KR101418061B1 - 성상교세포의 글루타메이트 방출 기작 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 성상교세포(Astrocyte)의 글루타메이트(Glutamate) 방출 기작을 밝힌 것으로, 보다 구체적으로 채널 매개의 글루타메이트의 빠른 방출 기작과 글루타메이트의 느린 방출 기작에 관한 것이다. 본 발명은 성상교세포의 글루타메이트 방출 기작을 밝힘으로써, 성상교세포 상의 조절을 통하여 신경 세포 보호 기술 및 신경 전달 촉진 기술의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

성상교세포의 글루타메이트 방출 기작 {MECHANISM OF GLUTAMATE RELEASE FROM ASTROCYTE}
본 발명은 성상교세포(Astrocyte)의 글루타메이트(Glutamate) 방출 기작을 밝힌 것으로, 보다 구체적으로 채널 매개의 빠른 글루타메이트 방출 기작과 느린 글루타메이트 방출 기작을 밝힘으로써, 글루타메이트의 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 성상교세포에서의 글루타메이트 방출 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
성상교세포(Astrocyte)는 뇌의 발생 과정뿐 아니라, 정상적인 뇌활동을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 지난 수 십 년간 뇌에서의 성상교세포는 단지 뉴런이 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제거하거나 뇌 내의 이온 농도를 조절하면서 뉴런 활성을 보조하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 들어, 성상교세포가 뉴런의 시냅스 형성, 시냅스 숫자 조절, 시냅스 가소성 등에 기능을 발휘하고 있는 것으로 알려져 있으며, 신경줄기세포가 신경으로 분화하는 단계에서도 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
글루타메이트(Glutamate)는 뇌속의 주요 흥분성 신경전달물질이다. 중추신경계에서 뉴런 및 성상교세포는 글루타메이트를 방출하는 것으로 알려져 있다. 뉴런의 글루타메이트는 빠른 시냅스 전달을 매개하며(Traynelis et al.,2010), 그에 반해 성상교세포의 글루타메이트는 시냅스 전달을 조절하는 것으로 알려져 있다(Haydon and Carmignoto,2006). 뉴런의 글루타메이트는 Ca2 + 의존적 엑소시토시스(exocytosis)에 의해 글루타메이트가 방출되는 것이 명백한 것에 반해, 성상교세포의 글루타메이트의 방출은 논쟁이 되어왔다.
종래 성상교세포의 글루타메이트 방출은 (1) 뉴런처럼 단지 소포낭의 엑소시토시스에 의해 글루타메이트 방출(Bezzi et al., 2004; Jourdain et al., 2007), (2) Ca2 + 비의존적 방출(Agulhon et al.,2010) (3) 트랜스포터(transporters) 또는 채널(channel)에 의한 방출(Cavelier and Attwell, 2005; Hamilton and attwell, 2010; Li et al., 2012; Takano et al., 2005; Ye et al., 2003)의 논의가 있었으나, 현재까지 불분명하였다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 성상교세포의 글루타메이트 방출에 대한 분자적 기작을 밝히는 것이다.
일 예는 성상교세포의 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출 억제를 통한 글루타메이트의 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공 한다.
다른 예는 성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출 억제제의 스크리닝 방법을 제공 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일례는 성상교세포 내 TREK-1 채널의 억제제를 유효성분으로 포함하고, 성상교세포의 글루타메이트의 빠른 방출을 억제하는, 글루타메이트의 빠른 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 성상교세포 내 베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1) 채널의 억제제를 유효성분으로 포함하고, 성상교세포의 글루타메이트의 느린 방출을 억제하는, 글루타메이트의 느린 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 성상교세포 샘플을 준비하는 단계, 후보 물질을 상기 샘플에 처리하는 단계, 및 상기 샘플에서의 TREK-1 채널의 활성화 여부를 확인하는 단계를 포함하고, TREK-1 채널이 불활성화된 경우 상기 후보 물질을 글루타메이트의 빠른 방출 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는, 성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 방출 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또 다른 예는 성상교세포 샘플을 준비하는 단계, 후보 물질을 상기 샘플에 처리하는 단계, 및 상기 샘플에서의 베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1) 채널의 활성화 여부를 확인하는 단계를 포함하고, 베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1) 채널이 불활성화된 경우 상기 후보 물질을 글루타메이트의 느린 방출 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는, 성상교세포에서의 글루타메이트의 느린 방출 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서의 글루타메이트의 빠른 방출은 G-단백질 결합 수용체 활성화제를 성상교세포에 처리하여 스니퍼패치를 수행하였을 때 전류(current)의 온셋(oncet;전류가 시작되는 시작점)지점이 상기 활성화제 처리 후 50 내지 400ms인 것을 말하며, 글루타메이트의 느린 방출은 G-단백질 결합 수용체 활성화제를 성상교세포에 처리하여 스니퍼패치를 수행하였을 때 전류(current)의 최고점(peak)의 시간이 상기 활성화제 처리 후 20 내지 50s인 것을 말하며, G-단백질 결합 수용체 활성화제는 통상적으로 알려진 활성화제를 의미하나 바람직하게는 TFLLR일 수 있다.
글루타메이트는 중요한 중추 신경 전달 물질이지만, 과방출된 경우에는 오히려 신경 독성으로 작용하여 신경 세포를 사멸시킬 수 있으므로, 글루타메이트의 항상성 유지가 매우 중요하며. 따라서 글루타메이트 신경독성으로 야기되는 급성 및 퇴행성 뇌질환의 치료제 개발에 대해 연구되어 왔다.
본 발명은 성상교세포의 글루타메이트 방출 기작을 밝힌 것으로, 성상교세포에서 세포막에 위치하는 G-단백질 수용체를 활성화시킴으로써, 글루타메이트 방출의 빠르기를 조절하는, 성상교세포의 글루타메이트 방출 기작에 관한 것이다.
본 발명자들은, 성상교세포의 글루타메이트 방출을 검출하는데 높은 정확성을 보이는 스니퍼패치(sniffer-patch) 기술을 사용하여, G-단백질 결합 수용체로 유도되는 글루타메이트의 방출의 자세한 기작을 밝혔으며, 성상교세포의 글루타메이트의 방출은 베지클(vesicle)의 엑소시토시스가 아닌 글루타메이트가 통과 가능한 이온 채널을 개방하여 이루어짐을 밝혔다.
구체적으로 성상교세포의 글루타메이트 방출 기작은 빠른 방출 기작과 느린 방출 기작으로 나누어질 수 있다. 각각의 방출 기작에 따라서 유발되는 질병 및/또는 증상이 상이하므로, 성상교세포의 글루타메이트 방출 기작은 빠른 방출 기작과 느린 방출 기작을 밝힘으로써, 글루타메이트 방출과 관련된 신경 질환의 치료에 있어서, 보다 근본적인 접근이 가능하다.
본 발명의 한 측면은 성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 방출이 TREK-1이라고 하는 칼륨채널을 통하여 일어남을 밝힘으로써, 성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 방출을 억제하여 이와 관련된 질병의 예방, 개선 및/또는 치료에 적용하는 기술과 관련된 것이다. 또 다른 측면은 성상교세포에서의 글루타메이트의 느린 방출이 베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1)이라고 하는 클로라이드 채널을 통하여 일어남을 밝힘으로써, 성상교세포에서의 글루타메이트의 느린 방출을 억제하여 이와 관련된 질병의 예방, 개선 및/또는 치료에 적용하는 기술과 관련된 것이다.
보다 구체적으로, 성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 방출 기작은 성상교세포 상의 G-단백질 결합 수용체의 활성화 단계; 상기 G-단백질 결합 수용체의 활성화에 의하여 Gai가 활성화되는 단계; 상기 Gai의 활성화에 의하여 Gai - Gβγ의 해리가 일어나는 단계; 상기 Gai - Gβγ의 해리로 인하여 Gβγ와 TREK-1의 N말단이 결합하는 단계; 및 상기 Gβγ와 TREK-1의 N말단의 결합으로 인하여 TREK-1 채널의 개방으로 글루타메이트가 방출되는 단계를 포함한다. 또한, 성상교세포의 글루타메이트 느린 방출 기작은 성상교세포 상의 G-단백질 결합 수용체의 활성화 단계; 상기 G-단백질 결합 수용체의 활성화에 의하여 Gaq의 신호전달 경로가 활성화되는 단계; 상기 Gaq의 신호전달 경로의 활성화에 의하여 성상교세포 내 Ca2 + 수준이 증가하는 단계; 및 상기 증가된 성상교세포 내 Ca2 +에 의하여 베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1) 채널의 개방으로 글루타메이트가 방출되는 단계를 포함한다.
상기 G-단백질 결합 수용체는 알려진 모든 G-단백질 결합 수용체를 포함하며, 예컨대, P2Y 수용체, 브래드키닌(bradykinin) 수용체 및 프로테아제 활성화 수용체(protease activated receptors, PARs)를 포함한다. 본 발명은 이들 수용체들 중에서 PAR이 다른 신경조직과 비교하여 성상교세포에서 특이적으로 다량 발현한다는 사실을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, G-단백질 결합 수용체는 PAR일 수 있다. 유리한 약리학적 및 분자적 수단, 성상교세포 내에서의 압도적인 발현 및 신경병리학적 프로세스의 적합성 등을 고려하여, 본 발명의 구현예에서는 프로테아제 활성화 수용체의 일종인 PAR1을 사용하였지만, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 성상교세포의 글루타메이트 빠른 및 느린 방출 기작은 인간뿐 아니라, 모든 포유류에 폭 넓게 적용될 수 있으며, 본 발명은 상기 방출 기작을 토대로 글루타메이트 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하게 되었다.
일 예는 성상교세포 내 TREK-1 채널의 억제제를 유효성분으로 포함하고, 성상교세포의 글루타메이트의 빠른 방출을 억제하는, 글루타메이트의 빠른 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
성상교세포의 글루타메이트 빠른 방출 기작은 중독(addiction)을 포함하여 신경질환과 관련되어 있으며, 상기 신경질환은 중독(addiction), 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 빠른 글루타메이트 과방출 유발 질병일 수 있다.
따라서, 성상교세포의 글루타메이트 빠른 방출 기작을 억제하면 중독(addiction), 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 빠른 글루타메이트 과방출 유발 질병을 예방, 개선 및/또는 치료할 수 있다.
따라서, 일 구체예는 성상교세포 내 TREK-1 채널 억제제를 유효성분으로 함유하고, TREK-1 채널을 통한 글루타메이트의 빠른 방출을 억제하는, 글루타메이트의 빠른 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 성상교세포 내 TREK-1 채널의 억제제를 함유하는 약학 조성물에 의하여 예방, 개선 및/또는 치료 가능한 글루타메이트의 빠른 방출 관련 질병 또는 증상은 중독(addiction), 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 빠른 글루타메이트 과방출 유발 질병일 수 있다.
상기 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 TREK-1 채널의 억제제는 하기 (1) 내지 (5) 각각의 해당하는 단계를 억제하는 역할을 하는 억제제일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 억제제는,
(1) 성상교세포의 TREK-1 채널의 개방을 억제하는 억제제;
(2) 성상교세포 내 Gβγ와 TREK-1 채널의 N말단 결합을 억제하는 억제제;
(3) 성상교세포 내 Gai - Gβγ의 해리를 억제하는 억제제;
(4) 성상교세포의 Gai의 활성화를 억제하는 억제제; 및
(5) 성상교세포의 G-단백질 결합 수용체의 활성화를 억제하는 억제제
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 억제제 (1)은 성상교세포의 TREK-1 채널의 개방을 억제함으로써, TREK-1 채널을 통한 글루타메이트의 빠른 방출의 억제를 가능하게 한다. 예컨대, 상기 억제제 (1)은 퀴닌(Quinine) 및 서열번호 1을 갖는 TREK-1-shRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 억제제 (2)은 성상교세포에서의 Gβγ와 TREK-1의 N말단의 결합을 억제함으로써 TREK-1 채널의 개방을 억제하여, TREK-1 채널을 통한 글루타메이트의 빠른 방출의 억제를 가능하게 한다. 상기 억제제 (2)은, 예컨대, Gβγ와 경쟁적으로 TREK-1에 결합하는 물질, TREK-1와 경쟁적으로 Gβγ와 결합하는 물질, Gβγ 및/또는 TREK-1와 결합하여 기능을 변화시키는 물질, TREK-1의 N1, N2 및 N4의 경쟁적인 펩티드등일 수 있으며, 예컨대 서열번호 2 (TREK-1의 N1의 경쟁적 펩티드, AAPDLLDPKSA)를 포함하는 펩티드, 서열번호 3 (TREK-1의 N2의 경쟁적 펩티드, AQNSKPRLSFSS)를 포함하는 펩티드, 또는 서열번호 4 (TREK-1의 N4의 경쟁적 펩티드, DSAINVMKWKT)를 포함하는 펩티드일 수 있으며 바람직하게는 TREK-1의 N1의 경쟁적 펩티드(서열번호 2), TREK-1의 N2의 경쟁적 펩티드(서열번호 3), TREK-1의 N4의 경쟁적 펩티드(서열번호 4)일 수 있다.
상기 억제제 (3)은 성상교세포에서의 Gai - Gβγ의 해리를 억제함으로써, 이후 단계인 해리된 Gβγ와 TREK-1의 N말단이 결합을 억제하고, 이를 통하여 TREK-1 채널의 개방을 억제하여, 종국적으로는 성상교세포에서의 빠른 글루타메이트 방출의 억제를 가능하게 한다. 상기 억제제 (3)은, 예컨대, 백일해독소(Pertussis toxin)일 수 있다.
상기 억제제 (4)은 성상교세포의 Gai의 활성화를 억제함으로써, Gai - Gβγ의 해리를 억제하고, 이후 단계인 해리된 Gβγ와 TREK-1의 N말단의 결합을 억제하고, 이를 통하여 TREK-1 채널의 개방을 억제하여, 종국적으로는 성상교세포에서의 빠른 글루타메이트 방출을 억제할 수 있다. 상기 억제제 (4)은, 예컨대, β-Ark(Beta-adrenergic receptor kinase) C-말단 (서열번호 5) 및 Phosducin C-말단(서열번호 6)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 억제제 (5)는 성상교세포의 G-단백질 결합 수용체의 활성화를 억제함으로써, Gai의 활성화를 억제하고, 이를 통하여 Gai - Gβγ의 해리를 억제하고, 해리된 Gβγ와 TREK-1의 N말단의 결합을 억제하고, TREK-1 채널의 개방을 억제하여, 종국적으로는 성상교세포에서의 빠른 글루타메이트 방출을 억제할 수 있다. 상기 억제제 (5)는 G-단백질 결합 수용체가 PAR-1 인 경우 FR 171113, SCH 79797 및 RWJ 56110로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, G-단백질 결합 수용체가 Canabinoid receptor 1 인 경우 AM 251일 수 있으며, G-단백질 결합 수용체가 GABAB recpetor인 경우 CGP 35348, SCH 50911 및 사클로펜(Saclofen)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, G-단백질 결합 수용체가 Adenosine receptor 1 일 경우 8-사이클로펜틸-1,3-디프로필잔틴(DPCPX), FK-453, BG-9719 및 8-사이클로펜틸-1,3-디메틸잔틴(CPX /8-사이클로펜틸테오필린)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수있다.
본 발명은 성상교세포 내 베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1) 채널의 억제제를 유효성분으로 포함하고, 성상교세포의 글루타메이트의 느린 방출을 억제하는, 글루타메이트의 느린 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
성상교세포의 글루타메이트 느린 방출 기작은 신경질환과 관련되어 있으며, 상기 신경질환은 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 느린 글루타메이트 과방출 유발 질병일 수 있다.
따라서, 성상교세포의 글루타메이트 느린 방출 기작을 억제하면 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 느린 글루타메이트 과방출 유발 질병을 예방, 개선 및/또는 치료할 수 있다.
따라서, 일 구체예는 성상교세포 내 베스트로핀 1 채널 억제제를 유효성분으로 함유하고, 베스트로핀 1 채널을 통한 글루타메이트의 느린 방출을 억제하는, 글루타메이트의 느린 방출 관련 질병 또는 증상의 예방, 개선 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 성상교세포 내 베스트로핀 1 채널의 억제제를 함유하는 약학 조성물에 의하여 예방, 개선 및/또는 치료 가능한 글루타메이트의 느린 방출 관련 질병 또는 증상은 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 느린 글루타메이트 과방출 유발 질병일 수 있다.
상기 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 베스트로핀 1 채널의 억제제는 하기 (A) 내지 (D) 중에서 각각의 해당하는 단계를 억제하는 역할을 하는 억제제일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 억제제는,
(A) 성상교세포의 베스트로핀 1 채널의 개방을 억제하는 억제제;
(B) 성상교세포 내 Ca2 + 농도 상승을 억제하는 억제제;
(C) 성상교세포 내 Gaq의 신호전달 경로를 억제하는 억제제;및
(D) 성상교세포의 G-단백질 결합 수용체의 활성화를 억제하는 억제제
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 억제제 (A)은 성상교세포의 베스트로핀 1 채널의 개방을 억제함으로써, 베스트로핀 1 채널을 통한 글루타메이트의 느린 방출의 억제를 가능하게 한다. 예컨대, 상기 억제제 (A)은 5-니트로-2-(페닐프로필아미노)-벤조에이트(NPPB), 니플루믹 산(NFA, niflumic acid) 및 디하이드로-4,4`-디아이소씨오시아노스틸벤-2,2′-디설폰산(DIDS)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 억제제 (B)은 성상교세포 내 Ca2 + 농도 상승을 억제함으로써, 베스트로핀 1 채널의 개방을 억제하여, 베스트로핀 1 채널을 통한 글루타메이트의 느린 방출의 억제를 가능하게 한다. 예컨대, 상기 억제제 (B)은 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N`,N`-테트라아세틱에시드(BAPTA-AM) 및 RGS-2(regulator of G-protein signaling-2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 억제제 (C)은 성상교세포 내 Gaq의 신호전달 경로를 억제함으로써, 이후 단계인 성상교세포 내 Ca2 + 농도 상승을 억제하고, 이를 통하여 베스트로핀 1 채널의 개방을 억제하여, 종국적으로는 성상교세포에서의 느린 글루타메이트 방출의 억제를 가능하게 한다. 예컨대, 상기 억제제 (C)은 RGS-2(regulator of G-protein signaling-2)일 수 있다.
상기 억제제 (D)은 성상교세포의 G-단백질 결합 수용체의 활성화를 억제함으로써, 성상교세포 내 Gaq의 신호전달 경로를 억제하고, 이후 단계인 성상교세포 내 Ca2+ 농도 상승을 억제하고, 이를 통하여 베스트로핀 1 채널의 개방을 억제하여, 종국적으로는 성상교세포에서의 느린 글루타메이트 방출의 억제를 가능하게 한다.
상기 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화 할 경우에는 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화 하여 사용할 수 있으며, 경구투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 투여는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 성상교세포에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에 있어서 용어, 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예컨대, 하루에 0.001 내지 100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.01 내지 30 ㎎/㎏(체중)의 양으로 투여될 수 있고, 상기 투여량은 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 투여량은 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방출 기작을 토대로 성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출 억제제의 스크리닝 방법을 제공하며, 본 발명의 일 예로 성상교세포 샘플을 준비하는 단계,
후보 물질을 상기 샘플에 처리하는 단계, 및
상기 샘플에서의 TREK-1 채널의 활성화 여부를 확인하는 단계를 포함하고,
TREK-1 채널이 불활성화된 경우 상기 후보 물질을 글루타메이트의 빠른 방출 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는,
성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 방출 억제제의 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예로 성상교세포 샘플을 준비하는 단계,
후보 물질을 상기 샘플에 처리하는 단계, 및
상기 샘플에서의 베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1) 채널의 활성화 여부를 확인하는 단계를 포함하고,
베스트로핀 1(Bestrophin 1, Best1) 채널이 불활성화된 경우 상기 후보 물질을 글루타메이트 의 느린 방출 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는,
성상교세포에서의 글루타메이트의 느린 방출 억제제의 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명의 일 예로 상기 스크리닝 방법 단계 중 채널의 활성화 여부는 스니퍼 패치에 의한 내향 전류 변화 측정에 의하여 확인할 수 있다.
상기 성상교세포 샘플은 사람을 포함하는 영장류, 설치류 등으로부터 유래하는 것으로 바람직하게 사람에서 채취한 샘플일 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물의 생체 또는 생체로부터 분리된 조직 또는 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간의 1차 대뇌피질 성상교세포 또는 해마세포일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 후보물질은 성상교세포의 글루타메이트의 느린 또는 빠른 방출 기작을 억제할 수 있는 물질로 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 유전자, 단백질 등의 물질을 제한 없이 포함한다.
본 발명은 성상교세포의 글루타메이트 빠른 및 느린 방출 기작을 밝힘으로써, 성상교세포 상의 조절을 통하여 신경 세포 보호 기술 및 신경 전달 촉진 기술의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출을 억제하는 글루타메이트 방출 관련 질병 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 성상교세포에서의 글루타메이트 방출 억제제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
도 1a 내지 도 1o은 하나의 성상교세포로부터 수용체-매개의 글루타메이트 방출의 기작과 관련한 도면을 나타낸 것으로,
도 1a는 스니퍼 패치의 개략도를 나타낸 것으로, 왼쪽 피펫(노랑)은 TFLLR의 가압작용(pressure-application)을 나타내며, 오른쪽 피펫은 GluR1-L497Y(초록)을 발현하는 HEK 세포를 나타내며, 빨간부분은 TFLLR 적용으로 1차 배양의 성상교세포로(파랑)부터 방출된 gliotransmitter를 나타낸 것이다.
도 1b는 스니퍼 패치의 실험 이미지를 나타낸 것으로, 왼쪽 위의 그림은 두 개의 유리 피펫과 두 개의 세포를 보여주며, 오른쪽 위의 그림의 GFP는 GluR1-L497Y 및 EGFP를 발현하는 센서 세포를 나타내며, 왼쪽 아래 그림은 Fura-2가 로드된 성상교세포 및 센서 세포의 TFLLR 적용 전을 보여주며, 오른쪽 아래 그림은 TFLLR 적용 후를 보여준 것이다.
도 1c는 스니퍼 패치로부터 기록된 representative trace를 나타낸 것이다. 구체적으로 파란색은 성상교세포에서 Ca2 + transient로 측정하였고, 초록색은 TFLLR의 가압 적용 시 센서 세포로부터 전체-세포의 전류를 보여주며(Vh= -70mV), 다이아몬드는 TFLLR 적용을 나타낸 것이다(100ms, 500uM).
도 1d는 GluR1-L497Y을 표면에 발현하는 센서세포에 1mM 글루타메이트의 배스 적용(bath application)에 따른 최대 활성화(full activation) 전류를 나타낸 것이다.
도 1e는 아래의 전류는 1 ug/ml PTX(12시간 내지 18시간)로 인해 빠른 방출 기작에서의 저해를 나타내며, 다이아몬드는 TFLLR 적용을 나타낸 것이다(100ms, 500uM).
도 1f는 아래의 전류는 PTX에서 저해되는 글루타메이트의 빠른 방출이 PTX-insensigive form (GiCG)에 의해 구제됨을 보여주는 것이다.
도 1g는 각 조건에서의 최대 활성화(full activation) %를 나타낸 것이다(**, p=0.005; ***, p=0.001).
도 1h는 Gαi- Gβγ의 해리를 저해하는 것으로 알려진 phosducin의 C말단을 과발현하는 성상교세포에서의 저해를 나타내며, 다이아몬드는 TFLLR 적용을 나타낸 것이다(100ms, 500uM).
도 1i는 phosducin의 C말단 및 β-ARK에 의한 Gβγ 해리의 저해에 대한 최대 활성화(full activation) %로 나타낸 것이다(**, p=0.015; ***, p=0.002).
도 1j는 representative trace는 Ca2 + transient 없이 빠른 방출을 유도하는 바클로펜(inverted triangle, 100ms, 300uM) 및 GABAB receptor agonist를 나타낸 것이다.
도 1k는 Gi-coupled GPCR agonist의 최대 활성화(full activation) %를 나타낸 것이다. CCPA(agonist of adenosine receptor 1, 100ms, 1uM) 및 ACEA(agonist of cannabinoid receptor 1, 100ms, 300uM)는 빠른 방출을 유도한다.
도 1l은 아래부분은 Gq 서브유닛을 저해하는 RGS-2를 과발현하는 성상교세포에서의 느린 방출의 저해를 나타낸 것이다.
도 1m은 RGS-2 발현하는 성상교세포의 최대 활성화(full activation) %를 나타낸 것이다.
도 1n은 representative trace는 같은 성상교세포/센서 세포에서의 20 uM BAPTA-AM(30 분) 처리 전/후를 나타내며, 다이아몬드는 TFLLR 적용을 나타낸 것이다(100ms, 500uM).
도 1o은 BAPTA-AM 처리의 최대 활성화(full activation) %를 나타내며(*, p=0.031), 모든 값은 평균 ± s.e.m이다.
도 2a 내지 도 2l는 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출의 분자적 확인과 관련된 도면을 나타낸 것으로,
도 2a는 trace는 BoToxB(8 ug/ml, 20 분)를 주입한 성상교세포에, TFLLR로 자극한 것(왼쪽)과 기계적으로 자극(오른쪽)한 것을 나타내며, 다이아몬드는 TFLLR 자극을, 육각형모양은 기계적 자극을 나타낸 것이다.
도 2b는 BSA(8 ug/ml, 20분)를 주입한 성상교세포의 trace를 나타낸 것이다.
도 2c는 BotoxB 및 BSA 주입 조건의 TFLLR로 유도된 최대 활성화(full activation) %를 나타낸 것이다.
도 2d는 기계적 자극의 최대 활성화(full activation) %를 나타낸 것이다(*, p=0.001).
도 2e는 왼쪽은 50uM NPPB 처리 전의 글루타메이트 방출을 나타내며, 오른쪽은 50uM NPPB 동안의 글루타메이트 방출을 나타낸 것이며, 다이아몬드는 TFLLR 적용을 나타낸 것이다(100ms, 500uM).
도 2f는 DIDS(50uM 10분), DCPIB(50uM 10분) 및 quinine(100uM 10분)과 같은 다양한 차단제의 존재 하에 TFLLR 적용으로 유도된 빠른 및 느린 방출의 차단의 %를 나타낸 것이다.
도 2g 내지 도 2j는 control scrambled-shRNA가 과발현된 각각의 성상교세포의 trace를 나타낸 것이다.
도 2k는 각각 Best1-shRNA이 과발현된, Best1-shRNA-insensitive이 공동발현된, wild type 및 Best1 cDNA의 W93C 통로 돌연변이의 성상교세포의 최대 활성화(full activation) %를 나타낸 것이다(**1, p=0.0004; **2, p=0.009; n.s, non-significance)
도 2l은 각각 TREK-1-shRNA이 과발현된, 래트 TREK-1 cDNA가 공동발현된, wild type 및 TREK-1-shRNA에 민감하지 않은 래트 TREK-1의 G144E 통로 돌연변이의 성상교세포의 최대 활성화(full activation) %를 나타낸 것이다(***, p=0.0004; *1, p=0.047; *2, p=0.012; *3, p=0.048)
도 3a 내지 도 3m은 Gβγ 및 TREK-1의 상호작용으로 성상교세포의 음이온 투과성 유도와 관련한 도면을 나타낸 것이다.
도 3a는 TREK-1의 다양한 도메인 및 아미노산 서열의 도식적인 그림을 나타낸 것이다. M1 내지 M4는 4개의 막관통단백질(transmembrane protein)의 도메인을 나타내며, P1 및 P2는 통로(pore) 도메인을 나타내며, N 말단(1 내지 46의 아미노산)은 4개의 부분(N1 내지 N4)으로 나누어지며, 빨간 부분은 효모의 하이브리드 시스템(yeast two hybrid system)으로부터 TREK-1과 Gγ 서브유닛(GNG4) 사이의 상호작용 정도를 나타낸 것이다.
도 3b는 TLH(tryptophan, leucine, histidine)의 효모(yeast) 콜로니의 존재로부터 TREK-1의 N1 내지 N4와 Gγ 서브유닛 사이의 상호작용을 나타낸 것이다.
도 3c는 면역침강법을 통해 TREK-1 및 GIRK 1과 IRK1이 아닌 GNG4와의 상호작용을 나타낸 것이다.
도 3d는 I-V 곡선은 염소(검정) 또는 글루타메이트(빨강)를 포함하는 세포 내 용액에서의 Gβγ 유도의 전도도 및 염소(파랑) 또는 글루타메이트(초록)을 포함하는 세포 내 용액에서의 BSA 유도의 전도도를 나타낸 것이다. 삽도는 실험의 도식적인 그림을 나타낸 것이다(in mM, 150 [Cl]in, 150[Glu]in, 6.09nM Gβγ, 150[Cl]out).
도 3e는 다른 4개 내부용액 상태의 -100mV 전류 진폭을 나타낸 것이다(*, p=0.019; ***, p=0.0004).
도 3f는 두 내부용액(검정:염소, 빨강:글루타메이트) 상태에서의 반전 전위(reversal potential)를 나타낸 것이다(**,p=0.001).
도 3g는 I-V 곡선은 TREK-1에 의존하는 글루타메이트 투과성을 나타낸 것이다. 삽도는 실험의 도식적인 그림을 나타낸 것이다(150 mM [Glu]in, 6.09nM Gβγ, 150 mM [Cl-]out). 파란색은 Gβγ 유도의 전도도는 TREK-1의 유전자 침묵(gene silencing)을 통해 거의 제거되었음을 나타내며, 빨간색은 TREK-1의 특정 shRNA에 의해 Gβγ 유도의 전도도의 방해가, 초록색은 래트 TREK-1의 통로 돌연변이인 G144E는 구제(rescue)되지 않은 것을 나타낸 것이다.
도 3h는 -100mV의 전류 진폭을 그래프로 나타낸 것이다(**, p=0.008; *1, p=0.038; *2, p=0.045).
도 3i는 염소상태하에 전도도에서의 Gβγ의 농도-반응 관계를 나타낸 것이다(150 mM [Cl-]in, Gβγ의 indicated concentration: 150 mM [Cl-]out)
도 3j는 경쟁적 펩티드에 의존하여 염소 투과성을 I-V 곡선으로 나타내며, N1 펩티드는 Gβγ-유도의 염소 전류를 거의 저해하였고(빨강), 그에 반해 Gβγ 단백질은 전류를 유도한 것을 나타낸 것이다(검정)(150 mM [Cl-]in, 6.09nM Gβγ, 150 mM [Cl-]out).
도 3k는 6.09nM Gβγ 주입된 성상교 세포의 trace를 나타내며, 빨간 화살표는 50ms에서의 전류 진폭을 나타낸 것이다.
도 3l은 Gβγ + 100uM N1 펩티드가 주입된 성상교세포의 trace를 나타내며, 빨간 화살표는 50ms에서의 전류 진폭을 나타낸 것이다.
도 3m은 Gβγ 에서 유도된 염소 내향전류가 N1,2 및 4 펩티드에 의해 억제됨을 보여주고, N3은 억제하지 않는다는 것을 보여주는 요약도표를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4i는 Gβγ 단백질에 직접적 결합으로 글루타메이트 방출의 게이트로 TREK-1에 대한 도면을 나타낸 것이다.
도 4a는 두 세포 스니퍼 패치의 도식적인 그림을 나타내며, 초록색 세포는 GluR1-L497Y을 발현하는 HEK 세포를 나타내며, 파란 세포는 성상교세포를 나타내며, 파란 라인은 5mM 글루타메이트 및 6.09 nM Gβγ 을 포함하는 모세관 피펫을 나타내며, 초록 라인은 센서 세포를 패칭하는 모세관 피펫을 나타내며, 파란 trace는 성상교세포에서의 홀딩 전압(Vh) 변화를 나타내며, representative trace는 성상교세포(중간 파랑) 및 GluR1-L497Y을 발현하는 HEK 세포(초록)으로부터의 전류 trace를 나타내며, 화살표는 6.09nM Gβγ 단백질이 주입된 지점을 나타내며, 점선은 전류의 기준치(base line)를 나타내며, 화살표는 글루타메이트-유도의 전류 측정을 나타낸 것이다.
도 4b는 최대 활성화(full activation) %를 막대그래프로 나타낸 것이며, 값은 평균 ± s. e. m (*, p=0.032)를 나타낸 것이다.
도 4c는 전압 스텝에 응하여 전류 환원의 %를 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 4d는 파란 trace는 control scrambled shRNA를 발현하는 성상교세포로부터 Gβγ 유도의 기록을 나타내며, 초록 trace는 센서 세포에서의 trace를 나타내며, 화살표는 성상교세포의 파열(rupture) 시간을 나타낸 것이다.
도 4e는 TREK-1-shRNA를 발현하는 성상교세포에서의 Gβγ 유도의 전류 및 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포의 센서 전류를 나타낸 것이다.
도 4f는 센서 전류의 최대 활성화(full activation) %를 막대그래프로 나타낸 것이며(초록)(**, p=0.008; *1, p=0.041; *2, p=0.038), 모든 값은 평균 ± s. e. m를 나타낸 것이다.
도 4g는 전류 trace(파랑)는 Gβγ 및 N3 비경쟁적 펩티드를 주입한 1차 배양된 성상교세포에서의 기록을 나타내며, 전류 trace(초록)은 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포에서의 기록을 나타낸 것이다.
도 4h는 전류 trace(파랑)는 Gβγ 및 N1 경쟁적 펩티드를 주입한 1차 배양된 성상교세포에서의 기록을 나타내며, 전류 trace(초록)은 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포에서의 기록을 나타내며, 검은 화살표는 파열(rupture) 부분을 나타내며, 빨간 화살표는 측정지점을 나타낸 것이다.
도 4i는 최대 활성화(full activation) %를 막대그래프로 나타낸 것이며(빨간 화살표는 전류 진폭/ 1mM 글루타메이트-유도의 최대 활성화(full activation) X 100), 값은 평균 ± s. e. m (**1, p=0.005; **2, p=0.001; ns., nonsignificance)를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5f는 Best1 채널이 Ca2 +에 의한 글루타메이트 방출의 기여와 관련한 도면에 대해 나타낸 것이다.
도 5a는 마우스 Best1을 발현하는 HEK293T 세포에서 전체 세포의 패치 클램프 기록으로부터의 representative I-V 관계를 나타내며, 각 전류는 4.5uM Ca2 + + 145mM Cl-(Cs-Cl, 검정 trace), 4.5 uM Ca2 + + 145mM 글루타메이트(Cs-글루타메이트, 빨간 trace) 또는 0 uM Ca2 + + 145mM 글루타메이트(Cs-글루타메이트(0 Ca2 +), 초록 trace)를 나타내며, 트랜스펙션이 안된(untransfected) HEK293T 세포를 4.5uM Ca2 + + 145 mM Cl-(untransfected)를 포함하는 피펫 용액을 이용하여 음성대조군으로 테스트한 것을 나타낸 것이다.
도 5b는 도 1a의 각 그룹으로부터 -70 mV에서 전류 진폭의 평균을 막대그래프로 나타낸 것이며(*, p=0.03, unpaired t-test), 최소 2개의 독립적인 배양 배치(batch)의 세포 수를 막대그래프에 나타낸 것이다.
도 5c는 Best1를 발현(source cell) 및 GluR1-L497Y를 발현(센서 세포)하는 HEK293T 세포를 이용한 two cell biosensor micro-assay의 도식적인 그림을 나타낸 것이다.
도 5d는 센서 세포에서 평균적인 반응을 나타내며, 센서 세포는 wild type Best1을 발현하는 세포, 트랜스펙션 되진 않은(untransfected) 세포 또는 4.5 uM Ca2+ + 145mM 글루타메이트를 포함하는 피펫 용액을 처리한 Best1 W93C(통로 돌연변이) 발현 세포, 0 uM Ca2 + + 145mM 글루타메이트를 포함하는 피펫 용액을 처리한 Best1 발현 세포 및 4.5 uM Ca2 + + 145mM 염소를 포함하는 피펫 용액을 처리한 Best1 W93C(통로 돌연변이) 발현 세포(**1, p=0.005, ***, p=0.004, **2, p=0.005, *, p=0.011)를 나타내며, 최소 2개의 독립된 배양 배치(batch)의 세포 수를 각 막대그래프에 나타내었다.
도 5e 및 도 5f는 representative traces는 mBest1를 발현하는 source cell(파랑, Best1) 및 GluR1-L497Y을 발현하는 센서 세포(초록, GluR1)로부터의 두 세포 스니퍼패치(two cell sniffer-patch) 측정을 나타내며, Best1 발현 세포는 높은 Ca2 + (4.5uM; E) 또는 0 uM Ca2 + 를 가지고 145mM 글루타메이트를 포함하는 피펫 용액을 이용하여 패치 클램프 되었고 파열된(ruptured) 것을 나타낸 것이다. 화살표는 source cell의 파열(rupture)된 시간을 나타낸 것이며, 모든 값은 평균 ± s. e. m 를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6k은 바로 분리된 성상교세포의 글루타메이트 빠른 및 느린 방출을 나타내며, TREK-1 및 Best1 CA1 해마(hippocampal) 성상교세포의 다른 위치를 나타낸 것이다.
도 6a는 GFPA-GFP 마우스로부터 바로 분리된 CA1 해마(hippocampal)에 위치하는 성상교세포의 스니퍼 패치를 위한 DIC, GFP(성상교세포), ds-red(sensor cell) 이미지를 나타낸 것이다.
도 6b는 10 uM CNQX를 하나의 성상교세포에 처리 전 후 센서 전류 trace를 나타낸 것이다.
도 6c는 GFPA-GFP 마우스로부터 바로 분리된 CA1 해마(hippocampal)에 위치하는 성상교세포에서의 분비되는 빠른 및 느린 방출의 글루타메이트의 양을 나타낸 요약표이다.
도 6d은 TREK-1의 전사를 방해하는 shRNA를 가지고 있는 렌티바이러스를 집어 넣어 바로 꺼낸 세포에서 글루타메이트의 빠른 방출이 없어진 것을 나타낸 것이다.
도 6e는 Best1이 없어진 마우스를 사용하여 글루타메이트의 느린 방출이 없어진 것을 나타낸 것이다.
도 6f는 Best1 KO 및 Sh-TREK-1을 모두 사용하여 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출이 없어진 것을 나타낸 것이다.
도 6g는 도 6d 내지 도 6f를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6h 및 도 6i는 GFAP-GFP 마우스의 CA1 해마(hippocampal)의 Best1(D) 및 TREK-1(E)의 면역전자현미경을 나타낸 것으로, Best1 및 TREK-1은 면역금 및 은으로 염색하였으며(dark specks, 화살촉), GFP는 면역퍼옥시다제로 염색하였다(dark amorphous deposits, 화살표)(Pr: pre-synapse; Po: post-synapse).
도 6j는 세포체, 세포돌기 및 마이크로도메인의 세포막에 위치하는 TREK-1 및 Best1의 금 입자의 퍼센트를 막대그래프로 나타낸 것이며(***1, p=0.0005; **, p=0.008; ***, p=0.0001), 모든 값은 평균 ± s. e. m 를 나타낸 것이다.
도 6k는 성상교세포에서 수용체 매개의 글루타메이트 방출의 분자적 모형을 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7i은 확산모델이 빠른 및 느린 방출 기작에서의 농도와 타겟하는 뉴런의 수용체에 대한 예측과 관련한 도면을 나타낸 것이다.
도 7a는 확산모델 시뮬레이션의 도식적인 그림을 나타내며, impermeable boundary은 100 uM x 100 uM이다.
도 7b는 sensor(HEK cell)로부터의 정규화된 반응을 기초하여, 성상교세포로부터 글루타메이트 방출 측정을 나타낸 것이며, TFLLR 자극에 의한 방출을 일시적인 방출(빠른) 및 완만한 방출(느린)으로 분류하여 나타낸 것이다.
도 7c는 시뮬레이션 결과에 따라, 빠른 방출 기작에서는 글루타메이트가 약 0.34 fmole이며 느린 방출 기작에서는 약 1.35 fmole인 결과 및 피크는 빠른 방출 기작에서 더 높지만 느린 방출 기작은 계속적으로 글루타메이트를 방출한다는 것을 나타낸 것이다.
도 7d는 TFLLR 자극에 의한 빠른 방출 기작은 글루타멩트가 약 0.34 fmole이며 기계적 자극에 의한 방출은 약 2.64 fmole인 것을 나타낸 것이다.
도 7e는 성상교세포에서의 빠른 방출의 글루메이트의 양을 성상교세포와 인접뉴런의 막이 10-40nm 떨어져있다고 가정하고 시뮬레이션 하였을 때 성상교세포에서 방출될 수 있는 양을 나타낸 것이다.
도 7f는 성상교세포에서의 느린 방출의 글루메이트의 양을 성상교세포와 인접뉴런의 막이 10-40nm 떨어져있다고 가정하고 시뮬레이션하였을 때 성상교세포에서 방출될 수 있는 양을 나타낸 것으로, 느린 방출의 글루타메이트는 10-40 nm 떨어져있을 때 큰 차이가 없다.
도 7g는 느린 방출 기작은 오직 NMDAR에 의해서만 검출이 되지만, 빠른 방출 기작은 NMDAR 및 mGluR에 의해 쉽게 검출가능하다는 것을 나타낸 것이다.
도 7h는 빠른 방출 기작의 도식적인 그림을 나타낸 것이다.
도 7i는 느린 방출 기작의 도식적인 그림을 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8u은 도 1과 관련된 실험 디자인 및 스니퍼 패치 실험의 빠른 및 느린 방출 기작의 키네틱(kinetic)과 관련된 도면을 나타낸 것이다.
도 8a는 스니퍼패치의 실험적 절차 및 타임라인을 도식적인 그림으로 나타낸 것이다. 초록선은 HEK 세포의 조작을 나타내며, 화살표는 각 시간대의 여러 처리에 대해 나타낸 것이다.
도 8b는 가압 적용의 TFLLR은 성상교세포 없이 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK세포부터 어떠한 GluR1-매개의 전류를 유도하지 않는다는 것을 나타내며, 다이아몬드는 100ms시 500uM 가압적용을 나타낸 것이다.
도 8c는 GluR1을 발현하는 HEK 세포의 1mM 글루타메이트의 배스 적용(bath application)은 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK세포의 최대 활성화(full activation)을 유도하는 것을 나타낸 것이다.
도 8d는 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출 기작에서의 글루타메이트 발생-전류의 성상교세포의 존재에 따른 차이를 막대그래프로 나타낸 것이며, 값은 평균 ± s. e. m(***, p=0.001; **, p=0.008)를 나타낸 것이다.
도 8e는 representative trace는 빠른 및 느린 방출 기작(왼쪽)과 10uM CNQX(AMPA 수용체 차단제) 처리(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 8f는 representative trace는 빠른 방출 기작(왼쪽)과 10uM CNQX(AMPA 수용체 차단제) 처리(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 8g는 representative trace는 느린 방출 기작(왼쪽)과 10uM CNQX(AMPA 수용체 차단제) 처리(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 8h는 최대 활성화(full activation) %를 막대그래프로 나타낸 것이다{(TFLLR 유도의 전류 진폭의 최대치/ 최대 활성화(full activation) 전류) x 100}.
도 8i는 빠른 및 느린 방출 기작의 전하이동을 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 8j는 CNQX의 저해 %를 막대그래프로 나타내며, 숫자는 세포 숫자를 나타낸 것이다.
도 8k는 반복적인 TFLLR의 가압 적용에 따른 같은 성상교세포에서의 빠른 및 느린 방출 기작의 반응을 나타낸 것이다(2개의 각 적용시간은 10분간 회복시간을 가졌다.)
도 8l 및 도 8m에서 도 8m은 도 8l을 수평적으로 연장한 도면이며, 초록 점은 Ca2 + transient 전(검은 점)의 빠른 방출 방식에서의 TFLLR 유도 시작점을 나타낸 것이다.
도 8n은 TFLLR을 압력처리한 시간에서 빠른 글루타메이트 방출이 시작된 시점에서의 시간과 칼슘이 증가하기 시작한 시간의 여러사건을 시간때별로 분류한 도표로 나타낸 것으로, 녹색 (빠른 글루타메이트 방출 사건)과 파란색(칼슘 사건)은 명확히 다른 시간으로 구분된다.
도 8o은 TFLLR을 압력처리한 시간에서 느린 방출 글루타메이트의 피크 시간과 칼슘의 시간을 나타낸 도표이다. 느린 글루타메이트 방출은 칼슘의 시간보다 늦으므로 느린 글루타메이트 방출은 칼슘에 의존적이라 할 수있다.
도 8p 내지 도 8s는 하나의 성상교세포 및 뉴런의 베지클 방출을 비교한 것으로, 도 8p 는 성상교세포에서의 TFLLR에 의한 빠른 방출 기작으로부터의 latency를 나타내며, 도 8q는 도 8p를 수평적으로 연장한 것이며, 도 8r은 고장용액(HOS, 512mOsm, sucrose로 조절한)을 처리한 뉴런 배지에 (HOS)-유도의 전류를 나타내며, 역삼각형은 HOS의 가압 적용 시 100ms 지점을 나타내며, 도 8s는 도 8r을 수평적으로 연장한 것을 나타낸 것이다.
도 8t는 10 내지 90%의 상승시간을 막대그래프로 나타내며, 값은 평균 ± s. e. m(n.s., nonsignificance)를 나타낸 것이다.
도 8u는 가압적용으로 인해 전류 시작점의 latency를 막대그래프로 나타낸 것이며, 값은 평균 ± s. e. m(n.s., nonsignificance)를 나타낸 것이다.
도 9a 내지 도 9k는 Ca2 + 이미지에서 G-단백질 저해제 및 Gas가 아닌 Gai 활성화(빠른 방출 기작을 유도하는)에 관한 도면을 나타낸 것이다.
도 9a는 PTX는 TFLLR 유도의 Ca2 + transient 를 저해하지 못하는 것을 나타낸 것이다.
도 9b는 naive 및 PTX 처리의 Ca2 + peak를 나타낸 것이다.
도 9c는 TFLLR 유도의 Ca2 + transient 를 저해하지 못하는 Phosducin-c term. 및 β-ARK-c term을 나타낸 것이다.
도 9d는 세 그룹사이의 아무런 의미가 없음을 나타낸 것이다.
도 9e는 RGS-2 및 GFP를 발현하는 성상교세포는 GFP만 발현하는 성상교세포와 비교하여 TFLLR 유도의 Ca2 + transient가 상당히 감소함을 나타낸 것이다.
도 9f는 GFP와 RGS-2 + GFP를 발현하는 성상교세포 사이의 Ca2 + transient의 피크 차이를 나타낸 것이다.
도 9g는 trace는 기본전위(holding potential)(Vh=-70mV)인 -70mV에서 Ca2+(위) 및 GluR-1-매개(의 전류(아래)를 나타낸다. A1R 활성화를 일으키는 CCPA 가압 적용은 주로 빠른 GluR1-매개의 내향전류를 유도하나, Ca2 + transient는 유도하지 못하며, 역삼각형은 1uM CCPA 100ms를 나타낸 것이다.
도 9h는 CB1R 활성화를 위한 ACEA 가압 적용은 주로 빠른 방출 기작을 유도하며, 검정 육각모양은 300uM 100ms를 나타낸 것이다.
도 9i 내지 도 9k는 빠른 방출 기작에 관여하지 않는 cAMP의 농도 변화를 나타낸 것으로, 도 9i는 포스포디에스테라아제(PDE) 저해제인 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)의 100uM 접종은 TFLLR 유도의 빠른 방출 기작에는 영향을 주지 않는 것을 나타내며, 도 9j는 아데닐산 고리화 효소 활성제인 포스콜린의 가압 적용은 빠른 방출 기작에 영향을 주지 않는 것을 나타내며, 다이아몬드는 300uM 포스콜린 100ms를 나타내며, 도 9k는 빠른 방출기작을 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10k은 일반적인 엑소시토시스 차단제를 이용하여 수용체 매개의 글루타메이트 방출이 엑소시토시스 방출과 관계가 없음을 나타내는 도면에 관한 것이다.
도 10a 내지 도 10c 고장액(HOS)은 글루타메이트 방출을 유도하지 않으며 로즈 벵갈(RB)은 TFLLR-유도의 GluR1LY 전류를 방해하지 않는 것을 나타낸 것으로, 도 10a는 HOS(510mOsm, 100ms)의 가압적용은 성상교세포로부터 GluR1LY-매개의 전류 및 Ca2 + transient를 유도하지 않음을 나타내며, 도 10b는 RB(1uM, 30분 전배양)은 TFLLR-유도의 GluR1LY 매개 전류를 저해하지 않음을 나타낸 것이며, 도 10c는 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 10d 내지 도 10k 베지클 방출의 여러 차단제는 GluR1L497Y-매개의 전류 및 Ca2 + 유입을 감소시키는 것을 나타내며, 도 10d는 같은 성상교세포에서 H+-ATPase의 저해제인 5uM 바필로마이신 A1을 30분간 전처리 시 TFLLR 유도의 전류를 감소시킨 것(오른쪽 중간)과 GluR1LY의 1mM 글루타메이트 유도의 최대 활성화(full activation) 전류를 감소시킨 것(오른쪽 아래)을 나타낸 것이다.
도 10e는 바필로마이신 A1 처리 시 TFLLR-유도의 전류를 상당히 감소시키는 것을 막대그래프로 나타낸 것이다. 값은 평균 ± s. e. m(*, p=0.03)을 나타낸 것이다.
도 10f는 HEK 세포에서, 바필로마이신 A1 처리(오른쪽) 시 바필로마이신 A1 처리전(왼쪽)과 비교하여 1mM 글루타메이트에 의해 발생하는 GluR1LY-매개의 Ca2 + transient를 감소시켜주는 것을 나타낸 것이다.
도 10g는 GluR1LY-매개의 Ca2 + transient에서 바필로마이신 A1의 효과를 막대그래프로 나타낸 것으로, 값은 평균 ± s. e. m(*, p=0.008)을 나타낸 것이다.
도 10h 내지 도 10k는 GluR1LY에 매개되는 내향전류로서 1mM 글루타메이트 배스처리로 센서 세포의 GluR1LY를 전부 활성화 한 것을 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11m은 글루타메이트 방출을 저해하는 여러가지 채널 차단제 및 TREK-1의 shRNA의 밸리데이션(validation)과 관련된 도면을 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11c은 여러가지 채널 차단제는 TFLLR 유도의 글루타메이트 방출을 감소시키는 것을 나타낸 것으로, 도 11a는 50uM 니플루믹산(NFA)(음이온 채널 차단제), 도 11b는 50 uM의 DIDS, 도 11c는 100uM 퀴닌(K2P 채널 차단제)을 나타낸 것이다.
도 11d 및 도 11e는 음이온 채널 차단제는 GluR1L497Y에 영향을 미치지 않지만, PPADS는 GluR1L497Y에 비특이적인 영향을 보여주는 것을 나타낸 것으로,
도 11d는 GluR1L497Y를 발현하는 HEK 세포로부터 50 uM 니플루믹산(NFA)은 1mM 글루타메이트 유도 전류(Vh=-70mV)에 영향을 미치지 않는 것을 나타낸 것이다.
도 11f 내지 도 11j는 TFLLR 유도의 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출 기작의 여러가지 차단제의 효과 및 PPADS에 의한 TREK-1 채널의 저해에 대해 나타낸 것으로,
도 11f는 50uM 카르베녹솔론(CBX, 10분 전처리)은 TFLLR-유도의 GluR1-매개의 전류를 저해하지 못하는 것을 나타내며, +CBX는 CBX의 존재를 나타낸 것이다.
도 11g는 50uM PPADS(P2X 채널 차단제로 알려진), 50uM CBX(hemi-채널 차단제) 및 50 uM DCPIB(volume-activated 염소 채널 차단제)에서의 차단 %를 나타낸 것이다.
도 11h는 PPADS는 마우스 TREK-1을 발현하는 COS-7 세포에서 TREK-1 매개의 전류를 저해하는 것을 일련의 전압 램프 trace로 나타낸 것이다.
도 11i는 PPADS 처리 전후의 I-V 관계의 평균 전류 밀도를 나타낸 것이다.
도 11j는 PPADS 처리 전후의 -150 mV 내지 +50mV의 전류 밀도를 막대그래프로 나타낸 것이다(*, p=0.023).
도 11k 내지 도 11m은 마우스 TREK-1 shRNA의 스크리닝 및 shRNA의 밸리데이션(validation)과 TREK-1-특이적 항체를 나타낸 것이다.
도 11k은 웨스턴 블로팅으로 마우스 TREK-1의 gene silencing을 테스트한 것을 나타낸 것이다.
도 11l은 TREK-1 shRNA-3-트랜스펙션된 성상교세포의 TREK-1 mRNA 레벨을 real-time PCR로 측정하였고, scrambled shRNA를 가진 트랜스펙션된 성상교세포를 정규화한 것을 나타낸 것으로, 값은 평균 ± s. e. m(*, p=0.03)을 나타낸 것이다.
도 11m은 TREK-1 shRNA가 과발현된 성상교세포와 scrambled shRNA가 과발현된 세포에서의 TREK-1의 발현을 비교한 도표를 나타낸 것이다
도 12a 내지 도 12f은 TREK-1의 N말단이 Gγ 서브유닛과의 결합 및 Gβγ 주입이 염소 전류를 유도하는 것에 관한 도면을 나타낸 것이다.
도 12a는 TREK-1의 다양한 도메인 및 아미노산 서열의 도식적인 그림을 나타낸 것이며, 빨간 부분은 효모의 하이브리드 시스템(yeast two hybrid system)으로부터 TREK-1과 Gγ 서브유닛(GNG4) 사이의 상호작용 정도를 나타낸 것이다.
도 12b는 대조군의 음성 반응은 TREK-1의 부분과 효모의 하이브리드 시스템(yeast two hybrid system)의 GNG4 사이의 아무런 상호작용이 없는 것을 나타낸 것이다.
도 12c는 면역침강법을 통해 N1, N2 및 N4가 GNG4 서브유닛에 특이적으로 결합하는 것을 나타탠 것이다.
도 12d는 I-V 관계 곡선 실험의 도식적인 그림을 나타낸 것이다.
도 12e는 1차 배양된 성상교세포에서의 6.09nM Gβγ- (빨강) 및 6.09nM BSA 유도의 전류(검정)의 I-V 곡선을 나타낸 것이다.
도 12f는 각 조건에서의 -100mV 전류 진폭을 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 13a 내지 도 13f은 면역전자현미경 사진을 나타낸 것이며, Best1(A-C) 및 TREK-2(D-F)를 면역금 및 은으로 염색하였으며(dark specks, 화살촉), GFP(성상교세포를 나타내는)는 면역퍼옥시다제로 염색하였다(dark amorphous deposits, 화살표).
도 13a는 Best1 면역표지를 성상교세포의 세포체에 한 것을 나타낸 것이다.
도 13b는 많은 금 입자들은 세포질에서 발견되는 mBest1 면역표지를 나타낸 것이다.
도 13c는 Best1 표지입자는 말초돌기의 막 근처(마이크로도메인)에 주로 관찰되는 것을 나타낸 것이다.
도 13d 및 도 13e는 많은 금 입자들은 TREK-1 면역표지들이 세포질 내에서 발견되는 것을 보여주며, 도 13d는 세포체의 새포막 근처를 도 13e는 돌기 근처에 주로 위치하는 것을 나타낸 것이다.
도 13f는 TREK-1 면역표지는 마이크로도메인에서는 발견되지 않는 것을 나타낸 것이다.
도 14a 내지 도 14d는 엑소시토시스 저해제가 TREK-1 및 Best1 매개의 전류를 감소시키는 것을 나타낸 것이다.
도 14a는 TeTX(파랑) 또는 바필로마이신 A1(빨강)을 처리한 TREK-1 발현하는 Cos-7 세포의 I-V 곡선을 나타낸 것이다. 20nM TeTX를 TREK-1을 발현하는 COS-7 세포에 주입하였고, 2uM 바필로마이신 A1 TREK-1을 발현하는 COS-7세포에 1시간에서 1시간 30분동안 전처리하였다. 램프(ramp)는 +70 에서 -150mV 이며, representative trace는 5분간을 나타낸 것이다.
도 14b는 +70 에서 -150mV의 전류 범위를 막대그래프로 나타낸 것이다(**, p=0.003, *, p=0.019).
도 14c는 배양된 성상교세포로부터 Ca2 + -활성화 음이온 전류의 I-V 곡선을 나타낸 곡선을 나타낸 것으로, 전류는 20nM TeTX 주입 E는 2uM 바필로마이신 A1의 전처리로 저해되었고, I-V 곡선은 다음과 같은 내부 피펫 용액으로 기록하였다: 135 NMDG-Cl + 0 uM Ca2 +(검정), 135 Cl + 4.5 uM Ca2 +(초록), 135 NMDG-Cl + 4.5 uM Ca2+(파랑, 2 uM 바필로마이신 A1을 1시간동안 세포밖에서 전처리), 135 NMDG-Cl + 4.5 uM Ca2 + + 20 nM TeTX(빨강). 외부 용액은 150mM NMDG-Cl이다.
도 14d는 -100mV에서 전류 진폭의 막대그래프를 나타낸 것이다(*1, p=0.04, *2, p=0.03, *3, p=0.01).
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
< 실시예 1> 유전자 클로닝 및 shRNA 벡터 설계
1-1. G protein signaling
pSport6-RGS-2(Regulatory G protein signaling 2)은 Openbiosystems에서 구입하였으며, GICG(pCDNA3.1-SS-ECFP-TM-Gα iC315G) 및 Gs(pCDNA3.1-SS-ECFP-TM-Gs)는 네빈 램버트 박사(Dr. Nevin Lambert로부터 제공받았다)(Digby et al.,2008). pRK-β-Ark(Beta-adrenergic receptor kinase)의 C말단은 루시에 랑주뱅 박사(Dr. Lucie Langevin)로부터 제공받았으며(Koch et al.,1993), 마우스 phosducin의 C 말단(251-278 a.a.)(서열번호 6, gefmvtdqlgedffavdleaflqefgllpekegsg)을 PCR로 증폭시켜(프라이머: Sense 5'- ggggaattcatggtcactgaccagctgggg-3' 서열번호 7, antisense 3'- cccggatccctattccttttctgggagcaatcc-5' 서열번호 8, denaturation: 95℃ 1분, annealing: 58℃ 1분, extension: 72℃ 30초, 35 cycle, DNA 중합효소: taq polymerase (New England Biolabs)) EcoR1 및 BamH1 제한효소를 이용하여 pIRES2-dsRed (Clontech) 벡터에 삽입하였다.
1-2. Best1 - shRNA , 마우스 Best1 shRNA 인센서티브 형태 및 Best1 - W93C 통로 돌연변이( shRNA 인센서티브 형태)의 제조
shRNA의 타겟 부분으로 마우스 Best1 뉴클레오티드(NM_011913.2)의 774부터 793까지의 염기서열(5’-tttgccaacttgtcaatgaa-3’, 서열번호 9)을 선택하였다. 상보적인 올리고머(5’-tttgccaacttgtcaatgaattcaagagatcattgacaagttggcaattttttc-3’, 서열번호 10 및 5′-cgagaaaaaatcgcatagcgtatgccgtttctcttgaaaacggcatacgctatgcgaa-3’, 서열번호 11) 를 이용하여 PSicoR-Best1-shRNA를 합성하였다. 강화된 이중가닥 올리고머를 HpaI-XhoI 제한 효소를 이용하여 pSicoR lentiviral vector(Addgene) 에 삽입하였고(Ventura et al., 2004), 시퀀싱(Sequencing)에 의해 확인하였다. 대조군으로 Scrambled shRNA-containing pSicoR construct를 이용하였다. 올리고뉴클레이티드 프라이머(sense 5’-gacagctacattcagctcatctgcatatccttcgttctgggtttc-3’서열번호 12, antisense 5’-gaaacccagaacgaaggatatgcagatgagctgaatgtagctgtc-3’서열번호 13)들을 이용하여 퀵체인지 멀티 위치지정돌연변이 키트(Stratagene)로 Best1 shRNA 인센서티브 형태가 만들어졌고, 시퀀싱(Sequencing)으로 확인하였다(Lee et al., 2010),(Park et al., 2009). 올리고머뉴클레오티드 프라이머(sense 5’-ggtgagccgctgctggagccagtac-3’서열번호 14, antisense 5’-gtactggctccagcagcggctcacc-3’서열번호 15)들을 가지고 퀵체인지 멀티 위치지정돌연변이 키트(Stratagene)를 이용하여 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이(oligonucleotide-directed mutagenesis)로 Best1 통로(pore) 돌연변이(Best-W93C)를 만들었다.
1-3. 래트 ( Rat ) TREK -1 cDNA 의 준비
공지된 RT-PCR-based gateway cloning방법(Kim et al., 2010)을 이용하여 래트(rat) TREK-1(GenBank Accession No. AY727922)의 전체를 인코딩하는 cDNA(서열번호 16)를 얻었다.
1-4: TREK -1- shRNA
마우스 TREK-1(NM_001159850)의 TREK-1-shRNA(서열번호 1)는 1043에서 1063까지의 뉴클레오티드(5′-gcgtggagatctacgacaagt-3′서열번호 17)에서 타겟이 되며 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 pSicoR system로 삽입을 하였다.
< 실시예 2> 세포 배양
2-1. 1차 대뇌 피질 성상교세포 준비
C57BL/6 마우스의 P0-P3 또는 GFAP-GFP 트랜스제닉(transgenic)마우스(Jackson laboratory)로부터 1차 피질 성상교세포를 준비하였고, 모든 실험절차는 한국과학기술연구원(KIST, Seoul, Korea)의 가이드라인에 따라 이루어졌다.
보다 구체적으로 대뇌피질을 지지하는 뇌막으로부터 분리하였고, 분쇄에 의해 갈고 분리시켜 하나의 세포 현탁액(single cell suspension)으로 만들었다. 세포들은 25 mM 글루코오스, 10 % heat-inactivated horse serum, 10 % heat-inactivated fetal bovine serum, 2 mM 글루타민, 1000 units/ml 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Invitrogen)에서 성장시켰고, 배양은 37℃의 가습된 5 % CO2 함유 대기 중의 인큐베이터에서 이루어졌다. 배양 셋째 날, 세포들을 피펫팅으로 반복하여 세척하였고, 부유물 및 잔해물을 제거하기 위해 배지를 갈아주었다.
2-2. GluR1 - L497Y 를 발현하는 HEK ( Human Embryonic Kidney ) 293T 세포의 준비
HEK 293T 세포들을 Korean Cell Line Bank(Seoul National University)로부터 구입하였고, 10 % 소태아혈청(Invitrogen), 100 units/ml 페니실린(Invitrogen) 및 100g/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 DMEM(Invitrogen)에서 37℃의 가습된 95 % 공기 및 5 % CO2 대기 상태로 배양하였다. 스니퍼패치를 하기 전날, 상기 HEK 세포에 Effectine(Qiagen, USA)을 이용하여 1:10 비율의 pEGFP-N1(green fluorescence protein) 및 pCINeo-GluR1-L497Y(5 μg per 60 mm dish) 또는 1:3 비율의 pDsRed (red fluorescence protein) 및 pCINeo-GluR1-L497Y를 가지고 형질주입 시켰다. 5 M CNQX(Tocris, USA)는 AMPA 수용체-매개의 세포독성을 차단하기 위해 항상 배지에 보충되었다.
2-3. 스니퍼패치의 준비(성상교세포 및 GluR1 - L497Y 를 발현하는 HEK 세포)
배양 다섯째 날(스니퍼패치를 수행하는 날) 상기 실시예 2-2에서 형질 주입된 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포를 분리하였고, 성상교세포와 함께 커버글라스에 넣었다(5 x 103 cells per coverglass). 5 M CNQX(Tocris, USA)도 상기 성상교세포와 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포가 혼합된 배양에 넣었다.
GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포의 정착은 스니퍼패치를 하기 1시간 전에 이루어졌고, 혼합한 스니퍼패치를 수행하는 날에 이루어졌다.
2-4. 스니퍼패치의 준비(대뇌 피질 뉴런 및 GluR1 - L497Y 를 발현하는 HEK 세포)
뉴런의 스니퍼패치를 수행하기 위하여, 1차 대뇌 피질의 배양된 뉴런을 C57BL/6 마우스 P0-P1로부터 준비하였다(Wang et al., 2001).
보다 구체적으로 C57BL/6 마우스의 대뇌 피질을 분리하고, Mg2 +- and Ca2 +- free HBSS(Hank’s balanced salt solution) 함유하는 0.025% 트립신, 6μg/ml DNase, 1 mg/ml 소혈청알부민 및 10 mg/ml 글루코오스에서 37℃ 15분간 배양하였다. 트립신처리(Trypsinization)는 1 mg/ml 대두 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor)를 첨가하여 중지하였고, 그 후 5 분 1500 rpm 상태로 원심분리 하였다. 원심분리 후의 침전물(pellets)을 10 % FBS 및 10 % horse serum(트립신 저해제 및 DNase)으로 분말화하였다. 세포현탁액을 파이어폴리쉬(fire polished) 파스퇴르 피펫에 통과시켰고 3 분 1500 rpm 상태에서 원심분리 시켰다. 원심분리된 대뇌 피질 뉴런 세포들을 neurobasal medium(Invitrogen), 2% B27 supplement, 2 mM L-글루타민, 1 % 페니실린-스트렙토마이신(50 units/ml 페니실린 및 50 g/ml 스트렙토마이신)(Invitrogen)로 이루어진 배양 배지에서 재부유 시켰고, 상기 세포들을 커버글라스 당(per coverglass) 2.5 x 105 cells로 배치하였다. 배양은 37℃의 가습된 5% CO2 / 95% O2 함유 대기 중에 이루어졌다.
GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포를 배양하는 대뇌피질 뉴런으로의 첨가는 스니퍼패치를 수행하는 날에 이루어졌다.
2-5. 스니퍼패치의 준비(바로 분리된 해마에 위치하는 성상교세포 및 GluR1 -L497Y를 발현하는 HEK 세포)
바로 분리된 해마(hippocampal)에 위치하는 성상교세포를 얻기 위해, 9-12주 된 GFAP-GFP 마우스의 뇌를 350m 두께로 잘랐다(Leica VT1000s). 각 잘려진 부분의 CA1 해마(hippocampal)는 1 KHz sine wave function에서의 function generator(EZ digital, Korea)의 통제하의 Alternating electronic relay switch(Omron G2R-2-S)와 연결된 진동하는 광택 유리 피펫의 팁(tip)으로 기계적으로 해리하였다. 기계적 해리가 일어난 약 5분 후, 해리된 세포들을 포함하는 ACSF(Artificial cerebrospinal fluid) 용액을 모았고, 5 분 1000 rpm 상태에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 모아진 세포들을 0.1 mg/ml PDL-코팅된 커버글라스(cover glass)에 배치시켰고, 사용하기 전 약 2시간동안 인큐베이터(incubator)에 두었다. 그리고 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포를 바로 분리된 GFP-양성 성상교세포와 함께 커버글라스에 첨가하였다.
바로 분리된 성상교세포로부터의 스니퍼패치는 플레이팅(plating) 6시간 이내에 수행하였다.
2-6. 성상교세포의 형질주입
성상교세포를 커버글라스에 배치시킨 4일째 되는 날, 초대배양된 성상교세포를 마이크로포레이터(Invitrogen)를 이용하여 최적화된 전압 프로토콜(1200V, 20 pulse width, 2 pulses)로 아래의 여러가지 cDNAs 또는 shRNA로 형질주입 하였다. 각 형질주입의 세포 수는 2 X 106 이었으며, 형질주입된 세포들을 커버글라스에 놓았고 최소 36시간동안 배양하였다.
형질주입된 성상교세포를 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포들과 혼합하는 날 스니퍼패치를 수행하였다.
형질주입 시 아래와 같은 cDNAs 및 shRNA가 사용되었다.
: Gαq 신호전달을 막기 위한 5μg pSPORT6-RGS-2(실시예 1-1 참조) 및 0.5μg pDsRed (Clontech), Gαi 신호전달을 조사하기 위한 5μg pCDNA3.1-SS-ECFP-TM-Gi1-CG(GiCG) (Nevin A. Lambert 박사로부터 얻음/ 참고문헌: Some G protein heterotrimers physically dissociate in living cells, Gregory J. Digby, Robert M. Lober, Pooja R. Sethi, and Nevin A. Lambert, PNAS, November 21, 2006 vol. 103 no. 47 17789-17794 ) 또는 5μg pCDNA3.1-SS-ECFP-TM-Gs(Nevin A. Lambert박사로부터 얻음/ 참고문헌: Some G protein heterotrimers physically dissociate in living cells, Gregory J. Digby, Robert M. Lober, Pooja R. Sethi, and Nevin A. Lambert, PNAS, November 21, 2006 vol. 103 no. 47 17789-17794 ), Gαi- Gβγ 해리를 저해하기 위한 5 μg pRK-β-Ark-C terminus(실시예 1-1 참조) 및 0.5μg pDsRed(Clontech) 또는 5μg pIRES2-dsRED-Phosducin-c terminus(실시예 1-1 참조), Best1 발현을 차단하기 위한 5μg pSicoR-Best1-shRNA(실시예 1-2 참조), 구제실험(rescue experiment)을 위한 5μg pSicoR-Best1-shRNA(실시예 1-2 참조) 및 5μg pIRES2-dsRed-Best1(shRNA 인센서티브 형태)(실시예 1-2 참조), 빠른 및 느린 방출 기작을 차단하기 위한 5μg pSicoR-Best1-shRNA(실시예 1-2 참조) 및 5μg pSicoR-TREK-1-shRNA(실시예 1-4 참조), 빠른 방출 기작의 구제실험(rescue experiment)을 위한 5μg pSicoR-TREK-1-shRNA(실시예 1-4 참조) 및 5μg pIRES2-GFP-TREK-1(래트)(rat TREK-1을 Invitrogen의 gateway system (recombination 방법)을 이용하여 클로닝 하였음)
< 실시예 3> 스니퍼 패치를 위한 HEK cell 전류 및 성상교세포의 Ca 2 + 동시 측정
3-1. 스니퍼 패치
스니퍼 패치를 하는 당일에, 배양된 성상교세포(HEK 세포가 첨가된)를 Fura-2 AM(20% 플루로닉 산 5 ul가 혼합된)(Invitrogen)이 함유된 배지에서 40분간 배양하고, 실온에서 세척한 후, 현미경관찰을 할 수 있게 만들었다. 외부용액은 150mM NaCl, 10mM Herpes, 3mM KCl, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 5.5mM 글루코오스이며, pH는 7.3이며, 오스몰농도는 325 mOsmol kg-1이었다. 510nm 파장의 강도이미지는 iXon EMCCD(DV887 DCS-BV, ANDOR technology)를 이용하여 340nm 및 380nm 방출파장에서 찍었다. 2개의 결과 이미지는 Axon Imaging Workbench version 6.2 (Axon Instruments)에서의 비율 계산을 이용하였다. pClamp 9.2를 이용한 Multiclamp 700B amplifier(Molecular device)을 이용하여 전압클램프(voltage clamp)(Vh=-70mV)하에 GluR1L497Y를 발현하는 HEK 세포로부터 GluR1LY의 전류 조절이 측정하였다. 도출전극(4-7MΩ)은 아래와 같이 채워졌다.
: 110 mM Cs-Gluconate, 30 mM CsCl, 0.5 mM CaCl2, 10 mM Hepes, 4 mM Mg-ATP, 0.3 mM Na3-GTP 및 10 mM BAPTA(Ph는 CsOH로 7.3으로 조절하고 오스몰 농도는 설탕으로 290 내지 310 mOsm/kg으로 조절하였다).
동시 측정을 위하여, pClamp 9.2를 이용하여 이미징 워크벤치(Imaging workbench)를 동시에 작동시켰다.
3-2. G 단백질 결합 수용체 작용자들의 가압작용
스니퍼패치를 수행하는 동안, 성상교세포의 PAR1(protease-activated receptor 1) 수용체는 PAR1 작용자의 가압작용(pressure-application)에 의해 활성화되고, Picospritzer(Parker Instruement)를 100 ms 사용하여, 500μM TFLLR(Peptron, Korea)를 포함하는 유리 피펫을 통해 성상교세포 가까이 위치시켰다. Gi가 연결된 G 단백질 결합 수용체를 활성화시키기 위하여, 각각의 1μM CCPA(A1 receptor agonist)(Sigma Chemicals, USA), 300μM ACEA(CB1 receptor agonist)(Sigma Chemicals, USA) 및 300μM 바클로펜(GABAB agonist)(Sigma Chemicals, USA)를 100ms 동안 가압작용(pressure-applied) 시켰다.
3-3. 약물처리
GluR1-L497Y-매개의 전류를 차단하기 위해 세포들을 10μM CNQX(Tocris, USA)로 5 분간 전처리 하였다.
Gi 신호전달 경로를 차단하기 위해 성상교세포를 스니퍼패치 수행 전에 12 내지 20 시간동안 1μg/ml Pertussis Toxin(PTX)(Sigma Chemicals, USA)이 들어있는 배양배지에 전처리 하였다.
VGluT (Vesicular glutamate transporter)를 차단하기 위해 HEK 세포와 성상교세포가 혼합된 세포들을 1μM 로즈 벵갈(Sigma Chemicals, USA)에 30분간 전처리 하였다.
H+-ATPase를 차단하기 위해 HEK 세포와 성상교세포가 혼합된 세포들을 5μM 바필로마이신 A1(for 30 min)(Tocris, USA) 또는 1μM 콘카나마이신 A(1시간 동안)에 전처리 하였다.
엑소시토시스를 차단하기 위해 성상교세포를 4μg/ml TenT(Tetanus Toxin)(Tocris, USA)가 보충된 배지에 12 내지 18시간 동안 전처리 하였다. TenT의 주입을 위하여, 4μg/ml TenT 및 200μM Fura-2 penta-potassium salt(불침투성 형태)를 내부 피펫 용액에 넣고 패치-피펫(patch-pipette)을 이용하여 하나의 성상교세포에 넣은 후, 전세포 패치(whole-cell patch)를 수행하였다.
BoToxB(Botulinum Toxin B)(Biological Lab, USA) 주입을 위하여, 8μg/ml BoToxB(대조군으로 8μg/ml 소혈청알부민) 및 200μM Fura-2 penta-potassium salts를 비슷하게 주입하였다. 주입시간은 20분이고 Fura-2는 성공적 주입을 위한 지표(indicator)를 사용하였다. 아래의 차단제 50Mm을 사용하였고, Quinine은 100μM 사용하였다.
: NPPB(Sigma Chemicals, USA), NFA(Sigma Chemicals, USA), DIDS(Sigma Chemicals, USA), DCPIB(Sigma Chemicals, USA), PPADS(Sigma Chemicals, USA) 및 CBX(Sigma Chemicals, USA).
이러한 약물들은 500μM TFLLR(Peptron, Korea) 첫 적용 후 10분간 전처리 하였다. 그리고 두 번째 TFLLR(Peptron, Korea) 적용은 이러한 차단제의 존재 하에 이루어졌다.
세포 내 Ca2 +를 킬레이팅하기 위해, 혼합된 세포들을 30분간 20μM BAPTA-AM(Sigma Chemicals, USA)로 전처리 하였다. 30분간 BAPTA-AM(Sigma Chemicals, USA) 처리는 Ca2 + imaging에서 TFLLR-매개의 Ca2 + 증가를 차단하기에 충분했다.
성상교세포의 글루타메이트 방출을 유도하는 cAMP 변화의 가능성을 제거하기 위해, 500μM 포스콜린(Sigma Chemicals, USA) (아데닐산고리화효소를 활성화시키기 위한)을 100ms로 가압작용(pressure-applied)하였다.
cAMP를 증가시키는 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase)를 저해하기 위해, 세포들을 5분간 100μM IBMX(Tocris, USA) 전처리 하였고, 100μM IBMX(Tocris, USA) 존재 하에 TFLLR(Peptron, Korea)을 적용하였다.
< 실시예 4> 두 세포 스니퍼 분석( Two cell sniffer assay )
스니퍼 패치를 하는 당일에, 배양된 성상교세포(HEK 세포가 첨가된)를 현미경으로 관찰할 수 있게 만들었다. 외부용액은 150mM NaCl, 10mM Herpes, 3mM KCl, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 5.5mM 글루코오스, pH는 7.3, 오스몰농도는 325 mOsmol kg-1이었다. 럽쳐전류(Rupture current)는 pClamp 9.2를 이용한 Multiclamp 700B amplifier(Molecular device)을 이용하여 전압(Vh=-70mV)하에 측정하였다. 도출전극(4-7MΩ)은 다음과 같이 채웠다.
: 5mM 글루타메이트, 135mM CsCl, 0.5mM CaCl2, 10mM Herpes, 4mM Mg-ATP, 0.3mM Na3-GTP, 10mM BAPTA 및 6.09nM Gβγ (pH는 CsOH로 7.3으로 조절하고 오스몰농도는 설탕으로 290 내지 310 mOsm/kg으로 조절하였다).
유전자 침묵(gene silencing)과 관련하여, 형질주입 방법은 스니퍼패치를 위하여 한 동시측정과 같았다. 경쟁적 정량법(competition assay)에서, 펩타이드로 합성되는 N1-N4 100mM을 측정될 성상교세포에 피펫으로 첨가하였다. pClamp 9.2를 이용한 Multiclamp 700B amplifier(Molecular device)을 이용하여 전압클램프(voltage clamp)(Vh=-70mV)하에 GluR1L497Y를 발현하는 HEK 세포로부터 GluR1LY의 전류 조절을 측정하였다. 도출전극(4-7MΩ)은 다음과 같이 채웠다.
: 110 mM Cs-Gluconate, 30 mM CsCl, 0.5 mM CaCl2, 10 mM Hepes, 4 mM Mg-ATP, 0.3 mM Na3-GTP 및 10 mM BAPTA(Ph는 CsOH로 7.3으로 조절하고 오스몰농도는 설탕으로 290 내지 310 mOsm/kg으로 조절하였다)
HEK 세포의 측면 파열 후, 전체 활성화를 매개하는 GluR1-L497Y가 1mM 글루타메이트의 처리로 유도하였다. 그리고 성상교세포의 측면 Gβγ에 파열 10분 후 주입하였다. 이 파열은 성상교세포 사이 및 GluR1-L497Y를 발현하는 HEK 세포 모두에서 측정되는 내향성 전류를 유도하였다.
< 실시예 5> 효모( yeast )의 하이브리드 시스템
The TREK-1-N 1-4을 GAL4 DNA BD(binding domain)를 인코딩하는 pGBKT7 와 연결하고 gamma 4을 AD(activation domain)을 인코딩하는 pGADT7로 클론(clone)하였다. TREK-1-N 와 gamma 4 사이의 단백질-단백질 상호작용을 알아보기 위해, BD/TREK-1-N 및 AD/gamma 4를 yeast strain AH109로 형질전환 시켰다. AH109은 히스티딘을 합성하지 못하였다. 그러나, TREK1-N 및 gamma 4 사이의 상호작용은 효모(yeast)가 His3 enzyme을 만들 수 있게 하며, 히스티딘 생합성을 일으키며 배지에 His가 성장하게 하였다.
< 실시예 6> 풀다운 어세이( Pull down assay )
GFP-gamma 4 및 hemagglutinin(HA)-TREK-1은 HEK293T cells에서 공동발현하며 포스트-트랜스펙션(post-transfection) 24시간 동안 추출하였다. HA-IRK1 및 HA-GirK1 은 결합 친화도(binding affinity)의 음성대조군 및 양성대조군으로 사용하였다. 세포 용해물은 HA를 가지고 면역침강법(immunoprecipitation)을 수행하였다. 4℃에서 2시간 배양 후, 비드(beads)를 냉각의 PBS(phosphate-buffered saline)로 4차례 세척하였다. 붙은 단백질들은 SDS sample buffer로 녹여서 분리하였고, 12% SDS-PAGE gels로 분리하였다. 그리고 블랏(blots)을 항-HA 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology) 또는 항-GFP 항체(1:1000; Ab cam)에서 4 °C로 하룻밤 배양하였다. 그리고 블랏(blots)을 세척하였고 horseradish peroxidase-conjugated goat 항마우스(anti-mouse) 또는 항래빗(antirabbit) IgG로 배양하였고, 세척 후, 강화된 화학발광(Amersham Biosciences)으로 면역반응성을 이용하여 검출하였다.
< 실시예 7> 웨스턴 블로팅( Western blotting )
TREK-1의 유전자 침묵(Gene silencing)은 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 수행하였다. TREK-1 발현의 shRNA-매개의 저해를 관찰하기 위해, 대조군으로 1μg 마우스 pIRES-GFP-TREK-1 및 1.5μg pSicoR-TREK-1-shRNA(실시예 1-4 참조) 또는 1.5μg pSicoR-scrambled-shRNA((5’- TTCGCATAGCGTATGCCGTTTTCAAGAGAAACGGCATACGCTATGCGATTTTTTC-3’, 서열번호 18)을 실시예 1-2와 동일한 방법으로 Xba I - Xho I 제한효소를 이용하여 pSicoR vector에 삽입하였다)를 형질주입 시약인 Effectine(Qiagen, USA)을 이용하여 35mm dishes에 심어진 5 X 105 HEK293T 세포에 넣어 형질전환 시켰다. 48시간 배양 후, 세포들을 RIPA buffer로 용해하였고, 30μg 단백질들을 10% gels을 가지고 SDS-PAGE를 통해 분리하였고, PVDF membranes에 블랏(blot)하였다. 블랏(blots)들은 항-GFP 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4°C 하룻밤 동안 배양하였다. 블랏(Blots)들을 세척하였고 horseradish peroxidase-conjugated goat 항마우스(anti-mouse) 및 항래빗(anti-rabbit) IgG로 배양하였고, 세척 후 강화된 화학발광(Amersham Biosciences)으로 면역반응성을 이용하여 검출하였다. 밴드 강도(band intensity)가 얻어졌고 ImageQuant LAS 4000(General Electric Company)를 통해 분석하였다.
< 실시예 8> Quantitative RT - PCR
제조사의 권장에 따라 RiboEx kit(GeneAll, Korea)를 이용하여, 형질주입 하였고 배양된 성상교세포의 scrambled shRNA 또는 TREK-1 shRNA로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA의 순도와 농도는 260 nm 및 280 nm의 흡광도 측정을 통해 확인하였다. RNA는 제조사의 설명에 따라 총 볼륨이 100μl인 cDNA로 역전사 하였다(Superscript VILO cDNA synthesis kit, Invitrogen). 모든 마우스 TREK-1 (NM_001159850) 및 GADPH (NM_008084)의 프라이머들은 IDT Primerquest software (www.idtdna.com/primerquest)를 이용하여 디자인하였고 블라스트(blast) 하였다.
TREK-1의 프라이머 시퀀스는 아래와 같다.
Probe: 5’-/56-FAM/ccgcctcct/ZEN/cgtttccttgaact/3IABkFQ/-3’
Primer 1: 5’-tggctacgggtgatctctaag-3’, 서열번호 19
Primer 2: 5’-gctggaacttgtcgtagatctc-3', 서열번호 20
GAPDH의 프라이머 시퀀스는 아래와 같다.
Probe: 5’-/56-FAM/tgcaaatgg/ZEN/cagccctggtg/3IABkFQ/-3’
Primer 1: 5’-gtggagtcatactggaacatgtag-3’, 서열번호 21
Primer 2: 5’-aatggtgaaggtcggtgtg-3’, 서열번호 22
Real-time PCRs은 ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems StepOnePlusTM Real Time PCR System)으로 96 웰 플레이트에서 수행하였다. 마지막 반응 볼륨은 20 μl 이었고, 각 샘플을 3번씩 분석하였다. 사이클의 온도조건은 다음과 같았다.
: 50 °C에서 2분, 95 °C에서 15분, 95 °C 에서 15초 및 60 °C에서 1분의 40사이클을 반복하였다.
Sequence Detector Software(Applied Biosystems)를 PCR 데이터를 추출하는데 이용하였고, 추가적 분석을 위하여 Excel 2010(Microsoft Corporation, Redmond, WA)로 전달하였다. 타겟이 되는 유전자 발현의 양은 내생 레퍼런스(endogenous reference) 및 상대적 캘리브레이터(calibrator)를 통해 정규화 하였다. GAPDH는 이번 실험의 내생 레퍼런스(endogenous reference)로 이용하였다. 2-ΔΔCt 식은 타겟 유전자 발현양을 계산하기 위해 사용하였다(Livak and Schmittgen, 2001).
< 실시예 9> 배양된 성상교세포의 면역형광염색( immunocytochemistry )
TREK-1 항체(Alomone labs, 래빗 다클론성 항체 1:100) 특이성은 TREK-1-shRNA와 결합된 배양된 성상교세포의 면역형광염색(immunocytochemistry)로 테스트하였다. TREK-1-shRNA로 전처리된 성상교세포들을 형질주입 하였고, 48시간동안 추가적으로 커버글라스에서 성장시켰다. 세포들을 실온에서 30분간 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 고정시켰고, 5분간 0.5% NP40를 가진 PBS에 투과시켰다. 비특이적 결합은 2% 당나귀 혈청에서 1시간 배양으로 방지되었다. 세포들은 항-TREK-1 및 항-GFAP(Millipore, 닭 다클론성 항체 1:500)의 1차 항체(Primary antibodies)으로 4℃ 하룻밤 동안 배양하였다. 세척 후 DyLight 488 또는 649-conjugated 2차 항체(Secondary antibody)(Jackson lab, 1:400)를 추가하였고 실온에서 2시간 배양하였다. 세포들은 세척 후 증가하였으며, Nikon A1 공초점 현미경으로 관찰하였다.
< 실시예 10> 확산방정식( Diffusion equation )을 이용한 모델링
하나의 성상교세포로부터 방출되는 글루타메이트의 총량을 측정하기 위하여, 스니퍼패치의 제한을 고려하여 확산방정식(Diffusion equation)의 수학적 모델을 이용하였다. 각각의 성상교세포는 글루타메이트를 통과시킬 수 없는 경계벽을 가지고 있으며 균일하게 세포 표면에 있다는 것을 전제하였다. 확산 계수로 글루타메이트 D를 정수로 전제하고 외부 가능성을 배제한다면, 확산방정식(diffusion equation)(Ito, 1992)은 [수학식 1]과 같이 쓰여질 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112012079833535-pat00001

Φ는 농도, t는 시간, x는 3차원의 위치(position)를 뜻한다. 연산자 δ/δt는 t 및 ▽2에 대한 편미분은 직교좌표계에 따른 [수학식 2]와 같은 라플라스 연산자(Laplace operator)로 정의되어 진다.
[수학식 2]
Figure 112012079833535-pat00002
D≡0.3㎛ 2 / ms 는 확산 계수로 사용하였다(Beenhakker and Huguenard , 2010). 글루타메이트가 점원(x=x0) 및 (시간 t = 0)으로부터 방출되면, 글루타메이트 방출의 자극의 첫 조건은 Φ x0(x,0)≡δ(x-x0)이다(δ는 디렉-델타 함수(Dirac delta function)). 편미분을 풀면 (수학식 1), 첫 조건은 3차원상으로 Φ x0(x,t)≡(4πDt)-3/2e-┃x-x0┃/4 Dt 의 해답이 나온다. 따라서, 임의의 첫 조건 Φ(x,0)을 수학식 1에 대입하면 아래의 수학식 3이 나온다.
[수학식 3]
Figure 112012079833535-pat00003

상기 수학식 3은 글루타메이트 소스의 형상(shape)에 의존하는 초기 조건(Φ(x0,0))에 의해 증가되는 글루타메이트 방출의 자극 반응 한 점(point)(Φ x0(x,t))의 적분식이다. 하나의 성상교세포는 100μm ×100μm 수치로 하여 사각형의 모양으로 사용되었다. 스니퍼패치 실험에서 하나의 성상교세포에서의 글루타메이트 방출을 검출하기 위해, 센서가 농도로 전환하는(Φ e (xd,t))(검출지점은 xd)(글루타메이트에 대한 GluR1-L497Y 농도-반응 관계를 이용) 전류장치에 의해 글루타메이트를 검출하였다. 컴퓨터 시뮬레이션 모델(수학식 3) 및 실험농도 프로파일을 비교하여(Φ e (xd,t)), 최고의 검출 지점 xd를 얻었다. 한번 xd를 계산하고 나니, 원래의 지점과 검출지점 농도 사이의 비율을 결정할 수 있었고, 이는 하나의 성상교세포로부터 방출되는 글루타메이트의 원래 양을 계산하는데 쓰여지게 되었다. 하나의 성상교세포로부터 방출되는 글루타메이트 양을 계산한 후, 글루타메이트 농도를 시뮬레이션화 하기 위해 수학식 3의 검출지점의 거리를 다양화하였다. 거리는 성상교세포의 막과 뉴런의 막 사이를 최소화하기 위해 10 nm 에서 40 nm 까지 다양화 하였다. 빠른 글루타메이트 방출의 농도 값은 최고점에서 약 100μM까지 올라갔고, 10에서 40 nm의 각 거리는 130 에서 100μM의 농도를 보였다. 검출농도 값의 증가 시간은 매우 빠른 운동성을 보여, 글루타메이트 방출의 자극으로 추정하였고, 실험농도 값과 잘 맞았다. 그러나, 느린 글루타메이트 방출 기작에서는, 자극 방출(impulse release)과 실험적 농도 값과 잘 맞지 않았다.
따라서, 계속적인 글루타메이트 방출을 전제하여 실험 농도 값을 맞추기 위해 4th order polynomial를 사용하였다. 10-40 nm 의 다른 거리에서의 예측 농도는 0.8 내지 0.9 μM로 매우 유사하였다. 따라서, 정점에서의 빠른 기작의 농도는 느린 기작의 농도의 100배였다. 반대 뉴런의 막으로부터의 글루타메이트의 측정된 농도를 통해, 글루타메이트 수용체 타입에 따른 알려진 농도-반응 관계를 비교하여 수용체 타입을 예측할 수 있었다. 빠른 기작은 NMDA 수용체 및 mGluR(metabotropic glutamate receptors) 모두 활성화시킬 수 있는 반면에 느린 기작은 우선적으로 NMDA 수용체를 활성화 시킨다는 것을 예측하였다.
< 실시예 11> 면역형광염색 -전자현미경( Electron microscopic immunohistochemistry )
20 내지 25g의 무게가 나가는 3개의 GFP-GFAP 트랜스제닉(transgenic) 마우스들을 실험에 사용하였다. 조직을 고정시키기 위해, 마우스들을 펜토바비탈나트륨(80 mg/kg, i.p.)으로 깊게 마취시켰고, 헤파린이 처리된 정상적인 염분 10ml을 심장에 살포하였고, pH 7.4(PB) 0.1 M phosphate buffer에 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 및 0.01% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 혼합하여 살포하였다. 해마(hippocampus)가 제거되었고, 정착액에 2시간 4 °C에 정착시켰다. 절편(Sections)은 바이브라톰(Vibratome) 60um으로 화살모양으로 잘려나갔고, PB에 30% sucrose로 4℃ 하룻밤 동안 냉동보존 하였다. 절편(Sections)을 20분간 드라이아이스로 냉동하였고, 침투를 강화하기 위해 PBS(phosphate-buffered saline; 0.01 M, pH 7.2)로 녹였다. 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 억제하기 위해 1% 수소화 붕소 나트륨(sodium borohydride)를 30분간 전처리 하였고, 내생의 과산화효소(Peroxidase)를 억제하기 위해 3 % H2O2를 10분간 처리하였고, 2차 항체 결합부위를 가리기 위해 10 % NDS(normal donkey serum(정상 당나귀 혈청) Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 처리하였다. GFP 및 Best1 또는 TREK-1의 두 개의 면역염색을 위하여, 상기와 같이 전처리된 해마(hippocampus)의 절편(Sections)을 닭 항-GFP (1:400; GFP-1020, 1229FP08, Aves labs, St. Tigard, Oregon) 및 래빗 항-Best1 (1:200) 또는 래빗 항-TREK-1 (1:50; APC-047, AN-02, Alomone labs, Jerusalem, Israel) 항체의 혼합에 하룻밤 배양하였다. Best1 항체의 특이성은 이전 연구에 의해 광범위하게 실험되었다(Park et al., 2009), (Lee et al., 2010), (Barro Soria et al., 2009). PBS로 헹군 후, 절편(Sections)을 biotinylated donkey anti-chicken (1:200, Jackson ImmunoResearch) 및 1 nm 금-결합 donkey anti-rabbit (1:50, EMS, Hatfield, PA) 항체의 혼합에 2-3시간 가량 배양하였다. 절편(Sections)을 PB의 1 % 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 10분간 고정시켰고, PBS로 여러 번 헹군 후, silver intensification solution (IntenSETM M, Amersham, Arlington Heights, IL)에 8분간 배양시켰고, 0.1 M 아세트산나트륨 및 PB로 헹궜다. 그리고 ExtrAvidin peroxidase(1:5,000, Sigma, St. Louis, MO)로 1시간 배양하였고, 면역퍼옥시다제(immunoperoxidase)는 DAB(nickel-intensified 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 관찰하였다. 절편(Sections)은 PB(0.5% osmium tetroxide in PB)에서 30분간 더 헹구어졌고, graded alcohols로 건조시키고, 벗겨진 Aclar plastic film (EMS)사이의 Durcupan ACM (Fluka, Buchs, Switzerland)에 평평하게 박고, 60 °C에 48시간동안 두었다.
해마(hippocampus) CA1 지역의 GFP 및 Best1 또는 TREK-1의 염색을 포함하는 칩(chips)은 웨이퍼(wafer)로부터 제거하였고, 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate)를 가지고 blank resin blocks에 접착하였다. 순차적인 얇은 절편은 포름바르-코팅된 싱글-슬롯 니켈 그리드로 모아졌고, 아세트산우라닐(uranyl acetate) 및 lead citrate로 염색하였다. 그리드(Grids)는 Hitachi H 7500 electron microscope(Hitachi, Tokyo, Japan)의 80 kV 가속 전류로 해서 관찰하였다. 이미지들은 현미경(microscope)에 붙어있는 Digital Montage software driving a MultiScan cooled CCD camera(ES1000W, Gatan, Pleasanton, CA)로 캡쳐하였고, TIFF 파일로 저장하였다. 1차 항원의 특이성을 조절하기 위해, 1차 또는 2차 항체가 생략되었다는 점만 제외하고 기술한 같은 방법으로 3개의 래트로부터 CA1 지역의 절단을 진행하였다. 1차 또는 2차 항체의 누락은 특정염색을 완벽히 없앴다. 게다가 면역반응성의 특이성은 같은 성상교세포의 순차적으로 인접한 얇은 절편의 면역염색과의 일치를 통해 확인할 수 있었다.
< 실시예 12> TREK -1 및 Best1 이 매개하는 전체 세포의 전류 측정
전류-전압(I-V)곡선은 TREK-1을 발현하는 COS-7로 측정하였다. 전류-전압(I-V)곡선은 +70에서 -100mV까지의 1000-ms-duration voltage ramps의 적용으로 수립하였다. Clampex 9.2 via Digidata 1322A data acquisition system (Molecular Devices)에 의해 통제되는 Axopatch 200A amplifier에 의해 데이터가 얻어졌다. 내부용액(Internal solution)은 아래와 같다.
: 150 mM KCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.3, 280osm
배스 용액(Bath solution)은 아래와 같다.
: 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5.5 mM 글루코오스, pH 7.3
성상교세포의 whole-cell patch clamp의 Ca2 + activated Cl- current (Best1 channel current)를 관찰하기 위한 피펫 용액(pipette solution)은 아래와 같다.
: 135 mM NMDG-Cl, 5 mM MgCl2, 5 mM (Ca2 +)-EGTA-N-methyl-D-glucamine (NMDG), 10 mM HEPES, 10 mM 글루코오스, pH 7.3, adjusted with NMDG
Ca2 +-free 세포내 용액(intracellular solution)은 아래와 같다.
: 135 mM NMDG-Cl, 5 mM EGTA-NMDG, 2 mM MgCl2, 8 mM HEPES, 10 mM sucrose, pH 7.3, adjusted with NMDG).
전류-전압(I-V)곡선은 +100에서 -100의 1000-ms-duration voltage ramps 적용으로 수립하였다.
< 실험예 1> 성상교세포에서의 글루타메이트 방출 기작 확인
1-1. 성상교 세포 내 Ca 2 + 수준이 글루타메이트 방출에 미치는 영향 시험
글루타메이트의 빠른 및 느린 방출 기작을 매개하는 신호전달경로를 조사하기 위하여, 다음과 같은 실험을 하였다. PAR1 수용체는 Gi /o 및 Gq /12와 연관되어 있기 때문에, ADP-리보실화에 의해 Gi 서브유닛의 활성을 저해하는 것으로 알려진 PTX(pertussis toxin)(Sigma Chemicals, USA)를 성상교세포와 전배양하여 Gi 경로를 선택적으로 저해하였고, 구체적으로는 Gi 신호전달 경로를 차단하기 위해 성상교세포를 스니퍼패치 수행 전에 12 내지 20 시간동안 1μg/ml PTX가 들어있는 배양배지에 전처리 하였고(실시예 3-3 참조) 스니퍼패치를 수행하였으며(실시예 3-1 참조), 그 결과를 도 1e, 도 1f, 도 1g, 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.
도 1e, 도 1f, 도 1g, 도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, PTX(Sigma Chemicals, USA)는 글루타메이트의 느린 방출 기작과 달리 성상교세포의 Ca2 + 반응에 영향을 미치지 않았고, 글루타메이트의 빠른 방출 기작에서 글루타메이트 방출 요소들을 선택적으로 거의 완벽하게 차단하였다. PTX에 의한 선택적 저해는 Gs 서브유닛의 과발현이 아닌, Gi의 PTX-인센서티브 형태의 과발현으로 상당히 구제(rescue)되었다(Digby et al.,2008).
1-2. G βγ 해리가 글루타메이트 방출에 미치는 영향 시험
G-단백질 결합 수용체의 활성화는 삼량체의 Gi-Gβγ 복합체로부터의 Gβγ 복합체의 해리로 알려져 있으므로(Koch et al., 1993), Gβγ 해리의 방해가 글루타메이트의 빠른 방출 기작에 영향을 주는지를 확인하기 위해 Gi 역할에 대한 실험을 하였다. 보다 구체적으로 Gαi 신호전달을 조사하기 위한 5μg pCDNA3.1-SS-ECFP-TM-Gi1-CG(GiCG) 또는 5μg pCDNA3.1-SS-ECFP-TM-Gs, Gαi- Gβγ 해리를 저해하기 위한 5 μg pRK-β-Ark-C terminus 및 0.5μg pDsRed 또는 5μg pIRES2-dsRED-Phosducin-c terminus 사용하여 성상교세포를 형질전환하여 스니퍼패치를 수행하였다. Gi agonist (1μM CCPA(A1 receptor agonist), 300μM ACEA(CB1 receptor agonist) 및 300μM 바클로펜(GABAB agonist)를 100ms 동안 가압작용(pressure-applied) 시켰다.)를 이용하여 스니퍼 패치를 수행하였다. PTX가 성상교세포에 칼슘에 영향을 주는 지를 알아 보기위해 PTX를 성상교세포에 처리하여 칼슘 이미징(510nm 파장의 강도이미지는 iXon EMCCD(DV887 DCS-BV, ANDOR technology)를 이용하여 340nm 및 380nm 방출파장에서 찍었다)을 수행하였고(실시예 2-6 참조), 각 결과를 도 1h 내지 도 1k, 도 9c, 도 9b, 도 9g 및 도 9h에 나타내었다.
도 1h 내지 도 1k, 도 9c, 도 9b, 도 9g 및 도 9h에 나타난 바와 같이, Gβγ의 해리를 방해하는 것으로 알려진(Bluml et al., 1997;Koch et al., 1993) Phosducin의 c 말단 및 β-ARK의 과발현은 Ca2 + 반응에 영향을 미치지 않았고, 거의 완벽하게 글루타메이트의 빠른 방출 기작을 차단하였다. 게다가, 잘 알려진 Gi-coupled G-단백질 결합 수용체의 작용자들은 글루타메이트의 빠른 방출 기작을 유도할 수 있었다.
: 주목할 만한 성상교세포내의 Ca2 + 증가 또는 느린 글루타메이트 방출 기작 없이, 바클로펜(Sigma Chemicals, USA), GABAB, agonist, CCPA(2-chloro-N(6)-cyclopentyladenosine)(Sigma Chemicals, USA), 아데노신 수용체 A1 작용자(adenosine receptor A1 agonist), ACEA(arachidonyl-2’-chloroethylamide), 카나비노이드 수용체 CB1 작용자 (cannabinoid receptor CB1 agonist) 및 이와 유사한 글루타메이트의 빠른 방출 기작에서의 글루타메이트 방출을 활성화시키는 것들은 TFLLR(Peptron, Korea)에 의해 유도되어질 수 있었다.
1-3. G q 신호가 글루타메이트 방출에 미치는 영향 시험
Gq 신호방식이 글루타메이트 방출 기작에 관여되는 것을 알아보기 위하여, Gq 서브유닛을 선택적으로 저해하는 것으로 알려진(Heximer et al., 1997) RGS-2를 과발현 하였고, 보다 구체적으로 pSport6-RGS-2(Regulatory G protein signaling 2)를 성상교세포에 형질전환하여 스니퍼패치를 수행하였으며, 그 결과를 도 1l, 도 1m, 도 9e, 도 9f에 나타내었다.
도 1l, 도 1m, 도 9e, 도 9f에 나타난 바와 같이, RGS-2의 과발현은 글루타메이트의 빠른 방출 기작에는 영향을 미치지 않는 반면에, 느린 방출 기작에서의 글루타메이트 방출 요소 및 관련된 Ca2 + 증가를 선택적 또는 상당하게 저해하는 것을 밝혔다.
Gq 신호방식은 IP3R 채널을 통한 IP3의 생산 및 Ca2 +의 방출로 포스포리파아제 Cβ를 활성화 시킨다(Clampham, 2007). 따라서, Ca2 + 킬레이터인 BAPTA에 대한 느린 기작 요소의 감도를 실험하였다(실시예 3-3). 보다 구체적으로 세포 내 Ca2 +를 킬레이팅하기 위해, 혼합된 세포들을 30분간 20μM BAPTA-AM(Sigma Chemicals, USA)로 전처리 하였으며, 30분간 BAPTA-AM(Sigma Chemicals, USA) 처리한 후 스니피패치를 수행하였고, 그 결과를 도 1n 및 도 1o에 나타내었다.
도 1n 및 도 1o에 나타난 바와 같이, BAPTA-AM의 30분간의 처리는 Ca2 + 반응을 없앴고, 글루타메이트의 빠른 방출 기작이 아닌 글루타메이트의 느린 방출 기작에서 상당히 감소시켰다.
1.4: cAMP 가 글루타메이트 방출에 미치는 영향 시험
cAMP를 생산하는 Gs의 관여를 실험하기 위해, cAMP 포스포디에스테라아제 또는 포스콜린(Sigma Chemicals, USA)의 저해제이고, 아데닐산고리화효소의 활성제인 IBMX(Tocris, USA)의 존재 하에 TFLLR(Peptron, Korea)을 적용시켰다.
보다 구체적으로 성상교세포의 글루타메이트 방출을 유도하는 cAMP 변화의 가능성을 제거하기 위해, 500μM 포스콜린(Sigma Chemicals, USA) (아데닐산고리화효소를 활성화시키기 위한)을 100ms로 가압작용(pressure-applied)하였다. cAMP를 증가시키는 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase)를 저해하기 위해, 세포들을 5분간 100μM IBMX(Tocris, USA) 전처리 하였고, 100μM IBMX(Tocris, USA) 존재 하에 TFLLR(Peptron, Korea)을 적용하여 스니퍼패치를 수행하였으며(실시예 3-3 참조), 그 결과를 도 9i 내지 도 9k에 나타내었다.
도 9i 내지 도 9k에 나타난 바와 같이, 글루타메이트 방출의 느린 또는 빠른 글루타메이트 방출 기작 모두 cAMP가 관여하지 않는다는 것을 밝혔다.
1.5: 성상교세포의 글루타메이트 엑소시토시스 방출 관여여부 시험
뉴런에서 글루타메이트의 엑소시토시스 방출을 야기하는 고장액을 처리하였다(Bekkers and Stevens, 1995). 보다 구체적으로 HOS, 512mOsm, sucrose로 조절한 용액을 사용하여 성상교세포가 엑소사이토시스를 보이는지를 스니퍼패치를 사용하여 관찰하였다. 고장액은 뉴런의 시냅스 베지클(synaptic vesicle)을 유도분비 시키는 활성제라고 알려져 있으므로 만약에 성상교세포가 엑소시토시스를 가지고 있다면 고장액에 의해 글루타메이트가 분비될 것이라는 가정을 이용해 실험하였으며, 그 결과를 도 10a 및 도 10c에 나타내었다.
도 10a 및 도 10c에 나타난 바와 같이, 성상교세포에서 글루타메이트의 방출이 일어나지 않았다(Lee et al., 2007). 이로부터 뉴런과 다르게, 성상교세포는 명백하게 고장액에 민감한 글루타메이트-포함 베지클을 가지지 않는 것을 알 수 있었다.
성상교세포가 엑소시토시스를 방출에 관여하는지를 알아보는 다른 실험으로 로즈벵갈(Sigma Chemicals, USA)을 이용하였다. 로즈벵갈은 vGLUT1의 저해제로서 베지클 안에 글루타메이트를 집어넣으려면 vesicular glutamate transporter 1이 필요하다고 알려져 있는데 이것을 저해제가 성상교세포의 글루타메이트 분비를 저해하는지 알아보았으며, 그 결과를 도10b 및 도 10c에 나타내었다.
도 10b 및 도 10c에 나타난 바와 같이, 기계적 자극에 의해 글루타메이트를 방출을 방해하는 로즈 벵갈(Montana et al., 2004)은 TFLLR에 의한 글루타메이트 방출의 빠른 또는 느린기작에서 어떠한 효과도 갖지 않았다.
성상교세포가 엑소시토시스를 통해서 글루타메이트를 방출하는지를 알아보기 위하여 다른 엑소시토시스 저해제인 바필로마이신 A1과 콘카나마이신 A를 처리하여 스니퍼패치를 이용하였다. 바필로마이신 A1과 콘카나마이신 A는 H-ATPse저해제인데 베지클 내에 글루타메이트를 업테이크(uptake)를 하기 위해서는 베지클 내에 산성화가 선행되어야 하는데 산성화를 저해하면 베지클 내에 글루타메이트가 없을 것임으로 엑소시토시스의 글루타메이트는 저해될 것이다.
도 10d에서 나타난 바와 같이 스니퍼패치 결과에서 바필로마이신 A1 처리군에서 글루타메이트 분비가 저해된 듯하나 센서 세포(GluR1-L497Y)에서의 채널 활성화에 영향을 미침을 보였다. 이는 바필로마이신 A1이 성상교세포 외에 인접 GluR1-L497Y의 발현에 영향을 미침을 보여준다. 그래서 GluR1-L497Y를 발현한 HEK 세포에서 바필로마이신 A1이 GluR1-L497Y의 발현에 영향을 미치는지를 알아보기 위해 칼슘이미징과 내향전류(실시예 12 참조)를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 10f 내지 10i 및 10k에 나타내었다.
도 10f 내지 10i 및 10k에서 나타난 바와 같이 바필로마이신 A1과 콘카나마이신 A를 처리하였을 때 Ca2 +와 내향전류가 대조군과 비교하여 감소함을 확인하였다. 이는 성상교세포 시냅스의 베지클에서 글루타메이트를 감소시키는 바필로마이신 A1(Tocris, USA) 및 콘카나마이신 A(Tocris, USA)의 처리는 빠른 및 느린 방출 기작 모두 차단시키는 것을 의미하며, 이는 상기 바필로마이신 A1 및 콘카나마이신 A들이 센서 세포의 Glu1R1-L497Y의 표면 발현을 거의 완벽하게 제거하였기 때문이다.
Tetanus toxin은 세포막과 베지클이 SNARE복합체를 이용하여 융합되는 현상을 저해하므로 만약 성상교세포가 엑소시토시스를 이용하여 글루타메이트를 분비한다면 이를 저해할 것이므로, 성상교세포의 엑소시토시스를 확인하기 위하여 다른 저해제인 Tetanus toxin을 사용하였으며, 그 결과를 도 10j 및 도 10k에 나타내었다.
도 10j 및 도 10k에 나타난 바와 같이, TeTX(Tetanus toxin)(Tocris, USA) 또한 Glu1R1-L497Y의 표면을 제거하는 비슷한 효과를 유발하였다.
앞서 나온 실험 결과에 따라 여러가지 엑소시토시스 저해제들이 성상교세포뿐만 아니라 인접한 센서세포에 영향을 미치므로 엑소시토시스 저해제인 Tetanus toxin, BoTox B(Botulininum toxin B)(Biological Lab, USA)를 성상교세포에만 패치-피펫을 이용하여 Ca2+ indicator dye Fura-2 (impermeable)와 함께 집어넣으면 인접 세포에는 영향을 미치지 않을 것이므로, Ca2 + indicator dye Fura-2와 함께 BoTox B(Botulininum toxin B)을 패치-피펫(patch-pipette)을 통하여 각 성상교세포에 주입하였고, 그 결과를 도 10l 및 도 10o에 나타내었다.
도 10l 및 도 10o에 나타난 바와 같이, Tetanus toxin은 여전히 성상교세포에만 패치 피펫을 이용하여 주입하였음에도 불구하고 여전히 센서 세포에도 영향을 미치는 것을 확인하였다. 반면에 도 10m 및 도 10o, 도 10p에 나타난 바와 같이, BoTox B(Botulininum toxin B)는 센서세포에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
도 2a 및 도 2c에 나타난 바와 같이, 기계적 자극(엑소시토시스를 유도하는 방법)에 반응하여 같은 성상교세포에서의 글루타메이트 방출이 완전히 제거되었더라도, BoToxB(Biological Lab, USA) 주입은 TFLLR-유도된 빠른 및 느린 기작에서 저해 효과를 보이지 않는다는 것을 알았다.
이와 대조적으로 도 2a 및 도 2d에 나타난 바와 같이, 대조실험으로서 BotoxB(Biological Lab, USA)를 대신하여 소혈청 알부민(BSA)을 주입하였고, 그 결과를 도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 10n 및 도 10o에 나타내었다.
도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 10n 및 도 10o 에 나타난 바와 같이, BSA는 TFLLR-유도 글루타메이트 방출의 빠른 및 느린 기작 또는 기계적 자극 유도에 의한 글루타메이트 방출에 영향을 미치지 않는다는 것을 알았다.
이러한 결과로부터 기계적 자극에 의한 글루타메이트 방출은 엑소시토시스에 의해 매개되지만, TFLLR(Peptron, Korea)에 의한 글루타메이트 방출은 그렇지 않다는 것으로 결론지었다.
< 실험예 2> 글루타메이트 방출의 빠른 및 느린 기작의 분자적 확인 시험
2-1. 채널 매개의 글루타메이트 방출 확인 시험
TFLLR(Peptron, Korea)이 성상교세포로부터 채널 또는 트랜스포터들을 경유하여 글루타메이트 방출을 유도할 수 있는 가능성을 조사하였다. 채널 및 글루타메이트 트랜스포터들의 다양한 차단제를 스크린하였다. 보다 구체적으로 성상교세포의 글루타메이트 기작 중 주요기작인 엑소시토시스와 채널을 통한 기작이 존재하는데 이전에 결과에 의하면 엑소시토시스에 의한 글루타메이트 방출은 부정적인 결과이므로 본 실험예에서는 채널에 의한 글루타메이트 방출을 시험하였다. 따라서 여러가지 채널 저해제(NPPB(Sigma Chemicals, USA), 니프룸산, DIDS(4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid) 및 K2P(two-pore potassium) 채널을 차단하는 퀴닌)를 사용하여 스니퍼패치를 수행하였고, 그 결과를 도 2f, 도 11a 내지 도 11j에 나타내었다.
도 2f, 도 11a 내지 도 11j에 나타난 바와 같이, 빠른 및 느린 방출 기작 모두 NPPB(Sigma Chemicals, USA), 니프룸산, DIDS(4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid)(도 2e, 도 11a 및 도 11b) 및 K2P(two-pore potassium) 채널을 차단하는 퀴닌(도 2f 및 도 11c)과 같은 CAAC(Ca2+-activated anion channel) 차단제에 의해 차단된다는 것을 알았다. 비록 이러한 차단제들은 비특이적 효과로 유명하지만(Greenwood and Leblanc, 2007; Wang et al., 1997), 이들 차단제들은 GluR1-L497Y 수용체를 가진 센서 세포에 대한 어떠한 효과도 가지지 않았다(도 11d 및 도 11e). 어떠한 효과도 보이지 않는 차단제들은 TTX(전위의존성 나트륨 채널), Cd2 +(전위의존성 Ca2 + 채널), TEA, Ba2 +, Cs+(칼륨 채널), CBX(간극결합 헤미채널) (Sigma Chemicals, USA) 및 DCPIB(볼륨-센서티브 음이온 채널)을 포함한다(도 11g). PPADS(P2X 채널)(Sigma Chemicals, USA)은 빠른 방식에서는 차단하는 것으로 보였다(도 11g). 그러나 이는 PPADS(Sigma Chemicals, USA)가 비특이적 효과를 보이기 때문에 이렇게 해석되지는 않았다(도 11e, 도 11h 내지 도 11j).
스크린닝의 결과로, CAAC 및 K2P 채널들이 성상교세포로부터 글루타메이트 방출에 대한 수용체-매개로 분자적 매개체의 강력한 후보임을 나타내었다.
2-2. Best1 채널 분석
글루타메이트 느린 방출 기작에 대한 분자적 확인을 위하여, 해마(hippocampus)에 위치하는 성상교세포에서 높게 발현되는 Ca2 +-activatd 음이온 채널 때문에(Park et al.,2009) 우선적으로 Best1을 테스트 하였다. 또한 Best1은 글루타메이트(Park et al.,2009) 및 GABA(Lee et al.,2010)에 대한 투과성과 같은 특이한 특성을 보여준다. 그러나, 피질 베르그만 아교세포와 달리(Lee et al.,2010) 해마(hippocampus)에 위치하는 성상교세포는 GABA를 포함하지 않기 때문에(Park et al.,2012;Yoon et al.,2012), Best1 채널은 해마에 위치하는 성상교세포로부터의 GABA 방출을 매개할 개연성은 낮다.
보다 구체적으로 Best1이 느린 글루타메이트 방출과 관련이 있을 수 있음을 알기 위하여 Best1 특이적 DNA construct (PSicoR-Best1-shRNA)를 과발현 시켜 형질전환한 성상교세포를 이용하여 스니퍼패치를 수행하였고(실시예 2-6), 그 결과를 도 2g, 도 2h 및 도 2l에 나타내었다.
도 2g, 도 2h 및 도 2l에 나타난 바와 같이, 마우스 Best1의 특이적 shRNA을 통한 Best1의 유전자 침묵(gene silencing)은 빠른 방식에는 영향을 주지 않으면서 느린 방식을 선택적으로 감소시켰다(도 2g, 도 2h 및 도 2k). 대조 scrambled shRNA를 발현하는 성상교세포에서는 글루타메이트의 느린 방출이 감소하지 않았고, Best1의 shRNA-인센서티브 형태의 DNA construct와 함께 Best1-shRNA의 코-트랜스펙션(co-transfection)에 의해 완전히 구제(rescue)되었으므로(도 2k), 이 효과는 특이적이었다. 그러나, position 97의 추가적인 통로(pore) 돌연변이(트립토판(tryptophan)을 시스테인(cysteine)으로(Best1-W93C))는 느린 방식에서의 구제(rescue)에 실패하였으며, 이는 Best1 채널의 통로(pore)를 통한 글루타메이트 투과가 글루타메이트의 느린 방출 기작과 관련이 있다는 것을 의미한다(도 2k). Best1의 shRNA, Best1의 shRNA-intensitive form 및 Best1-W93C(shRNA-인센서티브)의 특이성은 이전에 공지되어 있었다(Park et al.,2009).
2-3. TREK -1 분석
빠른 방출 기작에서는, 최근 성상교세포의 K2P 채널로 제안된(Zhou et al.,2009) TREK-1에 대한 가능성을 실험하였다.
보다 구체적으로 빠른 글루타메이트의 방출이 TREK-1과 관련됨을 알기 위하여 shRNA-TREK-1과 shRNA insensitive form 인 래트 TREK-1, pore mutant (W93C)를 성상교세포에 과발현하여 형질전환한 성상교세포를 이용하여 스니퍼패치를 수행하였고(실시예 2-6 참조), 그 결과를 도 2i, 도 2j 및 도 2l에 나타내었다.
도 2i, 도 2j 및 도 2l에 나타난 바와 같이, TREK-1에 대한 유전자 침묵(gene-silencing)은 느린 방출 기작에 영향을 미치지 않고 빠른 방출 기작에서 선택적으로 제거되었고(도 2i 및 도 2l), 마우스 TREK-1-shRNA에 둔감한 래트 TREK-1으로부터 완전히 구제(rescue)되었다(도 2l). 그러나, 추가적인 position 144의 통로(pore) 돌연변이(글리신에서 글루타메이트(rat TREK-1-G144E))(Brenner and O’Shaughnessy,2008)는 빠른 방출 기작에서 구제(rescue)를 실패하였으며, 이는 TREK-1의 통로(pore)를 통한 글루타메이트의 투과가 글루타메이트의 빠른 방출 기작과 관련이 있는 것을 의미한다. 최종적으로, Best1 및 TREK-1에 대한 shRNA의 코-트랜스펙팅(co-transfecting)은 빠른 방식 및 느린 방식 모두 제거시켰다(도 2j 및 도 2l).
< 실험예 3> G βγ 의 TREK -1 결합에 의한 글루타메이트 -투과성 채널의 개방 확인 시험
3-1. TREK -1 N 말단의 분석
TREK-1-매개의 글루타메이트 방출은 상대적으로 빠르고 Gi-Gβγ 해리를 요구하기에, Gβγ가 직접적으로 TREK-1을 결합하여 글루타메이트-투과 채널을 개방하는 가능성을 고려하였다. 이전 효모 2-하이브리드 스크린 방법은 TREK-1과 GNG4(Gγ 서브유닛의 4 부분형)의 상호작용을 나타내었다(Kim et al.,2010). 따라서, TREK-1 N말단의 자세한 분석을 수행하였고, 보다 구체적으로 글루타메이트의 빠른 방출이 Gβγ 와 TREK-1 필요하므로 세부적으로 TREK-1의 어느 부분에 결합하는지를 알아보기 위하여 효모 2-하이브리드 스크린 방법(실시예 5 참조)과 풀다운 어세이(실시예 6 참조)를 이용하여 실험하였고, 그 결과를 도 3a 내지 도 3c, 도 12b, 도 12c에 나타내었다.
도 3a 내지 도 3c, 도 12b, 도 12c에 나타난 바와 같이, 각각 11 또는 12개의 아미노산으로 구성된 TREK-1의 N말단 4부분에 대하여, N3에서는 달리 N1, N2 및 N4 부분은 GNG4와 강한 상호작용을 하는 것을 알았다(도 3a, 도 3b 및 도 12b). GNG4와 TREK-1 N 말단 상호작용은 코-이뮤노프리시피테이션(co-immunoprecipitation)에 의해 또한 확인되었다(도 12c). HA(Hemagglutinin)에 대한 항체 및 HEK293T 세포의 HA-TREK-1 및 GFP-GNG4의 이종 발현 후의 GFP를 이용하여, 전장(full-length) TREK-1 및 코-이뮤노프리시피테이션(co-immunoprecipitation)을 통한 GNG4의 상호작용을 확인하였다(도 3c). 양성대조군 및 음성대조군을 통해 Gβγ 상호작용 채널로 잘 알려진 GIRK(G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel) 및 상호작용하지 않는 IRK(inwardly-rectifying potassium channel)를 가지고 상기 방법과 동일한 실험을 수행하였다. GIRK는 GNG4와 강하게 상호작용하는데 반해, 예상한 바(Huang et al.,1995)와 같이 IRK는 그렇지 않았다(도 3c).
3-2. G βγ 에 의한 채널 개방 확인 시험
Gβγ가 배양된 성상교세포에서의 어떤 채널을 개방할 수 있는지 알아보기 위하여, 패치-피펫(Patch-pipette)에서 정제된 Gβγ(calbiochem)을 넣어 전체세포의 전류 측정(실시예 12 참조)을 하였고, 그 결과를 도 3d 내지 도 3f, 도 3i, 도 12d 내지 도 12f에 나타내었다.
도 3d 내지 도 3f, 도 3i, 도 12d 내지 도 12f에 나타난 바와 같이, 막 파열(rupture membrane)에서 내부 Gβγ에 의해 큰 내향전류(inward current)가 유도된다는 것을 알았다(Vh=-70mV). 놀랍게도, 이 전류의 반전전위(-3.8±0.2mV, n=19)는 K+(-70mV) 또는 Na+(40mV)의 평형전위와 떨어져 있고, Cl-의 평형전위와 가까웠다(0mV, 도 12d 내지 도 12f). 이온 치환 실험은 막 양쪽에 Cl-의 농도가 동등할 때 관찰되는 선형 전류-전압(linear current-voltage(I-V)) 관계 및 0mV 근처의 반전전위로 인하여 Gβγ 유도의 전류는 Cl- 이온에 의해 대부분이 이루어진다는 것을 보여주었다(도 3d, black trace). 대조군으로 소혈청알부민(BSA)을 사용하였고, 이는 어떤 상당한 전류도 유도하지 않았다(도 3d, blue trace). 전도도가 글루타메이트의 투과성을 보여주는지를 알아보기 위해, 세포내부의 피펫 용액(pipette solution)으로 Cl-을 글루타메이트로 교체하였으며, Gβγ이 반대전위가 -40mV이면서 -100mV에서 상당한 내향전류(inward current)를 유도한다는 것을 알았고(도 3d, red trace), 이를 통해 상당한 글루타메이트 투과성을 나타내는 것을 확인하였다. 세포내부의 Cl-을 글루타메이트로 치환함에 따라 생기는 -30.9mV의 반대전위의 평균으로부터(도 3f), 골드만식(Goldman-Hodgkin-Katz equation)을 이용하여 글루타메이트 대 Cl-의 투과비율(Pglutamate/Pcl -)이 0.27임을 계산하였다. Gβγ이 없을 때는, 글루타메이트 뿐만 아니라 Cl-의 전도도도 무시해도 될 정도였다(도 3e). 농도-반응 관계에서, Gβγ의 EC50은 32.4ng/ml(0.79Nm)로 나타났다(도 3i).
3-3. TREK -1의 N말단과 G βγ 사이의 상호작용
Gβγ-유도의 글루타메이트 전도도가 TREK-1으로부터 매개되는지를 실험하기 위해, shRNA로 TREK-1 유전자 침묵(gene silencing) 시킨 후 비슷한 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로 성상교세포에 shRNA TREK-1을 발현하여 형질전환한 성상교세포를 이용하여 패치 피펫에 Cl- 대신 글루타메이트와 Gβγ 를 주입한 후 세포전류측정(실시예12 참조)을 하였고, 그 결과를 도 3g 및 도 3h에 나타내었다.
Scrambled shRNA와 비교하기 위하여(도 3g black trace 및 도 3h), 마우스 TREK-1-shRNA가 Gβγ-유도의 전도도(blue trace)를 제거하는 것을 알았고, 이는 래트 TREK-1(red trace, shRNA insensitive form)의 코-익스프레션(co-expression)에 의해 상당히 구제(rescue)되었다(red trace). 통로(pore) 돌연변이인 rTREK-1-G144E은 Gβγ-유도의 전도도의 구제(rescue)에 실패하였다(green trace). 이러한 결과들은 TREK-1이 Gβγ에 유도되는 글루타메이트 전도도를 매개한다는 것을 나타낸다.
TREK-1의 N1, N2, 및 N4의 GNG4의 상호작용하기 때문에, 경쟁적 펩티드(서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4)를 사용하여 기능적 상호작용을 위해 실험하였다. 보다 구체적으로 성상교세포를 이용하여 패치-피펫에 Gβγ와 TREK-1의 N1 또는 N3 아미노산을 합성하여 세포 전류측정(실시예 12 참조)을 사용하여 실시하였고, 그 결과를 도 3j 내지 도 3m에 나타내었다.
도 3j 내지 도 3m에 나타난 바와 같이, 경쟁적 펩티드를 포함하여 패치 피펫(patch pipette)의 N1, N2 및 N4은 Gβγ-유도의 염소 전류를 상당히 감소시켰고, 이는 이러한 팹티드들이 TREK-1의 N말단과 Gβγ 사이의 상호작용을 방해한다는 것을 의미한다(도 3j 내지 도 3m).
Gβγ에 의한 TREK-1의 활성화가 성상교세포로부터 글루타메이트 방출을 할 수 있는지를 알아보기 위해, 두 세포 스니퍼패치(two-cell sniffer-patch)(아래 구성의 2 페치 피펫이 사용되었다: 하나는 성상교세포로부터의 측정을 위해 Gβγ 및 글루타메이트 5mM을 포함하고, 다른 것은 글루타메이트 방출을 발견하기 위해 GluR1-L497Y를 발현하는 센서 세포에 대한 것이다)(실시예 4 참조)를 수행하였다. 보다 구체적으로 Gβγ와 TREK-1을 직접 결합하여 글루타메이트를 방출한다는 것을 알아보기 위하여 성상교세포에 shRNA-TREK-1, rat TREK-1, pore mutant form (W93C)를 발현하여 형질전환된 성상교세포를 사용하였고, 방법적으로 성상교세포에 Gβγ와 글루타메이트를 넣고 막파열(membrane rupture)을 하여 두 세포 스니퍼 패치를 이용하여 실시하였고(실시예 4 참조), 그 결과를 도 4a 내지 도 4f에 나타내었다.
도 4a 내지 도 4f에 나타난 바와 같이, 막 파열(membrane rupture)시, 센서 세포는 이웃한 성상교세포로부터 방출되는 글루타메이트를 나타내는 상당한 패러랠 커런트(parallel current)를 보여주는 반면(도 4a 및 4b), 성상교세포는 큰 내향전류(inward current)(Vh=-70mV)를 보여주었다. 성상교세포로부터의 글루타메이트 유출은 전기화학적경사도에 의존적이며, Vh=-70mV로부터 Vh=+70mV의 holding potential의 변화로 네른스트 식(Nernst equation)에서 예상한 바와 같이, 약 75% 정도(도 4a 내지 4c) 글루타메이트 방출이 감소되었다. 글루타메이트 방출은 성상교세포의 TREK-1 gene의 침묵(silencing)으로 없어졌고, 래트 TREK-1의 co-expression으로 구제(rescue)되었다(도 4d 내지 4f). 통로(pore) 돌연변이인 rTREK-1-G114E은 구제에 실패하였다(도 4f).
이러한 결과들은 성상교세포의 글루타메이트 방출이 Gβγ에 의해 직접적으로 유도될 수 있고, TREK-1은 통로(pore)를 통해 글루타메이트를 직접 투과시킴으로서 이러한 방출을 조절한다는 것을 나타낸다.
Gβγ의 TREK-1 결합과 경쟁하는 TREK-1의 N말단의 부분을 통하여, TREK-1-매개되는 글루타메이트 방출이 Gβγ의 TREK-1의 직접적 결합이 필요한지를 실험하였고, 보다 구체적으로 성상교세포를 이용하여 Gβγ와 경쟁적저해제(N1 또는 N3 아미노산)을 패치-피펫을 이용하여 두 세포 스니퍼패치를 수행하였고(실시예 4 참조), 그 결과를 도 4g 내지 도 4i에 나타내었다.
도 4g 내지 도 4i에 나타난 바와 같이, 두 세포 스니퍼 패치(Two-cell sniffer patch)를 수행하였고, N3은 어떠한 펩티드도 없는 대조군과 비교하여 상당한 효과를 보이지 않은 반면(도 4g 및 도 4i), N1 펩티드는 Gβγ-유도의 글루타메이트 방출뿐만 아니라 Gβγ-유도 전류를 상당하게 감소시킨다는 것을 알았다(도 4h 및 4i).
< 실험예 4> Best1 의 글루타메이트 투과성 채널 여부 시험
Best1 채널은 많은 GABA의 투과성과 함께 세포내의 Ca2 +(EC50=150nM)에 의해 활성화되고(Lee et al.,2010;Park et al.,2009) 해마에 위치하는 성상교세포는 글루타메이트 투과성과 함께 CAAC를 발현한다(Lee et al.,2010;Park et al.,2009). 비상동적으로 발현하는 Best1이 글루타메이트에도 투과적인지 테스트하기 위하여, 최대 채널 활성화를 위한 높은 Ca2 +(4.5Μm free Ca2+) 및 단독으로 삼투하는 음이온으로 Cl- 또는 글루타메이트(145mM Cl- 또는 글루타메이트)를 가진 패치 피펫 용액(patch pipette solution)을 이용하여 마우스 Best1 유전자를 발현하는 HEK293T 세포의 Best1-매개의 음이온 전도도를 측정하였다. 보다 구체적으로 HEK293T 세포에 Best1을 발현시켜 형질전환된 HEK 293T를 이용하여 Ca2 +와 Cl- 혹은 Ca2 +와 글루타메이트를 패치-피펫을 통하여 주입하고 세포 전류측정(실시예 12 참조)을 하였다. 전류-전압관계에서 내향전류(I(Y 축기준으로), 0 pA 이하)는 양이온이 들어오거나 음이온이 나가는 경우인데 이 경우는 음이온(Cl-)이 나가는 경우이므로 내향전류가 생기는 것은 음이온의 방출을 의미한다. 전류측정 결과는 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
Best1을 통해 전류 흐름의 전류-전압관계(I-V)는 도 5a에 나타낸 것과 같이 밝혀졌다.
도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, 상당한 Ca2 +-유도 전도도는 -70mV에서 Cl- 또는 글루타메이트의 유출에 의해 수행된다는 것을 알았고, 이는 피펫 용액(pipette solution)의 free Ca2 + 의 결핍으로 없어졌다(도 5a 및 도 5b). 골드만 식(Goldman-Hodgkin-Katz equation)에 따르면 글루타메이트 대 Cl-의 추정의 투과비율은 Pglutamate/PCl=0.67(내부 Cl- Erev: 1.9±0.8 mV, n=9; 내부 글루타메이트 Erev: -6.4±2.0 mV, n=11; p=0.0019)이었다. 이러한 결과들은 Best1 채널은 GABA, 글루코네이트 및 글루타메이트와 같은 큰 음이온을 투과시킨다는 공지된 사실과 일치하며, Best1 채널은 글루타메이트에 상당한 투과성을 나타낸다는 것을 의미한다.
Best1 채널을 통한 글루타메이트 방출을 이웃하는 세포로부터 발견될 수 있는지를 알아보기 위하여, 두 세포 스니퍼 패치(two cell sniffer patch)를 수행하였다(실시예 4 참조)(도 5C) (Lee et al.,2010). 보다 구체적으로 글루타메이트가 Best1 (Ca2 + activated Cl- channel)을 통하여 방출될 수 있다는 가능성을 실험하기 위하여 Best1을 발현하는 HEK 293T 세포와 GluR1-L497Y를 발현시킨 HEK 293T 세포를 이용하였고, Best1을 발현시킨 HEK 293T 세포에는 Ca2 +와 글루타메이트를 주입하였고 GluR1-L497Y를 발현시킨 HEK 293T 세포에는 내향전류를 측정하였다(실시예 12 참조). 막 파열을 통하여 Ca2 +와 글루타메이트가 Best1을 발현하고 있는 세포에 전달되었다. 두 세포 스니퍼패치 결과는 도 5c 및 도 5e에 나타내었다.
도 5c 및 도 5e에 나타난 바와 같이, 분석에서, 한 세포(source cell; Best1-발현하는 HEK293T cell)에서 방출된 글루타메이트는 근처의 세포(센서 세포; GluR1-L497Y-발현하는 HEK293T cell)로부터 확인될 수 있었다. Best1 채널을 발현하는 세포에 대한 내부 용액은 음이온의 Cl- 또는 글루타메이트를 가지며, Best1 막의 파열시 피펫 용액(pipette solution)에서의 높은 Ca2 +로 활성화 되었다(~4.5 μM free Ca2 +; 도 5c). Best1은 상당한 글루타메이트 전도도를 보이며(도 5e, top blue race; source cell에서부터 -70Mv의 내향 전류 흐름에 의해 나타내어진다), 이러한 전류는 센서 세포로부터의 GluR1-매개 내향성 전류와 관계가 있다는 것을 밝혔다(도 5e, bottom green trace). 이는 Best1-발현 세포로부터 글루타메이트의 방출이 있다는 것을 의미한다.
글루타메이트를 수량화하기 위하여, 1mM 글루타메이트의 배스 적용(bath application)에 의해 유도된 최대 전류값의 반응을 이용하여 정규화(peak current / peak of full activation x 100)하였고, 그 결과를 도 5d 내지 도 5f에 나타내었다.
도 5d 내지 도 5f에 나타난 바와 같이, 이웃하는 세포에 대한 글루타메이트 방출이 Ca2 +-activated Best1을 통한 침투에 의존적인 것을 밝혔으며(도 5d), (1) 이는 Best1이 발현되지 않았을 때, (2) 글루타메이트가 Cl-로 대체되었을 때, (3) Ca2+가 없을 때(도 5f), (4) source cell이 Best1의 통로(pore) 돌연변이(W93C)를 발현했을 때 글루타메이트 방출이 없었기 때문이다.
이러한 결과들은 Best1이 글루타메이트로 투과가능하고 세포밖 환경으로 글루타메이트의 감지수준으로 방출할 수 있는 CAAC임을 입증한다.
< 실험예 5> TREK -1 및 Best1 의 위치적 차이와 뉴런의 타겟들
같은 종류의 글루타메이트 방출이 세포배양에서 이루어졌으므로 실제 생체내에서 성상교세포가 글루타메이트를 방출하는지를 알아보기 위해, 스니퍼패치 실험을 수행하였고 바로 분리된, 어른의 GFAP-GFP 트랜스제닉(transgenic) 마우스의 뇌 조각으로부터 준비 되어진 GFP-양성 해마에 위치하는 성상교세포로부터 CNQX-senstitive 글루타메이트를 측정하였고, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.
도 6b에 나타난 바와 같이, 비슷한 운동적 특성을 가지고(빠른 방출 기작 latency: 58.0±7.5 ms, n=15; 느린 방출 기작의 정점: 31.3±4.4 s, n=15) 글루타메이트의 빠른 및 느린 방식의 방출의 정규화된 값이 이전에 세포배양에서 나타난 바와 같이 비슷한 것을 확인하였고(도 6c), 이는 같은 신호전달 경로를 가지며 분자들이 생체 내(In vivo)에서도 관여된다는 것을 의미한다. 또한 방출된 것은 글루타메이트라는 것이 확인되었다(도 6b).
바로 분리된 성상교세포가 TREK-1과 관련한 글루타메이트의 빠른 방출 또는 Best1과 관련한 글루타메이트의 느린 방출을 하는지 알아보기 위하여 렌티바이러스(KIST virus facility, pSicoR-shRNA TREK-1)를 사용하여 마우스 해마부분에 주입하여 3-5일 인큐베이션 후, 해마절편을 이용하여 성상교세포를 분리하였다(실시예 2-5). Best1을 선택적으로 저해하기 위해서는 Best1 Knock Out 사용하였으며, 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출 모두 저해하기 위하여 상기 렌티바이러스를 Best1 KO 해마에 주입하여 같은 절차를 수행하였고, 그 결과를 도 6d 내지 6g에 나타내었다.
도 6d 내지 6g에 나타난 바와 같이, 글루타메이트의 빠른 방출은 TREK-1 저해제(pSicoR-shRNA TREK-1)에 의해 저해되었고(6d 및 6g), 글루타메이트의 느린 방출은 Best1 KO에서 저해되었다(도 6e 및 6g). 그리고 shRNA-TREK-1를 Best1 KO에 주입하여 글루타메이트의 빠른 및 느린 방출이 저해됨을 확인하였다 (도 6f 및 6g).
성상교세포는 여러 주요 세포분획을 가지고 생체 내에서 정교한 구조를 보인다. 이러한 구조에서, 마이크로도메인(microdomains)은 각 시냅스들 주변을 빽빽히 감싼다(Groschel et al., 1999; Halassa et al.,2007). Best1 및 TREK-1 채널들의 세포 이하의 분획 및 생체 내에서의 기능을 알기 위하여, Best1 또는 TREK-1 및 GFAP-GFP 마우스의 GFP에 대한 항혈청과 함께 면역형광염색-전자현미경(실시예 11 참조)을 수행하였고, 그 결과를 도 6h 내지 도 6i, 도 13a 내지 도 13f에 나타내었다.
도 6h 내지 도 6i, 도 13a 내지 도 13f에 나타난 바와 같이, 세포체나 큰 세포돌기와 같은 다른 세포내 구획과 비교하여(도 6h 및 도 13a 내지 도 13c), 글루타메이트 시냅스에 인접한 마이크로도메인의 표면막에 Best1이 우선적으로 발현되는 것(도 6h)을 알아내었다. 큰 세포돌기의 표시는 세포막이나 세포막에서 가까운 곳보다는 세포돌기 안에 위치시켰고, 이는 이런 단백질들이 먼 마이크로도메인쪽으로 이동되어 나가게 된다는 것을 암시한다. Best1과 대조적으로, TREK-1 항체는 반대 분포방식을 보였다; 즉 마이크로도메인이 아닌 세포체 표면 및 세포돌기에 위치하였다(도 6i, 6j 및 도 13d 내지 도 13 f).
한 개의 성상교세포로부터 방출되는 글루타메이트 총량은 실험측정에 알맞은 확산모델을 이용하여 스니퍼패치 측정의 실험적 값에 의해 추정하였고(실시예 10 참조), 그 결과를 도 7b 내지 도 7d에 나타내었다.
이 모델은 스니퍼패치의 제한을 대체로 고려하였고 검출하는데 실패한 글루타메이트 분자의 방출경로를 획득하기 위해 최적화되었다(도 7a).
도 7b 내지 도 7d에 나타난 바와 같이, 빠른 방식에서는 0.34 fmole, 느린 방식에서는 1.35 fmole의 글루타메이트가 하나의 성상교세포에서 방출된다는 것을 계산하였다(도 7b 및 도 7c). 이러한 값들은 반응의 최정점에서의 기계적 자극에 의해 유도된 글루타메이트 방출의 2.64 fmole과 비교될 수 있었다(도 7b 및 도 7d). 이러한 평가치는 예전에 공지된 평가치와 비교되어 졌다[0.078-0.2 fmol by glutamate imaging(Domercq et al.,2006), 및 3 fmol by HPLC(Takano et al.,2005)].
같은 확산모델을 이용함으로써, 성상교세포 막에 균등하게 퍼져있는 부위에서의 글루타메이트 방출에 대한 시뮬레이션을 할 수 있었고, 그 결과를 도 7h 내지 도 7g에 나타내었다.
도 7h 내지 도 7g에 나타난 바와 같이, 성상교세포-뉴런 상호작용을 모방하여 뉴런의 막으로부터 10-40nm 떨어진 글루타메이트 농도를 예측할 수 있었다(도 7h 및 7i). 성상교세포 내부의 시토졸 글루타메이트 농도가 2-10 mM만큼 높기 때문에(Ye et al.,2003), TREK-1 및 Best1 채널이 개방될 때 글루타메이트가 흘려나와 경사도를 낮추어주는 것으로 추정이 되었다. TREK-1을 경유하여 빠른 방식의 모의의 글루타메이트 방출 농도는 약 100μM 이었고(도 7e), Best1을 경유하는 느린 방식에서는 약 0.9 μM(도 7f)이었다. 이러한 값으로부터, 공지된 각 글루타메이트 수용체의 농도-반응 관계에 따라 느린 방식은 우선적으로 뉴런의 NMDA 수용체를 활성화시키며, 빠른 방식은 NMDA 수용체에다가 mGluR 수용체까지 우선적으로 활성화시키는 것을 예측할 수 있었다(도 7g). 성상교세포의 TREK-1과 관련된 글루타메이트는 뉴런의 비시냅스부분인 mGluR 및 NMDAR일 수 있으며, 뉴런의 실제 글루타메이트 수용체의 대상은 뉴런의 NMDA 수용체 또는 mGluR에 나란한 성상교세포의 TREK-1 및 Best1의 정교한 위치에 의존적일 것이다
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> MECHANISM OF GLUTAMATE RELEASE FROM ASTROCYTE <130> DPP20121089KR <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREK-1-shRNA <400> 1 gcguggagau cuacgacaag u 21 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Competitive peptides N1 of TREK-1 <400> 2 Ala Ala Pro Asp Leu Leu Asp Pro Lys Ser Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Competitive peptides N2 of TREK-1 <400> 3 Ala Gln Asn Ser Lys Pro Arg Leu Ser Phe Ser Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Competitive peptides N4 of TREK-1 <400> 4 Asp Ser Ala Ile Asn Val Met Lys Trp Lys Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B-Ark(Beta-adrenergic receptor kinase) C-terminus <400> 5 Trp Lys Lys Glu Leu Arg Asp Ala Tyr Arg Glu Ala Gln Gln Leu Val 1 5 10 15 Gln Arg Val Pro Lys Met Lys Asn Lys Pro Arg Ser Val Gln Arg Val 20 25 30 Pro Lys Met Lys Asn Lys Pro Arg Ser 35 40 <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phosducin C-terminus <400> 6 Gly Glu Phe Met Val Thr Asp Gln Leu Gly Glu Asp Phe Phe Ala Val 1 5 10 15 Asp Leu Glu Ala Phe Leu Gln Glu Phe Gly Leu Leu Pro Glu Lys Glu 20 25 30 Gly Ser Gly 35 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggggaattca tggtcactga ccagctgggg 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cccggatccc tattcctttt ctgggagcaa tcc 33 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Best1-shRNA <400> 9 tttgccaact tgtcaatgaa 20 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligomer <400> 10 tttgccaact tgtcaatgaa ttcaagagat cattgacaag ttggcaattt tttc 54 <210> 11 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligomer <400> 11 cgagaaaaaa tcgcatagcg tatgccgttt ctcttgaaaa cggcatacgc tatgcgaa 58 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gacagctaca ttcagctcat ctgcatatcc ttcgttctgg gtttc 45 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaaacccaga acgaaggata tgcagatgag ctgaatgtag ctgtc 45 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtgagccgc tgctggagcc agtac 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtactggctc cagcagcggc tcacc 25 <210> 16 <211> 1237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA of TREK-1(GenBank Accession No. AY727922) <400> 16 aggatggcgg cccctgactt gctggatccc aagtctgctg ctcagaactc caaaccgagg 60 ctctcgttct ccgcaaaacc caccgtgctt gcttcccggg tggagagtga ctcggccatt 120 aatgttatga aatggaagac ggtctccacg attttcctgg tggtcgtcct ctacctgatc 180 atcggagcca cggtgttcaa ggcgttggag cagcctcagg agatttctca gaggaccacc 240 attgtgatcc agaaacagaa cttcatagcc cagcatgcct gcgtcaactc caccgagctg 300 gatgaactca tccagcaaat agtgacggcc ataaatgcag ggattatccc cttaggaaac 360 aactccaatc aagttagtca ctgggacctc ggaagctctt tcttctttgc cggcactgtt 420 atcacaacca taggatttgg aaacatctcc ccacgaactg aaggtggaaa aatattctgt 480 atcatctatg ccttgctggg aattcccctc tttggttttc tactggctgg ggttggggat 540 cagcttggaa ccatatttgg aaaaggaatt gccaaagtgg aggacacatt tattaagtgg 600 aatgttagtc agaccaagat tcgtatcatc tcgaccatca tcttcatcct gtttggctgt 660 gtcctcttcg tggctctccc cgccgtcata ttcaagcaca tagaaggctg gagtgccctg 720 gacgccatct actttgtggt catcactctg accaccattg gatttggcga ttatgtggca 780 ggtgggtcgg acattgaata tctggacttc tacaagcccg tcgtgtggtt ctggatcctc 840 gttgggctgg cctactttgc ggctgttctg agcatgattg gagactggct acgggtgata 900 tctaagaaga cgaaggaaga ggtgggagag ttcagagcgc atgccgctga gtggacagcc 960 aatgtcacag ccgagttcaa ggaaacaagg aggcggctga gtgtggagat ctatgacaag 1020 ttccagcgtg ccacgtccgt gaagcggaag ctctctgcag agctggcggg taaccataac 1080 caggaactga ctccatgtag gaggaccctg tcggtgaacc acctgaccag cgagagggaa 1140 gtcctgcctc ccttgctgaa ggctgagagc atctatctga acggtctgac accacactgt 1200 gctgctgaag acatcgctgt cattgagaac atgaagt 1237 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence of TREK-1-shRNA <400> 17 gcgtggagat ctacgacaag t 21 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSicoR-scrambled-shRNA <400> 18 ttcgcatagc gtatgccgtt ttcaagagaa acggcatacg ctatgcgatt ttttc 55 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tggctacggg tgatctctaa g 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gctggaactt gtcgtagatc tc 22 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtggagtcat actggaacat gtag 24 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 aatggtgaag gtcggtgtg 19

Claims (11)

  1. 성상교세포 내 TWIK(The tandem of P domains in a weak inward rectifying K+)-관련 포타슘-1 (TWIK-related potassium-1, TREK-1) 채널의 억제제를 유효성분으로 포함하고, 성상교세포의 글루타메이트의 빠른 방출을 억제하는, 빠른 글루타메이트 과방출 유발 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 TREK-1 채널의 억제제는 퀴닌(Quinine), 서열번호 1를 갖는 TREK-1-shRNA, TREK-1의 N1의 경쟁적 펩티드(서열번호 2), TREK-1의 N2의 경쟁적 펩티드(서열번호 3), TREK-1의 N4의 경쟁적 펩티드(서열번호 4), β-Ark(Beta-adrenergic receptor kinase) C-말단(서열번호 5), Phosducin C-말단(서열번호 6) 및 백일해 독소(Pertussis toxin)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이며,
    상기 빠른 글루타메이트 과방출 유발 질병 또는 증상은 중독(addiction), 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia)로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    빠른 글루타메이트 과방출 유발 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TREK-1 채널의 억제제는,
    성상교세포의 TREK-1 채널의 개방을 억제하는 억제제;
    성상교세포 내 Gβγ와 TREK-1 채널의 N말단 결합을 억제하는 억제제;
    성상교세포 내 Gαi-Gβγ의 해리를 억제하는 억제제;
    성상교세포의 Gαi의 활성화를 억제하는 억제제; 및
    성상교세포의 G-단백질 결합 수용체의 활성화를 억제하는 억제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    빠른 글루타메이트 과방출 유발 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 성상교세포 샘플을 준비하는 단계,
    후보 물질을 상기 샘플에 처리하는 단계, 및
    상기 샘플에서의 TWIK(The tandem of P domains in a weak inward rectifying K+)-관련 포타슘-1 (TWIK-related potassium-1, TREK-1) 채널의 활성화 여부를 확인하는 단계를 포함하고,
    TREK-1 채널이 불활성화된 경우 상기 후보 물질을 글루타메이트의 빠른 방출 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는,
    성상교세포에서의 글루타메이트의 빠른 방출 억제제의 스크리닝 방법.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    채널의 활성화 여부는 스니퍼 패치(sniffer-patch)에 의한 내향 전류 변화 측정에 의하여 확인하는, 스크리닝 방법.
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