T 1,780 (1,348-2,362) 5,2 E-05 Estadio N 2,130 (1,481-3,060) 4,5 E-05 Diferenciación 1,110 (0,777-1,584) 5,7 E-01 Patrones CD3ct/CD3im 0,570 (0,450-0,721) 2,8 E-06

Variable* Relación de riesgo IC 95% P Estadio T 1,700 (1,275-2,268) 3,1 E-04 Estadio N 2,117 (1,449-3,093) 1,1 E-04 Diferenciación 0,969 (0,676-1,389) 8,6 E-01 Patrones CD8ct/CD8im 0,614 (0,480-0,786) 1,1 E-04

Variable* Relación de riesgo IC 95% P Estadio T 1,880 (1,441-2,452) 3,3 E-06 Estadio N 2,298 (1,599-3,301) 6,8 E-06 Diferenciación 1,035 (0,736-1,457) 8,4 E-01 Patrones CD45ROct/CD45ROim 0,564 (0,439-0,723) 6,2 E-06

Variable* Relación de riesgo 95% CI P Estadio T 1,777 (1,334-2,37) 8,5 E-05 Estadio N 2,449 (1,651- 3,63) 8,3 E-06 Diferenciación 1,049 (0,707-1,56) 8,1 E-01 Patrones GZMBct/GZMBim 0,591 (0,459-0,76) 4,3 E-05 *M estratificado

Variable Relación de riesgo 95% CI P Estadio T 1,335 (1,052-1,693) 1,7 E-02 Estadio N 1,657 (2,989-6,595) 3,6 E-03 Estadio M 4,440 (1,179-2,328) 1,5 E-13 Diferenciación 1,058 (0,748-1,496) 7,5 E-01 Patrones CD3ct/CD3im 0,726 (0,587-0,897) 3,0 E-03

Variable Relación de riesgo 95% CI P Estadio T 1,376 (1,070-1,769) 1,3 E-02 Estadio N 1,575 (1,100-2,254) 1,3 E-02 Estadio M 4,467 (2,966-6,729) 8,0 E-13 Diferenciación 0,966 (0,679-1,375) 8,5 E-01 Patrones CD8ct/CD8im 0,712 (0,571-0,888) 2,5 E-03 Tabla 7: análisis de riesgo proporcional multifactorial para DFS

Variable Razón de riesgo 95% CI P Estadio T 1,396 (1,114-1,750) 3,7 E-03 Estadio N 1,684 (1,204-2,355) 2,3 E-03 Estadio M 4,160 (2,805-6,170) 1,4 E-12 Diferenciación 0,935 (0,677-1,292) 6,9 E-01 Patrones CD45ROct/CD45ROim 0,703 (0,558-0,885) 2,8 E-03

Variable Razón de riesgo 95% CI P Estadio T 1,360 (1,071-1,73) 1,2 E-02 Estadio N 1,710 (1,188-2,46) 3,9 E-03 Estadio M 4,392 (2,866-6,73) 1,1 E-11 Diferenciación 1,094 (0,752-1,59) 6,4 E-01 Patrones GZMBct/GZMBim 0,905 (0,722-1,14) 3,9 E-01

Tabla 9

Tabla 9 (Continuación 1)

Tabla 9 (Continuación 2)

Tabla 9 (Continuación 3)

Tabla 9 (Continuación 4)

Tabla 9 (Continuación 5)

Tabla 9 (Continuación 6)

Tabla 9 (Continuación 7)

Tabla 9 (Continuación 8)

Tabla 9 (Continuación 9)

Tabla 9 (Continuación 10)

Tabla 9 (Continuación 11)

Tabla 9 (Continuación 12)

Tabla 9 (Continuación 13)

Tabla 9 (Continuación 14)

Tabla 9 (Continuación 15)

Tabla 9 (Continuación 16)

Tabla 9 (Continuación 17)

Tabla 9 (Continuación 18)

Tabla 9 (Continuación 19)

Tabla 10

Tabla 10 (Continuación 1)

Tabla 10 (Continuación 2)

t El estadio se determinó por examen patológico. T1 tumor que invade la submucosa, T2 tumor que invade la muscularis propia, T3 tumor que penetra en la muscularis propia e invade la subserosa, y T4 tumor que invade otros órganos o estructuras o que perfora el peritoneo visceral.

X No fue posible determinar el estado ganglionar de dos pacientes.

* Valor P de rango logarítmico corregido (Altman et al. 1994), valor P mediano 100*CV rango logarítmico a Valor P mediana 100*CV rango logarítmico estratificado

NR: No alcanzado, Het: Hi/Lo y Lo/Hi

* V a lo r P de rango lo ga rítm ico , v a lo r P m ed ia no 100*C V rango lo ga rítm ico

a V a lo r P m e d ia n a 100*C V rango lo g a rítm ico es tra tif ica d o

NR : No a lca n za d o , H et: H i/Lo y Lo /H i

* V a lo r P de rango lo ga rítm ico pa ra m e d ia n a de pu n to de co rte

NR : No a lcan zado , Het: H i/Lo y Lo /H i

* V a lo r P de rango lo g a rítm ico pa ra m e d ia n a de pu n to de co rte

NR : No a lcan zado , Het: H i/Lo y Lo /H i

a Valor P mediana 100*CV rango logarítmico estratificado

NR: No alcanzado, Het: Hi/Lo y Lo/Hi

* Valor P de rango logarítmico, valor P mediano 100*CV rango logarítmico

a Valor P mediana 100*CV rango logarítmico estratificado

NR: No alcanzado, Het: Hi/Lo y Lo/Hi

* V a lo r P de rango lo ga rítm ico pa ra m e d ia n a de pu n to de co rte

NR : No a lcan zado , Het: H i/Lo y Lo /H i

* V a lo r P de rango lo ga rítm ico pa ra m e d ia n a de pu n to de co rte

NR : No a lcan zado , Het: H i/Lo y Lo /H i

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para el pronóstico de pacientes para la progresión de un cáncer, método que comprende las etapas siguientes:

a) cuantificar, en una muestra de tejido tumoral de dicho paciente, al menos dos marcadores biológicos indicativos del estado de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente frente al cáncer; y

b) comparar el valor obtenido en la etapa a) para dichos al menos dos marcadores biológicos con un valor de referencia predeterminado para los mismos marcadores biológicos; valor de referencia predeterminado que se correlaciona con un pronóstico específico de progresión de dicho cáncer,

en donde dichos al menos dos marcadores biológicos comprenden PDCD1LG1 y CXCL9.

2. El método in vitro según la reivindicación 1, en donde dicha muestra de tejido tumoral se selecciona del grupo que consiste en (i) un tumor primario global, (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente el tumor, tejido que puede denominarse más específicamente el “margen invasivo” del tumor, (iv) los ganglios linfáticos localizados muy cerca del tumor, (v) una biopsia tumoral realizada antes de la cirugía y (vi) una metástasis distante.

3. El método in vitro según la reivindicación 1, en donde la etapa a) consiste en cuantificar dichos al menos dos marcadores biológicos por análisis de la expresión génica en una muestra de tejido tumoral total.

4. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer adrenocortical, cáncer anal, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro y sistema nervioso central, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer laríngeo e hipofaríngeo, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de seno de la cavidad nasal y paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salivar, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer tiroideo, cáncer vaginal, cáncer vulvar, y cáncer uterino.

5. El método in vitro según la reivindicación 4 en donde el cáncer es cáncer colorrectal.