ES2741676T3 - Terapia para promover el crecimiento celular - Google Patents

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Michel Lazdunski
Catherine Heurteaux
David Picard
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Moleac Pte Ltd
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Abstract

Una composición que comprende al menos tres de los siguientes componentes: rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla de durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu), para el uso en un método de disminución de los efectos del accidente cerebrovascular o de la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia para promover el crecimiento celular
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a métodos y composiciones para promover la excrecencia y la proliferación neuronales. La presente invención también se refiere a un método in vitro para promover el crecimiento celular.
Antecedentes
Las lesiones del sistema nervioso afectan numerosas personas cada año. Como resultado de esta alta incidencia de lesiones neurológicas, la regeneración y la reparación nerviosas se están convirtiendo en un campo de rápido crecimiento dedicado al descubrimiento de nuevas formas de recuperar la funcionalidad nerviosa después de una lesión. Sin embargo, hasta ahora, la reparación clínica de las lesiones del sistema nervioso central (SNC) y la recuperación de las funciones neurológicas de pacientes que sufren lesiones del sistema nervioso han sido problemáticas. Por lo tanto, los médicos siempre han advertido a los pacientes con diversas formas de enfermedades del sistema nervioso, tales como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS, conforme a sus siglas en inglés) y la demencia senil, que es difícil recuperar las funciones neurológicas.
La capacidad de las neuronas para extender neuritas (tales como los axones y las dendritas) es de vital importancia para establecer conexiones neuronales durante el desarrollo. También se requiere durante la neurorregeneración, para restablecer las conexiones destruidas como consecuencia de una lesión. Sin embargo, los axones en el sistema nervioso central tienen una capacidad muy limitada para volver a crecer después de una lesión. Por lo tanto, para enfermedades tales como la demencia senil, en la que hay una degeneración progresiva de las células neuronales, la investigación de agentes terapéuticos o moléculas que sean capaces de estimular la excrecencia y la proliferación de las células neuronales abrirá una nueva estrategia terapéutica que se centra en la reparación neuronal y la restauración de la función neurológica.
El documento WO 2007/043796 se refiere a una fracción soluble en éter dietílico de Salviae Miltiorrhizae Bunge BGE que puede inhibir la agregación de beta-amiloide, la toxicidad y la apoptosis celular, y por lo tanto, puede usarse para tratar y prevenir trastornos de la función cognitiva. El documento Cn 102091166 A se relaciona con medicinas tradicionales chinas, como Codonopsls pilosula, Astragalus y la raíz de la salvia de raíz roja, para promover la regeneración neuromuscular. El documento WO 2007/106049 A1 proporciona composiciones y métodos que incluyen Radix Astragali, raíz de Rhizoma Salviae Miltiorrhizae y Radix Paeoniae Rubra, para tratar afecciones seleccionadas de accidente cerebrovascular, enfermedades neurodegenerativas, traumatismo cerebral o del sistema nervioso, o neuroplasticidad. El documento WO 2010/053456 proporciona composiciones y métodos para el tratamiento de pacientes con accidente cerebrovascular utilizando la medicina tradicional china, como NeuroAid. Siow C., Eur Neurol (2008) 60: 264-266 se refiere a NeuroAid en la recuperación del accidente cerebrovascular.
Existe la necesidad de mejorar los métodos de tratamiento de lesiones del sistema nervioso y enfermedades neurológicas. Más específicamente, existe la necesidad de proporcionar terapias regenerativas que puedan promover la excrecencia neuronal y la proliferación de neuronas, de manera de permitir que los nervios dañados o enfermos vuelvan a funcionar.
Compendio
De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona una composición que comprende al menos tres de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla del durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu), para el uso en un método de disminución de los efectos del accidente cerebrovascular o la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración.
En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más de: Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Eupolyphaga Seu Setelephaga (cuerpo seco de escarabajo de tierra, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial, o Rengong Niuhuang), Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi).
En algunas realizaciones, la composición comprende 3 a 14 de los componentes. En algunas realizaciones, la composición comprende 4 de los componentes. En algunas realizaciones, la composición comprende 9 de los componentes.
En algunas realizaciones, la composición comprende además un agente usado en medicina occidental. En algunas realizaciones, la composición y la medicina occidental son adecuadas para la administración a un ser humano como un medicamento en combinación, en forma secuencial o separada.
En algunas realizaciones, la composición comprende los siguientes componentes: rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla de durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu).
En algunas realizaciones, la composición comprende los siguientes componentes: rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla de durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu), Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Eupolyphaga Seu Setelephaga (cuerpo seco de escarabajo de tierra, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial, o Rengong Niuhuang), Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi).
Glosario de términos
El objetivo de esta sección es proporcionar orientación sobre la interpretación de las palabras y frases que se exponen a continuación (y, cuando corresponda, sus variantes gramaticales).
El término "excrecencia neuronal" en la memoria descriptiva se refiere al crecimiento direccional general hacia afuera de axones y dendritas. La excrecencia neuronal es importante en la formación o el desarrollo de las sinapsis.
A menos que se especifique lo contrario, los términos "que comprende" y "comprende", y sus variantes gramaticales, pretenden representar un lenguaje "abierto" o "inclusivo" de tal manera que incluyen elementos citados pero también permiten la inclusión de elementos adicionales no citados.
Como se usa en este documento, el término "aproximadamente" como se usa en relación con un valor numérico significa, por ejemplo, 50% o 30% del valor numérico, preferiblemente 20%, más preferiblemente 10%, más preferiblemente aún 5 %, y más preferiblemente 1%. Cuando sea necesario, la palabra "aproximadamente" se puede omitir de la definición de la invención.
El término "tratamiento" incluye cualquiera y todos los usos que remedian un estado o síntomas de la enfermedad o sus síntomas, impiden el establecimiento de la enfermedad, o de otro modo previenen, impiden, retrasan o revierten la progresión de la enfermedad u otros síntomas indeseables de cualquier manera. Por lo tanto, "tratamiento" incluye tratamiento profiláctico y terapéutico.
A lo largo de esta descripción, ciertas realizaciones pueden describirse en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de los rangos descritos. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un rango describe específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un rango, tal como de 1 a 6, tiene subrangos descritos específicamente, tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.
Descripción detallada
La presente descripción proporciona el uso de una composición que comprende al menos tres de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla del durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu), en la fabricación de un medicamento para la disminución de los efectos del accidente cerebrovascular o la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración.
La composición puede comprender además un componente seleccionado del grupo que consiste en Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi), Eupolyphaga Seu Setelephaga (cuerpo seco de escarabajo de tierra, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial, o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao).
La composición puede comprender al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13 o 14 de los componentes.
El medicamento puede promover la excrecencia neuronal y la proliferación de neuronas o células madre en tejidos lesionados o enfermos que pueden aparecer en pacientes con alguna de las siguientes enfermedades: esclerosis lateral amiotrófica (ALS), absceso cerebral, isquemia cerebral, atrofia cerebral asociada con diabetes, arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL, conforme a sus siglas en inglés), trastornos cerebrovasculares, degeneración ganglionar corticobasal (CBGD, por sus siglas en inglés), isquemia crónica, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Dandy-Walker, distrofia muscular de Duchenne, demencia senil, demencia relacionada con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), encefalomielitis, temblor esencial, ataxia de Friedreich, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad de Huntington, hidrocefalia, hipoxia, insomnio familiar fatal, ataque isquémico transitorio, kuru, síndrome de Landau-Kleffner, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph, meningitis bacteriana y viral, trastornos de migraña, mielitis, atrofias olivopontocerebelosas, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, poliomelitis, síndrome pospoliomielitis, enfermedades priónicas, seudotumor cerebral, síndrome de Shy-Drager, espasmos infantiles, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Steinert, siringomielia, enfermedades talámicas, trastornos de tics, síndrome de Tourette y síndrome uveomeningoencefalítico.
La composición también se puede usar para tratar pacientes que tienen una afección seleccionada del grupo de indicaciones psiquiátricas, tales como trastornos de ansiedad, esquizofrenia, depresión y depresión posparto, envejecimiento natural, muerte traumática de células cerebrales y otras manifestaciones neurológicas tales como amnesia, dolor de espalda, vértigo, pérdida del conocimiento, síndrome del miembro fantasma, trastornos del olfato, dolor de cuello, dolor de cabeza, migrañas, espasmos y trastornos del habla.
La composición puede disminuir el efecto del accidente cerebrovascular o la neurodegeneración en sujetos predispuestos o en sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegerenación. La neurodegeneración puede ser causada por enfermedades seleccionadas del grupo de enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), absceso cerebral, isquemia cerebral, atrofia cerebral asociada con diabetes, arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL), trastornos cerebrovasculares, degeneración ganglionar corticobasal (CBGD), isquemia crónica, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Dandy-Walker, distrofia muscular de Duchenne, demencia senil, demencia asociada con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), encafalomielitis, temblor esencial, ataxia de Friedreich, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad de Huntington, hidrocefalia, hipoxia, insomnio familiar fatal, ataque isquémico transitorio, kuru, síndrome de Landau-Kleffner, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph, meningitis bacteriana y viral, trastornos de migraña, mielitis, atrofias olivopontocerebelosas, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, enfermedad de Parkinson, poliomelitis, síndrome pospoliomielitis, enfermedades priónicas, seudotumor cerebral, síndrome de Shy-Drager, enfermedad de Steinert, espasmos infantiles, parálisis supranuclear progresiva, siringomielia, enfermedades talámicas, trastornos de tics, síndrome de Tourette, síndrome uveomeningoencefalítico, isquemia global y focal y otras enfermedades cardiovasculares, en sujetos predispuestos .
Se contempla que NeuroAid™ o una composición similar a NeuroAid™ (por ejemplo, una composición como se describe a continuación), opcionalmente, en combinación con agentes suplementarios disponibles, puede ser útil para el bienestar general de las neuronas o para el tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso y otras enfermedades degenerativas. Los agentes suplementarios pueden ser vitaminas, suplementos minerales, suplementos herbales, aceites de pescado y medicina occidental. Típicamente, el agente suplementario usado en combinación con NeuroAid™ o una composición similar a NeuroAid™ es aquel que se dirige a un mecanismo diferente de NeuroAid™ o de una composición similar a NeuroAid™. Por ejemplo, la medicina occidental puede ser un factor de crecimiento que se usa normalmente para mejorar el potencial de recuperación en pacientes con enfermedades degenerativas. Los ejemplos de agentes adecuados utilizados en la medicina occidental incluyen bloqueadores del canal de calcio (D-600, Diltiazem, Nitrendipina, Nimodipina, Nifedipina, Flunarizina, Fluspirileno, Isradipina, Nicardipina, PY 108-068, Verapamil y Triapamil), quelante de calcio (DP-b99), eliminadores de radicales libres (Ebselen, Tirilazad, NXY-059), agonistas del receptor de GABA (ácido gamma-aminobutírico, conforme a sus siglas en inglés) (Diazepam, Baclofeno), agonistas de AMPA (ácido a -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico, conforme a sus siglas en inglés) (ZK 200775/MPQX), antagonistas competitivos de NMDA (W-metil-D-aspartato) (aptiganel/cerestat, CP 101.606, dextrofano, MK 801/dizocilpina, remacemida), antagonistas del sitio de glicina (GV 150526, ACEA 1021), antagonistas del sitio de poliamina (eliprodil), factores de crecimiento (bFGF), bloqueadores del canal de sodio (fosfenitoína, 619C89), abridores del canal de potasio (BMS 204352, cromakalim, levcromakalim, aprikalim, pinacidil, diazóxido, nicorandil, minoxidil), piracetam, inhibidor del transporte de adenosina (propentofilina), gangliósidos GM (no antagonista de NMDA), inhibidores de la liberación de glutamato presináptico, clazosentano, desmoteplasa, viprinex (ancrod), tenecteplasa (TNKasa; Metalisa), alteplasa, nitronas cíclicas, receptor TWEAK (inductor débil de la apoptosis de tipo TNF), tratamientos trombolíticos (uroquinasa, estreptoquinasa, activador de t -PA/plasminógeno tisular o uroquinasa recombinante), anistreplasa, riluzol y disufentona sódica (NXY 059), candesartán, AX-200 (G-CSF, Fligrastim), cafeinol (cafeína etanol), enecadina, microplasmina, sonolisis tPA, V -10153, HTUPA, solulina, piclozotán, S-0139, S-18986, AEOL-10150, AL-208, KN-38-7271, fridoxal 5-fosfato, Neu-2000KL, ONO-2231, PGX-100, RVX-208, SUN-N4057, SUN-N8075, TAT-NR2B9c, terapia con células madre que expresan GLP-1, Msc-1 (SA-4503, AGY-94806), NH-02D, S-0139 259, citoquinas protectoras de tejidos (Lu-AA24493), V10153270 (b B-10153, TAPgen), uso combinado de estatinas y otros fármacos reductores del colesterol, eritropoyetina, cerebrolisina y CDP-colina (citidina-5'-difosfocolina).
La descripción proporciona un método para inducir la proliferación o diferenciación de células, que comprende poner en contacto dichas células con una cantidad efectiva de al menos uno de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla del durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi), Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu), cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi), Eupolyphaga Seu Setelephaga (cuerpo seco de escarabajo de tierra, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial, o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao).
La composición puede promover el crecimiento celular o la supervivencia celular, y facilitaría el cultivo in vitro de diversas células que se pueden usar para la ingeniería tisular o usos terapéuticos ex vivo. El paciente que recibe las células cultivadas también puede ser administrado con NeuroAid™.
NeuroAid™ y composiciones similares
Los ingredientes expuestos anteriormente pueden estar presentes en la composición en una forma relativamente cruda (por ejemplo, hierbas sin procesar o trituradas), o en una forma más refinada (por ejemplo, extractos purificados).
En algunos casos, se usa NeuroAid™ de Moleac Pte. Ltd. NeuroAid™ es un producto TCM en forma de cápsula que comprende 9 componentes herbales y 5 componentes animales. NeuroAid™ comprende Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla del durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi), Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu), Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi), Eupolyphaga Seu Setelephaga (cuerpo seco de escarabajo de tierra, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial, o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao).
En otros casos, NeuroAid II comprende Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus Persica (semilla del durazno o Taoren), Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu). NeuroAid™, que puede estar registrado con diferentes nombres en diferentes países (por ejemplo, en Sudáfrica se comercializa como Strocaid™ o Dangi Piantan Jiaonang™), es fabricado y está disponible comercialmente en la República Popular China por Tianjin Shitian Pharmaceutical Group Co., Ltd. (ubicado en el área industrial de Jianxin, ciudad de Wangwenzhuang, distrito de Xiqing, ciudad de Tianjin, China; Código Postal 300381). También está disponible de Moleac Pte. Ltd. (anteriormente, Molecular Acupuncture Pte. Ltd.), el principal licenciatario fuera de la República Popular de China (11 Biopolis Way, Helios # 09-08 Singapur 138667).
Para evitar dudas, NeuroAid™ no solo incluye NeuroAid™ en la forma en que se comercializa actualmente, sino que también incluye formulaciones futuras de NeuroAid™ que pueden, por ejemplo, ser comercializadas por Tianjin Shitian Pharmaceutical Group Co., Ltd., o Moleac Pte. Ltd. Tales formulaciones futuras pueden, por ejemplo, variar en cantidades de dosificación o en la concentración de sus ingredientes activos, etc. También se conoce NeuroAid™ como MLC 601, y los términos "NeuroAid™" y "MLC 601" se pueden usar indistintamente. De manera similar, NeuroAid II también se conoce como MLC 901, y los términos "NeuroAid II" y "MLC 901" se pueden usar indistintamente.
Neuroprotectores
Mediante el uso de diversos mecanismos, los neuroprotectores son compuestos que preservan el tejido neuronal en riesgo de morir durante el curso de enfermedades que causan la neurodegeneración. Algunos agentes neuroprotectores incluyen antioxidantes (p. ej., selenio, 30 vitamina E, vitamina C, glutatión, cisteína, flavonoides, quinolinas, enzimas con actividad reductora, etc.), antagonistas del receptor de N-metil-D-aspartato (Dextrorfano, Selfotel, Magnesio), antagonista del receptor narcótico (Nalmefeno (Cervene)), bloqueadores del canal de Ca, moduladores del canal de Na (Lubeluzol), agonista del ácido alfa-aminobutírico (Clometiazol), moduladores del receptor de glutamato, agonistas del receptor de serotonina (repinotano), fosfolípidos, depuradores de radicales libres (Tirilazad y NXY-059), inhibidor de la activación de astrocitos (ONO 2506), anticuerpos monoclonales tales como anti-ICAM-1 (Enlimomab), anticuerpo antileucocitario humano, Hu23F2G, agente de estabilización de la membrana CDP-colina (Citicolina), factor de crecimiento de fibroblastos (Fiblasto), ácidos grasos insaturados y poliinsaturados, estrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SEAMS, conforme a sus siglas en inglés), progestinas, hormona tiroidea y compuestos miméticos de la hormona tiroidea, ciclosporina A y derivados, talidomida y derivados, metilxantinas, inhibidores de la monoamina-oxidasa (IMAO), bloqueadores de la captación de serotonina, noradrenalina y dopamina, agonistas de la dopamina I, L-DOPA, nicotina y derivados, y moduladores de la NO sintasa.
Factores de crecimiento
Mediante el uso de diversos mecanismos, los factores de crecimiento son compuestos que promueven la diferenciación o proliferación de células particulares. Algunos factores de crecimiento incluyen proteínas morfogenéticas óseas (BMP, conforme a sus siglas en inglés), factor de crecimiento epidérmico (EGF, conforme a sus siglas en inglés), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, conforme a sus siglas en inglés), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF, conforme a sus siglas en inglés), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, conforme a sus siglas en inglés), factores de crecimiento de hepatocitos (HGF, conforme a sus siglas en inglés), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF, conforme a sus siglas en inglés), miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF, conforme a sus siglas en inglés), neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, conforme a sus siglas en inglés), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento de transformación alfa (TGF-a , conforme a sus siglas en inglés), factor de crecimiento de transformación beta (TGF-p), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, conforme a sus siglas en inglés), interleuquina-1 p (IL-1P), IL-2, IL-3, IL-4, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-21, IL-33, M-CSF, Noggin, interferones (IFN)-a , IFN-p e IFN-y.
Compuestos para la activación de los canales de potasio TREK-1.
Otros agentes adecuados utilizados en la medicina occidental incluyen compuestos capaces de activar los canales de potasio TREK-1. Se ha encontrado que la activación de TREK-1 disminuye los efectos del accidente cerebrovascular o la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración. Además, se ha demostrado que TREK-1 desempeña un rol en el tratamiento de pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico, y en pacientes con depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte traumática de células cerebrales. Dado que NeuroAid® no activa los canales de potasio TREK 1, pueden usarse compuestos que son capaces de activar los canales de potasio TREK-1 en combinación con NeuroAid™ (MLC 601) a fin de disminuir los efectos del accidente cerebrovascular o de la neurodegeneración, y para tratar pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico y pacientes que sufren de depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte traumática de células cerebrales.
Un ejemplo de un compuesto que es capaz de activar los canales de potasio TREK-1 son los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, conforme a sus siglas en inglés). Los ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos que contienen más de un doble enlace. Los PUFA pueden clasificarse como polienos interrumpidos por metileno o ácidos grasos conjugados.
Los polienos interrumpidos por metileno son ácidos grasos que tienen dos o más dobles enlaces cis que están separados entre sí por un solo grupo metileno. Los ácidos grasos esenciales son todos ácidos grasos omega-3 y -6 interrumpidos por metileno. Los ejemplos de ácidos grasos Omega-3 incluyen, sin limitación: ácido alfa-linolénico (ALA), ácido estearidónico (STD), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido clupanodónico, ácido tetracosapentaenoico, ácido tetracosahexaenoico o ácido nisínico. Los ejemplos de ácidos grasos omega-6 incluyen, sin limitación: ácido linoleico (LIN), ácido gamma-linolénico (GLA), ácido eicosadienoico, ácido dihomogamma-linolénico (DGLA), ácido araquidónico (AA), ácido docosadienoico, ácido adrénico, ácido docosapentaenoico o ácido Osbond. Los ácidos grasos omega-9 son también polienos interrumpidos por metileno, y pueden ser monosaturados o polisaturados. Los ejemplos de ácidos grasos Omega-9 incluyen, sin limitación: ácido oleico, ácido eicosenoico, ácido Mead, ácido erúcico o ácido nervónico.
Los ácidos grasos conjugados son ácidos grasos que tienen dos o más dobles enlaces conjugados. Los ejemplos de ácidos grasos conjugados incluyen, sin limitación: ácido reménico, ácido a -caléndico, ácido p-caléndico, ácido jacárico, ácido a -eleosteárico, ácido p-eleosteárico, ácido catálpico, ácido punícico, ácido rumelénico, ácido a -parinárico, ácido p-parinárico, ácido boseopentaenoico.
Algunos otros PUFA que no se clasifican como polienos interrumpidos por metileno o ácidos grasos conjugados incluyen, sin limitación, el ácido pinolénico y el ácido podocárpico.
Otros compuestos que pueden ser capaces de activar los canales de potasio TREK-1 incluyen el fármaco Riluzol (Rilutek®), lisofosfolípidos (LPL), ésteres de ácido cafeico y Xenon. Estos compuestos también se pueden usar en combinación con NeuroAid™ (MLC 601) para disminuir los efectos del accidente cerebrovascular o de la neurodegeneración y tratar pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico, y pacientes que sufren de depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte traumática de células cerebrales.
Modos de Administración
NeuroAid™ (MLC 601) puede administrarse por vía oral, parenteral, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o tópica, en forma líquida, semilíquida o sólida, y se formula de una manera adecuada para cada vía de administración. Cuando NeuroAid™ (MLC 601) se administra por vía oral, se puede administrar como cuatro cápsulas de 0,4 g que se toman 3 veces por día. Para pacientes con dificultades en la deglución, las cápsulas pueden abrirse, y el polvo puede diluirse en agua que puede beberse como tal o inyectarse a través de un tubo gástrico. Por lo tanto, se contempla una dosis diaria de aproximadamente de 4,8 g. En una realización, la dosis diaria de NeuroAid™ (MLC 601) del paciente es de aproximadamente 1 g a 8 g; 2 g a 8 g; 3 g a 7 g; 4 g a 6 g; 4,25 g a 5,75 g; 4,5 g a 5,25 g; 4,5 g a 5 g; 4,6 g a 4,10 g; o 4,7 g a 4,9 g. Una "dosis diaria" puede ser un solo comprimido o cápsula, etc., o múltiples comprimidos o cápsulas, etc., que se tomarán en un día determinado.
Cada curso de tratamiento de NeuroAid™ (MLC 601) puede durar aproximadamente 4 semanas. Típicamente, se administran 3 cursos, más comúnmente, en forma consecutiva. No se requiere una ventana terapéutica, pero se pueden agregar cursos adicionales, incluso, después de algunos días de la finalización del tratamiento. Por lo tanto, en una realización, cada tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) dura aproximadamente 12 semanas. En otra realización, el curso de tratamiento de NeuroAid™ (MLC 601) es de aproximadamente 4 a 24 semanas; 7 a 16 semanas; 9 a 15 semanas; 10 a 14 semanas; u 11 a 13 semanas.
NeuroAid™ (MLC 601) también se puede usar como tratamiento crónico para dirigirse a enfermedades crónicas o como medida preventiva.
NeuroAid™ (MLC 601) puede usarse como parte de una terapia de combinación con medicina occidental que promueve el crecimiento celular. Las parejas de combinación de NeuroAid™ (MLC 601) y el factor de crecimiento celular pueden presentarse en una única formulación, o pueden presentarse como formulaciones separadas. En una realización, puede haber un efecto sinérgico.
Las parejas de combinación de NeuroAid™ (MLC 601) y el factor de crecimiento celular se pueden administrar al paciente al mismo tiempo (por ejemplo, simultáneamente) o en diferentes momentos (por ejemplo, de manera secuencial) y durante diferentes períodos de tiempo, que pueden estar separados entre sí o superponerse. Las parejas de combinación de NeuroAid™ (MLC 601) y el factor de crecimiento celular pueden administrarse en cualquier orden.
Cuando se utiliza el factor de crecimiento celular, los expertos en la técnica conocerán la vía de administración y el nivel de dosis apropiados, o estos podrían ser determinados fácilmente por un experto en la técnica. Típicamente, como es bien sabido en la técnica médica, los regímenes de dosificación pueden depender de diversos factores, que incluyen el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se administrará, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros aspectos fármacos que se administran simultáneamente. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los rangos óptimos de las cantidades efectivas de cada componente está dentro de los conocimientos de la técnica. La dosis será similar a aquella administrada cuando el agente se usa sin NeuroAid™ (MLC 601).
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra gráficos de barras del efecto dosis del tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) sobre la viabilidad celular en el día 8, día 10 y día 14. Tres concentraciones de NeuroAid™ (MLC 601) (0,1,0,5, 1,0 pg/ml) se compararon con el control.
La Fig. 2 muestra gráficos de barras del efecto del tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) sobre la liberación de LDH el día 10 y el día 14. Se comparó una concentración de 1,0 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) con el control.
La Fig. 3 muestra imágenes confocales del efecto del tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) sobre la expresión de DCX neuronal en el día 3 y el día 14. Se comparó una concentración de 1,0 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601), con el control.
La Fig. 4 muestra gráficos de barras del efecto de los tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) sobre la viabilidad celular en el día 8, día 10, día 12 y día 14. Una concentración de 1,0 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) y de 1,0 pg/ml de NeuroAid II (MLC 901) se compararon con el control.
La Fig. 5 muestra un gráfico lineal del efecto de los tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) sobre la liberación de LDH en el día 8, día 10, día 12 y día 14. Una concentración de 1,0 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) y de 1,0 pg/ml de NeuroAid II (MLC 901) se compararon con el control.
La Fig. 6 muestra imágenes confocales del efecto de los tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) sobre la expresión de DCX en el día 3 y el día 14. Una concentración de 1,0 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) y de 1,0 pg/ml de NeuroAid II (MLC 901) se compararon con el control.
La Fig. 7 muestra diagramas esquemáticos de los protocolos experimentales para los tratamientos de NeuroAid II (MLC 901) contra el accidente cerebrovascular. La Fig. 7A muestra el protocolo experimental para el Ejemplo 4, que investiga los efectos del tratamiento con NeuroAid II (MLC 901); la Fig. 7B muestra el protocolo experimental para el Ejemplo 5, que investiga los efectos de un tratamiento agudo de NeuroAid II (MLC 901). Ambos estudios evaluaron la tasa de supervivencia, y también cuantificaron el volumen del infarto a las 24 horas posisquemia.
La Fig. 8 muestra un gráfico de barras de la tasa de supervivencia después del pretratamiento de NeuroAid II (MLC 901) a las 24 horas posisquemia.
La Fig. 9 muestra un gráfico de barras de la tasa de supervivencia (A) y el volumen de infarto (B) después del postratamiento de NeuroAid II (MLC 901) a las 24 horas posisquemia.
La Fig. 10 muestra gráficos de barras sobre los efectos comparativos de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong Radix angelica sinensis, y tratamientos combinados de Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis (1 pg/ml) sobre las neuronas corticales en cultivo, estimado en el Día 12 de tratamiento. La Fig. 10A muestra el efecto de los tratamientos respectivos sobre la viabilidad celular, y la Fig. 10B muestra el efecto de los tratamientos respectivos sobre la liberación de LDH.
La Fig. 11 muestra gráficos de barras sobre los efectos comparativos de un postratamiento con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis, y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, contra la lesión cerebral isquémica in vivo. La Fig. 11A y la Fig. 11B muestran la tasa de supervivencia (A) y el volumen de infarto (B), respectivamente.
La Fig. 12 muestra gráficos de barras sobre los efectos comparativos de un pretratamiento con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis contra la lesión cerebral isquémica in vivo. La Fig. 12A y la Fig. 12B muestran la tasa de supervivencia (A) y el volumen de infarto (B), respectivamente.
La Fig. 13 muestra fotografías representativas de microscopia de epifluorecencia de los efectos comparativos entre NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y tratamiento combinado de Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis (1 pg/ml) sobre la inmunoexpresión de DCX in vitro en células corticales cultivadas en el Día 12 de tratamiento.
La Fig. 14 muestra gráficos de barras de la intensidad de la señal DCX en neuronas inmunoteñidas observada en la microscopia de epifluorecencia.
La Fig. 15 muestra gráficos de barras de la excrecencia de neuritas obtenida mediante la medición en microscopia de epifluorecencia, la longitud total de neuritas (pm) en función de los tratamientos.
Ejemplos
Materiales
Medio para el muestreo cortical:
- HBSS/1
NaCl 8 g/l
KCl 0,26 g/l
MgSO40,2 g/l
CaCl20,264 g/l
NaH2CO32,24 g/l
NaH2PO40,15 g/l en H2O
- HBSS : añadir 6 g de glucosa
Medio de cultivo celular
Neurobasal (21103-049; Invitrogen, San Diego, CA)
B27 (n ° 17504; Invitrogen, San Diego, CA)
Uridina (U3003; Sigma, St. Louis, MO, USA)
Fluoro-desoxi-uridina (46875; Fluka-Chemika-Biochemika, Buchs, Suiza)
Glutamax (35050; Gibco-BRL Life Technologies. GmbH, Karlsrahe, Alemania)
Antibióticos (penicilina-estreptomicina) (Gibco-BRL Life Technologies. GmbH, Karlsrahe, Alemania)
Animales
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las políticas sobre el cuidado y el uso de animales de laboratorio de la legislación de la Comunidad Europea. El Comité de Ética local aprobó los experimentos (números de protocolo NCA/2006/10-1 y NCA/2006/10-2). En este estudio se utilizaron ratones machos adultos C57/B16, que pesaban entre 22 y 26 g. Los animales fueron alojados en condiciones de laboratorio controladas, con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, una temperatura de 21 ± 2°C y una humedad de 60 a 70% durante al menos una semana antes del tratamiento con fármacos o la cirugía. Los ratones tenían acceso libre a la dieta estándar para roedores y al agua corriente.
Solución para beber de NeuroAid II (MLC 901)
Una cápsula de NeuroAid II (MLC 901) se disolvió en 66 ml de agua bajo agitación con un agitador durante una hora a 37°C. La solución luego se filtró con un filtro de 0,45 pm.
NeuroAid II (MLC 901) para inyecciones intraperitoneales
Se diluyeron 30 mg de una cápsula de NeuroAid II (MLC 901) en 3 ml de solución salina correspondiente a una concentración de 10 mg/ml (solución de reserva) a 37°C durante 60 min. La concentración utilizada en el experimento fue de 1 pg/ml (volumen inyectado: 500 pl). Para obtener la dosis de 1 pg/ml, la solución de reserva se diluyó a 100. Después de la dilución, la mezcla se agitó en vórtex para obtener una buena homogeneización, y se filtró sobre un filtro de 0,45 pm.
Métodos
A. Cultivo de células corticales
Se anestesiaron ratones C57B16/J preñadas por tiempo (E14), con isopentano, seguido de dislocación cervical. Los fetos se retiraron y se colocaron en una solución fría (solución salina equilibrada de Hanks) HBSS+. Las cortezas cerebrales se disecaron en una solución fría de HBSS+, y se eliminaron las meninges. Las muestras corticales se cortaron en trozos pequeños y se trituraron suavemente con una pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego en una solución de 8 ml de HBSS+. La mezcla se filtró (filtro de 40 pM) y se centrifugó a 800 rpm durante 8 min. El sobrenadante se eliminó, y el pellet se disolvió en 2 ml de medio de cultivo. Las células se colocaron en placas revestidas con polilisina de 12 pocillos (24 mm de diámetro; Sigma-Aldrich Chimie, St. Quentin Fallavier, Francia)) con cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro; CML, Nemours, Francia) a una densidad de 1 x 106 células/pocillo. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en una incubadora humedecida con atmósfera de CO2 al 5% en Neurobasal suplementado con B27, Glutamax; se usaron antibióticos para los experimentos después de 16 días. El crecimiento glial se suprimió mediante la adición de 5-fluoro-2-desoxiuridina (2 pM) y uridina (2 pM) durante el segundo día de cultivo.
B. Tratamiento de NeuroAid™ (MLC 601)
Se diluyeron 30 mg de una cápsula de NeuroAid™ (MLC 601) en 3 ml de medio Neurobasal correspondiente a una concentración de 10 mg/ml (solución de reserva) a 37°C durante un período de 60 minutos. Las concentraciones evaluadas en los experimentos fueron: 1 pg/ml o 10 pg/ml de medio de cultivo. Se colocó 1 ml de solución de NeuroAid™ (MLC 601) en cada pocillo de 24 mm de la placa.
Para obtener la dosis de 1 pg/ml, la solución de reserva se diluyó 100 veces: 0,1 mg/ml (10 pl por pocilio de 24 mm/ml, correspondiente a 1 pg/pocillo).
Para obtener la dosis de 10 pg/ml, la solución de reserva se diluyó 10 veces: 1 mg/ml (10 pl por pocillo de 24 mm/ml, correspondiente a 10 pg/pocillo).
Después de la dilución, la mezcla se agitó en vórtex para obtener una buena homogeneización, y se filtró en un filtro de 0,45 pm.
Las células se trataron cada día con NeuroAid™ (MLC 601), NeuroAid II (MLC 901) o medio Neurobasal desde el Día 1 de cultivo.
C. Mediciones de lactato deshidrogenasa (LDH)
La lesión neuronal se evaluó cuantitativamente mediante la medición de la liberación de deshidrogenasa láctica (LDH) de neuronas cultivadas incubadas en medio de cultivo celular. En los Días 1, 5, 8, 10, 12, 14 y 16, se transfirieron 100 pl del medio de cultivo celular de los pocillos de cultivo a placas de 96 pocillos, y se mezclaron con 100 pl de solución de reacción según el equipo de ensayo LDH (Roche Diagnostic: equipo de detección de citotoxicidad: ref. 1644793, Indianapolis, USA). La densidad óptica (OD) se midió 30 minutos más tarde a 492 nm utilizando un lector de microplacas Labsystem Multiscan (Labsystem Multiscan RC, Finlandia). Se resta la absorbancia de fondo a 620. La actividad de LDH se expresa como actividad presente en el volumen medio de 25 pl. Los resultados se expresan como OD x 10-3
D. Viabilidad celular
En los Días 1, 5, 8, 10, 12, 14 y 16, se eliminó la totalidad del medio de cultivo celular y se reemplazó con 500 pl de medio Neurobasal Cell Titer 96 Aqueous One Solution kit: equipo de ensayo de ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 (r) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit. La viabilidad neuronal se determinó utilizando el ensayo de proliferación celular de una solución acuosa Cell Titer 96 (r) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, USA). De acuerdo con el protocolo del equipo de ensayo de proliferación, las células se incuban durante 4 horas a 37°C en una incubadora de atmósfera de CO2 al 5% humedecida. La reacción se detuvo con 2% de dodecil sulfato de sodio (SDS). La densidad óptica se midió 4 horas después a 490 nm utilizando un lector de microplacas Labsystem Multiscan. Se restó la absorbancia de fondo a 620. Los resultados se expresaron como OD x 10-3 representando el número de células viables.
El análisis estadístico de la viabilidad celular y los resultados de LDH se evalúan utilizando una prueba ANOVA (análisis de la variancia) de un factor, seguida de la prueba post-hoc (P <0,05).
E. Inmunohistoquímica de doblecortina (DCX) de células corticales en cubreobjetos.
Las células corticales se fijaron sobre cubreobjetos con paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se permeabilizaron en poloxietilensorbitano monolaurato al 0,3% (Tween 20, Sigma) durante 10 minutos y se bloquearon con suero de burro al 2,5% en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se incubaron con un anticuerpo antidoblecortina (DCX) de cabra (1:200, SC-8066, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) en suero de burro al 2%/PBS durante la noche. Después de 3 lavados en PBS, los cubreobjetos se incubaron en anticuerpos acoplados a Alexa 488 anticabra (FluoProbes, Interchim, Montlucon, Francia) en suero de burro al 2% durante 2 horas, y se lavaron tres veces en PBS durante 5 minutos cada vez. Los cubreobjetos se incubaron luego en solución de Hoechst (3 pl en 10 ml; Sigma-Aldricht Chimie, Saint Quentin Fallavier, Francia) durante 10 minutos, para etiquetar los núcleos celulares. Después de 2 lavados en PBS y 1 lavado en agua, los cubreobjetos se secaron y se montaron en portaobjetos de vidrio con Fluoroprep (75521; BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia). Las células se observaron utilizando epifluorescencia y microscopia confocal. Las observaciones de microscopia confocal se realizan utilizando un microscopio confocal de barrido láser (TCS SP, Leica Microsystems Heidelberg GmbH, con sede en Mannheim, Alemania) equipado con un microscopio invertido DMIRBE y un láser de argón-criptón (excitación de láser de 488 nm, adquisición de 500-600 nm cada 10 nm). La especificidad de la señal se evaluó en los cubreobjetos de control negativo al omitir el anticuerpo primario dirigido contra la proteína DCX. Las imágenes se adquirieron como secciones ópticas transcelulares únicas y se promediaron en al menos cuatro barridos por cuadro. Luego se obtuvieron imágenes confocales de etiquetado de anticuerpo DCX-Alexa-488 después de la corrección espectral del fondo de autofluorescencia.
F. Parámetros fisiológicos utilizados al investigar los efectos de un NeuroAid II (MLC 901) en ratones C57B1/6
Se indujo anestesia general con isoflurano al 3%, y se mantuvo con isoflurano al 1% mediante una mascarilla abierta para cada ratón. A los ratones se les permitió respirar espontáneamente. Un subgrupo de animales (n = 5 por grupo) se monitorizó para determinar los parámetros fisiológicos, incluida la tensión arterial media (MABP, conforme a sus siglas en inglés), la temperatura rectal, los gases en sangre arterial y el pH, antes, durante y después de la isquemia. La arteria femoral derecha se cateterizó con un tubo de polietileno PE-10 y se conectó a un transductor de presión sanguínea (Harvard Apparatus, Massachusetts, USA) para el monitoreo continuo de la MABP (mm Hg). Luego se obtuvo una muestra de sangre heparinizada (75 pl) de la arteria femoral cateterizada, y se midieron pÜ2, pCO2 y el pH en sangre utilizando un sistema de laboratorio a base de ácido (ABL 555, Radiometer). La temperatura central se monitoreó en forma continua con un termómetro (diámetro de la sonda de 3 mm; Harvard Apparatus, Massachusetts, USA), insertado en el recto y mantenido a temperaturas fisiológicas utilizando un manto térmico controlado por termostato (Harvard Apparatus, Massachusetts, USA). La temperatura central se mantuvo en valores fisiológicos mediante una combinación del control del manto homeotérmico.
G. Inducción de isquemia cerebral focal transitoria en ratones C57B1/6
La isquemia focal fue inducida por oclusión de la arteria cerebral media izquierda (MCA, conforme a sus siglas en inglés) mediante una técnica de filamento intraluminal (Heurteaux et al, 2006). Después de hacer una incisión en el cuello en la línea media, se aislaron las arterias carótidas externas y comunes izquierdas y se ligaron con una sutura de seda 4-0 (Ethicon). Se colocó temporariamente una pinza temporaria de aneurisma Yasargil (BMH31, Aesculap, Tuttlingen, Alemania) en la arteria carótida interna. A través de una pequeña incisión en la arteria carótida común y 13 mm distal a la bifurcación de la carótida se introdujo un filamento recubierto 6-0 (Doccol, Redlands, CA, USA) embotado en la punta con una llama abierta, para la oclusión del origen de la MCA. Los animales se mantuvieron a 37°C durante una hora, después de lo cual el hilo se retiró cuidadosamente para permitir la reperfusión del territorio de la MCA. Para controlar la gravedad de la MCAO (oclusión de la arteria cerebral media, conforme a sus siglas en inglés), se determinó el CBF (flujo sanguíneo cerebral, conforme a sus siglas en inglés) regional (rCBF) mediante flujometría Doppler con láser (Perimed) utilizando una extensión flexible de fibra óptica de 0,5 mm a la sonda maestra fijada en el cráneo intacto sobre la corteza isquémica (2 mm posterior y 6 mm lateral desde el bregma). Se realizó una operación simulada insertando el hilo en la arteria carótida común sin hacer que avanzara para ocluir la MCA. A los animales se les permitió recuperar la plena conciencia en una almohadilla térmica antes de volver a la jaula.
H. Determinación del volumen de infarto
A fin de evaluar el volumen del infarto en el estudio postratamiento con NeuroAid II agudo (MLC 901) (Ejemplo 5), los ratones se sacrificaron 24 horas después de la reperfusión. Los cerebros se extrajeron y se seccionaron en seis rebanadas coronales de 1 mm de grosor usando un cortador de tejido (Phymep, Francia). Las rebanadas cerebrales coronales se sumergieron inmediatamente en cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 2% (TTC, Sigma, Francia) durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, seguido de una fijación en una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche antes del análisis como se describió anteriormente (Ding-Zhou et al., 2002). Las áreas estriatales y corticales del infarto, delineadas en luz, se midieron en cada sección utilizando un sistema de análisis de imágenes computarizado y se corrigieron para el edema cerebral de acuerdo con Golanov y Reis (Golanov y Reis, 1995). El volumen del infarto, expresado en mm3, se calculó mediante una integración lineal de las áreas de las lesiones corregidas.
Además, se usó violeta de cresilo, un tinte que tiñe los cuerpos de Nissl en los somas estrellados de neuronas viables, para confirmar la evolución del volumen del infarto en ratones isquémicos. Secciones congeladas coronales de cerebro (10 pm de espesor) se agregaron a una solución de violeta de cresilo al 1% en ácido acético al 0,25% durante 3 minutos, se enjuagaron, se deshidrataron y se montaron con Entellan. Las secciones fueron analizadas bajo microscopía óptica.
Ejemplo 1
Dosis-efecto de NeuroAid™ (MLC 601) sobre la viabilidad celular y la liberación de LDH
Las células corticales, tal como se prepararon por los métodos descritos anteriormente, se expusieron a cuatro concentraciones de NeuroAid™ (MLC 601): 0,1, 0,5, 1,0, 10 pg/ml desde el Día 1 hasta el Día 14 de cultivo. La viabilidad celular se estudió en los Días 8, 10 y 14 mediante los métodos descritos anteriormente, y los resultados se muestran en la Fig. 1.
El efecto del tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) contra la neurodegeneración de células corticales a lo largo del tiempo en el cultivo también se analizó mediante la liberación de LDH. El aumento del sufrimiento celular que conduce a la muerte celular se asocia con una mayor liberación de LDH. La liberación de LDH se midió el día 10 y el día 14 mediante los métodos descritos anteriormente, y los resultados se muestran en la Fig. 2.
Resultados
La Figura 1 muestra que en el Día 14, un tratamiento con NeuroAid ™ (MLC 601) en una concentración de 1 pg/ml indujo un aumento significativo (35%) en la supervivencia neuronal en comparación con el control (** P <0,01). Hasta el Día 10, no hubo una diferencia significativa en el porcentaje de la viabilidad celular en células tratadas con NeuroAid™ (MLC 601) en concentraciones de 0,1-0,5-1,0 pg/ml en comparación con el control (P> 0,05) (n = 10 pocillos por grupo experimental).
La Fig. 2 muestra la relación de liberación de LDH/viabilidad celular en los Días 10 y 14 en las concentraciones de 1 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601). En comparación con el control, el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) redujo significativamente la liberación de LDH después de 10 días y 14 días de cultivo (P <0,01) (n = 10 pocilios por grupo experimental).
Sobre la base de los datos experimentales del Ejemplo 1, se puede demostrar que el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) en células corticales en cultivo demuestra un aumento de la viabilidad celular y una reducción de la liberación de LDH, que es un marcador del sufrimiento celular. El Ejemplo 1 también demuestra que NeuroAid™ (MLC 601) se puede usar para disminuir el efecto de un accidente cerebrovascular o de la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración, para tratar pacientes con tejidos lesionados o enfermos del sistema nervioso central o periférico, o para usar como reactivo de cultivo celular.
Ejemplo 2
Efecto de NeuroAid™ (MLC 601) sobre la proliferación neuronal/neurogénesis
DCX es una proteína asociada a los microtúbulos altamente hidrófila que se expresa específicamente en todos los precursores migratorios del SNC en desarrollo y en áreas de neurogénesis continua en el cerebro adulto. La proliferación neuronal se analizó a partir de la expresión de DCX en células corticales en cultivo mediante los métodos descritos anteriormente. Las células corticales, tal como se prepararon mediante los métodos descritos anteriormente, se trataron con 1 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) desde el Día 1 hasta el Día 14 de cultivo. Luego se prepararon las células y se observaron usando epifluorescencia y microscopia confocal como se describe en los métodos anteriores para determinar la expresión de DCX. Los resultados se muestran en la Fig. 3.
Resultados
En la Fig. 3, la tinción con un anticuerpo contra DCX muestra que en el Día 3, no hubo diferencia en la expresión de DCX entre el control y las células corticales tratadas con 1 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601). Sin embargo, en el Día 14, la inmunorreactividad de DCX desapareció en el control, mientras que hubo un aumento de la expresión de DCX inducida por el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601), destacando el desarrollo de una importante red axonal y dendrítica.
Debido a su asociación con procesos neurogénicos, la proteína DCX se usa actualmente como un marcador para la neurogénesis. DCX es una proteína asociada a los microtúbulos cuya expresión está asociada con todos los precursores neuronales migratorios en el cerebro fetal y adulto. DCX parece ser importante para la migración del desarrollo normal de las neuronas corticales, ya que las mutaciones en DCX en humanos conducen a síndromes caracterizados por la detención migratoria de estas neuronas, que se manifiesta clínicamente por heterotopias laminares subcorticales, retraso mental y convulsiones. DCX también se expresa en algunas neuronas maduras en el cerebro adulto, donde se implica en la excrecencia axonal y la sinaptogénesis.
Por lo tanto, sobre la base de los datos experimentales del Ejemplo 2, se puede demostrar que el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) produce un aumento en la expresión de DCX en células corticales, lo que sugiere fuertemente que el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) mejora la neuroproliferación, la neurogénesis y la neurorreparación necesaria para restaurar la función neurológica (tal como la motora y la cognitiva). El Ejemplo 2 también demuestra que NeuroAid™ (MLC 601) puede usarse para promover la excrecencia neuronal y la proliferación de neuronas en los tejidos del sistema nervioso central o periférico, para promover el crecimiento celular y para un método para inducir la supervivencia celular, el crecimiento, la proliferación o la diferenciación de las células utilizando NeuroAid™ (MLC 601).
Ejemplo 3
Efecto de los tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) sobre la viabilidad celular, la liberación de LDH y la proliferación neuronal
Las células corticales se expusieron a una concentración de 1 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901) desde el Día 1 hasta el Día 14 de cultivo. Esta concentración de 1 pg/ml corresponde a los mejores resultados obtenidos sobre la viabilidad celular y la liberación de LDH como se describió anteriormente. La viabilidad celular se estudió los Días 8, 10, 12 y 14. La proliferación neuronal en el transcurso del tiempo se analizó mediante la observación de la expresión de DCX en células corticales en cultivos tratados con 1 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901).
Resultados
La Figura 4 muestra que en el Día 8, se observó un aumento significativo en la viabilidad neuronal en comparación con el control respectivo (** P <0,01; *** P <0,001) en células corticales tratadas con 1 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901). Sin embargo, la eficacia más alta de ambos tratamientos se observó en el Día 14 con un aumento de ~ 45% de la supervivencia celular (*** P <0,001). No hubo diferencias significativas de eficacia entre NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) en las diferentes etapas del cultivo (n = 10 pocillos por grupo experimental).
La Figura 5 muestra la comparación de los tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) sobre la relación de liberación de LDH/viabilidad celular en los Días 8, 10, 12 y 14 en las concentraciones de 1 pg/ml. En comparación con el control, ambos tratamientos redujeron significativamente la liberación de LDH después de 12 y 14 días de cultivo (* P <0,05 y *** p <0,001) (n = 10 pocillos por grupo experimental). No hubo diferencias significativas de eficacia sobre la liberación de LDH entre los tratamientos con NeuroAid™ (MlC 601) y NeuroAid II (MLC 901).
La Figura 6 muestra que, en comparación con el control, las células corticales tratadas con 1 pg/ml de NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901) desarrollaron una red axonal y dendrítica mucho más densa desde el Día 3 en cultivo. En el Día 14, la inmunorreactividad de DCX desapareció en el Control, y el etiquetado de la proteína DCX se diferenció entre las células corticales tratadas con NeuroAid™ (MLC 601) y las células corticales tratadas con NeuroAid II (MLC 901). La proteína DCX siempre se expresó en procesos de células corticales tratadas con NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901). Sin embargo, parece que en las células corticales tratadas con NeuroAid II (MLC 901) también hubo un fuerte aumento de la inmunorreactividad de DCX en el citoplasma de estas células.
Los resultados obtenidos con ambos tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) (NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901)) muestran un aumento en la supervivencia celular, un aumento en la liberación de LDH y un aumento en la expresión de DCX en células corticales. No hubo diferencias significativas entre los resultados de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901). Por lo tanto, según los datos experimentales, se puede demostrar que ambos tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601) (NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901)) mejoran la neuroproliferación, la neurogénesis y la neurorreparación, y pueden ser una forma de tratamiento mejorado para enfermedades neurológicas y lesiones del sistema nervioso.
Los resultados experimentales anteriores también apoyan el uso de extractos de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) para mejorar la conectividad y la supervivencia de todos los tipos de cultivos neuronales. Estos extractos podrían agregarse sistemáticamente a los medios de cultivo clásicos para que los cultivos neuronales mejoren considerablemente la viabilidad, el crecimiento dendrítico y la sinaptogénesis. El ejemplo 3 también demuestra que (NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) pueden usarse para promover la excrecencia neuronal y la proliferación de neuronas en tejidos del sistema nervioso central o periférico, para promover el crecimiento celular, para tratar pacientes que tienen una afección seleccionada del grupo de depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte traumática de células cerebrales, disminuir el efecto del accidente cerebrovascular o de la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración, promover el crecimiento de células, para el tratamiento de pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico, para el uso como reactivo de cultivo celular y para un método para inducir la supervivencia celular, el crecimiento, la proliferación o la diferenciación de células.
Ejemplo 4
El efecto del pretratamiento de NeuroAid II (MLC 901) en ratones 24 h posisquemia
En este estudio, los ratones (n = 11) se trataron previamente durante seis semanas con una solución de bebida de NeuroAid II (MLC 901), y la tasa de supervivencia se analizó a las 24 h después de la isquemia (Fig. 7A). Los ratones de control (n = 10) recibieron una solución para beber agua corriente.
A fin de determinar si un pretratamiento con NeuroAid II (MLC 901) aumenta la tasa de supervivencia de los ratones sometidos a isquemia, los animales se trataron con NeuroAid II (MLC 901) durante las seis semanas previas a la inducción de la isquemia. La Fig. 8 muestra que un pretratamiento de seis semanas de NeuroAid II (MLC 901), suministrado en la bebida, indujo una fuerte reducción de la mortalidad de los animales tratados con NeuroAid II (MLC 901), en comparación con los ratones de control. El pretratamiento con NeuroAid II (MLC 901) durante seis semanas indujo una tasa de supervivencia del 90,9% en comparación con el 40,0% en el grupo de control.
El Ejemplo 4 demuestra que NeuroAid es beneficioso antes de un accidente cerebrovascular isquémico. Estos estudios ilustran que NeuroAid redujo ventajosamente el tamaño del infarto y la tasa de mortalidad de los ratones isquémicos en un modelo clínicamente pertinente de accidente cerebrovascular.
Ejemplo 5
El efecto del postratamiento de NeuroAid II agudo (MLC 901) en ratones 24 h posisquemia
En este estudio, los ratones (n = 10) recibieron una inyección intraperitoneal de postratamiento agudo de NeuroAid II (MLC 901), suministrado al inicio de la isquemia y 6 h después de la reperfusión. Los ratones de control (n = 10) se inyectaron con solución salina. La tasa de supervivencia y los volúmenes de infarto se cuantificaron a las 24 h de la reperfusión.
A fin de determinar si la administración aguda de NeuroAid II (MLC 901) protege contra el accidente cerebrovascular isquémico, los ratones (n = 10) se sometieron a isquemia y se inyectaron por vía intraperitoneal con una dosis única de 1 mg/ml de solución de NeuroAid II (MLC 901) al inicio de la isquemia y 6 h después de la reperfusión. La administración aguda de NeuroAid II (MLC 901) indujo una tasa de supervivencia del 90,0% en comparación con el 38,8% observado en los ratones de control (Fig. 9A). Este postratamiento de NeuroAid II (MLC 901) disminuyó drásticamente el infarto cerebral como se muestra en la Fig. 9B. El postratamiento de NeuroAid redujo el volumen del accidente cerebrovascular en 47,4% (P <0,001) en comparación con los ratones de control.
Estos estudios demuestran que NeuroAid es beneficioso tanto antes como después de un accidente cerebrovascular isquémico. Estos estudios ilustran que NeuroAid redujo ventajosamente el tamaño del infarto y la tasa de mortalidad de los ratones isquémicos en un modelo clínicamente pertinente de accidente cerebrovascular.
Métodos para los Ejemplos 6 a 8
A. Cultivo de células corticales
Los ratones C57B16/J preñadas por tiempo (E14) se anestesiaron con isopentano seguido de dislocación cervical. Los fetos se retiraron y se colocaron en una solución fría (solución salina equilibrada de Hanks) HBSS+. Las cortezas cerebrales se disecaron en una solución fría de HBSS+, y se eliminaron las meninges. Las muestras corticales se cortaron en trozos pequeños y se trituraron suavemente con una pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego en una solución de 8 ml de HBSS+. La mezcla se filtró (filtro de 40 pM) y se centrifugó a 800 rpm durante 8 min. El sobrenadante se eliminó, y el pellet se disolvió en 2 ml de medio de cultivo. Las células se colocaron en placas revestidas con polilisina de 12 pocillos (24 mm de diámetro; Sigma-Aldrich Chimie, St. Quentin Fallavier, Francia)) con cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro; CML, Nemours, Francia) a una densidad de 1 x 106 células/pocillo. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en una incubadora humedecida con atmósfera de CO2 al 5% en Neurobasal suplementado con B27, Glutamax; se usaron antibióticos para los experimentos después de 16 días. El crecimiento glial se suprimió mediante la adición de 5-fluoro-2-desoxiuridina (2 pM) y uridina (2 pM) durante el segundo día de cultivo.
Los experimentos fueron monitoreados por un investigador cegado al estado del tratamiento (n = 3 cultivos, 36 pocillos por grupo experimental).
B. Ensayo de lesión celular: supervivencia celular y mediciones de lactato deshidrogenasa (LDH)
La viabilidad celular se evaluó en el Día 12 del cultivo celular mediante el uso del ensayo de proliferación celular de una solución Cell Titer 96 (r) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Charbonniéres-les-Bains, Francia) (n = 3 cultivos, 36 pocillos por grupo experimental). El ensayo fue un método colorimétrico, que se sustentó en el uso de la sal interna de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), un marcador de la actividad mitocondrial y un reactivo de acoplamiento de electrones (fenazina etosulfato, PES). El compuesto de tetrazolio MTS fue biorreducido por las células en un producto de formazán coloreado que es soluble en medio de cultivo de tejido.
En el Día 12, se eliminó la totalidad del medio de cultivo celular, y se reemplazó por 500 pl de medio de Neurobasal equipo de una solución Cell Titer 96 Aqueous One Solution kit: equipo de ensayo de proliferación celular de una solución Cell titer 96 (r) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit. De acuerdo con el protocolo del equipo de ensayo de proliferación, las células se incubaron durante 4 horas a 37°C en la incubadora de atmósfera de CO2 al 5% humedecida. La reacción se detuvo con 2% de dodecil sulfato de sodio (SDS). La densidad óptica se midió 4 horas después a 490 nm utilizando un lector de microplacas Labsystem Multiscan (Labsystem Multiscan RC, VWR International, Fontenay sous Bois, Francia). Se restó la absorbancia de fondo a 620. Los resultados se expresaron en densidad óptica (OD x 10-3), que representa el número de células viables. Los datos se expresaron como el porcentaje de viabilidad celular, que se calculó dividiendo el valor de absorbancia de las muestras tratadas, por el del control no tratado dentro de cada grupo.
La lesión neuronal fue evaluada cuantitativamente por la medición de la liberación de deshidrogenasa láctica (LDH) de neuronas cultivadas incubadas en medios de cultivo celular en el Día 12 del cultivo celular (Koh y Choi, 1987). El ensayo de liberación de LDH proporcionó una medida de la integridad de la membrana citoplásmica. En el Día 12, se transfirieron 100 pl del medio de cultivo celular de los pocillos de cultivo a placas de 96 pocillos, y se mezclaron con 100 pl de solución de reacción según el equipo de ensayo de LDH (Roche Diagnostic: equipo de detección de citotoxicidad: ref. 1644793, Indianapolis, USA). La densidad óptica (OD) se midió 30 minutos más tarde a 492 nm utilizando un lector de microplacas Labsystem Multiscan (Labsystem Multiscan RC, VWR International, Fontenay sous Bois, Francia). Se sustrajo la absorbancia de fondo a 620. Las neuronas expuestas a una solución de lisis (PBS que contenía Triton X-100 al 0,1%) se utilizaron como control positivo y se establecieron como 100% de liberación de LDH. Los datos se expresaron como la proporción de eflujo de LDH/viabilidad celular.
Los resultados correspondieron a la media de tres experimentos independientes con determinación por triplicado. Los análisis estadísticos de la viabilidad celular y los resultados de LDH se evaluaron mediante la prueba ANOVA de un factor (análisis de la variancia) y la prueba post-hoc (P <0,05).
C. Isquemia focal
Los investigadores, que realizaron la cirugía isquémica y midieron los volúmenes de infarto, fueron doblemente cegados con respecto al código de tratamiento.
Modelo de isquemia focal
Se indujo la isquemia focal en ratones adultos machos C57/B16, que pesaban entre 22 y 26 g (7-9 semanas de edad) por oclusión de la arteria cerebral media izquierda (MCA) mediante una técnica de filamento intraluminal (Huang et al, 1994). Se aislaron las arterias carótidas externas y comunes izquierdas y se ligaron con una sutura de seda 4-0 (Ethicon). Se colocó temporariamente una pinza temporaria de aneurisma Yasargil (BMH31, Aesculap, Tuttlingen, Alemania) en la arteria carótida interna. A través de una pequeña incisión en la arteria carótida común y 13 mm distal a la bifurcación de la carótida se introdujo un filamento recubierto 6-0 (Doccol, Redlands, CA, USA), para la oclusión del origen de la MCA. Los animales se mantuvieron a 37°C durante una hora, después de lo cual el hilo se retiró cuidadosamente para permitir la reperfusión del territorio de la MCA. Para controlar la gravedad de la MCAO, se determinó el CBF regional (rCBF) mediante flujometría Doppler con láser (Perimed) utilizando una extensión flexible de fibra óptica de 0,5 mm a la sonda maestra fijada en el cráneo intacto sobre la corteza isquémica (2 mm posterior y 6 mm lateral desde el bregma). Se realizó una operación simulada insertando el hilo en la arteria carótida común sin hacer que avanzara para ocluir la MCA. A los animales se les permitió recuperar la plena conciencia en una almohadilla térmica antes de volver a la jaula.
Determinación del volumen de infarto
A las 30 horas después de la reperfusión, se realizó una tinción con violeta de cresilo en secciones coronarias cerebrales congeladas (10 |im de grosor) utilizando una solución de violeta de cresilo al 1% en ácido acético al 0,25, y montada con Entellan. Las áreas estriatales y corticales del infarto, delineadas en luz, se midieron en cada sección utilizando un sistema de análisis de imágenes computarizado y se corrigieron para el edema cerebral de acuerdo con Golanov y Reis (Golanov y Reis, 1995). El volumen del infarto, expresado en mm3, se calculó mediante una integración lineal de las áreas de las lesiones corregidas como se describió anteriormente (Heurteaux et al., 2006a).
D. Tratamientos de fármacos
La composición de NeuroAid II (MLC 901) utilizada (0,4 g por cápsula) fue la siguiente:
0,57 g Radix astragali,
0,114 g Radix salvia miltiorrhizae,
0,114 g Radix paeoniae rubra,
0,114 g Rhizoma chuanxiong,
0,114 g Radix angelicae sinensis,
0,114 g Carthamus tinctorius,
0,114 g Prunus persica,
0,114 g Radix polygalae,
0,114 g Rhizoma acori tatarinowii,
0,0665 Hirudo.
Para los experimentos in vitro, el tratamiento celular con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados se realizó en una concentración de 1 |ig/ml, comenzando en el Día 3 de cultivo durante 12 días (correspondiente a 15 días de cultivo).
Para el postratamiento in vivo, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal una dosis única de 2 |ig/ml de solución de NeuroAid II (MLC 901) diluida en solución salina (como vehículo) en un volumen total de 500 pl/ratón que pesaba 25 g, 3 y 24 horas siguientes al final de la isquemia. Para el pretratamiento in vivo, NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados se administraron como pretratamiento en agua de beber en una concentración de 6 mg/ml durante las 6 semanas anteriores a la inducción de la isquemia.
E. Inmunohistoquímica en neuronas corticales en cultivo
Las células corticales se fijaron en cubreobjetos con 4% paraformaldehído/PBS, permeabilizadas en 0,3% de monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween 20, Sigma) durante 10 minutos y bloqueadas con suero de burro al 2,5% en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Las células se incubaron con un anticuerpo antidoblecortina de cabra (DCX) (1:200, SC-8066, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) en suero de burro al 2%/solución salina tamponada con fosfato durante la noche (Heurteaux et al., 2006b). Después de 3 lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se incubaron en anticuerpos acoplados a Alexa 488 anticabra (FluoProbes, Interchim, Montlucon, Francia) en suero de burro al 2% durante 2 horas, y se lavaron tres veces en PBS durante 5 minutos cada vez. Las neuronas se incubaron luego en solución de Hoechst (3 pl en 10 ml, Sigma-Aldricht Chimie, Saint Quentin Fallavier, Francia) durante 10 minutos para etiquetar los núcleos celulares. Después de 2 lavados en PBS y 1 lavado en agua, los cubreobjetos se secaron y se montaron en portaobjetos de vidrio con Fluoroprep (75521; Biomerieux, Marcy l'Etoile, Francia. Las células se observaron utilizando microscopia de epifluorescencia.
La especificidad de la señal se evaluó en los cubreobjetos de control negativo al omitir el anticuerpo primario. Las imágenes de microscopia de epifluorescencia del etiquetado de proteína se capturaron con el mismo tiempo de exposición después de la corrección espectral del fondo de autofluorescencia. Las neuritas diferenciadas de las neuronas corticales en cultivo se observaron mediante inmunotinción con DCX en el Día 12 del tratamiento. La excrecencia de neuritas se determinó mediante microscopia de epifluorescencia midiendo la longitud total de las neuritas en discos de cultivo en diferentes momentos de tratamiento utilizando una imagen de foto celular y el soporte lógico Neurite Tracer Image J (Pool et al., 2008).
F. Análisis estadísticos
Los datos se expresaron como media ± S. E. M. El análisis estadístico de las diferencias entre los grupos se realizó utilizando una prueba de la t no pareada o ANOVA. Cuando las relaciones de F fueron significativas, se ampliaron los análisis estadísticos, y se realizaron comparaciones post hoc mediante el uso de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. En todos los análisis, el nivel de significación se estableció en P <0,05.
Ejemplo 6
Efectos comparativos entre NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelica sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, sobre la viabilidad celular y la liberación de LDH
Las células corticales, tal como se prepararon mediante los métodos descritos anteriormente, se expusieron a una concentración de 1 pg/ml de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, durante 12 días.
Los efectos de NeuroAid II (MLC 901) a los tratamientos de Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, contra la neurodegeneración de células corticales se compararon en el Día 15 del cultivo (Día 12 del tratamiento) utilizando la viabilidad celular y las mediciones de LDH como se describe en los métodos anteriores. Los resultados se muestran en la Fig. 10.
Resultados
La Fig. 10A muestra que en la concentración de 1 pg/ml, los tres tratamientos indujeron un aumento significativo en la viabilidad neuronal en comparación con el control (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Sin embargo, NeuroAid II (MLC 901) demostró una mayor eficacia en la supervivencia celular, en comparación con los tratamientos de Rhizoma chuanxiong o Radix angelicae sinensis. Como se muestra en la Fig. 10A, un tratamiento con NeuroAid II (MLC 901) indujo un aumento de aproximadamente el 51% de la viabilidad celular, en comparación con el control (*** P <0,001), mientras que el aumento en la supervivencia celular inducido por Rhizoma chuanxiong, Radix, angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados fue del 37%, 29,5% y 35% respectivamente. Hubo una diferencia significativa de eficacia entre NeuroAid II (MLC 901) y Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados (## P <0,1) (n = 36 pocillos por grupo).
Es bien sabido que el aumento del sufrimiento celular que conduce a la muerte celular se asocia con un aumento de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). La Fig. 10B muestra que, en comparación con el control, los tres tratamientos redujeron significativamente la relación de liberación de LDH/viabilidad celular después de 12 días de tratamiento (* P <0,05 y ** P <0,01). La Fig. 10B también muestra que NeuroAid II (MLC 901) redujo significativamente la liberación de LDH en comparación con el tratamiento de Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados (## P <0,01) (n = 36 pocillos por grupo).
Sobre la base de los datos experimentales del Ejemplo 6, se puede demostrar que NeuroAid II (MLC 901) es más potente para aumentar la viabilidad celular y reducir la liberación de LDH, en cultivo, que Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados.
Ejemplo 7
Efectos comparativos in vivo de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelica sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados contra la lesión cerebral isquémica in vivo
Postratamiento: para comparar los efectos de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados in vivo, cada tratamiento se evaluó en un modelo de ratón de isquemia focal.
La isquemia se indujo por oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO) durante 60 minutos (Huang et al., 1994). Los ratones (n = 12) se sometieron a isquemia focal y se inyectaron por vía intraperitoneal a las 3 horas, y luego, nuevamente, a las 24 horas después de la MCAO, con una dosis única de 1 pg de solución de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelica sinensis combinados.
La administración aguda de cada tratamiento indujo una tasa de supervivencia significativa, con una mejor eficiencia obtenida con NeuroAid II (MLC 901). La Fig. 11A muestra que se logró una tasa de supervivencia del 89% con NeuroAid II (MLC 901) en comparación con una tasa de supervivencia del 58,5%, 64%, 73% y 75% en ratones isquémicos tratados con vehículo, Rhizoma Chuanxiong, Radix angelicae, y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, respectivamente.
La drástica disminución del infarto cerebral, como se muestra en la Fig. 11B, confirma que el mejor resultado se observó con NeuroAid II (MLC 901). La Fig. 11B muestra que NeuroAid II (MLC 901) redujo el volumen del accidente cerebrovascular en 48,4% (*** P <0,001) en comparación con los ratones isquémicos de control a las 30 h posisquemia. El tamaño del infarto en ratones tratados con Rhizoma chuanxiong, Radix Angelicae y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados fue significativamente mayor que en los animales tratados con NeuroAid II (MLC 901) después de 30 horas de la reperfusión (Fig. 11B, #P <0,05, ## P <0,001 frente al grupo de NeuroAid II (MLC 901).
Pretratamiento: para comparar los efectos in vivo potenciales entre MLC 901, Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis en la prevención contra el accidente cerebrovascular, cada tratamiento se evaluó en el pretratamiento.
Los animales (n = 12) se trataron con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong o Radix angelicae sinensis administrados en el agua de beber (6 mg/ml) durante 6 semanas antes de la inducción de la isquemia. No hubo diferencias significativas en el consumo de alimentos y soluciones de bebida entre los grupos tratados con vehículo y NeuroAid II (MLC 901). La Fig. 12A muestra que un pretratamiento de 6 semanas de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis indujo una reducción de la mortalidad de los animales tratados, en comparación con los ratones isquémicos de control.
El pretratamiento indujo una tasa de supervivencia del 92%, 78% y 70% en NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis, respectivamente, cuando se comparó con el 70,5% en el grupo control. El mejor resultado para disminuir los efectos del accidente cerebrovascular o la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración obtenido con NeuroAid II (MLC 901) se confirmó por una disminución significativa del volumen del infarto, que 39% y 24,5% menos importante en comparación con Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis (Fig. 3B, P<0,01).
Estos estudios en el Ejemplo 7 demuestran que NeuroAid II (MLC 901) es más potente que o bien Rhizoma chuanxiong o Radix angelicae sinensis en el pretratamiento de la isquemia focal, y NeuroAid II (MLC 901) es más potente que Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rizoma chuanxiong/Radix angelica sinensis combinados, en el postratamiento de la isquemia focal.
Ejemplo 8
Efectos comparativos de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma Chuanxiong, Radix angelica sinensis y Rhizoma Chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, en la neuroproliferación y la excrecencia de neuritas
A fin de analizar los efectos de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, sobre la proliferación neuronal y la excrecencia de neuritas, se comparó la expresión de DCX en células corticales cultivadas de ratones embrionarios, después de 14 días de tratamiento.
Las imágenes representativas de microscopia de epifluorescencia de la tinción de DCX se muestran en la Fig. 13. La Fig. 13 muestra que hubo un aumento de la expresión de DCX inducido por el tratamiento de NeuroAid II (MLC 901), Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, destacando el desarrollo de una importante red axonal y dendrítica con estos tres tratamientos en comparación con las células tratadas con el grupo de vehículo o Rhizoma chuanxiong solo.
La cuantificación de la intensidad de fluorescencia en cada imagen de microscopia de epifluorescencia se mostró en la Fig. 14. La Fig. 14 mostró que se obtuvo el mejor efecto neuroproliferativo en cultivos corticales tratados con NeuroAid II (MLC 901).
A fin de investigar si el tratamiento con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados podría promover la excrecencia de neuritas, la longitud total de las neuritas en las neuronas corticales cultivadas se midió en el Día 14 de tratamiento.
La Fig. 15 muestra que NeuroAid II (MLC 901), Radix angélica sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados indujeron una excrecencia significativa de neuritas, en comparación con el grupo de vehículo (* P <0,05, *** P <0,001). La mejor actividad de promoción de la excrecencia de neuritas se observó para NeuroAid II (MLC 901) en comparación con aquella de Radix angelica sinensis solo o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados (#P <0,05).
Estos estudios en el Ejemplo 8 demuestran que NeuroAid II (MLC 901) es más potente que Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, para producir la neuroproliferación y la excrecencia de neuritas.
Aplicaciones
Ventajosamente, las composiciones y los métodos descritos proporcionan una nueva estrategia terapéutica, que se centra en la reparación neuronal y la restauración de las funciones neurológicas.
Los métodos descritos proporcionan terapias regenerativas para tratar lesiones del sistema nervioso y enfermedades neurológicas, al promover el crecimiento neural a fin de permitir que los nervios dañados o enfermos vuelvan a funcionar.
Los métodos descritos también pueden usarse para promover el crecimiento celular in vitro. Ventajosamente, el cultivo in vitro de diversas células puede usarse para la ingeniería tisular o para usos terapéuticos ex vivo.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende al menos tres de los siguientes componentes:
rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong),
radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui),
Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi),
Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen),
Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua),
Prunus Persica (semilla de durazno o Taoren),
Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu),
para el uso en un método de disminución de los efectos del accidente cerebrovascular o de la neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de accidente cerebrovascular o neurodegeneración.
2. Una composición para el uso según la reivindicación 1, que además comprende uno o más de:
Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie),
Eupolyphaga Seu Setelephaga (cuerpo seco de escarabajo de tierra, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong),
Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial, o Rengong Niuhuang),
Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y
cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi).
3. Una composición para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la composición comprende 3 a 14 de los componentes.
4. Una composición para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la composición comprende 4 de los componentes.
5. Una composición para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la composición comprende 9 de los componentes.
6. Una composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende un agente usado en medicina occidental.
7. Una composición para el uso según la reivindicación 6, donde la composición y la medicina occidental son adecuadas para la administración a un ser humano como un medicamento en combinación, en forma secuencial o separada.
8. Una composición para el uso según la reivindicación 1, donde la composición comprende los siguientes componentes:
rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong),
radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui),
Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi),
Radix et Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen),
Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua),
Prunus Persica (semilla de durazno o Taoren),
Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu).
9. Una composición para el uso según la reivindicación 1, donde la composición comprende los siguientes componentes:
rizoma de Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong),
radix angelicae sinensis (raíz de Angelica china o Dang Gui),
Radix Astragali (raíz de Membranous Milkvetch o Huang Qi),
Radix et Salviae Miltiorrhizae (raíz de Red Sage o Dan Shen),
Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonia roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), flor de Carthamus Tinctorius (cártamo o HongHua),
Prunus Persica (semilla de durazno o Taoren),
Radix Polygalae (raíz de poligalácea de hoja delgada, Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi), Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de acorácea de tipo arbusto forrajero o Shichangpu),
Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie),
Eupolyphaga Seu Setelephaga (cuerpo seco de escarabajo de tierra, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong),
Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial, o Rengong Niuhuang),
Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y
cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi).
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