KR102427057B1 - 단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102427057B1
KR102427057B1 KR1020200168973A KR20200168973A KR102427057B1 KR 102427057 B1 KR102427057 B1 KR 102427057B1 KR 1020200168973 A KR1020200168973 A KR 1020200168973A KR 20200168973 A KR20200168973 A KR 20200168973A KR 102427057 B1 KR102427057 B1 KR 102427057B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hemangiopericytoma
tumor
monofibroblast
hpc
intracranial
Prior art date
Application number
KR1020200168973A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220079316A (ko
Inventor
이경화
문경섭
Original Assignee
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교산학협력단 filed Critical 전남대학교산학협력단
Priority to KR1020200168973A priority Critical patent/KR102427057B1/ko
Publication of KR20220079316A publication Critical patent/KR20220079316A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102427057B1 publication Critical patent/KR102427057B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G01N2333/96491—Metalloendopeptidases (3.4.24) with definite EC number
    • G01N2333/96494—Matrix metalloproteases, e. g. 3.4.24.7
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

본 발명은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.

Description

단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법{Biomaker for metastasis prediction or prognosis analysis of Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma and diagnosis method using there of}
본 발명은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종에서 WNT5A, MMP9, CLDN5 및 CD34와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후를 분석하는 방법에 관한 것이다.
단일섬유종양/혈관주위세포종은 비교적 드물게 발생하는 뇌종양으로, 재발 및 전이에 대하여 다양한 예후를 보이는 것으로 알려져 있다. 두개내 뇌수막에서 발생하는 단일섬유종양/혈관주위세포종과 두개외 단일섬유종양/혈관주위세포종은 오랫동안 서로 다른 생물학적 속성을 가지는 것으로 여겨왔다.
NAB2-STAT6 융합 유전자의 존재가 알려진 이후로도 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종과 두개외 (특히, 흉막과 폐를 비롯한 다양한 장기에서 발생하는) 단일섬유종양/혈관주위세포종이 동일한 유전자변이를 공유하는 동일 종양으로 분류되었다. 그럼에도 불구하고, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종은 다음과 같은 독특한 생물학적 특징을 나타낸다. 첫번째로, 중요한 진단 마커이자 대표적인 혈관 표지자인 CD34 면역염색에서 국소적이고 약한 면역염색 결과를 나타낸다. 이는 두개외 단일섬유종양/혈관주위세포종이 CD34 면역염색에서 강한 미만성 (Diffuse) 양성반응을 보이는 것과 대조적이다. 두번째로, 두개내에서 발생하는 다른 악성종양은 두개외 원격전이를 보이는 경우가 거의 없는데 반하여, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종은 예외적으로 두개외 원격전이를 나타내는 종양으로 잘 알려져 있다. 이러한 악성의 임상경과를 보이는 경우 수술적 절제, 항암 및 방사선 치료에도 불구하고 사망에 이르는 나쁜 예후를 보이며, 상대적으로 재발이 드물고 양성의 경과를 보이는 두개외 단일섬유종양/혈관주위세포종과 대조적인 경과를 보인다.
따라서, 이러한 악성의 경과를 보이는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종 환자들에게서 두개외 원격전이 및 재발을 진단할 수 있는 분자유전학 기반의 신규 바이오마커의 개발이 중요하다.
본 발명자들은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후를 정확하게 분석할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, WNT5A, MMP9, CLDN5 및 CD34가 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종에서 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.
본 발명자들은 이에 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종과 두개외 전이된 단일섬유종양/혈관주위세포종의 발현된 WNT5A, MMP9, CLDN5 및 CD34의 발현수준 사이에 유의적인 상관관계가 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 양태는 단일섬유종양/혈관주위세포종 (Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma; icSFT/HPC)에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 조성물이다.
본 명세서 상의 용어 "단일섬유종양/혈관주위세포종"은 두개내 뇌수막에서 발생하는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종과 두개외에서 발생하는 두개외 단일섬유종양/혈관주위세포종으로 나눌 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "단일섬유종양"은 두드러진 분지형의 얇은 확장성 사슴뿔 모양의 혈관 구조와 NAB2-STAT6 유전자 재배열을 특징으로 하는 섬유모세포 종양으로 혈관주위세포종이라고도 불린다.
본 명세서 상의 용어 "혈관주위세포종"은 두드러진 분지형의 얇은 확장성 사슴뿔 모양의 혈관 구조와 NAB2-STAT6 유전자 재배열을 특징으로 하는 섬유모세포 종양으로 단일섬유종양이라고도 불린다.
본 명세서 상의 용어 "두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종"은 두개내에서 발생하는 다른 악성종양과 달리 두개외 원격전이를 보이는 종양이다. 이러한 원격전이를 보이는 경우 예후가 좋지 않으며, 두개외 원격전이 한 단일섬유종양/혈관주위세포종은 유전자 발현에 유의적인 상관관계가 있다.
본 명세서 상의 용어 "마커(marker)는 단일섬유종양/혈관주위세포종을 가진 개체를 정상군 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 단일섬유종양/혈관주위세포종을 갖는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함할 수 있고, 예를 들어, 단일섬유종양/혈관주위세포종을 갖는 개체에서 발현이 증가 또는 감소되는 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 마커는 WNT5A (Wingless-related integration site Family Member 5A), MMP9 (Matrix metallopeptidase 9), CLDN5 (Claudin 5) 및 CD34 (Hematopoietic progenitor cell antigen)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 WNT5A 및 MMP9 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 WNT5A 및 MMP9 일 수 있다.
본 발명에 있어서 제제는 항체 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항체 또는 앱타머는 WNT5A, MMP9, CLDN5 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 각각 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미할 수 있으며, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 모두 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항체는 당업계에 널리 공지된 기술에 따라 생산될 수 있으며, 다클론 또는 단클론 항체로 생산될 수 있다. 다클론 항체는 WNT5A, MMP9, CLDN5 또는 CD34을 동물에 주사하고, 동물로부터 채혈한 혈청을 수득하는 공지된 방법에 따라 생산할 수 있다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 방법인 하이브리도마 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, WNT5A에 특이적으로 결합하는 항체는 R&D. Catalogue no. AF645 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, MMP9에 특이적으로 결합하는 항체는 Cell Signaling Technology. Catalogue no. #13667 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, CLDN5에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. Catalogue no. ab131259 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, CD34에 특이적으로 결합하는 항체는 DAKO. Catalogue no. M7165 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, WNT5A에 특이적으로 결합하는 항체는 R&D. Catalogue no. AF645 일 수 있고, MMP9에 특이적으로 결합하는 항체는 Cell Signaling Technology. Catalogue no. #13667 일 수 있고, CLDN5에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. Catalogue no. ab131259 일 수 있고, CD34에 특이적으로 결합하는 항체는 DAKO. Catalogue no. M7165 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, WNT5A에 특이적으로 결합하는 항체는 R&D. Catalogue no. AF645일 수 있고, MMP9에 특이적으로 결합하는 항체는 Cell Signaling Technology. Catalogue no. #13667 일 수 있다.
본 명세서 상의 용어, "앱타머 (aptamer)"는 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기를 갖는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 앱타머는 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자를 검출하거나 이의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명에 있어서 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 단일섬유종양/혈관주위세포종은 간, 척추, 폐, 골반 및 복막으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 전이된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 단일섬유종양/혈관주위세포종에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 키트이다.
본 발명에 있어서 키트는 단일섬유종양/혈관주위세포종에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 조성물을 포함할 수 있고, 이에 따라, 조성물 및 키트 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 있어서 키트는 WNT5A, MMP9, CLDN5 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 검출할 수 있는 것으로, 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA) 키트, 블랏팅 (Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 면역염색키트, 단백질 칩 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지 된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (Peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있다. 발색 기질액은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산 (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenxothiaxoline-6-sulfonic Acid; ABTS)), o-페닐렌디아민 (o-Phenylenediamine; OPD) 또는 테트라메틸 벤지딘 (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; TMB)가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법이다:
단일섬유종양/혈관주위세포종을 포함하는 시료를 준비하는 단계;
상기 단일섬유종양/혈관주위세포종의 WINT5A, MMP, CLDN5 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현수준을 측정하는 측정 단계.
본 발명에 있어서 시료는 단일섬유종양/혈관주위세포종을 보유한 개체 또는 단일섬유종양/혈관주위세포종이 의심되는 개체로부터 수득한 생물학적 시료일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 단일섬유종양/혈관주위세포종의 WINT5A 및 MMP9의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 웨스턴 블랏, 엘라이자 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA), 방사선 면역 분석 (Radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법 (Radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Oucherlony) 면역 확산법, 로케트 (Rocket) 면역 전기영동, 면역 조직 화학 염색, 면역 형광 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (Complement fixation assay), 유세포 분석 (Fluorescence Activated cell sorter; FACS), 앱타머 칩 (Aptamer chip), 마이크로어레이 (Microassay), 단백질 칩 (Protein chip) 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있고, 예를 들어, 면역 조직 화학 염색 또는 면역 형광 염색에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 측정단계는 WNT5A, MMP9, CLDN5 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 각각 결합하는 항체 또는 앱타머를 통해 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 측정단계는 WNT5A 및 MMP9에 각각 결합하는 항체 또는 앱타머를 통해 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 항체 또는 앱타머는 WNT5A, MMP9, CLDN5 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 특이적으로 결합하여 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머 복합체를 형성할 수 있다. 그리고, 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 검출라벨로 사용되는 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노 트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광물은 FITC, RITC, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리간드는 바이오틴 유도체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발광물은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 레독스 분자는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8 , [Os(bpy)3]2+ ,[RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 방사선동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 측정 단계에서 발현수준은 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머의 복합체의 형성량을 측정함으로써 측정될 수 있고, 항원-항체 복합체 측정은 ELISA법을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, ELISA는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA, 간접적 샌드위치 ELISA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종은 간, 척추, 폐, 골반 및 복막으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 전이된 것일 수 있다.
본 발명은 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 전이 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 두개외 단일섬유종양/혈관주위세포종(extracranial Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma; 이하, exSFT/HPC) 및 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종(Intracranial Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma; 이하, icSFT/HPC)의 13 개의 표준 암 경로를 평가하기 위하여 경로 조절 장애 점수 및 글로벌 유의성 통계를 사용하여 분석 결과를 도출한 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 유전자 세트의 WNT 신호 전달 및 초점 접착 경로가 icSFT/HPC에 비해 exSFT/HPC가 유전자 세트 농축 분석 (Gene set enrichment analysis; GSEA)이 더 풍부하다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 위치에 따른 차별적으로 발현된 유전자의 볼케이노 플롯 (Volcano plot)을 보여주는 그래프이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC 및 exSFT/HPC의 차별적인 발현 프로파일을 보여주는 대표적인 유전자의 히트맵이다.
도 1e는 본 발명의 일 실시예에 따른 WNT5A 및 MMP9 발현의 선형 상관 분석을 보여주는 그래프이다.
도 1f는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC에서 WNT5A의 발현 수준이 높고, icSFT/HPC에서 MMP9의 발현 수준이 높음을 보여주는 박스 플롯이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC 및 icSFT/HPC의 발생 부위와 종양 등급에 따른 대표적 진단 표지자인 MMP9, WNT5A, CD34, BCL2, CD99, STAT6의 발현을 나타내는 면역조직화학염색의 결과를 보여주는 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 SFT/HPC의 등급 및 위치와 함께 표시되는 BCL2, CD99, MMP9, CD34, WNT5A 및 CLDN5의 면역조직화학염색 상 발현을 보여주는 히트맵이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MMP9 및 WNT5A의 면역조직화학염색 상발현을 보여주는 선형 상관 분석 그래프이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 SFT/HPC의 위치 및 등급에 따른 CLDN5, CD34, WNT5A 및 MMP9의 면역조직화학염색 상 발현의 상관 관계를 보여주는 그림이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC의 H&E염색 결과를 보여주는 사진이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC의 면역조직화학염색 상 CLDN5의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC의 면역조직화학염색 상 CD34의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC의 이중 면역 형광 염색 상 CLDN5의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC의 이중 면역 형광 염색 상 CD34의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4f는 본 발명의 일 실시예에 따른 exSFT/HPC의 이중 면역 형광 염색 상 CLDN5 및 CD34의 잘 보존된 공동 발현이 있는 종양 혈관을 보여주는 사진이다.
도 4g는 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC의 H&E염색 결과를 보여주는 사진이다.
도 4h는 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC의 CLDN5의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4i는 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC의 CD34의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4j는 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC의 이중 면역 형광 염색 상 CLDN5의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4k는 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC의 이중 면역 형광 염색 상 CD34의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4l은 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC의 이중 면역 형광 염색 상 CD34 (회색 화살표)에 대해서만 염색된 혈관과 CLDN5 및 CD34 (노란 화살표)의 공동 발현을 가진 다른 혈관의 대비를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC에서 두개외 원격전이 기전에 대한 exSFT/HPC에 비해 WNT5A와 CLDN5의 발현감소와 MMP9발현 증가의 효과가 결합하여 두개외 원격전이를 촉진시켰음을 보여주는 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 icSFT/HPC의 두개외 원격전이 조직샘플에서 WNT5A 발현의 감소 및 MMP9의 발현 증가를 보여주는 그림이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 조직 표본 및 임상 데이터 선별
2000 년부터 2017 년 사이의 17년 동안 전남 대학교 화순 병원 및 전남 대학교 병원 병리과에서 단일섬유종양 (Solitary fibrous tumor, 이하, SFT) 또는 혈관주위세포종 (hemangiopericytoma, 이하, HPC)으로 진단된 케이스들을 검색하였다.
그리고, 본 발명의 모든 실험은 전남 대학교 화순 병원 임상 시험 심사위원회 (CNUHH-2017-029)의 승인을 받아 진행하였다. 또한, 임상 정보 및 병리학적 표본의 사용에 대해서 환자 또는 법적 대리인으로부터 서면 사전 동의를 얻어 진행하였다.
첫번째로 검색된 케이스는 STAT6 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry, 이하, IHC)에 의해 스크리닝 되었으며, NAB2-STAT6 유전자 융합 테스트를 대신하여 조직 가용성에 따라 표본을 선택하였다. 원발성 종양의 조직 샘플 50 개를 종양의 위치에 따라 18개의 두개내/수막 SFT/HPC (Solitary fibrous tumor/ hemangiopericytoma) (이하, icSFT/HPC) 및 32개의 두개외/연조직 SFT/HPC (이하, exSFT/HPC)으로 분류하였다. 18개의 icSFT/HPC에는 1개의 척추 SFT/HPC가 포함되었으며, 두개외 전이 및 국소 재발을 나타내는 13개의 조직 샘플이 포함되었다. 두개외 전이 및 국소 재발을 나타내는 13개의 조직 샘플 중 icSFT/HPC의 두개외 전이에 해당하는 6개의 조직 샘플과 7개의 국소 재발에 해당하는 조직 샘플로 나뉜다. 두개외 전이에 해당하는 6개의 조직 샘플은 (원발종양샘플 없이) 전이종양만 확보된 병원내 1건의 증례, 원발종양-전이종양샘플 모두 확보된 짝지어진 3건의 병원내 증례 및 세브란스 병원으로부터 제공받은 전이종양만 확보된 2건의 외부기관 증례로 구성된다. 또한, 국소 재발에 해당하는 7개의 병원 내 샘플은 3개의 일치된 icSFT/HPC 샘플과 4개의 일치된 exSFT/HPC샘플로 구성되었으며, 이중 3개의 일치된 icSFT/HPC 샘플은 1명의 환자로부터 획득하였다.
헤마톡실린 및 에오신 (Hematoxylin and Eosin, 이하, H&E)로 염색된 조직 슬라이드는 두 명의 병리 의사가 WHO 분류 기준에 따라 CNS 2016, 연조직 및 뼈 2020으로 검토하고 재등급화 하였다. 비록 icSFT/HPC의 18개의 샘플 중 한 개가 SFT 표현형을 나타내었지만, 등급을 따로 표시하지는 않았다. 추가 실험을 위해 포르말린에 고정한 파라핀 포매 (FFPE) 조직 블록을 제작하였다.
실시예 2. 나노스트링 엔카운터 분석 시스템을 통한 유전자 발현 분석
유전자의 발현 수준은 나노스트링 엔카운터 분석 시스템 (NanoString nCounter analysis system, NanoString Technologies사, 시애틀, WA)을 사용하여 측정하였다.
icSFT/HPC의 7개 케이스와 exSFT/HPC의 6개의 케이스를 유전자 발현 분석에 적용하였다. 하이퓨어 포르말린에 고정한 파라핀 포매 RNA 분리 키트 (High Pure FFPE RNA Isolation Kit, Roche Diagnostic사, 만하임, 독일)을 사용하여 10 μm 두께의 FFPE 섹션에 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 미리 설정된 프로브로 혼성화 되었고, 나노스트링 엔카운터 디지털 분석기 (PhileKorea Technologies사, 서울, 대한민국)을 사용하여 평가하였다. 엔카운터의 팬-암 경로 패널 (pan-cancer pathways, NanoString Technologies사)은 13개의 표준 경로에서 나온 770개의 유전자가 포함되었다.
확인된 770개의 유전자의 데이터 분석은 엔솔버 분석 소프트웨어 (nSolver analysis software, NanoString Technologies사)를 사용하여 수행하였다. mRNA 프로파일링 데이터는 하우스 키핑 유전자를 사용하여 정규화 하였다. 정규화 된 데이터는 추가 분석을 위해 log2 변환을 하였다.
실시예 3. 경로 조절 장애 및 차별적으로 발현된 유전자의 분석
경로 조절 장애는 엔솔버 소프트웨어 (nSolver software, NanoString Technologies사)를 사용하여 점수를 매겼다. 차별적인 발현된 유전자의 분석은 유전자 수준의 차별적인 발현 분석과 동일한 회귀 모델을 사용하여 수행하였다. 이러한 회귀는 icSFT/HPC 대 exSFT/HPC의 각 경로의 연관성에 대한 P-값을 계산하는데 사용되었다. 경로에서 유전자의 차별적 발현에 대한 누적 증거를 측정하여 각 경로에 대한 글로벌 유의성 통계를 계산하였다. 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)은 GSEA 소프트 웨어 v.4.0.1 (Broad Institute사, 캠브리지, MA)를 사용한 분자 서명 데이터 베이스 (Molecular Signatures Database, 이하, MSigDB) v.7.0을 사용하여 수행되었다. MSigDB 유전자 세트 모음에는 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 유전자 세트가 포함되어 있다. 순열 수는 1,000 개로 설정되었고, 순열 유형은 유전자 집합으로 하였다. 결과는 P- 값 <0.05 및 FDR q- 값 <0.1에서 유의미한 것으로 간주하였다. nSolver 분석 소프트웨어에서 DEG 분석을 수행하여 폴드 차이와 P- 값을 얻었다. Mac OS 용 R-project v. 4.0.2 소프트웨어는 DEG 시각화에 사용되었다.
실시예 4. 면역조직화학염색 및 결과 해석
헤마톡실린&에오신 염색 (Hematoxylin and eosin; H&E) 및 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry; IHC)을 위한 대표적인 단일섬유종양/혈관주위세포종 조직의 블록을 선정하였다. 이후, 단일섬유종양/혈관주위세포종의 헤마톡실린&에오신 염색 및 면역조직화학염색을 위한 3 μm 두께의 파라핀 블록을 제작하였다.
STAT6 (1:500 희석, Abcam사, 캠브리지, 영국), BCL2 (1:50 희석, DAKO, Glostrup, Denmark), CD99 (1:1000 희석, Zymed, 샌프란시스코, CA), CD34 (1:400 희석, DAKO), WNT5A (1:400 희석, R&D, Minneapolis, MN), MMP9 (1:300 희석, Cell Signaling Technology사, Danvers, MA) 및 CLDN5 (1:400 희석, Abcam)을 항체로 사용하였다.
SFT/HPC의 당해 여부 판단을 위해 STAT6 염색은 양성 또는 음성으로 평가하였다. 또한, BCL2, CD99 및 CD34에 대한 IHC의 점수는 다음의 기준에 따라 매겨졌다:
(1) 종양에서 발현되지 않는 경우: 0점 부여.
(2) 종양 면적의 1 내지 30 %로 발현되는 경우: 1점 부여.
(3) 종양 면적의 31 내지 60 %로 발현되는 경우: 2점 부여.
(4) 종양 면적의 61 % 이상에서 발현되는 경우: 3점 부여.
그리고 WNT5A의 IHC 결과는 0부터 3까지 염색 강도에 따라 각각 없음, 낮음, 보통 및 강한 발현으로 점수를 매겼다.
MMP9은 양성인 종양 세포의 비율이 적기 때문에 다음과 같은 변경된 점수 기준이 적용되었다:
(1) 염증 세포의 양성 염색은 점수 산정에서 제외함.
(2) 10개 이상의 양성 종양 세포가 있는 400 배 이상의 고출력 필드 (high-power field)가 3개 이상 있는 경우: 3점 부여.
(3) 고출력 필드에 양성 세포가 5개 미만인 경우: 1점 부여.
(4) 샘플이 1점과 3점의 기준 사이에 있는 경우: 2점 부여.
(5) 종양 세포에서 발현되지 않는 경우: 0점 부여.
CLDN5는 내피 (endothelium)에서 강한 발현을 나타내는 혈관 밀착 접합의 마커이다. CLDN5의 발현은 다음과 같이 점수를 매겼다.
(1) 종양 혈관의 10 % 미만에서 발현이 감소한 경우: 3점 부여.
(2) 종양 혈관의 11 내지 20 %에서 발현이 감소한 경우: 2점 부여.
(3) 종양 혈관의 21 %이상에서 발현이 감소한 경우: 1점 부여.
IHC 슬라이드는 숙련된 두 명의 병리의사가 임상적 세부사항에 대해 모른 채, 헤마톡실린&에오신 및 면역 조직 화학 염색된 슬라이드를 광학 현미경을 사용하여 평가하였다.
실시예 5. 면역 형광 염색
단일섬유종양/혈관주위세포종 파라핀 블록 조직을 절단하여 면역 형광 염색을 수행하였다. 구체적으로, 단일섬유종양/혈관주위세포종 케이스의 포르말린에 고정한 파라핀 포매 (FFPE) 조직을 3 mm 두께의 섹션으로 자르고 자일렌을 사용하여 파라핀을 제거하였다. 항원 검색은 열-활성화 시트레이트 완충액 (pH=6.0)을 이용하여 15분 동안 수행하였으며, 3% 과산화수소를 이용해 내인성 퍼옥시다제를 불활성화 하였다. 그후, 조직을 CD34 (항-마우스 항체, 1:50, DAKO) 및 CLDN5 (항-토끼 항체, 1:200, Abcam)를 표적으로 하는 1차 항체와 함께 4 ℃에서 16시간 동안 공동 배양하였다. 이어서, 조직을 이차항체로 사용한 염소 항-마우스 IgG (goat anti-mouse IgG) (1:200, Life Technologies), 염소 항-토끼 IgG (goat anti-rabbit IgG) (1:400, Life Technologies) 항체와 1시간 동안 실온에서 공동배양 하였다.
핵은 300 nM 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (4',6-diamidino-2-phenylindoe, DAPI)로 20 분 동안 카운터 염색을 한 다음 PBS로 세척하였으며, 이를 방부제가 든 배지에 탑재하고 EVOS® 형광 이미징 시스템 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 이미지화 하였다.
실시예 6. 통계 분석
내인성 단일섬유종양/혈관주위세포종 및 외인성 단일섬유종양/혈관주위세포종 간의 발현의 차이를 비교하기 위해, 카이 제곱 검정 (chi-squared test) 및 피셔 정확 검정 (Fisher exact test)을 수행하여 평가하였다. WNT5A와 MMP9간의 연관성을 평가하기 위해 산포 그래프 (Scatter plot)를 제작하고, 피어슨 연관 방법 (Pearson association)을 사용하여 분석하였다. Mann-Whitney 테스트는 두 그룹 간의 차이를 비교하는 데 사용하였다. 각 변수 간의 상관 계수를 계산하기 위해 Kendall 순위 상관 분석을 수행하였다. 통계적 유의성은 p값이 <0.05 인 경우를 유의성 있는 것으로 고려하였다.
그리고, 이러한 통계 분석은 Mac OS 용 R-project v.4.0.2 소프트웨어를 사용하여 실시하였다.
실험예 1. 선택된 단일섬유종양/혈관주위세포종 케이스의 특성
내인성 단일섬유종양/혈관주위세포종 (이하, icSFT/HPC) 및 외인성 단일섬유종양/혈관주위세포종 (이하, exSFT/HPC) 환자의 평균 연령은 각각 53세 및 49세로 비슷하였다. 또한, 환자 중 여성의 비율은 icSFT/HPC 환자 비율 (50.0 %) 보다exSFT/HPC (59.0 %)이 약 9%정도 높았다. 그리고 평균 종양의 크기는 icSFT/HPC (8.5 cm) 보다 exSFT/HPC (4.7 cm)이 더 크게 측정되었다. 높은 조직학적 등급의 비율은 exSFT/HPC(9/32, 28 %)보다 icSFT/HPC (9/18, 50 %)에서 더 높게 확인되었다. icSFT/HPC 및 exSFT/HPC의 임상 병리학적 프로파일은 하기 표 1에 나타내었다.
exSFT/HPC
(No. of patients = 32)		 icSFT/HPC
(No. of patients = 18)
나이 Median (range) 53 (23-79) 49 (22-78)
성별 남자 13 (41%) 9 (50%)
여자 19 (59%) 9 (50%)
사이즈 (cm) Median (range) 8.5 (1.7-21.0) 4.7 (1.5-7.0)
조직학 등급 Benign/grade 2 23 (72%) 9 (50%)
Malignant/grade 3 9 (28%) 9 (50%)
수술 후 치료 Chemotherapy 1 (3%) 1 (6%)
Radiation 3 (9%) 10 (56%)
재발률 (Recurrence) Local 3 (9%) 5 (28%)
Distant 2 (6%) 3 (17%)
실험예 2. 범암 경로 패널 분석에 의한 내인성 및 외인성 단일섬유종양/혈관주위세포종 간에 차별적으로 발현된 유전자의 분석
icSFT/HPC 7건과 exSFT/HPC 6건을 나노스트링 유전자 발현 분석법 (NanoString gene expression assay)으로 분석하였다.
exSFT/HPC와 비교하여 icSFT/HPC의 13개의 표준 암 경로의 중요성을 평가하기 위하여, 경로 조절 장애 점수 (Pathway dysregulation score)와 글로벌 유의성 통계 (Global significance statistic)라는 두 가지 통계적 접근법을 사용하였다 (도 1a). 차별적으로 발현된 유전자의 생물학적 중요성은 유전자 세트 언리치먼트 분석 (Gene Set Enrichment Analysis, 이하, GSEA)으로 조사하였다. WNT 신호 전달 경로 (언리치먼트 점수 (Enrichnebt Score) [ES] = 0.40, 정규화 된 (Normalized) 언리치먼트 점수 [NES]=1.59, 명목 P [NOM P]-밸류= 0.011 및 FDR q-밸류=0.344) 및 초점 접착 (ES = 0.39, NES=1.49, NOM P-밸류=0.06 및 FDR q-밸류=0.406) KEGG 유전자 세트는 icSFT/HPC와 비교하였을 때 exSFT/HPC에서 상향 조절되었다 (도 1b). nCounter 범암 경로 패널의 770개 유전자 중, WNT5A는 6.59 배 변화 (P=0.008)로 exSFT/HPC에서 농축되었으며, MMP9는 8659.1배 변화 (P=0.016)로 icSFT/HPC에서 강화되었다 (도 1c). 히트맵은 icSFT/HPC와 exSFT/HPC간의 차등 발현 프로파일을 보여준다 (도 1d). 유의 수준을 충족한 10 개의 WNT 관련 유전자 중 3 개는 icSFT/HPC에서 과발현되었고 7개는 exSFT/HPC에서 과발현되었다. MMP9의 발현은 선형 상관 분석에 의해 WNT5A의 발현과 역상관 관계 (MMP9의 발현이 높을수록 WNT5A 발현이 낮음)가 있었으나, 유의미하지는 않았다 (P=0.155, r2=0.175, 도 1e). WNT5A의 발현은 exSFT/HPC에서 유의하게 높았고 (P=0.008), MMP9의 발현은 icSFT/HPC에서 유의하게 높았다 (P=0.035, 도 1f). MMP9의 발현은 2기 (grade) icSFT/HPC 보다 3기 icSFT/HPC에서 더 높은 경향을 나타내었다. 개별 환자 정밀 분석에서, exSFT/HPC일때 보다 icSFT/HPC에서 WNT5A의 발현 수준과 MMP9의 발현 수준 사이의 거리는 훨씬 크다. 상관도에서 WNT5A (Kendal의 τ = -0.57, P = 0.01)와 MMP9 (Kendal의 τ = -0.52, P = 0.03)의 표현은 SFT/HPC의 위치와 강한 상관 관계를 나타내었다.
실험예 3. 내인성 및 외인성 단일섬유종양/혈관주위세포종 간의 차별화 된WNT5A 및 MMP9 단백질 수준
단백질 수준에서 차별적으로 발현된 유전자를 검사하기 위해, SFT/HPC의 포르말린에 고정한 파라핀 포매 (FFPE) 조직의 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry; IHC)을 수행하였다 (도 2). STAT6 사용 전 SFT/HPC의 보조 진단 마커로 사용되었던 CD99 및 BCL2의 발현은 그룹 간에 유의한 차이가 없었다 (각각 P = 0.777 및 0.277). CD34의 면역조직화학염색 결과는 exSFT/HPC에서는 미만성의 강한 발현을 나타내었지만, icSFT/HPC에서는 약하고 고르지 못한 양성을 나타내었다. WNT5A의 발현은 icSFT/HPC에서보다 exSFT/HPC에서 유의하게 높았으며, MMP9의 발현은 icSFT/HPC에서 유의성 있게 향상되었다 (각각 P<0.001 및 P=0.001, 도 3a). MMP9의 면역조직화학염색을 통해 뚜렷한 세포질 양성을 가진 개별 종양 세포를 밝혔다. MMP9의 면역조직화학염색 점수가 높은 경우 종양 세포에서 세포질 양성의 부피가 더 커지는 경향이 있었고 윤곽이 더 불규칙하였다. 선형 상관 분석에 의한 MMP9의 발현은 WNT5A의 발현도 (P=0.008, r2=0.137)와 역상관 관계를 나타내었다 (도 3b). 상관도에서 WNT5A (Kendal's τ = -0.57, P　<　0.001) 및 CD34 (Kendal's τ = -0.72, P < 0.001)는 exSFT/HPC와 유의한 상관 관계를 보인 반면, MMP9 (Kendal의 τ = 0.50, P <0.001)는 icSFT/ HPC와 유의한 상관 관계를 나타내었다 (도 3c). 이러한 결과는 차별적으로 발현된 유전자 분석과 일치함을 확인할 수 있다.
실험예 4. icSFT/HPC 및 exSFT/HPC에서 CLDN5 및 CD34의 차별적인 발현
혈관의 견고성을 유지하는 변경된 WNT5A 발현의 역할을 확인하기 위해 혈관 밀착 접합부의 대표적인 마커인 클라우딘-5 (Claudin-5, 이하, CLDN5)의 면역조직화학염색을 수행하였다. CLDN5의 면역조직화학염색에 따르면, exSFT/HPC는 종양 세포에서 미만성 면역 반응의 배경이 되는 CD34 발현과 겹치는 잘 보존된 혈관 밀착 접합을 나타낸다 (도 4a 내지 4c). 또한, 이중 면역 형광은 CLDN5 및 CD34와 공존하는 exSFT/HPC의 종양 내 혈관을 강조하였다 (도 4d 내지 4f). 대조적으로, icSFT/HPCs는 CLDN5에 대해 음성이었지만, CD34에 대해서는 강하게 양성인 종양 혈관계에 가끔 초점을 함께 나타내었다 (도 4g 내지 4i). 이중 면역 형광에 의해, 일부 종양 내 혈관의 icSFT/HPC는 CD34에만 양성이고, CLDN5에는 음성이었지만 다른 종양 내 혈관은 CLDN5 및 CD34 모두에 양성을 나타내었다 (도 4j 내지 4l). 반정량적 평가에 따르면 CLDN5 발현은 exSFT/HPC 보다 icSFT/HPC에서 현저하게 낮게 나타났다 (P < 0.001).
실험예 5. icSFT/HPC의 두개외 전이성 병변에서 WNT5A 및 MMP9의 발현의 증감
icSFT/HPC에서 WNT5A 및 MMP9의 생물학적 역할을 조사하기 위해서 두개외 전이가 있는 icSFT/HPC의 6개의 케이스 (전남대 병원 케이스 4건 및 병원 외 기관의 케이스 2건)에 대해 면역 조직 화학 (Immunohistochemistry, 이하, IHC)을 수행하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
　 케이스1 케이스 2 케이스 3 케이스 4 케이스 5 케이스 6
나이/성별 34/여자 55/여자 39/남자 36/여자 57/여자 29/여자
두개내 위치 Right tentorium Sphenoid ridge Right tentorium Right cerebellum Occipital lobe Temporal lobe
전이성 기관 간 C7 척추 T9 척추 폐 폐 골반 연조직
초기 종양 등급 Grade 2 NA Grade 3 Grade 2 Grade 3 Grade 3
전이 기간 (개월) 216 116 45 65 32 84
두개외 전이성 병변에서 WNT5A의 면역조직화학염색 결과는 약한 양성을 나타내지는 않았지만, MMP9의 면역조직화학염색 결과는 가끔씩 강한 세포질 면역 반응성을 보이는 종양 세포를 나타내었다 (점수 3)(도 5 및 6). 이에 반하여 국소 재발성 exSFT/HPC2의 케이스는 WNT5A의 높은 발현과 MMP9의 낮은 발현을 나타내었다. 이와 대조적으로, 국소 재발성 icSFT/HPC의 세 케이스는 두개 외 위치에서의 전이성 병변과 유사하게 WNT5A의 낮은 발현과 MMP9의 높은 발현을 나타내었다.
본 실험의 기록으로부터의 대표적인 사례는 icSFT/HPC의 두개외 전이로 인한 좋지 않은 임상 경과를 나타내었다. 처음에 환자(36세, 여성)는 2등급 icSFT/HPC를 진단받았으며 방사선 요법으로 환자의 상태는 재발 없이 유지되었다 (도 6). 하지만 국소 재발성 종양은 3등급 SFT/HPC로 진행되었고, 5.5 년 이후에 멀리 떨어진 폐에도 전이가 되었다. 반복적인 수술과 화학요법에도 불구하고 환자는 초기 진단 후 9년 만에 다발성 폐전이로 사망하였다.

Claims (11)

  1. 단일섬유종양/혈관주위세포종 (Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma; icSFT/HPC)에서 발현된 WNT5A 및 MMP9과 특이적으로 결합하는 제제;
    를 포함하는, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 항체 또는 앱타머를 포함하는, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 단일섬유종양/혈관주위세포종은 간, 척추, 폐, 골반 및 복막으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 전이된 것인, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  5. 단일섬유종양/혈관주위세포종 (Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma; icSFT/HPC)에서 발현된 WNT5A 및 MMP9과 특이적으로 결합하는 제제;
    를 포함하는, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 키트, 블랏팅 (blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 제제는 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단 또는 예후 분석용 키트.
  8. 다음 단계를 포함하는 두개내 단일섬유종양/혈관주위세포종의 두개외 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    단일섬유종양/혈관주위세포종을 포함하는 시료를 준비하는 단계;
    상기 단일섬유종양/혈관주위세포종의 WNT5A 및 MMP9의 발현수준을 측정하는 측정 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 측정 단계는 단일섬유종양/혈관주위세포종의 WNT5A 및 MMP9의 발현수준을 측정하는 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 측정 단계는 면역 조직 화학 염색 또는 면역 형광 염색에 의해 수행되는 것인, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 단일섬유종양/혈관주위세포종은 간, 척추, 폐, 골반 및 복막으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 전이된 것인, 방법.
KR1020200168973A 2020-12-04 2020-12-04 단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법 KR102427057B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200168973A KR102427057B1 (ko) 2020-12-04 2020-12-04 단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200168973A KR102427057B1 (ko) 2020-12-04 2020-12-04 단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220079316A KR20220079316A (ko) 2022-06-13
KR102427057B1 true KR102427057B1 (ko) 2022-07-29

Family

ID=81983981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200168973A KR102427057B1 (ko) 2020-12-04 2020-12-04 단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102427057B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008118915A (ja) 2006-11-10 2008-05-29 Kazuto Nishio 胃癌高発現遺伝子特定による胃癌診断および創薬への利用
JP2009515148A (ja) 2005-10-19 2009-04-09 アンセルム （アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） 患者の癌の進行およびその転帰の生体外予後診断方法、および該方法を実施するための手段

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014522993A (ja) * 2011-08-08 2014-09-08 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス エス．アー．エール．エル． バイオマーカー組成物および方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009515148A (ja) 2005-10-19 2009-04-09 アンセルム （アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） 患者の癌の進行およびその転帰の生体外予後診断方法、および該方法を実施するための手段
JP2008118915A (ja) 2006-11-10 2008-05-29 Kazuto Nishio 胃癌高発現遺伝子特定による胃癌診断および創薬への利用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chenhui Zhao et al, International Journal of Neuroscience (published online 2020.11.30.), DOI: 10.1080/00207454.2020.1846532, pp1-7.
Guodong Tang et al, Laboratory Investigations (published online 2019.04.23.), vol 99, pp 1501-1514.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220079316A (ko) 2022-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2460075C2 (ru) Биомаркеры рака
DeSouza et al. Endometrial carcinoma biomarker discovery and verification using differentially tagged clinical samples with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry
US20110257035A1 (en) Identification of signature genes associated with hepatocellular carcinoma
US20070218512A1 (en) Methods related to mmp26 status as a diagnostic and prognostic tool in cancer management
US20070286865A1 (en) Use of HE4 and other biochemical markers for assessment of ovarian cancers
CN112345755B (zh) 乳腺癌的生物标志物及其应用
US20200033351A1 (en) Diagnostic methods and kits for early detection of ovarian cancer
US20140271621A1 (en) Methods of prognosis and diagnosis of pancreatic cancer
US20140186837A1 (en) Methods For Diagnosing Cancer
US20160311921A1 (en) Methods for treatment of ovarian cancer
AU2017260806A1 (en) Markers of endometrial cancer
Madjd et al. BRCA1 protein expression level and CD44+ phenotype in breast cancer patients
US20130102486A1 (en) Perp as a prognostic and diagnostic marker for dysplasia and cancer
TWI512294B (zh) 偵測致死系統之方法與組合物及其用途
KR102427057B1 (ko) 단일섬유종양/혈관주위세포종 전이 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단방법
US20230416836A1 (en) Method for predicting responsiveness to plk1 inhibition
US7588904B2 (en) Perinucleolar compartment as a cancer marker
AU2020343723A1 (en) Methods for confirming detection and evaluating the progression of a prostate cancer and related therapies
KR102363980B1 (ko) 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법
Jain et al. Evaluation of Expression Of ADAM 10 as a Predictor of Lymph Node Metastasis in Oral Squamous Cell Carcinoma—An Immunohistochemical Study
US20080274461A1 (en) Perinucleolar Compartment Markers for Cancer
KR101247636B1 (ko) 편평상피세포암의 진단용 마커 및 이를 포함한 키트
US20230074311A1 (en) Composition for cancer diagnosis
US20130095483A1 (en) Predictive biomarkers for breast cancer
CN117836627A (zh) 从脱石蜡细胞开始的单细胞elisa用于检测感兴趣分子的用途

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant