CN111458509B

CN111458509B - 肝细胞癌预后评估的生物标志物及其试剂盒和方法

Info

Publication number: CN111458509B
Application number: CN202010291990.4A
Authority: CN
Inventors: 王红阳; 陈磊; 李祉萱; 郑博
Original assignee: Third Affiliated Hospital Of Chinese People's Liberation Army Naval Medical University
Current assignee: Third Affiliated Hospital Of Chinese People's Liberation Army Naval Medical University
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111458509A

Abstract

本发明公开了一种肝细胞癌预后评估的生物标志物及其试剂盒和方法。所述生物标志物为肿瘤旁组织中的CD8⁺PD‑1⁺CD161⁺T细胞或肿瘤组织中的CD8⁺PD‑1⁺CD161^‑T细胞。所述肝细胞癌预后评估试剂盒含有CD8⁺PD‑1⁺CD161⁺T细胞和/或CD8⁺PD‑1⁺CD161^‑T细胞的检测相关试剂。所述肝细胞癌预后评估的方法包括以下步骤：1)获取HCC患者肿瘤组织和/或肿瘤旁组织；2)检测出所述肿瘤旁组织中CD8⁺PD‑1⁺CD161⁺T细胞在所有T细胞中的占比和/或所述肿瘤组织中的CD8⁺PD‑1⁺CD161^‑T细胞在所有T细胞中的占比；3)得到的结果与设定的占比临界值进行对比；肿瘤旁组织中CD8⁺PD‑1⁺CD161⁺T细胞的占比越高，患者的预后评估越好，预测生存期和无复发生存期越长；肿瘤组织中CD8⁺PD‑1⁺CD161^‑T细胞的占比越高，患者的预后评估越差，预测生存期和无复发生存期越短。

Description

肝细胞癌预后评估的生物标志物及其试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种肝细胞癌预后评估的生物标志物、试剂盒及方法。

背景技术

肝细胞癌是最常见的原发性肝癌之一，在全世界癌症相关死亡中位居第四位。对于晚期患者，手术切除不能完全治愈该疾病。通常需要将放疗法、化学疗法、激素疗法和靶向疗法相结合。随着免疫疗法研究的迅速发展，免疫疗法有望可以给予晚期肝细胞癌患者更显著的疗效。尽管有些患者可以从抗PD-1治疗中受益，但没有迹象表明这些疗法可以明显改善预后。因此，迫切需要更深入地了解肝癌的免疫环境和免疫细胞的功能状态来评估患者的预后状况。

以前的研究观察到肝细胞癌中CD8⁺PD-1⁺ T细胞的富集具有较差的临床转归，但仍缺乏对CD8⁺PD-1⁺ T细胞内异质性亚群的深入表型区分。PD-1是活化T细胞上的抑制性受体，是重要的免疫检查点治疗靶标，在癌症免疫治疗中用于活化细胞毒性T细胞。但是仅PD-1的表达并不能决定T细胞的耗竭状态，其中不同的亚群具有不同的分布模式、表型和功能。因此，对CD8⁺PD-1⁺ T细胞亚群的深入研究将有助于肿瘤免疫治疗的进一步发展。

发明内容

为了探讨CD8⁺PD-1⁺ T细胞的潜在作用，本发明人将CD8⁺PD-1⁺ T细胞进一步细分为表达CD8和PD-1分子但是不表达CD161分子的T淋巴细胞亚群CD8⁺PD-1⁺CD161^- T和表达CD8、PD-1和CD161分子的T淋巴细胞亚群CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T，发现了它们在肝细胞癌中的独特分布，并在此基础上提供了评估HCC预后的标志物、试剂盒及方法。

本发明的第一个方面，提供了一种肝细胞癌预后评估的生物标志物，该标志物为肿瘤旁组织中的CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞或肿瘤组织中的CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞；优选地，所述肿瘤组织为肿瘤核心区域的组织，所述肿瘤旁组织为距肿瘤与非肿瘤交界处大于0.6cm的非肿瘤组织。

进一步，肿瘤旁组织中的CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞量与肝细胞癌的预后良好成正相关，肿瘤组织中的CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞量与肝细胞癌的预后良好成负相关。

优选地，所述预后包括检测、疗效评估、复发监控。

本发明第二个方面，提供了所述肝细胞癌预后评估的生物标志物在制备评估肝细胞癌预后的试剂或试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供了一种肝细胞癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包括CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和/或CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的检测相关试剂。

优选地，所述肝细胞癌预后评估试剂盒以肝细胞癌患者肿瘤旁组织中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞在所有T细胞中的占比和/或肿瘤组织中CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞在所有T细胞中的占比为评估标准。

优选地，所述肝细胞癌预后评估试剂盒还包括肝细胞癌患者肿瘤旁组织中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞在所有T细胞中的占比的临界值和/或肿瘤组织中CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞在所有T细胞中的占比的临界值。

优选地，所述肝细胞癌预后评估试剂盒包括染色液、缓冲液。

优选地，所述肝细胞癌预后评估试剂盒包括CD8抗体、PD-1抗体和CD161抗体以及染色剂。

优选地，所述肝细胞癌预后评估试剂盒包括免疫组化试剂，特别优选为多重免疫组化试剂。

本发明的第三个方面，提供了一种肝细胞癌预后评估的方法，包括以下步骤：

1)获取HCC患者肿瘤组织和/或肿瘤旁组织；

2)检测出所述肿瘤旁组织中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞在所有T细胞中的占比和/或所述肿瘤组织中的CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞在所有T细胞中的占比；

3)将步骤2)得到的结果与设定的占比临界值进行对比，对比结果用于评估患者的预后情况。

优选地，所述肿瘤组织为肿瘤核心区域的组织，肿瘤旁组织为距肿瘤与非肿瘤交界处大于0.6cm的非肿瘤组织。

进一步，肿瘤旁组织中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞的占比越高，患者的预后评估越好，预测生存期和无复发生存期越长。

优选地，步骤3)中肿瘤旁组织中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞的临界值可设定为5-10％，高于临界值患者预后评估为好，否则预后评估较差。

进一步，肿瘤组织中CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的占比越高，患者的预后评估越差，预测生存期和无复发生存期越短。

优选地，步骤3)中肿瘤组织中CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的临界值可设定为15-20％，高于临界值患者预后评估为差，否则预后评估较好。

本发明首先发现了HCC患者的肿瘤与肿瘤旁组织存在CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的差异性富集，并发现了不同区域的两类细胞细占比与HCC预后情况的相关性，CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T在肿瘤旁组织中的富集表明临床预后较好，而CD8⁺PD-1⁺CD161^- T在肿瘤组织中的富集表明临床预后较差。从而提供了一种新的评估HCC预后的有效方法、试剂盒和标志物，对HCC及肿瘤的研究以及肿瘤病人的治疗具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是从样本中分离白细胞进行CyTOF分析的工作流程图：提取手术切除的样品中的免疫细胞，用金属标记的抗体处理，然后用飞行时间质谱细胞仪检测；降维后获得的数据可视化，通过手动门控策略和聚类算法识别细胞簇；

图2是T细胞的tSNE图，显示通过Rphenograph聚类方法在T细胞中鉴定出的30个簇；

图3是T细胞的tSNE图，显示了已识别的经典T细胞亚群；

图4是T细胞的簇和表型热图，显示了30个T细胞簇35个分子的表达情况，从左往右数，第1列表示T细胞簇的富集情况，第2至36列表示分子表达强度，第37列表示CD4和CD8的表达情况(其中Dp为双阳性、Dn为双阴性)，第38列表示已知的经典亚型分类；

图5显示了T区和N区中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的差异性富集情况；

图6显示了CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞(T11和T13)和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞(T04、T15和T20)的35个分子表达谱差异；

图7显示了CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞(T11和T13)和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞(T04、T15和T20)的分化轨迹差异；

图8是多重免疫荧光在组织原位染色的照片，显示了CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的分布状况；

图9是CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞在T/N区与总生存期(OS)/无复发生存期(RFS)之间相关性的Kaplan-Meier分析图；

图10是CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞在T/N区与总生存期(OS)/无复发生存期(RFS)之间相关性的Kaplan-Meier分析图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

实施例1样本处理和白细胞分离

1、样本的处理

肝脏和肿瘤组织取自东方肝胆外科医院的15例HCC患者，这些患者接受了HCC根治性手术切除。如图1所示，将每份肝癌样本分为两种：来自肿瘤核心区域的肿瘤组织(T，tumor core)和肿瘤旁组织(N，non-tumor region)，其中，肿瘤旁组织(N)是指距肿瘤与非肿瘤交界处大于0.6cm的非肿瘤组织。所有样本都按照当地的道德准则进行了匿名编码。

2、从组织中分离白细胞

从新鲜的上述两种样本中分离出白细胞从而获得15组肿瘤浸润白细胞(TIL)和对应的肿瘤旁浸润白细胞(NIL)。

具体步骤为：切碎用HBSS洗涤的组织，并用消化酶消化，在37℃振荡60分钟，然后通过300目滤网过滤，将过滤后的混合物收集在50mL离心管中，用450g离心8分钟，然后将沉淀物用HBSS重悬后用50g离心一分钟；将澄清的上清液小心地叠加在淋巴液的表面，然后用450g离心25分钟；离心后，白细胞浓缩在混合液的中间层。其中，消化酶由胶原酶IV、I型脱氧核糖核酸酶和V型透明质酸酶组成，溶于含10％血清的RPMI中。

实施例2肝细胞癌的免疫微环境空间异质性分析

对15组白细胞进行CyTOF分析，步骤概括如下：洗涤白细胞并染色，用10mM的顺铂染色2分钟以鉴定细胞的存活/死亡，用金属结合的表面膜抗体(由35个表面标记物组成的以免疫细胞为中心的抗体板)在37℃孵育30分钟；之后，用固定浸透缓冲液(fix permbuffer)固定；最后，加入细胞插层(固定浸透缓冲液和铱的混合物)以进行细胞固定和可视化，该过程持续一整夜，然后在Helios质谱仪(Fludigm，美国)上进行分析。

根据制造商的说明，使用了EQ四元素校准珠以对信号进行归一化。每个样本收集了250,000～500,000个细胞事件。文件(.fcs)已上传到Cytobank，手动设置了感兴趣的种群，并将感兴趣的事件以.fcs文件形式导出。为了进一步分析，使用R软件包上的cytokit程序从每个fcs文件中随机抽取了5000个细胞样本。然后，在这些细胞上执行了基于tSNE的可视化和基于RPhenograph算法的聚类，CyTOF分析流程如图1所示。

本实施例从近20,000,000个白细胞(每个样品平均约450,000个细胞)中收集了高维度单细胞蛋白质组学概况。免疫谱系的分布可视化tSNE图如图2和图3所示：我们可视化并分析了T细胞亚群。通过应用RPhenograph算法，可以将T细胞划分为30个簇(cluster)T01-T30(图2)。然后，我们首先将30个簇按经典的T亚型分为10类，发现了不同亚群的空间分布差异(图3)。在30个T细胞簇中，T08、T10、T20和T28主要在T区富集，而T02、T07、T13、T14、T16、T18、T21和T26在N区富集(图4)。HCC中，T细胞数量从N区到T区逐渐减少，此外，在来自不同区域的不同免疫细胞谱系中观察到了表面标志物(PD-1、ICOS、CTLA-4、OX40、CD161、CD25、CD127)的多样化表达模式(图4)。我们发现并非所有PD-1⁺ T细胞都在T区富集，具有CD161表达的T13甚至显示出相反的趋势。这些结果表明，HCC的免疫微环境在空间上是异质性的。

实施例3CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞分布特征和表型差异

在30个T细胞簇中T04、T11、T13、T15、T20为CD8⁺PD-1⁺ T细胞，为了深入探索其亚群组成，我们进一步将CD8⁺PD-1⁺ T划分为CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞，并统计了两种细胞分别在肿瘤组织和肿瘤旁组织中的含量。图5显示了T区和N区中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的差异性富集情况。从图中可以看出，在15例HCC患者中，CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞在T区和N区中占T细胞的比例具有显著差异，其主要富集在肿瘤旁组织中，而CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞在T区和N区中占CD8⁺ T细胞的比例具有显著差异，其主要富集在肿瘤组织中。

为了完全识别CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞(T11和T13)和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞(T04、T15和T20)的表型特征，我们绘制了两类细胞35个分子的表达差异比较图(图6)和分化轨迹图(图7)。从图6中可以看出，T15的CD57表达急剧增加，这是终末分化的不可逆标记，表明其是“年迈”的T细胞子集；ICOS的较高表达水平表明T20被PI3K信号激活，然后通过PD-1/SHP2或PTEN信号转移至耗竭状态；T11中IL-7R和CD28的最高表达表明其潜在的增殖和免疫活性。值得强调的是，T20拥有最高水平的PD-1；总的来说，CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞(T15和T20，T04除外)的PD-1表达水平高于CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞(T11和T13)。此外，扩散图(图7)进一步暗示了CD8⁺PD-1⁺ T细胞的两个命运：它们都是从T04簇产生的，一个是T04-T13-T11轨迹(CD8⁺PD-1⁺CD161⁺，具有增殖和活动表型)，另一个是T04-T15-T20轨迹(CD8⁺PD-1⁺CD161^-，具有逐渐衰竭和较老的表型)。这些数据表明，只有PD-1表达不能确定CD8⁺ T细胞的功能状态，而CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞相对于CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞具有更强的免疫活性。

实施例4CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的预后价值

为了检查CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞的潜在预后价值，本实施例使用了由28例来自东方肝胆外科医院的HCC患者的匹配的T和N样本组成的组织微阵列进行多重免疫组化分析(图8)。

本实施例使用了Opal^TM 7 Immunology Discovery Kit试剂盒(Perkin-Elmer)对石蜡组织切片进行多标免疫荧光染色。具体步骤如下：

(1)去石蜡：在干燥的烤箱中于55-60℃加热载玻片加热四小时，其位置应允许排出熔化的石蜡。用二甲苯洗涤玻片10分钟，共3次。通过乙醇梯度水合，最后用蒸馏水洗涤。

(2)切片固定：在10％中性福尔马林缓冲液中固定组织20分钟，然后用蒸馏水洗涤。

(3)3种抗体标记的多重染色：

循环一：

C1.1：抗原修复/微波法。用AR9试剂冲洗切片。将切片放入Opal切片处理罐中浸满AR9试剂到顶部。在先前确定的最佳条件下执行微波处理，随后让切片在工作台上冷却至少15分钟至室温。

C1.2：封闭。用TBST冲洗幻灯片。用疏水性笔将要染色的组织区域圈起来。在室温(RT)下用抗体稀释液孵育组织10分钟。

C1.3：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的CD8抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。

C1.4：二抗孵育。将Opal多聚物HRP二抗溶液加入组织并在室温下孵育10分钟。用1X TBST洗涤切片3次，每次2分钟。

C1.5：Opal荧光基团孵育。将Opal-520工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。

C1.6：微波处理。用AR9冲洗切片。将切片放入装有AR9的Opal切片处理罐中，溶液装到顶部。使用微波处理，然后让切片冷却15分钟以上至室温。

循环二：

C1.1：封闭。用TBST冲洗幻灯片。用疏水性笔将要染色的组织区域圈起来。在室温(RT)下用抗体稀释液孵育组织10分钟。

C1.2：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的PD-1抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。

C1.3：二抗孵育。将Opal多聚物HRP二抗溶液加入组织并在室温下孵育10分钟。用1X TBST洗涤切片3次，每次2分钟。

C1.4：Opal荧光基团孵育。将Opal-570工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。

C1.5：微波处理。用AR9冲洗切片。将切片放入装有AR9的Opal切片处理罐中，溶液装到顶部。使用微波处理，然后让切片冷却15分钟以上至室温。

循环三：

C1.3：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的CD161抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。

C1.5：Opal荧光基团孵育。将Opal-620工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。

(4)DAPI染色：先用蒸馏水冲洗玻片，再用TBST冲洗。在DAPI溶液中将切片室温孵育5分钟。用TBST将切片洗两分钟，然后用蒸馏水洗两分钟。

(5)封片：用中性树脂作为封片试剂。

多重荧光标记过的切片使用Vectra 3.0Pathology Imaging System Microscope(Perkin-Elmer)进行了扫描(图8)，后续分析在Halo^TM Image Analysis software(indicalabs)平台上进行，使用了Highplex FL模块。计算CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞分别在T区和N区总T细胞中的占比：

CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞数/总T细胞数，以17.35％作为临界值将患者分为CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞高组和CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞低组(图9)；CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞数/总T细胞数，以7.80％作为临界值将患者分为CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞高组和CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞低组(图10)。

从图9中可以看出，T区CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞较多相应的无复发生存率RFS和总生存率OS均较低，而N区则无此差异，且该差异在T区的无复发生存率中具有显著性(HR＝2.60，P＝0.0419)。从图10中可以看出，N区CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞较多相应的无复发生存率RFS和总生存率OS均较高，T区无复发生存率也略高，但该差异只在N区的无复发生存率和总生存率中具有显著性，(HR＝0.30，P＝0.0062)RFS和(HR＝0.30，P＝0.0062)OS。上述生存率分析结果提示CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞和CD8⁺PD^-1⁺CD161⁺ T细胞分别在T区和N区发挥其不同的功能。生存和与复发相关的临床病理变量的单因素分析显示，T区CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞含量和N区CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞含量与患者的预后情况具有相关性，特别是N区CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞含量与患者预后显著相关。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种检测肝细胞癌预后评估生物标志物的试剂在制备评估肝细胞癌预后试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物为肿瘤旁组织中的CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞或肿瘤组织中的CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞，所述应用以肝细胞癌患者肿瘤旁组织中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞在所有T细胞中的占比和/或肿瘤组织中CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞在所有T细胞中的占比为评估标准；所述肿瘤组织为肿瘤核心区域的组织，所述肿瘤旁组织为距肿瘤与非肿瘤交界处大于0.6 cm的非肿瘤组织；肝细胞癌患者肿瘤旁组织中CD8⁺PD-1⁺CD161⁺ T细胞在所有T细胞中的占比的临界值设定为5-10%，肿瘤组织中CD8⁺PD-1⁺CD161^- T细胞在所有T细胞中的占比的临界值设定为15-20%。

2.如权利要求1所述的检测肝细胞癌预后评估生物标志物的试剂在制备评估肝细胞癌预后试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂包括CD8抗体、PD-1抗体和CD161抗体以及染色剂。