ES2759910T3

ES2759910T3 - Composición y vacuna para el tratamiento del cáncer de pulmón

Info

Publication number: ES2759910T3
Application number: ES14755334T
Authority: ES
Inventors: Karl-Josef Kallen; Mariola Fotin-Mleczek; Ulrike Gnad-Vogt
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2034-08-21
Also published as: MY174677A; AU2014310932B2; DK3035955T3; UA120595C2; ZA201508947B; EA201600189A1; IL276428A; AP2016009090A0; PE20160224A1; KR20160042935A; HK1225987A1; AU2019226125B2; EA037217B1; IL243090B; HUE046469T2; SG10201801429VA; CL2016000388A1; JP6678582B2; JP2016528264A; AU2019226125A1

Abstract

Composición para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo la composición seis ARNm, donde cada ARNm codifica un antígeno diferente seleccionado del grupo consistente en: - 5T4(Glicoproteína Trofoblástica, TPBG); - Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral; BIRC5), - NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York; CTAG1B), - MAGE-C1 (Familia de antígenos de melanoma C1); - MAGE-C2 (Familia de antígenos de melanoma C2), y - MUC1 (Mucina 1), y donde cada ARNm es idéntico a una secuencia de ARN diferente seleccionada de las secuencias de ARN según las SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 o 24, donde cada ARNm está complejado con un compuesto catiónico seleccionado del grupo consistente en un péptido catiónico, una proteína catiónica, un polisacárido catiónico, un polímero catiónico y un lípido catiónico y donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y vacuna para el tratamiento del cáncer de pulmón

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo la composición seis ARNm, codificando cada ARNm un antígeno diferente seleccionado del grupo consistente en 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG), Survivina (proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral IAP; BIRC5), NY-ESO-1 (carcinoma 1 de células escamosas esofágico de Nueva York, CTAG1B), MAGE-C1 (familia de antígeno de melanoma C1), MAGE-C2 (familia de antígeno de melanoma C2) y MUC1 (Mucina 1); y donde cada ARNm es idéntico a una secuencia de ARN diferente seleccionada de las secuencias según las SEQ ID NO 19, 20, 21, 22, 23 o 24, estando cada ARNm complejado con un compuesto catiónico seleccionado del grupo consistente en un péptido catiónico, una proteína catiónica, un polisacárido catiónico, un polímero catiónico y un lípido catiónico, y donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutica La invención se refiere además a una vacuna para su uso en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde la vacuna comprende la composición, comprendiendo el tratamiento además la administración de un agente quimioterapéutico. Adicionalmente, la invención se refiere a una combinación de seis ARNm para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde cada ARNm codifica para un antígeno diferente seleccionado del grupo consistente en 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG), Survivina (proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral IAP; BIRC5), NY-ESO-1 (carcinoma 1 de células escamosas esofágico de Nueva York, CTAG1B), MAGE-C1 (familia de antígeno de melanoma C1), MAGE-C2 (familia de antígeno de melanoma C2) y MUC1 (Mucina 1) y donde cada ARNm es idéntico a una secuencia de ARN diferente seleccionada de las secuencias según las SEQ ID NO 19, 20, 21, 22, 23 o 24, y donde cada ARNm está complejado con un compuesto catiónico seleccionado del grupo consistente en un péptido catiónico, una proteína catiónica, un polisacárido catiónico, un polímero catiónico y un lípido catiónico, y donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico. Finalmente, la invención se refiere a kits, en particular a kits de partes, que contienen la composición y/o la vacuna para su uso en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas tal como se define en las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

De todos los tumores malignos, el 25% son carcinomas bronquiales (carcinoma de pulmón). En todo el mundo, es la causa más común de muerte relacionada con el cáncer en los hombres y el segundo más común en mujeres. En Alemania es el tercer tipo más abundante de carcinoma después del carcinoma de próstata y el carcinoma colorrectal. Es responsable de 1,3 millones de muertes al año en todo el mundo. En Europa central, la incidencia es de aproximadamente un 60 por 100.000 habitantes y el número de personas recientemente diagnosticadas de cáncer de pulmón es cada vez mayor (en Alemania actualmente es aproximadamente de 50.000 al año). Cuando se diagnóstica de cáncer de pulmón, la tasa de supervivencia total media en cinco años es apenas un 5 por ciento. No obstante, la esperanza de vida de cada paciente individual depende por completo de la etapa de la enfermedad (clasificación TMN) y del subtipo de carcinoma (cáncer de pulmón) encontrado (ver a continuación).

Los subtipos principales de cáncer de pulmón categorizados por el tamaño y apariencia de las células malignas identificadas bajo microscopio son cáncer de pulmón de células pequeñas (20%) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (80%). Esta clasificación, aunque se basa en simples criterios histológicos, tiene implicaciones muy importantes para el manejo clínico y la prognosis de la enfermedad, siendo tratado el cáncer de pulmón de células pequeñas usualmente con quimioterapia, mientras que el cáncer de pulmón de células no pequeñas principalmente se somete a cirugía como tratamiento de primera línea.

Los cánceres de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se agrupan conjuntamente debido a que su prognosis y manejo son más o menos idénticos. Existen tres subtipos principales: carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes. La cirugía es el pilar del tratamiento; sin embargo, solo la cuarta parte de los pacientes experimentan una resección exitosa, con una tasa de recurrencia del 50%. Los enfoques terapéuticos en enfermedad avanzada implican - después de la cirugía - quimioterapia adyuvante y/o radioterapia adyuvante, mientras que la quimioterapia como monoterapia (terapia de primera línea) parece ser un procedimiento asociado a resultados relativamente deficientes. En una comparación de cuatro regímenes de quimioterapia de combinación usados habitualmente, ninguno era superior. Las tasas de respuesta variaban del 15% al 22%, con tasas de supervivencia de 1 año del 31% al 36% (ver por ejemplo O'Mahony, D., S. Kummar y col. (2005), “NonsmaN-ceN lung cancer vaccine therapy: a concise review”, J Clin Oncol 23(35): 9022-8). Así, aunque la quimioterapia preoperatoria parece que no dar como resultado una prolongación de la esperanza de vida, la quimioterapia adyuvante - también si se combina con radioterapia - demostraba un incremento significativo de la esperanza de vida.

Uno de los enfoques quimioterapéuticos usados en la actualidad son combinaciones de sustancias basadas en platino con, por ejemplo, Gemcitabina incluso como terapia de primera línea, mientras que, por ejemplo, Pemetrexed se usa como terapia de segunda línea.

Otra opción usada para el tratamiento del NSCLC es la llamada “Terapia Diana”, que trata mejorar el éxito de la quimioterapia citotóxica clásica influyendo en estructuras diana específicas de tumor a un nivel molecular. Las sustancias usadas incluyen Bevacizumab (un inhibidor de la angiogénesis) o Erlotinib, que se fija como diana a las tirosinas-quinasas del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

A pesar de que sin duda existen mejoras en los procedimientos terapéuticos actuales, el tratamiento del cáncer de pulmón, especialmente de NSCLC, sigue constituyendo una lucha sin cuartel dadas las altas tasas de mortalidad, con una gran necesidad de formas de tratamiento adicionales, alternativas o mejoradas.

Así, se sugiere aquí emplear el sistema inmunitario en un enfoque para el tratamiento del NSCLC. El sistema inmunitario juega un importante papel en el tratamiento y la prevención de numerosas enfermedades. De acuerdo con el actual estado de conocimiento, se proporcionan diversos mecanismos para que los mamíferos protejan su organismo identificando y exterminando, por ejemplo, células tumorales. Estas células tumorales tienen que ser detectadas y distinguidas de las células y tejidos normales del organismo.

El sistema inmunitario de los vertebrados, como el humano, consiste en muchos tipos de proteínas, células, órganos y tejidos que interactúan en una red elaborada y dinámica. Como parte de esta respuesta inmune más compleja, el sistema vertebrado se adapta con el tiempo para reconocer patógenos particulares o células tumorales de forma más eficiente. El proceso de adaptación crea memorias inmunológicas y permite una protección aún más efectiva en futuros encuentros. Este proceso de inmunidad adaptiva o adquirida es la base de las estrategias de vacunación.

El sistema inmune adaptivo es específico de antígeno y requiere el reconocimiento de “auto” o “no auto” antígenos específicos durante un proceso llamado presentación de antígenos. La especificidad del antígeno permite generar respuestas que están adaptadas a los patógenos específicos o a las células infectadas por los patógenos o a las células tumorales. La capacidad de desarrollar estas respuestas adaptadas es mantenida en el cuerpo por las llamadas “células de memoria”. Si un patógeno infecta el cuerpo más de una vez, se usan estas células de memoria específicas para eliminarlo rápidamente. El sistema inmunitario adaptivo permite así una respuesta inmune más potente, así como una memoria inmunológica donde cada patógeno o célula tumoral es “recordada” por la firma de uno o más antígenos.

Los componentes principales del sistema inmunitario adaptivo en los vertebrados incluyen predominantemente linfocitos en el nivel celular y anticuerpos en el nivel molecular. Los linfocitos como componentes celulares del sistema inmunitario adaptivo incluyen células B y células T derivadas de células madre hematopoyéticas de la médula ósea. Las células B están implicadas en la respuesta humoral, mientras que las células T están implicadas en la respuesta inmune mediada por células. Tanto las células B como las células T llevan portan receptoras que reconocen dianas específicas. Las células T reconocen una diana “no propia”, tal como una estructura diana patogénica, solo después de que los antígenos (por ejemplo fragmentos pequeños de un patógeno) se hayan procesado y presentado en combinación con un receptor “propio” llamado molécula complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Por el contrario, el receptor específico de antígeno de células B es una molécula anticuerpo de la superficie de la célula B y reconoce los patógenos como tales cuando los anticuerpos sobre sus superficies se unen a un antígeno extraño específico. Este complejo antígeno/anticuerpo es captado por la célula B y procesado por proteólisis en péptidos. La célula B después muestra estos péptidos antigénicos sobre sus moléculas MHC clase II superficiales. Esta combinación MHC y antígeno atrae una célula T auxiliar correspondiente, que libera linfoquinas y activa las células B. Dado que la célula B activada comienza a dividirse, sus descendientes secretan millones de copias del anticuerpo que reconoce este antígeno. Estos anticuerpos circulan en el plasma sanguíneo y la linfa, uniéndose a los patógenos o a las células tumorales que expresan el antígeno y los marcan para su destrucción por activación del complemento o para su captación y destrucción por fagocitos.

Como componente celular del sistema inmunitario adaptivo, las células T citotóxicas (CD8+) pueden generar una respuesta CTL. Las células T citotóxicas (CD8+) pueden reconocer péptidos de patógenos endógenos y autoantígenos ligados mediante las moléculas MHC tipo I. Las células T CD8+ llevan a cabo su función exterminadora liberando proteínas citotóxicas en la célula.

Los mecanismos del sistema inmunitario son dianas para los tratamientos curativos. Los métodos apropiados se basan típicamente en la administración de adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria innata o en la administración de antígenos o inmunógenos para provocar una respuesta inmunitaria adaptiva. Ya que los antígenos se basan típicamente en componentes específicos de patógenos (por ejemplo proteínas superficiales) o fragmentos de los mismos, la administración de ácidos nucleicos al paciente, que es seguida por la expresión de los polipéptidos, proteínas o antígenos deseados, también es tenida en cuenta.

Hasta ahora los métodos convencionales para inducir la respuesta inmunitaria, inmunización o vacunación, se basan en el uso de moléculas de ADN con el fin de incorporar la información genética requerida dentro de la célula. Se han desarrollado diversos métodos para introducir el ADN en las células, como la transfección de fosfato de calciola , transfección de polipreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la microinyección y la lipofección, lipofección que, en particular, ha demostrado ser un método adecuado. También pueden emplearse virus de ADN como vehículo del ADN. Debido a sus propiedades infecciosas, tales virus logran una tasa de transfección muy alta. Los virus usados se modifican genéticamente de manera que no se forman partículas infecciosas funcionales en la célula transfectada. A pesar de estas precauciones, sin embargo, no es posible descartar el riesgo de propagación descontrolada del gen introducido y de los genes virales, por ejemplo debido a posibles eventos de recombinación. Esto también conlleva el riesgo de que el ADN se inserte en un gen intacto del genoma de la célula huésped, por ejemplo por recombinación, con la consecuencia de que este gen puede mutar e inactivarla así completa o parcialmente o puede dar origen a información errónea. En otras palabras, la síntesis de un producto génico que es vital para la célula se puede suprimir completamente o, alternativamente, expresarse un producto génico modificado o incorrecto. Se produce un riesgo particular cuando el ADN se integra en un gen implicado en la regulación del crecimiento celular. En este caso, la célula huésped se puede degenerar y conducir a un cáncer o a una formación tumoral. Además, si el ADN introducido en las células se va a expresar, es necesario que el vehículo de ADN correspondiente contenga un promotor potente, tal como el promotor CMV viral. La integración de tales promotores en el genoma de la célula tratada puede resultar en alteraciones indeseadas de la regulación de la expresión génica de la célula. Otro riesgo del uso de ADN como agente para inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo como una vacuna) es la inducción de anticuerpos anti-ADN patogénicos en el paciente al que se ha introducido el ADN extraño, provocando así una respuesta inmune (posiblemente fatal).

Así, con el fin de estimular de manera efectiva el sistema inmunitario para permitir el tratamiento del cáncer de pulmón a la vez que se evitan los problemas de propagación descontrolada de la introducción de un gen por las composiciones basadas en ADN, se han desarrollado composiciones basadas en ARN. La WO2009/046738 proporciona una composición que comprende al menos un ARN que codifica al menos un antígeno seleccionado del grupo consistente en NY-ESO-1, MAGE-C1 y MAGE-C2 y que codifica adicionalmente al menos un antígeno seleccionado del grupo consistente en hTERT, WT1, Ma GE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, Survivina, MAGE-C1 y/o MAGE-C2. Aunque la combinación de al menos dos antígenos en la composición representa un paso importante hacia una inmunoterapia activa contra el cáncer de pulmón, el profesional aún se enfrenta - cuando busca opciones de tratamiento para un sujeto individual - con la selección de una combinación de antígenos adecuados que sea tanto efectiva como bien tolerada. También la WO 2009/046974 se refiere a composiciones de ARN para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón y describe la vacunación de ratones con una composición que comprende cinco ARN que codifican NY-ESO-1, MAGE-C2, MAGEC1, Survivina y 5T4.

Por tanto, en general, existe hay espacio y necesidad de un sistema eficiente que pueda emplearse para estimular de forma efectiva el sistema inmunitario permitiendo el tratamiento del cáncer de pulmón, en especial de cáncer de pulmón de células pequeñas (NSCLC), a la vez que se evitan los problemas encontrados cuando se usan las composiciones conocidas en la técnica.

Por ello, un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición, que a) permite el tratamiento del cáncer de pulmón estimulando el sistema inmunitario, a la vez que b) evita las desventajas mencionadas anteriormente.

Así, es un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna contra el cáncer de pulmón o una composición para el tratamiento de cáncer de pulmón que estimulan el sistema inmunitario.

El objeto subyacente de la presente invención se resuelve mediante el contenido reivindicado.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención queda establecida en su juego de reivindicaciones anexo. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones anexas no se consideran parte de la invención. El objetivo antes mencionado se resuelve por el contenido de la presente invención, en particular mediante una composición para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo la composición varios ARNm, donde cada ARNm codifica un antígeno diferente seleccionado del grupo consistente en:

• 5T4(Glicoproteína Trofoblástica, TPBG);

• Survivina (proteína 5 que contiene repetición IAP Baculoviral; BIRC5),

• NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York; CTAG1B),

• MAGE-C1 (Familia de antígenos de melanoma C1);

• MAGE-C2 (Familia de antígenos de melanoma C2), y

• MUC1 (Mucina 1),

y donde cada ARNm es idéntico a una secuencia de ARN diferente seleccionada de las secuencias de ARN según las SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 o 24, estando cada ARNm complejado con un compuesto catiónico seleccionado del grupo consistente en un péptido catiónico, una proteína catiónica, un polisacárido catiónico, un polímero catiónico y un lípido catiónico, y donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico.

Sorprendentemente, se ha descubierto que la combinación específica de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos del grupo mencionado anteriormente codificado por al menos seis ARNm de la composición para su uso de acuerdo con la presente invención es capaz de estimular de forma efectiva el sistema inmunitario (adaptivo) para permitir el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo el tratamiento además la administración de un agente quimioterapéutico. Los efectos ventajosos en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas se logran independientemente de si la combinación de antígenos tal como se describe aquí se aplica como una sola composición o mediante la administración separada de antígenos individuales. Así, cualquier combinación de los antígenos aquí descritos, por ejemplo en forma de seis formulaciones de ARNm separadas, puede cumplir los mismos propósitos y lograr el efecto deseado. El número de respuestas a esta estrategia de vacunación se espera que se incremente significativamente en comparación con otros enfoques. Aquí, los términos antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos se pueden como sinónimos. En el contexto de la presente descripción, una composición se entenderá además como una composición que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta inmunitaria adaptiva como se define aquí, debido al menos uno de los componentes contenidos en la composición o, más bien, debido a al menos uno de los antígenos codificados por el al menos un componente de la composición, es decir, por al menos un ARNm que codifica los antígenos como se define anteriormente. La combinación de antígenos, ya sea administrados separadamente (por ejemplo concurrentemente) o como una única composición, es capaz de inducir la respuesta inmunitaria deseada. La administración separada puede significar que los ARNm distintos sean administrados esencialmente de manera simultánea, por ejemplo en 10 minutos, o de forma escalonada durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo más de 30 minutos.

A continuación, se ilustra la combinación de antígenos tal como se emplea de acuerdo con la invención mediante la descripción de una composición que comprende seis ARNm que codifican la combinación de antígenos. Se entiende que los seis ARNm que se emplean de acuerdo con la invención se caracterizan por las características aquí descritas.

Entre la gran cantidad de antígenos expresados en las células de cáncer de pulmón, de acuerdo con la presente invención se seleccionan seis antígenos como se definen aquí, es decir 5T4, Survivina, NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2 y MUC1. Estos antígenos se han identificado como dianas potenciales en la inmunoterapia. De acuerdo con la invención, cada uno de los antígenos anteriores es codificado por al menos un ORF/región de codificación/secuencia de codificación proporcionados por los menos seis ARNm. En este contexto, un ARN mensajero es típicamente un ARN monohebra que está compuesto por (al menos) varios elementos estructurales, por ejemplo opcionalmente una región 5'UTR, un sitio de unión ribosómica aguas arriba seguido por una región de codificación, una región 3'UTR opcional, que puede estar seguida de una cola poli-A (y/o una cola poli-C). Una región de codificación para cada uno de los al menos seis antígenos se dispone en ARNm separados de la composición. A continuación se proporcionan realizaciones especialmente preferentes para los menos seis ARNm.

De acuerdo con la presente invención, un ARNm de la composición codifica 5T4. “5T4” es Glicoproteína Trofoblástica. Harrop, Connolly y col. (2006) reportaron que el antígeno oncofetal humano 5T4 es una glicoproteína de membrana rica en leucina de 72 kDa que se expresa en alto nivel en la placenta y también en una amplia gama de carcinomas humanos, incluyendo cánceres colorrectales, gástricos, renales y de ovario, pero rara vez en tejidos normales (ver Harrop, R., N. Connolly y col. (2006). “Vaccination of colorectal cancer patients with modified Vaccinia Ankara delivering the tumor antigen 5T4 (TroVax) induces immune responses which correlate with disease control: a phase I/II trial.”, Clin Cancer Res 12(11 Pt 1): 3416-24). La sobreexpresión de 5T4 está asociada a una prognosis deficiente en pacientes con carcinoma colorrectal, gástrico y de ovario. A pesar de tal combinación de factores, las respuestas inmunes celulares y/o humorales específicas de 5T4 se indujeron en la mayoría de pacientes (16 de 17; 94%) después de la inmunización con TroVax, lo que se consideró alentador en comparación con muchos otros ensayos de inmunoterapia cancerosa. Brevemente, se demostró la seguridad e inmunogenicidad de TroVax suministrado por las vías de administración i.m. e i.d. Zhao y Wang (2007) (Zhao, Y. y Y. Wang (2007), “5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors”, Cell Mol Immunol 4(2): 99-104) reportaron que la glicoproteína oncotrofoblástica 5T4 es una proteína transmembrana expresada en el tejido embriónico y varias superficies de células tumorales malignas. Desempeña una función vital en múltiples procesos biológicos y patológicos, incluyendo la migración celular masiva durante la embriogénesis, la invasión celular asociada a implantes y las metástasis neoplásicas en la progresión de la génesis tumoral. De acuerdo con Kopreski, Benko y col. (2001), 5T4 es una glicoproteína trofoblástica con frecuencia sobreexpresada en tumores malignos epiteliales que proporciona una diana potencial para la terapia contra el cáncer (ver Kopreski, M. S., F. A. Benko, y col. (2001), “Circulating RNA as a tumor marker: detection of 5T4 mRNA in breast and lung cancer patient serum”, Ann N Y Acad Sci 945: 172-8). Se recogió suero de 19 pacientes con cáncer de mama avanzado (5 pacientes) o con cáncer de pulmón de células no pequeñas (14 pacientes) y de 25 voluntarios de control normales con ARN amplificable. El ARN extraído del suero se amplificó por RT-PCR usando reacciones de dos etapas semianidadas con productos detectados mediante electroforesis en gel. El ARNm 5T4 se detectó de forma reproducible en 8/19 (42%) de los sueros de pacientes con cáncer, incluyendo 2/5 sueros de pacientes con cáncer de mama y 6/14 de sueros de pacientes con cáncer de pulmón, pero en solo 3/25 (12%) sueros de control normales (p = 0,035).

En el contexto de esta invención, la secuencia del ARNm que codifica el antígeno 5T4 consiste en una tal como se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 19).

Además, un ARNm de la composición codifica Survivina. “Survivina” es un IAP baculoviral 5 que contiene la repetición 5 (survivina). Grube, Moritz y col. (2007) descubrieron la Survivina (ver Grube, M., S. Moritz y col. (2007), “CD8+ T cells reactive to survivin antigen in patients with multiple myeloma”, Clin Cancer Res 13(3): 1053-60). La survivina es un miembro de la familia de inhibidores de la apoptosis y está sobreexpresada en diferentes tipos de tumores. Las células T citotóxicas que reconocen epítopos de survivina se pueden inducir in vitro y mediante vacunación en pacientes con leucemia, cáncer de mama y melanoma. Se investigó si las células T CD8+ específicas de survivina están presentes en pacientes con mieloma múltiple y se detectaron células T que reconocen el péptido de survivina ligado a HLA-A2.1 en 9 de 23 pacientes y en 1 de 21 voluntarios sanos. Las células T reactivas a la survivina se identificaron como células T efectoras terminalmente diferenciadas (CD8+, CD45RA+ y CCR7-). La expresión positiva de survivina de células de mieloma en muestras de médula ósea se demostró en 7 de 11 pacientes. La survivina se expresa en gran medida en la mayoría de las células cancerosas humanas de origen epitelial y hematopoyético, y la sobreexpresión se asocia con la progresión del cáncer, la deficiente prognosisla , resistencia y la escasa supervivencia de los pacientes. Duffy, O'Donovan (2007) describieron que la Survivina es una proteína de 16,5 kDa sobreexpresada en casi mayoría de los tumores, pero raramente se detecta en tejidos adultos diferenciados normales (ver Duffy, M. J., N. O'Donovan, y col. (2007), “Survivin: a promising tumor biomarker”, Cancer Lett 249(1): 49-60). Funcionalmente, se ha demostrado que la Survivina inhibe la apoptosis, promueve la proliferación celular y mejora la angiogénesis. Consistente con esta función en estos procesos, la Survivina se ha descrito como desempeñando una función clave en la progresión del cáncer. Debido a la gran diferencia en la expresión entre el tejido normal y maligno y su papel causal en la progresión del cáncer, actualmente se está sometiendo a la survinina a una investigación intensiva como potencial marcador tumoral. Los datos resultantes sugieren que la medida de la survivina puede ayudar en la diagnosis precoz del cáncer de vejiga, determina la prognosis en múltiples tipos de cáncer y predice la respuesta a diversas terapias anti-cáncer. Zeis, Siegel y col. (2003) demostraron que las CTL específicas de survivina humana generadas a partir de PBMC por estimulación con células dendríticas autólogas transfectadas con ARN-survivina eran citotóxicas para un rango de líneas de células malignas hematopoyéticas y células tumorales primarias aisladas de pacientes con leucemia mieloide aguda (ver Zeis, M., S. Siegel y col. (2003), “Generation of cytotoxic responses in mice and human individuals against hematological malignancies using survivin-RNA-transfected dendritic cells”, J Immunol 170(11): 5391-7). También se demostró que la vacunación de ratones con células dendríticas y transfectadas con ARN-survivina condujo a una resistencia a largo plazo del reto con linfoma que expresa survivina, demostrando el potencial de la survivina como un Ag de rechazo tumoral.

En el contexto de esta invención, el ARNm que codifica Survivina consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 6 (SEQ ID NO: 20).

Además, un ARNm de la composición codifica NY-ESO-1. “NY-ESO-1” es un antígeno 1B de cáncer/testículo. Chen, Scanlan y col. (1997) reportaron la expresión de ARNm de NY-ESO-1 en varios tumores humanos mediante RT-PCR en melanoma 23/67, cáncer de ovario 2/8, cáncer de mama 10/33, cáncer de tiroides 2/5, cáncer de próstata 4/16, cáncer de vejiga 4/5, cáncer de colon 0/16, linfoma de Burkitt 1/2, glioma 0/15, carcinoma de células basales 0/2, cáncer gástrico 0/12, leiomiosarcoma 0/2, cáncer de pulmón 2/12, otros sarcomas 0/2, cáncer renal 0/10, cáncer pancreático 0/2, linfoma 0/10, seminoma 0/1, hepatoma 2/7, tumor de médula espinal 0/1 (ver Chen, Y. T., M. J. Scanlan y col. (1997), “A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening”, Proc Natl Acad Sci U S A 94(5): 1914-8). Jager, Karbach y col. (2006) reportaron que NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer/testículo expresado en diversos tumores malignos humanos y que se están desarrollando diversas estrategias de vacunación que fijan como diana NY-ESO-1 (ver Jager, E., J. Karbach y col. (2006), “Recombinant vaccinia/fowlpox NY-ESO-1 vaccines induce both humoral and cellular NY-ESO-1-specific immune responses in cancer patients,” Proc Natl Acad Sci USA 103(39): 14453-8). En el estudio presentado, la seguridad e inmunogenicidad de la vaccinia-NY-ESO-1 recombinante y fowlpox-NY-ESO-1 recombinante se analizaron en una serie de 36 pacientes con diferentes tipos tumorales. Cada constructo primero se sometió a prueba individualmente en dos niveles de dosis diferentes y después en una configuración cebador-refuerzo con la vacinia-NY-ESO-1 recombinante, seguido por fowlpox-NY-ESO-1 recombinante. Las vacunas fueron bien toleradas individual o conjuntamente. Las respuestas del anticuerpo específico de NY-ESO-1 y/o las respuestas de las células T CD8 y CD4 específicas dirigidas contra una amplia gama de epítopos NY-ESO-1 se indujeron durante al menos cuatro vacunaciones en intervalos mensuales en una alta proporción de pacientes. Los clones de células T CD8 derivados de cinco pacientes vacunados demostraron lisar células de melanoma que expresan NY-ESO-1 diana. En varios pacientes con melanoma, hubo una fuerte impresión de que el curso natural de la enfermedad se veía influido favorablemente por la vacunación. Davis, Chen y col. (2004) reportaron que los péptidos NY-ESO-1 restringidos HLA-A2 inyectados intradérmicamente demostraron ser seguros e inmunogénicos (Davis, I. D., W. Chen y col. (2004), “Recombinant NY-ESO-1 protein with ISCOMATRIX adjuvant induces broad integrated antibody and CD4(+) and CD8(+) T cell responses in humans”, Proc Natl Acad Sci USA 101(29): 10697-702). Aunque estos ensayos se diseñaron solo para determinar la seguridad e inmunogenicidad, algunos pacientes mostraron una regresión tumoral o la estabilización de la enfermedad. Jager, Gnjatic y col. (2000) indicaron además que se observó una respuesta inmunitaria específica de NY-ESO-1 amplia que incluye respuestas de anticuerpo y células T CD4 y CD8 después de la inmunización con la proteína Ny -ESO-1 recombinante combinada con el adyuvante ISCo Ma TRIX (CSL Ltd., Parkville, Victoria, Australia) en pacientes extirpados de melanoma que expresa NY-ESO-1 (ver Jager, E., S. Gnjatic y col. (2000), “ Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptidevaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers”, Proc Natl Acad Sci USA 97(22): 12198-203). Esta respuesta inmunitaria a la vacuna parecía estar asociada a una supervivencia sin enfermedad prolongada. Además, Odunsi, Qian y col. (2007) reportaron que la vacunación con un péptido NY-ESO-1 induce respuestas humorales y de células T integradas en el cáncer de ovario (ver Odunsi, K., F. Qian y col. (2007), “Vaccination with an NY-ESO-1 peptide of HLA class I/II specificities induces integrated humoral and T cell responses in ovarian cancer”, Proc Natl Acad Sci U S A 104(31): 12837-42).

En el contexto de esta invención, el ARNm que codifica un antígeno NY-ESO-1 consiste en una secuencia tal como se muestra en la Figura 10 (SEQ iD NO: 21).

Además, un ARNm de la composición codifica MAGE-C1. “MAGE-C1” es el antígeno C1 de la Familia antígenos de melanoma. Lucas, De Smet y col. (1998) identificaron recientemente MAGE-C1 mediante RDA (ver Lucas, S., C. De Smet y col. (1998), “ Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression by representational difference analysis”, Cancer Res 58(4): 743-52). El MAGE-C1 no se expresó en un panel de tejidos normales sometidos a prueba, con la excepción de los testículos. Entre las muestras tumorales, con frecuencia se expresaba MAGE-C1 en seminomas, melanomas y carcinomas de vejiga. También se expresó en una fracción significativa de carcinomas de cabeza y cuello, carcinomas de mama, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinomas de próstata y sarcomas. Jungbluth, Chen y col. (2002) describieron la expresión en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de testículos, cáncer de vejiga, melanoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas (39%) (ver Jungbluth, A. A., Y. T. Chen y col. (2002), “CT7 (MAGE-C1) antigen expression in normal and neoplastic tissues”, Int J Cancer 99(6): 839-45). Gure, Chua y col. (2005) analizaron tumores de 523 pacientes de cancer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en relación a la expresión de antígenos de cáncer testiscular (ver Gure, A. O., R. Chua y col. (2005), “Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer”, Clin Cancer Res 11(22): 8055-62). El MAGE-C1 estaba presente en el 18,8%. Scanlan, Altorki y col. (2000) reportaron además la expresión de los antígenos CT en 33 cánceres de pulmón de células no pequeñas: MAGE-C1: 30% (ver Scanlan, M. J., N. K. Altorki y col. (2000), “Expression of cancer-testis antigens in lung cancer: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9”, Cancer Lett 150(2): 155-64).

En el contexto de esta invención, el ARNm que codifica el antígeno MAGE-C1 consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 14 (SEQ ID n O: 22).

Además, un ARNm de la composición codifica MAGE-C2. “MAGE-C2” es el antígeno C2 de la Familia antígenos de melanoma. Lucas, De Plaen y col. (2000) han identificado recientemente MAGE-C2 por RDA en una línea celular de melanoma (ver Lucas, S., E. De Plaen y col. (2000), “MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, and MAGE-C3: four new members of the MAGE family with tumor-specific expression”, Int J Cancer 87(1): 55-60). MAGE-C2 no se expresó en un panel de tejidos normales sometidos a prueba, con excepción de los testículos. Entre las muestras tumorales, MAGE-C2 se expresaba frecuentemente en seminomas, melanomas y carcinomas de vejiga. También se expresó en una fracción significativa de carcinomas de cabeza y cuello, carcinomas de mama, carcinomas de células no pequeñas y sarcomas. Scanlan, Altorki y col. (2000) reportaron la expresión de antígenos CT en 33 cánceres de pulmón de células no pequeñas: MAGE-C2: 30% (ver Scanlan, M. J., N. K. Altorki y col. (2000), “Expression of cancer-testis antigens in lung cáncer: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9.” Cáncer Lett 150(2): 155-64).

En el contexto de esta invención, el ARNm que codifica MAGE-C2 consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 19 (SEQ ID NO: 23).

Finalmente, un ARNm de la composición codifica adicionalmente MUC1. “MUC1” es mucina 1. Las mucinas asociadas al cáncer se cree que promueven la metástasis facilitando la adhesión de células malignas a la superficie de células endoteliales. De acuerdo con Denda-Nagai e Irimura (2000) (Denda-Nagai, K. y T. Irimura (2000), “MUC1 in carcinoma-host interactions”, Glycoconj J 17(7-9): 649-58) MUC-1 se sobreexpresa en un 90% de todos los adenocarcinomas, incluyendo de mama, de pulmón, de páncreas, de próstata, de estómago, de colon y de ovario. Kontani, Taguchi y col. (2001) encontraron que se había descubierto una expresión de MUC-1 en un 60% de cánceres de pulmón (ver Kontani, K., O. Taguchi y col. (2001), “Modulation of MUC1 mucin as an escape mechanism of breast cancer cells from autologous cytotoxic T-lymphocytes”, Br J Cancer 84(9): 1258-64), mientras que Kontani, Taguchi y col. (2003) encontraron, en un estudio que analiza el uso de DC pulsada con los antígenos MUC1 para inducir inmunidad celular en cánceres positivos a MUC1, que clínicamente siete de nueve pacientes positivos de MUC-1 respondieron al tratamiento con una reducción de los niveles de marcadores tumorales o con la desaparición de la efusión pleural maligna (ver Kontani, K., O. Taguchi y col. (2003), “Dendritic cell vaccine immunotherapy of cancer targeting MUC1 mucin”, Int J Mol Med 12(4): 493-502). Tres de estos pacientes que respondieron tenían NSCLC. Palmer, Parker y col. (2001) reportaron que, en un ensayo clínico fase I usando el péptido MUC1 en NSCLC en etapa III/IV, se estableció la seguridad y tolerabilidad de este agente (ver Palmer, M., J. Parker y col. (2001), “Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy un stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer”, Clin Lung Cancer 3(1): 49-57; discussion 58). Cinco de 12 pacientes (42%) tuvieron respuestas inmunológicas y 4 de 12 pacientes (33%) lograron estabilizar la enfermedad. Wierecky, Mueller y col. (2006) identificaron además dos nuevos péptidos 9-mer de unión a HLA-A2 del TAA MUC1, que se sobreexpresa en varias afecciones malignas hematológicas y epiteliales (ver Wierecky, J., M. Mueller y col. (2006), “Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1”, Cancer Immunol Immunother 55(1): 63-7). Las células T citotóxicas generadas después del pulsado DC con estos péptidos era capaz de inducir la lisis de células tumorales que expresan MUC1 en una forma específica de antígeno y restringida de HLA. En dos estudios clínicos, se demostró que la vacunación de pacientes con cáncer avanzado usando DC pulsadas con péptidos derivados de MUC1 era bien tolerada, sin efectos secundarios serios, y era capaz de inducir respuestas inmunológicas. De 20 pacientes con carcinoma de células renales metastásico, 6 pacientes presentaron una regresión de la metástasis con 3 respuestas objetivas (1 CR, 2 PR).

En el contexto de esta invención, el ARNm que codifica el antígeno MUC1 consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 23 (SEQ ID NO: 24).

En el contexto de la presente descripción, cuando se hace referencia a los antígenos o fragmentos, epítopos o variantes de los mismos, se entiende que la referencia se refiere al antígeno o péptido codificado por una o más de las secuencias de ARNm proporcionadas en la presente invención. Además, los antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen anteriormente que son codificados por al menos un ARNm de la composición aquí descrita pueden comprender fragmentos o variantes de esas secuencias. Tales fragmentos o variantes pueden comprender típicamente una secuencia con una homología de secuencia con uno de los antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos arriba mencionados o con sus secuencias o sus secuencias codificantes de ácidos nucleicos de al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de manera preferente al menos un 70%, de manera más preferente al menos un 80%, de manera especialmente preferente al menos un 85%, aun de manera más preferente al menos un 90% y de manera particularmente preferente al menos un 95% o un 97% con la secuencia de tipo natural completa, ya sea a nivel de ácido nucleico o a nivel de aminoácido.

“Fragmentos” de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos en el contexto de la presente descripción pueden comprender una secuencia de un antígeno, proteína antigénica o péptido antigénico como se define anteriormente que, con respecto a su secuencia de aminoácidos (o su secuencia de ácido nucleico codificada), es N-terminal, C-terminal está truncada intra-secuencialmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína original (nativa) (o su secuencia de ácidos nucleicos codificada). Tal truncamiento puede estar así presente a nivel de aminoácido o correspondientemente a nivel de ácido nucleico. Por tanto, una homología de secuencia con respecto a tal fragmento como se define anteriormente puede referirse preferentemente al antígeno, la proteína antigénica o el péptido antigénico completo como se define anteriormente o a la secuencia de ácido nucleico completa (de codificación) de tal antígeno, proteína antigénica o péptido antigénico.

Los fragmentos de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos en el contexto de la presente descripción pueden comprender además una secuencia de antígeno, proteína antigénica o péptido antigénico como se define anteriormente con una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 o más aminoácidos, por ejemplo fragmentos tal como son procesados y presentados por las moléculas MHC clase I que preferentemente tienen una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9, o 10 (o aún 6, 7, 11, o 12 aminoácidos), o fragmentos tal como son procesados y presentados por las moléculas MHC clase II que, preferentemente, tienen una longitud de aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más aminoácidos, pudiendo seleccionarse estos fragmentos de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos son reconocidos típicamente por las células T en forma de un complejo consistente en el fragmento de péptido y una molécula MHC, es decir los fragmentos típicamente no son reconocidos en su forma nativa.

Los fragmentos de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen aquí también pueden comprender epítopos de esos antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos. Los epítopos (también llamados “determinantes antigénicos”) en el contexto de la presente descripción son típicamente fragmentos situados en la superficie exterior de los antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos (nativos) como se definen aquí, preferentemente con 5 a 15 aminoácidos, de manera más preferente 5 a 12 aminoácidos, de manera aún más preferente 6 a 9 aminoácidos, que pueden ser reconocidos por los anticuerpos o receptores de células B, es decir en su forma nativa. Tales epítopos de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos se pueden seleccionar adicionalmente de cualquiera de las variantes mencionadas aquí de tales antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos. En este contexto, los determinantes antigénicos pueden ser epítopos conformacionales o discontinuos que se componen de segmentos de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen aquí que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos de los antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen aquí, pero que conjuntamente se conforman en la estructura tridimensional o continua o en epítopos lineales, compuestos por una sola cadena polipeptídica. “Variantes” de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen arriba pueden estar codificadas por al menos un ARNm de la composición aquí descrita, donde los nucleótidos del al menos un ARNm que codifica el antígeno, la proteína antigénica o el péptido antigénico como se define en lo anterior están intercambiados. Así, un antígeno, una proteína antigénica o un péptido antigénico se puede generar con una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia original en una o más mutaciones, tal como uno o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Preferentemente, estos fragmentos y/o variantes tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con el antígeno nativo o la proteína antigénica de longitud completa, por ejemplo su propiedad antigénica específica.

Al menos un ARNm de la composición aquí descrita también puede codificar un antígeno o una proteína antigénica como se define anteriormente donde la secuencia de aminoácidos codificada comprende una sustitución(es) de aminoácido conservadora en comparación con su secuencia fisiológica. Esas secuencias de aminoácidos codificadas, así como sus secuencias de nucleótidos de codificación en particular, están bajo el término “variantes” como se define anteriormente. Las sustituciones originadas por aminoácidos de la misma clase que se intercambian se denominan sustituciones conservadoras. En particular, éstos son aminoácidos con cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, con grupos aromáticos en cadenas laterales o en los aminoácidos, cadenas laterales que pueden conformar puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales con una función hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo, un aminoácido con una cadena lateral polar se reemplaza por otro aminoácido que tiene una cadena lateral polar similar o, por ejemplo, un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrofóbica se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral hidrofóbica similar (por ejemplo, serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Son posibles inserciones y sustituciones, en particular en tales posiciones de secuencia que no provocan una modificación de la estructura tridimensional o no afectan a la región de unión. Las modificaciones de una estructura tridimensional por inserción(es) o deleción(es) se pueden determinar fácilmente, por ejemplo usando espectrocopía CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polipeptides, en: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger y col. (ed.), Elsevier, Ámsterdam).

Además, las variantes de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen anteriormente, que pueden estar codificados por al menos un ARNm de la composición aquí descrita también pueden comprender secuencias donde los ácidos nucleicos del al menos un ARNm se han intercambiado de acuerdo con la degeneración del código genético sin conducir a una alteración de la secuencia de aminoácidos del antígeno, proteína antigénica o péptido antigénico respectiva, es decir la secuencia de aminoácidos o al menos parte de la misma pueden no diferir de la secuencia original en una o más mutación(es) dentro del significado anterior.

Además, las variantes de antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen anteriormente que pueden ser codificadas por el al menos un ARNm de la composición aquí descrita también pueden comprender aquellas secuencias de ADN que corresponden a una secuencia de ARN como se define aquí y comprende secuencias de ARN adicionales que corresponden a las secuencias de ADN como se definen aquí. El experto en la técnica está familiarizado con la traducción de una secuencia de ARN en una secuencia de ADN (o viceversa) o con la creación de la hebra de secuencia complementaria (es decir por sustitución de los residuos U con residuos T y/o construcción de la hebra complementaria respecto a una secuencia dada).

Con el fin de determinar el porcentaje al cual dos secuencias (secuencias de ácido nucleico, por ejemplo secuencias de ARN o ARNm como se definen aquí, o secuencias de aminoácidos, preferentemente sus secuencias de aminoácidos codificadas, por ejemplo las secuencias de aminoácidos de los antígenos, proteínas antigénicas o péptidos antigénicos como se definen anteriormente) son idénticas, las secuencias se pueden alinear para ser comparadas entre sí. Así, por ejemplo, se pueden insertar espacios en la secuencia de la primera secuencia y se puede comparar el componente en la posición correspondiente de la segunda secuencia. Si una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo componente que en una posición en la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esta posición. El porcentaje al cual dos secuencias son idénticas es función del número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones. El porcentaje al cual dos secuencias son idénticas se puede determinar usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferente, pero no limitativo, de algoritmo matemático que se puede usar es el algoritmo de Karlin y col. (1993), PnAs USA, 90:5873-5877, o de Altschul y col. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Tal algoritmo está integrado en el programa BLAST. Las secuencias que son idénticas a las secuencias de la presente descripción en un cierto grado pueden identificarse mediante este programa.

Tal como se usa aquí, el término “composición” se refiere a al menos seis ARNm como se definen en las reivindicaciones y, opcionalmente, excipientes adicionales. La composición contiene al menos seis especies distintas de ARNm, donde cada especie de ARNm codifica uno de los antígenos anteriores. Preferentemente, el término “composición” se refiere los al menos seis ARNm junto con al menos otra sustancia adecuada. En general, la composición puede ser una composición farmacéutica, que se diseña para el uso en el campo médico. Por consiguiente, la composición comprende típicamente al menos un excipiente adicional que es farmacéuticamente aceptable y que se puede seleccionar, por ejemplo, de portadores, vehículos y similares. La “composición” puede ser una composición líquida o seca. Si la composición es líquida, preferentemente será una solución o dispersión acuosa de los menos seis ARNm. Si la “composición” es una composición seca, será típicamente una composición liofilizada de los al menos seis ARNm. El término “composición” tal como se usa aquí se refiere además a los al menos seis ARNm definidos en las reivindicaciones en combinación con un ingrediente activo adicional. De manera preferente, la composición es una composición inmunoestimuladora, es decir una composición que comprende al menos un componente capaz de inducir una respuesta inmunitaria o de la cual se deriva un componente es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En este contexto, la respuesta inmunitaria puede ser resultado del sistema inmunitario adaptivo y/o innato.

La composición para su uso de acuerdo con la presente invención comprende seis ARNm que codifican al menos seis antígenos como se define en las reivindicaciones, ya que se encontró que la combinación específica de dichos antígenos es capaz de estimular de manera efectiva el sistema inmunitario (adaptivo), permitiendo así el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico.

En resumen, el objeto de la presente invención se resuelve proporcionando una composición que comprende seis ARNm que codifican una combinación novedosa de antígenos como se definen aquí. La composición comprende los seis antígenos (5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG), Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral; BIRC5), NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York, CTAG1B), MAGE-C1 (Familia de antígenos de melanoma C1), MAGE-C2 (Familia de antígenos de melanoma C2), y MUC1 (Mucina 1)) que son codificados por seis ARNm monocistrónicos como se definen en las reivindicaciones, cada uno de estos ARNm codificando un antígeno diferente seleccionado del grupo definido de antígenos. En una realización no reivindicada también descrita aquí, la composición puede comprender una combinación de ARNm monocistrónicos, bi- y/o multicistrónicos, donde más de uno de los seis antígenos es codificado por un ARNm bi- o multicistrónico. De acuerdo con realizaciones no reivindicadas aquí descritas, cualquiera combinación de ARNm mono-, bio multicistrónicos se considera que codifica los seis antígenos como se definen aquí, por ejemplo tres ARNm bicistrónicos cada uno codificando dos de los seis antígenos anteriores o dos ARNm bicistrónicos y dos monocistrónicos.

De acuerdo con una realización no reivindicada, la composición comprende al menos un ARNm que comprende al menos una secuencia de codificación seleccionada de secuencias de ARN que son idénticas o al menos un 80% idénticas a la secuencia de ARN de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 o 17. De manera aún más preferente, la composición comprende seis ARNm donde la secuencia de codificación en cada ARNm es idéntica o al menos un 80% idéntica a una de las secuencias de ARN de acuerdo con las SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 y 17.

De acuerdo con la invención, cada uno de los al menos seis antígenos de la composición para su uso según la presente invención es codificado por un ARNm (monocistrónico) como se define en las reivindicaciones. En otras palabras, la composición para su uso según la presente invención contiene seis ARNm (monocistrónicos), donde cada uno de estos seis ARNm (monocistrónicos) codifica solo un antígeno como se define en las reivindicaciones.

En una realización preferente, la composición comprende seis ARNm como se define en las reivindicaciones, donde un ARNm codifica 5T4 (de acuerdo con la SEQ ID NO: 75), un ARNm codifica Survivina (de acuerdo con la SEQ ID NO: 76 o 77), un ARNm codifica NY-ESO-1 (de acuerdo con la SEQ ID NO: 78), un ARNm codifica MAGE-C1 (de acuerdo con la SEQ ID NO: 79), un ARNm codifica MAGE-C2 (de acuerdo con la SEQ ID NO: 80) y un ARNm codifica MUC1 (de acuerdo con la SEQ ID NO: 82), respectivamente.

En una realización no reivindicada, la composición comprende seis ARNm en donde un ARNm codifica 5T4 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 2, un ARNm codifica Survivina y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 5, un ARNm codifica NY-ESO-1 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 8, un ARNm codifica MAGE-C1 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 11, un ARNm codifica MAGE-C2 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 14 y un ARNm codifica MUC1 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:17 (o fragmentos o variantes de cada una de etas secuencias) y opcionalmente excipientes adicionales.

En una realización no reivindicada, la composición comprende seis ARNm donde un ARNm codifica 5T4 y comprende la secuencia de codificación de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, un ARNm codifica Survivina y comprende la secuencia de codificación de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, un ARNm codifica NY-ESO-1 y comprende la secuencia de codificación de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, un ARNm codifica MAGE-C1 y comprende la secuencia de codificación de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, un ARNm codifica MAGE-C2 y comprende la secuencia de codificación de acuerdo con la SEQ ID NO: 14 y un ARNm codifica MUC1 y comprende la secuencia de codificación de acuerdo con la SEQ ID NO:17 o fragmentos de los mismos, respectivamente.

De acuerdo con una realización aquí descrita, el al menos un ARNm de la composición comprende un tallobucle de histona en la región 3' u Tr .

De acuerdo con otra realización no reivindicada, la composición aquí descrita puede comprender (al menos) un ARNm bi- o multicistrónico, es decir (al menos) un ARNm que lleva la secuencia de codificación de dos o más de los seis antígenos de acuerdo con la presente descripción. Tales secuencias de codificación de dos o más antígenos del (al menos) un ARNm bi- o multicistrónico pueden estar separadas por al menos una secuencia IRES (de sitio de entrada ribosómico interno), como se define a continuación. Así, el término “que codifica dos o más antígenos” puede significar, sin limitarse a, que el (al menos) un ARNm (bi- o multicistrónico) puede codificar por ejemplo al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis de los antígenos (preferentemente diferentes) mencionados anteriormente o sus fragmentos o variantes dentro de las definiciones anteriores. De manera más preferente, sin limitarse a, el (al menos) un ARNm (bi- o multicistrónico) puede codificar por ejemplo al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis de los antígenos (de manera preferente diferentes) mencionados anteriormente o sus fragmentos o variantes dentro de las definiciones anteriores. En este contexto, la llamada secuencia IRES (sitio de entrada ribosómico interno) como se define anteriormente puede funcionar como un solo sitio de unión a ribosoma, pero también puede servir para proporcionar un ARNm bi- o multicistrónico como se define anteriormente que codifica varias proteínas, las cuales serán traducidas por los ribosomas independientemente entre sí. Ejemplos de secuencias IRES que se pueden usar de acuerdo con la presente descripción son aquellas de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), virus de la polio (PV), virus de encefalomiocarditis (ECMV), virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la fiebre porcina clásico (CSFV), virus de leucoma de ratón (MLV), virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).

De acuerdo con otra realización particularmente preferente, la composición para su uso según la presente invención puede comprender una mezcla de al menos seis ARNm monocistrónicos como se definen en las reivindicaciones y al menos un ARNm bi- o multicistrónico como se define anteriormente. Los al menos seis ARNm monocistrónicos y/o el al menos un ARNm bi- o multicistrónico preferentemente codifican diferentes antígenos o sus fragmentos o variantes dentro de las definiciones anteriores. Sin embargo, los al menos seis ARNm monocistrónicos y el al menos un ARNm bi- o multicistrónico preferentemente también pueden codificar (en parte) antígenos idénticos seleccionados de los antígenos mencionados anteriormente, con la condición de que la composición aquí descrita como un todo proporcione los seis antígenos definidos anteriormente. Proporcionando múltiples copias de uno o más de los antígenos, la cantidad relativa de proteínas del uno o más antígenos pueden incrementarse, es decir, la proporción entre la cantidad de cada uno de los seis antígenos se puede modular. Tal realización puede ser además ventajosa, por ejemplo para una administración escalonada, por ejemplo dependiente del tiempo, de la composición aquí descrita a un paciente que la necesite. Los componentes de tal composición aquí descrita, en particular los diferentes ARNm que codifican los al menos seis antígenos, pueden estar contenidos en (diferentes partes de) un de kit de partes de la composición o pueden por ejemplo administrarse separadamente como componentes de diferentes composiciones para su uso de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, al menos un ARNm de la composición que codifica al menos uno de los seis antígenos típicamente tiene una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 20.000 o de 100 a aproximadamente 20.000 nucleótidos, de manera preferente de aproximadamente 250 a aproximadamente 20.000 nucleótidos, de manera más preferente de aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000, de manera aún más preferente de aproximadamente 500 a aproximadamente 5.000.

De acuerdo con una realización aquí descrita, al menos un ARNm de la composición que codifica los seis antígenos puede estar en forma de un ARN modificado, donde cualquier modificación, como se define aquí, se puede introducir en el ARNm de la composición. Las modificaciones como se definen aquí preferentemente conducen a un ARNm estabilizado de la composición.

De acuerdo con una realización aquí descrita, al menos un ARNm de la composición se puede proporcionar así como un “ARNm estabilizado”, es decir como un ARNm que es esencialmente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo por una exo- o endo-nucleasa). Tal estabilización se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un esqueleto fosfato modificado de al menos un ARNm de la composición aquí descrita. Una modificación de esqueleto en relación con la presente descripción es una modificación en la que los fosfatos del esqueleto de los nucleótidos contenidos en el ARNm están químicamente modificados. Los nucleótidos que pueden emplearse preferentemente a este respecto contienen, por ejemplo, un esqueleto fosfato modificado con fosforotioato, preferentemente al menos uno de los oxígenos fosfato contenidos en el esqueleto fosfato se ha reemplazado por un átomo de azufre. Los ARNm estabilizados pueden incluir además, por ejemplo: análogos fosfato no iónicos, por ejemplo alquil-y aril-fosfonatos, donde el oxígeno fosfonato cargado se reemplaza por un grupo alquilo o arilo, o fosfodiésteres y alquilfosfotriésteres, donde el residuo oxígeno cargado está presente en forma alquilada. Tales modificaciones de esqueleto incluyen típicamente, sin implicar ninguna limitación, modificaciones del grupo consistente en metilfosfonatos, fosforoamidatos y fosforotioatos (por ejemplo citidina-5'-O-(1-tiofosfato)).

Adicional o alternativamente, el al menos un ARNm de la composición aquí descrita puede también contener modificaciones de azúcar. Una modificación de azúcar en relación con la presente descripción es una modificación química del azúcar de los nucleótidos del al menos un ARNm e incluye típicamente, sin implicar ninguna limitación, modificaciones de azúcar seleccionadas del grupo consiste en 2'-desoxi-2'-fluorooligoribonucleótido (2'-fluor-2'-desoxicitidin-5'-trifosfato, 2'-fluor-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-deamina-oligoribonucleótido (2'-amino-2'-desoxicitidin-5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato), 2'-O-alquil-oligoribonucleótido, 2'-desoxi-2'-C-alquil-oligoribonucleótido (2'-O-metilcitidin-5'-trifosfato, 2'-metiluridin-5'-trifosfato), 2'-C-alquil-oligoribonucleótido e isómeros de los mismos (2'-aracitidin-5'-trifosfato, 2'-arauridin-5'-trifosfato) o azidotrifosfato (2'-azido-2'-desoxicitidin-5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato).

Adicional o alternativamente, al menos un ARNm de la composición aquí descrita también puede contener al menos una modificación de base, preferentemente adecuada para incrementar la expresión de la proteína codificada en comparación con la secuencia de ARNm no alterada, es decir natural (= nativa). Significativo en este caso significa un incremento en la expresión de la proteína, en comparación con la expresión de la secuencia de ARNm nativa, de al menos un 20%, de manera preferente al menos un 30%, 40%, 50% o 60%, de manera más preferente de al menos un 70%, 80%, 90% o aún del 100% y con total preferencia de al menos un 150%, 200% o incluso un 300% o más. En relación con la presente descripción, un nucleótido que tiene tal modificación de base se selecciona preferentemente del grupo de nucleótidos modificados en base consistente en 2-amino-6-cloropurinaribosido-5'-trifosfato, 2-aminoadenosin-5'-trifosfato, 2-tiocitidin-5'-trifosfato, 2-tiouridin-5'-trifosfato, 4-tiouridin-5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidin-5'-trifosfato, 5-aminoaliluridin-5'-trifosfato, 5-bromocitidin-5'-trifosfato, 5-bromouridin-5'-trifosfato, 5-iodocitidin-5'-trifosfato, 5-iodouridin-5'-trifosfato, 5-metilcitidin-5'-trifosfato, 5-metiluridin-5'-trifosfato, 6-azacitidin-5'-trifosfato, 6-azauridin-5'-trifosfato, 6-cloropurinaribosido-5'-trifosfato, 7-deazaadenosin-5'-trifosfato, 7-deazaguanosin-5'-trifosfato, 8-azaadenosin-5'-trifosfato, 8-azidoadenosin-5'-trifosfato, benzimidazolribosido-5'-trifosfato, N1-metiladenosin-5'-trifosfato, N1-metilguanosin-5'-trifosfato, N6-metiladenosin-5'-trifosfato, O6-metilguanosin-5'-trifosfato, pseudouridin-5'-trifosfato o puromicin-5'-trifosfato, xantosin-5'-trifosfato. Se da particular preferencia a los nucleótidos para las modificaciones de base seleccionados del grupo de nucleótidos modificados en base consistenye en 5-metilcitidin-5'-trifosfato, 7-deazaguanosin-5'-trifosfato, 5-bromocitidin-5'-trifosfato y pseudouridin-5'-trifosfato.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, también al menos un ARNm de la composición puede modificarse (y preferentemente estabilizarse) introduciendo nucleótidos modificados adicionales que contienen modificaciones de sus partes ribosa o base. En general, al menos un ARNm de la composición aquí descrita puede contener cualquier nucleótido nativo (= de origen natural), por ejemplo guanosina, uridina, adenosina y/o citidina o un análogo de los mismos. A este respecto, los análogos de nucleótidos se definen como variantes de origen no nativo de nucleótidos de origen natural. Por consiguiente, los análogos son nucleótidos químicamente derivados con grupos funcionales de origen no nativo, que preferentemente se añaden a o se eliminan del nucleótido de origen natural o que sustituyen los grupos funcionales que naturalmente están presentes en un nucleótido. Por consiguiente, cada componente del nucleótido de origen natural puede ser modificado, esto es el componente base, el componente azúcar (ribosa) y/o el componente fosfato que forma el esqueleto (ver arriba) de la secuencia de ARN. Los análogos de guanosina, uridina, adenosina y citidina incluyen, sin implicar ninguna limitación, cualquier guanosina uridina, adenosina y citidina de origen natural o no natural que se ha alterado químicamente, por ejemplo por acetilación, metilación, hidroxilación, etc., incluyendo 1-metiladenosina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2,6-diaminopurina, 2'-amino-2'-desoxiadenosina, 2'-amino-2'-desoxicitidina, 2'-amino-2'-desoxiguanosina, 2'-amino-2'-desoxiuridina, 2-amino-6-cloropurinaribosido, 2-aminopurina-ribósido, 2'-araadenosina, 2'-aracitidina, 2'-arauridina, 2'-azido-2'-desoxiadenosina, 2'-azido-2'-desoxicitidina, 2'-azido-2'-desoxiguanosina, 2'-azido-2'-desoxiuridina, 2-cloroadenosina, 2'-fluor-2'-desoxiadenosina, 2'-fluor-2'-desoxicitidina, 2'-fluor-2'-desoxiguanosina, 2'-fluor-2'-desoxiuridina, 2'-fluorotimidina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 2-metil-tio-N6-isopentenil-adenosina, 2'-O-metil-2-aminoadenosina, 2'-O-metil-2'-desoxiadenosina, 2'-O-metil-2'-desoxicitidina, 2'-O-metil-2'-desoxiguanosina, 2'-O-metil-2'-desoxiuridina, 2'-O-metil-5-metiluridina, 2-O-metilinosina, 2'-O-metilpseudouridina, 2-tiocitidina, 2-tiocitidina, 3-metilcitidina, 4-acetilcitidina, 4-tiouridina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5,6-dihidrouridina, 5-aminoalilcitidina, 5-aminoalil-desoxiuridina, 5-bromouridina, 5-carboximeilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilamonometil-uracilo, 5-cloro-aracitosina, 5-fluorouridina, 5-iodouridina, 5-metoxicarbonilmetil-uridina, 5-metoxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 6-azacitidina, 6-azauridina, 6-cloro-7-deazaguanosina, 6-cloropurinaribosido, 6-mercaptoguanosina, 6-metil-mercaptopurina-ribosido, 7-deaza-2'-desoxiguanosina, 7-deazaadenosina, 7-metilguanosina, 8-azaadenosina, 8-bromoadenosina, 8-bromoguanosina, 8-mercaptoguanosina, 8-oxoguanosina, benzimidazol-ribósido, Beta-D-manosilqueosina, dihidrouracilo, inosina, N1-metiladenosina, N6-([6-aminohexil]carbamoilmetil)adenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-metiladenosina, N7-metilxantosina, N-uracilo-5-oxiacetato de metilo, puromicina, queosina, ácido uracil-5-oxiacético, uracilo-5-oxiacetato de metilo, wibutoxosina, xantosina y xiloadenosina. El experto en la materia conoce la preparación de tales análogos, por ejemplo de las patentes US N° 4.373.071, US 4.401.796, US 4.415.732, US 4.458.066, US 4.500.707, US 4.668.777, US 4.973.679, US 5.047.524, US 5.132.418, US 5.153.319, US 5.262.530 y 5.700.642. En el caso de un análogo como se describe anteriormente, puede darse particular preferencia a aquellos análogos que incrementan la inmunogenidad del ARNm de la composición aquí descrita y/o que no interfieren con una modificación adicional del ARNm que se haya introducido.

De acuerdo con una realización particular aquí descrita, al menos un ARNm de la composición puede contener una modificación de lípidos. Tal ARNm modificado con lípidos comprende típicamente un ARNm como se define aquí que codifica uno de los seis antígenos como se define anteriormente. Tal ARNm modificado con lípidos comprende típicamente además al menos un enlazante unido covalentemente con ese ARNm y al menos un lípido unido covalentemente con el enlazante respectivo. Alternativamente, el ARNm modificado con lípidos comprende un ARNm (al menos uno) como se define aquí y al menos un lípido (bifuncional) unido covalentemente (sin enlazante) con ese ARNm. De acuerdo con una tercera alternativa, el ARNm modificado con lípidos comprende un ARNm como se define aquí, al menos un enlazante unido covalentemente a ese ARNm y al menos un lípido unido covalentemente al enlazante respectivo y también al menos un lípido (bifuncional) unido covalentemente (sin enlazante) a ese ARNm.

El lípido contenido en al menos un ARNm de la composición aquí descrita (complejado o unido covalentemente al mismo) es típicamente un lípido o un residuo lipofílico que, preferentemente, es biológicamente activo. Preferentemente tales lípidos incluyen sustancias naturales o compuestos tales como, por ejemplo, vitaminas, por ejemplo alfa-tocoferol (vitamina E), incluyendo RRR-alfa-tocoferol (anteriormente D-alfa-tocoferol), L-alfa-tocoferol, el racemato D,L-alfa-tocoferol, succinato de vitamina E (VES) o vitamina A y sus derivados, por ejemplo ácido retinoico, retinol, vitamina D y sus derivados, por ejemplo vitamina D y también los precursores ergoesterol de los mismos, vitamina E y sus derivados, vitamina K y sus derivados, por ejemplo vitamina K y compuestos de quinona o fitol relacionados, o esteroides, tales como ácidos biliares, por ejemplo ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido deshidrocólico, cortisona, digoxigenina, testosterona, colesterol o tiocolesterol. Otros lípidos o residuos lipofílicos dentro del alcance de la presente descripción incluyen, sin implicar ninguna limitación, polialquilenglicoles (Oberhauser y col., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), grupos alifáticos como, por ejemplo, alcanos C1-C20, alquenos C1-C20 o alcanoles C1-C20, etc., por ejemplo dodecanodiol, hexadecanol o residuos undecilo (Saison-Behmoaras y col., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov y col., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk y col., Biochimie, 1993, 75, 49), fosfolípidos tales como, por ejemplo, fosfatidilglicerol, diacilfosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, dihexadecil-rac-glicerol, esfingolípidos, cerebrósidos, gangliósidos, o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-racglicero-3-H-fosfonato (Manoharan y col., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea y col., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), poliaminas o polialquilenglicoles, por ejemplo polietilenglicol (p Eg ) (Manoharan y col., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), hexaetilenglicol (HEG), residuos de palmitina o palmitilo (Mishra y col., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229), octadecilaminas o residuos hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke y col., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), y también ceras, terpenos, hidrocarburos alicíclicos, residuos ácido graso saturado y mono- o poli-insaturado, etc.

Al menos un ARNm de la composición aquí descrita también puede estar estabilizado con el fin de prevenir la degradación del ARNm in vivo por varios procedimientos. Es conocido en la técnica que la inestabilidad y la degradación (rápida) del ARNm o del a Rn in vivo en general puede constituir un serio problema en la aplicación de las composiciones basadas en ARN. Esta inestabilidad del ARN se debe típicamente a las enzimas degradantes de ARN, “RNasas” (ribonucleasas), pudiendo degradar la contaminación con tales ribonucleasas a veces completamente el ARN en solución. Por consiguiente, la degradación natural del ARNm en el citoplasma de las células se regula muy finalmente y generalmente la contaminación con RNasas se puede eliminar mediante un tratamiento especial antes del uso de las composiciones, en particular con pirocarbonato de dietilo (DEPC). A este respecto, son conocidos diversos mecanismos de degradación natural en la técnica anterior que tambien pueden emplearse. Por ejemplo, la estructura terminal es típicamente de importancia crítica para un ARNm in vivo. Como ejemplo, en el extremo 5' de los ARNm de origen natural normalmente está presente una, así llamada, “estructura de terminación” (un nucleótido de guanosina modificado) y en el extremo 3' una secuencia de hasta 200 nucleótidos de guanosina (la llamada cola poli-A).

Así, al menos un ARNm de la composición aquí descrita puede estar estabilizado frente a la degradación por RNasas mediante la adición de una, así llamada, estructura “5'cap”. A este respecto, es particularmente preferente una m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A o G(5')ppp(5')G como estructura “5'cap”. Sin embargo, tal modificación se introduce solamente si una modificación, por ejemplo una modificación de lípidos, todavía no se ha introducido en el extremo 5' del ARNm de la composición aquí descrita o si la modificación no interfiere en las propiedades inmunogénicas del ARNm (no modificado o químicamente modificado). De acuerdo con una realización preferente aquí descrita, al menos un ARNm de la composición puede contener una cola poli-A en el terminal 3', típicamente de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos adenosina, de manera preferente de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos adenosina, de manera más preferente aproximadamente 40 a 80 nucleótidos adenosina o incluso de manera más preferente de aproximadamente 50 a 70 nucleótidos adenosina.

De acuerdo con una realización preferente adicional aquí descrita, al menos un ARNm de la composición puede contener una cola poli-C en el terminal 3', típicamente de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos citosina, de manera preferente de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos citosina, de manera más preferente aproximadamente 20 a 70 nucleótidos citosina o incluso de manera más preferente de aproximadamente 20 a 60 o aún de 10 a 40 nucleótidos citosina.

Al menos un ARNm de acuerdo con la presente descripción preferentemente comprende al menos un tallobucle de histona. En el contexto de la presente descripción, tal tallo-bucle de histona, en general (independientemente de si es un tallo-bucle de histona o no), se deriva típicamente de genes de histona y comprende un emparejamiento base intramolecular de dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas, formando así un tallo-bucle. Un tallo-bucle puede estar presente en un ADN o, más comúnmente, en un ARN monohebra.

En el contexto de la presente descripción, una secuencia tallo-bucle de histona se puede describir por su ADN o por su secuencia de ARN correspondiente. Así, cualquier referencia - en toda la presente descripción - a una secuencia tallo-bucle de histona, que se representa aquí por secuencias de ADN (por ejemplo SEQ ID NO: 38 a 67 y 71), también comprende la secuencia de ARN correspondiente. Esto se aplica en particular a las secuencias tallo-bucle de histona que están comprendidas en al menos un ARNm aquí descrito. Por consiguiente, la referencia a una secuencia de ADN específica que define un tallo-bucle de histona, también define la secuencia de ARN correspondiente.

La estructura también es conocida como horquilla o bucle- horquilla y normalmente consiste en un tallo y un bucle (terminal) dentro de una secuencia consecutiva, donde el tallo está formado por dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas separadas por una secuencia corta de tipo espaciador, lo cual conforma el bucle de la estructura tallo-bucle. Las dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas se pueden definir, por ejemplo, como elementos del tallo-bucle tallo1 y tallo2. El tallo-bucle se forma cuando estas dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas, por ejemplo los elementos del tallo-bucle tallo1 y tallo2, forman pares de bases entre sí, conduciendo a un tramo de secuencia de ácido nucleico de doble hebra que comprende un bucle no apareado en su extremo terminal formado por la secuencia corta situada entre los elementos del tallo-bucle tallo1 y tallo2 en la secuencia consecutiva. El bucle no emparejado de esta manera representa típicamente una región de ácido nucleico que no es capaz de emparejamiento de bases con cualquiera de estos elementos tallo-bucle. La estructura en forma “chupachups” resultante es un bloque constructivo clave de muchas estructuras secundarias del ARN. La formación de una estructura tallo-bucle es así dependiente de la estabilidad de las regiones de tallo y bucle resultantes, siendo el primer requisito típicamente la presencia de una secuencia que puede plegarse en sí misma para formar una doble hebra pareada. La estabilidad de los elementos tallo-bucle emparejados se determina por la longitud, el número de emparejamientos erróneos o desajustes que contiene (un pequeño número de emparejamientos erróneos típicamente es tolerable, especialmente en un tramo de hebra doble largo) y la composición de bases de la región pareada. En el contexto de la presente descripción, una longitud de bucle de 3 a 15 bases es concebible, una longitud de bucle preferente es 3-10 bases, de manera más preferente de 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6 o de manera aún más preferente de 4 a 5 bases, y con total preferencia de 4 bases. La secuencia que forma la región tallo-bucle de histona tiene típicamente una longitud de entre 5 a 10 bases, de manera más preferente entre 5 a 8 bases, donde preferentemente al menos una de las bases representa un emparejado erróneo, es decir no par de base.

En el contexto de la presente descripción, un tallo-bucle de histona se deriva típicamente de genes de histona (por ejemplo genes de las familias de histona H1, H2A, H2B, H3, H4) y comprende un emparejamiento de bases intramolecular de dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas, que forman así un tallo-bucle. Típicamente, un tallo-bucle de histona 3'UTR es un elemento de ARN implicado en el transporte nucleocitoplásmico de los ARNm de histona y en la regulación de la estabilidad y de la eficiencia de traducción en el citoplasma. Los ARNm de genes de histona de metazoo carecen de una poliadenilación y cola poli-A, en vez de en 3', el procesamiento se produce en un sitio entre este tallo-bucle altamente conservado y una región rica en purina de aproximadamente 20 nucleótidos aguas abajo (el elemento aguas abajo de histona o HDE). El tallo-bucle de histona se une a una proteína de unión de tallo-bucle de 31 kDa (SLBP - también llamada proteína de unión de horquilla de histona o HBP). Preferentemente, tales estructuras tallo-bucle de histona se emplean en la presente descripción en combinación con otros elementos y estructuras de secuencia que no están presentes naturalmente (esto es en organismos/células vivas no transformados) en genes de histona, pero se combinan - de acuerdo con la presente descripción - para proporcionar un ácido nucleico heterólogo artificial. Por consiguiente, la presente descripción proporciona una combinación artificial (no nativa) de una estructura tallo-bucle de histona con otros elementos de secuencia heterólogos que no están presentes naturalmente en genes de histona o genes de histona de metazoos y que se aíslan a partir de regiones de secuencia operacionales y/o reguladoras (que influyen en la transcripción y/o traducción) de genes que codifican para otras proteínas diferentes a las histonas, que proporcionan efectos ventajosos. Así, una realización aquí descrita proporciona la combinación de una estructura tallo-bucle de histona con una secuencia poli(A) o con una secuencia que representa una señal de poliadenilación (3' terminal de una región de codificación) que no está presente en genes de histona de metazoos. De acuerdo con otro aspecto aquí descrito, se proporciona aquí una combinación de una estructura tallo-bucle de histona con una región de codificación que codifica para al menos uno de los antígenos como se definieron anteriormente que, preferentemente, no está presente en genes de histona de metazoos (la región de codificación y la secuencia tallo-bucle de histona son heterólogos).

Así, un tallo-bucle de histona es una estructura tallo-bucle como se describe aquí que, si preferentemente se define funcionalmente, presenta/retiene la propiedad de unión a su socio de unión natural, la proteína de unión a tallo-bucle (SLBP - también llamada proteína de unión de horquilla de histona o HBP).

En una realización aquí descrita, la secuencia tallo-bucle de histona no se deriva de una proteína de histona de ratón. Más específicamente, la secuencia tallo-bucle de histona no se puede derivar del gen de histona de ratón H2A614. También, al menos un ARNm aquí descrito no puede contener una secuencia tallo-bucle de histona de ratón ni tampoco puede contener un gen de histona de ratón H2A614. Además, al menos un ARNm aquí descrito no puede contener una señal de procesamiento de tallo-bucle, de manera más específica una señal de procesamiento de histona de ratón y, de manera mucho más específica, no puede contener una señal de procesamiento de tallo-bucle de ratón H2kA614, incluso si el ARNm contiene al menos un gen de histona de mamífero. Sin embargo, el al menos un gen de histona de mamífero puede no tener la SEQ ID NO 7 de la WO 01/12824.

Al menos un ARNm aquí descrito puede comprender preferentemente una 5'UTR, una región de codificación que codifica los antígenos como se definen anteriormente o un fragmento, variante o derivado de los mismos; y/o una 3' UTR que preferentemente contiene al menos un tallo-bucle de histona. Cuando además de los antígenos definidos anteriormente, un péptido o proteína adicional es codificado por el ARNm, entonces el péptido o la proteína codificados preferentemente no es una proteína de histona ni una proteína reporter ni un marcador o proteína de selección, como se define anteriormente. La 3' UTR del ARNm preferentemente comprende también una secuencia poli(A) y/o poli(C) como se define aquí. Los elementos individuales de la 3' UTR pueden estar presentes aquí en cualquier orden de 5' a 3' a lo largo de la secuencia del al menos un ARNm. Además, también pueden estar contenidos otros elementos adicionales como se describen aquí, tales como una secuencia estabilizadora como se define aquí (por ejemplo derivada de la UTR de un gen de globina), secuencias IRES, etc. Cada uno de los elementos también se puede repetir en el ARNm al menos una vez (en particular en constructos di- o multi-cistrónicos), preferentemente dos o más veces. Como ejemplo, los elementos individuales pueden estar presentes en el ARNm en el siguiente orden:

5' - región de codificación - tallo-bucle de histona - secuencia poli(A)/(C) - 3'; o

5' - región de codificación - secuencia poli(A)/(C) - tallo-bucle de histona - 3'; o

5' - región de codificación - tallo-bucle de histona - señal de poliadenilación - 3'; o 5' - región de codificación - señal de poliadenilación - tallo-bucle de histona - 3'; o

5' - región de codificación - tallo-bucle de histona - tallo-bucle de histona - secuencia poli(A)/(C) - 3'; o 5' - región de codificación - tallo-bucle de histona - tallo-bucle de histona - señal de poliadenilación - 3'; o 5' - región de codificación - secuencia estabilizadora - secuencia poli(A)/(C) - tallo-bucle de histona - 3'; o

5' - región de codificación - secuencia estabilizadora - secuencia poli(A)/(C) - secuencia poli(A)/(C) - tallobucle de histona - 3'; etc.

En este contexto, es particularmente preferente que - si, además de los antígenos definidos arribas, otro péptido o proteína adicional es codificado por al menos un ARNm - el péptido o proteína codificado preferentemente no es una proteína de histona, ni una proteína reporter (por ejemplo Luciferasa, GFP, EGFP, p-Galactosidasa, particularmente EGFP) y/o un marcador o proteína de selección (por ejemplo alfaglobina, galactocinasa y xantina:guanina fosforibosil transferasa (GPT)).

En una realización aquí descrita, el ARNm no comprende un gen reporter o un gen marcador. De manera preferente, el ARNm no codifica, por ejemplo, luciferasa; proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes (tal como eGFP, RFP o BFP); a-globina; hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT); pgalactosidasa; galactocinasa; fosfatasa alcalina; fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP)) o un gen de resistencia (tal como un gen de resistencia a neomicina, puromicina, higromicina y zeocina). En una realización aquí descrita, el ARNm no codifica para luciferasa. En otra realización, el ARNm no codifica GFP o una variante de la misma.

En otra realización aquí descrita, el ARNm no codifica una proteína (o un fragmento de una proteína) derivada de un virus, preferentemente de un virus perteneciente a la familia Ortomixoviridae. Preferentemente, el ARNm no codifica una proteína que se deriva de un virus de la influenza, de manera más preferente de un virus de la influenza A. De manera preferente, el ARNm no codifica una proteína de la influenza A seleccionada del grupo consistente en hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoproteína (NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP: proteína de exportación nuclear), PA, PB1 (polimerasa básica 1), PB1-F2 y PB2. En otra realización aquí descrita, el ARNm no codifica para ovalbúmina (OVA) o un fragmento de la misma. Preferentemente, el ARNm no codifica una proteína de la influenza A u ovalbúmina.

De acuerdo con una realización aquí descrita, al menos un ARNm aquí descrito comprende al menos una secuencia tallo-bucle de histona, preferentemente de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas (I) o (II):

fórmula (I) (secuencia tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):

[N0-2GN3-5] [N o-4 (U /T )N o-4] [N3-5CN0-2]

v------y------' V------- v ------- 2 -^---- v -----'

Tallo 1 Bucle Tallo 2

fórmula (II) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera del tallo):

Elemento Tallol Bucle Tallo2 Elemento frontera de frontera de Tallo1 Tallo2

donde:

elementos frontera del tallol o tallo2 N-i-a: es una secuencia consecutiva de 1 a 6, preferiblemente de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 5, aún más preferiblemente de 3 a 5, más preferiblemente de 4 a 5 o de 5 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de entre A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo;

tallol [N0-2GN3-5]: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa con el elemento tallo2 y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, más preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, más preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo, y donde G es guanosina o un análogo del mismo, y se puede reemplazar opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma, siempre que su citidina de nucleótido complementario en tallo2 se reemplace por guanosina;

secuencia bucle [No-4(U/T)No-4]: se ubica entre los elementos tallol y tallo2 y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleótidos, más preferiblemente de 4 nucleótidos; donde cada No-4 es independiente de otra secuencia consecutiva de 0 a 4, preferiblemente de 1 a 3, más preferiblemente de 1 a 2 N, donde cada N se selecciona de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; donde U/T representa uridina, u opcionalmente timidina;

tallo2 [N3-5CN0-2]: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa al elemento tallo1 y es una secuencia consecutiva de 5 a 7 nucleótidos; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, más preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; siendo N0-2 una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, más preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G o C o un análogo de nucleótido del mismo; y donde C es citidina o un análogo de la misma, y se puede reemplazar opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma siempre que su guanosina de nucleósido complementario en tallo1 se reemplace por citidina;

donde tallo1 y tallo2 son capaces de apareamiento de bases entre sí formando una secuencia inversa complementaria, donde el apareamiento de bases puede ocurrir entre tallo1 y tallo2, por ejemplo por apareamiento de bases Watson-Crick de nucleótidos A y U/T o G y C o por apareamiento de bases no Watson-Crick, por ejemplo apareamiento de bases de tambaleo, apareamiento de bases Watson-Crick inverso, apareamiento de bases Hoogsteen, apareamiento de bases Hoogsteen inverso o son capaces de apareamiento de bases entre sí formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, donde un apareamiento de bases incompleto puede ocurrir entre tallo1 y tallo2, en base a que una o más bases en un tallo no tienen una base complementaria en la secuencia complementaria inversa del otro tallo.

En el contexto anterior, un apareamiento de bases de tambaleo es típicamente un apareamiento de bases no Watson-Crick entre dos nucleótidos. Los cuatro pares de bases de tambaleo principales en el presente contexto que se pueden usar son guanosina-uridina, inosina-uridina, inosina-adenosina, inosina-citidina (G-U/T, I-U/T, I-A y I-C) y adenosina-citidina (A-C).

Por consiguiente, en el contexto de la presente descripción, una base de tambaleo es una base que forma un par de bases de tambaleo con una base adicional como se describe anteriormente. Así, puede estar presente un apareamiento de bases no de Watson-Crick, por ejemplo de tambaleo, en el tallo de la estructura tallo-bucle de histona en el al menos un ARNm de acuerdo con la presente descripción.

En el contexto anterior, una secuencia complementaria parcialmente inversa comprende como máximo 2, preferentemente solo un apareamiento erróneo en la estructura tallo de la secuencia tallo-bucle formada por el apareamiento de bases de tallo1 y tallo2. En otras palabras, tallo1 y tallo2 preferentemente son capaces de un apareamiento de bases (completo) entre sí a lo largo de toda la secuencia completa del tallo1 y tallo2 (100% de los apareamiento de bases de Watson-Crick o no Watson-Crick correctos posibles), formando así una secuencia complementaria inversa, donde cada base tiene su base de Watson-Crick o no de Watson-Crick correcta pendiente como un socio de unión complementario. Alternativamente, tallo1 y tallo2 preferentemente son capaces de un apareamiento de bases parcial entre sí a lo largo de toda la secuencia completa de tallo1 y tallo2, donde al menos aproximadamente un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% del 100% de los apareamientos de bases de Watson-Crick o no de Watson-Crick corrector posibles están ocupados por los apareamientos de bases de Watson-Crick o no de Watson-Crick correctos y como máximo aproximadamente un 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, o 5% de las bases restantes no están pareadas.

De acuerdo con una realización aquí descrita, la al menos una secuencia tallo-bucle de histona (con elementos frontera de tallo) del al menos un ARNm como se define aquí comprende una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 nucleótidos, preferentemente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos, de manera preferente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleótidos, de manera preferente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos y de manera aún más preferente una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 y de manera totalmente preferente una longitud de aproximadamente 24 a aproximadamente 28 nucleótidos.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, la al menos una secuencia de tallo-bucle de histona (sin elementos frontera de tallo) del al menos un ARNm como se define aquí comprende una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos, de manera preferente una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleótidos, de manera preferente una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 20 nucleótidos, de manera preferente una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 20 nucleótidos y de manera aún más preferente una longitud de aproximadamente 16 a aproximadamente 17 y de manera totalmente preferente una longitud de aproximadamente 16 nucleótidos.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, el al menos un ARNm aquí descrito puede comprender al menos una secuencia de tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas específicas (Ia) o (IIa):

fórmula (la) (secuencia de tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):

tallo 1 bucle tallo 2

fórmula (lia) (secuencia de tallo-bucle con elementos frontera de tallo):

N2-s [N⁰.,GN3.5] |N,.³(U/r)No.2] [N³.⁵CN„.,] n ^2.5

^{'— I - ' ■} ----- v----- ' V__________________ ^>

Elemento frontera Tallo 1 Tallo 2 Elemento frontera de de tallo 1 ^bucletallo 2

donde N, C, G, T y U son como se definen anteriormente.

De acuerdo con una realización adicional aquí descrita del primer aspecto, al menos un ARN puede comprender o codificar para al menos una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas específicas (lb) o (lIb):

fórmula (Ib) (secuencia tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):

[N,GN4] [N²(U/a)N J,] v_ [N⁴CN,]

■J ^ _{" V} “V -------

tallo 1 bucle tallo 2

fórmula (IIb) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera de tallo):

N^4,5[N.GNJ [N²(U/T)N1] [N.CNJ n 4.s

------ Y "

Elemento frontera Tallo 1 Bucle Tall° 2 Elemento frontera de de tallo 1 tallo 2

donde N, C, G, T y U son como se definen anteriormente.

De acuerdo con una realización aquí descrita, al menos un ARNm aquí descrito puede comprender al menos una secuencia de tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas específicas (Ic) a (Ih) o (Ilc) a (IIh), mostradas alternativamente en su estructura de tallo-bucle y como una secuencia lineal que representa las secuencias de tallo-bucle de histona:

fórmula (Ic): (secuencia consenso tallo-bucle de histona de metazoarios y protozoarios sin elementos frontera de tallo):

N U

N N

N -N

G -C

N -N (estructura de tallo-bucle)

N G N N N N N N U N N N N N C N

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 26)

fórmula (Me): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de metazoarios y protozoarios con elementos frontera de tallo):

N U N N

N -N

G -C

N * N * N N N N - N N N N * N * N * (estructura de tallo-bucle)

N * N * N N N N G N N N N N N U N N N N N C N N N N * N * N *

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 27)

fórmula (Id): (sin elementos frontera de tallo

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 28)

fórmula (lid): (con elementos frontera de tallo)

N U N N

N - N

C - G

N * N * N N N N - N N N N * N * N * (estructura de tallo-bucle)

N * N * N N N N C N N N N N N U N N N N N G N N N N * N * N *

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 29)

fórmula (le): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de protozoario sin elementos frontera de tallo)

N U

N N

N -N

G -C

D -H (estructura de tallo-bucle)

D G N N N N N N U N N N N N C H

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 30)

fórmula (IIe): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de protozoario sin elementos frontera de tallo) N U

N N

N - N

G -C

N * N * N N N D - H N N N * N * N * (estructura de tallo-bucle)

N * N * N N N D G N N N N N N U N N N N N C H N N N * N * N *

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 31)

fórmula (If): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de metazoario sin elementos frontera)

N U

N N

Y - V

Y - N

B -D

N - N

G - C

N - N (estructura de tallo-bucle)

N G N B Y Y N N U N V N D N C N

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 32)

fórmula (llf): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de metazoario con elementos frontera de tallo)

N U N N

Y - V

Y - N

B -D

N - N

G - C

N * N * N N N N - N N N N * N * N * (estructura de tallo-bucle)

N * N * N N N N G N B Y Y N N U N V N D N C N N N N * N * N *

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 33)

fórmula (Ig): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de vertebrados sin elementos frontera de tallo)

N U

D H

Y -A

Y -B

Y -R

H - D

G - C

N - N (estructura de tallo-bucle)

N G H Y Y Y D N U H A B R D C N

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 34)

fórmula (IIg): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de vertebrados con elementos frontera de tallo) N U

D H

Y -A

Y -B

Y -R

H - D

G -C

N * N * H N N N - N N N N * N * H * (estructura de tallo-bucle)

N * N * H N N N G H Y Y Y D N U H A B R D C N N N N * N * H *

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 35)

fórmula (Ih): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de humano (Homo sapiens) sin elementos frontera de tallo)

Y U

D H

U - A

C -S

Y -R

H - R

G - C

D - C (estructura de tallo-bucle)

D G H Y C U D Y U H A S R R C C

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 36)

fórmula (IIh): (secuencia consenso de tallo-bucle de histona de humano (Homo sapiens) con elementos frontera de tallo)

Y U D H

U -A

C -S

Y -R

H -R

G -C

N * H * A A H D - C V H B * N * H * (estructura de tallo-bucle)

N * H * A A H D G H Y C U D Y U H A S R R C C V H B * N * H *

(secuencia lineal) (SEQ ID NO: 37)

donde en cada una de las fórmulas anteriores (Ic) a (Ih) o (IIc) a (IIh):

N, C, G, A, T y U son como se definen anteriormente; cada U se puede reemplazar por T; cada G o C (altamente) conservada en los elementos de tallo 1 y 2 se pueden reemplazar por su base de nucleótidos complementaria C o G, con la condición de que su nucleótido complementario en el tallo correspondiente se reemplace por su nucleótido complementario en paralelo; y/o G, A, T, U, C, R, Y, M, K, S, W, H, B, V, D, y N son bases de nucleótidos como se definen en la siguiente Tabla:

En este contexto se prefiere particularmente que la secuencia de tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas (I) o (Ia) a (Ih) o (II) o (IIa) a (IIh) anteriores se seleccionen de una secuencia de tallo-bucle de histona de origen natural, con particular preferencia de secuencias de tallo-bucle de histona de protozoarios o metazoos, y con particular preferencia de vertebrados y con total preferencia de secuencias de tallo-bucle de histona de mamífero, especialmente de secuencias de tallo-bucle de histona humanas.

De acuerdo con una realización aquí descrita, la secuencia de tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas específicas (I) o (Ia) a (Ih) o (II) o (IIa) a (IIh) es una secuencia de tallo-bucle de histona que comprende, en cada posición de nucleótidos, el nucleótido de origen natural más frecuente o cualquiera de los nucleótidos más frecuentes o el segundo de origen natural más frecuente de la secuencia de tallo-bucle de histona de origen natural de metazoos y protozoarios, protozoarios, metazoos, vertebrados y humanos. En este contexto, se prefiere particularmente que al menos el 80%, preferentemente al menos el 85% o con mayor preferencia al menos el 90% de todos los nucleótidos correspondan al nucleótido de origen natural más frecuente de las secuencias de tallo-bucle de histona de origen natural.

En una realización adicional aquí descrita, la secuencia de tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos de las fórmulas específicas (I) o (Ia) a (Ih) anteriores se seleccionan de las siguientes secuencias de tallobucle de histona (sin elementos frontera de tallo):

VGYYYYHHTHRVVRCB (SEQ ID NO: 38 de acuerdo con la fórmula (Ic))

SGYYYTTYTMARRRCS (SEQ ID NO: 39 de acuerdo con la fórmula (Ic))

SGYYCTTTTMAGRRCS (SEQ ID NO: 40 de acuerdo con la fórmula (Ic))

DGNNNBNNTHVNNNCH (SEQ ID NO: 41 de acuerdo con la fórmula (Ie))

RGNNNYHBTHRDNNCY (SEQ ID NO: 42 de acuerdo con la fórmula (Ie))

RGNDBYHYTHRDHNCY (SEQ ID NO: 43 de acuerdo con la fórmula (Ie))

VGYYYTYHTHRVRRCB (SEQ ID NO: 44 de acuerdo con la fórmula (If))

SGYYCTTYTMAGRRCS (SEQ ID NO: 45 de acuerdo con la fórmula (If))

SGYYCTTTTMAGRRCS (SEQ ID NO: 46 de acuerdo con la fórmula (If))

GGYYCTTYTHAGRRCC (SEQ ID NO: 47 de acuerdo con la fórmula (Ig))

GGCYCTTYTMAGRGCC (SEQ ID NO: 48 de acuerdo con la fórmula (Ig))

GGCTCTTTTMAGRGCC (SEQ ID NO: 49 de acuerdo con la fórmula (Ig))

DGHYCTDYTHASRRCC (SEQ ID NO: 50 de acuerdo con la fórmula (Ih))

GGCYCTTTTHAGRGCC (SEQ ID NO: 51 de acuerdo con la fórmula (Ih))

GGCYCTTTTMAGRGCC (SEQ ID NO: 52 de acuerdo con la fórmula (Ih))

Adicionalmente en este contexto, las secuencias de tallo-bucle de histona (con elementos frontera de tallo) de acuerdo con una de las fórmulas (II) o (IIa) a (IIh) son particularmente preferentes:

H*H*HHVVGYYYYHHTHRVVRCBVHH*N*N* (SEQ ID NO: 53 de acuerdo con la fórmula (IIc))

M*H*MHMSGYYYTTYTMARRRCSMCH*H*H* (SEQ ID NO: 54 de acuerdo con la fórmula (IIc)) M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H* (SEQ ID NO: 55 de acuerdo con la fórmula (IIc)) N*N*NNNDGNNNBNNTHVNNNCHNHN*N*N* (SEQ ID NO: 56 de acuerdo con la fórmula (IIe))

N*N*HHNRGNNNYHBTHRDNNCYDHH*N*N* (SEQ ID NO: 57 de acuerdo con la fórmula (IIe)) N*H*HHVRGNDBYHYTHRDHNCYRHH*H*H* (SEQ ID NO: 58 de acuerdo con la fórmula (IIe))

H*H*MHMVGYYYTYHTHRVRRCBVMH*H*N* (SEQ ID NO: 59 de acuerdo con la fórmula (IIf))

M*M*MMMSGYYCTTYTMAGRRCSMCH*H*H* (SEQ ID NO: 60 de acuerdo con la fórmula (IIf)) M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H* (SEQ ID NO: 61 de acuerdo con la fórmula (IIf))

H*H*MAMGGYYCTTYTHAGRRCCVHN*N*M* (SEQ ID NO: 62 de acuerdo con la fórmula (IIg))

H*H*AAMGGCYCTTYTMAGRGCCVCH*H*M* (SEQ ID NO: 63 de acuerdo con la fórmula (IIg)) M*M*AAMGGCTCTTTTMAGRGCCMCY*M*M* (SEQ ID NO: 64 de acuerdo con la fórmula (IIg))

N*H*AAHDGHYCTDYTHASRRCCVHB*N*H* (SEQ ID NO: 65 de acuerdo con la fórmula (IIh)) H*H*AAMGGCYCTTTTHAGRGCCVMY*N*M* (SEQ ID NO: 66 de acuerdo con la fórmula (IIh))

H*M*AAAGGCYCTTTTMAGRGCCRMY*H*M* (SEQ ID NO: 67 de acuerdo con la fórmula (IIh))

De acuerdo con otra realización aquí descrita, al menos un ARNm comprende al menos una secuencia de tallo-bucle de histona que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 80%, de manera preferente al menos aproximadamente 85%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, o de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, con el no 100% de nucleótidos conservados en las secuencias de tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas específicas (I) o (Ia) a (Ih) o (II) o (IIa) a (IIh) o con una secuencia de tallo-bucle de histona de origen natural. Una secuencia de tallo-bucle de histona preferida particular es la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 71 CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA o de manera más preferente la secuencia de ARN correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 71: CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA (SEQ ID NO: 72).

En una realización preferente, la secuencia de tallo-bucle de histona no contiene la secuencia bucle 5'-UUUC-3'. Más específicamente, el tallo-bucle de histona no contiene la secuencia tallo1 5'-GGCUCU-3' y/o la secuencia tallo2 5'-AGAGCC-3', respectivamente. En otra realización preferente, la secuencia de tallobucle no contiene la secuencia bucle 5'-CCUGCCC-3' o la secuencia bucle 5'-UGAAU-3'. Más específicamente, el tallo-bucle no contiene la secuencia tallo1 5'-CCUGAGC-3' o no contiene la secuencia tallo1 5'-ACCUUUCUCCA-3' y/o la secuencia tallo2 5'-GCUCAGG-3' o 5'-UGGAGAAAGGU-3', respectivamente. También, preferentemente las secuencias de tallo-bucle no se derivan de una región 3' no traducida del receptor de insulina de mamífero. También, preferentemente, al menos un ARNm aquí descrito puede no contener señales de procesamiento de tallo-bucle de histona, en particular no aquellas derivadas del gen de histona de ratón h 2a 614 (H2kA614).

Preferentemente, al menos un ARNm de la composición aquí descrita no contiene uno o dos o al menos uno o todos sino uno o todos los componentes del grupo consistente en: una secuencia que codifica una ribozima (de manera preferente una ribozima de auto-empalme), una secuencia de ácido nucleico viral, una señal de procesamiento de tallo-bucle de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallobucle de histona derivada del gen de histona de ratón H2A614, un gen Neo, una secuencia promotora inactivada y una secuencia potenciadora inactivada. De manera aún más preferente, al menos un ARNm aquí descrito no contiene una ribozima, de manera preferente una ribozima de autoempalme, y uno del grupo consistente en: un gen Neo, una secuencia promotora inactivada, una secuencia potenciadora inactivada, una señal de procesamiento de tallo-bucle de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo-bucle de histona derivada del gen de histona de ratón H2A614. Así, en un modo preferente, el ARNm no conteniene una ribozima, de manera preferente una ribozima de autoempalme, tampoco un gen Neo o, alternativamente, ninguna ribozima, de manera preferente una ribozima de autoempalme, tampoco cualquier gen de resistencia (por ejemplo usualmente aplicado para la selección). En otro modo preferente, al menos un ARNm aquí descrito puede no contener una ribozima, de manera preferente una ribozima de autoempalme, tampoco una señal de procesamiento de tallo-bucle de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo-bucle de histona derivada del gen de histona de ratón H2A614.

Alternativamente, al menos un ARNm de la composición aquí descrita comprende opcionalmente una señal de poliadenilación que se define aquí como señal que transporta la poliadenilación a un ARNm (transcrito) mediante factores de proteínas específicos (por ejemplo factor de especificidad de escisión y poliadenilación (CPSF), factor de estimulación de escisión (CstF), factores I y II de escisión (CF I y CF II), poli(A) polimerasa (PAP)). En este contexto, se prefiere una señal de poliadenilación consenso que comprende la secuencia consenso NN(U/T)ANA. En un aspecto preferido particular, la señal de poliadenilación comprende una de las siguientes secuencias: AA(U/T)AAA o A(U/T)(U/T)AAA (donde la uridina está normalmente presente en el ARN y la timidina en el ADN). En algunas realizaciones, la señal de poliadenilación usada en al menos un ARNm aquí descrito no corresponde a U3 ARNsn, U5, señal de procesamiento de poliadenilación del gen humano G-CSF o secuencias señal de poliadenilación SV40. En particular, las señales de poliadenilación anteriores no se combinan con cualquier gen de resistencia a antibióticos (o cualquier otro gen reporter, marcador o de selección), en particular ni con el gen neo de resistencia (neomicina fosfotransferasa). Y cualquiera de las señales de poliadenilación anteriores preferentemente no se combinan con el tallo-bucle de histona o la señal de procesamiento de tallo-bucle de histona del gen de histona de ratón H2A614 en al menos un ARNm aquí descrito.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, al menos un ARNm de la composición aquí descrita se puede modificar, y así estabilizar, modificando el contenido en G/C del ARNm, preferentemente de la región de codificación del ARNm.

En una realización aquí descrita, el contenido en G/C de la región de codificación de al menos un ARNm de la composición aquí descrita se modifica, particularmente aumenta, en comparación con el contenido en G/C de la región de codificación de su ARNm de tipo salvaje particular, es decir ARNm no modificado. La secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm preferentemente no está modificada en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm salvaje particular. Esta modificación de al menos un ARNm de la composición se basa en el hecho de que la secuencia de cualquier región de ARNm a traducir es importante para la traducción eficiente de ese ARNm. Así, la composición y la secuencia de varios nucleótidos son importantes. En particular, las secuencias que tienen un contenido en G (guanosina)/C (citosina) incrementado son más estables que las secuencias que tienen un contenido en A (adenosina)/U (uracilo) incrementado. De acuerdo con la presente descripción, los codones del ARNm por tanto varían en comparación con el ARNm salvaje respectivo, a la vez que se mantiene la secuencia de aminoácidos traducida, de forma que incluyen una cantidad incrementada de nucleótidos G/C. Con respecto al hecho de que varios codones codifican para uno y el mismo aminoácido (la llamada degeneración del código genético), pueden determinarse los codones más favorables para la estabilidad (el llamado uso de codón alternativo). Dependiendo del aminoácido a codificar por el ARNm, existen varias posibilidades para la modificación de la secuencia de ARNm en comparación con su secuencia de tipo natural. En el caso de los aminoácidos codificados por los codones que contienen exclusivamente los nucleótidos G o C, no es necesaria la modificación del codón. Así, los codones para Pro (CCC o CCG), Arg (CGC o CGG), Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no requieren modificación, puesto que no hay A o U presente. Por el contrario, los codones que contienen los nucleótidos A y/o U se pueden modificar por sustitución con otros codones que codifican para los mismos aminoácidos pero que no contienen A y/o U. Ejemplos de estos son: los codones para Pro se puede modificar de CCU o CCA a CCC o CCG; los codones para Arg se pueden modificar de CGU o c Ga o AGA o AGG a CGC o CGG; los codones para Ala se pueden modificar de GCU o GCA a GCC o GCG; los codones para Gly se pueden modificar de GGU o Gg A a GGC o GGG. En otros casos, aunque los nucleótidos A o U no se pueden eliminar de los codones, sin embargo, es posible disminuir el contenido de A y U empleando codones con un contenido más bajo de nucleótidos A y/o U. Ejemplos de éstos son: los codones para Phe se pueden modificar de UUU a UUC; los codones para Leu se pueden modificar de UUA, UUG, CUU o CUA a CUC o CUG; los codones para Ser se pueden modificar de UCU o UCA o AGU a UCC, UCG o AGC; el codón para Tyr se pueden modificar de UAU a UAC; el codón para Cys se pueden modificar de UGU a UGC; el codón para His se pueden modificar de CAU a CAC; el codón para Gln se pueden modificar de CAA a CAG; los codones para Ile se pueden modificar de AUU o AUA a AUC; los codones para Thr se pueden modificar de ACU o a Ca a ACC o ACG; el codón para Asn se pueden modificar de AAU a AAC; el codón para Lys se pueden modificar de AAA a AAG; los codones para Val se pueden modificar de GUU o GUA a GUC o GUG; el codón para Asp se pueden modificar de GAU a GAC; el codón para Glu se pueden modificar de GAA a GAG; el codón de detención UAA se puede modificar a UAG o UGA. En el caso de los codones para Met (AUG) y Trp (UGG), por otra parte, no existe posibilidad de modificación de secuencia. Las sustituciones citadas anteriormente se pueden usar ya sea individualmente o en todas las combinaciones posibles para incrementar el contenido en G/C de al menos un ARNm de la composición aquí descrita en comparación con su ARNm de tipo natural particular (es decir la secuencia original). Así, por ejemplo, todos los codones para Thr presentes en la secuencia de tipo natural se pueden modificar a ACC (o ACG). Preferentemente, sin embargo, por ejemplo, se emplean las combinaciones de las posibilidades de sustitución anteriores:

sustitución de todos los codones que codifican para Thr en la secuencia original (ARNm de tipo natural) a ACC (o ACG) y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Ser a UCC (o UCG o AGC); sustitución de todos los codones que codifican para Ile en la secuencia original a AUC y sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Lys a AAG y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Tyr a UAC; sustitución de todos los codones que codifican para Val en la secuencia original a GUC (o GUG) y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Glu a GAG y sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Ala a GCC (o GCG) y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Arg a CGC (o CGG); sustitución de todos los codones que codifican para Val en la secuencia original a GUC (o GUG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Glu a GAG y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Ala a GCC (o GCG) y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Gly a GGC (o GGG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Asn a AAC; sustitución de todos los codones que codifican para Val en la secuencia original a GUC (o GUG) y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Phe a UUC y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Cys a UGC y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Leu a CUG (o CUC) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Gln a CAG y

sustitución de todos los codones que codifican originalmente para Pro a CCC (o CCG); etc. Preferentemente, el contenido en G/C de la región de codificación de al menos un ARNm de la composición aquí descrita se incrementa en al menos un 7%, de manera más preferente en al menos un 15%, de manera particularmente preferente en al menos un 20%, en comparación con el contenido en G/C de la región codificada del ARNm de tipo natural que codifica para un antígeno, proteína antigénica o péptido antigénico como se definen aquí o su fragmento. De acuerdo con una realización específica, al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de manera más preferente al menos un 70%, de manera aún más preferente al menos un 80% y con total preferencia al menos un 90%, 95% o incluso el 100% de los codones sustituibles de la región que codifica para un antígeno, proteína antigénica o péptido antigénico como se definen aquí o su fragmento o variante del mismo o la secuencia completa de la secuencia de ARNm de tipo natural se sustituyen, incrementando así el contenido en GC de la secuencia. En este contexto, es particularmente preferible incrementar el contenido en G/C de al menos un ARNm de la composición aquí descrita al máximo (es decir 100% de los codones sustituibles), en particular en la región que codifica para una proteína, en comparación con la secuencia de tipo natural. De acuerdo con la presente descripción, una modificación preferente adicional de al menos ARNm de la composición aquí descrita se basa en el descubrimiento de que la eficiencia de traducción también está determinada por una frecuencia diferente en la ocurrencia de ARNt en la célula. Así, si los llamados “codones raros” están presentes en al menos un ARNm de la composición aquí descrita en un grado incrementado, la secuencia de ARNm modificada correspondiente se traduce en un grado significativamente más deficiente que cuando los codones que codifican para ARNt relativamente “frecuentes” están presentes. De acuerdo con la presente descripción, en el ARNm modificado de la composición aquí descrita, la región que codifica para uno de los antígenos arriba definidos se modifica en comparación con la región correspondiente del ARNm de tipo natural de forma que al menos un codón de la secuencia de tipo natural que codifica para un ARNt que es relativamente raro en la célula se intercambia por un codón que codifica para un ARNt que es relativamente frecuente en la célula y que lleva el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro. Con esta modificación, las secuencias del ARNm de la composición aquí descrita están modificadas de forma que se insertan los codones para los cuales los ARNt de origen natural más frecuentes están disponibles. En otras palabras, de acuerdo con la presente descripción, mediante esta modificación todos los codones de la secuencia de tipo natural que codifican para un ARNt que es relativamente raro en la célula se pueden intercambiar, en cada caso, con un codón que codifica para un ARNt que es relativamente frecuente en la célula y que, en cada caso, lleva el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro. Tales ARNt que están presentes con relativa frecuencia en la célula y aquellos que, por el contrario, están presentes de forma relativamente rara son conocidos por el experto en la técnica; ver por ejemplo Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666. Los codones que se usan para el aminoácido particular del ARNt presenta con más frecuencia, por ejemplo el codón Gly, que usa el ARNt más frecuentemente presente en la célula (humana), son particularmente preferentes. De acuerdo con la presente descripción, es particularmente preferible ligar el contenido en G/C secuencial que se aumenta, en particular se maximiza, en el ARNm modificado de la composición aquí descrita con los codones “frecuentes” sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la región de codificación del ARNm. Esta realización permite proporcionar un ARNm traducido y estabilizado (modificado) de manera particularmente eficiente de la composición aquí descrita. La determinación de un ARNm modificado de la composición arriba descrita (contenido en G/C incrementado; intercambio de ARNt) se puede llevar a cabo usando el programa de ordenador explicado en la WO 02/098443. Usando este programa de ordenador, la secuencia de nucleótidos de cualquier ARNm deseado se puede modificar con la ayuda del código genético o la naturaleza degenerativa del mismo de forma que resulte en un contenido de G/C máximo, en combinación con el uso de codones que codifican para ARNt presentes con la mayor frecuencia posible en la célula, preferentemente donde la secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm modificado no se modifica en comparación con la secuencia no modificada. Alternativamente, también es posible modificar solo el contenido en G/C o solo el uso del codón comparado con la secuencia original. El código fuente en Visual Basic 6.0 (entorno de desarrollo usado: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 con Servicepack 3) también se describe en la WO 02/098443. En otra modalidad aquí descrita, el contenido de A/U en ambiente del sitio de unión al ribosoma de al menos un ARNm de la composición aquí descrita se incrementa en comparación con el contenido A/U en el ambiente del sitio de unión al ribosoma de su ARNm de tipo natural particular. Esta modificación (un contenido en A/U incrementado alrededor del sitio de unión de ribosoma) incrementa la eficiencia de unión del ribosoma al ARNm. Una unión efectiva de los ribosomas al sitio de unión al ribosoma (secuencia Kozak: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 68), el AUG forma el codón de inicio) a su vez tiene el efecto de una traducción eficiente del ARNm. De acuerdo con otra realización aquí descrita, al menos un ARNm de la composición aquí descrita puede estar modificado con respecto a elementos de secuencia potencialmente desestabilizantes. En particular, la región de codificación y/o la región no traducida 5' y/o 3' de este ARNm se puede modificar en comparación con el ARNm de tipo natural particular de forma que no contiene elementos de secuencia desestabilizantes, preferentemente no modificándose la secuencia de aminoácidos codificada de ARNm modificado en comparación con su ARNm de tipo natural particular. Es sabido que, por ejemplo, en las secuencias de ARN eucariotas están presentes elementos desestabilizantes de secuencia (DSE), los cuales se unen a las proteínas señal y regulan la degradación enzimática del ARNm in vivo. Para una estabilización adicional del ARNm modificado, opcionalmente en la región que codifica para una antígeno, proteína antigénica o péptido antigénico como se definen aquí, puede llevarse entonces a cabo una o más de tales modificaciones en comparación con la región correspondiente del ARNm de tipo natural de modo que esencialmente no están contenidos elementos desestabilizadores de secuencia. De acuerdo con la presente descripción, el DSE presente en las regiones no traducidas (3'- y/o 5'-UTR) también se puede eliminar del al menos un ARNm de la composición aquí descrita mediante tales modificaciones. Tales secuencias desestabilizantes son, por ejemplo, secuencias ricas en AU (AURES), presentes en las secciones 3'-UTR de numerosos ARN inestables (Caput y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 1986, 83: 1670 a 1674). Por tanto, al menos un ARNm de la composición aquí descrita preferentemente está modificado en comparación con el ARNm de tipo natural de forma que el ARNm no contiene tales secuencias desestabilizantes. Esto también se aplica a aquellos motivos de secuencia que son reconocidos por posibles endonucleasas, por ejemplo la secuencia GAACAAG que está contenida en el segmento 3'-UTR del gen que codifica para el receptor de transferrina (Binder y col., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980). Preferentemente, estos motivos de secuencia también se eliminan del al menos un ARNm de la composición aquí descrita. También, de acuerdo con la presente descripción, al menos un ARNm de la composición tiene, en una forma modificada, al menos una IRES como se define anteriormente y/o al menos una secuencia estabilizante 5' y/o 3', en una forma modificada, por ejemplo para mejorar la unión al ribosoma o para permitir la expresión de diferentes antígenos codificados situados en un al menos ARNm (bi- o multi-cistrónico) de la composición aquí descrita.

De acuerdo con la presente descripción, al menos un ARNm de la composición preferentemente además tiene al menos una secuencia estabilizadora 5' y/o 3'. Estas secuencias estabilizadoras en las regiones no traducidas 5' y/o 3' tienen el efecto de aumentar la vida media del ARNm en el citosol. Estas secuencias estabilizadoras pueden tener un 100% de homología de secuencia con las secuencias de origen natural presentes en virus, bacterias y eucariotas, pero también pueden ser parcial o totalmente sintéticas. Las secuencias no traducidas (UTR) del gen de p-globina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis, se pueden mencionar como ejemplos de secuencias estabilizadoras que se pueden usar para un ARNm estabilizado. Otro ejemplo de secuencia estabilizadora tiene la fórmula general (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO: 69), que está contenida en la 3'UTR del ARNm muy estable que codifica para la a-globina, a(I)-colágeno, 15-lipoxigenasa o para la tirosina-hidroxilasa (ver Holcik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Tales secuencias estabilizadpras por su puesto se pueden usar individualmente o en combinación entre sí y también en combinación con otras secuencias estabilizadoras conocidas por el experto en la técnica. Por tanto, al menos un ARNm de la composición aquí descrita está presente preferentemente como un ARNm estabilizado con una UTR de globina (regiones no traducidas), en particular como un ARNm estabilizado con UTR de a-globina. Preferentemente, al menos un ARNm de la composición comprende una secuencia estabilizadora en la 3'-UTR derivada de la parte central de unión al a-complejo de la 3'UTR de un gen de a-globina, tal como un gen de a-globina humano, preferentemente según la SEQ ID NO: 70:

Parte central de unión a a-complejo de la 3'UTR de un gen de a-globina (también llamado aquí “muag”)

GCCCGAUGGGCCUCCCAACGGGCCCUCCUCCCCUCCUUGCACCG (SEQ ID NO: 70) No obstante, preferentemente se realizan sustituciones, adiciones o eliminaciones de bases en al menos un ARNm de la composición aquí descrita, usando una matriz de ADN para la preparación del ARNm de la composición aquí descrita por técnicas de la mutagénesis dirigida a sitio, bien conocida, o con una estrategia de unión de oligonucleótidos (ver por ejemplo Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001). En tal proceso, para preparar el ARNm, una molécula de a Dn correspondiente se puede transcribir in vitro. Esta matriz de ADN comprende preferentemente un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T7 o SP6, para la transcripción in vitro, seguido por la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm a preparar y una señal de terminación para la transcripción in vitro. La molécula de ADN, que forma la matriz de un ARNm de interés, se puede preparar por proliferación fermentativa y aislamiento posterior como parte de un plásmido que se puede replicar en bacterias. Los plásmidos que se pueden mencionar como adecuados para la presente invención son, por ejemplo, los plásmidos pT7Ts (número de acceso de GenBank U26404; Lai y col., Development 1995, 121: 2349 a 236o), serie pGEMM®, por ejemplo pGEMM®-1 (número de acceso de GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (Número de acceso GenBank X65327); ver también Mezei y Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.

De acuerdo con la presente invención, cada uno de los seis ARNm como se definen en las reivindicaciones está complejado con un compuesto catiónico seleccionado del grupo consistente en un péptido catiónico, una proteína catiónica, un polisacárido catiónico, un polímero catiónico y un lípido catiónico.

La estabilización de al menos un ARNm de la composición aquí descrita también se puede llevar a cabo asociando o complejando el ARNm con, o uniéndolo a, un compuesto catiónico, en particular un compuesto policatiónico, por ejemplo un péptido o proteína (poli)catiónico. En particular el uso de protamina, nucleolina, espermina o espermidina como proteína de unión de ácido nucleico policatiónica al a Rn es particularmente efectivo. Además, también es posible el uso de otros péptidos o proteínas catiónicos, tales como poli-L-lisina o histonas. Este procedimiento para estabilizar el ARNm se describe en la EP-A-1083232. Otras sustancias catiónicas preferentes que se pueden emplear para estabilizar el ARNm de la composición aquí descrita incluyen polisacáridos catiónicos, por ejemplo quitosano, polibreno, polietilenimina (PEI) o poli-L-lisina (PLL), etc. La asociación o complejación de al menos un ARNm de la composición aquí descrita con compuestos catiónicos, por ejemplo proteínas catiónicas o lípidos catiónicos, por ejemplo oligofectamina como reactivo de formación de complejos basado en lípidos, preferentemente incrementa la transferencia del ARNm presente como componente farmacéuticamente activo a las células a tratar o al organismo a tratar. También se refiere la presente descripción al efecto estabilizante para al menos un ARNm de la composición aquí descrita mediante complejación, que también mantiene la estabilización del ARNm.

De acuerdo con otra realización particularmente preferente, al menos un ARNm de la composición puede codificar adicional o alternativamente un péptido señal secretor. Tales péptidos señal son secuencias que típicamente tienen una longitud de aproximadamente 15 a 30 aminoácidos y que preferentemente se localizan N-terminal en el péptido codificado, sin limitarse a ello. Los péptidos señal aquí definidos preferentemente permiten transportar el antígeno, la proteína antigénica o el péptido antigénico tal como está codificado por al menos un ARNm de la composición a un compartimiento celular determinado, preferentemente a la superficie celular, el retículo endoplásmico (ER) o el compartimiento endosomallisosomal. Ejemplos de secuencias de péptido señal secretoras como se definen aquí incluyen, sin limitarse a, secuencias señal de moléculas MHC clásicas o no clásicas (por ejemplo secuencias señal de moléculas de MHC I y II, por ejemplo de la molécula MHC de clase I HLA-A*0201), secuencias señal de citoquinas o inmunoglobulinas como se definen aquí, secuencias señal de la cadena invariante de inmunoglobulinas o anticuerpos como se definen aquí, secuencias señal de Lamp1, Tapasina, Erp57, calreticulina, calnexina, y otras proteínas asociadas a la membrana o proteínas asociadas al retículo endoplásmico (ER) o al compartimiento endosomal-lisosomal. Con particular preferencia, según la presente descripción se pueden emplear las secuencias señal de la molécula MHC de clase I HLA-A*0201.

Cualquiera de las modificaciones anteriores se pueden aplicar a al menos un ARNm de la composición aquí descrita y además a cualquier ARN tal como se usa en el contexto de la presente descripción y, si es adecuado o necesario, pueden combinarse entre sí en cualquier combinación, con la condición de que estas combinaciones de modificaciones no interfieran entre sí en el ARNm respectivo. El experto en la técnica será capaz de hacer su elección en consecuencia. Cada uno de los seis antígenos de la composición aquí descrita es codificado por un ARNm (monocistrónico) tal como se define en las reivindicaciones. En otras palabras, la composición aquí descrita contiene seis ARNm (monocistrónicos), donde cada uno de estos seis ARNm (monocistrónicos) codifica para uno único antígeno como se ha definido anteriormente. La composición comprende seis ARNm como se definen en las reivindicaciones, donde un ARNm codifica 5T4, un ARNm codifica survivina, un ARNM codifica NY-ESO-1, un ARNm codifica MAGEC1, un ARNm codifica MAGE-C2 y un ARNm codifica MUC1, respectivamente.

En una realización no reivindicada, la composición comprende seis ARNm, donde un ARNm codifica 5T4 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 3, un ARNm codifica survivina y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 6, un ARNm codifica NY-ESO-1 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 9, un ARNm codifica MAGE-C1 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 12 o 25, un ARNm codifica MAGE-C2 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 15 y un ARNm codifica MUC1 y comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO: 18 (o fragmentos o variantes de cada una de estas secuencias) y opcionalmente excipientes adicionales. En otra realización no reivindicada, la composición comprende al menos un ARNm que es idéntico o al menos un 80% idéntico a la secuencia de Ar N de SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 o 16. De manera aún más preferente, la composición comprende seis ARNm donde cada ARNm es idéntico o al menos un 80% idéntico a una de las secuencias de ARN de acuerdo con las SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 o 16.

En una realización no reivindicada, la composición comprende seis ARNm, donde un ARNm codifica 5T4 y es idéntico o al menos un 80% idéntico a la SEQ ID NO: 1, un ARNm codifica survivina y es idéntico o al menos un 80% idéntico a la SEQ ID NO: 4, un ARNm codifica NY-ESO-1 y es idéntico o al menos un 80% idéntico a la SEQ ID NO: 7, un ARNm codifica MAGE-C1 y es idéntico o al menos un 80% idéntico a la SEQ ID NO: 10, un ARNm codifica MAGE-C2 y es idéntico o al menos un 80% idéntico a la SEQ ID NO: 13 y un ARNm codifica MUC1 y es idéntico o al menos un 80% idéntico a SEQ ID NO: 16 (o fragmentos o variantes de cada una de estas secuencias) y opcionalmente excipientes adicionales. Según la presente descripción, al menos un ARNm de la composición descrita arriba comprende un tallo-bucle de histona en la región 3'-UTR. De acuerdo con la presente invención, la composición comprende seis ARNm tal como se define en las reivindicaciones, cada uno de los cuales comprendiendo un tallo-bucle de histona como se define aquí.

La composición comprende seis ARNm, donde un ARNm codifica 5T4 y es idéntico a la SEQ ID NO: 19, un ARNm codifica survivina y es idéntico a la SEQ ID NO: 20, un ARNm codifica NY-ESO-1 y es idéntico a la SEQ ID NO: 21, un ARNm codifica MAGE-C1 y es idéntico a la SEQ ID NO: 22, un ARNm codifica MAGE-C2 y es idéntico a la SEQ ID NO: 23 y un ARNm codifica MUC1 y es idéntico a la SEQ ID NO: 24 (o fragmentos o variantes de cada una de estas secuencias) y opcionalmente excipientes adicionales

De acuerdo con otra realización, la composición para su uso de acuerdo con la invención puede comprender un adyuvante con el fin de mejorar las propiedades inmunoestimuladoras de la composición. En este contexto, un adyuvante se puede entender como cualquier compuesto adecuado para apoyar la administración y el suministro de la composición de acuerdo con la invención. Además, tal adyuvante puede, sin limitarse a, iniciar o incrementar una respuesta inmunitaria del sistema inmunitario innato, es decir, una respuesta inmunitaria no específica. En otras palabras, cuando se administra, la composición para su uso de acuerdo con la invención típicamente inicia una respuesta inmunitaria adaptiva debido a los al menos seis antígenos codificados por los al menos seis ARNm contenidos en la composición como se define en las reivindicaciones. Adicionalmente, la composición para su uso de acuerdo con la invención puede generar una respuesta inmunitaria innata (de apoyo) debido a la adición de un adyuvante como se define aquí a la composición aquí descrita.

Tal adyuvante se puede seleccionar de cualquier adyuvante conocido por el experto y adecuado para el presente caso, es decir apoyarla inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero. Preferentemente, el adyuvante se puede seleccionar del grupo consistente en, sin limitarse a, TDM, MDP, dipéptido de muramilo, pluronics, solución de alumbre, hidróxido de aluminio, ADJUMER™ (polifosfaceno); gel de fosfato de aluminio; glucanos de algas; algamulina; gel de hidróxido de aluminio (alumbre); gel de hidróxido de aluminio sumamente absorbente de proteínas; gel de hidróxido de aluminio de baja viscosidad; AF o SPT (emulsión de escualeno (5%), Tween 80 (0,2%), Pluronic L121 (1,25%), solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4); AVR iD in E™ (propanodiamina); BAY R1005TM ((hidroacetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoilamida); CALCITRIOL™ (1-alfa,25-dihidroxi-vitamina D3); gel de fosfato de calcio; CAPTM (nanopartículas de fosfato de calcio); holotoxina de cólera, proteína de fusión de cólera toxina-A1-proteína-A-fragmento D, subunidad B de la toxina de cólera; CRL 1005 (copolímero de bloques P1205); liposomas que contienen citoquinas; DDA (bromuro de dimetildioctadeciamonio); DHEA (deshidroepiandrosterona); DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol); complejo de DOC/alumbre (sal de sodio de ácido desoxicólico); adyuvante completo de Freund; adyuvante incompleto de Freund; inulina-gamma; adyuvante Gerbu (mezcla de: i) N-acetilglucosaminil-(P1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D35 glutamina (GMDP), ii) cloruro de dimetildioctadecilamonio (DDA), iii) complejo de sal de zinc L-prolina (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-acetilglucosaminil-(b14)-N-acetilmuramil-L47-alanil-D-isoglutamina); imiquimod (1-(2-metipropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-4-amina); ImmTher™ (dipalmitato de N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol); DRVs (inmunoliposomas preparados de vesículas de deshidratación-rehidratación); interferón gamma; interleucina-1beta; interleucina-2; interleucina-7; interleucina-12; ISCOMSTM; ISCOPREP 7.0.3.TM; liposomas; LOXORIBINE™ (7-alil-8-oxoguanosina); adyuvante oral LT 5 (enterotoxina-protoxina lábil de E.coli); microesferas y micropartículas de cualquier composición; MF59TM; (emulsión de agua de escualeno); MONTANIDE™ ISA 51 (adyuvante de Freund incompleto purificado); MONTANIDE ISA 720TM (adyuvante de aceite metabolizable); MPLTM (lípido A de 3-Q-desacil-4'monofosforilo); MTP-PE y liposomas MTP-PE ((N-acetil-L alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi))-etilamida, sal de monosodio); MURAMETIDEtm (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINETM y DMURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-gliceroldipalmitoilo); NAGO (neuraminidasa-galactosa-oxidasa); nanoesferas o nanopartículas de cualquier composición; NISVs (vesículas de agentes tensioactivos no iónicos); PLEURAN™ (p-glucano); PLGA, PGA y PLA (homo- y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico; microesferas/nanoesferas); PLURONIC L121TM; PMMA (polimetilmetacrilato); PODDSTM (microesferas proteinoides); derivados de polietilen-carbamato; poli-rA: poli-rU (complejo de ácido poliadenílico-ácido poliuridílico); polisorbato 80 (Tween 80); cocleatos proteínicos (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON™ (QS-21); Quil-A (saponina de QuilA); S-28463 (4-amino-otec-dimetil-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol); SAF-1TM (“formulación adyuvante Syntex”); proteoliposomas Sendai y matrices lipídicas que contienen Sendai; Span-85 (triolato de sorbitan); Specol (emulsión de Marcol 52, Span 85 y Tween 85); escualeno o Robane™ (2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosan y 2,6,10,15,l9,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexano); esteariltirosina (clorhidrato de octadeciltirosina); Theramid® (N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Aladipalmitoxipropilamida); Teronil-MDP (Termurtide™ o [thr 1]-MDP; N-acetilmuramil-treonil-D-isoglutamina); partículas de Ty (Ty-VLPs o partículas similares a virus); liposomas Walter-Reed (liposomas que contienen lípido A adsorbido en hidróxido de aluminio), y lipopéptidos, incluyendo Pam3Cys, en particular sales de aluminio, tales como Adju-phos, Alhydrogel, Rehydragel; emulsiones, incluyendo CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanida, Vaxfectina; copolímeros, incluyendo Optivax (CRL1005), L121, Poloaxmer4010), etc.; liposomas, incluyendo Stealth, cocleatos, incluyendo BlORAL; adyuvantes derivados de plantas, incluyendo QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; adyuvantes adecuados para la co estimulación incluyendo Tomatina, biopolímeros, incluyendo PLG, PMM, Inulina, adyuvantes derivados de microbios, incluyendo Romurtida, DETOX, MPL, c Ws , Manosa, secuencia de ácido nucleicos CpG, CpG7909, ligandos de TLR 1-10 humanos, ligandos de TLR 1-13 de murino, ISS-1018, 35 IC31, Imidazoquinolinas, Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs, toxina de cólera, toxina lábil térmica, Pam3Cys, Flagelina, anclaje GPI, LNFPIII/Lewis X, péptidos antimicrobianos, UC-1V150, proteína de fusión RSV, cdiGMP; y adyuvantes adecuados como antagonistas, incluyendo neuropéptido de CGRP.

Adyuvantes adecuados también se pueden seleccionar de compuestos catiónicos o policatiónicos donde el adyuvante preferentemente se prepara complejando los al menos seis ARNm de la composición con el compuesto catiónico policatiónico. La asociación o complejación del al menos un ARNm de la composición con los compuestos catiónicos o policatiónicos como se definen aquí preferentemente proporciona propiedades adyuvantes y confiere un efecto estabilizante a los ARNm de la composición. En particular, los compuestos catiónicos o policatiónicos preferentes se seleccionan de péptidos o proteínas catiónicas o policatiónicas, incluyendo protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros péptidos o proteínas catiónicas, tal como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, polipéptidos básicos, péptidos de penetración de células (CPP), incluyendo péptidos de unión a VIH, Tat, HIV-1 Tat (HIV), péptidos derivados de Tat, penetratina, derivados o análogos de VP22, HSV VP22 (Herpes simple), MAP, KALA o dominios de transducción de proteína (PTD, PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en lisina, péptido(s) MPG, Pep-1, L-oligómeros, péptido(s) de calcitonina, péptidos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, Lactoferina, Transportano, Buforina-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, protamina, espermina, espermidina, o histonas. Compuestos catiónicos o policatiónicos preferentes adicionales pueden incluir polisacáridos catiónicos, por ejemplo quitosano, polibreno, polímeros catiónicos, por ejemplo polietilenimina (PEI), lípidos catiónicos, por ejemplo DOTMA: cloruro de 1-(2,3-sioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: dioleil-fosfatidiletanolamina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: dioctadecilamidoglicilespermina, DIMRI: bromuro de dimiristo-oxipropil-dimetilhidroxietil-amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano, DC-6-14: cloruro de O,O-ditetradecanoil-N-(trimetilamonioacetil)dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-(2,3-dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)-dimetilamonio, CLIP6: rac-2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi)etil-trimetilamonio, CLIP9: rac-2-(2,3-dihexadeciloxipropil-oxisucciniloxi)etil-trimetilamonio, oligofectamina, o polímeros catiónicos o policatiónicos, por ejemplo poliaminoácidos modificados, tales como polímeros de aminoácido o poliamidas inversas, etc., polietilenos modificados, tal como PVP (bromuro de (poli(N-etil-4-vinilpiridinio)), etc., acrilatos modificados, tales como pDMAEMA (poli(dimetilaminoetil metilacrilato)), etc., amidoaminas modificadas tal como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibetaaminoéster modificado (PBAE), tal como diamina y polímeros de diacrilato de 1,4-butanodiol-diacrilato-co-5-amino-1-pentanol, etc., dendrímeros, tal como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros basados en pAMAM, etc., poliimina(s), tal como PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), etc., polialilamina, polímeros basados en la cadena principal de azúcar, tal como polímeros basados en ciclodextrina, polímeros basados en dextrano, quitosano, etc., polímeros basados en un esqueleto silano, tal como copolímeros PMOXA-PDMS, etc., polímeros en bloque consistentes en una combinación de uno o más bloques catiónicos (por ejemplo seleccionados de un polímero catiónico como se menciona anteriormente) y uno o más bloques hidrofílicos o hidrofóbicos (por ejemplo polietilenglicol); etc.

Adicionalmente, proteínas o péptidos catiónicos o policatiónicos preferentes que se pueden usar como adyuvante mediante complejación del al menos un ARNm de la composición se puede seleccionar de las siguientes proteínas o péptidos con la siguiente fórmula total (III): (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, donde l m n o x = 8-15, y l, m, n u o, independientemente entre sí, pueden ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, con la condición de que el contenido total de Arg, Lys, His y Orn represente al menos el 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos, excepto Arg, Lys, His u Orn; y x puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3 o 4, con la condición de que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido. Oligoargininas particularmente preferentes en este contexto son, por ejemplo, Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, etc.

La relación entre el ARNm y el compuesto catiónico o policatiónico en el componente adyuvante se puede calcular sobre la base de la relación nitrógeno/fosfato (relación N/P) del complejo de ARNm completo, es decir, la relación entre los átomos cargados positivamente (nitrógeno) del compuesto catiónico o policatiónico y los átomos fosfato cargados negativamente de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, 1 |jg de ARN contiene típicamente aproximadamente 3 nmol de residuos fosfato, con la condición de que el ARN muestre una distribución estadística de bases. Además, 1 jg de péptido contiene típicamente aproximadamente x nmol de residuos nitrógeno, dependiendo del peso molecular y del número de aminoácidos básicos. Cuando se calcula a modo de ejemplo para (Arg)9 (peso molecular 1.424 g/mol, 9 átomos de nitrógeno), 1 jg de (Arg)9 contiene aproximadamente 700 pmol de (Arg)9 y así 700 x 9 = 6.300 pmol de aminoácidos básicos = 6,3 nmol de átomos de nitrógeno. Para una relación en masa de aproximadamente 1:1 ARN/(Arg)9, se puede calcular una relación N/P de aproximadamente 2. Cuando se calcula a modo de ejemplo para la protamina (peso molecular de aproximadamente 4.250 g/mol, 21 átomos de nitrógeno, empleando protamina de salmón) con una relación en masa de aproximadamente 2:1 con 2 jg de ARN, se pueden calcular 6 nmol de fosfato para el ARN; 1 jg de protamina contiene aproximadamente 235 pmol de moléculas de protamina y así 235 x 21 = 4.935 pmol de átomos de nitrógeno básicos = 4,9 nmol de átomos de nitrógeno. Para una relación en masa de aproximadamente 2:1 ARN/protamina, puede calcularse una relación N/P de aproximadamente 0,81. Para una relación en masa de aproximadamente 8:1 ARN/protamina, puede calcularse una relación N/P de aproximadamente 0,2. En el contexto de la presente invención, una relación N/P preferentemente está en el intervalo de aproximadamente 0,1-10, de manera preferente en un intervalo de aproximadamente 0,3-4 y con especial preferencia en un intervalo de aproximadamente 0,5-2 o 0,7-2, con respecto a la relación ARN:péptido en el complejo, y con total preferencia en el intervalo de aproximadamente 0,7-1,5.

En una realización preferente, la composición para su uso se obtiene en dos etapas separadas con el fin de obtener tanto un efecto inmunoestimulador eficiente como una traducción eficiente de los al menos seis ARNm aquí descritos. Aquí, se prepara el llamado “componente adyuvante” combinando - en un primer paso - al menos un ARNm del componente adyuvante con un compuesto catiónico o policatiónico en una relación específica para formar un complejo estable. En este contexto, es importante que ningún compuesto catiónico o policatiónico libre o solo una pequeña cantidad insignificante permanezca en el componente adyuvante después de la complejación con el ARNm. Por consiguiente, la relación entre ARNm y el compuesto catiónico o policatiónico en el componente adyuvante se selecciona típicamente de un intervalo tal que el ARNm está complejado completamente y no hay compuesto catiónico o policatiónico libre o solo una pequeña cantidad insignificante en la composición. Preferentemente, la relación del componente adyuvante, es decir la relación entre el ARNm y el compuesto catiónico o policatiónico se selecciona de un intervalo de aproximadamente 6:1 (p/p) a aproximadamente 0,25:1 (p/p), de manera más preferente de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 0,5:1 (p/p), de manera aún más preferente de aproximadamente 4:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p) o de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p), y con total preferencia es una relación de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 2:1 (p/p).

De acuerdo con una realización preferente, los al menos seis ARNm que codifican los antígenos aquí descritos se añaden, en un segundo paso, al ARNm complejado del componente adyuvante con el fin de formar la composición (inmunoestimuladora). Aquí, el al menos ARNm se añade como un ARNm libre, es decir un ARNm no complejado con otros compuestos. Antes de la adición, el al menos un ARNm libre no está complejado y preferentemente no está sometido a ninguna reacción de complejación detectable o significativa por la adición del componente adyuvante. Esto es debido a la fuerte unión del componente catiónico o policatiónico con el al menos un ARNm descrito anteriormente en el componente adyuvante. En otras palabras, cuando el ARNm libre, que codifica uno de los antígenos aquí descritos, se agrega al “componente adyuvante”, preferentemente no hay presente ningún compuesto catiónico o policatiónico libre o esencialmente libre que pueda formar un complejo con el ARNm libre. Por consiguiente, es posible una traducción eficiente del ARNm libre de la composición in vivo. Aquí, al menos un ARNm libre puede estar presente como un ARNm mono-, di- o multicistrónico, es decir un ARNm que lleva la secuencia de codificación de una o más proteínas. Tales secuencias de codificación del ARNm di- o multicistrónico pueden estar separadas por al menos una secuencia IRES, por ejemplo como se define aquí.

En una realización particularmente preferente, el al menos un ARNm libre comprendido en la composición aquí descrita puede ser idéntico o diferente que al menos un ARNm del componente adyuvante de la composición aquí descrita, dependiendo de los requisitos específicos de la terapia. Aún de manera más preferente, el al menos un ARNm libre comprendido en la composición aquí descrita es idéntico a al menos un ARNm del componente adyuvante de la composición aquí descrita.

En una realización particularmente preferente, la composición comprende al menos seis ARNm, donde los al menos seis ARNm codifican los antígenos como se definen anteriormente y donde dicho ARNm está presente en la composición parcialmente como un ARNm libre y parcialmente como un ARNm combinado. Preferentemente, los al menos seis ARNm que codifican un antígeno como se define anteriormente están complejados como se describe arriba y los mismos al menos seis ARNm se añaden entonces como ARNm libres, donde, de manera preferente, el compuesto que se usa para complejar el ARNm no está presente en forma libre en la composición en el momento de la adición del componente de ARNm libre.

La relación entre el primer componente (es decir, el componente adyuvante que comprende o consiste en al menos un ARNm complejado con un compuesto catiónico o policatiónico) y el segundo componente (es decir, el al menos un ARNm libre) se puede seleccionar en la composición aquí descrita de acuerdo con los requisitos específicos de una terapia concreta. Típicamente, la proporción entre el ARNm en el componente adyuvante y el al menos un ARNm libre (ARNm en el componente adyuvante: ARN libre) de la composición aquí descrita se selecciona de manera que se induce una estimulación significativa del sistema inmunitario innato debido al componente adyuvante. En paralelo, la proporción se selecciona de manera que una cantidad significativa del ARNm libre pueda proporcionarse in vivo, conduciendo a una traducción eficiente y a una concentración de la proteína expresada in vivo, por ejemplo los seis antígenos, etc., como se define anteriormente. Preferentemente, la relación ARNm en el componente adyuvante:ARNm libre en la composición aquí descrita se selecciona de un intervalo de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 1:10 (p/p), de manera más preferente de un intervalo de aproximadamente 4:1 (p/p) a aproximadamente 1:8 (p/p), de manera aún más preferente de un intervalo de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:5 (p/p) o 1:3 (p/p), y de manera totalmente preferente la relación ARNm del componente adyuvante:ARNm libre en la composición aquí descrita se selecciona de una relación de aproximadamente 1:1 (p/p).

Adicional o alternativamente, la relación entre el primer componente (es decir, el componente adyuvante que comprende o consiste en al menos un ARNm complejado con un compuesto catiónico o policatiónico) y el segundo componente (es decir, el al menos un ARNm libre) se puede calcular sobre la base de la relación nitrógeno/fosfato (relación N/P) del complejo de ARNm completo. En el contexto de la presente descripción, una relación N/P preferentemente está en el intervalo de aproximadamente 0,1-10, de manera preferente en un intervalo de aproximadamente 0,3-4 y con mayor preferencia en un intervalo de aproximadamente 0,5-2 o 0,7-2 con respecto a la relación ARN:péptido en el complejo, y con total preferencia en el intervalo de aproximadamente 0,7-1,5.

Adicional o alternativamente, la proporción entre el primer componente (es decir, el componente adyuvante que comprende o consiste en al menos un ARNm complejado con un compuesto catiónico o policatiónico) y el segundo componente (es decir, el al menos un ARNm libre) también se puede seleccionar en la composición aquí descrita sobre la base de la relación molar de ambos ARNm entre sí, es decir el ARNm del componente adyuvante, complejado con un compuesto catiónico o policatiónico, y el al menos un ARNm libre del segundo componente. Típicamente, la relación molar entre el ARNm del componente adyuvante y el al menos un ARNm libre del segundo componente se puede seleccionar de manera que la relación molar cumple las definiciones anteriores (p/p) y/o N/P. De manera más preferente, la relación molar entre el ARNm del componente adyuvante y el al menos un ARNm libre del segundo componente se puede seleccionar, por ejemplo, de una relación molar de aproximadamente 0,001:1, 0,01:1, 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1:0,9, 1:0,8, 1:0,7, 1:0,6, 1:0,5, 1:0,4, 1:0,3, 1:0,2, 1:0,1, 1:0,01, 1:0,001, etc., o de cualquier intervalo formado por cualesquiera dos de los valores anteriores, por ejemplo un intervalo seleccionado de aproximadamente 0,001:1 a 1:0,001, incluyendo un intervalo de aproximadamente 0,01:1 a 1:0,001, 0,1:1 a 1:0,001, 0,2:1 a 1:0,001, 0,3:1 a 1:0,001, 0,4:1 a 1:0,001, 0,5:1 a 1:0,001, 0,6:1 a 1:0,001, 0,7:1 a 1:0,001, 0,8:1 a 1:0,001, 0,9:1 a 1:0,001, 1:1 a 1:0,001, 1:0,9 a 1:0,001, 1:0,8 a 1:0,001, 1:0,7 a 1:0,001, 1:0,6 a 1:0,001, 1:0,5 a 1:0,001, 1:0,4 a 1:0,001, 1:0,3 a 1:0,001, 1:0,2 a 1:0,001, 1:0,1 a 1:0,001, 1:0,01 a 1:0,001, o un intervalo de aproximadamente 0,01:1 a 1:0,01, 0,1:1 a 1:0,01, 0,2:1 a 1:0,01, 0,3:1 a 1:0,01, 0,4:1 a 1:0,01, 0,5:1 a 1:0,01, 0,6:1 a 1:0,01, 0,7:1 a 1:0,01, 0,8:1 a 1:0,01, 0,9:1 a 1:0,01, 1:1 a 1:0,01, 1:0,9 a 1:0,01, 1:0,8 a 1:0,01, 1:0,7 a 1:0,01, 1:0,6 a 1:0,01, 1:0,5 a 1:0,01, 1:0,4 a 1:0,01, 1:0,3 a 1:0,01, 1:0,2 a 1:0,01, 1:0,1 a 1:0,01, 1:0,01 a 1:0,01, o incluyendo un intervalo de aproximadamente 0,001:1 a 1:0,01, 0,001:1 a 1:0,1, 0,001:1 a 1:0,2, 0,001:1 a 1:0,3, 0,001:1 a 1:0,4, 0,001:1 a 1:0,5, 0,001:1 a 1:0,6, 0,001:1 a 1:0,7, 0,001:1 a 1:0,8, 0,001:1 a 1:0,9, 0,001:1 a 1:1, 0,001 a 0,9:1, 0,001 a 0,8:1, 0,001 a 0,7:1, 0,001 a 0,6:1, 0,001 a 0,5:1, 0,001 a 0,4:1, 0,001 a 0,3:1, 0,001 a 0,2:1, 0,001 a 0,1:1, o un intervalo de aproximadamente 0,01:1 a 1:0,01, 0,01:1 a 1:0,1, 0,01:1 a 1:0,2, 0,01:1 a 1:0,3, 0,01:1 a 1:0,4, 0,01:1 a 1:0,5, 0,01:1 a 1:0,6, 0,01:1 a 1:0,7, 0,01:1 a 1:0,8, 0,01:1 a 1:0,9, 0,01:1 a 1:1, 0,001 a 0,9:1, 0,001 a 0,8:1, 0,001 a 0,7:1, 0,001 a 0,6:1, 0,001 a 0,5:1, 0,001 a 0,4:1, 0,001 a 0,3:1, 0,001 a 0,2:1, 0,001 a 0,1:1, etc.

De manera aún más preferente, la relación molar entre el ARNm del componente adyuvante y el al menos un ARNm libre del segundo componente se puede seleccionar, por ejemplo, de un intervalo de aproximadamente 0,01:1 a 1:0,01. De manera especialmente preferente, la relación molar entre el ARNm del componente adyuvante y el al menos un ARNm libre del segundo componente se puede seleccionar, por ejemplo, de una relación molar de aproximadamente 1:1. Cualquiera de las definiciones anteriores con respecto a la relación (p/p) y/o N/P también puede aplicarse.

Adyuvantes adecuados pueden además seleccionarse de ácidos nucleicos de la fórmula (IV): GlXmGn, donde: G es guanosina, uridina o un análogo de guanosina o uridina; X es guanosina, uridina, adenosina, timidina, citidina o un análogo de los nucleótidos antes mencionados; l es un número entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, G es guanosina o un análogo de la misma; cuando l > 1, al menos el 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma; m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3, X es uridina o un análogo de la misma; cuando m > 3, están presentes al menos 3 uridinas o análogos de la misma; n es un entero de 1 a 40, donde cuando n = 1 G es guanosina o un análogo de la misma, cuando n > 1, al menos el 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma.

Otros adyuvantes adecuados se pueden seleccionar de ácidos nucleicos con la fórmula (V): ClXmCn, donde: C es citidina, uridina o un análogo de citidina o uridina; X es guanosina, uridina, adenosina, timidina, citidina o un análogo de estos nucleótidos; l es un número entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, C es cititidina o un análogo de la misma, cuando l > 1, al menos el 50% de los nucleótidos son citidina o un análogo de la misma; m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3, X es uridina o un análogo de la misma; cuando m > 3, están presentes al menos 3 uridinas o análogos de la misma sucesivas; n es un entero de 1 a 40, donde, cuando n = 1, C es citidina o un análogo de la misma, cuando n > 1, al menos el 50% de los nucleótidos son citidina o un análogo de la misma.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención puede proporcionar una vacuna para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico. La vacuna comprende una composición tal como se define en las reivindicaciones. Preferentemente, la vacuna comprende además un vehículo farmacéutica aceptable. Así, la vacuna comprende al menos seis especies distintas de ARNm como se definen en las reivindicaciones, que codifican al menos los antígenos definidos anteriormente 5T4, survinina, NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2 y MUC-1. Por consiguiente, la vacuna aquí descrita se basa en los mismos componentes que las composiciones definidas arriba. En su caso, puede estar referida a la descripción anterior que define la composición. En realizaciones no reivindicadas, la vacuna inventiva, sin embargo, puede proporcionarse en una forma separada físicamente y puede administrarse en pasos de administración separados. La vacuna aquí descrita puede corresponder a la composición aquí descrita si los componentes de ARNm se proporcionan en una única composición. Sin embargo, según una realización no reivindicada, la vacuna aquí descrita puede proporcionarse, por ejemplo, físicamente separada. Por ejemplo, las especies de ARNm se pueden proporcionar de forma que dos composiciones separadas, que pueden contener al menos una especie de ARNm cada una (por ejemplo tres especies de ARNm distintas) que codifican para tres antígenos distintos, se proporcionan de manera que pueden o no combinarse (no reivindicado). Asimismo, la vacuna aquí descrita puede ser una combinación de tres composiciones distintas, cada composición comprendiendo al menos un ARNm que codifica dos de los seis antígenos anteriores (no reivindicado). O la vacuna puede proporcionarse como una combinación de al menos un ARNm, preferentemente seis ARNm, cada uno codificando para uno de los seis antígenos definidos anteriormente (no reivindicado). La vacuna se puede combinar para proporcionar una única composición antes de su uso o se puede usar de manera que sea necesaria más de una administración para administrar las distintas especies de ARNm que codifican para los seis antígenos distintos definidos anteriormente (no reivindicado). Si la vacuna contiene al menos una molécula de ARNm, típicamente al menos dos moléculas de ARNm, que codifican para los seis antígenos definidos anteriormente, por ejemplo puede administrarse mediante una única administración (combinando todas las especies de ARNm), mediante dos administraciones separadas (por ejemplo cada administración administra las moléculas de ARNm que codifican para tres de los seis antígenos anteriores), mediante tres, cuatro, cinco o seis administraciones (en el caso en que todas las especies de ARNm codifican uno de los seis antígenos definidos anteriormente y se proporcionen separados físicamente). Por consiguiente, cualquier combinación de ARNm mono-, bi- o multicistrónicos que codifican para los seis antígenos definidos anteriormente (y opcionalmente otros antígenos), proporcionados como entidades separadas (conteniendo una especie de ARNm) o como una entidad combinada (conteniendo más de una especie de ARNm) se entiende como la vacuna según la presente descripción (no reivindicado). De acuerdo con una realización no reivindicada de la vacuna aquí descrita, cada uno de los antígenos aquí definidos se proporciona como un ARNm individual (monocistrónico), que se administra de forma separada.

Como con la composición aquí descrita, las entidades de la vacuna se pueden proporcionar en forma líquida o en forma seca (por ejemplo liofilizada). Pueden contener componentes adicionales, en particular otros componentes que permiten su uso farmacéutico. La vacuna o la composición aquí descritas pueden contener además, por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o sustancias auxiliares adicionales y aditivos y/o adyuvantes.

La vacuna o la composición aquí descritas comprenden típicamente una cantidad segura y efectiva de los al menos seis ARNm de la composición como se define anteriormente que codifican los antígenos definidos arriba. Tal como se usa aquí, “cantidad segura y efectiva” significa una cantidad de los al menos seis ARNm de la composición o la vacuna como se define arriba que es suficiente para inducir significativamente una modificación positiva del cáncer de pulmón, preferentemente una condición relacionada con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) a tratar, de manera más preferente condiciones relacionadas con los tres subtipos de NSCLC incluyendo, sin que se restrinja a, carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes. Al mismo tiempo, sin embargo, una “cantidad segura y efectiva” es lo suficiente pequeña como para evitar efectos secundarios serios, es decir permite una relación equilibrada entre ventaja y riesgo. La determinación de estos límites está normalmente dentro del alcance del juicio médico sensible. En relación a la vacuna o a la composición aquí descritas, la expresión “cantidad segura y efectiva” preferentemente significa una cantidad del ARNm (y así de los antígenos codificados) que es adecuada para estimular el sistema inmunitario adaptivo, de manera que no se logran reacciones inmunitarias excesivas o perjudiciales sino que, preferentemente, tales reacciones inmunitarias están por debajo de un nivel medible. Tal “cantidad segura y efectiva” de los al menos seis ARNm de la composición o la vacuna como se definen anteriormente puede seleccionarse además dependiendo del tipo de ARNm, por ejemplo ARNm monocistrónico, bi- o multicistrónico, ya que un ARNm bi- o multicistrónico puede conducir a una expresión significativamente más alta del o de los antígenos codificados que el uso de una cantidad igual de un ARNm monocistrónico. Una “cantidad segura y efectiva” del al menos un ARNm de la composición o la vacuna como se definen anteriormente variará además según la afección particular a tratar y también con la edad y la condición física del paciente a tratar, la gravedad de la afección, la duración del tratamiento, la naturaleza de terapias acompañantes, del portador farmacéuticamente aceptable particular usado y factores similares, dentro del conocimiento y experiencia del médico. La vacuna o la composición aquí descritas pueden emplearse de acuerdo con la invención para propósitos médicos humanos y también veterinarios, como una composición farmacéutica o como una vacuna.

En una realización preferente, los al menos seis ARNm de la composición, vacuna o kit de partes para su uso de acuerdo con la invención se proporcionan en forma liofilizada. Preferentemente, los al menos seis ARNm liofilizados se reconstituyen en una solución tampón adecuada, ventajosamente basada en un vehículo acuoso, antes de la administración, por ejemplo una solución Ringer-Lactato, que es preferente, una solución de Ringer, una solución tampón fosfato. En una realización preferente, la composición, la vacuna o el kit de partes aquí descritos contienen seis ARNm, que se proporcionan por separado en forma liofilizada (opcionalmente junto con al menos un aditivo adicional) y que son reconstituidos preferentemente por separado en una solución tampón adecuada (tal como una solución Ringer-Lactato) antes de su uso para permitir la administración individual de cada uno de los seis ARNm (monocistrónicos).

La vacuna o la composición para su uso de acuerdo con la invención puede contener típicamente un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” tal como se usa aquí incluye preferentemente la base líquida o no líquida de la vacuna inventiva. Si la vacuna inventiva se proporciona en forma líquida, el vehículo será agua, típicamente libre de pirógenos; solución salina isotónica o soluciones tampón (acuosas), por ejemplo soluciones tampón fosfato, citrato, etc. En particular, para la inyección de la vacuna, se puede emplear agua o preferentemente un tampón, en especial un tampón acuoso, que contenga una sal de sodio, preferentemente al menos 50 mM de una sal de sodio, un sal de calcio, preferentemente al menos 0,01 mM de una sal de calcio, y opcionalmente una sal de potasio, preferentemente al menos 3 mM de una sal de potasio. De acuerdo con una realización preferente, las sales de sodio, calcio y opcionalmente de potasio pueden estar presentes en forma de sus haluros, por ejemplo cloruros, yoduros o bromuros, en forma de sus hidróxidos, carbonatos, hidrogenocarbonatos o sulfatos, etc. Sin limitarse a éstos mismos, ejemplos de sales de sodio incluyen, por ejemplo, NaCl, NaI, NaBr, Na²CO³, NaHCO³, Na²SO⁴, ejemplos de sales de potasio opcionales incluyen, por ejemplo, KCl, KI, KBr, K²CO³, KHCO³, K²SO⁴, y ejemplos de sales de calcio incluyen, por ejemplo, CaCh, Cah, CaBr², CaCO³, CaSO⁴, Ca(OH)². Además, el tampón puede contener aniones orgánicos de los cationes mencionados anteriormente. De acuerdo con una realización especialmente preferente, el tampón adecuado para propósitos de inyección como se define anteriormente puede contener sales seleccionadas de cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCh) y opcionalmente cloruro de potasio (KCl), pudiendo estar presentes otros aniones diferentes a cloruros. El CaCh también se puede reemplazar por otra sal similar al KCl. Típicamente, las sales en el tampón de inyección están presentes en una concentración de al menos 50 mM de cloruro de sodio (NaCl), al menos 3 mM de cloruro de potasio (KCl) y al menos 0,01 mM de cloruro de calcio (CaCh). El tampón de inyección puede ser hipertónico, isotónico o hipotónico en relación al medio de referencia específico, es decir el tampón puede tener un contenido de sal superior, idéntico o inferior en relación al medio de referencia específico, donde preferentemente pueden emplearse las concentraciones de las sales mencionadas anteriormente, que no conducen a un daño celular debido a la ósmosis o a otros efectos de la concentración. Medios de referencia son, por ejemplo, los líquidos empelados en métodos “in vivo", tales como sangre, linfa, líquidos citosólicos u otros líquidos corporales, o por ejemplo líquidos que se pueden usar como medio de referencia en métodos “in vitro”, como líquidos o tampones haituales. Tales líquidos o tampones habituales son conocidos por el experto. La solución Ringer-Lactato es particularmente preferente como base líquida.

Sin embargo, también pueden emplearse una o más cargas sólidas o líquidas o diluyentes o compuestos encapsulantes compatibles, adecuados para la administración a una persona. El término “compatible” como se usa aquí significa que los constituyentes de la vacuna son capaces de mezclarse con los al menos seis ARNm de la composición, que codifican al menos seis antígenos como se define anteriormente,de manera que no existe una interacción que reduzca esencialmente la efectividad farmacéutica de la vacuna bajo las condiciones de uso típicas. Por supuesto, los vehículos, cargas y diluyentes farmacéuticamente aceptables deben tener una pureza lo suficientemente alta y una toxicidad lo suficientemente baja para hacerlos adecuados para la administración a una persona a tratar. Algunos ejemplos de compuestos que pueden emplearse como vehículos, cargas o constituyentes farmacéuticamente aceptables son azúcares, por ejemplo lactosa, glucosa, trehalosa y sacarosa; almidones, por ejemplo almidón de maíz o de patata; dextrosa; celulosa y sus derivados, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; grasas; deslizantes sólidos, por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, por ejemplo aceite de nuez molida, aceite de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, por ejemplo polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico.

La elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable viene determinada, en principio, por la forma en que la se administra la vacuna. La vacuna se puede administrar, por ejemplo, sistémica o localmente. Las vías de administración sistémica en general incluyen, por ejemplo, la vía transdérmica, oral, parenteral, incluyendo subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intradérmica e inyecciones intraperitoneales y/o vías de administración intranasales. Las vías para la administración local incluyen en general, por ejemplo, vías de administración tópicas, pero también inyecciones intradérmicas, transdérmicas, subcutáneas o intramusculares o inyecciones intralesionales, intracraneales, intrapulmonares, intracardiacas y sublinguales. De manera preferente, las vacunas se pueden administrar vía intradérmica, subcutánea o intramuscular, preferentemente por inyección, que puede ser inyección sin y/o con aguja. Por tanto, las composiciones/vacunas se formulan preferentemente en forma líquida o sólida. La cantidad adecuada de vacuna a administrar se puede determinar mediante experimentos de rutina con modelos animales. Tales modelos incluyen, sin implicar ninguna limitación, conejo, oveja, ratón, rata, perro y modelos de primate no humano. Las formas de dosis unitarias preferentes para la inyección incluyen soluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de las mismas. El pH de estas soluciones se debe ajustar a aproximadamente 7,4. Vehículos adecuados para la inyección incluyen hidrogeles, dispositivos de liberación controlada o retardada, ácido poliláctico y matrices de colágeno. Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la aplicación tópica incluyen aquellos adecuados para el uso en lociones, cremas, geles y similares. Si la vacuna se va a administrar perotalmente, los comprimidos, cápsulas y similares son formas de dosis unitaria preferentes. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para la preparación de las formas de dosis unitaria que se pueden usar para la administración oral son bien conocidos en la técnica anterior. Su elección dependerá de consideraciones secundarias, tales como sabor, coste y capacidad de almacenamiento, que no son críticos para los propósitos de la presente invención y pueden ser evaluados sin dificultad por el experto en la técnica.

La vacuna o composición puede contener adicionalmente una o más sustancias auxiliares con el fin de incrementar además la inmunogenicidad. Una acción sinérgica de los al menos seis ARNm de la composición o vacuna como se define anteriormente y de una sustancia auxiliar, que opcionalmente se puede co-formular (o formular separadamente) con la vacuna o la composición inventiva describe anteriormente, se consigue preferentemente por este medio. Dependiendo de los diversos tipos de sustancias auxiliares, a este respecto entran en consideración varios mecanismos. Por ejemplo, los compuestos que permiten la maduración de las células dendríticas (DC), por ejemplo lipopolisacáridos, TNF-alfa o ligando CD40, forman una primera clase de sustancias auxiliares adecuadas. En general, es posible usar como sustancia auxiliar cualquier agente que influya en el sistema inmunitario a manera de “señal de peligro” (LPS, GP96, etc.) o citoquinas, como GM-CFS, que permiten una respuesta inmunitaria producida por el adyuvante inmunoestimulador aquí descrito a mejorar y/o incluir de forma dirigida. Sustancias auxiliares particularmente preferentes son citoquinas, tales como monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimioquinas, que - además de la inducción de la respuesta inmunitaria mediante al menos seis antígenos codificados - promueven la respuesta inmunitaria innata, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-alfa, IFN-beta, INF-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta o TNF-alfa, factores de crecimiento, como hGH. Preferentemente, tales agentes o compuestos de incremento de la inmunogenicidad se proporcionan separadamente (no se co-formulan con la vacuna o la composición) y se administran individualmente.

Otros aditivos que pueden incluirse en la vacuna o composición son emulsificantes, tales como, por ejemplo, Tween; agentes humectantes, por ejemplo laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes, vehículos farmacéuticos; agentes formadores de comprimidos; estabilizantes; antioxidantes; conservantes. La vacuna o la composición puede contener además cualquier compuesto adicional conocidos por ser inmunoestimulador debido a su afinidad de unión (como ligando) a los receptores tipo Toll humanos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, o debido a su afinidad de unión (como ligandos) a los receptores tipo Toll murinos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13.

Otra clase de compuestos que pueden añadirse a una vacuna o composición en este contexto pueden ser ácidos nucleicos CpG, en particular CpG-ARN o CpG-ADN. Un CpG-ARN o CpG-ADN puede ser un CpG-ADN monohebra (ssCpG-ADN), un CpG-ADN de doble hebra (dsDNA), un CpG-ARN monohebra (ssCpG-RNA) o un CpG-ARN de doble hebra (ds CpG-ARN). El ácido nucleico CpG preferentemente está en forma de CpG-ARN, de manera más preferente en forma de CpG-ARN monohebra (ssCpG-RNA). El ácido nucleico CpG preferentemente contiene al menos una o más secuencia(s) de dinucleótidos citosina/guanina (mitogénico) (motivo(s) de CpG). De acuerdo con una primera alternativa preferente, el al menos un motivo de CpG contenido en estas secuencias, es decir C (citidina) y G (guanina) del motivo CpG no está metilada. Todas las demás citidinas o guaninas contenidas opcionalmente en estas secuencias pueden estar metiladas o no metiladas. De acuerdo con otra alternativa preferente, sin embargo, la C (citidina) y la G (guanina) del motivo CpG también pueden estar presentes en forma metilada.

Preferentemente, los compuestos anteriores se formulan y administran separadamente a partir de la composición o vacuna anterior que contiene al menos seis ARNm que codifican al menos los seis antígenos definidos anteriormente.

De acuerdo con un objeto adicional de la presente descripción, la composición o la vacuna aquí descritas se pueden usar para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de pulmón y de enfermedades y trastornos relacionados con éste, preferentemente en una condición relativa al cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) a tratar, más preferentemente en afecciones relacionadas con los tres sub-tipos principales de NSCLC, incluyendo, sin limitación, carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes.

De acuerdo con otro objeto preferente de la presente invención, la vacuna o la composición que contienen los al menos seis ARNm que codifican los antígenos como se definen en las reivindicaciones se proporcionan para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo el tratamiento además la administración de un agente quimioterapéutico.

También se describe aquí la vacuna o la composición aquí descritas para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón y trastornos relacionados con el mismo, preferentemente de una afección relativa al cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) a tratar, más preferentemente afecciones relacionadas con los tres sub-tipos principales de NSCLC incluyendo, sin limitación, carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes.

En este contexto, también se incluyen en la presente descripción la vacuna o la composición para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón y trastornos relacionados con el mismo, preferentemente de una afección relativa al cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) a tratar, más preferentemente afecciones relacionadas con los tres sub-tipos principales de NSCLC incluyendo, sin limitación, carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes, mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una vacuna o de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición. Tal tratamiento comprende típicamente un primer paso opcional de preparar la composición, o la vacuna, y un segundo paso que comprende administrar (una cantidad farmacéuticamente efectiva de) dicha composición o de dicha vacuna a un paciente que lo necesite. Un sujeto que lo necesite será típicamente un mamífero. En el contexto de la presente descripción, el mamífero se selecciona preferentemente del grupo que comprende, sin limitarse a, por ejemplo, cabra, ganado, cerdo, perro, gato, burro, mono, simio o roedor tal como ratón, hámster, conejo y particularmente, humano, donde el mamífero típicamente padece de cáncer de pulmón y enfermedades y trastornos relacionados con el mismo, preferentemente una afección relacionada con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) a tratar, de manera más preferente afecciones relacionadas con los tres sub-tipos principales de NSCLC incluyendo, sin que se restrinja a, carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes.

La presente descripción se refiere también a la composición o a los menos seis ARNm que codifican los antígenos como se definen aquí para la preparación de una vacuna, preferentemente para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero, de manera preferente para el tratamiento del cáncer de pulmón, de manera más preferente para el tratamiento de una condición relacionada con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) como se define aquí.

Preferentemente, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio 0, I (IA y/o IB), II (IIA y/o IIB), III (IIIA y/o IIIB) o IV.

En una realización particular, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV.

Adicionalmente, el sujeto que recibe la composición o la vacuna puede ser un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas que recibe quimioterapia (por ejemplo quimioterapia de primera línea o de segunda línea), radioterapia, quimiorradiación (combinación de quimioterapia y radioterapia), inhibidores de tirosina-quinasa (por ejemplo inhibidores de tirosina-quinasa EGFR), terapia de anticuerpos y/o inhibidores de la ruta PD1, o un paciente que ha logrado una respuesta parcial o una enfermedad estable después de haber recibido uno o más de los tratamientos especificados arriba.

En este contexto, un inhibidor de la ruta PD-1 se define aquí preferentemente como un compuesto capaz de deteriorar la señalización de la ruta PD-1, de manera preferente la señalización mediada por el receptor PD-1. Por tanto, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser cualquier inhibidor dirigido contra cualquier miembro de la ruta PD-1 capaz de antagonizar la señalización de la ruta PD-1. En este contexto, el inhibidor puede ser un anticuerpo antagonista, que fija como objetivo cualquier miembro de la ruta PD-1, preferentemente dirigido contra el receptor PD-1, PD-L1 o PD-L2. Este anticuerpo antagonista también puede ser codificado por un ácido nucleico. También, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un fragmento del receptor PD-1 o el receptor PD1 que bloquea la actividad de los ligandos PD1. B7-1 o fragmentos del mismo pueden actuar también como ligandos inhibidores de PD1. Adicionalmente, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser ARNsi (ARN interferente pequeño) o ARN antisentido dirigido contra un miembro de la ruta PD-1, preferentemente PD-1, PD-L1 o PD-L2. Adicionalmente, un inhibidor de la ruta PD-1 puede ser una proteína que comprende (o un ácido nucleico que codifica para) una secuencia de aminoácidos capaz de unirse a PD-1, pero que previene la señalización de PD-1, por ejemplo inhibiendo PD-1 y B7-H1 o la interacción B7-Dl . Adicionalmente, un inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un inhibidor de molécula pequeña capaz de inhibir la señalización de la ruta PD-1, por ejemplo un péptido de unión a PD-1 o una molécula orgánica pequeña.

Además, en este contexto, un inhibidor de tirosina-quinasa se define aquí preferentemente como un compuesto capaz de deteriorar la señalización de una o más tirosina-quinasas, preferentemente uno o más factores de crecimiento tirosina-quinasas. De manera preferente, un inhibidor de tirosina-quinasa como se usa en este contexto es un inhibidor del receptor de tirosina-quinasa del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En una realización preferida, un inhibidor de tirosina-quinasa como se usa aquí es un inhibidor de tirosina-quinasa de EGFR oral. En una realización preferida adicional, un inhibidor de tirosina-quinasa se selecciona del grupo de erlotinib, gefitinib o afatinib. En otra realización, un inhibidor de tirosina-quinasa como se usa en este contexto es un inhibidor de ALK, preferentemente crizotinib o ceritinib.

Tal como se usa aquí, un anticuerpo usado en la terapia de anticuerpos preferentemente se dirige contra un factor de crecimiento o un receptor de factor de crecimiento, preferentemente funcionalmente unido a una tirosina-quinasa. De manera preferente, un anticuerpo, en este contexto, se dirige contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En una realización preferida, el bevacizumab se usa en una terapia de anticuerpos. En otra realización, el cetuximab se usa en una terapia de anticuerpos.

En una realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente antes o después de cirugía (por ejemplo lobectomía), donde el paciente preferentemente padece NSCLC en estadio I o II.

En otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que recibe radioterapia, o un paciente que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de la radioterapia, donde el paciente preferentemente padece NSCLC en estadio I o II.

De acuerdo con una realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que recibe quimioterapia, preferentemente una quimioterapia basada en platino o una quimioterapia de combinación basada en platino (por ejemplo cisplatino, carboplatino, cisplatino combinado con vinorelbina, cisplatino en combinación con etopósido, cisplatino en combinación con gemcitabina, cisplatino en combinación con taxanos, cisplatino o carboplatino en combinación con premetrexed, o carboplatino en combinación con paclitaxel), o un paciente que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de quimioterapia, donde el paciente preferentemente padece NSCLC en estadio III o IV.

En otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que recibe quimioterapia, preferentemente una quimioterapia basada en platino o una quimioterapia de combinación basada en platino (por ejemplo cisplatino, carboplatino, cisplatino en combinación con vinorelbina, cisplatino en combinación con etopósido, cisplatino en combinación con gemcitabina, cisplatino en combinación con taxanos, cisplatino o carboplatino en combinación con premetrexed, o carboplatino en combinación con paclitaxel) en combinación con radioterapia (quimioradiación), o un paciente que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de quimiorradiación, donde preferentemente el paciente padece NSCLC en estadio III (de manera preferente localmente avanzado) o IV.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna inventiva es un paciente que recibe solo una terapia, preferentemente gemcitabina, taxanos, premetrexed, paclitaxel, vinorelbina o etopósido, de manera preferente como tratamiento de segunda línea o tercera línea, o un paciente que ha tenido una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de tal tratamiento de segunda línea o tercera línea.

En una realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV (NSCLC) después de la quimioterapia de primera línea y de segunda línea opcional (por ejemplo quimioterapia basada en platino o quimioterapia de combinación basada en platino (combinación de quimioterapia basada en platino con al menos un agente quimioterapéutico adicional)) o quimiorradiación de primera línea y de segunda línea opcional, donde el paciente preferentemente ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de la quimioterapia de primera línea y opcionalmente de segunda línea.

De acuerdo con una realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV (NSCLC) e histología no escamosa, con o sin activación de mutaciones del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

De acuerdo con otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV (NSCLC) e histología escamosa, con o sin activación de mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

En una realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV (NSCLC) e histología no escamosa, de manera preferente sin activación de mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de quimioterapia de primera línea usando platino o quimioterapia de combinación de platino (por ejemplo platino y pemetrexed).

En otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con NSCLC en estadio III o IV e histología de células escamosas que preferentemente ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de quimioterapia de primera línea usando platino o quimioterapia de combinación basada en platino (por ejemplo platino y pemetrexed).

De manera aún más preferente, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que padece de cáncer de pulmón metastásico, preferentemente cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico.

En una realización aquí descrita adicional, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con NSCLC locorregionalmente avanzado en estadio III, preferentemente que recibe tratamiento con quimioradiación concomitante (por ejemplo como se define en lo anterior) o que ha logrado una respuesta o enfermedad estable (sin progresión) después de quimioradiación (como se define aquí).

En otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con NSCLC en estadio III o IV, independientemente del subtipo histológico molecular y que preferentemente está recibiendo un tratamiento concomitante con un inhibidor de la ruta PD-1 o ha logrado una respuesta o enfermedad estable (sin progresión) después del tratamiento con un inhibidor de la ruta PD-1.

Además, de acuerdo con una realización específica aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que recibe un anticuerpo o una combinación de quimioterapia y un anticuerpo, preferentemente bevacizumab o una combinación de bevacizumab con quimioterapia, preferentemente una quimioterapia basada en platino, o un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después de este tratamiento.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que recibe un inhibidor de tirosina-quinasa, preferentemente un inhibidor de tirosina-quinasa de EGFR (por ejemplo erlotinib, gefitinib o afatinib), y de manera preferente como un tratamiento de segunda línea después de quimioterapia de primera línea, o un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después de la terapia con el inhibidor de tirosina-quinasa de EGFR.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que porta una mutación EGFR de activación y recibe un inhibidor de la tirosina-quinasa, de manera preferente un inhibidor de tirosina-quinasa de EGFR (por ejemplo erlotinib, gefitinib o afatinib), o un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después de terapia con el inhibidor de tirosinaquinasa de EGFR.

En otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente con NSCLC en estadio etapa III o IV y preferentemente de histología no escamosa que preferentemente porta una mutación de activación de EGFR y que está preferentemente está recibiendo un tratamiento concomitante con un inhibidor tirosina-quinasa de EGFR, o un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después de recibir el tratamiento con un inhibidor de tirosina-quinasa de EGFR (por ejemplo erlotinib, gefitinib o afatinib u otros inhibidores de EGFR tirosina-quinasa).

En otra realización aquí descrita, el sujeto que recibe la composición o la vacuna es un paciente que recibe el inhibidor de tirosina-quinasa crizotinib o ceritinib u otros inhibidores de ALK.

Similarmente, la presente descripción también se refiere a la vacuna per se o a los al menos seis ARNm que codifican los antígenos como se define aquí para su uso para inducir una respuesta inmunitaria adaptiva en un mamífero, preferentemente para el tratamiento del cáncer de pulmón, de manera más preferente para el tratamiento de una afección relacionada con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) como se define aquí.

La prevención o el tratamiento del cáncer de pulmón de un paciente que lo necesite, preferentemente cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionados con el mismo se pueden llevar a cabo administrando la composición y/o la vacuna de una vez o de forma escalonada, por ejemplo como un kit de partes, conteniendo cada parte al menos un antígeno preferentemente diferente. De manera preferente, cada uno de los antígenos se administra separadamente, es decir, cada antígeno se administra a una parte o región diferente del cuerpo del sujeto a tratar, de manera preferente simultáneamente o dentro de un mismo marco de tiempo corto, respectivamente. En una realización preferente, los ARNm individuales se administran distribuidos sobre las cuatro extremidades del sujeto (es decir brazo y pierna derecha/izquierda). Preferentemente, la administración (de todos los al menos seis ARNm) se produce en una hora, de manera más preferente en 30 minutos, de manera aún más preferente en 15, 10, 5, 4, 3, o 2 minutos o incluso en 1 minuto.

Para la administración, preferentemente se puede usar cualquiera de las vías de administración definidas anteriormente. En particular, se usa una vía de administración adecuada para tratar el cáncer de pulmón, de manera preferente cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionadas con el mismo, induciendo o mejorando una respuesta inmunitaria adaptiva sobre la base de los antígenos codificados por los al menos seis ARNm de la composición aquí descrita. La administración de la composición y/o de la vacuna puede así tener lugar antes, a la vez y/o después a la administración de otra composición y/o vacuna como se definen aquí que pueden - además - contener otra combinación de ARNm que codifican para diferentes antígenos, donde cada antígeno codificado por el al menos un ARNm de la composición inventiva preferentemente puede ser adecuado para la terapia del cáncer de pulmón, de manera preferente de cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionados con el mismo. En este contexto, una terapia como se define aquí también puede comprender la modulación de una enfermedad asociada al cáncer de pulmón, preferentemente al cáncer de pulmón de células no pequeñas, y de enfermedades o trastornos relacionados con el mismo.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción comprende además la composición o los al menos seis ARNm que codifican los antígenos aquí definidos (para la preparación de una vacuna para su uso para modular, preferentemente para inducir o mejorar, una respuesta inmunitaria en un mamífero como se define anteriormente, en especial para tratar y/o apoyar el tratamiento del cáncer de pulmón, de manera preferente cáncer de pulmón de células no pequeñas, o de enfermedades o trastornos relacionados con el mismo. En este contexto, el soporte del tratamiento del cáncer de pulmón puede ser cualquier combinación de un método de terapia del cáncer de pulmón convencional, tal como cirugía, terapia de radiación, quimioterapia (por ejemplo quimioterapia de primera línea o de segunda línea), quimiorradiación, tratamiento con inhibidores de tirosina-quinasa, tratamiento con inhibidores de la ruta PD-1, terapia de anticuerpos o alguna combinación de éstas, y una terapia empleando la composición como se define aquí. El soporte del tratamiento del cáncer de pulmón también se puede considerar en cualquiera de las otras realizaciones definidas aquí. Por consiguiente, la composición o la vacuna para cualquier uso en una coterapia con cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores, en particular en combinación con cirugía, terapia de radiación, quimioterapia, quimiorradiación y/o tratamiento con inhibidores de la tirosinaquinasa o anticuerpos también se describe aquí.

En una realización aquí descrita, la composición o la vacuna aquí descritas se usan en un tratamiento de cáncer de pulmón que comprende además quimioterapia (por ejemplo quimioterapia de primera línea o segunda línea), radioterapia, quimiorradiación (combinación de quimioterapia y radioterapia), inhibidores de tirosina-quinasa (por ejemplo inhibidores de EGFR tirosina-quinasa), terapia de anticuerpos y/o inhibidores de la ruta PD1, o en un paciente que ha logrado una respuesta parcial o una enfermedad estable después de haber recibido uno o más de los tratamientos especificados anteriormente.

En este contexto, un inhibidor de la ruta PD-1 se define aquí preferentemente como un compuesto capaz de deteriorar la señalización de la ruta PD-1, de manera preferente la señalización mediada por el receptor PD-1. Por tanto, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser cualquier inhibidor dirigido contra cualquier miembro de la ruta PD-1 capaz de antagonizar la señalización de la ruta PD-1. En este contexto, el inhibidor puede ser un anticuerpo antagonista que fija como diana cualquier miembro de la ruta PD-1, preferentemente dirigido contra el receptor PD-1, PD-L1 o PD-L2. Este anticuerpo antagonista también puede estar codificado por un ácido nucleico. Igualmente, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un fragmento del receptor p D-1 o del receptor PD1 que bloquea la actividad de los ligandos PD1. Los B7-1 o fragmentos del mismo pueden actuar también como ligandos inhibidores de PD1. Adicionalmente, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un ARNsi (ARN interferente pequeño) o un ARN anti-sentido dirigido contra un miembro de la ruta PD-1, preferentemente PD-1, PD-L1 o PD-L2. Adicionalmente, un inhibidor de la ruta PD-1 puede ser una proteína que comprende (o un ácido nucleico que codifica) una secuencia de aminoácidos capaz de unirse a PD-1, pero que previene la señalización de PD-1, por ejemplo inhibiendo PD-1 y B7-H1 o una interacción B7-DL. Adicionalmente, un inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un inhibidor de moléculas pequeñas capaz de inhibir la señalización de la ruta PD-1, por ejemplo un péptido de unión a PD-1 o una molécula orgánica pequeña.

Tal como se usa aquí, un anticuerpo usado en la terapia de anticuerpos preferentemente se dirige contra un factor de crecimiento o un receptor del factor de crecimiento que preferentemente se une funcionalmente a una tirosina-quinasa. De manera preferente, un anticuerpo en este contexto se dirige contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En una realización preferida, el bevacizumab se usa en una terapia de anticuerpos. En otra realización, el cetuximab se usa en una terapia de anticuerpos.

Según una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento del cáncer de pulmón que comprende además una terapia de radiación, donde al menos una lesión tumoral es candidata para la radiación. De acuerdo con una realización aquí descrita, una lesión tumoral candidata para la radiación se selecciona consistente en metástasis ósea, nódulos linfáticos en las regiones paraclaviculares, axiales o cervicales, metástasis de la piel o subcutánea y lesiones torácicas (tumor pulmonar centralmente localizado, ganglios linfáticos en el hilio pulmonar o mediastino). De manera preferente, la radiación se administra en 4 fracciones diarias de 5 GY cada una en una semana, de manera preferente del Día 9-12.

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón que comprende además la administración de un inhibidor de quinasa. Aquí, un inhibidor de quinasa preferentemente es un inhibidor de tirosina-quinasa, de manera aún más preferente un inhibidor de tirosina-quinasa del factor de crecimiento, en especial un inhibidor de tirosina-quinasa de EGFR oral, tal como, por ejemplo, gefitinib, erlotinib o afatinib. Además, en este contexto, un inhibidor de tirosina-quinasa se define aquí preferentemente como un compuesto capaz de deteriorar la señalización de una o más tirosina-quinasas, de manera preferente de una o más tirosina-quinasas del factor de crecimiento. En otra realización, un inhibidor de tirosina-quinasas tal como se usa en este contexto es un inhibidor de ALK, preferentemente crizotinib o ceritinib.

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna descritas se proporcionan para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón que comprende además la administración de un agente quimioterapéutico, tal como un compuesto basado en platino (por ejemplo carboplatino, cisplatino), pemetrexed, gemcitabina, taxanos, vinorelbina, etopósido docetaxel o paclitaxel. De manera aún más preferente, la composición o la vacuna se proporcionan para su uso en un sujeto que recibe quimioterapia, preferentemente quimioterapia de combinación basada en platino, de manera preferente como se define anteriormente, preferentemente combinada además con una terapia de radiación (quimiorradiación).

Preferentemente, la composición o la vacuna se proporcionan para su uso en un tratamiento de combinación del cáncer de pulmón donde un paciente tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio 0, I (IA y/o IB), II (IIA y/o IIB), III (IIIA y/o IIIB) o IV.

En una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente antes o después de cirugía (por ejemplo lobectomía), donde el paciente preferentemente padece NSCLC en estadio I o II.

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que recibe radioterapia, o en un paciente que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de radioterapia, donde el paciente preferentemente padece NSCLC en estadio I o II.

De acuerdo con una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporcionan para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que recibe quimioterapia, preferentemente quimioterapia basada en platino o quimioterapia de combinación basada en platino (por ejemplo cisplatino, carboplatino, cisplatino en combinación con vinorelbina, cisplatino en combinación con etopósido, cisplatina en combinación con gemcitabina, cisplatino en combinación con taxanos, cisplatino o carboplatino en combinación con premetrexed, o carboplatino en combinación con paclitaxel), o en un paciente que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de quimioterapia, donde el paciente preferentemente padece NSCLC en estadio III o IV.

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que recibe quimioterapia, preferentemente quimioterapia basada en platino o quimioterapia de combinación basada en platino (por ejemplo cisplatino, carboplatino, cisplatino en combinación con vinorelbina, cisplatino en combinación con etopósido, cisplatina en combinación con gemcitabina, cisplatino en combinación con taxanos, cisplatino o carboplatino en combinación con premetrexed, o carboplatino en combinación con paclitaxel) en combinación con radioterapia (quimiorradiación) o en un paciente que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de quimiorradiación, donde el paciente preferentemente padece NSCLC en estadio III (de manera preferente localmente avanzado) o IV.

De acuerdo con otra realización descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que recibe solo una quimioterapia, preferentemente gemcitabina, taxanos, premetrexed, paclitaxel, vinorelbina, o etopósido, de manera preferente como tratamiento de segunda línea o tercera línea, o en un paciente que ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de tal tratamiento de segunda línea o tercera línea.

En una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en estadio III o IV después de quimioterapia de primera línea y opcionalmente de segunda línea (por ejemplo combinación de quimioterapia basada en platino con al menos un agente quimioterapéutico adicional)) o de quimioterapia de primera línea y opcionalmente de segunda línea donde el paciente preferentemente ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de la quimioterapia de primera línea y de segunda línea opcional.

De acuerdo con una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas ene estadio III o IV (NSCLC) y de histología no escamosa, con o sin mutaciones de receptor de factor de crecimiento epidérmicas de activación (EGFR).

De acuerdo con otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en etapa estadio III o IV (NSCLC) e histología escamosa, con o sin mutaciones de receptor de factor de crecimiento epidérmico de activación (EGFR).

En una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV (NSCLC) e histología no escamosa, preferentemente sin mutaciones de receptor de factor de crecimiento epidérmico de activación (EGFR), donde el paciente preferentemente ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de la quimioterapia de primera línea usando platino o de una quimioterapia de combinación basada en platino (por ejemplo platino y pemetrexed).

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con NSCLC en estadio III o IV e histología de células escamosas, donde el paciente preferentemente ha logrado una respuesta parcial (PR) o una enfermedad estable (SD) después de quimioterapia de primera línea usando platino o de una quimioterapia de combinación basada en platino (por ejemplo platino y pemetrexed).

La presente descripción también comprende la composición o la vacuna como se describen aquí proporcionadas para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que sufre de cáncer de pulmón metastásico, de manera preferente cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico.

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con NSCLC locorregionalmente avanzado en estadio III, donde el paciente preferentemente recibe un tratamiento concomitante con quimiorradiación (por ejemplo como se define anteriormente), o donde el paciente ha logrado una respuesta o una enfermedad estable (sin progresión) después de quimiorradiación (como se define aquí).

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con NSCLC en estadio III o IV independientemente del subtipo histológico molecular, donde el paciente preferentemente está recibiendo un tratamiento concomitante con un inhibidor de la ruta PD-1 o ha logrado una respuesta o una enfermedad estable (sin progresión) después del tratamiento con un inhibidor de la ruta PD-1.

Adicionalmente, de acuerdo con una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que recibe un anticuerpo o una combinación de quimioterapia y un anticuerpo, preferentemente en un paciente que recibe bevacizumab o una combinación de bevacizumab con quimioterapia, de manera preferente una quimioterapia basada en platino, o en un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después este tratamiento.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que recibe un inhibidor de tirosina-quinasa, de manera preferente un inhibidor de tirosina-quinasa de EGFR (por ejemplo erlotinib, gefitinib o afatinib), y de manera preferente como tratamiento de segunda línea después de quimioterapia de primera línea, o en un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después de la terapia con el inhibidor tirosinaquinasa de EGFR.

De acuerdo con otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporcionan para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que porta una mutación EGFR de activación y que recibe un inhibidor de tirosina-quinasa, de manera preferente un inhibidor EGFR tirosina-quinasa (por ejemplo erlotinib, gefitinib o afatinib), o en un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después de la terapia con el inhibidor EGFR tirosina-quinasa.

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente con NSCLC en estadio III o IV, de manera preferente con histología no escamosa, preferentemente que porta una mutación EGFR de activación y donde el paciente preferentemente está recibiendo un tratamiento concomitante con un inhibidor EGFR tirosina-quinasa, o en un paciente que ha logrado una respuesta o una enfermedad estable después de recibir el tratamiento con un inhibidor EGFR tirosina-quinasa (por ejemplo erlotinib, gefitinib o afatinib u otros inhibidores EGFR tirosina-quinasa).

En otra realización aquí descrita, la composición o la vacuna se proporciona para su uso en un tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que recibe el inhibidor de tirosina-quinasa crizotinib o ceritinib u otros inhibidores a Lk .

El protocolo de inmunización para la inmunización de un sujeto contra la combinación de al menos seis antígenos como se define aquí comprende típicamente una serie de dosis o dosificaciones individuales de la composición o vacuna. Una dosificación individual, tal como se usa aquí, se refiere a la dosis inicial/primera, una segunda dosis o cualquier dosis adicional, respectivamente, que preferentemente se administran con el fin de “reforzar” la reacción inmune. En este contexto, cada dosis individual comprende la administración de todos los al menos seis antígenos como se describen aquí, donde el intervalo entre la administración de dos dosis individuales puede variar de al menos un día, de manera preferente 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, a al menos una semana, de manera preferente 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 semanas. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser constantes o variar durante el protocolo de inmunización, por ejemplo los intervalos pueden ser más cortos al inicio y más prolongados hacia el final del protocolo. Dependiendo del número total de dosificaciones individuales y del intervalo entre dosificaciones individuales, el protocolo de inmunización puede extenderse durante un período de tiempo que preferentemente dura al menos una semana, de manera más preferente varias semanas (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas), de manera aún más preferente varios meses (por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 o 24 meses). Cada dosificación individual abarca la administración de todos los al menos seis antígenos como se definen aquí y, por tanto, puede implicar al menos una, de manera preferente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 inyecciones. En el caso de que la composición aquí descrita se administre, una dosificación individual comprende típicamente una inyección. En el caso en que la vacuna comprenda formulaciones de ARNm separadas que codifican los antígenos respectivos como se describen aquí, el número mínimo de inyecciones llevadas a cabo durante la administración de una dosis individual corresponde al número de componentes separados de la vacuna. En ciertas realizaciones, la administración de una dosis individual puede abarcar más de una inyección para cada componente de la vacuna (por ejemplo una formulación de ARNm específica que comprende un ARNm que codifica, por ejemplo, uno de los seis antígenos aquí descritos). Por ejemplo, se puede inyectar parte del volumen total de un componente individual de la vacuna en diferentes partes corporales, implicando así más de una inyección. En un ejemplo más específico, una dosis individual de una vacuna que comprende seis formulaciones de ARNm separadas, cada una de las cuales se administra en dos partes del cuerpo diferentes, comprende doce inyecciones. Típicamente, una dosificación individual comprende todas las inyecciones requeridas para administrar todos los componentes de la vacuna, donde un componente individual puede estar implicado en más de una inyección como se indica anteriormente. En caso de que la administración de una dosificación individual de la vacuna aquí descrita abarque más de una inyección, la inyección se lleva a cabo esencialmente de forma simultánea o concurrente, es decir, típicamente en una forma escalonada en el tiempo dentro del marco de tiempo requerido para que el profesional pueda llevar a cabo los pasos de inyección individuales uno después del otro. Así, la administración de una dosificación individual se extiende preferentemente a lo largo de un período de tiempo de varios minutos, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 10, 15, 30 o 60 minutos.

La administración de la composición o de los al menos seis ARNm que codifican los antígenos como se definen aquí o la vacuna se puede llevar a cabo en un tratamiento escalonado en el tiempo. Un tratamiento escalonado en el tiempo puede ser, por ejemplo, a la administración de la composición o de los al menos seis ARNm que codifican los antígenos como se define aquí o de la vacuna antes, concurrente y/o subsecuente a una terapia convencional de cáncer de pulmón, preferentemente cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionados con los mismos, por ejemplo mediante la administración del medicamento o de la composición o la vacuna antes, concurrente y/o subsecuente a una terapia o una administración de un tratamiento terapéutico adecuado para el tratamiento de cáncer de pulmón, preferentemente cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionados con los mismos. Tal tratamiento escalonado en el tiempo se puede llevar a cabo usando un kit, preferentemente un kit de partes como se define a continuación.

El tratamiento escalonado en el tiempo también puede comprender, adicional o alternativamente, una administración de la composición o vacuna aquí descrita, preferentemente del al menos un ARNm que codifica los antígenos como se define anteriormente, en una forma donde el al menos un ARNm que codifica los antígenos como se define anteriormente, preferentemente formando parte de la composición o la vacuna aquí descrita, se administra en paralelo, antes o subsecuente a otro de los al menos un ARNm que codifica los antígenos como se define anteriormente, preferentemente que forma parte de la misma composición o vacuna. De manera preferente, la administración (de todos los al menos un ARNm) tiene lugar dentro de una hora, de manera más preferente dentro de 30 minutos, de manera aún más preferente dentro de 15, 10, 5, 4, 3, o 2 minutos o aún dentro de 1 minuto. Tal tratamiento escalonado en el tiempo se puede llevar a cabo usando por ejemplo un kit, preferentemente un kit de partes como se define a continuación.

En una realización aquí descrita, la composición o la vacuna se administra repetidamente, comprendiendo cada administración preferentemente la administración individual del al menos un ARNm como se describe aquí. En cada punto de tiempo de la administración, el al menos un ARNm se puede administrar más de una vez (por ejemplo 2 o 3 veces). En otra realización aquí descrita, seis ARNm (cada uno codificando uno de los antígenos como se define arriba) se administra en cada punto de tiempo, administrándose cada ARNm por inyección dos veces, resultando así doce inyecciones distribuidas sobre las cuatro extremidades.

De acuerdo con una realización final, la presente invención también proporciona kits, en particular kits de partes, para su uso en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico, comprendiendo los kits o kits de partes la composición activa (inmunoestimuladora) y/o la vacuna aquí descrita, opcionalmente un vehículo líquido para la solubilización y opcionalmente instrucciones técnicas con información sobre la administración y dosificación de la composición y/o la vacuna. Las instrucciones técnicas pueden contener información acerca de la administración y dosificación de la composición y/o de la vacuna. Tales kits, preferentemente kits de partes, se pueden aplicar, por ejemplo, para cualquiera de las aplicaciones o uso mencionados anteriormente, preferentemente para el uso de la composición para la preparación de un medicamento, preferentemente una vacuna, para el tratamiento del cáncer de pulmón, preferentemente cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionados con los mismos. Los kits también se pueden aplicar para el uso de la composición para la preparación de una vacuna para el tratamiento del cáncer de pulmón, preferentemente cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionados con los mismos, donde la composición y/o la vacuna, debido a los al menos seis antígenos codificados, puede ser capaz de inducir o mejorar una respuesta inmunitaria en un mamífero como se define en lo anterior. Tales kits se pueden aplicar además para el uso de la composición para la preparación de un medicamento, preferentemente una vacuna, para modular, de manera preferente para provocar, por ejemplo inducir o mejorar, una respuesta inmunitaria en un mamífero como se define anteriormente, y preferentemente para apoyar al tratamiento del cáncer de pulmón, de manera más preferente cáncer de pulmón de células no pequeñas, y enfermedades o trastornos relacionados con los mismos. Los kits de partes, como una forma especial de kits, pueden contener una o más composiciones activas (inmunoestimuladoras) idénticas o diferentes y/o una o más vacunas idénticas o diferentes en diferentes partes del kit. Los kits de partes también pueden contener una (por ejemplo una) composición activa, una (por ejemplo una) vacuna y/o los al menos seis ARNm que codifican al menos seis antígenos como se define en lo anterior en diferentes partes del kit, por ejemplo cada parte del kit conteniendo al menos un ARNm que preferentemente codifica un antígeno diferente. Adicionalmente, es posible una combinación de ambos tipos de kits de partes. Los kits de partes se pueden usar, por ejemplo, cuando se contempla un tratamiento escalonado en el tiempo, por ejemplo cuando se usan diferentes formulaciones y/o se incrementan concentraciones de la composición, la vacuna y/o los al menos seis ARNm que codifican los antígenos como se define arriba durante el mismo tratamiento in vivo. Los kits de partes se pueden usar cuando se contempla una formulación separada o una administración de al menos uno de los antígenos de la composición (es decir en partes) o cuando es necesario (por ejemplo por razones técnicas), pero por ejemplo se puede conseguir una presencia combinada de los diferentes antígenos in vivo. En particular, se contemplan los kits de partes como una forma especial de kits, donde cada parte del kit contiene al menos un antígeno preferentemente diferente como se define en lo anterior, formando todas las partes de kit de partes la composición o la vacuna como se define aquí. Tales kits de partes específicas pueden ser particularmente adecuadas, por ejemplo, cuando se formulan por separado diferentes antígenos como diferentes partes de los kits, pero después se administran a la vez juntos o de forma escalonada en el tiempo al mamífero que lo necesita. En el último caso, la administración de todos las diferentes partes de tal kit se lleva a cabo típicamente dentro de un límite de tiempo corto, de forma que todos los antígenos están presentes en el mamífero en aproximadamente el mismo tiempo posterior a la administración de la última parte del kit. En una realización aquí descrita, el kit contiene al menos dos partes que contienen los seis ARNm aquí descritos. De manera preferente, los seis ARNm se proporcionan en partes separadas del kit, donde estos ARNm preferentemente están liofilizados. De manera más preferente, el kit contiene además, como parte, un vehículo para solubilizar los al menos seis ARNm, preferentemente siendo el vehículo una solución Ringer-lactato. Cualquiera de los kits anteriores se puede proporcionar para su uso en un tratamiento como se define anteriormente.

Ventajas de la presente invención

La presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas como se define en las reivindicaciones, donde la composición comprende al menos seis ARNm como se definen en las reivindicaciones que codifican al menos seis antígenos capaces de inducir una respuesta inmunitaria (adaptiva) en un mamífero, donde los antígenos se seleccionan del grupo consistente 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG), Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición iAp Baculoviral; BIRC5), NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York, CTAG1B), MAGE-C1 (Familia de antígenos de melanoma C1), MAGE-C2 (Familia de antígenos de melanoma C2), y MUC1 (Mucina 1). Tal composición permite un tratamiento eficiente del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo el tratamiento además la administración de un agente quimioterapéutico, o un tratamiento complementario cuando se usas la terapia convencional. Además, evita el problema de la propagación descontrolada de secuencias de ADN introducidas mediante el uso de ARN como enfoque de los métodos curativos. El ARNm como se usa en la composición aquí descrita tiene ventajas considerables adicionales sobre los sistemas de expresión de ADN, por ejemplo, en la respuesta inmunitaria, la inmunización o la vacunación. Estas ventajas incluyen, inter alia, que el ARN introducido en la célula no se integre en el genoma. Esto evita el riesgo de mutación de este gen, que de otra manera se puede inactivar completa o parcialmente o puede dar origen a una información errónea. Esto evita además otros riesgos del uso del ADN como agente para inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo como una vacuna), como la inducción de anticuerpos anti-DNA hepatogénicos en el paciente al que se ha introducido el ADN extraño, proporcionando así una respuesta inmunitaria (posiblemente fatal). Por el contrario, todavía no se han detectado anticuerpos anti-RNA.

Figuras

Las siguientes figuras tratan de ilustrar la invención adicionalmente. No se proponen para limitar el contenido de la invención a las mismas.

Figura 1: muestra la secuencia de ARNm 5T4(GC)-muag-A64-C30 (SEQ ID NO: 1), que codifica 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG). El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica 5T4 de acuerdo con la SEQ ID NO. 3, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID No. 70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 Citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C).

Figura 2: muestra la secuencia de ARNm 5T4(GC)-muag-A64-C30-HistonaSL (SEQ ID NO: 19), que codifica 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG). El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica 5T4 de acuerdo con la SEQ ID NO. 3, la secuencia estabilizante “muag” en 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C); y una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID NO. 72.

Figura 3: muestra la secuencia de codificación de tipo natural que codifica 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG) de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, es decir la secuencia de codificación (CDS) que codifica 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG) sin secuencia de codificación optimizada en GC.

Figura 4: muestra la secuencia de codificación optimizada en GC que codifica 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG) de acuerdo con SEQ ID NO: 3.

Figura 5: muestra la secuencia ARNm de Survivina (GC)-muag-A64-C30 (SEQ ID NO: 4), que codifica Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral; BIRC5). El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica Survivina de acuerdo con la SEQ ID NO. 6, la secuencia estabilizante “muag” en 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'- terminal (cola poli-C).

Figura 6: muestra la secuencia de ARNm de Survivina (GC)-muag-A64-C30-HistonaSL (SEQ ID NO:

20), que codifica Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral; BIRC5). El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica Survivina de acuerdo con la SEQ ID NO. 6, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'- terminal (cola poli-C); y una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID NO. 72.

Figura 7: muestra la secuencia de codificación de tipo natural que codifica Survivina de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, es decir la secuencia de codificación (CDS) que codifica Survivina sin secuencia de codificación optimizada en GC.

Figura 8: muestra la secuencia de codificación optimizada en GC que codifica Survivina de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.

Figura 9: muestra la secuencia de ARNm NY-ESO-1(GC)-muag-A64-C30 (SEQ ID NO: 7), que codifica NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York, CTAG1B). El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica NY-ESO-1 de acuerdo con la SEQ ID NO. 9, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C).

Figura 10: nuestra la secuencia de ARNm NY-ESO-1(GC)-muag-A64-C30-HistonaSL (SEQ ID NO: 21), que codifica NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York, CTAG1B). El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica NY-ESO-1 de acuerdo con la SEQ ID NO. 9, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C); y una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID NO. 72.

Figura 11: muestra la secuencia de codificación de tipo natural que codifica NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York, CTAG1B) de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, es decir la secuencia de codificación (CDS) que codifica NY-ESO-1 sin secuencia de codificación optimizada en GC.

Figura 12: muestra la secuencia de codificación optimizada en GC que codifica NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York, CTAG1B) de acuerdo con la SEQ ID NO: 9.

Figura 13: muestra la secuencia de ARNm MAGE-C1 (aa 613-1142) (GC)-muag-A64-C30 (SEQ ID NO:

10) que codifica MAGE-C1, comprendiendo la secuencia de aminoácidos aa 613-1142 de la proteína de tipo natural MAGE-C1. El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica MAGE-C1 (aa 613-1142) de acuerdo con la SEQ ID No . 25, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'- terminal (cola poli-C).

Figura 14: muestra la secuencia de ARNm MAGE-C1 (aa 613-1142) (GC)-muag-A64-C30-HistonaSL (SEQ ID NO: 22), que codifica MAGE-C1 (aa 613-1142). El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica MAGE-C1 (aa 613-1142) de acuerdo con la SEQ ID NO. 25, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C) y una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID No.

72.

Figura 15: muestra la secuencia de codificación de tipo natural que codifica la proteína de longitud completa de MAGE-C1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, es decir la secuencia de codificación (CDS) que codifica MAGE-C1 sin secuencia de codificación optimizada en GC. Figura 16: muestra la secuencia de codificación optimizada en GC que codifica la proteína de longitud completa de MAGE-C1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12.

Figura 17: muestra la secuencia de codificación optimizada en GC que codifica MAGE-C1 (aa 613-1142) de acuerdo con la SEQ ID NO: 25.

Figura 18: muestra la secuencia de ARNm MAGE-C2(GC)-muag-A64-C30 (SEQ ID NO: 13), que codifica MAGE-C2. El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica MAGE-C2 de acuerdo con la SEQ ID NO. 15, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C).

Figura 19: muestra la secuencia de ARNm MAGE-C2(GC)-muag-A64-C30-HistonaSL (SEQ ID NO: 21), que codifica MAGE-C2. El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica MAGE-C2 de acuerdo con la SEQ ID NO. 9, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C) y una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID NO. 72.

Figura 20: muestra la secuencia de codificación de tipo natural que codifica MAGE-C2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 14, es decir la secuencia de codificación (CDS) que codifica MAGE-C2 sin secuencia de codificación optimizada en GC.

Figura 21: muestra la secuencia de codificación optimizada en GC que codifica MAGE-C2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 15.

Figura 22: muestra la secuencia de ARNm MUC1 5xVNTR (GC)-muag-A64-C30 (SEQ ID NO: 16) que codifica MUC1 (Mucina 1) comprendiendo 5 repeticiones en tándem. El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica MUC1 5xVNTR de acuerdo con la SEQ ID NO. 18, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO.70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-C).

Figura 23: muestra la secuencia de ARNm MUC1 5xVNTR (GC)-muag-A64-C30-HistonaSL (SEQ ID NO: 24), que codifica MUC1 (Mucina 1) comprendiendo 5 repeticiones en tándem. El ARNm contiene los siguientes elementos de secuencia: una 5'-CAP, una secuencia de codificación optimizada en GC para la estabilización y un mejor uso de codón que codifica MUC1 5xVNTR de acuerdo con la SEQ ID NO. 18, la secuencia estabilizante “muag” en la 3'-UTR de acuerdo con la SEQ ID NO. 70, ~ 64 adenosinas en el extremo 3'-terminal (cola poli-A), ~ 30 citidinas en el extremo 3 '- terminal (cola poli-C) y una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID NO. 72.

Figura 24: muestra la secuencia de codificación de tipo natural que codifica MUC1 5xVNTR de acuerdo con la SEQ ID NO: 17, es decir la secuencia de codificación (CDS) que codifica MUC1 sin secuencia de codificación optimizada en GC.

Figura 25: muestra la secuencia de codificación optimizada en GC que codifica MUC1 5xVNTRde acuerdo con la SEQ ID NO: 18.

Figura 26: muestra la detección de la respuesta inmunitaria celular específica de MUC1 por ELISPOT.

Ratones C57BL/6 se vacunaron con 32 |jg MUC1-RNActiveMR (SEQ ID NO: 16) en los días 1, 5, 8, 12 y 15. El análisis ELISpot ex vivo de la secreción de IFN-gamma en los esplenocitos de ratones vacunados y de control se llevó a cabo el día 6 después de la última vacunación. Las células se estimularon sobre la placa ya sea con péptido derivado de MUC1 (epítopo MHC-clase I predicho) o con el péptido de control. La gráfica muestra puntos de datos individuales para ratones individuales.

Figura 27: muestra el efecto de la combinación de la inmunoterapia de ARN con terapia de radiación en el tratamiento de carcinoma de pulmón de Lewis inmunogénico y radioresistente bajo (LLC). Figura 28: muestra la secuencia de proteínas de 5T4 NP_001159864.1 de acuerdo con la Se Q ID n O:

75.

Figura 29: muestra la secuencia de proteínas de Survivina (BIRC5) O15392de acuerdo con la SEQ ID NO: 76.

Figura 30: muestra la secuencia de proteínas de Survivina (BIRC5) NP_001159.2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 77.

Figura 31: muestra la secuencia de proteínas de NY-ESO-1 NP_001318.1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 78.

Figura 32: muestra la secuencia de proteínas de MAGE-C1 NP_005453.2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 79.

Figura 33: muestra la secuencia de proteínas de MAGE-C2 NP_057333.1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 80.

Figura 34: muestra la secuencia de proteínas de la proteína MUC1 J05582.1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 81.

Figura 35: muestra la secuencia de proteínas de la Proteína 5xVNTR de acuerdo con la SEQ ID NO: 82. Figura 36: muestra la secuencia de codificación de tipo natural que codifica MUC1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 83, es decir la secuencia de codificación de longitud completa (CDS) que codifica MUC1 sin secuencia de codificación optimizada en GC.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar la invención. No se proponen para limitar el contenido de la invención a los mismos.

1. Preparación de una vacuna de ARNm basada en MUC1 e inducción de células T citotóxicas específicas de antígeno:

1.1 Preparación de una vacuna de ARNm basada en MUC1:

La vacuna ARNm consiste en ARNm optimizados en GC que codifican para MUC1 (SEQ ID NO: 16). El ARNm se complejó con protamina mediante la adición de protamina al ARNm en una relación (1:2) (p/p) (componente adyuvante). Después de incubación durante 10 minutos, se agregó la misma cantidad del ARNm libre usado como ARNm que proporciona antígenos.

La composición resultante se disolvió en al 80% (v/v) en solución de lactato de Ringer.

1.2 Vacunación

Los ratones C57BL/6 se vacunaron intradérmicamente con 32 |jg de una de las vacunas de ARNm como se describe en el 1.1 anterior. Los ratones de control se inyectaron intradérmicamente con solución tampón (lactato de Ringer). La vacunación comprendió cinco inmunizaciones con 2 inmunizaciones por semana, la respuesta inmunitaria se analizó 5 o 6 días después de la terminación del ciclo de vacunación.

1.3 ELISPOT - Detección de respuestas de CTL (células T citotóxicas)

Para la detección de las repuestas de CTL (célula T citotóxica), se puede observar el análisis de secreción de IFN-gamma en respuesta a un estímulo específico a nivel de célula individual usando la técnica ELISPOT.

Los esplenocitos de los ratones vacunados con la vacuna de ARNm como se describe en el 1.1 anterior y los ratones de control se aislaron 5 o 6 días después de la última vacunación y después se transfirieron en placas ELISPOT de 96 pocillos recubiertos con un anticuerpo de captura IFN-gamma. Las células después se estimularon durante 24 horas a 37°C usando los siguientes péptidos:

Después del período de incubación, las células se lavaron fuera de la placa y el IFN-gamma secretado por las células se detectó usando un anticuerpo secundario biotinilado contra IFN-gamma de murino, seguido por estreptavidina-AKP. Los puntos se visualizaron usando el substrato BCIP/NBT y se contaron usando un lector ELISPOT automatizado (Immunospot Analyzer, CTL Analyzers LLC).

La vacunación intradérmica con el ARNm que codifica MUC1 condujo la activación de las células T CD8+ específicas de antígeno como se muestra por la secreción del IFN-gamma en el ELISpot.

2. Combinación de la vacunación de ARNm e irradiación en ratones que portan tumores inmunogénicos bajos (LLC)

Este estudio examinó la eficacia de una vacunación y la combinación de radiación en ratones C57BL/6 con tumores inmunogénicos bajos (LLC).

En el día 0 los ratones C57BL/6 (n = 10 por grupo) se estimularon subcutáneamente con células 3LL singénicas (células LLC que expresan antígenos tumorales EGFR y Conexina) en la extremidad posterior derecha. El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron 50 mm3. Los ratones se vacunaron o bien con ARNm que codifica EGFR y Conexina (dos veces a la semana) o los tumores se irradiaron con 36 Gy distribuidos en 3 dosis iguales durante 3 días consecutivos o los ratones se trataron con terapia de combinación (con la primera vacunación administrada 6 horas antes de la segunda radiación) como se indica en la Fig. 28. Los ratones no tratados sirvieron como control. El crecimiento tumoral se controló midiendo el tamaño del tumor en tres dimensiones usando calibradores.

Debido a la falta de expresión de MHC clase I, la inmunoterapia sola fue ineficaz en inhibir el crecimiento tumoral y también la terapia de radiación dio como resultado solo un control transitorio del tumor. Por otra parte, las vacunas de ARNm combinadas con la radioterapia dieron como resultado un efecto anti-tumor sinérgico potente.

3. Estudio clínico: vacuna de cáncer derivada de ARNm y radiación local como tratamiento de SCLC Fármaco del Estudio:

Se usa como vacuna una composición que comprende un ARNm que codifica 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG) de acuerdo con la SEQ ID NO. 19, un ARNm que codifica para Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral; BIRC5) de acuerdo con la SEQ ID NO. 20, un ARNm que codifica para NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York; CTAG1B) de acuerdo con la SEQ ID NO. 21, un ARNm que codifica para MAGE-C1 (Familia de antígenos de melanoma C1) de acuerdo con la SEQ ID NO. 22, un ARNm que codifica para MAGE-C2 (Familia de antígenos de melanoma C2) de acuerdo con la SEQ ID NO. 23 y un ARNm que codifica para MUC1 (Mucina 1) de acuerdo con la SEQ ID NO. 24 complejados con protamina de acuerdo con el ejemplo 1.1. Cada ARNm que proporciona antígeno se proporciona como un liofilizado estéril. La reconstitución en lactato de Ringer proporciona una solución para inyección intradérmica. El medicamento usado en el ensayo clínico se denomina CV9202. Es una vacuna que comprende seis componentes fármacos, cada uno con un ARNm que proporciona un antígeno diferente.

Población del Estudio:

• Estrato 1: Pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas estadio IV (NSCLC) e histología no escamosa, sin mutaciones de receptor de factor de crecimiento epidérmico de activación (EGFR), quienes habían logrado una respuesta parcial (PR) o enfermedad estable (SD) después de al menos 4 ciclos de quimioterapia de primera línea basada en platino y pemetrexed, y una indicación para la terapia de mantenimiento con pemetrexed.

• Estrato 2: Pacientes con NSCLC estadio IV e histología de células escamosas, quienes habían logrado PR o SD después de al menos 4 ciclos de quimioterapia de primera línea de compuesto basado en platino y sin platino (quimioterapia de combinación basada en platino).

• Estrato 3: Pacientes con NSCLC estadio IV e histología no escamosa, que alojan una mutación EGFR de activación, quienes habían logrado PR después de hasta 6 meses de tratamiento con un inhibidor de EGFR tirosina cinasa (TKI).

Población del Estudio: Criterios de Inclusión

1. Pacientes: > 18 años de edad con NSCLC etapa IV histológica o citológicamente confirmado, y un estado de mutación EGFR confirmado en el caso de histología de células no escamosas.

- Estrato 1: NSCLC no escamosos sin mutación EGFR de activación

- Estrato 2: NSCLC escamoso

- Estrato 3: NSCLC no escamoso que aloja una mutación EGFR de activación 2. PR o SD de acuerdo con la versión RECIST 1.1 después de la terapia de primera línea que debe haber consistido en:

- Estrato 1: PR o SD después del tratamiento de cisplatino o carboplatino y pemetrexed (al menos 4 ciclos).

- Estrato 2: PR o SD después del cisplatino o carboplatino y un tratamiento compuesto sin platino (al menos 4 ciclos)

- Estrato 3: PR después del tratamiento de gefitinib, erlotinib o afatinib de hasta 6 meses.

3. Para pacientes en el estrato 1, la terapia de mantenimiento con pemetrexed se debe indicar conforme a la opinión del investigador.

4. Presencia de al menos una lesión tumoral que es adecuada para la radiación con 4 x 5 GY, y al menos una lesión tumoral medible adicional de acuerdo con RECIST Versión 1.1.

Las lesiones tumorales elegibles para radiación son:

Metástasis ósea

Nódulos linfáticos en las regiones paraclaviculares, axilares o cervicales

Metástasis de la piel o subcutáneas

Para pacientes en los estratos 1 y 2 solamente: Lesiones torácicas (tumor de pulmón centralmente localizado, ganglios linfáticos en el íleo pulmonar o mediastino)

5. Estado de desempeño: Grupo de Oncología Cooperativo del Este (ECOG) 0 a 1

6. Función de órganos adecuada:

Función de la médula ósea: Valores hematológicos en el inicio de la vacunación: hemoglobina > 95 g/l, recuento de plaquetas > 75000/pl, recuento de glóbulos blancos > 2000/pl, recuento de neutrófilos absolutos > 1000/pl, recuento de linfocitos > 0,8 x 109/l

Hepático: ALT y AST < 2,5 veces ULN en pacientes sin metástasis de hígado y < 5 veces ULN en pacientes con metástasis de hígado

Renal: Creatinina en suero < 2 mg/dl, y eliminación de creatinina > 45 ml/min de acuerdo con la fórmula MDRD

7. Uso de la contracepción sumamente efectiva en pacientes de potencial embarazo mientras se desarrolla el estudio y durante un mes después de la última inmunización.

8. Consentimiento informado por escrito antes de realizar cualquier procedimiento relacionado con el estudio.

- Duración del tratamiento: en cada paciente, la vacuna se administrará hasta que la progresión de la enfermedad y la necesidad de iniciar un tratamiento de segunda línea sistémico subsecuente, ocurrencia de la toxicidad inaceptable, cualquiera que venga primero. - Tiempo de clasificación: Los pacientes comenzarán la clasificación 2 semanas después del día 1 del último ciclo de su quimioterapia de primera línea (estratos 1 y 2), o dentro de 6 meses después del inicio del tratamiento con un EGFR TKI (erlotinib o gefitinib) (estrato 3).

Método de administración

Cada ARNm que proporciona antígeno se aplica individualmente el mismo día como dos inyecciones intradérmicas de 20o pl cada una, dando un total de 12 inyecciones.

Las primeras tres vacunaciones serán en un intervalo semanal (días 1, 8, 15), seguido por los intervalos de 2 o 3 semanas hasta el día 57, intervalos de 3 semanas hasta el mes 6 y 6 semanas después como se especifica en el protocolo del estudio como es especificado en el protocolo del estudio. La vacunación se administrará hasta la ocurrencia de una toxicidad inaceptable o progresión de tumor que requiere el inicio de una terapia de segunda línea sistémica.

En los estratos 1 y 3, CV9202 se administrará inicialmente en los Días 1, 8, 15, 36, y 57. Durante el tratamiento con pemetrexed (estrato 1), la vacunación se administrará 4-7 días antes de la siguiente dosis programada de pemetrexed. Este programa se eligió para evitar la vacunación durante el nadir de neutrófilos y la interferencia con los esteroides anti-inflamatorios.

En el estrato 2, CV9202 se administrará inicialmente en los Días 1, 8, 15, 29, 43 y 57. Este programa identificado se elige puesto que los pacientes tienen un tiempo más corto esperado para la progresión de la enfermedad debido a que no reciben tratamiento anti-cáncer concomitante.

En todos los estratos, los pacientes continuarán vacunándose después del Día 57 en caso de que no se cumplan ningún criterio para la descontinuación del tratamiento. Después del Día 57 las vacunaciones se administrarán cada 3 semanas hasta 6 meses desde el día de la primera vacunación. Después del período de 6 meses, la vacunación se llevará a cabo cada seis semanas hasta que se cumplan los criterios de descontinuación:

Criterios para descontinuación del tratamiento:

1. Ocurrencia de toxicidad que requiere descontinuación permanente de tratamiento

2. Progresión de la enfermedad que requiere de inicio de un tratamiento sistémico subsecuente

Administración de

Vacunas: En cada punto de tiempo de vacunación individual, cada uno de los 6 componentes de fármaco se administrará separadamente en el mismo día. Dos inyecciones intradérmicas (i.d.) de 200 pl cada una se llevaron a cabo por componente, dando por resultado un total de 12 inyecciones.

Radiación: La radioterapia se administrará en fracciones de 4 días de 5 GY cada una que se administra dentro de una semana, de manera preferente del Día 9-12.

Selección de las lesiones tumorales para la radiación

Las lesiones seleccionadas para la radiación deben medir al menos 2 cm en el diámetro más largo, y el oncólogo de radiación en el sitio del ensayo debe confirmar que la lesión respectiva es elegible para radiación de acuerdo con este protocolo antes de que el paciente se enrole.

Las siguientes lesiones son potencialmente seleccionables y se deben seleccionar de acuerdo con la siguiente jerarquía:

Primera preferecia: Metástasis ósea

Segunda preferencia: Nódulos linfáticos en las regiones paraclaviculares, axilares y cervicales

Tercera preferencia: Metástasis de la piel o subcutáneas

Cuarta preferencia (para pacientes en los estratos 1 y 2 solamente): Lesiones torácicas (tumor de pulmón centralmente localizado, ganglios linfáticos en el íleo pulmonar o mediastino)

En pacientes en el estrato 3, no se debe seleccionar una lesión torácica para la radiación puesto que los pacientes están en mayor riesgo de neumonitis de radiación después de la radiación torácica debido al tratamiento concomitante con EGFR TKIs.

La irradiación de más de una lesión con el mismo programa de 4 x 5 GY (por ejemplo múltiples metástasis óseas) se permite si se indica clínicamente siempre y cuando una lesión medible permanezca para la evaluación de una respuesta abscopal. La irradiación de más de una lesión se debe llevar a cabo dentro de la misma ventana de tiempo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo la composición seis ARNm, donde cada ARNm codifica un antígeno diferente seleccionado del grupo consistente en:

• 5T4(Glicoproteína Trofoblástica, TPBG);

• Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral; BIRC5),

• MAGE-C1 (Familia de antígenos de melanoma C1);

• MAGE-C2 (Familia de antígenos de melanoma C2), y

• MUC1 (Mucina 1),

y donde cada ARNm es idéntico a una secuencia de ARN diferente seleccionada de las secuencias de ARN según las SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 o 24, donde cada ARNm está complejado con un compuesto catiónico seleccionado del grupo consistente en un péptido catiónico, una proteína catiónica, un polisacárido catiónico, un polímero catiónico y un lípido catiónico y donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico.

2. Composición para su uso según la reivindicación 1, donde el compuesto catiónico es un policatión, preferentemente protamina u oligofectamina, más preferentemente protamina.

3. Composición para su uso según la reivindicación 2, donde la proporción N/P entre al menos un ARNm y el uno o más policationes está en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 10, incluyendo un intervalo de aproximadamente 0,3 a 4, de aproximadamente 0,5 a 2, de aproximadamente 0,7 a 2 y de aproximadamente 0,7 a 1,5.

4. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende al menos un ARN que está complejado con uno o más policationes y al menos un ARN libre, donde el ARN complejado preferentemente es idéntico al a Rn libre.

5. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la composición además comprende al menos un adyuvante, seleccionándose el al menos un adyuvante preferentemente del grupo consistente en:

compuestos catiónicos o policatiónicos, que comprenden péptidos o proteínas catiónicas o policatiónicas, incluyendo protamina, nucleolina, espermina o espermidina, poli-L-lisina (PLL), poliarginina, polipéptidos básicos, péptidos de penetración de células (CPPs), incluyendo péptidos de unión a VIH, Tat, HIV-1 Tat (HIV), péptidos derivados de Tat, penetratina, derivados o análogos de VP22, HSV VP22 (Herpes simple), Ma P, KALA o dominios de transducción de proteína (PTD, PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, péptido(s) MPG, Pep-1, L-oligómeros, péptido(s) de calcitonina, péptidos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, lactofetrina, transportano, buforina-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, protamina, espermina, espermidina o histonas; polisacáridos catiónicos, incluyendo quitosano, polibreno, polímeros catiónicos, incluyendo polietilenimina (PEI), lípidos catiónicos, incluyendo DOTMA: cloruro de 1-(2,3-sioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil-fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecilamidoglicilespermina, DIMRI: bromuro de dimiristo-oxipropil-dimetil-hidroxieti-amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano, DC-6-14: cloruro de O,O-ditetradecanoil-N-(trimetilamonioacetil)dietanolamina, c L ip 1: cloruro de rac-(2,3-dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)-dimetilamonio, CLIP6: rac-2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi)etil-trimetilamonio, CLIP9: rac-2(2,3-dihexadeciloxipropil-oxisucciniloxi)etil-trimetilamonio, oligofectamina; o polímeros catiónicos o policatiónicos, incluyendo poliaminoácidos modificados, incluyendo polímeros de p-aminoácidos o poliamidas inversas, polietilenos modificados, incluyendo PVP bromuro de (poli(N-etil-4-vinilpiridinio)), acrilatos modificados, incluyendo pDMAEMA (poli(dimetilaminoetilmetilacrilato)), amidoaminas modificadas, incluyendo pAMAM (poli(amidoamina)), polibetaaminoéster modificado (PBAE), incluyendo diamina y polímeros de diacrilato de 1,4-butanodiol-diacrilato-co-5-amino-1-pentanol, dendrímeros, incluyendo dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros basados en pAMAM, poliimina(s), incluyendo PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), polialilamina, polímeros basados en el esqueleto azúcar, incluyendo polímeros basados en ciclodextrina, polímeros basados en dextrano, quitosano, etc., polímeros basados en el esqueleto silano, como copolímeros PMOXA-PDMS, etc., polímeros en bloque consistentes en una combinación de uno o más bloques catiónicos seleccionados de un polímero catiónico como se menciona anteriormente y de uno o más bloques hidrofílicos o hidrofóbicos (por ejemplo polietilenglicol); o

proteínas o péptidos catiónicos o policatiónicos seleccionados de las siguientes proteínas o péptidos con la siguiente fórmula total (I): (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, donde l m n o x = 8-15, y l, m, n u o, independientemente entre sí, puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, con la condición de que el contenido total de Arg, Lys, His y Orn represente al menos un 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto de Arg, Lys, His u Orn; y x puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3 o 4, con la condición de que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; o

ácidos nucleicos con la fórmula (II): GlXmGn, donde: G es guanosina, uridina o un análogo de guanosina o uridina; X es guanosina, uridina, adenosina, timidina, citidina o un análogo de los nucleótidos mencionados; l es un entero de 1 a 40, donde cuando l = 1 G es guanosina o un análogo de la misma, cuando l > 1 al menos el 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma; m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3 X es uridina o un análogo de la misma, cuando m > 3 están presentes al menos 3 uridinas sucesivas o análogos de uridina; n es un entero de 1 a 40, donde cuando n = 1 G es guanosina o un análogo de la misma, cuando n > 1 al menos el 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma; o

ácidos nucleicos con la fórmula (III): ClXmCn, donde: C es citidina, uridina o un análogo de citidina o uridina; X es guanosina, uridina, adenosina, timidina, citidina o un análogo de los nucleótidos mencionados; l es un número entero de 1 a 40, donde cuando l = 1 C es citidina o un análogo de la misma, cuando l > 1 al menos el 50% de los nucleótidos son citidina o un análogo de la misma; m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3 X es uridina o un análogo de la misma, cuando m > 3 están presentes al menos 3 uridinas sucesivas o análogos de uridina; n es un entero de 1 a 40, donde cuando n = 1 C es citidina o un análogo de la misma, cuando n > 1 al menos el 50% de los nucleótidos son citidina o un análogo de la misma.

6. Vacuna para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo la vacuna una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la vacuna preferentemente además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo el tratamiento además la administración de un agente quimioterapéutico.

7. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o vacuna para su uso según la reivindicación 6, donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo consistente en un compuesto basado en platino, pemetrexed, gemcitabina, taxanos, vinorelbina, etopósido, docetaxel y paclitaxel.

8. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 7 o vacuna para su uso según la reivindicación 6 o 7, donde el tratamiento comprende además terapia de radiación.

9. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 7 u 8 o vacuna para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde la composición o la vacuna se utiliza para el tratamiento de un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV.

10. Composición para su uso o vacuna para su uso según la reivindicación 9, donde el cáncer de pulmón de células no pequeñas se caracteriza por una histología no escamosa.

11. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 7 a 10 o vacuna para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el sujeto es un paciente que recibe quimioterapia, preferentemente quimioterapia basada en platino o quimioterapia combinada basada en platino, o un paciente que ha tenido una respuesta parcial o una enfermedad estable después de quimioterapia.

12. Combinación de seis ARNm para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde cada ARNm codifica un antígeno seleccionado del grupo consistente en 5T4 (Glicoproteína Trofoblástica, TPBG), Survivina (Proteína 5 que contiene la repetición IAP Baculoviral; BIRC5), NY-ESO-1 (Carcinoma 1 de células escamosas esofágicas de Nueva York, CTAG1B), MAGE-C1 (Familia de antígenos de melanoma C1), MAGE-C2 (Familia de antígenos de melanoma C2) y MUC1 (Mucina 1) y donde cada ARNm es idéntico a una secuencia de ARN diferente seleccionada de las secuencias de ARN de acuerdo con las SEQ ID NO: 19, 20, 21,22, 23 o 24 y donde cada ARNm está complejado con un compuesto catiónico seleccionado del grupo consistente en un péptido catiónico, una proteína catiónica, un polisacárido catiónico, un polímero catiónico y un lípido catiónico, y donde el tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico.

13. Combinación para su uso según la reivindicación 12, donde cada uno de los seis ARNm se administra por separado.

14. Combinación para su uso según la reivindicación 12 o 13, donde los ARNm se administran por inyección intradérmica.

15. Combinación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde el tratamiento comprende además una terapia de radiación.

16. Combinación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde la composición se usa para el tratamiento de un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio III o IV.

17. Combinación para su uso según la reivindicación 16, donde el cáncer de pulmón de células no pequeñas se caracteriza por una histología no escamosa.

18. Combinación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, donde el sujeto es un paciente que recibe quimioterapia, preferentemente quimioterapia basada en platino o quimioterapia combinada basada en platino, o un paciente que ha tenido una respuesta parcial o una enfermedad estable después de quimioterapia.

19. Kit, preferentemente kit de partes, para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, comprendiendo el kit la composición para su uso según con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 7 a 11 y/o una vacuna para su uso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, y opcionalmente un vehículo líquido para la solubilización y opcionalmente instrucciones técnicas con información sobre la administración y dosificación de la composición activa y/o de la vacuna.

20. Kit para su uso según la reivindicación 19, donde el kit es un kit de partes y cada parte del kit contiene al menos un ARNm que codifica preferentemente un antígeno diferente seleccionado de los antígenos definidos en la reivindicación 1, formando todas las partes del kit de partes la composición o la vacuna de las reivindicaciones anteriores.

21. Kit para su uso según la reivindicación 19 o 20, donde el kit contiene al menos dos partes que contienen seis ARNm.

22. Kit para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, donde todos los seis ARNm se proporcionan en forma liofilizada en partes separadas.

23. Kit para su uso según la reivindicación 22, donde el kit contiene, como una parte, una solución Ringer-Lactato.

24. Kit para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, donde el kit contiene seis partes, conteniendo cada parte uno de los seis ARNm.