ES2637807T3 - Extracto de rhizoma coptidis y uso novedoso del mismo en el tratamiento de enfermedad respiratoria - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un extracto de Rhizoma Coptidis como principio activo para su uso en la supresión de tos o eliminación de esputo, en la que el extracto de Rhizoma Coptidis es un extracto crudo que se obtiene usando uno o más disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos o una solución acuosa de alcohol C1-4 como disolvente de extracción, o un extracto soluble en disolvente que se obtiene añadiendo una solución acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos al extracto crudo.

Description

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DESCRIPCION

Extracto de rhizoma coptidis y uso novedoso del mismo en el tratamiento de enfermedad respiratoria Campo de la Invencion

Se proporciona un extracto de Rhizoma Coptidis o un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra que es util en actividades expectorantes, antitusivas y/o antihistammicas. En particular, una composicion antitusiva y/o expectorante y/o una composicion para prevenir y tratar enfermedades respiratorias que comprende el extracto de Rhizoma Coptidis o el extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra como principio activo y un metodo de preparacion de la misma.

Antecedentes de la Invencion

Se sabe que la tos y el esputo son ocasionados por factores ffsicos o qmmicos, tales como aire fno, sustancias extranas incluyendo microorganismos patologicos, contaminantes del aire, alergenos y similares, y se pueden dividir de acuerdo con las siguientes causas:

Primera, si los receptores de la tos, en la laringe, traquea, bronquios, faringe, senos paranasales, diafragma y similares, se estimulan por factores fisicoqmmicos, la estimulacion se lleva al centro de la tos en la medula del cerebro, por lo que ocurre el reflejo de la tos.

Segunda, si se activa el sistema nervioso parasimpatetico por factores ffsicos o qmmicos, un musculo liso del bronquio se contrae, por lo que se pueden dar smtomas tales como convulsion bronquial y broncoconstriccion.

Tercera, los mediadores inflamatorios y similares se liberan de los mastocitos por factores ffsicos o qmmicos.

Por lo tanto, la eliminacion de los factores anteriores puede suprimir la tos y el esputo. Sin embargo, la mayona de los farmacos desarrollados hasta ahora principalmente son compuestos qmmicos sinteticos y asf, ocasionan diversos efectos secundarios. Los farmacos naturales desarrollados para compensar tales defectos no pueden presentar excelente efecto para suprimir la tos y el esputo.

Mientras, el asma, que es una enfermedad respiratoria representativa, muestra repetida y espasmodicamente smtomas tales como dificultad para respirar, tos, respiracion estridulosa y similares. El asma puede dividirse en asma cardfaco y asma bronquial. Aunque la tasa de incidencia del asma vana de acuerdo con un pafs, raza humana, edad y similares, en Inglaterra se informo en 2007 que aproximadamente 7,9 % de los adultos, 13,7 % de los ninos y 9,4 % de los adultos mayores sufren de asma. En Corea, se ha incrementado la incidencia debido al cambio en el estilo de vida, la contaminacion ambiental, el incremento en estres y similares. Recientemente, se ha maximizado la gravedad del asma, puesto que la contaminacion ambiental se vuelve seria, la edad de incidencia de asma disminuye y los smtomas duran mas.

La obstruccion respiratoria, que es caractenstica del asma, se da mediante 3 etapas. Espedficamente, se contrae un musculo liso de los bronquios, la mucosa pulmonar se espesa y la mucosa pegajosa se juntan en los bronquios y bronquiolos, obstruyendose de ese modo el tracto respiratorio. Entre estas etapas, unicamente se puede recuperar facilmente la contraccion del musculo liso de los bronquios.

En el mecanismo de ocurrencia del asma exogeno (alergenico), IgE es especialmente importante, e IgG en parte se refiere al mismo. IgE libera mediadores, tales como, histamina, SRS-A, ECF-A, NCF, pAf, Cinina, PG y similares, los cuales activan los mastocitos para ocasionar reaccion de hipersensibilidad. El asma endogeno (no alergenico), aunque su mecanismo no se ha aclarado, parece ser mediado por el nervio autonomo. La estimulacion de colina en pacientes endogenos ocasiona el aislamiento de un mediador tal como histamina de un mastocito directamente a traves de los organos diana, incremento en la secrecion de celulas calciformes, expansion de vasos sangumeos pulmonares y contraccion de traquea, bronquios y bronquiolos, incrementando de ese modo la convulsion bronquial y la secrecion de moco.

Aun no se ha desarrollado el tratamiento fundamental del asma, y se desarrollan diversos metodos y farmacos para prevenir un espasmo y complicaciones; sin embargo, simplemente mejoran los smtomas y no pueden tratar fundamentalmente la enfermedad y pueden ocasionar serios efectos secundarios.

Con el fin de superar tales ffmites de los farmacos existentes, hay una demanda de desarrollo de farmacos novedosos capaces de tratar fundamentalmente la causa y mejorar eficazmente los smtomas de la enfermedad. Sin embargo, estan implicados diversos leucocitos y citoquinas y mediadores inflamatorios separados de los mismos en la enfermedad respiratoria y, por tanto, es diffcil el tratamiento efectivo con un compuesto de un solo componente. Por lo tanto, el extracto natural que tiene diversos ingredientes y mecanismos puede ser un farmaco efectivo y, por tanto, existe una demanda de desarrollo de un farmaco basado en el extracto natural.

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Descripcion detallada de la Invencion

Problema tecnico

Como resultado de estudios para desarrollar antitusivos o expectorantes, los inventores de la presente identificaron que el extracto de Rhizoma Coptidis o extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra tiene excelentes actividades antitusivas, expectorantes y antihistammicas para completar la presente invencion.

Una realizacion proporciona un uso novedoso del extracto de Rhizoma Coptidis o extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra para eliminacion de esputo, supresion de tos y/o tratamiento y/o prevencion de enfermedades respiratorias.

Otra realizacion proporciona composicion antitusiva o expectorante y/o una composicion para prevenir y/o tratar enfermedades respiratorias, que comprende el extracto de Rhizoma Coptidis o extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra como principio activo.

Solucion tecnica

Una realizacion se refiere a un uso novedoso del extracto de Rhizoma Coptidis o extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra para eliminar esputo, suprimir tos y/o tratar y/o prevenir enfermedades respiratorias.

Otra realizacion se refiere a una composicion antitusiva o expectorante y/o una composicion para prevenir y/o tratar enfermedades respiratorias, que comprende el extracto de Rhizoma Coptidis o extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra como principio activo.

El Rhizoma Coptidis es una hierba perene que pertenece a la familia Ranunculaceae, y principalmente se usa su parte del rizoma. Se sabe que contiene berberina alcaloide, palmatina, coptisina, berberastina, magnoflorina y similares, como componentes farmacologicos principales.

Sin embargo, aun no se ha estudiado el efecto del extracto de Rhizoma Coptidis y una composicion que contiene Rhizoma Coptidis sobre las actividades antitusivas, expectorantes y antihistammicas.

Los inventores de la presente encontraron que el extracto de Rhizoma Coptidis tiene actividades antitusivas, expectorantes y antihistammicas, y es efectivo en el tratamiento y/o prevencion de enfermedad respiratoria, para completar la presente invencion.

La hiedra pertenece a la familia Araliaceae y significa que es una planta que pertenece al genero Hedera (Hedera spp.). Por ejemplo, puede incluir Hedera algeriensis, Hedera azorica, Hedera canariensis, Hedera colchica, Hedera helix, Hedera hibernica, Hedera maderensis, Hedera nepalensis, Hedera pastuchowii, Hedera rhombea y similares. Se han revelado los efectos antitusivos y expectorantes del extracto de hoja de hiedra seca; sin embargo, aun no se ha informado que cuando se administra el extracto de hoja de hiedra combinado con otros extractos herbales, se puede obtener un efecto sinergico importante sin efectos secundarios.

Los inventores de la presente identificaron que la combinacion de extracto de Rhizoma Coptidis y extracto de hoja de hiedra incrementa notoriamente el efecto antitusivo, efecto expectorante, efecto antihistammico, efecto para suprimir broncoconstriccion, efecto para suprimir hipersensibilidad de vfas respiratorias, efecto para suprimir oclusion bronquial en tejido de pulmon y efecto para suprimir infiltracion de celulas inflamatorias, comparado con cada extracto solo. Ademas, se sugiere la relacion de mezcla optima de extracto de Rhizoma Coptidis y extracto de hoja de hiedra que muestra efecto sinergico maximo para las actividades farmacologicas.

Con el fin de maximizar los efectos sinergicos para actividades antitusivas, expectorantes, antihistammicas, supresion de broncoconstriccion, supresion de hipersensibilidad de vfas respiratorias, supresion de oclusion bronquial en tejido de pulmon y supresion de infiltracion de celulas inflamatorias al mezclar extracto de Rhizoma Coptidis con extracto de hoja de hiedra, la relacion de mezcla de extracto de hoja de hiedra y extracto de Rhizoma Coptidis es de 0,1:1 a 10:1, basado en el peso del contenido solido (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de extracto de Rhizoma Coptidis), preferiblemente de 0,2:1 a 5:1, mas preferiblemente de 1:1 a 4:1, mucho mas preferiblemente de 1,5:1 a 3,5:1, lo mas preferiblemente 2,5:1 a 3,5:1. El termino “contenido solido” significa aquellos de los cuales se separa un disolvente usado para preparar el extracto.

El termino “extracto” en la presente memoria significa un extracto crudo de Rhizoma Coptidis y/o hoja de hiedra y/o un extracto o fraccion soluble en disolvente espedfico del extracto crudo y puede estar en forma de una solucion, concentracion o polvo. El termino “extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra” significa tanto una mezcla de extracto de hoja de hiedra y extracto de Rhizoma de Coptidis obtenido respectivamente por extraccion de hoja de hiedra y Rhizoma Coptidis como un extracto obtenido por extraccion de una mezcla de hoja de hiedra y Rhizoma Coptidis.

El extracto de Rhizoma Coptidis es un extracto crudo obtenido por extraccion de Rhizoma Coptidis con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 carbonos, o un extracto soluble en disolvente obtenido anadiendo al extracto crudo uno o mas disolventes seleccionados del grupo

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que consiste en una solucion acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 carbonos, preferiblemente solucion acuosa de alcohol propflico, solucion acuosa de alcohol isopropflico y alcohol butflico saturado con agua.

El extracto de hoja de hiedra puede ser un extracto crudo obtenido por extraccion de hoja de hiedra seca con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, o un extracto soluble en disolvente obtenido anadiendo al extracto crudo uno mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en una solucion acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos, preferiblemente solucion acuosa de alcohol propflico, solucion acuosa de alcohol isopropflico y alcohol butilico saturado con agua. La hiedra usada para preparar el extracto de hoja de hiedra puede ser Hedera spp y, por ejemplo, puede ser una o mas seleccionadas del grupo que consiste en Hedera algeriensis, Hedera azorica, Hedera canadensis, Hedera colchica, Hedera helix, Hedera hibernica, Hedera maderensis, Hedera nepalensis, Hedera pastuchowii, Hedera rhombea y similares, pero no se limita a las mismas.

El disolvente usado para preparar el extracto crudo de hoja de hiedra puede ser uno o mas seleccionados del grupo que consiste en agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % (v/v) de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, preferiblemente solucion acuosa de metanol y solucion acuosa de etanol, y alcohol butflico saturado con agua.

El disolvente usado para preparar el extracto soluble en disolvente de Rhizoma Coptidis u hoja de hiedra puede ser uno o mas seleccionados del grupo que consiste en de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % (v/v) de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos, preferiblemente solucion acuosa de alcohol propflico y solucion acuosa de alcohol isopropflico, y alcohol butflico saturado con agua.

El extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra puede ser una mezcla de extracto de Rhizoma Coptidis y extracto de hoja de hiedra, o un extracto de una mezcla de Rhizoma Coptidis y hoja de hiedra. Por ejemplo, el extracto combinado puede ser un extracto crudo obtenido mezclando Rhizoma Coptidis y hoja de hiedra y sometiendo la mezcla a extraccion con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, o un extracto soluble en disolvente obtenido anadiendo al extracto crudo uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en una solucion acuosa de alcohol inferior que tiene 1 a 6 carbonos, preferiblemente solucion acuosa de alcohol propflico y solucion acuosa de alcohol isopropflico, y alcohol butflico saturado con agua.

Preferiblemente, el disolvente usado para preparar el extracto crudo de Rhizoma Coptidis y hoja de hiedra puede ser agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de aproximadamente 25 a 55 % (v/v) de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua. El disolvente usado para preparar el extracto soluble en disolvente puede ser uno o mas seleccionados del grupo que consiste en de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de aproximadamente 25 a 55 % (v/v) de una solucion acuosa de alcohol inferior que tiene 1 a 6 carbonos, preferiblemente solucion acuosa de alcohol propflico y solucion acuosa de alcohol isopropflico, y alcohol butflico saturado con agua.

La “fraccion” puede obtenerse sometiendo el extracto soluble en disolvente a una cromatograffa en columna de gel de sflice con un disolvente mezclado de cloruro de metileno y metanol (30:1 a 7:1 (v/v)).

El extracto de Rhizoma Coptidis, extracto o fraccion soluble en disolvente comprende berberina, palmatina, coptisina, columbamina y jatrorrizina, preferiblemente berberina (0,5 a 47,0 partes en peso):palmitina (0,2 a 21,4 partes en peso):coptisina (0,1 a 18,0 pates en peso):columbamina (0,1 a 3,2 partes en peso):jatrorrizina (0,1 a 2,6 partes en peso).

EEn la presente memoria tambien se describe un metodo de preparacion de un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra que tiene actividades antitusivas, expectorantes, antihistammicas, de supresion de broncoconstriccion, supresion de hipersensibilidad de vfas respiratorias, supresion de oclusion bronquial en tejido de pulmon y supresion de infiltracion de celulas inflamatorias.

El metodo comprende la etapa de extraccion de Rhizoma Coptidis, preferiblemente la parte de rizoma del mismo con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente, de aproximadamente 25 a 55 % (v/v) de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua.

El metodo de preparacion del extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra puede comprender las etapas de:

extraccion de hoja de hiedra seca con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % (v/v) de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua, para obtener el extracto de hoja de hiedra;

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extraccion de Rhizoma Coptidis, preferiblemente la parte de rizoma del mismo con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % (v/v) de solucion acuosa de metanol, o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua, para obtener el extracto de Rhizoma Coptidis; y

mezcla del extracto de la hoja de hiedra obtenido y el extracto de Rhizoma Coptidis en una relacion de 0,1:1 a 10:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de extracto de Rhizoma Coptidis), preferiblemente de 0,2:1 a 5:1, mas preferiblemente de 1:1 a 4:1, mucho mas preferiblemente de 1,5:1 a 3,5:1, lo mas preferiblemente de 2,5:1 a 3,5:1, basado en el contenido solido.

La etapa de preparacion de extracto de hoja de hiedra y la etapa de preparacion de extracto de Rhizoma Coptidis ademas puede comprender la etapa de adicion de uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos, preferiblemente alcohol butflico saturado con agua, alcohol propflico y alcohol isopropflico al extracto obtenido, para obtener un extracto soluble en disolvente.

La etapa de preparacion del extracto de hoja de hiedra sera explicada en detalle: se corta hoja de hiedra y se lava con agua para eliminar impurezas, y la hoja se seca y, a continuacion, se somete a extraccion a reflujo con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua, en una cantidad de aproximadamente 5 a 20 veces en volumen, preferiblemente 7 a 15 veces en volumen de la hoja de hiedra seca. La temperatura de extraccion es de 40 a 110 °C, preferiblemente 55 a 90 °C.

Despues de la extraccion, el extracto se filtra para recoger el filtrado y el residuo se somete a extraccion a reflujo con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua, en una cantidad de aproximadamente 5 a 15 veces en volumen, preferiblemente 8 a 12 veces en volumen. La temperatura de extraccion es, aunque no se limita espedficamente, de 40 a 110 °C, preferiblemente 55 a 90 °C. Despues de la extraccion, el extracto se filtra, el filtrado se combina con filtrado previamente obtenido y se concentran bajo vacfo para preparar extracto de hoja de hiedra. Las extracciones dobles y la combinacion de los filtrados obtenidos despues de cada extraccion pueden incrementar la eficacia de extraccion, pero el numero de extraccion no se limita al mismo.

La etapa de preparacion de extracto de Rhizoma Coptidis sera explicada en detalle: La parte de rizoma del Rhizoma Coptidis se corta en pequenos pedazos y, a continuacion, uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua, se anade al mismo en una cantidad de aproximadamente 3 a 20 veces en volumen, preferiblemente 5 a 15 veces en volumen de la materia prima para extraer durante 0,5 a 20 horas, preferiblemente 1 a 10 horas, mas preferiblemente 2 a 5 horas. La temperatura de extraccion es, aunque no se limita espedficamente, preferiblemente de 40 a 110 °C, preferiblemente 55 a 90 °C. Preferiblemente, el extracto obtenido se filtra para recoger el filtrado, y uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbono, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de 25 a 55 % de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua, se anaden al residuo en una cantidad de aproximadamente 5 a 15 veces en volumen, preferiblemente 8 a 12 veces en volumen, y la temperatura se eleva para volver a extraer durante 1 a 10 horas, preferiblemente 2 a 5 horas y, a continuacion, el extracto se filtra y se concentra bajo vado para obtener extracto de Rhizoma Coptidis. La combinacion del extracto obtenido con filtrado previamente obtenido puede incrementar la eficacia de extraccion.

Las extracciones dobles y la combinacion de los filtrados obtenidos despues de cada extraccion pueden incrementar la eficacia de extraccion, pero el numero de extraccion no se limita a las mismas.

Si la cantidad del disolvente usado para preparar extracto de Rhizoma Coptidis y/o el extracto de hoja de hiedra es demasiado pequena, la agitacion es diffcil y la solubilidad del extracto disminuye a eficacia de extraccion inferior. Si la cantidad del disolvente usado para preparar extracto de Rhizoma Coptidis y/o extracto de hoja de hiedra es muy grande, la cantidad de alcohol inferior usado para la siguiente etapa de purificacion se incrementa para ocasionar problemas economicos y problemas en su manejo. Por tanto, es preferible ajustar la cantidad del disolvente dentro del intervalo descrito anteriormente .

De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, la re-extraccion se puede realizar despues de la extraccion primaria, que es para prevenir la disminucion en la eficacia de extraccion realizando unicamente la extraccion primaria, debido a que en el caso de que el extracto herbal sea producido en grandes cantidades, incluso si se realiza la filtracion efectiva, la cantidad de extracto herbal es alta, generando de ese modo perdidas del mismo y, por tanto, disminuye la eficacia de extraccion cuando se realiza unicamente la extraccion primaria. Por lo tanto, de

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acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, se puede realizar la re-extraccion despues de la extraccion primaria. Ademas, como resultado del examen de la eficacia de extraccion en cada etapa, se ha encontrado que el aproximadamente 80 al 90 % de la cantidad de extracto total se extrae por extraccion secundaria y, por tanto, se puede sugerir que las extracciones en dos etapas permiten eficacia economica significativa en comparacion con las extracciones en multiples etapas mas de una tercera extraccion.

El extracto soluble en disolvente puede prepararse mediante la suspension del extracto crudo obtenido en aproximadamente 2 a 10 veces, preferiblemente aproximadamente 3 a 7 veces en volumen de agua, y adicion al mismo de uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en una solucion acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos, preferiblemente solucion acuosa de alcohol propflico o solucion acuosa de alcohol isopropflico, y alcohol butilico saturado con agua en una cantidad de 0,5 a 3 veces, preferiblemente la cantidad equivalente a 2 veces de la suspension para una a cinco veces, preferiblemente dos a tres veces, para extraer una capa soluble en disolvente y, a continuacion, concentracion bajo vado.

La etapa de extraccion soluble en disolvente usando alcohol inferior es para purificar impurezas innecesarias tales como protemas, polisacaridos, acidos grasos y similares. Si la cantidad del alcohol inferior usado para lo mismo es pequena en comparacion con el filtrado, se forman partfculas finas de ingredientes innecesarios tales como acido graso, produciendo de ese modo la separacion de capas no uniforme y disminuyendo la cantidad de extraccion de principios activos. Por lo tanto, puede ser preferible ajustar la cantidad del alcohol inferior dentro del intervalo descrito anteriormente.

La fraccion de alcohol inferior obtenida despues de la separacion de capas se concentra bajo vacfo a 50 a 60 °C para separar el disolvente restante en la muestra.

Con el fin de controlar el contenido del alcohol inferior restante en el concentrado obtenido para hacerlo adecuado para su uso como materia prima para medicina, el concentrado puede someterse a concentracion azeotropica con aproximadamente 10 a 30 veces, preferiblemente 15 a 25 veces, mas preferiblemente aproximadamente 20 veces en peso de agua, basado en la cantidad total del concentrado, durante 1 a 5 veces, preferiblemente 2 a 3 veces, y la cantidad equivalente de agua se anade al mismo para suspenderlo homogeneamente y, a continuacion, la suspension se liofiliza para preparar extracto de Rhizoma Coptidis y/o extracto de hoja de hiedra en forma de polvo.

Preferiblemente, con el fin de combinar homogeneamente cada extracto en el extracto combinado, se anade aproximadamente 2 a 3 veces en peso de agua al extracto combinado y, a continuacion, se concentra bajo vacfo a 50 a 60 °C, se anade la cantidad equivalente de agua de nuevo al concentrado para suspenderlo homogeneamente y, a continuacion, la suspension se liofiliza para preparar una composicion en forma de polvo.

De acuerdo con otra realizacion, el metodo para preparar extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra puede comprender las etapas de:

mezcla de la hoja de hiedra seca y Rhizoma Coptidis, preferiblemente la parte de rizoma de la misma en una relacion en peso de 1:4 a 7:1 (el peso de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis), preferiblemente de 1:1 a 6:1, mas preferiblemente de 2:1 a 5:1 para preparar una mezcla de hoja de hiedra y Rhizoma Coptidis; y

extraccion de la mezcla con uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos, por ejemplo, agua, de 10 a 70 % (v/v), preferiblemente de 20 a 60 % (v/v), mas preferiblemente de aproximadamente 25 a 55 % (v/v) de solucion acuosa de metanol o solucion acuosa de etanol, o alcohol butflico saturado con agua.

El metodo anterior ademas puede comprender la etapa de adicion de uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol inferior lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos, preferiblemente alcohol propflico, alcohol isopropflico y alcohol butflico saturado con agua, para obtener extracto soluble en disolvente, despues de la etapa de obtener extracto de la mezcla de hoja de hiedra y Rhizoma Coptidis.

Los detalles de las etapas de preparacion del extracto crudo y el extracto soluble en disolvente son como se describen en la preparacion de cada extracto herbal.

Se puede utilizar cualquier metodo convencionalmente usado. Por ejemplo, la extraccion se puede realizar a traves de la extraccion a temperatura ambiente, extraccion en agua caliente, extraccion ultrasonica, extraccion por reflujo o extraccion por enfriamiento. Otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion antitusiva que comprende el extracto de Rhizoma Coptidis. La composicion ademas puede comprender extracto de hoja de hiedra como principio activo. En otro aspecto, la presente invencion tambien proporciona una composicion expectorante que comprende el extracto de Rhizoma Coptidis. La composicion ademas puede comprender extracto de hoja de hiedra como principio activo. En aun otro aspecto, la presente invencion tambien proporciona una composicion para prevenir y/o tratar enfermedad respiratoria que comprende el extracto de Rhizoma Coptidis o un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra como principio activo.

En la presente memoria tambien se describe un metodo de supresion de tos que comprende la etapa de administracion del extracto de Rhizoma Coptidis o, preferiblemente un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con

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hoja de hiedra a un paciente en una cantidad terapeuticamente efectiva. En la presente invencion tambien se describe un metodo de eliminacion de esputo que comprende la etapa de administracion del extracto de Rhizoma Coptidis, o preferiblemente un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra, a un paciente en una cantidad terapeuticamente efectiva. En aun otro aspecto, en la presente invencion se describe un metodo de prevencion y/o tratamiento de enfermedad respiratoria que comprende la etapa de administracion del extracto de Rhizoma Coptidis o un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra a un paciente en una cantidad terapeuticamente efectiva. El paciente puede ser cualquier mairnfero que necesita supresion de tos, eliminacion de esputo o tratamiento y/o prevencion de enfermedad respiratoria, preferiblemente humana.

La cantidad terapeuticamente efectiva es una dosis determinada para obtener el efecto de tratamiento deseado. Se puede variar dependiendo de la distincion de edad, peso, sexo, forma de dosis, estado de salud y gravedad de la enfermedad y tambien se puede variar dependiendo del juicio del medico o farmaceutico. Por ejemplo, la dosis diaria puede ser de 0,5 a 500 mg/kg, preferiblemente 1 a 300 mg/kg, basado en el contenido de principio activo, pero no limitado a lo mismo. La dosis se puede administrar una vez al dfa o varias veces al dfa. La dosis se ilustra para caso promedio, y puede ser superior o inferior individualmente. Si la dosis diaria de la composicion que comprende el extracto combinado de la presente invencion es menor que el intervalo anteriormente descrito, no se puede obtener efecto significativo; y si supera el intervalo anteriormente descrito, disminuye la eficiencia economica y la dosis esta fuera de la dosis comun ocasionando asf efectos secundarios indeseables. Por tanto, la dosis diaria preferiblemente esta en el intervalo anteriormente descrito.

El extracto de Rhizoma Coptidis y un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra muestran actividades antitusivas, expectorantes, antihistammicas, de supresion de broncoconstriccion, supresion de hipersensibilidad de vfas respiratorias, supresion de oclusion bronquial en tejido de pulmon y supresion de infiltracion de celulas inflamatorias y, por tanto, se pueden usar para tratar, prevenir o aliviar enfermedades respiratorias relacionadas. Y, el extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra es preferible debido a que la sinergia se puede obtener en comparacion con cada extracto solo.

La enfermedad respiratoria puede ser toda enfermedad que implica tos y esputo y, por ejemplo, se selecciona del grupo que consiste en tos o esputo comun; enfisema pulmonar que implica tos o esputo; bronquitis tal como bronquitis cronica, bronquitis aguda, bronquitis catarral, enfermedad bronquial obstructiva o inflamatoria, etc.; asma tal como asma bronquial, asma atopica, asma mediada por IgE bronquial atopica, asma no atopica, asma alergica, asma no alergica, etc.; broncoconstriccion cronica o aguda; smdrome infantil estriduloso; enfermedad pulmonar obstructiva cronica; adenoma bronquial; nodulo pulmonar solitario; tuberculosis pulmonar; piotorax; absceso pulmonar; resfriado comun; gripe; e histiocitosis pulmonar.

La composicion de la presente invencion puede administrarse a mamfferos incluidos seres humanos en diversas vfas. Puede administrarse usando el metodo comunmente usado, por ejemplo, puede administrarse oralmente, intrarectalmente, o por inyeccion intravenosa, intramuscular, subcutanea, intrauterina o intracerebroventricular. La composicion de la presente invencion se puede formular en una forma de dosis oral tal como polvo, granulo, comprimido, capsula, suspension, emulsion, jarabe, aerosol, etc., o una forma de dosis parenteral tal como agente transdermico, supositorio y solucion de inyeccion esteril.

La composicion de la presente invencion ademas puede comprender adyuvante farmaceuticamente adecuado y fisiologicamente aceptable tal como vehfculo, excipiente y diluyentes.

La composicion de la presente invencion se puede administrar sola; sin embargo, en general, considerando la via de administracion y la practica farmaceutica estandar, puede administrarse con un vehfculo farmaceutico seleccionado. Por ejemplo, la composicion se puede administrar oralmente, intrabucalmente o sublingualmente en forma de comprimido que contiene lactosa o almidon, capsula sola o que contiene excipiente, elixir que contiene compuestos qmmicos aromatizantes o colorantes, o suspension. La formulacion lfquida puede formularse con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agente de suspension (por ejemplo, metilcelulosa, glicerido semisintetico tal como Witepsol, o una mezcla de gliceridos tal como una mezcla de aceite de semilla de albaricoque y ester de PEG-6, o una mezcla de PEG-8 y glicerico capnlico/caprico).

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un alimento funcional saludable para suprimir la tos, eliminar el esputo, o prevenir o mejorar la enfermedad respiratoria tal como asma, que comprende el extracto de Rhizoma Coptidis o un extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra. El alimento funcional saludable puede ser comida, bebida, o aditivos alimenticios, etc.

El contenido del extracto como principio activo contenido en el alimento funcional saludable se puede variar apropiadamente dependiendo de la forma de comida, uso deseado, etc., sin limitaciones espedficas. Por ejemplo, se puede anadir en una cantidad de 0,01 a 15 % en peso de la comida total y para composicion de bebida saludable, puede anadirse en una cantidad de 0,02 a 10 g, preferiblemente de 0,3 a 1 g, basado en 100 ml de la composicion.

n caso de que la composicion herbal de la presente invencion se administre en el cuerpo humano, considerando las propiedades generales de los extractos naturales, se cree que no existe preocupacion de efectos secundarios en

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comparacion con otras medicinas sinteticas y, como resultado de la prueba de toxicidad practica, se prueba que no tiene influencia sobre un cuerpo vivo.

Breve Descripcion de los Dibujos

La Figura 1 muestra actividades expectorantes del extracto de Rhizoma Coptidis y la fraccion activa e ingredientes representativos del mismo a traves del metodo de secrecion de rojo de fenol en un modelo de raton.

La Figura 2 muestra actividades expectorantes de los extractos preparados en el Ejemplo 2, indicando los resultados medidos por el metodo de rojo de fenol usando un raton.

La Figura 3 muestra actividades antitusivas de los extractos preparados en el Ejemplo 2, indicando los resultados de la prueba de supresion de tos usando un conejillo de indias.

La Figura 4 muestra actividades de supresion de broncoconstriccion de los extractos preparados en el Ejemplo 2, indicando la relajacion (%) para un inductor de contraccion usando un bronquio extrafdo de un conejillo de indias.

La Figura 5 muestra los efectos de los extractos de los Ejemplos 2~7 en oclusion bronquial en tejido de pulmon y actividades de supresion de infiltracion de celulas inflamatorias en un tejido pulmonar de raton sensibilizado con OVA y ensayado ((a) grupo normal, (b) grupo inducido, (c) control positivo, (d) ejemplos 2~7).

Ejemplos

La presente invencion sera explicada en detalle con referencia a los siguientes ejemplos y experimentos.

Ejemplo 1. Preparacion del extracto de Rhizoma Coptidis

1-1. Preparacion del extracto de Rhizoma Coptidis usandoel uso de agua

1-1-1. Preparacion de extracto crudo de Rhizoma Coptidis (CR-GA)

El Rhizoma Coptidis comprado en el mercado de Kyungdong se lavo con agua para eliminar impurezas y 250 g de Rhizoma Coptidis seco se sometieron a extraccion con agua caliente con 1,5 l de agua a 80 °C dos veces durante cada 3 horas y, a continuacion, el extracto se filtro y se concentro bajo vacfo para obtener 62,5 g de extracto crudo (rendimiento del 25 % comparado con la hierba sin procesar), que se nombro como “CR-GA” y se uso en el siguiente Ejemplo 1-2.

1-1-2. Preparacion de extracto soluble en disolventes de Rhizoma Coptidis (CR-GA-1)

A 62,5 g del CR-GA obtenido en el Ejemplo 1-1-1, se anadieron 0,5 l de agua para suspenderlo, y se anadio al mismo 1 l de alcohol butflico saturado con agua, para separar una capa dos veces y, a continuacion, solo se recogio la fraccion de alcohol butflico saturada con agua y se concentro bajo vacfo hasta que se seco. Cuando se evaporo la mayona del alcohol butflico y el agua, se anadieron 0,4 l de agua para concentrarlo azeotropicamente, lo cual se repitio dos veces. Y, finalmente, se anadieron 0,1 l de agua destilada para suspender el concentrado y, a continuacion, la suspension se liofilizo para obtener 19,8 g de extracto de Rhizoma Coptidis en forma de polvo (7,92 % de rendimiento comparado con la hierba sin procesar), que se nombro como “CR-GA-1” y se uso como una muestra en los siguientes Experimentos.

1-2. Preparacion del extracto de Rhizoma Coptidis usando etanol al 50 % (v/v)

1-2-1. Preparacion de extracto crudo de Rhizoma Coptidis (CR-GB)

El Rhizoma Coptidis comprado en el mercado de Kyungdong se lavo con agua para eliminar impurezas y, 250 g de Rhizoma Coptidis seco se sometio a extraccion a reflujo con 2,0 l de solucion acuosa de etanol al 50 % (v/v) a 80 °C dos veces durante cada 3 horas y, a continuacion, el extracto se filtro y se concentro bajo vacfo para obtener 57,5 g de extracto crudo (rendimiento del 23 % comparado con la hierba sin procesar), que se nombro como “CR-GB” y se uso en el siguiente Ejemplo 2-2.

1-2-2. Preparacion de extracto de Rhizoma Coptidis soluble en disolvente (CR-GB-1)

A 57,5 g del CR-GB obtenido en el Ejemplo 1-2-1, se anadieron 0,3 l de agua para suspenderlo, y se anadieron a la misma 0,6 l de alcohol butflico saturado con agua, para separar una capa dos veces y, a continuacion, unicamente se recogio la fraccion de alcohol butflico y se concentro bajo vacfo hasta que se seco. Cuando se evaporo la mayona del alcohol butflico y el agua, se anadieron 0,2 l de agua para concentrarlo azeotropicamente, lo cual se repitio dos veces. Y, finalmente, se anadieron 0,2 l de agua destilada se agrego para suspender el concentrado y, a continuacion, la suspension se liofilizo para obtener 31,8 g de extracto de Rhizoma Coptidis en forma de polvo (rendimiento del 12,7 % comparado con la hierba sin procesar), que se nombro como “CR-GB-1” y se uso como una muestra en los siguientes Experimentos.

1-3. Preparacion del extracto de Rhizoma Coptidis usando alcohol butflico saturado con agua

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1-3-1. Preparacion del extracto de Rhizoma Coptidis (CR-GC)

El Rhizoma Coptidis comprado en el mercado de Kyungdong se lavo con agua para eliminar impurezas y, 250 g de Rhizoma Coptidis seco se sometieron a extraccion a reflujo con 2,5 l de alcohol n-butilico saturado con agua a 85 °C dos veces durante cada 3 horas y, a continuacion, el extracto se filtro y se concentro bajo vado. Cuando se evaporo la mayona del alcohol butilico, se anadieron 0,2 l de agua para concentrarlo azeotropicamente, lo cual se repitio dos veces. Finalmente, se anadieron 0,2 l de agua destilada para suspenderlo, y la suspension se liofilizo para obtener 32,8 g de extracto en forma de polvo (13,1 % de rendimiento comparado con la hierba sin procesar), que se nombro como “CR-GC” y se uso en los siguientes Experimentos.

1- 4. Separacion de extracto de Rhizoma Coptidis

20 g del CR-GB-1 obtenido en el Ejemplo 1-2-2 se dividieron en 5 fracciones por cromatograffa en columna de gel de sflice usando un disolvente mezclado de cloruro de metileno y metanol (30:1 ~ 7:1 (v/v). Fr. 1 fue de 0,8 g (de aqm en adelante, referida como “Fr. 1”), Fr. 2 fue de 2,6 g (de aqm en adelante, referida como “Fr. 2”), Fr. 3 fue de 5,5 g (de aqm en adelante, referida como “Fr. 3”), Fr. 4 fue de 2,8 g (de aqm en adelante, referida como “Fr. 4”), Fr. 5 fue de 6,5 g (de aqm en adelante, referida como “Fr. 5”), las cuales se usaron como muestras en los siguientes Experimentos.

Ejemplo 2. Preparacion de extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra

Preparacion de extracto de hoja de hiedra

Se lavaron con agua hojas de hiedra (Hedera helix) para eliminar impurezas y se secaron completamente. A 250 g de las hojas de hiedra preparadas, se anadieron 3 l de solucion acuosa de etanol al 30 % (v/v) y se sometieron a extraccion a reflujo durante 6 horas y, a continuacion, el extracto se filtro para recoger el filtrado. Al residuo, se anadieron 2,5 l de solucion acuosa de etanol al 30 % (v/v), se sometio a extraccion a reflujo a 80 °C durante 3 horas y el filtrado obtenido se combino con filtrado previamente recogido y se concentro a vado. Cuando la mayona del disolvente se evaporo, se anadieron 0,2 l de agua para concentrarlo azeotropicamente, lo cual se repitio dos veces. Y, se anadio la cantidad equivalente de agua para suspenderla homogeneamente y, a continuacion, se liofilizo la suspension para obtener 42,4 g de extracto de hoja de hiedra en forma de polvo. El extracto de hoja de hiedra obtenido se uso para la preparacion del extracto combinado en los siguientes Ejemplos 2-1 a 2-11.

Preparacion del extracto de Rhizoma Coptidis

Se lavo Rhizoma Coptidis con agua para eliminar impurezas y se seco completamente. A 250 g del Rhizoma Coptidis preparado, se anadieron 2,0 l de solucion acuosa de etanol al 50 % (v/v) para someter a extraccion a reflujo a 80 °C durante 3 horas. Y, a continuacion, el extracto se filtro y se concentro bajo vado para obtener 57,5 g del extracto crudo. Y se anadieron al mismo 0,3 l de agua para suspenderlo y se anadieron al mismo 0,6 l de alcohol butflico saturado con agua para separar una capa dos veces. Y, a continuacion, unicamente se recogio la fraccion de alcohol butflico y se concentro bajo vado hasta que se seco. Cuando se evaporaron la mayona del alcohol butflico y el agua, se anadio 0,2 l de agua para concentrarlo azeotropicamente, lo cual se repitio dos veces. Finalmente, se anadio al mismo una cantidad equivalente de agua para suspenderlo y la suspension se liofilizo para obtener 31,8 g de Rhizoma Coptidis que se uso para la preparacion del extracto combinado en los siguientes Ejemplos 2-1 a 2-11.

2- 1. Preparacion de extracto combinado (0,2:1)

El extracto de hoja de hiedra anteriormente preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se mezclaron en una relacion en peso de 0,2:1 (el peso del extracto de hoja de hiedra:el peso del extracto de Rhizoma Coptidis). Con el fin de mezclar homogeneamente, aproximadamente 2 a 3 veces en peso de agua se anadieron al extracto combinado y, a continuacion, se concentraron bajo vacio a una temperatura de 50 a 60 °C. Y, se anadio de nuevo una cantidad equivalente de agua al concentrado obtenido para suspenderlo homogeneamente, y la suspension se liofilizo para preparar un extracto combinado en forma de polvo.

2-2. Preparacion de extracto combinado (0,4:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 0,4:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-3. Preparacion de extracto combinado (1:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 1:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-4. Preparacion de extracto combinado (1,5:1)

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Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 1,5:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-5. Preparacion de extracto combinado (2:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 2:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-6. Preparacion de extracto combinado (2,5:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 2,5:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-7. Preparacion de extracto combinado (3:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 3:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-8. Preparacion de extracto combinado (3,5:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 3,5:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-9. Preparacion de extracto combinado (4:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 4:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2-10. Preparacion de extracto combinado (4,5:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 4,5:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

2- 11. Preparacion de extracto combinado (5:1)

Se preparo un extracto combinado mediante el mismo metodo que el anterior Ejemplo de Preparacion 1, excepto que la relacion del extracto de hoja de hiedra preparado y el extracto de Rhizoma Coptidis se cambio a 5:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de Rhizoma Coptidis).

Ejemplo 3. Experimento para la actividad del extracto de Rhizoma Coptidis

3- 1. Medicion de la actividad expectorante del extracto de Rhizoma Coptidis Metodo del experimento

Con el fin de medir las actividades expectorantes de los extractos de Rhizoma Coptidis de los Ejemplos 1-1 a 1-3, el experimento se llevo a cabo usando el metodo de Engler et al. (Engler H., Szelenyl I., J. Pharmacol. Moth. 11, 151157, 1984; Bao-quin Lin et., Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 21, 259-263, 2008) en el siguiente procedimiento.

Un farmaco de control positivo (Ambroxol, Sigma) y los farmacos de ensayo (extracto de Rhizoma Coptidis de los Ejemplos 1-1 a 1-3) se administraron oralmente a un raton macho (8 semanas de edad, Sam tako BioKorrea) y despues de 30 minutos, se inyectaron intraperitonealmente 500 mg/kg de rojo de fenol (el rojo de fenol se disolvio en solucion salina). Despues de 30 minutos, el raton fue anestesiado con eter dietflico, exanguinado al cortar la aorta abdominal y, a continuacion, se extirpo la traquea completa. La traquea separada se coloco en 1 ml de solucion salina y se lavo durante 30 minutos, se centrifugo a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos, se anadio hidroxido de sodio 1 N (NaOH) al sobrenadante (anadiendo 0,1 ml de NaOH 1 N por 1 ml de sobrenadante) y, a continuacion, se midio la absorbancia a 546 nm para medir la actividad expectorante como concentracion del rojo de fenol.

Resultados del Experimento

Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente Tabla 1

Tabla 1

Dosis (mg/kg) Capacidad de secretar esputo (%)

Ejemplo 1-1

CR-GA 500 29

CR-GA-1 500 36

Ejemplo 1-2

CR-GB 500 32

CR-GB-1 500 41

Ejemplo 1-3

CR-GC 500 38

Control positivo (Ambroxol)

250 32

Como resultados del experimento, mostrados en la anterior Tabla 1, los extractos tuvieron excelentes actividades en conjunto, particularmente CR-GB-1 del Ejemplo 2 mostro la actividad de secrecion de esputo mas excelente.

5 Y, se midieron las actividades de CR-GC-1 del Ejemplo 2 de acuerdo con la dosis (50, 100, 150, 200, 500 mg/kg), cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2

Dosis (mg/kg) Capacidad de secretar esputo (%)

Ejemplo 1-2

CR-GB-1 50 4

100 22

150

32

200

33

500

41

Control positivo (Ambroxol)

250 30

Como resultados del experimento, mostrados en la anterior la Tabla 2, CR-GB-1 del Ejemplo 1-2 mostro la actividad 10 de secrecion de esputo mas excelente a una dosis de 500 mg/kg.

3-2. Medicion de la actividad antitusiva del extracto de Rhizoma Coptidis

Metodo del Experimento

Con el fin de medir la actividad antitusiva de los extractos de Rhizoma Coptidis de los Ejemplos 1-1 a 1-3, el experimento se llevo a cabo usando el metodo de Tanaka et al. (Motomu Tanaka y Kei Maruyama, J. Pharmacol. 15 Sci. 93, 465-470, 2003, Daoui, Cognon, Naline et., Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 158, 42-48, 1998) en el siguiente procedimiento.

Un farmaco de ensayo se administro oralmente a un conejillo de indias macho (6 semanas de edad, Sam tako BioKorea) y despues de 1 hora, el conejillo de indias se coloco en una camara de pletismografo (Buxco, EE.UU.) y, a continuacion, se nebulizo un inductor de tos, acido cttrico (Sigma), para inducir la tos. Como control positivo, se uso 20 la teobromina (Sigma) la cual se usa como antitusivo. Y, el conejillo de indias se expuso a acido cftrico 0,2 M durante 10 minutos, y se midio el numero de toses ocurridas durante 15 minutos.

Resultado del Experimento

Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3

Dosis (mg/kg) Capacidad de secretar esputo (%)

Ejemplo 1-1

CR-GA 200 33

CR-GA-1 200 46

Ejemplo 1-2

CR-GB 200 35

CR-GB-1 200 52

Ejemplo 1-3

CR-GC 200 44

Control positivo (Teobromina)

50 57

25

Como resultados de los experimentos, mostrados en la anterior Tabla 3, los extractos tuvieron excelentes actividades en conjunto y, particularmente, CT-GB-1 del Ejemplo 1-2 mostro la actividad de secrecion de esputo mas excelente.

Y, se midieron las actividades de CR-GB-1 del Ejemplo 1-2 de acuerdo con la dosis (50, 100, 150, 200 mg/kg), cuyos 30 resultados se presentan en la siguiente Tabla 4.

Tabla 4

Dosis (mg/kg) Capacidad de suprimir la tos (%)

Ejemplo 1-2

CR-GB-1 50 7

100 25

150

37

200

52

Control positivo (Teobromina)

50 57

Como resultados del experimented mostrados en la anterior Tabla 4, CR-GB-1 del Ejemplo 1-2 mostro la actividad de supresion de la tos mas excelente a una dosis de 200 mg/kg.

3-3. Medicion de la actividad antihistammica del extracto de Rhizoma Coptidis

5 Metodo del Experimento

Con el fin de medir la actividad antihistammica del extracto de Rhizoma Coptidis de los Ejemplos 1-1 a 1-3, el experimento se llevo a cabo usando el metodo de Honuchi et al. (Masako Honuchi y Yoshiyuki Seyama, J. Health Sci., 52(6), 711-717, 2006, Naoki Inagaki et al., Biol. Pharm. Bull. 24(7), 829-834, 2001) en el siguiente procedimiento.

10 Se midio el efecto antihistammico usando mastocitos peritoneales de una rata macho (7 semanas de edad, Sam tako BioKorea) sensibilizados con ovalbumina. Como control positivo, se uso Ketotifeno (Sigma). A una rata sensibilizada con ovalbumina, se administro oralmente Ketotifeno a una concentracion de 5 mg/kg, y los farmacos de ensayo se administraron oralmente respectivamente a una concentracion de 200 mg/kg durante 4 dfas y, a continuacion, se separaron los mastocitos peritoneales. Los mastocitos peritoneales (2x10° celulas/ml) se trataron 15 con Ketotifeno a concentraciones de 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml y 1,0 mg/ml, y los farmacos de ensayo a concentraciones de 0,1 mg/ml, 1,0 mg/ml y 10 mg/ml. Finalmente, los mastocitos se trataron con el compuesto 48/80 (Sigma) que activa la liberacion de histamina no inmunologica a una concentracion de 10 pg/ml. En este momento, la cantidad de histamina liberada de los mastocitos se cuantifico para examinar si los materiales de ensayo suprimen la liberacion de histamina de los mastocitos. Se midio la cantidad relativa de histamina liberada de mastocito en una 20 rata a la cual no se administro farmaco, cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 5.

Tabla 5

Dosis oral (mg/kg) Concentracion de tratamiento de mastocito (mg/ml) Cantidad de liberacion de histamina (%)

Ejemplo 1-1

CR-GA 200 0 41

0,1 38

1,0

33

10,0

26

CR-GA-1

200 0 44

0,1 35

1,0

29

10,0

23

Ejemplo 1-2

CR-GB 200 0 42

0,1 38

1,0

31

10,0

27

CR-GB-1

200 0 39

0,1 34

1,0

27

10,0

21

Ejemplo 1-3

CR-GC 200 0 41

0,1 37

1,0

30

10,0

22

Control Positivo (Ketotifeno)

5 0 43

0,01 41

0,1

32

1,0

18

Como resultados de los experimentos, mostrados en la anterior Tabla 5, los extractos en conjunto tuvieron excelentes actividades y, particularmente, CR-GB-1 del Ejemplo 1-2 mostro la actividad antihistammica mas 25 excelente.

Y, las actividades de CR-GB-1 del Ejemplo 1-2 se midieron de acuerdo con la dosis (100, 200, 400 mg/kg), cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 6.

Tabla 6

Dosis oral (mg/kg) Concentracion de tratamiento de mastocitos (mg/ml) Cantidad de liberacion de histamina (%)

Ejemplo 1-2

CR-GB-1 100 0 49

0,1 40

1,0

36

10,0

30

200

0 42

0,1 34

1,0

27

10,0

21

400

0 31

0,1 26

1,0

23

10,0

18

Control Positivo (Ketotifeno)

5 0 43

0,01 41

0,1

32

1,0

18

5 Como resultados de los experimented, mostrados en la anterior Tabla 6, CR-GB-1 del Ejemplo 1-2 mostro la actividad antihistammica mas excelente a una dosis de 400 mg/kg.

3-4. Medicion de las actividades antitusivas de subfracciones activas

Con el fin de medir las actividades antitusivas de 5 sub-fracciones preparadas en el anterior Ejemplo 1-4, se llevo a cabo el experimento para actividad antitusiva mediante el mismo metodo que el Experimento 3-2, cuyos resultados 10 se presentan en la siguiente Tabla 7.

Tabla 7

Dosis (mg/kg) Capacidad para suprimir la tos (%)

Fr. 1

60 41

Fr. 2

60 32

Fr. 3

60 62

Fr. 4

60 34

Fr. 5

60 24

Control Positivo

| Teobromina 50 57

Como resultados del experimento, mostrados en la Tabla 7, las fracciones tuvieron excelentes actividades en conjunto y, particularmente, Fr. 3 mostro la actividad antitusiva mas excelente.

15 3-5. Medicion de actividades antihistammicas de sub-fracciones activas

Con el fin de medir las actividades antihistammicas de las 5 sub-fracciones preparadas en el anterior Ejemplo 1-4, se llevo a cabo el mismo experimento que el anterior Experimento 3-3 cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 8.

Tabla 8

Dosis oral (mg/kg) Concentracion de tratamiento de mastocito (mg/ml) Cantidad de liberacion de histamina (%)

Fr. 1

60 0 55

0,1

50

1,0

42

10,0

39

Dosis oral (mg/kg) Concentracion de tratamiento de mastocito (mg/ml) Cantidad de liberacion de histamina (%)

Fr. 2

60 0 59

0,1

54

1,0

48

10,0

41

Fr. 3

60 0 38

0,1

31

1,0

26

10,0

19

Fr. 4

60 0 56

0,1

50

1,0

44

10,0

40

Fr. 5

60 0 66

0,1

62

1,0

55

10,0

51

Control Positivo T (Ketotifeno)

5 0 43

0,01

41

0,1

32

1,0

18

Como resultados del experimento, mostrados en la anterior Tabla 8, las fracciones tuvieron excelentes actividades en conjunto y, particularmente, Fr. 3 mostro la actividad antihistammica mas excelente.

3-6. Analisis de compuestos de extracto de Rhizoma Coptidis

5 Con el fin de analizar los compuestos de los extractos de Rhizoma Coptidis y las fracciones de los mismos de los anteriores Ejemplos, se llevaron a cabo experimentos usando analisis fisicoqmmicos tales como HPLC, LC/MS, Espectrometro de UV y FT-NMR.

Como resultados, se identifico que berberina, palmatina, coptisina, columbamina y jatrorrizina estan contenidas en el extracto de Rhizoma Coptidis. Se analizaron los contenidos de compuestos de los extractos de Coptidis de los 10 Ejemplos 1-1 a 1-4, cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 9.

La cromatograffa lfquida de alta resolucion se midio usando el modelo Alliance 2695 de Waters usando PDA 2996 de Waters. Como columna, se uso Hydrosphere C18 de YMC, S-5 pm, 120 mm, 4,6x250 mm D.I., y la temperatura de la muestra se mantuvo a 25 °C ± 1 y la temperatura de la columna se mantuvo a 30 °C ± 1. Una concentracion de la muestra fue de 1 mg/ml, la cantidad de inyeccion fue de 10 pl y el caudal fue de 1,0 ml/min. Como materiales 15 patron, para berberina, palmatina y coptisina, se compraron los comercializados por Sigma Company y se usaron y, para columbamina y jatrorrizina, se usaron los purificados de Rhizoma Coptidis. La fase movil fue el estado de gradiente de solucion de acido fosforico al 0,2 % (disolvente A) y metanol (disolvente B) de 0~60 minutos (A:B=9:1 ~ 6:4), 60~70 minutos (A:B =6:4 ~ 5:5), 70~90 minutos (A:A=5:5 ~ 0:10). Los contenidos de los compuestos en los extractos se indican por la proporcion de area para cada material patron en porcentaje en peso.

20 Tabla 9

Contenidos de compuestos (%)

Berberina palmatina coptisina columbamina jatrorrizina

Eiemplo 1-1

CR-GA 15,6 4,2 4,3 0,6 0,6

CR-GA-1 25,3 4,5 4,7 0,6 0,5

Ejemplo 1-2

CR-GB 22,8 5,6 6,5 1,5 0,9

CR-GB-1 27,0 7,1 5,2 0,9 0,8

Ejemplo 1-3

CR-GC 30,9 7,8 6,2 1,1 1,0

Ejemplo 1-4

Fr. 1 0,5 0,2 0,1 0,1 0,1

Fr. 2

10,1 6,7 0,8 0,1 0,1

Fr. 3

47,0 21,4 3,7 3,2 1,5

Fr. 4

5,2 1,4 18,0 0,1 2,6

Fr. 5

0,1 o menos 0,1 o menos 0,1 o menos 0,1 o menos 0,1 o menos

Como se muestra en la anterior Tabla 9, como resultados de la comparacion de los contenidos de los compuestos principales de acuerdo con los extractos y fracciones, se identifico que estaban contenidas 0,5 a 47,0 partes en peso

5

10

15

20

25

30

de berberina, 0,2 a 21,4 partes en peso de palmatina, 0,1 a 18,0 partes en peso de coptisina, 0,1 a 3,2 partes en peso de columbamina y 0,1 a 2,6 partes en peso de jatrorrizina.

3-7. Medicion de la actividad expectorante de berberina

Con el fin de medir la actividades expectorantes de los extractos de Rhizoma Coptidis de los Ejemplos 1-2 y 1-3 y las 5 subfracciones preparadas en el Ejemplo 1-4, se llevo a cabo el mismo experimento para la actividad expectorante que el anterior Experimento 1, cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 10, y se muestra una grafica de barras para las actividades en la Figura 1.

Tabla 10

dosis (mg/kg) Capacidad para secretar esputo (%)

Fr. 1

125 25

Fr. 2

125 22

Fr. 3

125 44

Fr. 4

125 24

Fr. 5

125 10

CR-GB Ejemplo 1-2

125 32

CR-GB-1 del Ejemplo 1-2

125 38

CR-GC del Ejemplo 1-3

125 37

Berberina

125 39

Control Positivo

| Ambroxol 250 34

Ejemplo 4: Ensayo de actividad del extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra

4-1. Medicion de la actividad expectorante

Con el fin de evaluar las actividades expectorantes del extracto combinado y el extracto sencillo preparado en el Ejemplo 2 (2-1 a 2-11), el experimento se llevo a cabo mediante el mismo metodo descrito en el “Metodo del Experimento” del Experimento 3-1, usando el metodo de Engler, et al., (Enler H., Szeleny I., J Pharmacol. Moth. 11, 151 ~157, 1984, Bao-quin Lin et., Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 21, 259-263, 2008), cuyos resultados se muestran en la Figura 2. En la Figura 2, para el control positivo, el Ambroxol se administro oralmente a una dosis de 250 mg/kg y el resto de farmacos de ensayo se administraron oralmente a una dosis de 500 mg/kg. Y, para el extracto del Ejemplo 2-7 que muestra la actividad mas excelente, las actividades expectorantes se midieron de acuerdo con la dosis, cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 11.

Tabla 11

dosis (mg/kg) Capacidad de secretar esputo (%)

Ejemplo 2-7

50 17

100 30

150 38

200 44

500 56

Control Positivo

| Ambroxol 250 34

Como se muestra en la Figura 2, todos los extractos combinados de los Ejemplos 2-1 a 2-11 presentaron efectos expectorantes mejorados comparados con el extracto de hoja de hiedra, del cual se puede identificar que la sinergia para la actividad farmacologica ocurre por combinacion de extracto de Rhizoma Coptidis y extracto de hoja de hiedra.

Particularmente, los Ejemplos 2-3 a 2-9 presentaron efectos expectorantes mas excelentes que el expectorante existente Ambroxol, de lo cual se muestra que si el extracto de hoja de hiedra y el extracto de Rhizoma Coptidis se combinan en una relacion en peso de 1:1 a 4:1, se pueden obtener efectos expectorantes incrementados.

La anterior Tabla 11 muestra los resultados de evaluaciones para las actividades del Ejemplo 2-7 que tiene la mayor actividad de acuerdo con la dosis, y se identifica que el material del Ejemplo 2-7 tiene capacidad mas excelente para secretar esputo que el farmaco de control positivo. Particularmente, el material del Ejemplo 2-7 presenta efecto similar al control positivo a una dosis de 100 mg/kg o mas, y efecto mas excelente que el control positivo a una dosis de 150 mg/kg o mas.

4-2. Medicion de la actividad antitusiva

5

10

15

20

25

30

Con el fin de medir las actividades antitusivas del extracto de hoja de hiedra y el extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra (Ejemplos 2-1 a 2-11) preparado en el Ejemplo 2, se llevo a cabo el experimento mediante el mismo metodo descrito en el “Metodo del Experimento” en el Experimento 3-2 usando el metodo de Tanaka et al. (Motomu Tanaka y Kei Maruyama, J. Pharmacol. Sci. 93, 465~470, 2003, Daoui, Cognon, Naline et. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 158, 42~48, 1998), cuyos resultados se muestran en la Figura 3.

En la Figura 3, para el control positivo, Teobromina, se administro oralmente a una concentracion de 50 mg/kg y el resto de los farmacos de ensayo se administraron oralmente a una concentracion de 200 mg/kg. Y, para el Ejemplo 2-7 que muestra la actividad mas excelente, se evaluaron las actividades antitusivas de acuerdo con la dosis, cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 12.

Tabla 12

dosis (mg/kg) Capacidad para suprimir la tos (%)

Ejemplo 2-7

50 29

100 51

150 69

200 83

Control positivo

Teobromina 50 56

Como se muestra en la Figura 3, todos los extractos combinados de los Ejemplos 2-1 a 2-11 presentaron efectos antitusivos incrementados que el extracto de hoja de hiedra solo, de lo cual se identifica que ocurre una sinergia para la actividad farmacologica por la combinacion del extracto de Rhizoma Coptidis con extracto de hoja de hiedra. Particularmente, los Ejemplos 2-3 a 2-9 presentaron efectos antitusivos mas excelentes que el antitusivo existente Teobromina, de lo cual se muestra que si se combinan el extracto de hoja de hiedra y el extracto de Rhizoma Coptidis en una relacion en peso de 1:1 a 4:1, se pueden obtener efectos antitusivos mas excelentes.

Y, la anterior Tabla 12 muestra los resultados de evaluacion para actividades del Ejemplo 2-7 que tiene la mayor actividad de acuerdo con la dosis, de lo cual se muestra que el material del Ejemplo 2-7 presenta efecto similar para el control positivo a una dosis de 100 mg/kg o mas y efecto mas excelente que el control positivo a una dosis de 150 mg/kg.

4-3. Medicion del efecto antihistammico

Con el fin de medir el efecto antihistammico del extracto de hoja de hiedra, y el extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra (Ejemplos 2-1 a 2-11) preparado en el Ejemplo 2 en mastocitos, se llevo a cabo el experimento mediante el mismo metodo descrito en el “Metodo del Experimento” en el Experimento 3-3 usando el metodo de Honuchi et al. (Masako Honuchi y Yoshiyuki Seyma, J. Health Sci, 52(6), 711 ~717, 2006, Naoki Inagaki et. Biol. Pharm. Bull. 24(7), 829~834, 2001), cuyos resultados se presentan en la siguiente Tabla 13. Y, para el Ejemplo 2-7 que muestra la actividad mas excelente, se midieron los efectos antihistammicos de acuerdo con la dosis y los resultados se presentan en la siguiente Tabla 14.

Tabla 13

Dosis oral (mg/kg) Concentracion de tratamiento de mastocitos (mg/ml) Cantidad de liberacion de histamina (%)

Ejemplo 2-1

200 0 48

0,1

42

1,0

39

10,0

32

Ejemplo 2-2

200 0 47

0,1

41

1,0

38

10,0

31

Ejemplo 2-3

200 0 41

0,1

37

1,0

34

Dosis oral (mg/kg) Concentracion de tratamiento de mastocitos (mg/ml) Cantidad de liberacion de histamina (%)

10,0 28

Ejemplo 2-4

200 0 39

0,1

37

1,0

33

10,0

26

Ejemplo 2-5

200 0 37

0,1

34

1,0

31

10,0

25

Ejemplo 2-6

200 0 36

0,1

34

1,0

31

10,0

24

Ejemplo 2-7

200 0 34

0,1

32

1,0

29

10,0

20

Ejemplo 2-8

200 0 35

0,1

33

1,0

30

10,0

22

Ejemplo 2-9

200 0 38

0,1

35

1,0

31

10,0

27

Ejemplo 2-10

200 0 42

0,1

39

1,0

36

10,0

31

Ejemplo 2-11

200 0 49

0,1

44

1,0

39

10,0

30

Extracto de hoja de hiedra

200 0 45

0,1

40

1,0

35

10,0

34

Control positivo

Ketotifeno 5 0 44

0,01

41

0,1

32

1,0

19

5

10

15

20

25

Dosis oral (mg/kg) Concentracion de tratamiento de mastocitos (mg/ml) Cantidad de liberacion de histamina (%)

Ejemplo 2-7

100 0 49

0,1

39

1,0

35

10,0

34

200

0 34

0,1

32

1,0

29

10,0

20

400

0 21

0,1

18

1,0

17

10,0

17

Extracto de hoja de hiedra

200 0 45

0,1

40

1,0

35

10,0

34

Control positivo

Ketotifeno 5 0 44

0,01

41

0,1

32

1,0

19

Como se muestra en la Tabla 13, se identifica que el extracto de hoja de hiedra y los extractos combinados de los Ejemplos 2-1 a 2-11 tienen efecto antihistammico. Particularmente, se muestra que si se combinan el extracto de hoja de hiedra y el extracto de Rhizoma Coptidis que presentan respectivamente actividad antihistammica, ocurre sinergia. Y, la anterior Tabla 14 muestra los resultados de evaluacion del Ejemplo 2-7 que tiene la actividad mas excelente de acuerdo con la dosis, y se muestra que el material del Ejemplo 2-7 presentan actividad antihistammica excelente.

4-4. Experimento para la supresion de broncoconstriccion (in vitro)

Con el fin de medir los efectos de supresion de broncoconstriccion del extracto de hoja de hiedra y los extractos combinados de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra (Ejemplos 2-1 a 2-11) preparados en el Ejemplo 2, se llevo a cabo el experimento usando el metodo de Casoni GL et al. (Clin Exp Allergy., 33, 999-1004, 2003, Anesth Analg., 89, 191-196, 1999, Br J Pharmacol., 128, 577-584, 1999) en el siguiente procedimiento.

Se administro intraperitonealmente pentobarbital de sodio (75/ mg/kg) a conejillos de indias Hartely macho (350-400 g, Daechan Biolink) para anestesiarlo y, a continuacion, se extrajo la traquea. La traquea extrafda se corto a aproximadamente 3 ~ 5 mm en solucion de Krebs-Henseleit para dividirla en segmentos y, a continuacion, se fijo en un bano de organo y se perfundio con histamina 10-4 M para contraer la traquea extrafda. Y, a continuacion, se anadio el material del experimento (0,50 mg/ml) al mismo para medir el cambio en el grado de tension de la traquea extrafda. Como farmaco de control positivo, se uso dihidrato de nitroprusiato de sodio a una concentracion de 2,6x10-5 mg/ml. Al suponer que la contraccion inducida por histamina 10-4 M como el 100%, las tasas de relajamiento (%) de los grupos administrados con material del experimento y el grupo administrado con farmaco de control positivo se calcularon restando la tasa de relajamiento (%) del grupo de control con excipiente a la tasa de relajamiento (%) del grupo administrado con material del experimento y el grupo administrado con farmaco de control positivo obtenido bajo las mismas condiciones. Las tasas de relajacion de bronquios calculadas (actividad de supresion de broncoconstriccion) se mostraron en la Figura 4 y para el Ejemplo 2-7 que muestra la actividad mas excelente, se midieron las tasas de relajamiento de traquea de acuerdo con la dosis y los resultados se presentan en la siguiente Tabla 15.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

concentracion (mg/ml) rtasa de relajamiento de bronquios (%)

Ejemplo 2-7

0,25 20

0,50

48

1,00

83

Grupo control CMD ... SNP positivo

2,6x10-5 30

Como se muestra en la Figura 4, se identifica que el extracto de hoja de hiedra y los extractos combinados de los Ejemplos 2-1 a 2-11 tienen efecto de supresion de broncoconstriccion. Y, se muestra que todos los extractos combinados de los ejemplos 2-1 a 2-11 presentan supresion mas incrementada de broncoconstriccion que el extracto de hoja de hiedra solo. La anterior Tabla 15 muestra los resultados de la evaluacion de las actividades del Ejemplo 2-7 que tiene las actividades mas excelentes de acuerdo con la dosis, a partir de lo cual se muestra que el material del Ejemplo 2-7 presenta excelente supresion de broncoconstriccion.

4-5. Experimento para el efecto antiasmatico usando un modelo de asma murino

Con el fin de confirmar el efecto antiasmatico usando un modelo de asma murino del extracto combinado del Ejemplo 2-7 que mostro los efectos mas excelentes en los Experimentos 4-1 a 4-4, el experimento se llevo a cabo usando el metodo Tang M.L.K. et al. (Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 14, 203-210, 2001, Immunology and Cell Biology 79, 141-144, 2001, Journal of Experimental Medicine 189(10), 1.621-1.629, 1999). Y, para la evaluacion, se llevaron a cabo el examen de hipersensibilidad de vfas respiratorias (AHR, del ingles “Airway Hiper- Responsiveness”) para metacolina, examen del valor de IgE en plasma sangumeo, examen del numero de celulas y la distribucion de globulos blancos en fluido de lavado broncoalveolar (BALF, del ingles “Bronchoalveolar Lavage Fluid”), observacion del tejido pulmonar y RT-PCR (IL-1p, IL-4, IL-13r2a).

Metodo del Experimento

A un raton Balb/c (18 ~ 21 g, Orientbio Inc.), se administro intraperitonealmente una solucion de ovalbumina (OVA, Sigma) para inyeccion intraperitoneal en una cantidad de 500 ul (20 ug como OVA) por un raton en el Dfa 0 y el Dfa 7 y se sensibilizo con una solucion preparada para inhalacion de OVA usando un nebulizador (NE-U17, OMRON Co. Ltd, Japon) y, a continuacion, se inhalo diariamente la solucion de OVA al 5 % preparada durante 30 minutos desde el Dfa 14 al Dfa 20. Como farmaco de control positivo, se usaron 30 mg/kg de Montelukast sodio y todos los materiales del experimento se usaron en una cantidad de 200 mg/kg. Y, se administraron oralmente el farmaco de control positivo y los materiales del experimento diariamente una hora antes de la inhalacion de OVA durante 7 dfas desde el Dfa 14 al Dfa 20 despues de la sensibilizacion y, a continuacion, se llevaron a cabo los experimentos mediante los siguientes puntos de evaluacion.

1) Examen de la hipersensibilidad de vfas respiratorias (AHR) a metacolina

24 horas despues de la inhalacion final de OVA (en el Dfa 21), se coloco el raton en un pletismografo de cuerpo completo (BUXCO, EE.UU.), se tomaron cada 0,4 ml de soluciones de metacolina de las concentraciones de 0, 10 y 20 mg/ml para introducirlas en un aerosol y se administraron por inhalacion al raton respectivamente durante 3 minutos. Y, se midieron los Penh durante 4 minutos a partir del tiempo de inhalacion y el valor promedio se ajusto como Penh (pausa mejorada) a la dosis correspondiente de metacolina.

2) Examen del valor de IgE en plasma sangumeo (Dfa 21)

Para el animal medido de acuerdo con 1), se recogio aproximadamente 0,05 ml de sangre por muestreo sangumeo orbital y se centrifugo y el plasma obtenido se dividio en dos partes y se diluyo a 1:10 para examinar el valor de inmunoglobulina E (IgE) en plasma a traves del analisis inmunoabsorbente ligado a enzima IgE (ELISA; kit de ELISA IgE para raton, ME-151, SHIBAYAGI Co., Ltd., JAPON).

3) Examen del numero de celulas y la distribucion de globulos blancos en fluido de lavado broncoalveolar (BALF) (Dfa 22)

A los animales cuya sangre se muestreo de acuerdo con 2), se inyecto intraperitonealmente pentotal sodico (50 mg/kg) para anestesiarlo. Y, a continuacion, mientras se fijo el pulmon izquierdo con pinzas, 0,4 ml de solucion PBS se inyecto en el bronquio y pulmon y, a continuacion, se extrajo y se tomo su solucion lavada , lo cual se repitio tres veces. Y, se centrifugo la solucion a 1.500 g y se desecho el sobrenadante y, a continuacion, se anadio 0,2 ml de PBS al precipitado para volverlo a suspender. Para la suspension, se midieron los numeros de leucocitos, neutrofilos, eosinofilos y linfocitos totales usando analizadores de hematologfa automaticos (Contador Coulter Advia 120, BAYER, Alemania).

4) Observacion del tejido pulmonar

l pulmon izquierdo fijado con una pinza se extrajo y se fijo con una solucion de formalina al 10 % durante un dfa y, a continuacion, tejido penetrado con parafina usando un procesador de tejido se corto a un grosor de 3-4 um usando un microtomo para obtener fragmentos de tejido. El corte preparado se tino con eosina y el portaobjetos se cubrio 5 con balsamo y se observo con un microscopio para examinar el grado de oclusion de bronquiolo e infiltracion de celulas inflamatorias.

5) RT-PCR

El tejido pulmonar derecho se quito rapidamente y se guardo a -80 °C antes del experimento. Se separo ARN del tejido usando RNA-Bee (Tel-Test Inc. EE.UU.) y el ARN separado se cuantifico a 260 nm usando un espectrometro 10 y, a continuacion, 4 ug de ARN y Oligo dT 2 ul (Promega), se anadio agua DEPC para formar 10 ul y la mezcla se hizo reaccionar a 65 °C durante 5 minutos. Y, a continuacion, se introdujeron 5x 5 ul de tampon de reaccion + 2 ul de RTasa + 5 ul de dNTP + 1 ul de inhibidor de RNasa + 2 ul de agua DEPC, y los 25 ul totales de una mezcla se hicieron reaccionar a 42 °C durante 1 hora y a 100 °C durante 5 minutos para preparar ADNc. Todos los reactivos usados se compraron a PROMEGA. Se llevo a cabo una PCR con iniciadores preparados (IL-1p, IL-4, IL-13r2a). Los 15 iniciadores usados son los siguientes:

IL-1P sentido: 5'-TCATGGGATGATGATGATAACCTGCT-3' (Secuencia N° 1),

IL-1P antisentido: 5'-CCCATACTTTAGGAAGACACGGATT-3' (Secuencia N° 2);

IL-4 sentido: 5'-TCATCGGCATTTTGAACGAG-3' (secuencia N° 3),

IL-4 antisentido: 5'-GAATCCAGGCATCGAAAAGC-3' (Secuencia N° 4);

20 IL-13r2a sentido: 5'-GGTTATGCCAAATGCACTTGAG-3' (Secuencia N° 5),

IL-13r2a antisentido: 5'-ATGGCTTTTTGTGCATATCAGAT-3' (Secuencia N° 6).

Las condiciones de la PCR son 32 ciclos de 94 °C 30 segundos, 56 °C 30 segundos y 72 °C 1 minuto. El reactivo de PCR se sometio a electroforesis en un gel de agarosa al 2 % y se tino con BrEt y, a continuacion, se irradio UV y se comparo la densidad y se dividio por densidad de actina para analizar el valor.

25 Resultados del Experimental

1) Examen de la hipersensibilidad de vfas respiratorias (AHR) a metacolina

La hipersensibilidad a metacolina de Montelukast (del DR. Reddy) usado como farmaco de control positivo, extracto de hoja de hiedra y los extractos combinados de los Ejemplos 2-7 se presentan en la siguiente Tabla 16.

Tabla 16

Valor de Penh de acuerdo con la dosis de metacolina

0 mg/ml

10 mg/ml 20 mg/ml

Grupo normal

1,2±0,1 1,7±0,2 6,0±2,4

Grupo inducido

1,5±0,2 14,3±3,0 29,7±12,2

Ejemplos 2-7 (200 mg/kg)

1,5±0,2 7,5±2,1 15±4,9

Extracto de hoja de hiedra (200 mg/kg)

1,4±0,2 8,2±2,5 18,1±5,9

Control Montelukast positivo (30 mg/kg)

1,5±0,2 8,4±2,4 19,8±5,4

30 Como se muestra en la anterior Tabla 16, los extractos combinados de los Ejemplos 2-7 presentan efecto mas excelente para suprimir la hipersensibilidad de vfas respiratorias que el extracto de hoja de hiedra solo.

2) Examen del valor de IgE en plasma

Los valores de IgE en plasma de Montelukast (del Dr. Reddy) usado como farmaco de control positivo, extracto de hoja de hiedra y los extractos combinados de los Ejemplos 2-7 de acuerdo con las concentraciones se presentan en 35 la siguiente Tabla 17.

Tabla 17

Nivel de IgE (ng/ml)

Grupo normal

0,6±0,2

Grupo inducido

19,7±6,1

Ejemplos 2-7 (200 mg/kg)

9,6±3,2

Extracto de hoja de hiedra (200 mg/kg)

11,0±4,8

Control Positivo

Montelukast (30 mg/kg) 13,7±5,7

Como muestra la anterior Tabla 17, el grupo que recibe los materiales de los Ejemplos 2-7 de la presente invencion tiene valor IgE inferior, que media la inflamacion, que el grupo que recibe el extracto de hoja de hiedra solo y el grupo que recibe farmaco de control positivo.

5 3) El numero de celulas en el fluido de lavado broncoalveolar (BALF)

LLos numeros de neutrofilos y eosinofilos en el fluido de lavado broncoalveolar (BALF) de montelukast (del Dr. Reddy) usada como farmaco de control positivo, extracto de hoja de hiedra, y los extractos combinados de los ejemplos 2-7 de acuerdo con las concentraciones se presentan en la siguiente tabla 18.

Tabla 18

WCGB (x103 celulas)

NEU

EOS

Grupo Normal

16,3±3,4 4,7±2,7

Grupo Inducido

24,0±6,1 414,7±168,2

Ejemplos 2-7 (200 mg/kg)

16,3±11,3 296,7±300,1

Extracto de hoja de hiedra (200 mg/kg)

18,7±7,1 369,3±232,2

Control positivo Montelukast (30 mg/kg)

22,3±7,2 466,0±207,0

10

Como se muestra en la anterior Tabla 18, el grupo que recibe los materiales de los Ejemplos 2-7 tiene conteo inferior de globulos blancos relacionados con la inflamacion (neutrofilos, eosinofilos) que el grupo que recibe el extracto de hoja de hiedra solo y el grupo que recibe el farmaco de control positivo.

4) Observacion del tejido pulmonar

15 Los grados de oclusion de bronquiolo e infiltracion de celulas inflamatorias de Montelukast usado como farmaco de control positivo, extracto de hoja de hiedra y los extractos combinados de los Ejemplos 2-7 de acuerdo con las concentraciones se presentan en la siguiente Tabla 19 y las fotograffas del tejido pulmonar tenido por tincion de H&E se muestran en la Figura 5. ((a) grupo normal, (b) grupo inducido, (c) grupo de control positivo, (d) Ejemplos 2-7). En la siguiente Tabla 19, 1=No, 2=ligero, 3=delgado, 4=moderado, 5=grueso de acuerdo con los grados de oclusion e 20 infiltracion de celulas inflamatorias.

Tabla 19

Observacion microscopica

Grado de oclusion de bronquios

Grado de infiltracion de celulas inflamatorias

Grupo Normal

0±0 0±0

Grupo Inducido

3,3±0,5 3,8±0,4

Ejemplos 2-7 (200 mg/kg)

1,8±0,4 1,9±0,4

Extracto de hoja de hiedra (200 mg/kg)

2,0±0,0 2,3±0,5

Control positivo Montelukast (30 mg/kg)

3,5±0,5 3,7±0,5

Como se muestra en la anterior Tabla 19, los extractos combinados de los Ejemplos 2-7 presentan efecto mas excelente para suprimir la oclusion de bronquios y la infiltracion de celulas inflamatorias que el extracto de hoja de 25 hiedra y farmaco de control positivo.

5) RT-PCR

Las tasas de expresion de citoquinas mediadoras de la inflamacion (IL-1p, IL-4, IL-13r2a) de Montelukast usado como farmaco de control positivo y los materiales del experimento de los Ejemplos 2-7 de acuerdo con las concentraciones se presentan en la siguiente Tabla 20. En la Tabla 20, cada valor se obtiene dividiendo la densidad 30 de cada citoquina de acuerdo con la irradiacion de UV por la densidad de actina.

Grado de expresion de citoquina

IL-1P

IL-4 IL-13r2a

Grupo Normal

0,58±0,27 0,58±0,21 0,56±0,49

Grupo Inducido

0,94±0,39 1,96±0,98 1,20±0,67

Ejemplos 2-7 (200 mg/kg)

0,16±0,74 0,83±0,67 0,29±0,96

Extracto de hoja de hiedra (200 mg/kg)

1,21±0,62 0,14±0,70 0,60±0,70

Control Montelukast positivo (30 mg/kg)

0,51±0,26 1,47±0,48 0,37±0,31

Como se muestra en la anterior Tabla 20, en el grupo que recibe los materiales de los Ejemplos 2-7, la expresion de citoquinas mediadoras de la inflamacion (IL-1p, IL-4, IL-13r2a) se suprime mas en comparacion con el grupo que recibe el extracto de hoja de hiedra solo y el grupo que recibe el farmaco de control positivo.

5 Ejemplo 5. Formulacion del extracto de Rhizoma Coptidis

5-1. Preparacion de polvo

El extracto de Rhizoma Coptidis (Ejemplo 1-1) 20 mg

Lactosa 100 mg

Talco 10 mg

Los ingredientes anteriores se mezclaron y llenaron en un saco sellado para preparar un polvo.

5-2. Preparacion de comprimido

El extracto de Rhizoma Coptidis (Ejemplo 1-2)

10 mg

Almidon de ma^z

100 mg

Lactosa

100 mg

Estearato de magnesio

2 mg

Los ingredientes anteriores se mezclaron y se comprimieron por el metodo comun de preparacion de comprimidos 10 para preparar un comprimido.

5-3. Preparacion de capsula

El extracto de Rhizoma Coptidis (Ejemplo 1-3)

10 mg

Celulosa cristalina

3 mg

Lactosa

14,8 mg

Estearato de magnesio

0,2 mg

Los ingredientes anteriores se mezclaron por el metodo comun de preparacion de capsulas y se llenaron en una

capsula de gelatina para preparar una capsula.

5-4. Preparacion de inyeccion

El extracto de Rhizoma Coptidis (Ejemplo 1-4) 10 mg

Manitol 180 mg

Agua esteril para inyeccion 2.974 mg

Na2HPO4, 12H2O 26 mg

5

Se preparo una ampolleta (2 ml) con los contenidos anteriores de los ingredientes por el metodo comun de preparacion de inyeccion.

5-5. Preparacion de solucion

El extracto de Rhizoma Coptidis (Ejemplo 1-1)

20 mg

Jarabe de mafz con alto contenido de Fructosa

10 mg

Manitol

5 mg

Agua purificada

cantidad adecuada

De acuerdo con el metodo comun de preparacion de solucion, cada ingrediente se anadio a agua purificada y se disolvio en la misma y se anadio limon a la misma en una cantidad adecuada. Y, a continuacion, los ingredientes anteriores se mezclaron y se anadio agua purificada a la misma de manera que la cantidad total llego a ser de 100 ml y se lleno en una botella marron y se esterilizo para preparar una solucion.

5-6. Preparacion de alimento saludable

El extracto de Rhizoma Coptidis (Ejemplo 1-2)

1.000 mg

Acetato de vitamina A

70 pg

Vitamina E

1,0 mg

Vitamina B1

0,13 mg

Vitamina B2

0,15 mg

Vitamina B6

0,5 mg

Vitamina B12

0,2 Mg

Vitamina C

10 mg

Biotina

10 Mg

Amida de acido nicotmico

1,7 mg

Acido folico

50 Mg

Pantotenato de calcio

0,5 mg

Mezcla de minerales

cantidad adecuada

Sulfato ferroso

1,75 mg

Oxido de zinc

0,82 mg

Carbonato de magnesio

25,3 mg

Fosfato de potasio monobasico

15 mg

Fosfato de calcio dibasico

55 mg

Citrato de potasio

90 mg

Carbonato de calcio

100 mg

Cloruro de magnesio

24,8 mg

Las relaciones anteriores de vitaminas y mezcla de minerales ilustran un ejemplo preferible de mezcla de ingredientes relativamente adecuada para alimento saludable; sin embargo, se pueden modificar las relaciones. Y los ingredientes anteriores se pueden mezclar de acuerdo con un metodo comun de preparacion de alimentos saludables y, a continuacion, formarse como un granulo y usarse para la preparacion de una composicion de alimento saludable por el metodo comun.

5-7. Preparacion de bebida saludable

El extracto de Rhizoma Coptidis (Ejemplo 1-3) 1.000 mg

Acido cftrico 1.000 mg

Oligosacarido 100 g

Concentrado de albaricoque japones 2 g

Taurina 1 g

Agua purificada anadida de manera que alcanza una cantidad total de 900 ml

Los ingredientes anteriores se mezclaron de acuerdo con un metodo comun de preparacion de bebidas saludables y se calentaron con agitacion a 85 °C durante aproximadamente 1 hora y, a continuacion, la solucion preparada se filtro para recoger en un recipiente de 2 l esterilizado, se esterilizo con sello y se almaceno con refrigeracion.

as relaciones anteriores ilustran un ejemplo preferible de mezcla de ingredientes relativamente adecuada para una 5 bebida favorita; sin embargo, puede modificarse de acuerdo con el gusto regional y etnico tal como una clase de demanda, un pafs de demanda, uso, etc.

Ejemplo 6. Formulacion del extracto combinado de Rhizoma Coptidis con hoja de hiedra

6-1. Preparacion de comprimido

200 mg del extracto combinado del Ejemplo 2-7, 10 mg de acido silfcico anhidro ligero, 2 mg de estearato de 10 magnesio, 50 mg de celulosa microcristalina, 25 mg de acido glicolico de sodio de almidon, 113 mg de almidon de mafz y cantidad adecuada de etanol anhidro se mezclaron y se comprimieron en un comprimido por un metodo comun.

6-2. Preparacion de alimento saludable

Extracto combinado (Ejemplo 2-7)

Acetato de vitamina A

Vitamina E

Vitamina B1

Vitamina B2

Vitamina B6

Vitamina B12

Vitamina C

Biotina

Amida de acido nicotmico Acido folico Pantotenato de calcio Mezcla de minerales Sulfato ferroso Oxido de zinc Carbonato de magnesio Fosfato de potasio monobasico Fosfato de calcio dibasico

1.000 mg 70 pg

1.0 mg 0,13 mg 0,15 mg 0,5 mg 0,2 Mg 10 mg 10 Mg 1,7 mg

50 Mg 0,5 mg

cantidad adecuada

1,75 mg

0,82 mg

25,3 mg

15 mg

55 mg

Citrato de potasio 90 mg

Carbonato de calcio 100 mg

Cloruro de magnesio 24,8 mg

Las relaciones anteriores de vitamina y mezcla de minerales ilustran un ejemplo preferible de mezcla de ingredientes 15 relativamente adecuada para un alimento saludable; sin embargo, se pueden modificar las relaciones. Y los

ingredientes anteriores se pueden mezclar por un metodo comun de preparacion de alimento saludable y, por tanto, formarse como un granulo y usarse para la preparacion de alimento saludable por el metodo comun.

6-3. Preparacion de bebida saludable

Extracto combinado (Ejemplo 2-7) 1.000 mg

Acido cftrico 1.000 mg

Oligosacarido 100 g

Concentrado de albaricoque japones 2 g

Taurina 1 g

Agua purificada anadida de manera que alcanza una cantidad total de 900 ml

Los ingredientes anteriores se mezclaron por un metodo comun de preparacion de bebida saludable y, a 5 continuacion, se calentaron con agitacion a 85 °C durante aproximadamente 1 hora y, a continuacion, la solucion obtenida se filtro y se introdujo en un recipiente de 2 l esterilizado, y se esterilizo con sello y se almaceno con refrigeracion.

Las relaciones anteriores ilustran un ejemplo preferible de mezcla de ingredientes relativamente adecuada para una bebida favorita; sin embargo, las relaciones se pueden modificar de acuerdo con el gusto regional y etnico tal como 10 una clase de demanda, un pafs de demanda, uso, etc.

Los ingredientes anteriores se mezclaron por un metodo comun de preparacion de bebida saludable y, a continuacion, se calentaron con agitacion a 85 °C durante aproximadamente 1 hora y, a continuacion, la solucion obtenida se filtro y se introdujo en un recipiente de 2 l esterilizado, y se esterilizo con sello y se almaceno con refrigeracion.

15 Las relaciones anteriores ilustran un ejemplo preferible de mezcla de ingredientes relativamente adecuada para una bebida favorita; sin embargo, las relaciones se pueden modificar de acuerdo con el gusto regional y etnico tal como una clase de demanda, un pafs de demanda, uso, etc.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende un extracto de Rhizoma Coptidis como principio activo para su uso en la supresion de tos o eliminacion de esputo, en la que el extracto de Rhizoma Coptidis es un extracto crudo que se obtiene usando uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos o una solucion acuosa de alcohol C1-4 como disolvente de extraccion, o un extracto soluble en disolvente que se obtiene anadiendo una solucion acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos al extracto crudo.
2. 2. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion ademas comprende un extracto de hoja de hiedra y la composicion esta en forma de un extracto combinado de Rhizoma Coptidis y hoja de hiedra, en la que el extracto de hoja de hidra es un extracto crudo que se obtiene usando uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos como disolventes de extraccion, o un extracto soluble en disolvente que se obtiene anadiendo una solucion acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos al extracto crudo.
3. 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que la relacion en peso del extracto de hoja de hiedra y el extracto de Rhizoma Coptidis es de 0,1:1 a 10:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de extracto de Rhizoma Coptidis), preferiblemente 0,2:1 a 5:1.
4. 4. Una composicion que comprende una combinacion de un extracto de Rhizoma Coptidis y un extracto de hoja de hiedra como principio activo para su uso en la prevencion o tratamiento de una enfermedad respiratoria, y la composicion esta en forma de un extracto combinado de Rhizoma Coptidis y hoja de hiedra
5. 5. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que la relacion en peso del extracto de hoja de hiedra y el extracto de Rhizoma Coptidis es de 0,1:1 a 10:1 (el peso de extracto de hoja de hiedra:el peso de extracto de Rhizoma Coptidis) preferiblemente 0,2:1 a 5:1
6. 6. La composicion para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en la que la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en enfisema pulmonar, bronquitis, asma, broncoconstriccion cronica o aguda, smdrome infantil estriduloso, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, adenoma bronquial, nodulo pulmonar solitario, tuberculosis pulmonar, piotorax, absceso pulmonar, resfriado comun, gripe e histiocitosis pulmonar.
7. 7. La composicion para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que el extracto es un extracto crudo que se obtiene usando uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en agua y alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos como disolvente de extraccion, o un extracto soluble en disolvente que se obtiene anadiendo al extracto crudo una solucion acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos.
8. 8. La composicion para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composicion se formula en polvo, granulo, comprimido, capsula, suspension, emulsion, jarabe, aerosol, agente transdermico, supositorio o solucion de inyeccion esteril.
9. 9. Una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la preparacion de un alimento funcional saludable para prevenir o mejorar la enfermedad respiratoria.
10. 10. Una composicion para su uso como antitusivo o expectorante, que comprende un extracto de Rhizoma Coptidis como principio activo, en la que el extracto de Rhizoma Coptidis es un extracto crudo que se obtiene usando uno o mas disolventes seleccionados del grupo que consiste en alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 4 carbonos o una solucion acuosa de alcohol C1-4 como disolvente de extraccion, o un extracto soluble en disolvente que se obtiene anadiendo una solucion acuosa de alcohol lineal o ramificado que tiene 1 a 6 carbonos al extracto crudo.
11. 11. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la composicion comprende ademas cualquiera de las caractensticas enumeradas en las reivindicaciones 2 o 3.
12. 12. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10 o 11, en la que la dosis de la composicion por dfa es de 0,5 a 500 mg/kg, basado en la cantidad del principio activo.
13. 13. Una composicion para su uso en el tratamiento o prevencion de una enfermedad respiratoria, que comprende una combinacion de un extracto de Rhizoma Coptidis y un extracto de hoja de hiedra como principio activo, y la composicion se administra en forma de un extracto combinado de Rhizoma Coptidis y hoja de hiedra.
14. 14. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que la composicion comprende ademas cualquiera de las caractensticas enumeradas en la reivindicacion 5 o 12.
15. 15. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en enfisema pulmonar, bronquitis, asma, broncoconstriccion cronica o aguda, smdrome infantil estriduloso, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, adenoma bronquial, nodulo pulmonar solitario, tuberculosis pulmonar, piotorax, absceso pulmonar, resfriado comun, gripe e histiocitosis pulmonar.