ES2691642T3 - Polipéptidos de enrollamiento al azar de prolina/alanina biosintéticos y sus usos - Google Patents

Polipéptidos de enrollamiento al azar de prolina/alanina biosintéticos y sus usos Download PDF

Info

Publication number
ES2691642T3
ES2691642T3 ES11725656.0T ES11725656T ES2691642T3 ES 2691642 T3 ES2691642 T3 ES 2691642T3 ES 11725656 T ES11725656 T ES 11725656T ES 2691642 T3 ES2691642 T3 ES 2691642T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
proline
acid sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11725656.0T
Other languages
English (en)
Inventor
Arne Skerra
Uli Binder
Martin Schlapschy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Muenchen
XL Protein GmbH
Original Assignee
Technische Universitaet Muenchen
XL Protein GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Muenchen, XL Protein GmbH filed Critical Technische Universitaet Muenchen
Application granted granted Critical
Publication of ES2691642T3 publication Critical patent/ES2691642T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/14—Antitussive agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • C07K14/615—Extraction from natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Conjugado de fármaco que comprende (i) un polipéptido de enrollamiento al azar biosintético o segmento de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente en residuos de aminoácido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoácidos consiste en al menos 50 residuos de aminoácido de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) un fármaco seleccionado del grupo que consiste en (a) una proteína biológicamente activa o un polipéptido que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o media en una actividad biológica y (b) un fármaco de molécula pequeña.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
DESCRIPCION
Polipeptidos de enrollamiento al azar de prolina/alanina biosinteticos y sus usos
La presente invencion se refiere a un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o a un segmento de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o a un conjugado, comprendiendo dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o conjugado una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en los que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos aproximadamente 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala). Dichos al menos aproximadamente 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala) pueden ser (a) constituyente(s) de un polipeptido heterologo o un constructo de polipeptido heterologo. Tambien se describen usos y metodos de uso de estos polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos, dichos segmentos de polipeptido o dichos conjugados. Los usos pueden comprender, entre otros, usos medicos, usos de diagnostico o usos en la industria alimentaria asf como otras aplicaciones industriales, tales como en la industria del papel, en la recuperacion de petroleo y similares. La presente invencion tambien se refiere a (a) uso(s) espedfico(s) del polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o conjugados proporcionados en el presente documento, comprendiendo dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o conjugados una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina. La secuencia de aminoacidos del polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico proporcionado en el presente documento consiste en al menos aproximadamente 50, en al menos aproximadamente 100, en al menos aproximadamente 150, en al menos aproximadamente 200, en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350 o en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala). Dichos al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 350 o al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala) son un constituyente de un conjugado de farmaco, tal como un conjugado con un compuesto biologicamente activo. En particular, en el presente documento se proporcionan protemas heterologas mediante lo cual estas protemas comprenden al menos dos dominios, en las que un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad, tal como una actividad biologica, y un segundo dominio de dichos al menos dos dominios que comprenden el polipeptido de prolina/alanina de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de prolina/alanina de la presente invencion. La presente invencion se refiere en particular a un conjugado de farmaco que comprende (i) un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) un farmaco seleccionado del grupo que consiste en (a) una protema biologicamente activa o un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o media en una actividad biologica y (b) un farmaco de molecula pequena. Un objeto adicional de la presente invencion es un conjugado de farmaco que comprende el polipeptido de prolina/alanina de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de prolina/alanina segun se proporcionan en el presente documento y, adicionalmente, (a) molecula(s) pequena(s) farmaceuticamente util(es) o protema(s) unidas y/o acopladas a dicho polipeptido de prolina/alanina de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de prolina/alanina. Ademas, se dan a conocer moleculas de acido nucleico que codifican para el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido y/o las protemas heterologas biologicamente activas asf como vectores y celulas que comprenden dichas moleculas de acido nucleico. Ademas, se dan a conocer metodos para la produccion de los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos o segmentos de polipeptido de la invencion descritos en el presente documento y conjugados de farmaco o alimento correspondientes, es decir, conjugados que comprenden los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos o segmentos de polipeptido definidos en el presente documento y un ingrediente alimenticio o un aditivo alimenticio. Tambien se dan a conocer conjugados correspondientes (que comprenden como constituyente el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido dado a conocer en el presente documento) que comprenden, entre otras cosas, un componente o aditivo cosmetico o un compuesto biologica o espectroscopicamente activo. Ademas, la presente invencion proporciona composiciones que comprenden los conjugados de farmaco o las moleculas de acido nucleico, vectores y celulas de la invencion. Tambien se proporcionan metodos de produccion y/u obtencion de los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos o segmentos de polipeptido de la invencion asf como de produccion y/u obtencion de las protemas heterologas biologicamente activas y/o constructos de polipeptido o conjugados de farmaco de la invencion. Ademas, en el presente documento se proporcionan usos medicos, farmaceuticos asf como de diagnostico para el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina (o para moleculas y conjugados que comprenden los mismos) tal como se define en el presente documento. Tal uso medico o farmaceutico puede comprender el uso de dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido como expansor del plasma y similares. Sin embargo, los medios y metodos proporcionados en el presente documento no se limitan a usos farmaceuticos, medicos y biologicos, sino que tambien pueden emplearse en otros sectores industriales, tales como la industria del papel, en la recuperacion de petroleo, etc. Un aclaramiento rapido de la circulacion sangumea mediante filtracion renal es una propiedad tfpica de moleculas pequenas (incluyendo protemas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
pequenas y peptidos). Sin embargo, expandiendo las dimensiones moleculares aparentes mas alia del tamano de poro de los glomerulos renales puede prolongarse la semivida en plasma de protemas terapeuticas hasta un intervalo medicamente util de varios dfas. Una estrategia para lograr un efecto de este tipo es la conjugacion qmmica del componente biologico con el polfmero sintetico polietilenglicol (PEG). Esto ha conducido a varios farmacos aprobados, por ejemplo PEG-interferon alfa2a (Pegasys®), PEG-G-CSF (Neulasta®) y, recientemente, un alfaTNF- fragmento Fab pegilado (Cimzia®). No obstante, la tecnologfa de la “pegilacion” tiene varios inconvenientes: los derivados de pEg de calidad clmica son caros y su acoplamiento covalente a una protema recombinante requiere etapas de procesamiento y purificacion posteriores adicionales, reduciendo por tanto el rendimiento y aumentando los costes. Ademas, el PEG no es biodegradable, lo cual puede provocar efectos secundarios tales como vacuolizacion del epitelio renal tras el tratamiento continuo; vease, por ejemplo, Gaberc-Porekar (2008) Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-50; Knop (2010) Angew Chem Int Ed Engl 49:6288-308 o Armstrong en: Veronese (Ed.), “PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications”; Birkhauser Verlag, Basilea 2009.
Con el fin de superar algunos de los inconvenientes de la tecnologfa de PEG, se han proporcionado determinados compuestos mimeticos de polipeptidos recombinantes en la tecnica, algunos de los cuales se basan en secuencias de aminoacidos que se producen de manera natural o tramos de aminoacido sinteticos.
La mayona de las secuencias de aminoacidos naturales no se comportan como una cadena al azar ideal en disolucion fisiologica porque o bien tienden a adoptar una conformacion plegada (estructura secundaria) o bien, si estan desplegadas, habitualmente son insolubles y forman agregados. De hecho, la mayona de los experimentos clasicos para investigar el comportamiento de cadenas al azar de polipeptidos se llevaron a cabo en condiciones desnaturalizantes, es decir en presencia de desnaturalizantes qmmicos tales como urea o cloruro de guanidinio (vease, por ejemplo, Cantor (1980) Biophysical Chemistry. W.H. Freeman and Company, Nueva York). Por tanto, tales tecnologfas se basan generalmente en secuencias de aminoacidos peculiares que resisten al plegamiento, la agregacion asf como la adsorcion inespedfica y, por tanto, proporcionan cadenas al azar estables en condiciones y temperatura de tampon fisiologico aunque se fusionen geneticamente con un dominio de protema terapeutica plegado. En estas circunstancias, tales compuestos mimeticos de PEG recombinantes pueden conferir un aumento de tamano mucho mayor de lo que se esperana normalmente basandose en su masa molecular sola, retardando eventualmente la filtracion renal y prolongando eficazmente la semivida en plasma del componente unido en factores considerables.
Sin embargo, muchas de estas tecnologfas tienen desventajas y advertencias adicionales.
Por ejemplo, se han sometido a prueba secuencias de aminoacidos repetitivas que se producen de manera natural para determinar su utilidad en las ciencias medicas y en enfoques farmaceuticos. Uno de estos enfoques se refiere a la trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi. Contiene un dominio catalftico de 680 residuos de aminoacido seguido por un dominio repetitivo C-terminal, denominado “antigeno secretado de fase aguda” (SAPA), que comprende un numero variable de repeticiones de aminoacidos de 12 meros. Estudios de farmacocinetica (PK) en ratones de la trans-sialidasa que contiene 13 repeticiones de aminoacidos correspondientes hidrofilas y (a pH fisiologico) cargadas negativamente que tienen la secuencia natural DSSAHSTPSTPA revelaron una semivida en plasma cinco veces mas larga en comparacion con la enzima recombinante de la que se habfa delecionado la secuencia repetitiva C- terminal (Buscaglia (1999) Blood 93 :2025-32). Se observo un efecto de prolongacion de la semivida similar tras la fusion de la misma trans-sialidasa, es decir su dominio catalftico de 76 kDa, con 13 repeticiones de aminoacidos cargadas de la secuencia EPKSA que se encontraron en el antfgeno proteico 13 de Trypanosoma cruzi. Tanto las repeticiones de SAPA como del antfgeno 13 pudieron prolongar la semivida en plasma de la protema heterologa glutation S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum en un factor de 7-8 tras la fusion genetica a ambos extremos C-terminales de esta enzima homodimerica (vease Buscaglia, citado anteriormente). Sin embargo, aunque estas secuencias de aminoacidos repetitivas que se producen de manera natural de patogenos humanos en principio pueden parecer atractivas para optimizar la farmacocinetica de protemas terapeuticas, se encontro que eran altamente inmunogenicas (vease Affranchino (1989), Mol Biochem Parasitol 34:221-8 o Buscaglia (1998), J Infect Dis 1998; 177:431-6).
Otro enfoque se refiere al uso de gelatina. La gelatina, colageno animal hidrolizado y desnaturalizado, contiene largos tramos de repeticiones de Gly-Xaa-Yaa, en los que Xaa y Yaa constituyen principalmente prolina y 4- hidroxiprolina, respectivamente. La succinilacion de gelatina, principalmente mediante los grupos e-amino de cadenas laterales de lisina intercaladas de manera natural, aumenta la hidrofilia de este biopolfmero y reduce su punto isoelectrico (p/). La repulsion electrostatica intramolecular entre los grupos carboxilato cargados negativamente de las cadenas laterales modificadas extiende supuestamente la molecula para dar una conformacion mas o menos extendida. El volumen expandido resultante hace que la gelatina succinilada sea una macromolecula para su uso como expansor del plasma en seres humanos y se comercializa, entre otras cosas, como Volplex® (Beacon Pharmaceuticals Ltd) o Gelofusine® (B. Braun Melsungen AG). Ademas, se logro un efecto de prolongacion de la semivida mediante fusion genetica de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) a un polipeptido similar a gelatina artificial (Huang (2010) Eur J Pharm Biopharm 74:435-41). Para ello, se intercambiaron todas las cadenas laterales hidrofobas en una gelatina natural por residuos hidrofilos, dando como resultado una protema similar a gelatina de 116 aminoacidos (GLK) que comprendfa los aminoacidos G, P, E, Q, N, S y K en un orden variable. Se fusiono G-CSF en su extremo N-terminal con 4 copias de esta secuencia de GLK y se secreto en Pichia pastoris. Pichia pastoris parecio ser un organismo de produccion favorable para protemas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
fusion de GLK; sin embargo, queda por determinar si tambien pueden producirse GLK en otros organismos ya que se conoce que fragmentos de gelatina recombinantes solo pueden expresarse con bajo rendimiento en E. coli, por ejemplo, tal como se ilustra en Olsen (2003), Adv Drug Deliv Rev 55:1547-67.
La elastina es un componente de la matriz extracelular en muchos tejidos. Se forma a partir del precursor soluble tropoelastina, que consiste en un dominio hidrofilo rico en Lys/Ala y un dominio elastomerico hidrofobo con secuencia repetitiva. La reticulacion enzimatica de cadenas laterales de lisina dentro del dominio hidrofilo conduce a la formacion de elastina insoluble. Los polipeptidos similares a elastina (ELP) son secuencias de aminoacidos repetitivas, disenadas artificialmente, derivadas del dominio hidrofobo de tropoelastina. El motivo de secuencia de repeticion mas comun de ELP es V-P-G-X-G, en el que “X” puede ser cualquier aminoacido excepto Pro (MacEwan (2010) Biopolymers 94:60-77; Kim (2010) Adv Drug Deliv Rev 62:1468-78). Pueden fusionarse ELP adecuados con protemas terapeuticas y producirse en E. coli. Por consiguiente, la capacidad de los ELP de formar depositos similares a gel tras la inyeccion puede prolongar significativamente la semivida in vivo de un compuesto biologico unido, aunque mediante un mecanismo diferente de los demas polipeptidos no estructurados. Sin embargo, la union a ELP puede obstaculizar la bioactividad de la pareja de fusion tal como se demuestra para el antagonista de receptor de interleucina-1 en un bioensayo de proliferacion de linfocitos inducida por IL-1 (Shamji (2007) Arthritis Rheum. 11:3650- 3661). Ademas, los ELP son propensos a degradacion mediante proteasas endogenas tales como colagenasa. Ademas, las protemas agregadas son generalmente mas susceptibles a la inmunogenicidad.
Enfoques adicionales se refieren al uso de polfmeros polianionicos. Por ejemplo, se ha acoplado qmmicamente poliglutamato (PG) a farmacos de molecula pequena citotoxicos escasamente solubles para el tratamiento de cancer. Un producto correspondiente es Opaxio™, un conjugado de farmaco de paclitaxel actualmente en estudios clmicos de fase III. La semivida de un conjugado de paclitaxel-PG se prolongo en un factor de 3 a 14 en comparacion con el compuesto sin modificar (Singer (2005) J Control Release 109:120-6). Se produjeron protemas de fusion adicionales, por ejemplo G-CSF fusionado en su extremo N-terminal con un tramo de 175 residuos de Glu consecutivos o IFN-alfa2 que porta en su extremo C-terminal una cola de PG de 84 residuos, en un estado soluble en el citoplasma de E. coli (vease el documento WO2002/077036). Para una traduccion eficaz, la fusion N-terminal requirio un peptido lfder, que posteriormente se elimino mediante escision con proteasa de virus de grabado del tabaco (TEV). Las fusiones con poliglutamato de G-CSF e INFa2 mostraron bioactividad en ensayos de cultivo celular. Sin embargo, hasta la fecha no se han notificado datos farmacocineticos de estas fusiones con PG. Ademas, la carga altamente negativa de las fusiones con PG es una desventaja general con respecto a interacciones biomoleculares (por ejemplo, union del factor soluble o receptor diana) debido a efectos de atraccion o repulsion electrostaticas artificiales.
El documento WO 2006/081249 describe una secuencia de polipeptido con aproximadamente de 2 a 500 unidades de repeticion de 3 a 6 aminoacidos, en la que G, N o Q representan los principales constituyentes mientras que constituyentes minoritarios pueden ser A, S, T, D o E. Esta composicion de aminoacidos permite la integracion del sequon de glicosilacion Asn-Xaa-Ser/Thr (en el que Xaa es cualquier aminoacido excepto Pro) para la glicosilacion unida en N de la cadena lateral de Asn en sistemas de expresion eucariotas. El tamano macromolecular aumentado de una protema de fusion resultante, incluyendo la modificacion tras la traduccion con estructuras de hidratos de carbono solvatadas voluminosas, puede prolongar la farmacocinetica de la protema geneticamente conjugada. Tales uniones de oligosacaridos (“glicoingeniena”) en general pueden tanto reducir la propension a proteolisis como aumentar el volumen hidrodinamico (Sinclair (2005) J Pharm Sci 94:1626-35). Una desventaja es la heterogenicidad molecular intrmseca de la biomacromolecula glicosilada, lo que provoca un esfuerzo adicional durante la produccion por biotecnologfa y el control de calidad.
El documento WO 2010/091122 (y el documento WO 2007/103515) y Schellenberger (2009) Nat Biotechnol 27:1186-90 dan a conocer polfmeros de aminoacidos no repetitivos, no estructurados, que abarcan y que comprenden los residuos P, E, S, T, A y G. Este conjunto de aminoacidos, que muestra una composicion similar a la repeticion de PSTAD descrita adicionalmente con anterioridad, se examino sistematicamente para determinar secuencias para producir un polipeptido solvatado con gran tamano molecular, adecuado para el desarrollo biofarmaceutico, evitando cadenas laterales hidrofobas (en particular F, I, L, M, V y W) que pueden dar lugar a agregacion y pueden provocar una respuesta inmunitaria mediada por HLA/MHC-II. Ademas, se excluyeron residuos de Cys posiblemente reticulantes, los aminoacidos cationicos K, R y H, que podfan interaccionar con membranas celulares cargadas negativamente, y las cadenas laterales de amida de N y Q, que eran posiblemente propensas a hidrolisis (vease Schellenberger (2009), citado anteriormente). Se examinaron bibliotecas genicas sinteticas que codificaban para secuencias no repetitivas que comprendfan el conjunto de residuos de PESTAG, que se fusionaron con la protema verde fluorescente (GFP), con respecto a niveles de expresion solubles en E. coli, y se investigo adicionalmente un subconjunto resultante para determinar la estabilidad genetica, solubilidad de protema, termoestabilidad, tendencia a la agregacion y perfil de contaminantes. Finalmente, se sometio a pruebas adicionales una secuencia de 864 aminoacidos que contema 216 residuos de Ser (el 25,0% en moles), 72 residuos de Ala (el 8,3% en moles) y 144 aminoacidos (el 16,7% en moles) de cada uno de Pro, Thr, Glu y Gly, para determinar su fusion al agonista de receptor de GLP-1 exendina-4 (E-XTEN) y algunos otros compuestos biologicos. Las protemas de fusion (que portaban normalmente un dominio de union a celulosa, que posteriormente se elimino por escision) se produjeron en un estado soluble en el citoplasma de E. coli y se aislaron. La investigacion de E-XTEN mediante espectroscopfa de dicrofsmo circular (CD) revelo una ausencia de estructura secundaria mientras que durante la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
cromatograffa de exclusion molecular (SEC) la protema de fusion mostro sustancialmente menos retencion de la esperada para una protema de 84 kDa, demostrando por tanto un volumen hidrodinamico aumentado (Schellenberg (2009), citado anteriormente). La estructura desordenada del polipeptido PESTAG y el aumento asociado del radio hidrodinamico pueden verse favorecidos por la repulsion electrostatica entre aminoacidos que portan una alta carga negativa neta que se distribuyen a lo largo de la secuencia de XTEN (vease el documento WO 2010/091122). Sin embargo, un estudio adicional, Geeting (2010) PLoS One 2010; 5:e10175, demostro que XTEN disminuye la potencia de su pareja de fusion terapeutica. En un ensayo de cultivo celular, una fusion de glucagon-XTEN mostro una bioactividad de simplemente el 15% del peptido no modificado. Se describio una perdida aun mayor de afinidad de receptor (CE50 aumentada 17 veces) para una fusion con XTEN de hormona del crecimiento humana (hGH); vease el documento WO 2010/144502. Tambien se ha considerado glicina, el aminoacido mas pequeno y estructuralmente mas sencillo, como el conformacionalmente mas flexible basandose en razonamientos teoricos; vease, por ejemplo, Schulz GE, Schirmer RH. Principles of Protein Structure. Springer, Nueva York 1979. Ademas, simulaciones informaticas han indicado que polfmeros de Gly carecen de estructura secundaria y es probable que formen un enrollamiento al azar en disolucion; vease Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-402. Desde un punto de vista qmmico, la poliglicina es una poliamida no ramificada, lineal, que muestra cierto parecido con el polieter PEG en la medida en que ambos son macromoleculas esencialmente unidimensionales con muchos grados de libertad rotacionales a lo largo de la cadena, que estan compuestas por unidades de hidrocarburos cortas repetidas que estan interrumpidas de manera regular por enlaces de hidrogeno y grupos polares altamente solvatados. Por consiguiente, la poliglicina debe constituir el compuesto mimetico de PEG geneticamente codificable mas sencillo con la perspectiva de prolongar la semivida en plasma de protemas terapeuticas. Este concepto se empleo en forma de “polfmero de homoaminoacido (HAP)” o como secuencia rica en glicina (GRS), respectivamente; vease, Schlapschy (2007) Protein Eng Des Sel 20:273-84; documento WO 2007/103515. Sin embargo, se ha sabido desde hace mucho que los polfmeros de Gly puros qmmicamente sintetizados muestran una escasa solubilidad en agua; vease, entre otros, en Bamford CH et al. Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, and Properties. Academic Press, Nueva York 1956. Por tanto, se realizaron diferentes intentos por aumentar la hidrofilia, o bien introduciendo cadenas laterales de alcohol de serina formadoras de enlaces de hidrogeno (documento WO 2007/103515 asf como Schlapschy (2007), citado anteriormente) o bien, adicionalmente, residuos de glutamato cargados negativamente (documento WO 2007/103515). Debe observarse que ya se han descrito espaciadores peptfdicos con la composicion (Gly4Ser)n en la tecnica con el fin de unir dominios en protemas de fusion de una manera flexible. Se detecto un volumen hidrodinamico significativamente aumentado para estas protemas de fusion en SEC analftica. En el caso de la version de HAP de 200 residuos, el aumento de tamano aparente fue del 120% en comparacion con el fragmento Fab sin fusionar, mientras que la masa autentica solo fue mayor en un 29%, revelando por tanto el efecto de un volumen hidrodinamico potenciado debido a la estructura de enrollamiento al azar solvatada de la cola de poliglicina. Ademas, los espectros de diferencia de CD fueron caractensticos para la estructura secundaria desordenada para el resto de HAP. Finalmente, la semivida en plasma terminal del fragmento Fab que portaba el HAP de 200 residuos en ratones se prolongo en un factor de aproximadamente 3. Aunque moderado, este efecto puede resultar apropiado para determinadas aplicaciones de diagnostico (especializadas), tales como obtencion de imagenes in vivo; vease Schlapschy (2007); citado anteriormente. Desafortunadamente, la produccion de protemas de fusion con secuencias de repeticion de (Gly4Ser)n mas largas parecio ser menos viable debido a un aumento de la tendencia a formar agregados, planteando por tanto una limitacion natural al uso de polfmeros de glicina (mas o menos puros) como compuestos mimeticos de PEG.
El documento WO 2008/155134 da a conocer que secuencias con una mezcla apropiada de residuos de Pro, Ala y Ser (es decir PAS) conducen a una cancelacion mutua de sus preferencias de estructura secundaria diferenciadas y, por tanto, dan como resultado un polipeptido desordenado de manera estable. Sin embargo, el documento WO 2008/155134 tambien documenta que las protemas de fusion con un dominio compuesto unicamente por residuos de serina y alanina (SA), es decir un dominio que comprende solo dos tipos de aminoacidos, no forman un enrollamiento al azar, sino en su lugar una estructura de lamina p. El documento US 2009/0192087 da a conocer una secuencia de poli-Ala que sirve como grupo de union para fusionar al menos un subdominio extracelular de la protema Klotho con un polipeptido que comprende una hormona del crecimiento de fibroblastos. El documento EP- A1 1 739 167 da a conocer un metodo para la generacion de virus y su uso en la preparacion de vacunas. El documento EP-A1 1 739 167 tambien da a conocer una secuencia de poli-A de un polipeptido que puede usarse para preparar virus. Sin embargo, estas secuencias de poli-A no consisten unicamente en residuos de prolina y alanina.
El documento WO 2008/14500 da a conocer protemas de parvovirus con determinadas inserciones y su uso medico. Sin embargo, el documento WO 2008/14500 no da a conocer una protema que tiene una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en al menos 50 residuos de prolina y alanina ni un conjugado de farmaco que comprende la misma.
El documento WO 01/78503 da a conocer protemas de fusion con GFP para su expresion en celulas vegetales, en las que las protemas de fusion pueden comprender una secuencia de (hidroxi)prolina-alanina. Sin embargo, GFP no es un farmaco.
La smtesis qmmica de polipeptidos se conoce bien y se ha descrito en la tecnica. Izuka da a conocer la smtesis qmmica de polipeptidos que contienen prolina (vease Izuka (1993), Bull. Chem. Soc. Jpn 66, 1269-1272). Estos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
copolipeptidos contienen secuencias al azar de prolina y o glicina, L-alanina, acido L-a-aminobutmico (Abu), L- norvalina (Nva) o L-leucina, respectivamente, y se sintetizan mediante copolimerizacion qmmica. Izuka da a conocer que tales copolipeptidos tienen principalmente una conformacion similar a colageno definida. Ademas, en esta publicacion se describe que los copolipeptidos de prolina y alanina (o prolina y acido L-a-aminobutmco) son parcialmente solubles en agua, mientras que otros copolipeptidos eran completamente insolubles. En Izuka se especula que los copolipeptidos de prolina/alanina pueden tener una conformacion desordenada parcial. Izuka enfatiza que los polipeptidos qmmicamente sintetizados con una secuencia de prolina/alanina al azar se producen de manera predominante en una conformacion similar a colageno, es decir en una conformacion estructurada.
Por tanto, el problema tecnico subyacente a la presente invencion es proporcionar polipeptidos grandes con una autentica conformacion de enrollamiento al azar. El problema tecnico se resuelve proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y tal como se proporciona en el presente documento.
Por consiguiente, la invencion se refiere a un conjugado de farmaco que comprende (i) un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) un farmaco seleccionado del grupo que consiste en (a) una protema biologicamente activa o un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o media en una actividad biologica y (b) un farmaco de molecula pequena. Los polipeptidos con autentica conformacion de enrollamiento al azar y segmentos de polipeptido con autentica conformacion de enrollamiento al azar tal como se proporciona en el presente documento tambien son utiles en el contexto de usos cosmeticos asf como usos en la industria alimentaria y la produccion de bebidas. Los polipeptidos grandes proporcionados en el presente documento que muestran autentica conformacion de enrollamiento al azar consisten unica o simplemente en residuos de prolina (P, Pro) y alanina (A, Ala) y comprenden mas de al menos 50 aminoacidos, en particular de al menos aproximadamente 100, en particular de al menos aproximadamente 150, en particular de al menos aproximadamente 200, en particular de al menos aproximadamente 250, en particular de al menos aproximadamente 300, en particular de al menos aproximadamente 350, en particular de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina y alanina. Ambos aminoacidos, P y A, necesitan estar presentes en los polipeptidos grandes con autentica conformacion de enrollamiento al azar y segmentos de polipeptido con autentica conformacion de enrollamiento al azar proporcionados el presente documento. En el presente documento tambien se proporcionan moleculas de acido nucleico que codifican para los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos o segmentos de polipeptido dados a conocer en el presente documento asf como para conjugados de farmaco o alimento que comprenden dichos polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos o segmentos de polipeptido y una protema de interes (covalentemente unida), tal como una protema biologicamente activa.
El polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico tal como se describe en el presente documento y que va a usarse en conjugados de farmaco o alimento tal como se proporciona en el presente documento y que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en al menos aproximadamente 50, en al menos aproximadamente 100, en al menos aproximadamente 150, en al menos aproximadamente 200, en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350, en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina (P) y alanina (A) va a usarse, entre otras cosas, en un contexto heterologo, es decir en una protema heterologa biologicamente activa, constructo de protema y/o en un conjugado de farmaco que comprende dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido y moleculas farmaceutica o medicamente utiles, tales como moleculas pequenas, peptidos o biomacromoleculas tales como protemas, acidos nucleicos, hidratos de carbono, vesmulas iipfdicas y similares. Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, los inventores pudieron proporcionar satisfactoriamente conjugados de farmaco que consisten en los polipeptidos de enrollamiento al azar autentico tal como se define en el presente documento y protemas biologicamente activas o tramos de protema asf como conjugados de farmaco que consisten en moleculas pequenas o farmacos de molecula pequena que comprenden y/o estan unidos a los polipeptidos de enrollamiento al azar descritos en el presente documento, que consisten unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina (es decir en aminoacidos tanto P como A).
Por consiguiente, la presente invencion proporciona, entre otras cosas, una protema heterologa biologicamente activa que comprende al menos dos dominios en la que (a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica; y (b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que consiste en una secuencia de aminoacidos que consiste en al menos aproximadamente 50, en al menos aproximadamente 100, en al menos aproximadamente 150, en al menos aproximadamente 200, en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350, en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina y alanina. Segun esta invencion, dicho “primer dominio” y dicho “segundo dominio” no estan comprendidos ni en una protema natural (es decir, que se produce en la naturaleza) ni en una protema hipotetica segun se deduce a partir de secuencias de acido nucleico codificantes que se producen de manera natural, tales como marcos de lectura abiertos, etc.
Ademas, esta invencion proporciona un conjugado de farmaco que consiste en el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en al
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
menos aproximadamente 50, en al menos aproximadamente 100, en al menos aproximadamente 150, en al menos aproximadamente 200, en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350, en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina y alanina y (a) molecula(s) farmaceuticamente util(es), tal(es) como una(s) molecula(s) pequena(s) o una(s) protema(s) que se conjuga(n) con dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido. De nuevo, debe observarse que el termino “biologicamente activo” en el contexto de los conjugados dados a conocer en el presente documento no se limita a moleculas biologicas puras sino que tambien comprende moleculas medicamente activas, terapeuticamente activas, farmaceuticamente activas y similares. Resulta evidente para el experto en la tecnica que los medios y metodos proporcionados en el presente documento no se limitan a usos farmaceuticos y medicos, sino que pueden emplearse en una amplia variedad de tecnologfas, incluyendo, pero sin limitarse a, tecnologfas cosmeticas, alimentarias, de bebidas y nutricion, industria del petroleo, industria del papel y similares.
A diferencia de copolipeptidos qmmicamente sintetizados (tal como en Izuka, citado anteriormente), los polipeptidos de enrollamiento al azar proporcionados en el presente documento se producen de manera biosintetica. El termino “biosintetico” tal como se usa en el presente documento se refiere a la smtesis por medio de medios biotecnologicos (a diferencia de la smtesis qmmica). Tales metodos biotecnologicos se conocen bien en la tecnica y tambien se describen en el presente documento a continuacion. La biosmtesis de los polipeptidos de enrollamiento al azar de la presente invencion permite la produccion de polipeptidos con una secuencia de residuos de prolina y alanina definida, una longitud definida y/o una razon definida de residuos de prolina y alanina. Ademas, los polipeptidos proporcionados segun la presente invencion son sustancialmente puros, es decir, los polipeptidos producidos son esencialmente uniformes y comparten las caractensticas anteriores (es decir secuencia definida, longitud definida y/o razon de aminoacidos definida). Los polipeptidos de enrollamiento al azar que consisten en al menos aproximadamente 50, en particular en al menos aproximadamente 100, en particular en al menos aproximadamente 150, en particular en al menos aproximadamente 200, en particular en al menos aproximadamente 250, en particular en al menos aproximadamente 300, en particular en al menos aproximadamente 350, en particular en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina y alanina estan comprendidos segun esta invencion en conjugados de farmaco.
En conjunto, las caractensticas anteriores de los polipeptidos de la presente invencion permiten la formacion de un enrollamiento al azar estable de los polipeptidos y estos polipeptidos de enrollamiento al azar tienen propiedades sorprendentes y ventajosas. Por ejemplo, los polipeptidos de la presente invencion son completamente solubles en disolucion acuosa y tienen un volumen hidrodinamico aumentado. De manera inesperada, los polipeptidos de enrollamiento al azar tal como se define en el presente documento tambien pueden conferir una estabilidad in vivo/in vitro aumentada. Esto es particularmente importante para aplicaciones medicas, por ejemplo, para protemas biologicamente activas o conjugados de farmaco que comprenden el polipeptido de enrollamiento al azar de esta invencion. Sin embargo, las numerosas propiedades ventajosas de los polipeptidos de enrollamiento al azar de la presente invencion no solo permiten su uso en el campo medico sino tambien en otros campos, tales como en cosmetica/tratamientos cosmeticos o en los campos de nutricion y tecnologfa de los alimentos, tal como en la industria lactea o en el procesamiento de la carne. Ejemplos de conjugados utiles en industria alimentaria y similares son conjugados que comprenden el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido dado a conocer en el presente documento que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina y compuestos que son utiles en estas tecnologfas, tales como, por ejemplo, polfmeros de polioxipropileno o polioxietileno, que son tensioactivos no ionicos usados como emulsionantes. En el presente documento tambien se preve el uso del polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico tal como se define en el presente documento en metodos bioqmmicos y en procedimientos tecnicos, tales como produccion de papel, recuperacion de petroleo y similares. Las caractensticas sorprendentes y ventajosas de los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos que consisten simplemente en residuos de prolina y alanina tal como se proporciona en el presente documento (y tambien de los conjugados y constructos dados a conocer en el presente documento, tales como conjugados/constructos de farmaco o alimento, que comprenden dichos polipeptidos de enrollamiento al azar autentico biosinteticos) se describen a continuacion con mas detalle. Ademas, a continuacion se proporcionan usos y medios y metodos ilustrativos que emplean estos polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos de la invencion. En el presente documento tambien se proporcionan medios y metodos para la produccion de tales polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos asf como polipeptidos heterologos o constructos de polipeptido biologicamente activos y de los conjugados y constructos dados a conocer en el presente documento, tales como constructos de farmaco, que comprenden dichos polipeptidos de enrollamiento al azar.
En el contexto de esta invencion, se ha encontrado sorprendentemente que los polfmeros/polipeptidos de prolina- alanina con una composicion uniforme forman una conformacion de enrollamiento al azar estable. Esto tambien se demuestra en los ejemplos adjuntos, en los que la estructura de enrollamiento al azar de (co)polfmeros/polipeptidos de prolina/alanina biosinteticos se confirma mediante espectroscopfa de dicrofsmo circular (CD). La obtencion y el empleo de tales polipeptidos/polfmeros autenticamente de enrollamiento al azar biosinteticos fueron sorprendentes dado que el metodo de Chou-Fasman establecido (Chou y Fasman (1974), Biochemistry 13, 223-245) predice una estructura secundaria en helices a al 100% de polfmeros/polipeptidos (o segmentos de los mismos) compuestos por prolina y alanina, tal como se muestra en la figura 7. Sin embargo, en el presente documento se ha encontrado sorprendentemente y se ha mostrado experimentalmente que los polfmeros/polipeptidos de prolina-alanina con una composicion uniforme forman una conformacion de enrollamiento al azar estable. Esto tambien se demuestra en los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ejemplos adjuntos, en los que la estructura de enrollamiento al azar de (co)poKmeros/polipeptidos de prolina/alanina se confirma mediante tecnicas experimentales tales como espectroscop^a de dicnmsmo circular (CD) y cromatograffa de exclusion molecular (SEC).
A diferencia de los polipeptidos/poKmeros de la presente invencion, los polipeptidos qmmicamente sintetizados descritos, por ejemplo, en Izuka (1993), citado anteriormente, tienen una secuencia arbitraria/no definida y estocastica y una longitud diversa. Por tanto, los polipeptidos qmmicamente sintetizados comprenden una mezcla de peptidos completamente diferentes con diversas razones de prolina/alanina, longitudes, y asf sucesivamente. Tal como se menciona en Izuka, los polipeptidos qmmicamente sintetizados de una mezcla de este tipo no forman (o solo forman parcialmente) un enrollamiento al azar y, por consiguiente, no tienen ninguna de las propiedades ventajosas de los polipeptidos biosinteticos proporcionados y descritos a continuacion en el presente documento. Por consiguiente, la presente divulgacion comprende y se refiere a composiciones que comprenden los polipeptidos/polfmeros de enrollamiento al azar biosinteticos de la invencion tal como se da a conocer en el presente documento, mediante lo cual dichos polipeptidos/polfmeros de enrollamiento al azar biosinteticos se definen, entre otras cosas, por su secuencia que comprende unicamente residuos de prolina y alanina. La invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. La invencion se refiere a conjugados de farmaco que comprenden, como constituyente, estos polipeptidos/polfmeros de enrollamiento al azar dados a conocer en el presente documento. Estos polipeptidos/polfmeros de enrollamiento al azar biosinteticos de la invencion comprendidos en dichas composiciones son, en una realizacion, de longitud uniforme.
Tal como se menciono anteriormente, los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos (o segmentos de polipeptido de enrollamiento al azar) de esta invencion que consisten unicamente en residuos de prolina y alanina forman de manera inesperada una conformacion de enrollamiento al azar estable. El termino “enrollamiento al azar” tal como se usa en el presente documento se refiere de manera general a cualquier conformacion de una molecula polimerica, incluyendo polfmeros de aminoacidos/secuencias de aminoacidos/polipeptidos, en la que los elementos monomericos individuales que forman dicha estructura polimerica estan orientados esencialmente al azar hacia los elementos monomericos adyacentes mientras que todavfa estan qmmicamente unidos a dichos elementos monomericos adyacentes. En particular, un polipeptido, secuencia de aminoacidos o polfmero de aminoacidos que adopta/tiene/forma una “conformacion de enrollamiento al azar” carece sustancialmente de una estructura secundaria y terciaria definida. En el contexto de los polipeptidos de la presente invencion, los elementos monomericos que forman la estructura polimerica (es decir el polipeptido/secuencia de aminoacidos) son o bien aminoacidos individuales tales como prolina y alanina en sf mismos o bien tramos peptfdicos tales como las “repeticiones de aminoacidos”/“casetes de aminoacidos”/“repeticiones de casete”/“bloques estructurales”/“modulos” (o fragmentos de los mismos) que se describen y definen adicionalmente a continuacion.
La naturaleza de enrollamientos al azar de polipeptidos y sus metodos de identificacion experimental los conoce el experto en la tecnica y se han descrito en la bibliograffa cientffica (Cantor (1980) Biophysical Chemistry, 2a ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York; Creighton (1993) Proteins - Structures and Molecular Properties, 2a ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York; Smith (1996) Fold Des 1:R95-R106). El termino “segmento” tal como se usa en el presente documento se refiere a una parte del polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico definido en el presente documento, mediante el cual una parte de este tipo puede ser una parte interna del polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico descrito en el presente documento. Un “segmento” de este tipo puede ser, por ejemplo, un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico tal como se define en el presente documento en el que uno (o mas) aminoacidos se han delecionado, por ejemplo desde el comienzo y/o desde el final del polipeptido de la invencion. Ademas, un “segmento” de este tipo puede usarse como, o formar parte de, una protema o polipeptido mas grande, por ejemplo, de una protema de fusion con una protema biologicamente activa. Una “protema de fusion” de este tipo tambien sera un ejemplo de un polipeptido/protema/constructo de polipeptido biologicamente activo, heterologo, de la presente invencion. El termino “heterologo” tal como se usa en el presente documento se define a continuacion en el presente documento.
El polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de enrollamiento al azar del mismo), tal como se proporciona en la presente invencion y que va a emplearse en el contexto de esta invencion, adopta/forma una conformacion de enrollamiento al azar, por ejemplo, en disolucion acuosa o en condiciones fisiologicas. El termino “condiciones fisiologicas” se conoce en la tecnica y se refiere a las condiciones en las que las protemas adoptan habitualmente su conformacion plegada nativa. Mas espedficamente, el termino “condiciones fisiologicas” se refiere a los parametros bioffsicos tal como son normalmente validos para formas de vida superiores y, particularmente, en mairnferos, lo mas preferiblemente seres humanos. El termino “condiciones fisiologicas” puede referirse a los parametros bioqmmicos y bioffsicos tal como se encuentran normalmente en el organismo (en particular en lfquidos corporales) de mamfferos y en particular en seres humanos. Dichas “condiciones fisiologicas” pueden referirse a los parametros correspondientes encontrados en el organismo sano asf como los parametros encontrados en estados patologicos o en pacientes humanos. Por ejemplo, un paciente humano o mamffero enfermo puede tener una condicion de temperatura superior, pero “fisiologica” cuando dicho mamffero o dicho ser humano padece fiebre. Con respecto a “condiciones fisiologicas” en las que las protemas adoptan su conformacion/estado nativo, los parametros mas importantes son la temperatura (37°C para el cuerpo humano), pH (7,35 - 7,45 para la sangre humana), osmolaridad (280 - 300 mmol/kg de H2O), y, si es necesario, contenido en protemas (66 - 85 g/l de suero). Sin embargo, el experto en la tecnica es consciente de que en condiciones fisiologicas estos parametros pueden variar, por ejemplo la temperatura, pH, osmolaridad y contenido en protemas pueden ser diferentes en lfquidos corporales o tisulares
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
dados tales como sangre, Uquido cefalorraqmdeo, Ifquido peritoneal y linfa (Klinke (2005) Physiologie, 5a ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart). Por ejemplo, en el lfquido cefalorraqmdeo la osmolaridad puede ser de aproximadamente 290 mmol/kg de H2O y la concentracion de protemas puede ser de entre 0,15 g/l y 0,45 g/l, mientras que en la linfa el pH puede ser de aproximadamente 7,4 y el contenido en protemas puede ser de entre 3 g/l y 5 g/l. Cuando se determina si un polipeptido (o segmento del mismo)/secuencia de aminoacidos forma/adopta una conformacion de enrollamiento al azar en condiciones experimentales usando los metodos tal como se describe a continuacion en el presente documento, los parametros bioffsicos tales como temperatura, pH, osmolaridad y contenido en protemas pueden ser diferentes de las condiciones fisiologicas normalmente encontradas in vivo. Temperaturas de entre 1°C y 42°C o preferiblemente de 4°C a 25°C pueden considerarse utiles para someter a prueba y/o verificar las propiedades bioffsicas y la actividad biologica de una protema en condiciones fisiologicas in vitro.
Se considera que varios tampones, en particular en entornos experimentales (por ejemplo en la determinacion de estructuras de protemas, en particular en mediciones de CD y otros metodos que permiten al experto en la tecnica determinar las propiedades estructurales de una protema/tramo de aminoacidos) o en tampones, disolventes y/o excipientes para composiciones farmaceuticas, representan “disoluciones fisiologicas”/“condiciones fisiologicas” in vitro. Ejemplos de tales tampones son, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato (PBS: NaCl 115 mM, KH2PO4 4 mM, Na2HPO4 16 mM, pH 7,4), tampones Tris, tampones acetato, tampones citrato o tampones similares tales como los usados en los ejemplos adjuntos. Generalmente, el pH de un tampon que representa “condiciones de disolucion fisiologica” debe encontrarse en un intervalo de desde 6,5 hasta 8,5, preferiblemente en un intervalo de desde 7,0 hasta 8,0, lo mas preferiblemente en un intervalo de desde 7,2 hasta 7,7 y la osmolaridad debe encontrarse en un intervalo de desde 10 hasta 1000 mmol/kg de H2O, mas preferiblemente en un intervalo de desde 50 hasta 500 mmol/kg de H2O y lo mas preferiblemente en un intervalo de desde 200 hasta 350 mmol/kg de H2O. Opcionalmente, el contenido en protemas de un tampon que representa condiciones de disolucion fisiologica puede encontrarse en un intervalo de desde 0 hasta 100 g/l, despreciando la propia protema con actividad biologica, mediante lo cual pueden usarse protemas estabilizantes tfpicas, por ejemplo albumina serica humana o bovina.
En el presente documento se ha encontrado que los polipeptidos (o segmentos de los mismos) no solo forman una conformacion de enrollamiento al azar en condiciones fisiologicas sino, mas generalmente, en disolucion acuosa. El termino “disolucion acuosa” se conoce bien en la tecnica. Una “disolucion acuosa” puede ser una disolucion con un contenido en agua (H2O) de al menos aproximadamente el 20%, de al menos aproximadamente el 30%, de al menos aproximadamente el 40%, de al menos aproximadamente el 50%, de al menos aproximadamente el 60%, de al menos aproximadamente el 70%, de al menos aproximadamente el 80% o de al menos aproximadamente el 90% de H2O (peso/peso). Por consiguiente, el polipeptido (o segmento del mismo) de la presente invencion puede formar una conformacion de enrollamiento al azar en disolucion acuosa, que contiene posiblemente otros disolventes miscibles, o en dispersiones acuosas con un intervalo mas amplio de temperaturas, valores de pH, osmolaridades o contenido en protemas. Esto es particularmente relevante para aplicaciones del polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) fuera de la terapia medica o diagnostico in vivo, por ejemplo en cosmetica, nutricion o tecnologfa de los alimentos.
Por consiguiente, tambien se preve en el contexto de esta invencion que la conformacion de enrollamiento al azar del polipeptido biosintetico de prolina/alanina (o segmento del mismo) de la presente invencion se mantiene y/o se usa en el contexto de composiciones farmaceuticas, tales como productos farmaceuticos/biologicos lfquidos o composiciones farmaceuticas liofilizadas. Esto es particularmente importante en el contexto de los conjugados de farmaco proporcionados en el presente documento que comprenden, entre otras cosas, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) de la invencion. Preferiblemente, las “condiciones fisiologicas” van a usarse en sistemas de tampon, disolventes y/o excipientes correspondientes. Sin embargo, por ejemplo en composiciones liofilizadas o secadas (tales como, por ejemplo, composiciones farmaceuticas/productos biologicos), se preve que la conformacion de enrollamiento al azar del polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) proporcionado en el presente documento temporalmente no esta presente y/o no puede detectarse. Sin embargo, dicho polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) adoptara/formara de nuevo su enrollamiento al azar tras la reconstitucion en tampones/disoluciones/excipientes/disolventes correspondientes o tras la administracion al organismo. En la tecnica se conocen metodos para determinar si un polipeptido (o segmento del mismo) forma/adopta una conformacion de enrollamiento al azar (Cantor (1980), citado anteriormente; Creighton (1993), citado anteriormente; Smith (1996), citado anteriormente). Tales metodos incluyen espectroscopfa de dicrofsmo circular (CD) tal como se muestra a modo de ejemplo a continuacion en el presente documento. La espectroscopfa de CD representa un metodo de espectroscopfa de absorcion de luz en el que se mide la diferencia en la absorbancia de luz polarizada de manera circular a la derecha y a la izquierda por una sustancia. La estructura secundaria de una protema puede determinarse mediante espectroscopfa de CD usando espectros en el ultravioleta lejano con una longitud de onda de entre aproximadamente 190 y 250 nm. A estas longitudes de onda, pueden analizarse las diferentes estructuras secundarias encontradas habitualmente en polipeptidos, dado que las conformaciones de helices a, de laminas p paralelas y antiparalelas, y de enrollamiento al azar dan cada una lugar a una forma y magnitud caractensticas del espectro de CD. Por consiguiente, usando espectrometna de CD el experto en la tecnica puede determinar facilmente si el polipeptido (o segmento del mismo) forma/adopta una conformacion de enrollamiento al azar en disolucion acuosa o en condiciones fisiologicas. Otros metodos bioffsicos establecidos incluyen espectroscopfa de resonancia magnetica nuclear (RMN), espectrometna de absorcion, espectroscopfa de infrarrojos y de Raman, medicion del volumen hidrodinamico mediante cromatograffa de exclusion molecular,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ultracentrifugacion analftica o dispersion de la luz dinamica/estatica asf como mediciones del coeficiente de friccion o la viscosidad intnnseca (Cantor (1980), citado anteriormente; Creighton (1993), citado anteriormente; Smith (1996), citado anteriormente).
Ademas de los metodos experimentales anteriores, se han descrito metodos teoricos para la prediccion de estructuras secundarias en protemas. Un ejemplo de un metodo teorico de este tipo es el metodo de Chou-Fasman (Chou y Fasman, citado anteriormente) que se basa en un analisis de las frecuencias relativas de cada aminoacido en helices a, laminas p y giros basandose en estructuras de protema conocidas resueltas, por ejemplo, con cristalograffa de rayos X. Sin embargo, se sabe que la prediccion teorica de la estructura secundaria de protemas no es fiable. Tal como se muestra a modo de ejemplo a continuacion en el presente documento, se encontro que secuencias de aminoacidos que se esperaba que adoptasen una estructura secundaria en helices a segun el metodo de Chou-Fasman formaban un enrollamiento al azar. Por consiguiente, metodos teoricos tales como el algoritmo de Chou-Fasman pueden tener tan solo un valor predictivo limitado de si un polipeptido dado adopta una conformacion de enrollamiento al azar, tal como tambien se ilustra en los ejemplos y figuras adjuntos. No obstante, la prediccion teorica descrita anteriormente es con frecuencia el primer enfoque en la evaluacion de una supuesta estructura secundaria de un polipeptido/secuencia de aminoacidos dado. Una prediccion teorica de una estructura de enrollamiento al azar tambien indica con frecuencia que puede merecer la pena verificar mediante los medios experimentales anteriores si un polipeptido/secuencia de aminoacidos dado tiene de hecho una conformacion de enrollamiento al azar.
Los homopolfmeros de la mayona de los aminoacidos, en particular los aminoacidos hidrofobos, son habitualmente insolubles en disolucion acuosa (Bamford (1956) Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, and Properties, 2a ed., Academic Press, Nueva York). Se sabe que los homopolfmeros de varios aminoacidos hidrofilos forman estructuras secundarias, por ejemplo helices a en el caso de Ala (Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-2402) y laminas p en el caso de Ser (Quadrifoglio (1968) J Am Chem Soc 90:2760-2765), mientras que poliprolina, el homooligopeptido mas ngido (Schimmel (1967) Proc Natl Acad Sci USA 58:52-59), forma una helice trans de tipo II en disolucion acuosa (Cowan (1955) Nature 176:501-503).
Usando los principios teoricos de bioffsica de polfmeros, el diametro de enrollamiento al azar de una cadena de 200 residuos de aminoacido ascendera en el caso de poliglicina, por ejemplo, hasta cerca de 75 A (calculado como
J&Y = |. Jn-C. ,
media cuadratica promedio de la distancia de extremo a extremo de V' <o * “ con n = 200 enlaces
rotatorios de longitud l = 3,8 A para cada distancia Ca-Ca y la “razon caractenstica” C- “ 2,0 para poli(Gly) (Brant (1967) J Mol Biol 23:47-65; Creighton, (1993), citado anteriormente)). Esta relacion muestra que el experto en la tecnica esperara que el volumen hidrodinamico de un polfmero de aminoacidos de cadena al azar pueda extenderse o bien (a) usando una longitud de cadena l mas larga o bien (b) usando aminoacidos que muestran una razon caractenstica, C-, mayor. C- es una medida de la rigidez inherente de la cadena al azar molecular y tiene un valor general de 9 para la mayona de los aminoacidos (Brant (1967), citado anteriormente). Solo Gly, que carece de una cadena lateral, y tambien el iminoacido Pro, muestran valores significativamente menores. Por tanto, se espera que Gly y Pro (en condiciones desnaturalizantes) contribuyan a reducir las dimensiones de protemas de enrollamiento al azar (Miller (1968) Biochemistry 7:3925-3935). Por consiguiente, se espera que secuencias de aminoacidos que comprenden residuos de prolina tengan un volumen hidrodinamico relativamente compacto. Sin embargo, a diferencia de estas ensenanzas, en el presente documento se muestra que el volumen hidrodinamico de los polfmeros de aminoacidos/polipeptidos de la invencion que comprenden una mezcla de residuos de prolina y alanina tienen un volumen hidrodinamico drasticamente aumentado tal como se determina mediante permeacion en gel analftica/cromatograffa de exclusion molecular en comparacion con el volumen hidrodinamico esperado. De hecho, resulta sorprendente que polipeptidos que comprenden mezclas de estos dos aminoacidos (prolina y alanina), de los que cada uno por si solo tiende a formar un homooligopeptido con estructura secundaria definida, adopten una conformacion de enrollamiento al azar en condiciones fisiologicas. Tales polipeptidos de prolina/alanina de la invencion tienen un radio hidrodinamico mayor que homopolfmeros que comprenden el mismo numero de residuos de Gly, por ejemplo, y confieren mejor solubilidad a las protemas biologicamente activas o constructos, es decir protemas heterologas biologicamente activas o conjugados de farmaco, segun la invencion.
Tal como se menciono anteriormente, los polipeptidos de prolina/alanina de enrollamiento al azar biosinteticos de la presente invencion difieren de polipeptidos qmmicamente sintetizados en que pueden adoptar una longitud uniforme definida mediante medios y metodos faciles. Mientras que la tecnica anterior proporciona mezclas/composiciones de polipeptidos con enormes variaciones en cuanto a la longitud de los peptidos, la presente invencion puede proporcionar mezclas/composiciones de polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos con una longitud definida. De manera preferible, esencialmente todos los polipeptidos de la invencion comprendidos en una mezcla/composicion de este tipo tienen la misma longitud definida y, por tanto, comparten las mismas caractensticas bioqrnmicas. Una composicion uniforme de este tipo es mas ventajosa en las diversas aplicaciones medicas, cosmeticas, nutricionales, en las que pueden emplearse los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos. Ademas, en particular en un contexto medico o farmaceutico, el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido definido en el presente documento que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en al menos aproximadamente 50, en particular en al menos aproximadamente 100, en particular en al menos aproximadamente 150, en particular en al menos aproximadamente 200, en particular en al menos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
aproximadamente 250, en particular en al menos aproximadamente 300, en particular en al menos aproximadamente 350, en particular en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina y alanina tambien puede usarse en la prevencion, mejora y/o tratamiento de trastornos asociados y/o afiliados con una situacion de plasma sangumeo alterada, por ejemplo tras lesiones, quemaduras, cirugfa y similares. Por consiguiente, un uso medico de dichos polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos o segmentos de polipeptido es el uso como expansor del plasma. Sin embargo, debe observarse que segun esta invencion los conjugados de farmaco descritos en el presente documento, tales como polipeptidos heterologos o constructos de polipeptido heterologo, tambien pueden emplearse en el contexto de la intervencion medica o farmaceutica de un trastorno relacionado con una cantidad de plasma sangumeo alterada o contenido en plasma sangumeo o de un trastorno relacionado con un volumen de sangre alterado.
Por consiguiente, la presente invencion se refiere en una realizacion a un polipeptido al azar biosintetico (o segmento del mismo) que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en al menos aproximadamente 50 residuos de aminoacido de prolina y alanina, en al menos aproximadamente 100 residuos de aminoacido de prolina y alanina, en al menos aproximadamente 150 residuos de aminoacido de prolina y alanina o en al menos aproximadamente 200 residuos de prolina y alanina cuando esta comprendido en un conjugado de farmaco, tal como una protema heterologa/polipeptido/constructo de polipeptido. La presente invencion tambien se refiere a polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos que comprenden una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en al menos aproximadamente 200 residuos de aminoacido de prolina y alanina, incluso mas preferiblemente en al menos aproximadamente 300 residuos de aminoacido de prolina y alanina, de manera particularmente preferible en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina y alanina, de manera mas particularmente preferible en al menos aproximadamente 500 residuos de aminoacido de prolina y alanina y lo mas preferiblemente en al menos aproximadamente 600 residuos de aminoacido de prolina y alanina que van a usarse en el presente documento. La secuencia de aminoacidos que forma una conformacion de enrollamiento al azar puede consistir como maximo en aproximadamente 3000 residuos de aminoacido de prolina y alanina, como maximo en aproximadamente 2000 residuos de aminoacido de prolina y alanina, como maximo en aproximadamente 1500 residuos de aminoacido de prolina y alanina, como maximo en aproximadamente 1200 residuos de aminoacido de prolina y alanina, como maximo en aproximadamente 800 residuos de aminoacido de prolina y alanina. Por consiguiente, el tramo de secuencia de aminoacidos de prolina/alanina puede consistir en aproximadamente 50, en aproximadamente 100, en aproximadamente 150, en aproximadamente 200, en aproximadamente 250, en aproximadamente 300, en aproximadamente 350, en aproximadamente 400, en aproximadamente 500, en aproximadamente 600, en aproximadamente 700, en aproximadamente 800, en de aproximadamente 900 a aproximadamente 3000 residuos de aminoacido de prolina y alanina. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoacidos biosintetica de la invencion que va a usarse en el presente documento comprende de aproximadamente 200 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 300 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 300 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 300 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 400 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 400 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 400 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 400 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 600 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 600 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 600 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 600 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 700 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 700 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 700 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 700 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 700 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 800 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 800 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 800 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 800 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, de aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina. Tal como resulta evidente a partir del contenido de esta invencion, secuencias de aminoacidos biosinteticas mas grandes (que consisten esencialmente en prolina y alanina) tambien estan dentro del alcance de esta invencion y pueden emplearse facilmente en las protemas biologicamente activas o constructos de protema definidos en el presente documento que comprenden como un dominio de al menos dos dominios una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica y como otro dominio de al menos dos dominios el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que consiste en al menos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
aproximadamente 50 residuos de aminoacido de prolina y alanina, en al menos aproximadamente 100 residuos de aminoacido de prolina y alanina, en al menos aproximadamente 150 residuos de aminoacido de prolina y alanina, en al menos aproximadamente 200, en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350, en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina y alanina. Un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de este tipo corresponde a la parte de enrollamiento al azar biosintetica de una protema heterologa/constructo de protema. Estos tramos de prolina/alanina biosinteticos consisten como maximo en aproximadamente 3000 residuos de aminoacido de prolina y alanina. Estas secuencias de aminoacidos (tramos de prolina/alanina) comprenden prolina y alanina como residuos principales o unicos tal como se explica adicionalmente a continuacion.
Se preve que es la secuencia de aminoacidos biosintetica definida en el presente documento que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina (P) y alanina (A) la que forma/adopta/tiene una conformacion de enrollamiento al azar. En el caso mas sencillo, el polipeptido biosintetico o segmento de polipeptido consiste en la secuencia de aminoacidos que tiene una conformacion de enrollamiento al azar tal como se define en el presente documento. Sin embargo, el polipeptido biosintetico (o segmento del mismo) puede comprender, ademas de la secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento que forma/adopta/tiene una conformacion de enrollamiento al azar, secuencias de aminoacidos/residuos de aminoacido adicionales que no contribuyen a la formacion de la conformacion de enrollamiento al azar o que no pueden formar/adoptar/tener una conformacion de enrollamiento al azar por sf solos. Sin apartarse de la esencia de la invencion, tales polipeptidos biosinteticos (o segmentos de los mismos) tambien son polipeptidos de “enrollamiento al azar” biosinteticos o segmentos de polipeptido. Las secuencias de aminoacidos/residuos de aminoacido adicionales pueden ser utiles, por ejemplo, como grupos de union. Entre otras cosas, tambien se preven dfmeros, tnmeros, es decir multimeros en general del polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico, en el contexto de la presente invencion y tales multfmeros pueden unirse mediante secuencias de aminoacidos/residuos que no forman una conformacion de enrollamiento al azar. Un ejemplo de una protema que puede comprender un polipeptido de enrollamiento al azar de este tipo es la protema biologicamente activa proporcionada en el presente documento, que puede comprender adicionalmente, ademas del polipeptido de enrollamiento al azar que consiste en residuos de aminoacido de prolina y alanina tal como se define en el presente documento, otro polipeptido que tiene/media en una actividad biologica. De nuevo, un constructo de este tipo puede ser un constructo de polipeptido o protema heterologo biologicamente activo tal como se describe en el presente documento.
El termino “al menos aproximadamente 50/100/150/200/300/400/500/600/700/800/etc. residuos de aminoacido” no esta limitado al numero espedfico de residuos de aminoacido sino que comprende tramos de aminoacidos que comprenden o bien aproximadamente el 1-20%, tal como del 10% al 20% mas residuos o bien aproximadamente el 1-20%, tal como aproximadamente del 10% al 20% menos residuos. Por ejemplo “al menos aproximadamente 100 residuos de aminoacido” tambien puede comprender aproximadamente de 80 a 100 y aproximadamente de 100 a 120 residuos de aminoacido sin apartarse de la esencia de la presente invencion. Por ejemplo “al menos aproximadamente 200 residuos de aminoacido” tambien puede comprender aproximadamente de 160 a 200 y aproximadamente de 200 a 240 residuos de aminoacido sin apartarse de la esencia de esta invencion. La definicion y explicaciones facilitadas anteriormente en el presente documento tambien se aplican, cambiando lo que sea necesario, al termino “como maximo aproximadamente 3000/2000/1500/1200/800 residuos de aminoacido” etc. Por consiguiente, el termino “aproximadamente” no se limita o restringe al numero espedfico de residuos de aminoacido en el contexto de secuencias de aminoacidos mas largas (por ejemplo secuencias de aminoacidos que comprenden o consisten como maximo en 3000 residuos de aminoacido). Por tanto, el termino “como maximo aproximadamente 3000/2000/1500/1200/800 residuos de aminoacido” tambien puede comprender tramos de aminoacidos que comprenden del 10% al 20% mas o del 10% al 20% menos residuos sin apartarse de esta invencion.
Ademas, los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos (o segmentos de los mismos) se caracterizan por un contenido definido o razon de residuos de aminoacido, en particular de los constituyentes principales prolina y alanina. Tal como se menciono anteriormente, la presente invencion se refiere a un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos aproximadamente 50, en al menos aproximadamente 100, en al menos aproximadamente 150, en al menos aproximadamente 200 en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350, en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala) en particular cuando esta comprendida en una protema biologicamente activa heterologa/constructo de protema/polipeptido o conjugado de farmaco.
Por consiguiente, la presente invencion se refiere en una realizacion a un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo) mediante el cual la secuencia de aminoacidos consiste principalmente en prolina y alanina, y en el que los residuos de prolina constituyen mas de aproximadamente el 10% y menos del 75% de la secuencia de aminoacidos. Los residuos de alanina comprenden el al menos del 25% al 90% restante de dicha secuencia de aminoacidos (o el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido si consiste en la secuencia de aminoacidos).
Preferiblemente, la secuencia de aminoacidos comprende mas de aproximadamente el 10%, preferiblemente mas de aproximadamente el 12%, incluso mas preferiblemente mas de aproximadamente el 14%, de manera
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
particularmente preferible mas de aproximadamente el 18%, de manera mas particularmente preferible mas de aproximadamente el 20%, de manera incluso mas particularmente preferible mas de aproximadamente el 22%, el 23% o el 24% y lo mas preferiblemente mas de aproximadamente el 25% de residuos de prolina. La secuencia de aminoacidos comprende preferiblemente menos de aproximadamente el 75%, mas preferiblemente menos del 70%, el 65%, el 60%, el 55% o el 50% de residuos de prolina, en la que se prefieren los valores inferiores. Incluso mas preferiblemente, la secuencia de aminoacidos comprende menos de aproximadamente el 48%, el 46%, el 44%, el 42% de residuos de prolina. Se prefieren particularmente secuencias de aminoacidos que comprenden menos de aproximadamente el 41%, el 40%, el 39% el 38%, el 37% o el 36% de residuos de prolina, mediante lo cual se prefieren los valores inferiores. Lo mas preferiblemente, la secuencia de aminoacidos comprende menos de aproximadamente el 35% de residuos de prolina; vease tambien los constructos de PA proporcionados a continuacion en el presente documento.
A la inversa, la secuencia de aminoacidos comprende preferiblemente menos de aproximadamente el 90%, mas preferiblemente menos del 88%, el 86%, el 84%, el 82% o el 80% de residuos de alanina, en la que se prefieren los valores inferiores. Incluso mas preferiblemente, la secuencia de aminoacidos comprende menos de aproximadamente el 79%, el 78%, el 77%, el 76% de residuos de alanina, mediante la cual se prefieren los valores inferiores. Lo mas preferiblemente, la secuencia de aminoacidos comprende menos de aproximadamente el 75% de residuos de alanina.
Tambien se prefiere en el presente documento una secuencia de aminoacidos que comprende mas de aproximadamente el 25%, preferiblemente mas de aproximadamente el 30%, incluso mas preferiblemente mas de aproximadamente el 35%, de manera particularmente preferible mas de aproximadamente el 40%, de manera mas particularmente preferible mas de aproximadamente el 45% o el 50%, de manera incluso mas particularmente preferible mas de aproximadamente el 52%, el 54%, el 56%, el 58% o el 59% de residuos de alanina, en la que se prefieren los valores superiores. Incluso mas preferiblemente, la secuencia de aminoacidos comprende mas de aproximadamente el 60%, el 61%, el 62%, el 63% o el 64% de residuos de alanina y lo mas preferiblemente mas de aproximadamente el 65% de residuos de alanina.
Por consiguiente, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) puede comprender una secuencia de aminoacidos que consiste en aproximadamente el 25% de residuos de prolina, y aproximadamente el 75% de residuos de alanina. Alternativamente, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) puede comprender una secuencia de aminoacidos que consiste en aproximadamente el 35% de residuos de prolina y aproximadamente el 65% de residuos de alanina. El termino “aproximadamente el X%” tal como se uso anteriormente en el presente documento no esta limitado al numero espedfico del porcentaje, sino que tambien comprende valores del 10% al 20% mas o del 10% al 20% menos residuos. Por ejemplo, el termino el 10% tambien puede referirse al 11% o al 12% y al 9% y al 8%, respectivamente.
Segun la invencion, un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo)/la secuencia de aminoacidos consiste exclusivamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, es decir, no hay ningun otro residuo de aminoacido presente en el polipeptido de enrollamiento al azar o en la secuencia de aminoacidos.
Mientras que lo anterior se refiere a la longitud y contenido en prolina/alanina globales de la secuencia de aminoacidos comprendida en el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo), lo siguiente se refiere en mas detalle a las secuencias de aminoacidos a modo de ejemplo espedficas (o fragmentos de las mismas).
En una realizacion, las secuencias de aminoacidos/polipeptidos que adoptan una conformacion de enrollamiento al azar (el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento del mismo tal como se define en el presente documento), por ejemplo, en disolucion acuosa o en condiciones fisiologicas, pueden comprender una pluralidad de “repeticiones de aminoacidos”/“casetes de aminoacidos”/“repeticiones de casete”, en las que dichas “repeticiones de aminoacidos”/“casetes de aminoacidos”/“repeticiones de casete”/“bloque estructuralTmodulos” (estos terminos se usan en el presente documento de manera intercambiable) consisten exclusivamente en residuos de aminoacido de prolina (Pro, P) y alanina (Ala, A) (representados en el presente documento como “PA” o como “AP”), en las que no mas de 6 residuos de aminoacido consecutivos son identicos. Un “bloque estructural” ilustrativo es, por ejemplo, “AP” y esto tambien se ha proporcionado en los ejemplos ilustrativos adjuntos como dominio de enrollamiento al azar biosintetico funcional de la presente invencion. Este ejemplo ilustrativo es la secuencia “P1A1” tal como tambien se proporciona en forma de APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51), es decir, una “repeticion de aminoaddosYaminoacido casete”/“repeticion de casete” de “poli-PA”. En una realizacion preferida, la secuencia de aminoacidos/polipeptido que comprende las “repeticiones de aminoacidos”/“casetes de aminoacidos”/“repeticiones de casete” definidas anteriormente y similares no comprende mas de 5 residuos de aminoacido consecutivos identicos. A continuacion en el presente documento se proporcionan otras realizaciones alternativas en el contexto de bloques estructurales individuales mostrados a modo de ejemplo.
Dentro de un polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) segun esta invencion, las repeticiones de aminoacidos pueden ser identicas o no identicas. A continuacion en el presente documento se proporcionan ejemplos no limitativos de “repeticiones de aminoacidos”, “bloques estructurales”, “modulos”, “repeticiones”, “casetes de aminoacidos”, etc., que consisten en residuos de prolina y alanina; veanse, por ejemplo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 51 (la lista de secuencias adjunta
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tambien comprende secuencias de acido nucleico ilustrativas que codifican para tales “repeticiones”/“modulos”, etc. Las secuencias adjuntas en dicha lista de secuencias tal como se presenta con el presente documento constituyen parte de esta memoria descriptiva y descripcion). En el presente documento tambien se preve el uso de fragmentos (identicos y/o no identicos) de estas secuencias, mediante lo cual un “fragmento” comprende al menos 2 aminoacidos y comprende al menos una prolina y/o alanina, preferiblemente al menos una prolina y una alanina. Los “fragmentos” de estas secuencias que van a emplearse segun esta invencion para la generacion del polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) pueden consistir en al menos 3, preferiblemente en al menos 4, mas preferiblemente en al menos 5, incluso mas preferiblemente en al menos 6, todavfa mas preferiblemente en al menos 8, de manera particularmente preferible en al menos 10, de manera mas particularmente preferible en al menos 12, de manera incluso mas particularmente preferible en al menos 14, de manera todavfa mas particularmente preferible en al menos l6, y lo mas preferiblemente en al menos 18 aminoacidos consecutivos de la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 51 (debe observarse en este caso que SEQ ID NO: 51 consiste en una repeticion de “AP” o “PA” ilustrativa).
Basandose en las ensenanzas facilitadas en el presente documento, el experto en la tecnica esta facilmente en una posicion para generar secuencias de aminoacidos/polipeptidos adicionales que forman una conformacion de enrollamiento al azar, por ejemplo en condiciones acuosas o fisiologicas y que estan constituidas principalmente por prolina y alanina tal como se define en el presente documento. Ejemplos adicionales de secuencias de aminoacidos/polipeptidos que forman una conformacion de enrollamiento al azar que van a usarse como bloques estructurales o modulos del polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) definido en el presente documento pueden comprender, entre otras cosas, combinaciones y/o fragmentos o versiones permutadas de manera circular de los “bloques estructurales”, “casetes de polfmeros” o “repeticiones de polfmeros” espedficos mostrados anteriormente. Por consiguiente, los modulos/unidades de secuencia/repeticiones de polfmeros/casetes de polfmeros mostrados a modo de ejemplo del polipeptido de enrollamiento al azar/secuencia de aminoacidos tambien pueden proporcionar fragmentos individuales que pueden combinarse de una manera nueva para formar modulos/unidades de secuencia/repeticiones de polfmeros/casetes de polfmeros adicionales segun esta invencion.
Los terminos “modulo(s)”, “unidad(es) de secuencia”, “repeticion/repeticiones de polfmeros”, “casete(s) de polfmeros” y “bloque(s) estructural(es)” se usan como sinonimos en el presente documento y se refieren a tramos de aminoacidos individuales que pueden usarse para formar el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)/secuencia de aminoacidos definido en el presente documento.
Una repeticion de aminoacidos (usada como “bloque estructural”, etc., de un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico de la presente invencion) puede consistir en al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas residuos de aminoacido, en la que cada repeticion comprende un(os) residuo(s) de prolina y alanina. Sin embargo, tal como se ilustra en la SEQ ID NO: 51 adjunta, dicho “bloque estructural” tambien puede consistir simplemente en los 2 residuos de aminoacido P y A proporcionados en el presente documento, concretamente en forma de “PA” o “AP”. En una realizacion, la repeticion de aminoacidos segun la presente invencion no comprende mas de 50 residuos de aminoacido. Sin embargo, resulta evidente para el experto en la tecnica que una “repeticion” de este tipo puede comprender incluso mas de 50 residuos de aminoacido, por ejemplo, en casos en los que dicho polipeptido/polfmero de enrollamiento al azar biosintetico de la invencion comprende mas de aproximadamente, por ejemplo, 100 aminoacidos, mas de aproximadamente 150 aminoacidos, mas de aproximadamente 200 aminoacidos, etc. Por consiguiente, la cantidad maxima de residuos de aminoacido comprendidos en una “repeticion” de este tipo esta condicionada por la longitud global del polipeptido biosintetico (o segmento del mismo)/polfmero tal como se proporciona en el presente documento.
Sin embargo, debe observarse que los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos/secuencias de aminoacidos que comprenden las repeticiones, etc., anteriores deben tener preferiblemente la longitud y/o contenido en prolina/alanina globales tal como se definio y explico anteriormente en el presente documento, es decir, consistir en aproximadamente 50, en aproximadamente 100, en aproximadamente 150, en aproximadamente 200, en aproximadamente 250, en aproximadamente 300, en aproximadamente 350, en de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoacidos y/o comprender mas de aproximadamente el 10% y menos de aproximadamente el 75% de residuos de prolina. Todas las definiciones facilitadas anteriormente en el presente documento en este contexto tambien se aplican aqrn, cambiando lo que sea necesario.
Tal como se comenta en detalle en el presente documento y tal como se proporciono anteriormente en el presente documento, la presente invencion proporciona una(s) protema(s) heterologa(s) biologicamente activa(s) o un(os) constructo(s) de protema que es/son particularmente utiles en un entorno farmaceutico, medico y/o medicinal. Estas protemas heterologas biologicamente activas/constructos de protema comprenden como al menos un dominio de dichos al menos dos dominios el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de prolina y alanina, en las que dicha secuencia de aminoacidos consiste en aproximadamente 50, en aproximadamente 100, en aproximadamente 150, en aproximadamente 200, en aproximadamente 250, en aproximadamente 300, en aproximadamente 350, en de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de prolina (Pro) y alanina (Ala).
En el contexto de las protemas heterologas biologicamente activas, polipeptidos o constructos de protema tal como
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
se da a conocer en el presente documento, el termino “heterologo” se refiere a al menos dos dominios dentro de dichas protemas, polipeptidos o constructos de protema en las que un primero de dichos al menos dos dominios confiere, tiene y/o media en una actividad biologica definida y en las que un segundo de dichos al menos dos dominios comprende el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina y mediante lo cual dichos al menos dos dominios no se encuentran operativamente unidos entre sf en la naturaleza o no se codifican mediante una unica secuencia de acido nucleico codificante (tal como un marco de lectura abierto) que existe en la naturaleza. El polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico/segmento de polipeptido que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina tal como se proporciona en el presente documento y tal como se emplea en las protemas heterologas biologicamente activas/constructos de protema de esta invencion preferiblemente no estan (qmmicamente) modificados de manera adicional, por ejemplo preferiblemente no estan glicosilados ni hidroxilados.
Debe observarse que determinadas protemas que se producen de manera natural o protemas hipoteticas tal como se deducen a partir de tramos de secuencias de acido nucleico encontradas en la naturaleza se describen como que comprenden un contenido relativamente alto (es decir, por encima de la media) de prolina y alanina. Por ejemplo, se ha descrito una protema hipotetica homologa para la cepa Friedlin de Leishmania major (Ivens (2005) Science 309, 436-442.). El marco de lectura dado a conocer que comprende 1514 tripletes de codones incluye un tramo de 412 tripletes compuesto por 240 codones de Ala, 132 de Pro, 34 de Lys y 4 de Val. Los residuos de Lys, que estan cargados positivamente en condiciones de tampon fisiologico, estan distribuidos de manera casi uniforme entre esta secuencia, lo que sugiere un efecto solubilizante. Sin embargo, tal como resulta evidente a partir de la divulgacion en el presente documento, una protema hipotetica homologa de este tipo tal como se deduce a partir de un marco de lectura abierto o molecula de acido nucleico que se produce de manera natural, que comprende un alto contenido en prolina y alanina por encima de la media no forma parte de esta invencion. La invencion se basa en el hecho de que se proporciona un polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido bastante grande que no se produce en la naturaleza de una manera aislada y que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en aproximadamente 50, en aproximadamente 100, en aproximadamente 150, en aproximadamente 200, en aproximadamente 250, en aproximadamente 300, en aproximadamente 350, en de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos en prolina (Pro) y alanina (Ala), que es particularmente util en el contexto medico/farmaceutico. Los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos o segmentos de polipeptido aislados descritos en el presente documento que no se producen en la naturaleza de una manera aislada tambien estan comprendidos en la(s) protema(s) heterologa(s) biologicamente activa(s) o el/los constructo(s) de protema dados a conocer en el presente documento que son particularmente utiles en un entorno farmaceutico, medico y/o medicinal. Estas protemas heterologas biologicamente activas/constructos de protema comprenden como al menos un dominio de dichos al menos dos dominios el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en aproximadamente 50, en aproximadamente 100, en aproximadamente 150, en aproximadamente 200, en aproximadamente 250, en aproximadamente 300, en aproximadamente 350, en de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos en prolina (Pro) y alanina (Ala).
Ademas, las protemas de arabinogalactano (AGP), protemas ricas en Pro y extensinas pertenecen a un gran grupo de glicoprotemas, conocidas como glicoprotemas ricas en hidroxiprolina (Hip) (HRGP), que se expresan a lo largo de todo el reino vegetal. Un motivo de AGP de este tipo que comprende una repeticion de Ala-Pro (AP)51 se expreso como peptido de glicomodulo sintetico con secuencia senal N-terminal y protema verde fluorescente C-terminal en Arabidopsis thaliana transgenica y se investigo como sustrato para prolil hidroxilasas y posterior O-glicosilacion de los residuos de hidroxiprolina (Estevez (2006) Plant Physiol. 142, 458-470). De nuevo, las cadenas laterales de Pro hidroxiladas y/o glicosiladas dadas a conocer, que pueden formar enlaces de hidrogeno con moleculas de agua, parecen tener un efecto solubilizante.
Debe observarse que las “protemas biologicamente activas o constructos de protema que comprenden como (al menos) un dominio un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de peptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de prolina y alanina” descritos en el presente documento se refieren a protemas o constructos de protema que no se producen normalmente en la naturaleza y, por tanto, son “heterologos”. Ademas, y a diferencia de secuencias ricas en prolina descritas en el reino vegetal, los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos/segmentos de polipeptido descritos en el presente documento preferiblemente no estan qmmicamente modificados, es decir, preferiblemente no estan glicosilados o hidroxilados.
El polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico/secuencias de aminoacidos de la presente invencion puede comprender concatemeros de bloques individuales que comprenden tramos de prolina/alanina combinadas de la secuencia (Pro)x-(Ala)y, mediante lo cual x puede tener un valor de numero entero de desde 1 hasta preferiblemente 15, mas preferiblemente de 1 a 10, incluso mas preferiblemente de 1 a 5, e y puede tener un valor de numero entero de desde 1 hasta preferiblemente 15, mas preferiblemente de 1 a 10, incluso mas preferiblemente de 1 a 5, y x e y pueden variar entre bloques posteriores. Dichos x e y tambien pueden ser un numero entero de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15.
Las secuencias de aminoacidos/polipeptidos que forman una conformacion de enrollamiento al azar en disolucion acuosa o en condiciones fisiologicas pueden tener la formula (I):
[PrOxAlay]n
en la que x se selecciona independientemente de un numero entero de 1 a 5. Ademas, para cada n, y se selecciona independientemente de un numero entero de 1 a 5. Finalmente, n es cualquier numero entero siempre que el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)/secuencia de aminoacidos consista preferiblemente en 5 al menos aproximadamente 50, en al menos aproximadamente 100, en al menos aproximadamente 150, en al menos aproximadamente 200, en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350, en al menos aproximadamente 400 residuos de aminoacido y hasta aproximadamente 3000 residuos de aminoacido. Tambien en este contexto debe observarse que los polipeptidos/secuencias de aminoacidos que comprenden los concatemeros anteriores o que tienen la formula (I) anterior deben tener 10 preferiblemente la longitud y/o contenido en prolina/alanina globales tal como se definio y explico anteriormente en el presente documento, es decir, consistir en aproximadamente 50, en aproximadamente 100, en aproximadamente 150, en aproximadamente 200, en aproximadamente 250, en aproximadamente 300, en aproximadamente 350, en de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoacidos y/o comprender mas de aproximadamente el 10% y menos de aproximadamente el 75% de residuos de prolina. De nuevo, todas las definiciones facilitadas 15 anteriormente en el presente documento en este contexto tambien se aplican aqrn, cambiando lo que sea necesario.
La presente invencion tambien se refiere a polipeptidos de enrollamiento al azar (un(os) segmento(s) de polipeptido)/secuencias de aminoacidos que comprenden un tramo de aminoacidos seleccionado del grupo que consiste en AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3 que es un ejemplo para [Pro-iAlaak);
20 AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5);
AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6) y APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51 que es un ejemplo para [Pro1Ala1]10) o versiones permutadas circulares o un(os) multimero(s) de estas secuencias en su conjunto o partes de estas secuencias. Por consiguiente, el polipeptido de enrollamiento al azar (un(os) segmento(s) de polipeptido del mismo)/secuencia de aminoacidos puede comprender el tramo de aminoacidos 25 AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1), AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1);
AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3);
AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5);
AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6) y APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51), asf como combinaciones de estos motivos o combinaciones de fragmentos y partes de estos motivos siempre que el 30 polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico resultante consista unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala).
Segun la presente invencion tambien pueden usarse versiones permutadas circulares de las secuencias de aminoacidos anteriores. Pueden generarse facilmente versiones permutadas circulares a modo de ejemplo de, por 35 ejemplo, AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1), por ejemplo retirando la primera alanina y anadiendo otra alanina al final de la secuencia anterior. Una version permutada circular de este tipo de SEQ ID NO: 1 sera entonces APAAPAPAAPAAPAPAAPAA (SEQ ID NO: 7). Ademas, ejemplos no limitativos de versiones permutadas circulares de SEQ ID NO: 1 son:
PAAPAPAAPAAPAPAAPAAA (SEQ ID NO: 8),
40 AAPAPAAPAAPAPAAPAAAP (SEQ ID NO: 9),
APAPAAPAAPAPAAPAAAPA (SEQ ID NO: 10),
PAPAAPAAPAPAAPAAAPAA (SEQ ID NO: 11),
APAAPAAPAPAAPAAAPAAP (SEQ ID NO: 12),
PAAPAAPAPAAPAAAPAAPA (SEQ ID NO: 13),
45 AAPAAPAPAAPAAAPAAPAP (SEQ ID NO: 14),
APAAPAPAAPAAAPAAPAPA (SEQ ID NO: 15),
PAAPAPAAPAAAPAAPAPAA (SEQ ID NO: 16),
y similares. Basandose en las ensenanzas de la presente invencion, un experto esta facilmente en posicion de generar versiones permutadas circulares correspondientes de los tramos de aminoacidos tal como se muestra en 50 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 51 (basandose dicha SEQ ID NO: 51 totalmente en repeticiones de “AP” y una version permutada circular puede basarse totalmente en repeticiones/bloques estructurales de “PA” o “AP”).
Tales versiones permutadas circulares tambien pueden considerarse ejemplos de un “modulo”/“bloque estructural”, etc., adicional de los polipeptidos/secuencias de aminoacidos proporcionados en el presente documento que pueden
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
usarse por consiguiente en el presente documento.
Resulta evidente para el experto en la tecnica que “modulos” y fragmentos (mas cortos) o versiones permutadas circulares de los tramos de aminoacidos proporcionados en el presente documento tambien pueden usarse como “modulos”, “repeticiones” y/o bloques estructurales para el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)/secuencia de aminoacidos definido en el presente documento.
Segun lo anterior, el polipeptido de enrollamiento al azar/secuencia de aminoacidos que forma una conformacion de enrollamiento al azar puede comprender un multimero de cualquiera de los tramos de aminoacidos anteriores (o versiones permutadas circulares o fragmentos de los mismos), preferiblemente los mostrados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 51. Debe observarse que estas secuencias no son de ningun modo limitativas en el contexto de esta invencion.
De nuevo, los polipeptidos/secuencias de aminoacidos que comprenden los tramos de aminoacidos anteriores (o fragmentos de los mismos), versiones mutadas circulares (o fragmentos de las mismas) deben tener preferiblemente la longitud y/o contenido en prolina/alanina globales tal como se definio y explico anteriormente en el presente documento, es decir consistir en aproximadamente 50, en aproximadamente 100, en aproximadamente 150, en aproximadamente 200, en aproximadamente 250, en aproximadamente 300, en aproximadamente 350, en de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoacidos y/o comprender mas de aproximadamente el 10% y menos de aproximadamente el 75% de residuos de prolina. Todas las definiciones facilitadas anteriormente en el presente documento en este contexto tambien se aplican aqm, cambiando lo que sea necesario. El termino “fragmento” tambien se definio anteriormente.
Tal como se menciono anteriormente, en el contexto de esta invencion se encontro sorprendentemente que los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos (o segmento de polipeptido)/poftmeros tal como se proporciona en el presente documento se caracterizan por un volumen hidrodinamico relativamente grande. Este volumen hidrodinamico, tambien denominado tamano aparente, puede determinarse facilmente mediante filtracion en gel analftica (tambien conocida como cromatograffa de exclusion molecular, SEC). Preferiblemente, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) tiene un tamano aparente de al menos 10 kDa, preferiblemente de al menos 25 kDa, mas preferiblemente de al menos 50 kDa, incluso mas preferiblemente de al menos 100 kDa, de manera particularmente preferible de al menos 200 kDa y lo mas preferiblemente de al menos 400 kDa. El experto en la tecnica puede determinar facilmente el volumen hidrodinamico de protemas espedficas. Tales metodos pueden incluir dispersion de la luz dinamica/estatica, ultracentrifugacion analftica o filtracion en gel analftica tal como se muestra a modo de ejemplo a continuacion en el presente documento. La filtracion en gel analftica representa un metodo conocido en la tecnica para medir el volumen hidrodinamico de macromoleculas. Alternativamente, el volumen hidrodinamico de un polipeptido globular puede estimarse mediante su peso molecular (Creighton (1993), citado anteriormente). Tal como se describe en el presente documento, el volumen hidrodinamico de los polipeptidos de la invencion que consisten preferiblemente en al menos aproximadamente 50, en al menos aproximadamente 100, en al menos aproximadamente 150, en al menos aproximadamente 200, en al menos aproximadamente 250, en al menos aproximadamente 300, en al menos aproximadamente 350, en de al menos aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de aminoacido de prolina y alanina y que tienen una conformacion de enrollamiento al azar muestra valores inesperadamente altos con respecto al volumen hidrodinamico que se estimana para una protema globular plegada correspondiente basandose en el peso molecular. Lo siguiente se refiere a protemas heterologas biologicamente activas o constructos de protema que comprenden, entre otras cosas, el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo) tal como se describio y se definio anteriormente en el presente documento que representan una realizacion preferida de la presente invencion. Sin limitarse a la teona, se encontro sorprendentemente en el contexto de la presente invencion que los tramos de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico tal como se proporciona en el presente documento y que consisten unicamente en prolina y alanina pueden incluso proporcionar un volumen hidrodinamico superior a un tramo de enrollamiento al azar biosintetico correspondiente que tiene el mismo numero total de residuos de aminoacido pero que consiste unicamente en prolina, alanina y serina (tal como se proporciona en el documento WO 2008/155134).
Las protemas de plasma humanas tales como albumina serica (HSA) e inmunoglobulinas (Ig), incluyendo anticuerpos humanizados, muestran semividas largas, normalmente de 2 a 3 semanas, lo cual puede atribuirse a su interaccion espedfica con el receptor de Fc neonatal (FcRn), conduciendo a recirculacion endosomica (Ghetie (2002) Immunol Res, 25:97-113). En cambio, la mayona de las demas protemas de interes farmaceutico, en particular fragmentos de anticuerpo recombinantes, hormonas, interferones, etc., experimentan un aclaramiento (de la sangre) rapido. Esto es particularmente cierto para protemas cuyo tamano es inferior al valor de umbral para la filtracion renal de aproximadamente 70 kDa (Caliceti (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277). En estos casos la semivida en plasma de una protema farmaceutica sin modificar puede ser considerablemente menos de una hora, haciendo por tanto que sea esencialmente inutil para la mayona de las aplicaciones terapeuticas. Con el fin de lograr una accion farmacologica sostenida y tambien mejorar el cumplimiento del paciente (al requerir intervalos de dosificacion que se prolongan a dfas o incluso semanas), anteriormente se establecieron varias estrategias con fines de desarrollo de biofarmacos.
En primer lugar, se ha empleado el mecanismo de recirculacion de protemas de plasma naturales produciendo protemas de fusion con la parte Fc de Ig, por ejemplo Enbrel®, un hubrido entre el dominio extracelular de receptor de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
TNFa e IgG1 humana (Goldenberg (1999) Clin Ther 21:75-87) o con albumina serica, por ejemplo Albuferon® (albinterferon alfa-2b, ZALBIN™, JOuLfERON®), una fusion correspondiente de IFNalfa con HSA (Osborn (2002) J Pharmacol Exp Ther 303:540-548). Tambien se ha usado albumina, con su alta concentracion en plasma de 600 |iM, de una manera indirecta, sirviendo como vehmulo portador para productos biofarmaceuticos que estan equipados con una funcion de union a albumina, por ejemplo mediante fusion con un dominio de union a albumina (ABD) bacteriano de protema G de estreptococos (Makrides (1996) J Pharmacol Exp Ther 277:534-542) o con un peptido seleccionado contra HSA a partir de una biblioteca de presentacion en fagos (Dennis (2002) J Biol Chem, 277:35035-35043; Nguyen (2006) Protein Eng Des Sel 19:291-297).
En segundo lugar, una metodologfa fundamentalmente diferente para prolongar la semivida en plasma de productos biofarmaceuticos es la conjugacion con polfmeros qmmicos altamente solvatados y fisiologicamente inertes, agrandando por tanto eficazmente el radio hidrodinamico de la protema terapeutica mas alla del tamano de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (Caliceti (2003), citado anteriormente). El acoplamiento covalente en condiciones bioqmmicamente leves con derivados activados de polietilenglicol (PEG), o bien al azar a traves de cadenas laterales de Lys (Clark (1996) J Biol Chem 271:21969-21977) o bien por medio de residuos de Cys espedficamente introducidos (Rosendahl (2005) BioProcess International:52-60) ha sido moderadamente satisfactorio y esta aplicandose actualmente en varios farmacos aprobados. Se han logrado ventajas correspondientes especialmente en relacion con protemas pequenas que presentan actividad farmacologica espedfica, por ejemplo Pegasys®, un IFNa-2a recombinante qmmicamente pegilado (Harris (2003) Nat Rev Drug Discov, 2:214-221; Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870).
Sin embargo, el acoplamiento qrnmico de una protema biologicamente activa con polfmeros sinteticos tiene desventajas con respecto al desarrollo y la produccion biofarmaceuticos. Los derivados de PEG adecuados son caros, especialmente ya que se necesita una alta pureza, y su conjugacion con una protema recombinante requiere etapas de procesamiento y purificacion in vitro adicionales, lo cual reduce el rendimiento y aumenta los costes de fabricacion. De hecho, el PEG con frecuencia esta contaminado con aldelddos y peroxidos (Ray (1985) Anal Biochem 146:307-312) y es intrmsecamente propenso a degradacion qmmica con el almacenamiento en presencia de oxfgeno. Ademas, la funcion farmaceutica de una protema terapeutica puede verse dificultada si cadenas laterales de aminoacido en la proximidad de su sitio activo bioqmmico se modifican mediante el procedimiento de pegilacion. Ademas, el acoplamiento qrnmico con polfmeros sinteticos da habitualmente como resultado una mezcla heterogenea de moleculas que pueden mostrar una varianza sustancial de actividad in vivo.
En tercer lugar, se ha propuesto el uso de analogos de glicosilacion de protemas biologicamente activas en los que se introducen nuevas secuencias consenso de glicosilacion unidas en N para prolongar la semivida en plasma; vease el documento WO 02/02597; Perlman (2003) J Clin Endocrinol Metab 88:2327-2335; o Elliott (2003) Nat Biotechnol 21:414-420. Sin embargo, las protemas modificadas por glicoingeniena descritas presentaron una actividad in vivo alterada, lo cual indica que las nuevas cadenas laterales de hidratos de carbono influyen en la actividad biologica de la protema modificada por ingeniena. Ademas, es probable que las cadenas laterales de hidratos de carbono adicionales aumenten la antigenicidad de las moleculas activas biologicas resultantes, lo cual plantea preocupaciones de seguridad sustanciales. Ademas, se ha notificado que protemas de fusion que comprenden la secuencia repetitiva artificial PSTAD derivada de Trypanosoma cruzi inducen una semivida en plasma prolongada de trans-sialidasa (Alvarez (2004) JBC 279:3375-3381). Sin embargo, se ha notificado que tales repeticiones derivadas de Trypanosoma cruzi inducen una respuesta inmunitaria humoral (Alvarez (2004), citado anteriormente). Por consiguiente, se desean estrategias alternativas para prolongar la accion de protemas biologicamente activas.
Se encontro sorprendentemente que las secuencias de aminoacidos/polipeptidos biosinteticos tal como se da a conocer en el presente documento y que consisten unicamente en prolina y alanina segun la invencion adoptan una conformacion de enrollamiento al azar en particular en condiciones fisiologicas. Por tanto, son moleculas ventajosas para proporcionar el “segundo dominio” definido a continuacion en el presente documento de la(s) protema(s) biologicamente activa(s)/polipeptido(s), es decir que comprende un tramo de polipeptido que forma en condiciones fisiologicas una conformacion de enrollamiento al azar y de ese modo media en una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada a protema(s) o polipeptido(s) biologicamente activo(s) (“funcional/funcionales”), en particular, una semivida en plasma aumentada. El volumen hidrodinamico de una protema funcional que esta fusionada a dicho dominio de enrollamiento al azar se aumenta drasticamente tal como puede estimarse usando metodos convencionales mencionados en el presente documento. Dado que se piensa que el dominio de enrollamiento al azar no interfiere con la actividad biologica del primer dominio de la protema biologicamente activa, se conserva esencialmente la actividad biologica mediada por la protema de interes funcional a la que se fusiona. Ademas, se piensa que los polfmeros de aminoacidos/polipeptidos que forman un dominio de enrollamiento al azar tal como se da a conocer en el presente documento son en gran medida biologicamente inertes, especialmente con respecto a la proteolisis en plasma sangumeo, inmunogenicidad, punto isoelectrico/comportamiento electrostatico, union a receptores de superficie celular asf como internalizacion, pero todavfa son biodegradables, lo cual proporciona claras ventajas con respecto a polfmeros sinteticos tales como PEG.
Segun lo anterior, la presente invencion se refiere a una protema biologicamente activa que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico descrito en el presente documento. Una protema biologicamente activa/constructo de protema de este tipo que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico descrito
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
en el presente documento es una protema heterologa biologica activa/constructo de protema. En particular, en el presente documento tambien se da(n) a conocer una(s) protema(s) heterologa(s) biologicamente activa(s) que comprende(n) o que consiste(n) en al menos dos dominios en la que
(a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica; y
(b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende o consiste en el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido descrito y definido en el presente documento.
Debe observarse que segun la presente invencion que “primer dominio” y dicho “segundo dominio” se refieren a tramos de protema que no se producen de manera natural dentro de la misma protema o que no se espera que formen parte de la misma protema hipotetica segun se codifica por una secuencia de acido nucleico codificante (tal como un marco de lectura abierto) tal como se encuentra en la naturaleza.
Las definiciones y explicaciones facilitadas anteriormente en el presente documento en el contexto del polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido del mismo se aplican, cambiando lo que sea necesario, en el contexto de protemas biologicamente activas que comprenden dicho polipeptido de enrollamiento al azar (o un(os) segmento(s) de polipeptido del mismo).
Preferiblemente, dicha conformacion de enrollamiento al azar media en una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada de dicha protema biologicamente activa, tal como la estabilidad in vivo y/o in vitro en muestras biologicas o en entornos fisiologicos.
Por ejemplo, en el presente documento se preve que protemas que comprenden un “segundo dominio” adicional definido en el presente documento que adopta una conformacion de enrollamiento al azar en disolucion acuosa o en condiciones fisiologicas (por ejemplo polfmeros que consisten en aproximadamente 200 o aproximadamente 400 o aproximadamente 600 residuos de aminoacido y que comprenden PA#1/SEQ ID NO: 1, PA#2/SEQ ID NO: 2, PA#3/SEQ ID NO: 3, PA#4/SEQ ID NO: 4, PA#5/SEQ ID NO: 5, PA#6/SEQ ID NO: 6 y/o P1A1/SEQ ID NO: 51 como “bloques estructurales”) tienen una semivida en plasma o estabilidad en suero ventajosa, incluso in vivo (en particular si se administran por via intravenosa) en comparacion con un control que carece de dicha conformacion de enrollamiento al azar.
En el documento WO 2008/155134 (tal como se comento anteriormente en el presente documento) se ha mostrado que protemas biologicamente activas que comprenden un dominio con una secuencia de aminoacidos que adopta una conformacion de enrollamiento al azar tienen una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada. Los dominios de enrollamiento al azar dados a conocer en el documento WO 2008/155134 consisten, en particular, en residuos de prolina, alanina y serina (PAS). La presencia de estos tres residuos se describe en este documento de la tecnica anterior como requisito esencial para la formacion de un enrollamiento al azar estable y soluble en disolucion acuosa.
Tal como se comento en la introduccion anteriormente en el presente documento, el documento WO 2007/103515 describe polfmeros recombinantes no estructurados que comprenden como constituyentes principales una gran variedad de aminoacidos, entre otras cosas, glicina, aspartato, alanina, serina, treonina, glutamato y prolina. Sin embargo, el termino “polfmero recombinante no estructurado” no tiene ningun significado claro reconocido, a diferencia de los terminos “biosintetico” y “enrollamiento al azar”.
Anteriormente en el presente documento tambien se menciono el documento WO 2006/081249. Este documento describe conjugados de protema que comprenden una protema biologicamente activa acoplada a un polipeptido que comprende de 2 a 500 unidades de una repeticion de aminoacidos que tiene Gly, Asn y Gln como constituyente principal y Ser, Thr, Asp, Gln, Glu, His y Asn como constituyente minoritario. Se describe que dichos conjugados de protema tienen una semivida en plasma o bien aumentada o bien reducida en comparacion con la protema biologicamente activa sin conjugar. Sin embargo, el documento WO 2006/081249 no proporciona ninguna ensenanza para predecir si una repeticion de aminoacidos espedfica reduce o aumenta la semivida en plasma del conjugado. Ademas, el documento WO 2006/081249 no ensena ni sugiere que la semivida en plasma de protemas pueda aumentarse cuando la protema conjugada comprende una repeticion de aminoacidos que forma una conformacion de enrollamiento al azar tal como se muestra en la presente invencion. Ademas, las repeticiones de aminoacidos dadas a conocer en el documento WO 2006/081249 comprenden al menos dos residuos seleccionados de Gly, Asn y Gln, lo cual contrasta claramente con los polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos de la presente invencion que comprenden una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina.
Sorprendentemente, en el presente documento se ha encontrado que secuencias de aminoacidos de enrollamiento al azar biosinteticas tal como se proporciona en el presente documento que, a diferencia de la tecnica anterior, comprenden unicamente residuos de prolina y alanina (es decir que preferiblemente no comprenden una cantidad sustancial de ningun otro aminoacido, tampoco una cantidad sustancial de serina o nada de serina en absoluto) tambien forman una estructura de enrollamiento al azar util. Esto es particularmente inesperado dada la divulgacion en el documento WO 2008/155134 de protemas de fusion con un dominio compuesto unicamente por residuos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
serina y alanina (SA), es decir en las que se omitieron residuos de prolina, demostrando que un dominio de este tipo que comprende unicamente dos tipos de aminoacidos no formaba un enrollamiento al azar, sino una estructura de lamina p. Estos dominios de serina-alanina tampoco mostraron un volumen hidrodinamico aumentado de este tipo tal como se observa con “PAS” o, en particular, con las secuencias de “P/A” tal como se proporciona en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “actividad biologica” describe el efecto biologico de una sustancia sobre materia viva. Por consiguiente, el termino “protema biologicamente activa” tal como se usa en el presente documento se refiere a protemas que pueden inducir un efecto biologico sobre celulas vivas/organismos que se exponen a dicha protema o polipeptido. Sin embargo, debe observarse que, en el contexto de la presente invencion, el termino “protema biologicamente activa” se refiere a la protema completa de la invencion que comprende tanto una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica (dicho primer dominio) como la secuencia de aminoacidos de la invencion que adopta/forma una conformacion de enrollamiento al azar y que consiste unicamente en prolina y alanina (dicho segundo dominio).
Por consiguiente, los terminos “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica” o “secuencia de aminoacidos con actividad biologica” tal como se usan en el presente documento para el “primer dominio” anteriormente definido de la protema biologicamente activa de la invencion, que media en o tiene o puede mediar en o tener la “actividad biologica” anteriormente definida. En los terminos “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica” o “secuencia de aminoacidos con actividad biologica” tambien estan comprendidas cualquier protema de interes (y fragmentos funcionales de las mismas, tales como fragmentos de anticuerpo, fragmentos que comprenden dominio(s) extracelular(es) o intracelular(es) de un receptor de membrana, formas truncadas de un factor de crecimiento o citocina y similares), cuya la semivida, o bien in vivo o bien in vitro, necesita prolongarse. En una realizacion de esta invencion, la secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica segun la presente invencion puede deducirse de cualquier “protema de interes”, es decir cualquier protema de interes farmaceutico o biologico o cualquier protema que es util como agente terapeutico/de diagnostico.
Por consiguiente, las protemas biologicamente activas pueden comprender un primer dominio que comprende una secuencia de aminoacidos biologicamente activa que se deriva de polipeptidos producidos de manera natural o polipeptidos producidos mediante tecnologfa de ADN recombinante. En una realizacion preferida, la protema de interes puede seleccionarse del grupo que consiste en protemas de union/moleculas de union, inmunoglobulinas, fragmentos de anticuerpo, protemas de transporte, receptores de membrana, protemas/peptidos de senalizacion tales como citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas y similares.
Tal como se explico anteriormente en el presente documento, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) comprendido en el segundo dominio de la protema biologicamente activa forma la conformacion de enrollamiento al azar en particular en condiciones fisiologicas. Esto es particularmente relevante en el contexto de protemas biologicamente activas que pueden formar parte de una composicion farmaceutica que va a administrarse a un sujeto o paciente.
Debe observarse que el dominio de enrollamiento al azar biosintetico de la invencion (dicho “segundo dominio”) de la protema biologicamente activa adopta/forma/tiene de manera nativa (es decir, en condiciones fisiologicas) una conformacion de enrollamiento al azar, en particular in vivo y cuando se administra a marnfferos o pacientes humanos que necesitan intervencion medica. En cambio, en la tecnica se conoce que protemas que tienen una estructura secundaria y/o terciaria no al azar como conformacion nativa tienden a adoptar una conformacion de enrollamiento al azar en condiciones no fisiologicas (es decir, en condiciones de desnaturalizacion). Sin embargo, tales protemas desnaturalizadas tienen caractensticas completamente diferentes en comparacion con la protema biologicamente activa que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar de la presente invencion. Por tanto, la esencia de esta invencion es que la “protema biologicamente activa” y la parte biologicamente activa de las protemas de fusion/constructos de fusion tal como se proporciona en el presente documento tambien conservan su funcion biologica cuando se combinan y/o unen con el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento de polipeptido) de esta invencion.
Ademas, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) conserva solubilidad en condiciones fisiologicas. Por consiguiente, tambien se preve que el constructo de protema de la presente invencion (que comprende el “primer dominio” y “segundo dominio” definidos anteriormente) puede comprender el “segundo” dominio que forma/adopta un enrollamiento al azar de manera transitoria o temporal no en conformacion de enrollamiento al azar, por ejemplo, cuando esta en forma de una composicion espedfica, tal como un liofilizado o una composicion secada. Sin embargo, es importante que un “segundo dominio” de este tipo del constructo de protema de la invencion adopte de nuevo, por ejemplo, tras la reconstitucion en tampones correspondientes (preferiblemente tampones/excipientes “fisiologicos” y/o disolventes), la conformacion de enrollamiento al azar definida en el presente documento. Dicho “segundo dominio” puede mediar (si es necesario, tras una reconstitucion correspondiente) en una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada de la protema biologicamente activa de la invencion. En el presente documento se prefiere que el “segundo dominio” tal como se define en el presente documento consista en el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) de la presente invencion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tal como se usa en el presente documento, el termino “dominio” se refiere a cualquier region/parte de una secuencia de aminoacidos que puede adoptar de manera autonoma una estructura y/o funcion espedfica. Por consiguiente, en el contexto de la presente invencion, un “dominio” puede representar un dominio funcional o un dominio estructural. Tal como se describe en el presente documento, las protemas de la presente invencion comprenden al menos un dominio/parte que tiene y/o media en una actividad biologica y al menos un dominio/parte que forma una conformacion de enrollamiento al azar. Sin embargo, las protemas de la invencion tambien pueden consistir en mas de dos dominios y pueden comprender, por ejemplo, una estructura de grupo de union o espaciador adicional entre los dos dominios/partes definidos en el presente documento u otro dominio/parte tal como, por ejemplo, un sitio de escision sensible a proteasa, una cola de afinidad tal como la cola de His6 o la cola de estreptavidina, un peptido senal, peptido de retencion, un peptido de direccionamiento tal como peptido de translocacion de membrana o dominios efectores adicionales tales como fragmentos de anticuerpo para direccionamiento tumoral asociados con una toxina antitumoral o una enzima para activacion de profarmacos, etc.
En otra realizacion, la protema biologicamente activa de la invencion tiene un volumen hidrodinamico tal como se determina mediante filtracion en gel analttica (tambien conocida como cromatograffa de exclusion molecular, SEC) de al menos 50 kDa, preferiblemente de al menos 70 kDa, mas preferiblemente de al menos 80 kDa, incluso mas preferiblemente de al menos 100 kDa, de manera particularmente preferible de al menos 125 kDa y lo mas preferiblemente de al menos 150 kDa. El experto en la tecnica puede determinar facilmente el volumen hidrodinamico de protemas espedficas. Anteriormente en el presente documento se han descrito metodos a modo de ejemplo en el contexto del polipeptido de enrollamiento al azar. Un experto esta facilmente en posicion de adaptar tales metodos tambien en el contexto de la protema biologicamente activa de la presente invencion. Tal como se describe a continuacion en el presente documento, el volumen hidrodinamico de las protemas biologicamente activas de la invencion que comprenden el segundo dominio anteriormente definido, es decir el dominio que comprende o consiste en el polipeptido de enrollamiento al azar proporcionado en el presente documento (o segmento del mismo), se muestra que tienen un volumen hidrodinamico inesperadamente grande con respecto al volumen hidrodinamico estimado para una protema globular plegada correspondiente basandose en su peso molecular o numero/composicion de residuos de aminoacido.
Debe observarse que el primer dominio que comprende una “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica” tambien puede adoptar su actividad biologica en el contexto de o tras la asociacion con otro polipeptido o secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, el fragmento Fab de un anticuerpo tal como el del anticuerpo antitumoral Herceptin (Eigenbrot (1993) J. Mol. Biol. 229:969-995) consiste en dos cadenas de polipeptido diferentes, la cadena ligera de inmunoglobulina y un fragmento de la cadena pesada de inmunoglobulina, que pueden unirse ademas a traves de un(os) enlace(s) disulfuro entre cadenas. Segun la presente invencion, puede ser suficiente con unir una de esas cadenas (por ejemplo, mediante fusion genica) al polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) mientras que la protema biologicamente activa completa se reconstituye por medio de asociacion con la otra cadena. Tal reconstitucion puede lograrse, por ejemplo, mediante coexpresion de los diferentes polipeptidos (por un lado una protema de fusion de una cadena y el polipeptido de enrollamiento al azar, por el otro lado la otra cadena) en la misma celula huesped, tal como se describe en los ejemplos adjuntos, o mediante reconstitucion in vitro, por ejemplo, como parte de un protocolo de replegamiento.
Por consiguiente, tales protemas (que comprenden dos cadenas de polipeptido independientes) tambien se consideran protemas biologicamente activas segun la presente invencion. En tal caso, el primer dominio tal como se define en el presente documento puede comprender dos cadenas de polipeptido independientes que solo estan unidas de manera no covalente. Ademas, las cadenas independientes de la protema biologicamente activa/dominio pueden unirse cada una al polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido). Ademas de fragmentos de anticuerpo, hay muchas otras protemas de interes homo o heterooligomericas (por ejemplo, insulina, hemoglobina y similares) que estan compuestas por varias cadenas de polipeptido asociadas y que son objeto de esta invencion.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “protema de union” se refiere a una molecula que puede interaccionar espedficamente con una(s) posible(s) pareja(s) de union de modo que puede distinguir entre dicha(s) posible(s) pareja(s) de union y una pluralidad de diferentes moleculas como dicha(s) posible(s) pareja(s) de union hasta tal punto que, a partir de una combinacion de dicha pluralidad de diferentes moleculas como posible(s) pareja(s) de union, solo se une(n), o se une(n) significativamente, dicha(s) posible(s) pareja(s) de union. En la tecnica se conocen metodos para la medicion de la union entre una protema de union y una posible pareja de union y pueden realizarse de manera rutinaria, por ejemplo, usando ELISA, calorimetna de titulacion isotermica, dialisis en equilibrio, ensayos de precipitacion, resonancia de plasmon superficial o un aparato de Biacore. Las protemas de union/moleculas de union a modo de ejemplo que son utiles en el contexto de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), regiones variables aisladas de anticuerpos (regiones VL y/o VH), CDR, anticuerpos de dominio individual/inmunoglobulinas, compuestos peptidomimeticos derivados de CDR, lectinas, dominios de inmunoglobulina, dominios de fibronectina, dominios de protema A, dominios SH3, dominios de repeticion de anquirina, lipocalinas o diversos tipos de protemas de union derivadas de armazon tal como se describe, por ejemplo, en Skerra (2000) J Mol Recognit 13:167-187, Gebauer (2009) Curr Opin Chem Biol 13:245255, Binz (2005) Nat Biotechnol 23:1257-1268 o Nelson (2009) Nat Biotechnol 27:331-337.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Otras protemas biologicamente activas de interes a modo de ejemplo (en particular protemas comprendidas en el primer dominio o que constituyen/son el primer dominio de la protema biologicamente activa) que son utiles en el contexto de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos, hormona del crecimiento humana, alfa-interferon, beta-interferon, gamma-interferon, lambda-interferon, factor de necrosis tumoral, eritropoyetina, factores de coagulacion tales como factor de coagulacion VIII, factor de coagulacion Vila, factor de coagulacion IX, gp120/gp160, receptor de factor de necrosis tumoral I y II soluble, compuestos trombolfticos tales como reteplasa, peptidos con efectos metabolicos tales como GLP-1 o exendina-4, protemas inmunosupresoras/inmunorreguladoras tales como antagonistas de receptor de interleucina-1 o anakinra, interleucina-2 y lipocalina asociada con gelatinasa de neutrofilos u otras lipocalinas naturales o modificadas por ingeniena o aquellas protemas o compuestos indicados, por ejemplo, en Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870 o Walsh (2004) Eur J Pharm Biopharm 58:185-196 o indicados en bases de datos en lmea tales como
http://www.biopharma.com/approvals.html o
http://www.drugbank.ca. Protemas biologicamente activas adicionales (en particular protemas comprendidas en el primer dominio o que constituyen/son el primer dominio de la protema biologicamente activa) que pueden emplearse en el contexto de la presente invencion son, entre otras cosas, hormona estimulante del folroulo, glucocerebrosidasa, timosina alfa 1, glucagon, somatostatina, adenosina desaminasa, interleucina 11, Hematide, leptina, interleucina-20, subunidad alfa de receptor de interleucina-22 (IL- 22ra), interleucina-22, hialuronidasa, factor de crecimiento de fibroblastos 18, factor de crecimiento de fibroblastos 21, peptido similar a glucagon 1, osteoprotegerina, protema de union a IL-18, factor de liberacion de la hormona del crecimiento, receptor de TACI soluble, trombospondina-1, receptor de VEGF soluble Flt-1, a-galactosidasa A, antagonista de miostatina, polipeptido inhibidor gastrico, antitripsina alfa-1, mutema de IL-4, y similares. Tal como resultara evidente a partir de la divulgacion en el presente documento, la presente invencion tambien se refiere a comprender el polipeptido de prolina/alanina de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de prolina/alanina y moleculas farmaceutica o medicamente utiles, tales como moleculas pequenas, peptidos o biomacromoleculas tales como protemas, acidos nucleicos, hidratos de carbono, vesroulas lipfdicas y similares, en particular protemas farmaceutica o medicamente utiles, tales como (pero sin limitarse a) protemas de union/moleculas de union, inmunoglobulinas, fragmentos de anticuerpo, protemas de transporte, receptores de membrana, protemas/peptidos de senalizacion, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas y similares, pueden comprenderse en los constructos de farmaco definidos en el presente documento pero tambien pueden formar parte de la protema heterologa biologicamente activa definida en el presente documento que comprende o consiste en dichos al menos dos dominios definidos. En tal caso, dichas protemas farmaceutica o medicamente utiles particulares (o fragmentos funcionales de las mismas) pueden ser el “primer dominio” de dichos al menos dos dominios que comprenden o consisten en una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica. Los fragmentos funcionales, en este contexto, son fragmentos de dichas protemas farmaceutica o medicamente utiles que todavfa pueden producir la respuesta biologica o farmaceutica deseada in vivo y/o in vitro y/o todavfa tienen o median en la actividad biologica deseada.
El grupo de union/espaciador de polipeptido anteriormente mencionado, insertado entre dichos dominios primero y segundo, comprende preferiblemente varios aminoacidos hidrofilos, unidos a peptido, que estan unidos de manera covalente a ambos dominios. En aun otra realizacion dicho grupo de union/espaciador de polipeptido comprende un sitio de escision por proteasa plasmatica que permite la liberacion controlada de dicho primer dominio que comprende un polipeptido que tiene y/o media en una actividad biologica. Pueden identificarse grupos de union de diferentes tipos o longitudes sin carga excesiva para obtener una actividad biologica optima de protemas espedficas.
En una realizacion preferida, las protemas biologicamente activas de la presente invencion son protemas de fusion. Una protema de fusion tal como se describe en el presente documento puede comprender al menos un dominio que puede mediar en una actividad biologica y al menos otro dominio que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento de polipeptido) tal como se describe en el presente documento en un unico polipeptido de multiples dominios. De nuevo, debe observarse que la presente invencion no esta limitada a protemas de fusion en las que un dominio media en una actividad biologica. Ademas, en el presente documento se proporcionan otras “protemas de fusion”/“constructos de fusion” en los que una parte/dominio es o comprende el polipeptido de enrollamiento al azar/polfmero de prolina/alanina de la invencion y la otra parte/dominio comprende otro tramo de protema/estructura.
En particular, en el caso de protemas de fusion el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) segun esta invencion no porta necesariamente residuos de Pro o Ala en su extremo amino o carboxilo-terminal. En una realizacion alternativa, la protema biologicamente activa segun la presente invencion puede representar un conjugado de protema en el que una protema de interes o un polipeptido/tramo de polipeptido/peptido/secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica se conjuga mediante un enlace no peptfdico a una secuencia de aminoacidos que forma/adopta una conformacion de enrollamiento al azar, en particular, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido) tal como se proporciona en el presente documento y que consiste unicamente en residuos de prolina y alanina. En la tecnica se conocen enlaces no peptfdicos que son utiles para reticular protemas, comprendiendo el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala) tal como se proporciona en el presente documento. Tales enlaces no peptfdicos pueden incluir enlaces
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
disulfuro, por ejemplo entre cadenas laterales de Cys, enlaces tioeter o enlaces covalentes no peptidicos inducidos por grupos de reticulacion qmmicos, tales como suberato de disuccinimidilo (DSS) o 4-[p-maleimidofenil]butirato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-SMPB), grupos complejantes/quelantes de metales, as^ como interacciones protema- protema no covalentes.
Debe observarse que la “protema biologicamente activa” de la presente invencion tambien puede comprender mas de una “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica”. Ademas, la protema biologicamente activa tambien puede comprender mas de un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo). En el caso mas sencillo, la protema biologicamente activa consiste en dos dominios, es decir un primer dominio que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica y un segundo dominio que comprende el polipeptido biosintetico (o segmento del mismo). Debe observarse que la presente invencion no se limita a “protemas biologica o terapeuticamente activas” unidas al polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido dado a conocer en el presente documento que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala). Tambien pueden fabricarse otras protemas o moleculas de interes, segun sea relevante para otras industrias, tales como industria alimentaria o de bebidas, industria cosmetica y similares, mediante los medios y metodos proporcionados en el presente documento.
El experto en la tecnica es consciente de que el “dominio que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica” y el “segundo dominio que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)” segun esta comprendido en las protemas biologicamente activas de la invencion pueden organizarse en un orden espedfico.
Por consiguiente, y en el contexto de la invencion, el orden de los dominios “primero” y “segundo” definidos en el presente documento del polipeptido biologicamente activo de la invencion puede disponerse en cualquier orden, mediante lo cual dicho “primer dominio” (es decir protema de interes; “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica”) esta ubicado en el extremo amino (N)-terminal y dicho “segundo dominio” (es decir el dominio que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar proporcionado en el presente documento (o segmento del mismo)) esta ubicado en el extremo carboxilo (C)-terminal de la protema biologicamente activa. Sin embargo, este orden puede invertirse, por ejemplo dicho “primer dominio” (es decir protema de interes; “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica”) esta ubicado en el extremo carboxilo (C)- terminal y dicho “segundo dominio” (es decir el dominio que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar proporcionado en el presente documento (o segmento del mismo)) esta ubicado en el extremo amino (N)-terminal de la protema biologicamente activa. Si la protema biologicamente activa consiste unicamente en un primer dominio y un segundo dominio, el orden de dominios puede ser por consiguiente (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal): primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)). A la inversa, el orden de dominios puede ser (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal): segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica).
Tambien se preve que va a usarse mas de un dominio que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica en el contexto del constructo de protema de la invencion. Por ejemplo, la protema biologicamente activa puede comprender dos “primeros dominios”, es decir dos secuencias de aminoacidos espedficas que tienen y/o que median en una actividad biologica, mediante lo cual esta actividad biologica puede ser la misma o una actividad diferente. Si la protema biologicamente activa consiste en dos “primeros dominios” de este tipo, es decir dos secuencias de aminoacidos espedficas que tienen y/o que median en una actividad biologica, y un “segundo dominio” (que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo), el orden de dominios puede ser (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal): primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica (opcionalmente diferente)).
Las mismas explicaciones se aplican en casos en los que la protema biologicamente activa comprende mas de un “segundo dominio” (es decir la protema biologicamente activa comprende mas de un polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)). Si la protema biologicamente activa consiste en dos “segundos dominios” de este tipo, es decir, dos dominios que comprenden el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo), y un “primer dominio” (que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica), el orden de dominios puede ser (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal): segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) -- segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)). Si la protema biologicamente activa comprende mas de un “segundo dominio” en el presente documento se preve que estos “segundos dominios” pueden ser identicos o pueden ser diferentes.
Tal como se menciono anteriormente, la protema biologicamente activa puede comprender mas de un “primer
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
dominio”, es decir mas de una secuencia de aminoacidos espedfica que tiene y/o que media en una actividad biologica y mas de un “segundo dominio” (polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo)), mediante lo cual estos “primeros dominios” pueden ser identicos o diferentes y/o mediante lo cual dichos “segundos dominios” pueden ser identicos o diferentes. En tales casos, pueden concebirse los siguientes ordenes de dominios a modo de ejemplo (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal):
- primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) -
segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de
aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo));
- segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) -- primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo));
- primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) -
segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - segundo dominio (polipeptido de
enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica);
- segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica);
- segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica); o
- primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) - primer dominio (secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)) - segundo dominio (polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo)).
Para un experto en la tecnica, ordenes de dominios correspondientes adicionales (en particular en casos en los que mas de dos “primeros dominios” o mas de dos “segundos dominios” estan comprendidos en la protema biologicamente activa) son facilmente concebibles.
Como con todas las realizaciones del presente polipeptido/protema biologicamente activa de la invencion, dicho(s) dominio(s) que comprende(n) una secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en dicha actividad biologica tambien puede(n) ser un fragmento biologicamente activo de una protema dada con una funcion biologica deseada. Por tanto, el “segundo dominio” definido en el presente documento (preferiblemente que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar proporcionado en el presente documento (o segmento del mismo)) tambien puede estar ubicado entre dos fragmentos biologicamente activos de una protema de interes o entre fragmentos biologicamente activos de dos protemas de interes. Todas las explicaciones y definiciones facilitadas anteriormente en el presente documento en el contexto de protemas/polipeptidos de interes de “longitud completa” (es decir, cuando las secuencias de aminoacidos tienen/median en una determinada actividad biologica por sf solas) se aplican, cambiando lo que sea necesario, en el contexto de tales fragmentos.
De nuevo, la invencion anterior no se limita a los constructos que comprenden un “dominio” con una “funcion biologica activa”. Los constructos de la presente invencion tambien pueden comprender dominios con otras funciones y no se limitan a actividades biologicas. Estas son simplemente realizaciones de la presente invencion y resulta evidente para el experto en la tecnica que otros constructos pueden realizarse facilmente y usarse sin apartarse de la esencia de la presente invencion. Por consiguiente, lo dicho en el presente documento en el contexto de “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una actividad biologica espedfica” se aplica, cambiando lo que sea necesario, para otros constructos, por ejemplo constructos que van a usarse en otros campos tecnicos, tales como la cosmetica, procesamiento de alimentos, productos lacteos, produccion de papel, etc. Tal como se menciono anteriormente en el presente documento, los polipeptidos/polfmeros biosinteticos de la presente invencion tambien puede usarse para unirse por ejemplo a moleculas pequenas y similares.
De nuevo, debe indicarse que el termino “secuencia de aminoacidos que tiene y/o que media en una primera actividad biologica” no se limita a polipeptidos de longitud completa que tienen y/o median en dicha actividad o funcion biologica, sino tambien a fragmentos biologica y/o farmacologicamente activos de los mismos. Especialmente, pero no unicamente, en un contexto en el que dos o mas “primeros dominios” tal como se define en el presente documento estan comprendidos en la “protema biologicamente activa” de la invencion, tambien se preve que estos “primeros dominios” son o representan diferentes partes de un complejo de protema o fragmentos de tales
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
partes de complejo de protema.
Tal como se muestra a modo de ejemplo a continuacion en el presente documento, las protemas biologicamente activas de la invencion que se modifican para comprender un polipeptido de enrollamiento al azar muestran sorprendentemente una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada en comparacion con protemas biologicamente activas sin modificar que carecen de dicho dominio de enrollamiento al azar. Tal como se usa en el presente documento, el termino “estabilidad in vivo" se refiere a la capacidad de una sustancia espedfica que se administra al organismo vivo de permanecer biologicamente disponible y biologicamente activa. In vivo, una sustancia puede retirarse y/o inactivarse debido a excrecion, filtracion renal, captacion hepatica, agregacion, degradacion y/u otros procesos metabolicos. Por consiguiente, en el contexto de la presente invencion las protemas biologicamente activas que tienen una estabilidad in vivo aumentada pueden excretarse menos rapidamente a traves de los rinones (orina) o a traves de las heces y/o pueden ser mas estables frente a proteolisis, en particular frente a proteolisis in vivo en lfquidos biologicos, tales como sangre, lfquido cefalorraqmdeo, lfquido peritoneal y linfa. En una realizacion, la estabilidad in vivo aumentada de una protema biologicamente activa se manifiesta en una semivida en plasma prolongada de dicha protema biologicamente activa. En particular, la estabilidad in vivo aumentada de la protema biologicamente activa es una semivida en plasma prolongada de dicha protema biologicamente activa que comprende dicho segundo dominio en comparacion con la protema biologicamente activa que carece del segundo dominio.
En la tecnica se conocen metodos para medir la estabilidad in vivo de protemas biologicamente activas. Tal como se muestra a modo de ejemplo a continuacion en el presente documento, protemas biologicamente activas pueden detectarse espedficamente en el plasma sangumeo usando tecnicas de inmunotransferencia de tipo Western o ensayo de inmunoabsorcion asociado a enzimas (ELISA). Sin embargo, el experto en la tecnica es consciente de que pueden emplearse otros metodos para medir espedficamente la semivida en plasma de una protema de interes. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, la deteccion ffsica de una protema de interes marcada radiactivamente. En la tecnica se conocen metodos para el marcaje radiactivo de protemas, por ejemplo, mediante radioyodacion.
El termino “estabilidad in vitro aumentada” tal como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de una protema biologicamente activa de resistir la degradacion y/o agregacion y de conservar su actividad biologica original en un entorno in vitro. En la tecnica se conocen bien metodos para medir la actividad biologica de protemas biologicamente activas.
Ademas, se proporciona un conjugado de farmaco que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido descrito y definido en el presente documento y un farmaco de molecula pequena que se conjuga a dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido. Ejemplos no limitativos de las moleculas pequenas son doxorubicina, caliqueamicina, camptotecina, fumagilina, dexametasona, geldanamicina, paclitaxel, docetaxel, irinotecan, ciclosporina, buprenorfina, naltrexona, naloxona, vindesina, vancomicina, risperidona, aripiprazol, palonosetron, granisetron, citarabina, NX1838, leuprolida, goserelina, buserelina, octreotida, teduglutida, cilengitida, abarelix, enfuvirtida, ghrelina y derivados, tubulisinas, derivados de platino, inhibidores de integrina alfa 4, acidos nucleicos antisentido, ARN de interferencia pequenos, microARN, esteroides, aptameros de ADN o ARN, peptidos, compuestos peptidomimeticos. En general, la presente invencion tambien se refiere a constructos de farmaco que comprenden el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido definido en el presente documento y en particular moleculas farmaceutica o medicamente utiles, tales como moleculas pequenas, peptidos o biomacromoleculas tales como protemas, acidos nucleicos, hidratos de carbono, vesroulas iipfdicas y similares. En la parte experimental ilustrativa adjunta (vease, por ejemplo, el ejemplo 22) se proporciona la generacion satisfactoria de constructos/conjugados de la presente invencion, tambien constructos en los que se han conjugado “moleculas qmmicas pequenas” al polipeptido de enrollamiento al azar dado a conocer en el presente documento. Por tanto, las presentes figuras e informacion experimental en las leyendas de figuras correspondientes proporcionan ejemplos ilustrativos, en los que los conjugados de farmaco dados a conocer en el presente documento comprenden (i) un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) una molecula pequena, que, como ilustracion, se selecciona de digoxigenina y fluorescema. Debe observarse que esto no son solo ejemplos teoricos. La fluorescema o derivados de fluorescema se usan habitualmente como compuestos de diagnostico, y se comercializan disoluciones de fluorescema medicas con los nombres comerciales Fluoescite®, AK-FLUOR® o Fluress®. Tales compuestos pueden beneficiarse ciertamente de los medios y metodos proporcionados en el presente documento. La digoxigenina forma la parte esteroide de digoxina, un metabolito vegetal secundario bien conocido con funcion cardioactiva que ademas contiene tres azucares digitoxosa. La digoxina, y en menor medida el compuesto estrechamente relacionado digitoxina, se usan ampliamente para el tratamiento de taquiarritmias ventriculares e insuficiencia cardiaca congestiva (Hauptman (1999) Circulation 99: 1265-1270). Todos los esteroides cardioactivos son inhibidores potentes y altamente espedficos de la Na+/K+-ATPasa ubicada en la membrana plasmatica celular, ejerciendo por tanto efectos inotropicos positivos o simpaticolfticos.
Las definiciones y explicaciones facilitadas anteriormente en el presente documento en el contexto del polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido del mismo se aplican, cambiando lo que sea necesario, en el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
contexto de conjugado de farmaco que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido del mismo) y un farmaco seleccionado del grupo que consiste en (a) una protema biologicamente activa o un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o media en una actividad biologica y (b) un farmaco de molecula pequena.
El polfmero de aminoacidos que forma una conformacion de enrollamiento al azar/el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) tal como se define y se proporciona en el presente documento puede conjugarse a una molecula pequena/farmaco de molecula pequena. Por medio de esto, puede aumentarse la semivida en plasma y/o solubilidad de la molecula pequena/farmaco de molecula pequena, puede reducirse la toxicidad inespedfica, y la exposicion prolongada de farmaco activo a celulas o estructuras diana en el organismo puede dar como resultado farmacodinamia potenciada.
Es posible una conjugacion espedfica del sitio del extremo N-terminal del polipeptido de enrollamiento al azar con un derivado de farmaco activado, por ejemplo tal como derivado de ester de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA). Generalmente, el grupo amino N- terminal puede acoplarse qmmicamente con una amplia variedad de grupos funcionales tales como aldehfdos y cetonas (para formar bases de Schiff, que pueden reducirse para dar aminas usando borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio, por ejemplo) o para dar derivados de acido carbonico activados (anlddridos, cloruros, esteres y similares, para formar amidas) o para dar otros productos qrnmicos reactivos tales como isocianatos, isotiocianatos, cloruros de sulfonilo, etc. Ademas, el extremo N-terminal del polfmero de aminoacidos/polipeptido puede modificarse en primer lugar con un grupo protector adecuado, por ejemplo un grupo acetilo, un grupo bOc o un grupo FMOC (Jakubke (1996) Peptide. Spektrum Akdemischer Verlag, Heidelberg, Alemania). Ademas, el extremo amino-terminal puede protegerse mediante un grupo piroglutamilo, que puede formarse a partir de un residuo de aminoacido de Gln codificado que precede al polipeptido de Pro/Ala o segmento de polipeptido. Tras la activacion del grupo carboxilato C-terminal, por ejemplo usando los reactivos comunes EDC (N-(3- dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida) y NHS, puede lograrse el acoplamiento espedfico del sitio al extremo C- terminal del polipeptido de enrollamiento al azar protegido si el farmaco porta un grupo amino libre, por ejemplo.
Alternativamente, el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del polfmero de aminoacidos que forma una conformacion de enrollamiento al azar/el polipeptido de enrollamiento al azar puede modificarse con un reactivo de union comercialmente disponible que proporciona un grupo maleimida, permitiendo por tanto el acoplamiento qrnmico a un grupo tiol como parte de la molecula de farmaco. De esta manera pueden obtenerse facilmente conjugados de farmaco uniformes. Pueden usarse tecnicas similares, que se conocen bien en la tecnica (Hermanson (1996), citado anteriormente), para acoplar el polipeptido de enrollamiento al azar a un peptido o incluso a un farmaco de protema. Tales peptidos o protemas pueden prepararse facilmente portando una cadena lateral de Lys o Cys, que permite su acoplamiento in vitro al polfmero de aminoacidos que forma una conformacion de enrollamiento al azar a traves de grupos activos de maleimida o ester de NHS. Generalmente, pueden prepararse conjugados de farmaco similares con protemas de fusion que comprenden el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo). Sin embargo, y tal como se ilustra en los ejemplos y figuras adjuntos, la presente invencion tambien proporciona la preparacion de polipeptidos de enrollamiento al azar o segmentos de polipeptido de enrollamiento al azar segun esta comprendido en los conjugados innovadores de la presente invencion.
Como alternativa a una unica conjugacion espedfica del sitio, el polipeptido de enrollamiento al azar puede equiparse con cadenas laterales adicionales, en el extremo N o C-terminal o de manera interna, adecuadas para su modificacion qrnmica, tales como residuos de lisina con sus grupos e-amino, residuos de cistema con sus grupos tiol, o incluso aminoacidos no naturales, permitiendo la conjugacion de multiples moleculas pequenas usando, por ejemplo, grupos activos de maleimida o ester de NHS.
Aparte de la conjugacion estable, puede unirse transitoriamente un profarmaco al polipeptido de enrollamiento al azar. La union puede disenarse para escindirse in vivo, de una manera predecible, o bien mediante un mecanismo enzimatico o bien mediante hidrolisis lenta iniciada a pH fisiologico de manera similar, por ejemplo, al agente antitumoral escasamente soluble camptotecina que se conjugo a un polfmero de PEG, logrando por tanto una biodistribucion aumentada, toxicidad reducida, eficacia potenciada y acumulacion tumoral (Conover (1998) Cancer Chemother Pharmacol, 42:407-414). Ejemplos de profarmacos adicionales son agentes quimioterapicos tales como docetaxel (Liu (2008) J Pharm Sci. 97:3274-3290), doxorubicina (Veronese (2005) Bioconjugate Chem. 16: 775-784) o paclitaxel (Greenwald (2001) J Control Release 74:159-171).
Ademas, la molecula pequena puede acoplarse a una protema de fusion que comprende el polfmero de aminoacidos/polipeptido geneticamente fusionada a un dominio de direccionamiento, por ejemplo un fragmento de anticuerpo, dando por tanto como resultado un suministro espedfico del farmaco de molecula pequena. En este ultimo caso, pueden generarse facilmente inmunotoxinas mediante conjugacion con una molecula pequena citotoxica si se dirige el dominio de direccionamiento contra un receptor de superficie celular que experimenta internalizacion, por ejemplo.
Por tanto, segun lo anterior, la presente invencion tambien se refiere a proporcionar el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido dado a conocer en el presente documento que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina para su
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
acoplamiento suplementario y adicional con otros compuestos de eleccion. Dicho acoplamiento suplementario y/o adicional puede ser y/o puede comprender el primer acoplamiento de dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico con o a otro compuesto.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a moleculas de acido nucleico que codifican para los polipeptidos de enrollamiento al azar (o segmentos de los mismos) o protemas biologicamente activas tal como se describe en el presente documento. Por consiguiente, dicha molecula de acido nucleico puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica para un polipeptido que tiene actividad biologica y una secuencia de acido nucleico que codifica para el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo). Se pretende que el termino “molecula de acido nucleico”, tal como se usa en el presente documento, incluya moleculas de acido nucleico tales como moleculas de ADN y moleculas de ARN. Dicha molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. Preferiblemente, dicha molecula de acido nucleico puede estar comprendida en un vector.
Por consiguiente, la presente divulgacion tambien se refiere a una molecula de acido nucleico que codifica para el polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido segun esta comprendido en los conjugados proporcionados en el presente documento, tal como un conjugado de farmaco tal como se define en el presente documento. La presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico que codifica para un conjugado de protema que comprende una protema biologicamente activa tal como se definio anteriormente y que comprende, adicionalmente, un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala).
En una realizacion se proporciona una molecula de acido nucleico que codifica para un conjugado de farmaco tal como se definio anteriormente, comprendiendo dicha molecula de acido nucleico
(i) una secuencia de acido nucleico que codifica para una secuencia de aminoacidos y/o lfder traducida;
(ii) una secuencia de acido nucleico que codifica para un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala);
(iii) una secuencia de acido nucleico que codifica para una protema biologicamente activa o dicho polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad biologica; y
(iv) una secuencia de acido nucleico que representa o es un codon de terminacion de la traduccion.
La “secuencia de aminoacidos y/o lfder traducida” anteriormente mencionada en (i) puede ser, por ejemplo, la “M” de iniciacion, es decir una metionina derivada de un codon de iniciacion correspondiente, tambien puede comprender secuencias no traducidas de un ARNm tal como la secuencia en 5' hasta un codon de iniciacion que comprende, por ejemplo, un sitio de union a ribosoma. Sin embargo, una secuencia de este tipo tambien puede comprender secuencias lfder y/o senal clasicas, por ejemplo, para la secrecion de una protema expresada en el periplasma o en un medio de cultivo. Peptidos senal procariotas son, por ejemplo, OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII. Peptidos senal eucariotas son, por ejemplo, secuencia senal de melitina de abejas, secuencia senal de glicoprotema acida gp67, secuencia senal de IgM de raton, secuencia senal de hGH.
Anteriormente en el presente documento se han proporcionado protemas biologicamente activas o polipeptidos que comprenden o que son una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad biologica asf como otras protemas de interes, tales como una protema que va a emplearse en otros sectores industriales. Dichas realizaciones se aplican, cambiando lo que sea necesario, para la molecula de acido nucleico (partes/segmentos (iii)) tal como se ilustro anteriormente en el presente documento.
En la tecnica se conocen bien codones de terminacion de la traduccion que van a emplearse en la molecula de acido nucleico proporcionada en el presente documento y son, por ejemplo codones UAA, UAG o UGA.
En una realizacion de la molecula de acido nucleico tal como se proporciono anteriormente en el presente documento dichas partes/segmentos de molecula de acido nucleico (ii) y (iii) intercambian su posicion en dicha molecula de acido nucleico que codifica para un conjugado de farmaco. Una molecula de acido nucleico de este tipo comprendera el siguiente orden de partes/segmentos:
(i) una secuencia de acido nucleico que codifica para una secuencia de aminoacidos y/o lfder traducida;
(ii) una secuencia de acido nucleico que codifica para una protema biologicamente activa o dicho polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad biologica;
(iii) una secuencia de acido nucleico que codifica para un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala); y
(iv) una secuencia de acido nucleico que representa o es un codon de terminacion de la traduccion.
Las moleculas de acido nucleico tal como se proporciono anteriormente en el presente documento tambien pueden comprender, opcionalmente, entre las partes/segmentos (i) y (ii) y/o entre las partes/segmentos (ii) y (iii), un sitio de escision por proteasa y/o qmmica y/o un sitio de reconocimiento. Tales sitios de escision qmmica se conocen bien en la tecnica, y comprenden por ejemplo secuencias de aminoacidos individuales espedficas (vease, por ejemplo Lottspeich y Engels (Hrsg.) (2006) Bioanalytik. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier, Munich, Alemania). Por ejemplo, bromuro de cianogeno o cloruro de cianogeno escinde el enlace peptfdico tras un residuo de Met; hidroxilamina escinde el enlace asparaginil-glicilo; acido formico escinde Asp-Pro; 2-(2'-nitrofenilsulfenil)-3- metil-3-bromoinolenina, acido 2-yodosobenzoico o N-clorosuccinimida tras Trp; acido 2-nitro-5-tiocianatobenzoico tras Cys. Tambien se preve y es posible que el residuo que precede al polipeptido de Pro/Ala o segmento de polipeptido puede sustituirse por Met mediante mutagenesis dirigida al sitio y entonces puede escindirse la protema de fusion resultante mediante BrCN. De manera similar, pueden introducirse otras secuencias de aminoacidos que comprenden sitio de escision en la protema de fusion recombinante o su acido nucleico codificante mediante mutagenesis dirigida al sitio.
En la tecnica tambien se conocen sitios de reconocimiento/escision por proteasa utiles. Estos comprenden, pero no se limitan a: tripsina, quimotripsina, enterocinasa, proteasa de grabado del tabaco (TEV), proteasa PreScission, proteasa 3C de HRV, SUMO proteasa, sortasa A, granzima B, furina, trombina, factor Xa o interna autoescindible. El factor Xa hidroliza el enlace peptfdico en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos IleGluGlyArg, que puede insertarse entre la pareja de fusion N-terminal y el polipeptido de Pro/Ala o segmento de polipeptido. Un metodo particularmente sencillo para lograr la escision proteolftica sera mediante insercion o sustitucion de una cadena lateral de Lys o Arg en el extremo N-terminal del polipeptido de Pro/Ala o segmento de polipeptido seguido por digestion con tripsina, que no escinde dentro del polipeptido de Pro/Ala o segmento de polipeptido siempre que se eviten cadenas laterales de Lys o Arg internas. Sitios de reconocimiento ilustrativos son, sin ser limitativos, D-D- D-D-K (enterocinasa), ENLYFQ(G/S) (proteasa de TEV), I-(E/D)-G-R (factor Xa), L-E-V-L-F-Q-G-P (3C de HRV), R- X-(K/R)-R (furina), LPXTG (sortasa A), L-V-P-R-G (trombina) o I-E-X-D-X-G (granzima B).
Tal como resulta evidente a partir de la divulgacion anteriormente en el presente documento, la presente invencion proporciona polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos producidos de manera recombinante y segmentos de polipeptido que pueden conjugarse con polipeptidos o moleculas pequenas farmaceuticamente activos.
Se describe un acido nucleico que codifica para un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), comprendiendo dicha molecula de acido nucleico
(i) una secuencia de acido nucleico que codifica para una secuencia de aminoacidos y/o lfder traducida;
(ii) una secuencia de acido nucleico que codifica para dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina; y
(iii) una secuencia de acido nucleico que representa o es un codon de terminacion de la traduccion.
Una molecula de acido nucleico de este tipo puede comprender, opcionalmente, entre (i) y (ii) un sitio de escision por proteasa y/o qmmica y/o un sitio de reconocimiento.
Tambien para esta molecula de acido nucleico, las realizaciones proporcionadas anteriormente en el presente documento en el contexto de las dos primeras moleculas de acido nucleico descritas (es decir un sitio de escision por proteasa y/o qmmica y/o un reconocimiento) se aplican en este caso cambiando lo que sea necesario.
Las secuencias senal utiles e ilustrativas que van a emplearse en el contexto de esta invencion comprenden, pero no se limitan a, secuencias procariotas tales como: OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII o secuencias eucariotas tales como: secuencia senal de melitina de abejas, secuencia senal de glicoprotema acida gp67, secuencia senal de IgM de raton, secuencia senal de hGH.
En particular la molecula de acido nucleico que codifica para el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina de la presente invencion es util en metodos tal como tambien se proporciona a continuacion en el presente documento y tal como se ilustra en los ejemplos y figuras adjuntos. Un polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar expresado de este tipo puede aislarse, por ejemplo, de celulas huesped que expresan un polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar de este tipo. Tales celulas huesped pueden ser celulas transfectadas, por ejemplo con un vector tal como se proporciona en el presente documento.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Por tanto, se preve transfectar celulas con la molecula de acido nucleico o vectores tal como se describe en el presente documento. En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a moleculas de acido nucleico que, tras la expresion, codifican para el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) o protemas biologicamente activas de la invencion. Sin embargo, en una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a moleculas de acido nucleico que, tras la expresion, codifican para los polipeptidos dados a conocer en el presente documento que, en su totalidad o en parte, forman/adoptan una conformacion de enrollamiento al azar en disolucion acuosa o en condiciones fisiologicas. Dichas moleculas de acido nucleico pueden fusionarse a secuencias de control de la expresion adecuadas conocidas en la tecnica para garantizar una transcripcion y traduccion apropiadas del polipeptido asf como secuencias senal para garantizar una secrecion celular o direccionamiento a organulos. Tales vectores pueden comprender genes adicionales tales como genes marcadores que permiten la seleccion de dicho vector en una celula huesped adecuada y en condiciones adecuadas.
Preferiblemente, la molecula de acido nucleico de la invencion esta comprendida en un vector recombinante en el que una molecula de acido nucleico que codifica para la protema biologicamente activa descrita en el presente documento esta operativamente unida a las secuencias de control de la expresion permitiendo la expresion en celulas procariotas o eucariotas. La expresion de dicha molecula de acido nucleico comprende la transcripcion de la molecula de acido nucleico para dar un ARNm que puede traducirse. Los elementos reguladores que permiten la expresion en celulas huesped procariotas comprenden, por ejemplo, los promotores lambda PL, lac, trp, tac, ara, phoA, tet o T7 en E. coli. Los expertos en la tecnica conocen bien posibles elementos reguladores que garantizan la expresion en celulas eucariotas, preferiblemente celulas de mairnfero o levadura. Habitualmente comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripcion y opcionalmente senales de poli-A que realizan la terminacion de la transcripcion y estabilizacion del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripcion asf como de la traduccion, y/o regiones de promotor heterologas o asociadas de manera natural. Ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresion en celulas huesped eucariotas son los promotores AOX1 o GAL1 en levadura o los promotores de CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intron de globina en celulas de marnffero y de otros animales. Aparte de los elementos que son responsables del inicio de la transcripcion, tales elementos reguladores tambien pueden comprender senales de terminacion de la transcripcion, tales como el sitio de poli-A de SV40 o el sitio de poli-A de tk, en el sentido de 3' desde la region codificante.
Pueden usarse metodos que conocen bien los expertos en la tecnica para construir vectores recombinantes (veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory NY y Ausubel (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). En este contexto, en la tecnica se conocen vectores de expresion adecuados tales como vector de expresion de ADNc de Okayama-Berg pcDVI (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3, pPICZalfa A (Invitrogen) o pSPORTI (GIBCO BRL). Ademas, dependiendo del sistema de expresion que se usa, pueden anadirse secuencias lfder, que pueden dirigir el polipeptido a un compartimento celular o secretarlo en el medio de cultivo, a la secuencia codificante de la molecula de acido nucleico de la invencion.
La presente invencion tambien se refiere a vectores, particularmente plasmidos, cosmidos, virus y bacteriofagos, que se emplean convencionalmente en ingeniena genetica, que comprenden una molecula de acido nucleico que codifica para el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) o la protema biologicamente activa de la invencion. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresion y/o un vector de direccionamiento o transferencia genica. Pueden usarse vectores de expresion derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociado, virus del herpes o virus del papiloma bovino, para el suministro de los polinucleotidos o vector de la invencion al interior de poblaciones celulares seleccionadas como diana.
Los vectores que contienen las moleculas de acido nucleico de la invencion pueden transfectarse al interior de la celula huesped mediante metodos bien conocidos, que vanan dependiendo del tipo de celula. Por consiguiente, la invencion se refiere ademas a una celula que comprende dicha molecula de acido nucleico o dicho vector. Tales metodos incluyen, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook (1989), citado anteriormente y Ausubel (1989), citado anteriormente. Por consiguiente, la electroporacion o la transfeccion con cloruro de calcio se usan habitualmente para celulas procariotas, mientras que puede usarse la electroporacion o el tratamiento con fosfato de calcio para otros huespedes celulares (Sambrook (1989), citado anteriormente). Como alternativa adicional, las moleculas de acido nucleico y vectores de la invencion pueden reconstituirse para dar liposomas para su suministro a celulas diana. La molecula de acido nucleico o vector de la invencion que esta presente en la celula huesped puede o bien integrarse en el genoma de la celula huesped o bien puede mantenerse de manera extracromosomica. Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a una celula huesped que comprende la molecula de acido nucleico y/o el vector de esta invencion. En la tecnica se conocen bien celulas huesped para la expresion de polipeptidos y comprenden celulas procariotas asf como celulas eucariotas, por ejemplo celulas de E. coli, celulas de levadura, celulas de invertebrados, celulas CHO, celulas CHO-K1, celulas HEK 293, celulas Hela, celulas de mono COS-1, celulas de melanoma tales como celulas de Bowes, celulas L-929 de raton, lmeas celulares 3T3 derivadas de ratones suizos, Balb-c o NIH, lmeas celulares de hamster BHK o HaK y similares.
En un aspecto adicional, la presente invencion comprende metodos para la preparacion de los conjugados de la presente invencion asf como el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo) o protemas biologicamente activas proporcionadas en el presente documento y que comprenden cultivar la celula (huesped) de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
esta invencion y aislar dicho polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) o el conjugado o una protema biologicamente activa a partir del cultivo tal como se describe en el presente documento. En general, el polipeptido de enrollamiento al azar de la invencion (o segmento del mismo), el conjugado o protema biologicamente activa que comprende un dominio de enrollamiento al azar puede producirse mediante tecnologfa de ADN recombinante, por ejemplo cultivando una celula que comprende la molecula de acido nucleico descrita o vectores que codifican para la protema biologicamente activa de la invencion o polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) y aislando dicha protema/polipeptido a partir del cultivo. La protema biologicamente activa de la invencion o polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) puede producirse en cualquier sistema de cultivo celular adecuado incluyendo celulas procariotas, por ejemplo E. coli BL21, KS272 o JM83, o celulas eucariotas, por ejemplo cepa X-33 de levadura Pichia pastoris o celulas CHO. Pueden obtenerse lmeas celulares adecuadas adicionales conocidas en la tecnica a partir de depositarios de lmeas celulares tales como la Coleccion americana de cultivos tipo (ATCC).
Se pretende que el termino “procariota” incluya celulas bacterianas mientras que se pretende que el termino “eucariota” incluya celulas de levadura, plantas superiores, insectos y mairnferos. Los huespedes transformados pueden hacerse crecer en fermentadores y cultivarse segun tecnicas conocidas en la tecnica para lograr un crecimiento celular optimo. En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de un polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) o una protema biologicamente activa descrita anteriormente que comprende cultivar una celula de la invencion en condiciones adecuadas para la expresion de la protema biologicamente activa o polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) y aislar dicha protema/polipeptido a partir de la celula o del medio de cultivo.
Preferiblemente el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) en sf mismo de la presente invencion no comprende ningun grupo qmmicamente reactivo, excepto, posiblemente, por un grupo amino primario (o, en el caso de prolina, secundario) N-terminal y un grupo carboxilato en el extremo C-terminal del polfmero. Sin embargo, resulta evidente para el experto en la tecnica que el polipeptido/polfmero de enrollamiento al azar biosintetico tal como se proporciona en el presente documento puede comprender un grupo qmmicamente reactivo, por ejemplo cuando dicho polipeptido de enrollamiento al azar/polfmero forma parte de una “protema de fusion”/“constructo de fusion”. Tal como tambien se describio anteriormente, el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento del mismo) puede prepararse mediante expresion recombinante en una celula transformada de varias maneras segun metodos bien conocidos por el experto en la tecnica, por ejemplo: (i) expresion directa en el citoplasma con la ayuda de un codon de iniciacion/residuo de Met N-terminal; (ii) secrecion mediante un peptido senal N-terminal, por ejemplo OmpA, PhoA (Monteilhet (1993) Gene. 1993 125:223-228), melitina (Tessier (1991) Gene 98: 177-183), interleucina 2 (Zhang (2005) J Gene Med 7: 354-365), hGH (Pecceu (1991) Gene 97(2):253- 258) y similares, seguido por escision intracelular dando como resultado el extremo N-terminal maduro, tal como Ala o Pro; (iii) expresion como protema de fusion con otra protema soluble, por ejemplo, protema de union a maltosa en el extremo N-terminal y con un sitio de escision por proteasa intercalado (Kapust y Waugh (2000) Protein Expr. Purif. 19:312-318), seguido por escision con proteasa espedfica in vitro o in vivo, liberando por tanto el polfmero de aminoacidos/polipeptido con su extremo N-terminal maduro, tal como Ala o Pro. Otra pareja de fusion adecuada es la protema SUMO, que puede escindirse mediante SUMO proteasa, tal como se describe en los ejemplos 20 y 21. Las parejas de fusion adicionales incluyen, sin limitacion, glutation-S-transferasa, tiorredoxina, un dominio de union a celulosa, un dominio de union a albumina, una protema fluorescente (tal como GFP), protema A, protema G, una interna y similares (Malhotra (2009) Methods Enzymol. 463:239-258).
Tal como se explico anteriormente, los polipeptidos de enrollamiento al azar (o segmentos de polipeptido)/polfmeros descritos consisten predominantemente en residuos de alanina y prolina, mientras que serina, treonina o asparagina, que se requieren para la O o N-glicosilacion, estan preferiblemente ausentes. Por tanto, la produccion del propio polipeptido o de una protema biologicamente activa que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido del mismo) o, generalmente, una protema de fusion que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido del mismo) puede dar sorprendentemente como resultado un producto monodispersado preferiblemente carente de modificaciones tras la traduccion dentro de la secuencia de Pro-Ala. Esto es una ventaja para la produccion de protemas recombinantes en celulas eucariotas, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO) o levadura, que se eligen con frecuencia para la biosmtesis de protemas complejas. Por ejemplo, se ha usado levadura para la produccion de protemas terapeuticas aprobadas tales como insulina, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos, factor de crecimiento derivado de plaquetas o hirudina (Gerngross (2004) Nat. Biotechnol. 22:1409-1414). Las celulas CHO han servido para la produccion de protemas terapeuticas tales como factor de coagulacion IX, interferon p-1a, tenecteplasa (Chu (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187) o gonadotropinas, en las que el glicocomponente puede influir positivamente sobre varios aspectos tales como actividad funcional, plegamiento, dimerizacion, secrecion asf como interaccion con receptor, transduccion de senales y aclaramiento metabolico (Walsh (2006) Nat. Biotechnol. 24:-1241-1252). Por consiguiente, la preparacion de los constructos, polipeptidos de enrollamiento al azar y conjugados de la invencion en sistemas de expresion eucariotas tambien se da a conocer en el contexto de la presente invencion.
Con los medios y metodos proporcionados en el presente documento ahora es posible fabricar y proporcionar los conjugados y moleculas dados a conocer en el presente documento que comprenden (i) un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina y (ii) una molecula de interes adicional, tal como una protema util, un segmento de protema o una molecula pequena. Por tanto, la presente invencion tambien proporciona metodos para la preparacion o fabricacion de tales conjugados as^ como de polipeptidos de enrollamiento al azar biosinteticos y/o moleculas o conjugados que comprenden los mismos. Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona un metodo para la preparacion y/o fabricacion de un polipeptido de enrollamiento al azar o un segmento de polipeptido de enrollamiento al azar segun esta comprendido en los conjugados de farmaco. Tambien se proporcionan metodos para la preparacion y/o fabricacion de la protema biologicamente activa o conjugado que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar o el segmento de polipeptido de enrollamiento al azar. Ademas, se proporcionan metodos para la preparacion y/o fabricacion y/o para la preparacion y/o fabricacion de un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad biologica y que comprende adicionalmente dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar. Estos metodos comprenden en particular (como una etapa) el cultivo de la celula (huesped) tal como se proporciono anteriormente en el presente documento y (como etapa adicional) el aislamiento de dicho polipeptido de enrollamiento al azar o protema biologicamente activa y/o dicha protema biologicamente activa y/o dicho polipeptido conjugado a partir del cultivo o a partir de dicha celula. Entonces, este enrollamiento al azar aislado, polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina asf como el conjugado aislado pueden procesarse adicionalmente. Por ejemplo, dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina puede unirse o acoplarse qmmicamente a una molecula de interes, tal como tambien se muestra en los ejemplos adjuntos. Ademas, y como alternativa, la molecula de interes puede conjugarse enzimaticamente, por ejemplo, mediante transglutaminasa (Besheer (2009) J Pharm Sci. 98:4420-8) u otras enzimas (Subul (2009) Org. Biomol. Chem. 7:3361-3371) a dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en residuos de aminoacido de prolina y alanina.
El polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) y/o un conjugado de protema que comprende polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) y una protema de interes, tal como una protema biologica o terapeuticamente activa o una protema que va a usarse, por ejemplo, en metodos de diagnostico, puede aislarse (entre otras cosas) a partir del medio de crecimiento, lisados celulares, periplasma o fracciones de membrana celular. (De nuevo, la presente invencion no se limita a conjugados (de protema) que son utiles en un entorno medico o farmaceutico. Los medios y metodos proporcionados en el presente documento tambien tienen utilidad en otros sectores industriales, tales como, pero sin limitarse a, industria alimentaria y de bebidas, industria de nutrientes, industria del papel, industria de biorreactivos, industria de reactivos y herramientas de investigacion, industrias en las que van a usarse enzimas, industria cosmetica, procesamiento de petroleo y recuperacion de petroleo, y similares). El aislamiento y la purificacion de los polipeptidos expresados de la invencion pueden realizarse mediante cualquier medio convencional (Scopes (1982) “Protein Purification”, Springer, Nueva York, NY), incluyendo precipitacion con sulfato de amonio, purificacion por afinidad, cromatograffa en columna, electroforesis en gel y similares, y pueden implicar el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra una cola fusionada con la protema biologicamente activa de la invencion. Por ejemplo, la protema puede purificarse mediante Strep-tag II usando cromatograffa de afinidad por estreptavidina (Skerra (2000) Methods Enzymol. 326:271-304) tal como se describe en los ejemplos adjuntos. Se prefieren polipeptidos sustancialmente puros con una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95% (a nivel de protema), y lo mas preferido es una homogeneidad del 98 al 99% o mas, en particular para uso/aplicaciones farmaceuticas. Dependiendo de la celula huesped/organismo empleado en el procedimiento de produccion, los polipeptidos de la presente invencion pueden estar glicosilados o no glicosilados.
La invencion se refiere ademas al uso de la protema biologicamente activa, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) o los conjugados, tales como los conjugados de farmaco de la invencion, la molecula de acido nucleico de la invencion, el vector de la invencion o la celula (huesped) de la invencion para la preparacion de un medicamento, en los que dicha protema biologicamente activa o farmaco (o cualquier otra molecula pequena o protema de interes) tiene una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada en comparacion con una molecula de control que no comprende o que no esta unida a un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala).
En aun otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo para el tratamiento de enfermedades y/o trastornos que se benefician de la estabilidad mejorada de dicha protema biologicamente activa o farmaco, que comprende administrar la protema biologicamente activa o conjugado de farmaco tal como se describe en el presente documento a un mairnfero que necesita tal tratamiento. Dependiendo de la actividad biologica de la protema o conjugado de farmaco de la invencion, el experto puede determinar facilmente que enfermedad/trastorno va a tratarse con una protema biologicamente activa o conjugado de farmaco de la invencion espedfico. En la siguiente tabla se indican algunos ejemplos no limitativos:
Protema______biologicamente_______activa______(o | Trastorno/enfermedad que va a tratarse
componente/fragmento biologicamente activo de la misma) o farmaco
factor estimulante de colonias de granulocitos
neutropenia relacionada con quimioterapia y/o cancer
hormona del crecimiento humana
retraso del crecimiento y/o hipoglucemia relacionado con carencia de hormona del crecimiento
interferon a
cancer, infeccion viral, hepatitis C
interferon p
enfermedad autoinmunitaria, esclerosis multiple
interferon y
infeccion viral
factor de necrosis tumoral
cancer
interleucina-20
psoriasis
a-galactosidasa A
enfermedad de Fabry
antagonista de miostatina
sarcopenia
polipeptido inhibidor gastrico
diabetes tipo 2
antitripsina alfa-1
terapia de reposicion de enzimas, fibrosis qrnstica, enfermedades pulmonares obstructivas cronicas, smdrome respiratorio agudo, asma grave
eritropoyetina
anemia
factor de coagulacion VIII
hemofilia
gp120/gp160
VIH
receptor de factor de necrosis tumoral I y II soluble
enfermedad inflamatoria
reteplasa
trombosis, infarto de miocardio
exendina-4
diabetes
antagonista de receptor de interleucina-1 (IL-1ra; anakinra)
enfermedad autoinmunitaria, artritis reumatoide
interleucina-2
cancer
insulina
diabetes
asparaginasa
leucemia linfoblastica aguda, linfoma no Hodgkin
onconasa
mesotelioma maligno y otros tipos de cancer
estreptocinasa
trastornos tromboticos
lipocalina asociada a gelatinasa de neutrofilos
infeccion microbiana, lesion por reperfusion renal
anticuerpos y sus fragmentos, incluyendo anticuerpos de dominio individual, cadena sencilla y otros fragmentos modificados por ingeniena incluyendo peptidos mimeticos de CDR y las CDR
enfermedades inmunologicas, oncologicas, neovasculares e infecciosas, etc.
factor estimulante de colonias de granulocitos- macrofagos
neutropenia relacionada con quimioterapia
hormona estimulante del folfculo
esterilidad
glucocerebrosidasa
enfermedad de Gaucher
timosina alfa 1
hepatitis B cronica, cancer
glucagon
hipoglucemia
somatostatina
acromegalia
adenosina desaminasa
carencia de adenosina desaminasa
interleucina-11
trombocitopenia
factor de coagulacion VIIa
hemofilia
factor de coagulacion IX
hemofilia
Hematide
anemia
interferon X
hepatitis C
leptina
lipodistrofia, obesidad, enfermedad de Alzheimer, diabetes tipo I
subunidad alfa de receptor de interleucina-22 (IL-22ra)
psoriasis
interleucina 22
melanoma metastasico
hialuronidasa
tumores solidos
factor de crecimiento de fibroblastos 18
osteoartritis
factor de crecimiento de fibroblastos 21
diabetes tipo II, obesidad, dislipidemia, trastornos metabolicos
peptido similar a glucagon 1
diabetes
osteoprotegerina
cancer, osteoporosis, artritis reumatoide
protema de union a IL-18
artritis reumatoide
factor de liberacion de la hormona del crecimiento
lipodistrofia asociada con VIH
receptor de TACI soluble
lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, artritis reumatoide
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
trombospondina-1
cancer
receptor de VEGF soluble Flt-1
cancer
mutema de IL-4 (antagonista de receptor de IL-4)
asma
ciclosporina
rechazo de organo
fumagilina
cancer
naltrexona
adiccion al alcohol
octreotida
acromegalia, tumores carcinoides
teduglutida
smdrome del intestino corto, enfermedad de Crohn
goserelina
cancer de prostata avanzado, cancer de mama
camptotecina
cancer
vancomicina
neumomas Gram-positivas
Segun lo anterior, la protema biologicamente activa, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo), el conjugado de farmaco, el acido nucleico, el vector o la celula pueden usarse para la preparacion de un medicamento que preferiblemente tiene o confiere una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada, en particular para el componente de protema biologicamente activa y/o farmaco, para el tratamiento de carencias hormonales o trastornos relacionados, enfermedad autoinmunitaria, cancer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas/inflamatorias, trombosis, infarto de miocardio, diabetes, esterilidad, enfermedad de Gaucher, hepatitis, hipoglucemia, acromegalia, carencia de adenosina desaminasa, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidad, enfermedad de Alzheimer, lipodistrofia, psoriasis, melanoma metastasico, osteoartritis, dislipidemia, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, asma, osteoporosis, y lesion por reperfusion u otras enfermedades renales, por ejemplo. En una realizacion, la protema biologicamente activa, el conjugado de farmaco, el acido nucleico, el vector o la celula es para el uso como medicamento que tiene una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada de dicha protema biologicamente activa/conjugado de farmaco. De manera similar, la protema biologicamente activa, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo), el conjugado de farmaco, el acido nucleico, el vector o la celula son para su uso en el tratamiento de para el tratamiento de carencias hormonales o trastornos relacionados, enfermedad autoinmunitaria, trastornos proliferativos, tales como cancer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas y/o inflamatorias, trombosis, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, diabetes, esterilidad, disfuncion erectil, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, sarcopenia, fibrosis qmstica, enfermedades pulmonares obstructivas, smdrome respiratorio agudo, hepatitis, hipoglucemia, acromegalia, carencia de adenosina desaminasa, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidad, enfermedad de Alzheimer, lipodistrofia, psoriasis, melanoma metastasico, osteoartritis, dislipidemia, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, asma, osteoporosis, y lesion por reperfusion u otras enfermedades renales, por ejemplo.
La presente invencion tambien se refiere al uso de las moleculas de acido nucleico, vectores asf como celulas transfectadas tal como se proporciona en el presente documento y que comprenden las moleculas de acido nucleico o vectores de la presente invencion en enfoques medicos, tales como, por ejemplo, enfoques de terapia genica basada en celulas o enfoques de terapia genica basada en acido nucleico.
En una realizacion adicional, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento de polipeptido del mismo) tal como se proporciona en el presente documento, el conjugado de farmaco que comprende el polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico (o segmento de polipeptido del mismo) y/o la molecula de acido nucleico o el vector o la celula huesped de la presente invencion, forman parte de una composicion. Dicha composicion puede comprender uno o mas de los conjugados de farmaco o moleculas de acido nucleico, vectores y/o celulas huesped que codifican para y/o expresan los mismos. Dicha composicion puede ser una composicion farmaceutica, opcionalmente que comprende ademas un portador y/o diluyente farmaceuticamente aceptable. En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere al uso de la protema biologicamente activa descrita en el presente documento, el polipeptido de enrollamiento al azar (o segmento del mismo) o el conjugado de farmaco para la preparacion de una composicion farmaceutica para la prevencion, tratamiento o mejora de enfermedades que requieren la captacion de una composicion farmaceutica de este tipo.
Tal como se menciono anteriormente en el presente documento, no solo los conjugados dados a conocer en el presente documento, tales como conjugados de farmaco o conjugados de diagnostico, y/o protemas heterologas biologicamente activas/constructos de protema (que comprenden el polipeptido de enrollamiento al azar de la invencion o segmento de polipeptido del mismo) tienen utilidad en particular medica o farmaceutica. Ademas, dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido puede emplearse en sf mismo en un contexto medico de este tipo, por ejemplo como “expansor del plasma” o como sucedaneo de la sangre, en la mejora, prevencion y/o tratamiento de un trastorno relacionado con una cantidad de plasma sangumeo o contenido de plasma sangumeo alterado o en la mejora, prevencion y/o tratamiento de un trastorno relacionado con un volumen de sangre alterado. Trastornos que se tratan con expansores del plasma son, pero no se limitan a, trastornos afiliados con perdida de sangre, tales como lesiones, cirugfas, quemaduras, traumatismo o urgencias abdominales, infecciones, deshidrataciones, etc. Sin embargo, un uso medico de este tipo no se limita al polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido de esta invencion sino que tambien puede extenderse a determinados conjugados de farmaco tal como se da a conocer en el presente documento o incluso a determinadas protemas heterologas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
biologicamente activas/constructos de protema.
En un aspecto, la composicion tal como se describe en el presente documento puede ser una composicion de diagnostico, por ejemplo un reactivo de obtencion de imagenes, opcionalmente que comprende ademas medios adecuados para deteccion, en la que dicha composicion de diagnostico tiene una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada.
Las composiciones de la invencion pueden estar en forma solida o lfquida y pueden estar, entre otras cosas, en forma de un(os) polvo(s), un(os) comprimido(s), una(s) disolucion/disoluciones o un(os) aerosol(es). Ademas, se preve que el medicamento de la invencion puede comprender agentes biologicamente activos adicionales, dependiendo del uso previsto de la composicion farmaceutica.
La administracion de las composiciones (farmaceuticas) adecuadas puede realizarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administracion parenteral, subcutanea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, topica, intrabronquial, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, administracion intralesional. Las administraciones parenterales incluyen administracion intraperitoneal, intramuscular, intradermica, subcutanea, intravenosa o intraarterial. Las composiciones de la invencion tambien puede administrarse directamente al sitio diana, por ejemplo, mediante administracion biolfstica a un sitio diana externo o interno, tal como un organo espedficamente afectado.
En la tecnica se conocen bien ejemplos de portadores, excipientes y/o diluyentes farmaceuticos adecuados e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato u otras disoluciones de tampon, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones esteriles, etc.
Pueden formularse composiciones que comprenden tales portadores mediante metodos convencionales bien conocidos. Los portadores adecuados pueden comprender cualquier material que, cuando se combina con la protema biologicamente activa/conjugado de farmaco de la invencion, conserva su actividad biologica y/o farmaceutica (vease Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16a edicion, Osol, A. Ed, Mack Publishing Company, Easton, PA). Las preparaciones para administracion parenteral pueden incluir disoluciones, suspensiones y emulsiones esteriles acuosas o no acuosas. Los tampones, disolventes y/o excipientes tal como se emplean en el contexto de la composicion farmaceutica son preferiblemente “fisiologicos” tal como se definio anteriormente en el presente documento. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones alcoholicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solucion salina y medios tamponados. Los vehnculos parenterales pueden incluir disolucion de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solucion de Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehnculos intravenosos pueden incluir reponedores de lfquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. Tambien pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, incluyendo agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y/o gases inertes y similares. Ademas, una composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender portadores proteicos, tales como, por ejemplo, albumina serica o inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano.
Estas composiciones farmaceuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. El regimen de dosificacion lo determinara el medico encargado y mediante factores clmicos. Tal como se conoce bien en la ciencia medica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamano del paciente, area de superficie corporal, edad, el compuesto particular que va a administrarse, sexo, tiempo y via de administracion, salud general, y otros farmacos que estan administrandose de manera concurrente. La materia farmaceuticamente activa puede estar presente en cantidades de entre 1 |ig y 20 mg/kg de peso corporal por dosis, por ejemplo entre 0,1 mg y 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo entre 0,5 mg y 5 mg/kg de peso corporal. Si el regimen es una infusion continua, tambien debe estar en el intervalo de 1 |ig a 10 mg por kilogramo de peso corporal por minuto. Sin embargo, tambien pueden preverse dosis inferiores o superiores a los intervalos indicados a modo de ejemplo, especialmente teniendo en cuenta los factores anteriormente mencionados.
Ademas, se preve que la composicion farmaceutica de la invencion puede comprender agentes biologica o farmaceuticamente activos adicionales, dependiendo del uso previsto de la composicion farmaceutica. Estos agentes biologica o farmaceuticamente activos adicionales pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, hormonas, factores de crecimiento, enzimas, moleculas de union, citocinas, quimiocinas, moleculas de acido nucleico y farmacos.
Debe observarse que la presente invencion no se limita a composiciones farmaceuticas. Tambien se preven composiciones que van a usarse en investigacion o como producto(s) de diagnostico. Por ejemplo, se preve que las protemas biologicamente activas o conjugados de farmaco que comprenden un dominio o componente de enrollamiento al azartal como se define en el presente documento se usan en un entorno de diagnostico. Con tal fin, la protema biologicamente activa de la invencion o conjugado de farmaco de esta invencion puede marcarse con el fin de permitir la deteccion. Tales etiquetas comprenden, pero no se limitan a, etiquetas radiactivas (tales como [3H]hidrogeno [125I]yoduro o [123I]yoduro), etiquetas fluorescentes (incluyendo protemas fluorescentes, tales como protema verde fluorescente (GFP) o fluoroforos, tales como isotiocianato de fluorescema (FITC)) o etiquetas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
RMN (tales como quelatos de gadolinio). Las etiquetas o marcadores definidos en este caso no son de ninguna manera limitativos y representan simplemente ejemplos ilustrativos. Las composiciones de diagnostico de esta divulgacion son particularmente utiles en experimentos de seguimiento u obtencion de imagenes o en un entorno medico de diagnostico. En los ejemplos y figuras adjuntos, se proporciona la preparacion de un constructo correspondiente que comprende conjugados que comprenden (i) un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) fluorescema o digoxigenina; veanse las figuras 13 y 14 adjuntas y la leyenda de las figuras correspondiente asf como ejemplo ilustrativo 22.
Pero no solo los usos farmaceuticos o de diagnostico de los medios y metodos proporcionados en el presente documento estan dentro de la esencia de la presente invencion. Los compuestos/conjugados proporcionados en el presente documento tambien son utiles en otros determinados sectores industriales, tales como en la industria alimentaria, la industria de las bebidas, la industria cosmetica, la industria del petroleo, la industria del papel y similares. Por tanto, la presente divulgacion tambien proporciona usos del polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico tal como se proporciona en el presente documento en tales sectores industriales. Por consiguiente, tambien forma parte de esta divulgacion un metodo para la produccion de un cosmetico, de un compuesto que va a usarse en tratamientos cosmeticos, de un alimento o de una bebida, comprendiendo dicho metodo el cultivo de la celula que comprende una molecula de acido nucleico (o un vector) que codifica para un polipeptido de enrollamiento al azar tal como se define en el presente documento o que codifica para una protema biologicamente activa y/o una protema biologicamente activa y/o un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad. Un metodo de este tipo tambien incluye el aislamiento de dicho polipeptido de enrollamiento al azar, dicha protema biologicamente activa y/o dicha protema biologicamente activa o dicho polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad, tal como una actividad biologica, y que adicionalmente comprende dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar a partir del cultivo o a partir de dicha celula. En el mismo contexto, pueden producirse otros conjugados de interes, por ejemplo conjugados que son utiles en diferentes sectores de la industria, tales como la industria del petroleo o del papel. El experto en la tecnica esta facilmente en posicion de adaptar los medios y metodos proporcionados en el presente documento para la generacion de constructos moleculares/recombinantes correspondientes asf como para la generacion de conjugados que comprenden un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), y una molecula pequena o un polipeptido de interes.
Tambien se describe un kit que comprende el conjugado de farmaco, la molecula de acido nucleico que codifica para dicha protema biologicamente activa y/o que codifica para dicho polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad (por ejemplo una actividad biologica), el vector que comprende dicha molecula de acido nucleico o la celula que comprende dicho acido nucleico o dicho vector tal como se describe en el presente documento. El kit de la presente invencion puede comprender ademas, un(os) tampon/tampones, disoluciones de almacenamiento y/o reactivos o materiales adicionales requeridos para la realizacion de ensayos y fines medicos o cientfficos. Ademas, partes del kit pueden envasarse de manera individual en viales o botellas o en combinacion en recipientes o unidades de multiples recipientes.
El kit puede usarse ventajosamente, entre otras cosas, para llevar a cabo el metodo de la invencion y puede emplearse en una variedad de aplicaciones a las que se hace referencia en el presente documento, por ejemplo, como herramientas de investigacion o como herramientas medicas. Adicionalmente, el kit puede contener medios para la deteccion adecuados para fines cientfficos o medicos. La fabricacion de los kits sigue preferiblemente procedimientos convencionales que conoce el experto en la tecnica.
La invencion se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.
Figura 1. Diseno genico para la secuencia de polfmero/polipeptido de Pro/Ala PA#1.
Secuencia de nucleotidos y de aminoacidos codificada de un bloque estructural para PA#1 (SEQ ID NO: 1) obtenida mediante hibridacion de dos oligodesoxinucleotidos complementarios (oligodesoxinucleotido de cadena superior/codificante SEQ ID NO: 17, oligodesoxinucleotido de cadena inferior/no codificante SEQ ID NO: 18). El acido nucleico resultante tiene dos extremos cohesivos (mostrados en minusculas), correspondientes a un codon de Ala y anticodon, respectivamente, y son mutuamente compatibles. Tras la ligacion repetida de un bloque estructural de este tipo, pueden obtenerse concatemeros que codifican para polipeptidos de Pro-Ala de longitudes variables y posteriormente clonarse, por ejemplo, mediante un(os) sitio(s) de restriccion SapI.
Figura 2. Estrategias de clonacion para una secuencia de polfmero/polipeptido de Pro/Ala como fusion a un fragmento Fab o a IFNa2b humano.
(A) Tramo de secuencia de nucleotidos y de aminoacidos codificada (cadena superior/codificante SEQ ID NO: 19, cadena inferior/no codificante SEQ ID NO: 20, secuencia de aminoacidos codificada SEQ ID NO: 21) alrededor del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
extremo C-terminal de la cadena ligera de inmunoglobulina de un fragmento Fab de anticuerpo tal como se codifica en pASK88-Fab-2xSapI (SEQ ID NO: 22), un derivado de pASK75, usado para la subclonacion de secuencias de poKmero/polipeptido de Pro/Ala y expresion de protemas biologicamente activas correspondientes. La secuencia de nucleotidos porta dos sitios de reconocimiento SapI en orientacion mutuamente inversa, lo que conduce, tras la digestion, a extremos de ADN sobresalientes que son compatibles con el casete genico sintetico mostrado en la figura 1. Las secuencias de reconocimiento y los aminoacidos C-terminales de la cadena ligera estan subrayados.
(B) Secuencia de nucleotidos y secuencia de aminoacidos codificada (cadena superior/codificante SEQ ID NO: 23, cadena inferior/no codificante SEQ ID NO: 24, secuencia de aminoacidos codificada SEQ ID NO: 25) de un polfmero/polipeptido PA#1 con 20 residuos tras la insercion de un unico casete tal como se muestra en la figura 1 en el plasmido pASK88-Fab-2xSapI. La ligacion/insercion similar de 10 de tales casetes repetidos dio como resultado el vector de plasmido pFab-PA#1(200) (SEQ ID NO: 28) que codifica para un polfmero/polipeptido con 200 residuos (SEQ ID NO: 26 y 27). Los sitios de restriccion SapI que flanquean la secuencia que codifica para polfmero de Pro/Ala estan marcados (las secuencias de reconocimiento estan subrayadas).
(C) Mapa de plasmido de pFab-PA#1(200) (SEQ ID NO: 28). Los genes estructurales para la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de Fab-PA#1(200) estan bajo el control transcripcional del promotor/operador de tetraciclina (tetp/o) y los extremos de operon con el terminador de lipoprotema (tlpp). HC comprende el peptido senal OmpA bacteriano, el dominio variable (VH) y el primer dominio constante C (CH) de cadena pesada de IgG1 humana asf como la cola de His6. LC comprende el peptido senal PhoA bacteriano, el dominio variable (VL) y dominio constante (CL) de cadena ligera humana, el polfmero/polipeptido PA#1 con 200 residuos. La estructura principal de plasmido de pFab-PA#1(200) fuera del casete de expresion flanqueado por los sitios de restriccion XbaI y HindIII es identica a la del vector de clonacion y expresion generico pASK75 (Skerra (1994) Gene 151:131-135). Se indican sitios de restriccion individuales.
(D) Tramo de secuencia de nucleotidos y aminoacidos (cadena superior/codificante SEQ ID NO: 29, cadena inferior/no codificante SEQ ID NO: 30, secuencia de aminoacidos codificada SEQ ID NO: 31) alrededor del extremo N-terminal de IFNa2b humano tal como se clona en pASK-IFNa2b (SEQ ID NO: 32). El sitio de restriccion individual SapI que puede usarse para la insercion de la secuencia que codifica para polfmero de Pro/Ala esta marcado (la secuencia de reconocimiento esta subrayada). Los dos aminoacidos C-terminales de Strep-tag II estan subrayados. El primer aminoacido de IFNa2b maduro esta marcado con +1.
(E) Tramo de secuencia de nucleotidos y de aminoacidos codificada (cadena superior/codificante SEQ ID NO: 33, cadena inferior/no codificante SEQ ID NO: 34, secuencia de aminoacidos codificada SEQ ID NO: 35) del extremo N- terminal de IFNa2b tras la insercion de un casete de secuencia de polfmero PA#1 tal como se muestra en la figura 1. El sitio de restriccion individual SapI, que permanece tras la insercion de la secuencia que codifica para polfmero de Pro/Ala, esta marcado (las secuencias de reconocimiento estan subrayadas). El primer aminoacido de IFNa2b como parte de la protema de fusion esta marcado (1) y los dos aminoacidos C-terminal de Strep-tag II estan subrayados. La ligacion/insercion similar de 10 casetes de secuencia de polfmero PA#1 repetidos dio como resultado el vector de plasmido pPA#1(200)-IFNa2b que codifica para un polfmero/polipeptido con 200 residuos (SEQ ID NO: 36).
(F) Mapa de plasmido de pPA#1(200)-IFNa2b (SEQ ID NO: 37). El gen estructural para la protema biologicamente activa PA#1(200)-IFNa2b (que comprende el peptido senal OmpA bacteriano, Strep-tag II, el segmento de polfmero/polipeptido PA#1 con 200 residuos, e IFNa2b humano) esta bajo el control transcripcional del promotor/operador de tetraciclina (tetp/o) y termina con el terminador de lipoprotema (tlpp). La estructura principal de plasmido fuera del casete de expresion flanqueado por los sitios de restriccion XbaI y HindIII es identica a la del vector de clonacion y expresion generico pASK75 (Skerra (1994), citado anteriormente). Se indican sitios de restriccion individuales.
Figura 3. Analisis del fragmento Fab recombinante purificado y del IFNa2b recombinante purificado asf como sus fusiones de polipeptido/polfmero de Pro/Ala mediante SDS-PAGE.
Las protemas recombinantes se produjeron en E. coli KS272 (Strauch (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1576-80) mediante secrecion periplasmica y se purificaron por medio de la cola de His6 (Fab) o Strep-tag II (IFNa2b) usando cromatograffa de metal inmovilizado o de afinidad por estreptavidina, respectivamente.
(A) Analisis del Fab recombinante purificado y su fusion con PA#1 con 200 residuos mediante SDS-PAGE al 12%. El gel muestra muestras de protema de 2 pg de cada uno de Fab y Fab-PA#1(200). Las muestras a la izquierda se redujeron con 2-mercaptoetanol mientras que las muestras repetidas a la derecha se dejaron sin reducir. En el margen izquierdo se indican marcadores de tamano de protema (aplicados en condiciones reductoras). Tras la reduccion del puente disulfuro entre cadenas el fragmento Fab y su fusion con PA#1 de 200 residuos aparecen como dos bandas homogeneas. En el caso del fragmento Fab reducido, las dos bandas con tamanos moleculares de cerca de 24 y 26 kDa, respectivamente, corresponden a las LC y HC separadas. En el caso de la protema de fusion Fab-PA#1(200) reducida la banda a 24 kDa corresponde a la HC, mientras que la banda a cerca de 90 kDa corresponde a la LC fusionada con el segmento de polipeptido PA#1(200). En condiciones no reductoras, el fragmento Fab y su fusion con PA#1(200) aparecen como bandas homogeneas individuales con tamanos moleculares aparentes de cerca de 45 kDa y 100 kDa, respectivamente. Los dos valores de tamano aparentes para
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
la protema de fusion Fab-PA#1(200) son significativamente mayores que las masas calculadas de 64,3 kDa para Fab-PA#1(200) no reducida y de 39,1 kDa para LC-PA#1(200) aislada. Este efecto se debe a la adicion del segmento de poKmero/polipeptido de Pro/Ala porque el propio fragmento Fab, con una masa calculada de 48,0 kDa, o su cadena ligera sin fusionar muestran movilidad electroforetica esencialmente normal.
(B) Analisis del IFNa2b recombinante purificado y su protema de fusion con PA#1 con 200 residuos mediante SDS- PAGE al 12%. El gel muestra muestras de protema de 2 |ig de cada uno de IFNa2b y de PA#1(200)-IFNa2b. Las muestras a la izquierda se redujeron con 2-mercaptoetanol mientras que las muestras correspondientes a la derecha se dejaron sin reducir. En el margen izquierdo se indican marcadores de tamano de protema (aplicados en condiciones reductoras). Las dos protemas aparecen como bandas homogeneas individuales con tamanos moleculares aparentes de cerca de 20 kDa y cerca de 80 kDa en la forma reducida. Este ultimo valor es significativamente mayor que la masa calculada de 37,0 kDa para PA#1(200)-IFNa2b. Este efecto se debe a la adicion del segmento de polfmero/polipeptido de Pro/Ala porque el propio IFNa2b, con una masa calculada de 20,9 kDa, muestra movilidad electroforetica esencialmente normal. IFNa2b en el estado no reducido tiene una movilidad electroforetica ligeramente superior, indicando una forma mas compacta como resultado de sus dos puentes disulfuro intramoleculares.
Figura 4. Analisis cuantitativo de los volumenes hidrodinamicos del Fab recombinante purificado e IFNa2b asf como sus fusiones con PA#1(200).
(A) Cromatograffa de exclusion molecular analffica (SEC) de Fab y Fab-PA#1(200). Se aplicaron 250 |il de la protema purificada a una concentracion de 0,25 mg/ml a una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con tampon PBS. Se monitorizo la absorcion a 280 nm y se normalizo el pico de cada ejecucion de cromatograffa a un valor de 1. La flecha indica el volumen inicial de la columna (7,8 ml).
(B) Curva de calibracion para los cromatogramas de (A) usando una columna Superdex S200 10/300 GL. El logaritmo del peso molecular (PM) de protemas marcadoras (citocromo c, 12,4 kDa; anhidrasa carbonica, 29,0 kDa; ovoalbumina, 43,0 kDa; albumina serica bovina, 66,3 kDa; alcohol deshidrogenasa, 150 kDa, p-amilasa, 200 kDa, apo-ferritina, 440 kDa) se represento graficamente frente a sus volumenes de elucion (drculos negros) y se ajusto mediante una lmea recta. A partir de los volumenes de elucion observados del fragmento Fab y su protema de fusion con PA#1 (cuadrados negros) se determinaron sus tamanos moleculares aparentes de la siguiente manera. Fab: 31 kDa (masa autentica: 48,0 kDa); Fab-PA#1(200): 237 kDa (masa autentica: 64,3 kDa). Estos datos muestran que la fusion con el polipeptido PA#1 confiere un volumen hidrodinamico muy ampliado.
(C) Cromatograffa de exclusion molecular analffica de IFNa2b y PA#1(200)-IFNa2b. Se aplicaron 250 |il de cada protema purificada a una concentracion de 0,25 mg/ml a una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con solucion salina tamponada con fosfato, PBS. Se monitorizo la absorcion a 280 nm y se normalizo el pico de cada ejecucion de cromatograffa a un valor de 1. La flecha indica el volumen inicial de la columna (7,8 ml).
(D) Curva de calibracion para el cromatograma de (C) usando una columna Superdex S200 10/300 GL. El logaritmo del peso molecular (PM) de protemas marcadoras (vease B) se represento graficamente frente a sus volumenes de elucion (cffculos negros) y se ajusto mediante una lmea recta. A partir de los volumenes de elucion observados de IFNa2b y su protema de fusion con PA#1 (cuadrados negros) se determinaron sus tamanos moleculares aparentes de la siguiente manera. IFNa2b: 22,5 kDa (masa autentica: 20,9 kDa); PA#1(200)-IFNa2b: 229,0 kDa (masa autentica: 37,0 kDa). Estos datos muestran que la fusion con el polipeptido PA#1 confiere un volumen hidrodinamico muy ampliado.
Figura 5. Analisis de estructura secundaria experimental de protemas recombinantes y sus fusiones con polfmero/polipeptido PA#1 mediante espectroscopfa de dicrofsmo circular (CD).
Se registraron espectros a temperatura ambiente en K2SO4 50 mM, fosfato de K 20 mM pH 7,5 y se normalizaron a la elipticidad molar, ©m, para cada protema.
(A) Espectros de CD del Fab recombinante purificado y Fab-PA#1(200). El espectro de CD para el fragmento Fab muestra las caracteffsticas ffpicas de una protema de laminas p predominante con un maximo negativo ancho alrededor de 216 nm (Sreerama en: Circular Dichroism - Principles and Applications (2000) Berova, Nakanishi y Woody (Eds.) Wiley, Nueva York, NY, pags. 601-620), lo que indica el plegamiento correcto del fragmento Fab producido de manera bacteriana. El espectro de su protema de fusion con el polfmero/polipeptido de Pro/Ala revela una banda negativa dominante por debajo de 200 nm, lo cual es indicativo de una conformacion de enrollamiento al azar. Ademas, hay un hombro alrededor de 220 nm, que resulta de la contribucion de laminas p del fragmento Fab e indica su plegamiento correcto incluso como parte de la protema de fusion.
(B) Espectro de CD de diferencia molar para Fab-PA#1(200) obtenido mediante sustraccion del espectro para el fragmento Fab. El espectro de CD de diferencia representa la estructura secundaria del segmento de polfmero/polipeptido PA#1 de 200 residuos y revela un fuerte mmimo alrededor de 200 nm, lo cual es una clara indicacion de una conformacion de enrollamiento al azar en la disolucion acuosa tamponada (Greenfield (1969) Biochemistry 8: 4108-4116; Sreerama (2000), citado anteriormente; Fandrich (2002) EMbO J. 21:5682-5690).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(C) Espectros de CD del IFNa2b recombinante purificado y PA#1(200)-IFNa2b. El espectro de CD para IFNa2b muestra las caractensticas tfpicas de una protema de helice a predominate con dos bandas negativas alrededor de 208 nm y 220 nm (Sreerama (2000), citado anteriormente), lo cual indica el plegamiento correcto del IFNa2b humano producido de manera bacteriana. El espectro de su protema de fusion con el polfmero/polipeptido de Pro/Alar revela desviaciones caractensticas con un mmimo dominante alrededor de 200 nm, lo cual es indicativo de una conformacion de enrollamiento al azar. Ademas, hay un hombro alrededor de 220 nm, que resulta de la contribucion de helices a de IFNa2b e indica el plegamiento correcto del IFNa2b incluso como parte de la protema de fusion.
(D) Espectro de CD de diferencia molar para PA#1(200)-IFNa2b obtenido mediante sustraccion del espectro para IFNa2b. El espectro de CD de diferencia representa la estructura secundaria del segmento de polfmero/polipeptido PA#1 de 200 residuos y revela un fuerte mmimo alrededor de 200 nm, esencialmente identico al mostrado en (B). De nuevo, esto es una clara indicacion de una conformacion de enrollamiento al azar en disolucion acuosa tamponada para un polfmero biologico que comprende residuos de Pro y Ala segun la invencion.
Figura 6. Produccion secretora de una protema de fusion entre hormona del crecimiento humana (hGH) y el polfmero PA#1 geneticamente codificado en celulas CHO.
(A) Tramo de secuencia de nucleotidos y aminoacidos (cadena superior/codificante SEQ ID NO: 38, cadena inferior/no codificante SEQ ID NO: 39, secuencia de aminoacidos codificada SEQ ID NO: 40) alrededor del extremo N-terminal de hGH tal como se clona en pASK75-His6-hGH (SEQ ID NO: 41). Los sitios de restriccion individuales Nhel, que puede usarse junto con HindIII (no mostrado) para la subclonacion, y SapI, que puede usarse para la insercion de la secuencia que codifica para polfmero de Pro/Ala, estan marcados (la secuencia de reconocimiento esta subrayada). Los seis aminoacidos de la cola de His6 estan subrayados. El primer aminoacido de hGH esta marcado con +1.
(B) Secuencia de nucleotidos y de aminoacidos codificada (cadena superior/codificante SEQ ID NO: 42, cadena inferior/no codificante SEQ ID NO: 43, secuencia de aminoacidos codificada SEQ ID NO: 44) del extremo N-terminal de hGH tras la insercion de un casete de secuencia de polfmero PA#1 tal como se muestra en la figura 1. Los sitios de restriccion individuales NheI, que puede usarse para la subclonacion, y SapI, que permanece tras la insercion de la secuencia que codifica para polfmero de Pro/Ala, estan marcados (las secuencias de reconocimiento estan subrayadas). El primer aminoacido de hGH como parte de la protema de fusion esta marcado (1) y los aminoacidos de la cola de His6 estan subrayados. La ligacion/insercion similares de 10 casetes de secuencia de polfmero PA#1 repetidos dieron como resultado el vector de plasmido pASK75-His6-PA#1(200)-hGH que codifica para la protema de fusion madura SEQ ID NO: 45).
(C) Mapa de plasmido de pASK75-His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 46). El gen estructural para la protema biologicamente activa His6-PA#1(200)-hGH (que comprende el peptido senal OmpA bacteriano, la cola de His6, el segmento de polfmero/polipeptido PA#1 con 200 residuos, y GH humana) esta bajo el control transcripcional del promotor/operador de tetraciclina (tetp/o) y termina con el terminador de lipoprotema (tlpp). La estructura principal de plasmido fuera del casete de expresion flanqueado por los sitios de restriccion XbaI y HindIII es identica a la del vector de clonacion y expresion generico pASK75 (Skerra (1994), citado anteriormente). Se indican sitios de restriccion individuales.
(D) Mapa de plasmido de pCHO-PA#1(200)-hGH, que codifica para una protema de fusion His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 47). El gen estructural, que comprende el peptido senal de hormona del crecimiento humana (Sp), la cola de His6, la secuencia de polfmero/polipeptido PA#1 con 200 residuos (PA#1(200)), la hormona del crecimiento humana (hGH), y que contiene la senal de poliadenilacion de hormona del crecimiento bovina (bGH pA), esta bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMVp). Los sitios de restriccion individuales NheI y HindIII estan indicados. El gen de resistencia para neomicinfosfotransferasa (neo) esta bajo el control del promotor de SV40 (SV40p) y seguido por una senal de poliadenilacion de SV40 (SV40 pA). Ademas, el plasmido contiene el origen de replicacion de ColE1 bacteriano (ColEl-ori), el origen de replicacion de bacteriofago f1 (f1-ori), y el gen de p- lactamasa (bla) para permitir la propagacion y seleccion en E. coli.
(E) Analisis de inmunotransferencia de tipo Western de una protema de fusion entre hGH y el polfmero PA#1 geneticamente codificado de 200 residuos producido en celulas CHO en comparacion con hGH recombinante. Se transfectaron celulas CHO-K1 o bien con pCHO-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 48) o bien con pCHO-hGH (SEQ ID NO: 49), un plasmido similar que codifica para hGH sin la secuencia de PA#1(200) (pero que tambien porta la cola de His6). Dos dfas tras la transfeccion, se sometio una muestra del sobrenadante de cultivo celular a SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western con un anticuerpo anti-hGH conjugado con peroxidasa del rabano. Las dos protemas aparecen como bandas individuales indicadas por flechas, con tamanos moleculares aparentes de cerca de 23 kDa (His6-hGH) y cerca de 90 kDa (His6-PA#1-hGH). Tambien hay una banda debil alrededor de 60 kDa que surge de protemas sericas en el medio de cultivo. Aunque la hGH marcada con cola de His6 aparece a la masa calculada de 23,5 kDa, el tamano molecular aparente de His6-PA#1-hGH es significativamente mayor que su masa calculada de 39,5 kDa. Este efecto se debe a la naturaleza hidrofila de enrollamiento al azar del polfmero de Pro-Ala.
Figura 7. Prediccion teorica de la estructura secundaria para la secuencia de polipeptido/polfmero de Pro/Ala PA#1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Esta ilustracion muestra el resultado del algoritmo informatico CHOFAS segun el metodo de Chou-Fasman (Chou y Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245) tal como se implementa en el servidor de comparacion de secuencias y prediccion de estructura secundaria en la Universidad de Virginia (URL:
http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2). Para evitar efectos de ffmite en los extremos amino y carboxilo-terminales, se pego la repeticion de aminoacidos de 20 meros segun la figura 1 en tres copias consecutivas (dando como resultado un concatemero similar al codificado tras la ligacion/insercion repetida del casete genico sintetico) y solo se considero el resultado para el bloque de secuencia de 20 meros central (en recuadro). En el caso de la secuencia/segmento de polipeptido PA#1 (SEQ ID NO: 1), el algoritmo de Chou-Fasman predice una estructura secundaria en helices a al 100%. Esto contrasta con la conformacion de enrollamiento al azar predominante observada de manera experimental para el segmento de polipeptido/polipeptido PA#1 como parte de una protema de fusion (vease la figura 5B/D).
Figura 8: Analisis cuantitativo de la farmacocinetica del fragmento Fab recombinante purificado y sus fusiones con polfmero PA#1 con 200 y 600 residuos en ratones BALB/c.
Se sometieron a ensayo muestras de plasma del ejemplo 16 para determinar concentraciones de Fab, Fab- PA#1(200) y Fab-PA#1(600) usando un ELISA de tipo sandwich. Para estimar la semivida en plasma de Fab, Fab- PA#1 (200) y Fab-PA#1(600), se representaron graficamente los valores de concentracion medidos frente al tiempo tras la inyeccion intravenosa y se ajustaron numericamente suponiendo una disminucion biexponencial. El fragmento Fab sin fusionar mostro un aclaramiento muy rapido con una semivida de eliminacion de 1,3 ± 0,1 h. En cambio, la fase de eliminacion determinada para Fab-PA#1(200) y Fab-PA#1(600) fue significativamente mas lenta, con semividas terminales de 4,1 ± 1,8 h y 38,8 ± 11,2 h, respectivamente, demostrando por tanto una circulacion prolongada cerca de 3 veces y cerca de 30 veces debido a la fusion con polfmero de Pro/Ala con 200 o 600 residuos en comparacion con el fragmento Fab sin fusionar.
Figura 9: Analisis del fragmento Fab recombinante purificado como fusion con el polfmero P1A1 o P1A3 que tiene 200 residuos.
Las protemas recombinantes se produjeron en E. coli KS272 mediante secrecion periplasmica y se purificaron por medio de la cola de His6 usando cromatograffa de afinidad de metal inmovilizado. Se analizaron las protemas purificadas mediante SDS-PAGE al 12%. El gel muestra muestras de protema de 2 |ig de cada uno de Fab- P1A1(200) y Fab-P1A3(200) asf como, para comparacion, del fragmento Fab sin fusionar (vease la figura 3A). Las muestras a la izquierda se redujeron con 2-mercaptoetanol mientras que las muestras analogas a la derecha se dejaron sin reducir. En el margen izquierdo se indican marcadores de tamano de protema (aplicados en condiciones reductoras). Tras la reduccion de los puentes disulfuro entre cadenas, el fragmento Fab y sus fusiones con Pro/Ala de 200 residuos aparecen como dos bandas homogeneas. En el caso del fragmento Fab reducido, las dos bandas con tamanos moleculares de cerca de 24 y 26 kDa, respectivamente, corresponden al fragmento de cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) separadas. En el caso de la protema de fusion Fab-P1A1(200) reducida, la banda a 24 kDa corresponde a la HC, mientras que la banda a cerca de 90 kDa corresponde a la LC fusionada con el polipeptido P1A1(200). En el caso de la protema de fusion Fab-P1A3(200) reducida, la banda a 24 kDa corresponde a la HC, mientras que la banda a cerca de 75 kDa corresponde a la LC fusionada con el polipeptido P1A5(200). En condiciones no reductoras, el fragmento Fab, su fusion con P1A1(200) y con P1A3(200) aparecen como bandas prominentes individuales con tamanos moleculares aparentes de cerca de 45 kDa, 110 kDa y 90 kDa, respectivamente. Los tamanos aparentes para las protemas de fusion Fab-P1A1(200) y Fab-P1A3(200) son significativamente mas grandes que las masas calculadas de 65,3 kDa para Fab-P1A1(200) sin reducir y de 64,0 kDa para la Fab-P1A3(200) sin reducir. Ademas, los tamanos aparentes para las cadenas ligeras reducidas correspondientes son significativamente mas grandes que las masas calculadas de 40,7 kDa para la LC de P1A1(200) y de 39,4 kDa para la LC de P1A3(200). Este efecto se debe a la adicion del segmento de poffmero/polipeptido de Pro/Ala porque el propio fragmento Fab, con una masa calculada de 48,0 kDa, o su cadena ligera sin fusionar, con una masa calculada de 23,4 kDa, muestran movilidad electroforetica esencialmente normal.
Figura 10. Analisis cuantitativo de los volumenes hidrodinamicos de las protemas de fusion Fab recombinante purificado-P1A1(200) y Fab-P1A3(200).
Cromatograffa de exclusion molecular analffica (SEC) de Fab-P1A1(200) y Fab-P1A3(200). Se aplicaron 250 |il de la protema purificada a una concentracion de 0,25 mg/ml a una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con PBS. Se monitorizo la absorcion a 280 nm y se normalizo el pico de cada ejecucion de cromatograffa a un valor de 1. La flecha indica el volumen inicial de la columna (7,8 ml). A partir de los volumenes de elucion observados de las protemas de fusion se determinaron sus tamanos moleculares aparentes usando una curva de calibracion similar tal como se muestra en la figura 4B de la siguiente manera. Fab-P1A1(200): 180,7 kDa (masa autentica: 65,3 kDa); Fab-P1A3(200): 160,2 kDa (masa autentica: 64,0 kDa). Estos datos muestran que la fusion de una protema con el polipeptido P1A1 y/o P1A5 confiere un volumen hidrodinamico muy ampliado.
Figura 11. Analisis de estructura secundaria experimental de fusiones Fab-P1A1(200) y Fab-P1A3(200) mediante espectroscopfa de dicrofsmo circular (CD).
Se registraron espectros a temperatura ambiente en K2SO4 50 mM, fosfato de K 20 mM pH 7,5 y se normalizaron a la elipticidad molar, ©m, para cada protema.
(A) Espectros de CD de Fab recombinante purificado-P1A1(200) y Fab-P1A3(200). Los espectros de CD de las protemas de fusion de Fab con ambos poKmeros/polipeptidos de Pro/Ala revelan cada uno una banda negativa dominante por debajo de 200 nm, lo cual es indicativo de una conformacion de enrollamiento al azar. Ademas, hay un hombro alrededor de 220 nm, que surge de la contribucion de laminas p del fragmento Fab e indica su
5 plegamiento correcto incluso como parte de la protema de fusion.
(B) Espectros de CD de diferencia molar para Fab-P1A1(200) y Fab-P1A3 (200) obtenidos mediante sustraccion del espectro para el fragmento Fab sin fusionar (vease la figura 5A). Los espectros de CD de diferencia representan las estructuras secundarias de los segmentos de polfmero/polipeptido P1A1 (SEQ ID NO: 51) y P1A3 (SEQ ID NO: 3) de 200 residuos, respectivamente, y revelan un fuerte mmimo alrededor de 200 nm, lo cual es una clara indicacion
10 de su conformacion de enrollamiento al azar en la disolucion acuosa tamponada (Greenfield (1969) Biochemistry 8: 4108-4116; Sreerama (2000), citado anteriormente; Fandrich (2002) EMbO J. 21:5682-5690).
Figura 12: Preparacion de un polfmero/polipeptido de Pro/Ala biosintetico aislado.
(A) Mapa de plasmido de pSUMO-PA#1(200) (SEQ ID NO: 60). El gen estructural para la protema de fusion MKHis(6)-SUMO-PA#1(200) que comprende un codon de iniciacion de metionina seguido por un codon de lisina, 15 una cola de afinidad N-terminal de seis residuos de His consecutivos, la protema modificador similar a ubiquitina pequeno (SUMO) escindible Smt3p (Panavas (2009) Methods Mol Biol. 497: 303-17), y el segmento de polfmero/polipeptido PA#1 con 200 residuos (SEQ ID NO: 60) esta bajo el control transcripcional del promotor de gen 10 del bacteriofago T7 y termina con el terminador t^. Los elementos de plasmido adicionales comprenden el origen de replicacion (ori), el gen de resistencia a ampicilina (bla), y el origen de replicacion de f1. La estructura 20 principal de plasmido fuera del casete de expresion flanqueado por los sitios de restriccion NdeI y HindIII es identica, excepto por un sitio de restriccion SapI que se elimino mediante mutacion silenciosa, a la del vector de clonacion y expresion generico pRSET5a (Schoepfer (1993) 124: 83-85).
SEQ ID NO: 60 se proporciona en la lista de secuencias adjunta (que tambien forma parte de esta descripcion y memoria descriptiva) y se reproduce a continuacion en el presente documento.

Claims (22)

1.
10 2.
3.
15 4.
5.
20
25
30
6.
35
7. 40
8. 45
REIVINDICACIONES
Conjugado de farmaco que comprende
(i) un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), y
(ii) un farmaco seleccionado del grupo que consiste en (a) una protema biologicamente activa o un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o media en una actividad biologica y (b) un farmaco de molecula pequena.
Conjugado de farmaco segun la reivindicacion 1, en el que dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que consiste en de aproximadamente 50 a aproximadamente 3000 residuos de aminoacido.
Conjugado de farmaco segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dichos residuos de prolina constituyen mas de aproximadamente el 10% y menos de aproximadamente el 75% de la secuencia de aminoacidos.
Conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido comprende una pluralidad de repeticiones de aminoacidos, en el que dicha repeticion consiste en residuos de prolina y alanina y en el que no mas de 6 residuos de aminoacido consecutivos son identicos.
Conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en
AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1);
AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP(SEQ ID NO: 2);
AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3);
AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4);
APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5);
AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6); y
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51)
o versiones permutadas circulares o (a) multimero(s) de estas secuencias en su conjunto o partes de estas secuencias.
Conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polipeptido con actividad biologica, dicha protema biologicamente activa o dicho polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad biologica se selecciona del grupo que consiste en protemas de union, fragmentos de anticuerpo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas.
Conjugado de farmaco segun la reivindicacion 6, en el que dicho polipeptido con actividad biologica es una protema de union y en el que dicha molecula de union se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, compuestos peptidomimeticos derivados de CDR, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio, lectinas, dominios de inmunoglobulina, dominios de fibronectina, dominios de protema A, dominios SH3, dominios de repeticion de anquirina y lipocalinas.
Conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha protema biologicamente activa se selecciona del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos, hormona del crecimiento humana, alfa-interferon, beta-interferon, gamma-interferon, factor de necrosis tumoral, eritropoyetina, factor de coagulacion VIII, gp120/gp160, receptor de factor de necrosis tumoral I y II soluble, reteplasa, exendina-4, anakinra, interleucina-2, lipocalina asociada a gelatinasa de neutrofilos, hormona estimulante del folmulo, glucocerebrosidasa, timosina alfa 1, glucagon, somatostatina, adenosina desaminasa, interleucina 11, factor de coagulacion VIIA, factor de coagulacion IX, Hematide, lambda-interferon, leptina, subunidad alfa de receptor de interleucina-22 (IL-22ra), interleucina-22, hialuronidasa, factor de crecimiento de fibroblastos 18, factor de crecimiento de fibroblastos 21, peptido similar a glucagon 1, osteoprotegerina, protema de union a IL-18, factor de liberacion de la hormona del
5 10.
10
11.
12.
13.
15
14.
20
25
30 15.
16.
35
17.
18.
19.
40
45
50 20.
crecimiento, receptor de TACI soluble, trombospondina-1, receptor de VEGF soluble Flt-1 y mutema de IL-4.
Conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, mediante el cual dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido media en una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada de dicho conjugado de farmaco.
Conjugado de farmaco segun la reivindicacion 9, en el que dicha estabilidad in vivo aumentada es una semivida en plasma prolongada de dicho conjugado de farmaco que comprende dicho polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala), en comparacion con la estabilidad de un polipeptido de control o un conjugado de control que carece de dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido.
Composicion que comprende el conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10. Composicion segun la reivindicacion 11, que es una composicion farmaceutica.
Molecula de acido nucleico que codifica para un conjugado de protema que comprende una protema biologicamente activa segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y que comprende un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala).
Molecula de acido nucleico que codifica para un conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicha molecula de acido nucleico
(i) una secuencia de acido nucleico que codifica para una secuencia de aminoacidos y/o lfder traducida;
(ii) una secuencia de acido nucleico que codifica para un polipeptido de enrollamiento al azar biosintetico o segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que consiste unicamente en residuos de aminoacido de prolina y alanina, en el que dicha secuencia de aminoacidos consiste en al menos 50 residuos de aminoacido de prolina (Pro) y alanina (Ala);
(iii) una secuencia de acido nucleico que codifica para una protema biologicamente activa o un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad biologica y/o terapeutica; y
(iv) una secuencia de acido nucleico que representa o es un codon de terminacion de la traduccion.
Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 14, en el que las partes o segmentos de molecula de acido nucleico segun se definen en (ii) y en (iii) intercambian su posicion en dicha molecula de acido nucleico que codifica para un conjugado de farmaco.
Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 14 o 15, que comprende opcionalmente, entre partes o segmentos segun se definen en (i) y en (ii) y/o entre partes o segmentos segun se definen en (ii) y (iii), un sitio de escision por proteasa y/o qmmica y/o un sitio de reconocimiento.
Vector que comprende el acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
Celula huesped que comprende el acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 o el vector segun la reivindicacion 17.
Metodo para la preparacion de un polipeptido de enrollamiento al azar o un segmento de polipeptido de enrollamiento al azar segun esta comprendido en el conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la preparacion de la protema biologicamente activa o un conjugado de farmaco que comprende dicho polipeptido de enrollamiento al azar o dicho segmento de polipeptido de enrollamiento al azar y/o para la preparacion de un polipeptido que comprende o que es una secuencia de aminoacidos que tiene o que media en una actividad biologica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y que comprende adicionalmente dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar,
comprendiendo dicho metodo cultivar la celula segun la reivindicacion 18 y aislar dicho polipeptido de enrollamiento al azar o protema biologicamente activa y/o dicha protema biologicamente activa o dicho polipeptido a partir del cultivo o a partir de dicha celula.
Conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, composicion segun la reivindicacion 11 o 12, acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, vector segun la reivindicacion 17, celula segun la reivindicacion 18, o protema biologicamente activa o polipeptido que
comprende dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido de enrollamiento al azar y segun se prepara mediante el metodo segun la reivindicacion 19, para su uso en el tratamiento de trastornos relacionados con carencia hormonal, enfermedad autoinmunitaria, trastornos proliferativos, cancer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas/inflamatorias, trastornos 5 alergicos, trombosis, infarto de miocardio, reestenosis, diabetes, esterilidad, enfermedad de Gaucher,
hepatitis B cronica, hepatitis C, hipoglucemia, acromegalia, carencia de adenosina desaminasa, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidad, enfermedad de Alzheimer, lipodistrofia, psoriasis, melanoma metastasico, osteoartritis, dislipidemia, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, asma, osteoporosis y lesion por reperfusion u otras enfermedades renales.
10 21. Conjugado de farmaco segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, composicion segun la
reivindicacion 11 o 12, acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, vector segun la reivindicacion 17 o celula segun la reivindicacion 18, para su uso como medicamento que tiene una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada de dicho polipeptido de enrollamiento al azar o segmento de polipeptido, protema biologicamente activa o conjugado de farmaco.
15
Fig Lira 1
gCcGCTCCAGCTGCACCTGCTCCAGCAGCACCTGCTGCACCAGCTCCGGCTGCTCCTGCT
II I I I I I I I ! t t 1 i I ! I I I I I I I J ! M I I I I I II I I I I I I I I Ml II M ! I I I t I I l
CGAG GT C GACGTG GAC G AGG T CGTCGTGG ACGACGTGGTCGAGG CCGACGAGGACGAcgg AlaAlaProAlaAlaProAlaFroAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAla
Figure 2 A
SapI SapI
\ \
AAGAG C TTCAACC GCG GAGAGTGCTCTTCTlGC C T GAAGAGCT TAAGC TT
+------------------+-------------------+------------------------,--------------+-----------------
T T CTGGAAGTTGGCGCCTCTCACGAGAAGACGQACTTCTCGAATTCGAA LysSerPheAsnArgGlyGluCysSerSerAlaEnd
B
5apl
Sapi
I
GAGT GCTCTTCljG CC GCTC C AGC TGCAC CTGCT C C AG C AG C ACC TGC TGC ACC AGC T CCG GCT GCTCCTGC T|GC C TGAAGAGCTT
C T CACGAGAAGACGjcGAG GTCG AC G T GG ACG AGGT C G T C GTG GACGACGT GGT CG AGGC CG ACG AG G AC GACGgIaCTTCTCGAA GluCysSerSerAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAla
imagen1
Figura 2 cont.
D
Sap I " I
GAAAAAGGCG CCAGCTCTTC Tfc CC T GT GATCTGCCTCAAACC CACAGCCTGGGTAGC.. .
--------+-------------------+-----------1—r+--------------------+-------------------+-------------------+ —
CTTTTTCCGC GGTCGAGAAGACG dftCACTAGACG G ACT TTGG GTGTC GGACCCATC G.. .
GluLvs G1yAla Ser Se rScrA1aCy sAspLe uProGinThr His Ser LeuG 1 ySe r ■ - .
+1
E
Sapi
i
GAAAAACGCGCCAGCTCTTCTpCCGCTCCAGCTGCACCTGCTCCAGCAGCACCTGCTGCACCAGCTCCGGCTGCTCCTGCTGCCTGTGAT
C TT TT TC CG CG GT CGAGAAGACGqCGAGGTCGACGTG GACGAGGTC GT CG TGGACGACGTGGTCGAGG CCGACGAGGACGACGGACACT A GluLysGlyAlaSerSerSerAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaCysAsp
(1)
imagen2
imagen3
imagen4
Fab
Fab-PApl (200}
0.8
0.6
0.4
0.2
vo umen de e uaon
[mi]
' occ
- 440 kDa
- Fab-PAsn(20Q) [spp. MW; 237 kDa;
200 kDa -
200
cal. MW: 64,3 kDa
50 kDa
— 100
66.3 kDa -
43,0 kDa - •
Fab {app. MW: 31 kDa; cal. MW: 48,0 kDa) -V 29,0 kDa
12.4 kDa -*
Volumen de elution [ml]
imagen5
PA#1(2l0Q)-lrNa2b
IFKia2b
Volume n de el ucio n ml
1COC
- 440 kDa
200 kDaV*PA#1(200)'IFMa2t> (app- MW: 229 KDa; ■
200
cal. MW: 37.0 kDa)
-150 kDa
100
66,3 kDa - •
43 kDa * ■
29 kDa
]FNa2b (app. MW: 19.6 kDa: cal. MW: 21.0 kDa) -
12.4 kDa
Vo I li men de elucion fml]
imagen6
imagen7
6x104
FNa2b
PA#1 (200)4 FNa2b
3x10
3x10
© -exio
-9x1
250
220
230
240
190
200
210
Longitua ae onda [nm]
u -4x10 -
-6x10
PA#1{200)
-8x104
240
250
200
210
220
230
J90
Longitud de onda [nm]
A
imagen8
Figura 6 cont. B
Whel SapI
I I
GCC GGTAGCC ATCACC AC CAT C AC CAT G GCGC CAGCTCTTCrf|GCCGCT C C AGC T GC ACC TGCT C C AGC AGC AC C TGC T G C ACCAGCTC C G CGGCGATCGCTAGTG GTG GT AGTG GTAC C GCGGTCGAGAAGAC G C3CC AC GTCGACGTGGAC GAG G TCGT CGTGGACGACG TGGTC GAGG C
AlaAl aSerHisHisHisHisHisHisGl YAlaSerSerSgrAlflAlaFroAlaAlaProAlaProAlaAlaProMaA) 3 ProAlaPto
GCTGCTCCTGCTGCCTTCCCAACC..,
cgacgaggacgacggaagggttgg..,
AlaAlaProAlaAlaPheProThr„..
(1)
imagen9
imagen10
imagen11
GnSflcodeChtou-Fasman, &Q an:

AA P AA PA PAAFAA PA F AA F AfrlAF A A PA PA A P AA PAP AA P AjA A P A AP A PA APAA PAP AA P A h£lice -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------->
l&mlna
gircs

Residues totaEes : H: b 9 E: 0 T:

porcentaje : H: 98,3 E: 0,0 T:
0
0,0
imagen12
Asad (normalizada)
o o o o o w u cn oo
imagen13
feducido sin redutir
to
o
N5
o> -E* —1h
co cn
<Jl rji OJ
4^ o ■ i
Cf • o » M i 0 1
1 i | i=
£ i Wj
|
1 1
imagen14
%
/0 <4,
\%
*4 %
%
S\
V
%
*?
CD
ASfa [deg cm2 nmmo!"f] ©u [deg cm2 rimmaf1!
imagen15
190 200 210 220 230 240 250
Longitud cfe onda [nm]
imagen16
190 200 210 220 230 240 250
Longitud de onca [nm]
imagen17
PA#1(20G)
pSUM0-PA#1 (200)
His-SUMO
kDa
116,G —
SUMO-PA#1(2uOj
66,3 —
45,0 —
35,0 —
25,0 —
18,4
SUMO
14.4
1: SUMO"PA#1 200) antes de la escisidn
2 SUMO-PA#! (200) escindidooon SUMOprotease
imagen18
Ffg. 13
A
SUMOPA#1 (200)
A
200
SUMO-PA#1(200)
(escindido)
0,4
2S0
SUMO-PA#1 (200)
22?
(escmdido. acoplado )
PiKjfjtatfa por I MAC Fluoresoelna-
PA#1(200)
22?
Volumen de etucidn [mil
Absorcion Absorcitin Absorcion
imagen19
imagen20
Vr
imagen21
22$
494
“ A
-■A
A
260
As
225
V)4
Absorclbn Absoncibn Absoncion Absarcion
imagen22
imagen23
imagen24
imagen25
250 300 350 400 450 500 550 600
Longltuti do onda [nm]
imagen26
SUMOPAffl{200)
PA#1 (200) & Fluonescefna -PA#1(200)
100
SUMO
-uoresceina
Vblurmen de elucitirr [nil]
16671,4
100^
Cigoxigenina -PA#1 (200)
i ■ ; HIM,#
nwij i
masa
30000
22000
26000
14000
16000
10000
imagen27
ES11725656.0T 2010-05-21 2011-05-20 Polipéptidos de enrollamiento al azar de prolina/alanina biosintéticos y sus usos Active ES2691642T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10163564 2010-05-21
EP10163564 2010-05-21
US201061428016P 2010-12-29 2010-12-29
US201061428016P 2010-12-29
PCT/EP2011/058307 WO2011144756A1 (en) 2010-05-21 2011-05-20 Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2691642T3 true ES2691642T3 (es) 2018-11-28

Family

ID=42629445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11725656.0T Active ES2691642T3 (es) 2010-05-21 2011-05-20 Polipéptidos de enrollamiento al azar de prolina/alanina biosintéticos y sus usos

Country Status (19)

Country Link
US (3) US9221882B2 (es)
EP (2) EP2571510B1 (es)
JP (2) JP5828889B2 (es)
KR (1) KR101872541B1 (es)
CN (2) CN102883734B (es)
AU (1) AU2011254564B2 (es)
BR (1) BR112012029577B1 (es)
CA (1) CA2794614C (es)
DK (1) DK2571510T3 (es)
EA (1) EA024755B1 (es)
ES (1) ES2691642T3 (es)
HK (1) HK1219902A1 (es)
LT (1) LT2571510T (es)
MX (2) MX338914B (es)
NZ (1) NZ602522A (es)
PL (1) PL2571510T3 (es)
SG (1) SG185440A1 (es)
SI (1) SI2571510T1 (es)
WO (1) WO2011144756A1 (es)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102883734B (zh) 2010-05-21 2018-01-02 Xl-蛋白有限责任公司 生物合成的脯氨酸/丙氨酸无规卷曲多肽及其用途
CA2843504C (en) * 2011-08-12 2020-08-25 Ascendis Pharma A/S Protein carrier-linked prodrugs
CN117462693A (zh) 2012-02-27 2024-01-30 阿穆尼克斯运营公司 Xten缀合组合物和制造其的方法
CA2869460C (en) 2012-04-04 2018-05-15 Halozyme, Inc. Combination therapy with an anti-hyaluronan agent and a tumor-targeted taxane
US10066007B2 (en) 2013-01-22 2018-09-04 Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) Dipeptide-repeat proteins as therapeutic target in neurodegenerative diseases with hexanucleotide repeat expansion
JP6259209B2 (ja) * 2013-06-17 2018-01-10 雪印メグミルク株式会社 コラーゲン産生促進剤
JP6259208B2 (ja) * 2013-06-17 2018-01-10 雪印メグミルク株式会社 ヒアルロン酸産生促進剤
JP6259207B2 (ja) * 2013-06-17 2018-01-10 雪印メグミルク株式会社 エラスチン産生促進剤
WO2015067791A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Ascendis Pharma Relaxin Division A/S Relaxin prodrugs
US9618507B2 (en) 2014-02-24 2017-04-11 Betanien Hospital Methods of treating rheumatoid arthritis
US9975929B2 (en) 2014-03-05 2018-05-22 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect
PL228341B1 (pl) * 2014-04-21 2018-03-30 Bio Ventures Inst Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu
EP3185881B1 (en) * 2014-08-26 2022-03-09 Betanien Hospital Methods, agents and compositions for treatment of inflammatory conditions
ES2896971T3 (es) 2014-11-21 2022-02-28 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Formas de administración de hormona del crecimiento de acción prolongada
JP6983075B2 (ja) 2015-06-02 2021-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス 極性の組換え延長部を有するインスリン
TW201718627A (zh) 2015-06-11 2017-06-01 梅茲製藥有限兩合公司 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞
EP3347874B1 (en) * 2015-09-09 2021-05-12 Technische Universiteit Eindhoven Imaging of dispersion and velocity of contrast agents
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
EP3359577A4 (en) * 2015-10-08 2019-04-17 The Governors of the University of Alberta HEPATITIS C VIRUS E1 / E2 HETERODIMERS AND METHODS OF PRODUCING THE SAME
US11401305B2 (en) * 2015-12-22 2022-08-02 Xl-Protein Gmbh Nucleic acids encoding repetitive amino acid sequences rich in proline and alanine residues that have low repetitive nucleotide sequences
US11123405B2 (en) 2015-12-23 2021-09-21 The Johns Hopkins University Long-acting GLP-1R agonist as a therapy of neurological and neurodegenerative conditions
WO2017118700A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with increased nep stability
AU2017205273C1 (en) 2016-01-08 2022-12-01 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release CNP agonists with reduced side-effects
EP3400020A1 (en) 2016-01-08 2018-11-14 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with large carrier moieties
PL3400019T3 (pl) 2016-01-08 2023-01-23 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Proleki cnp z przyłączeniem nośnika w ugrupowaniu pierścieniowy
SG11201805026SA (en) 2016-01-08 2018-07-30 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with low npr-c binding
NZ743488A (en) 2016-01-08 2023-02-24 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with low initial npr-b activity
ES2929347T3 (es) 2016-01-20 2022-11-28 Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con aumento de la duración del efecto
EP3423103A1 (en) 2016-03-01 2019-01-09 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Pth prodrugs
KR20180114891A (ko) 2016-03-02 2018-10-19 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물
US11306130B2 (en) 2016-04-01 2022-04-19 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona PAR3 mimetic peptides and uses thereof
EP3452097A1 (en) * 2016-05-04 2019-03-13 Navigo Proteins GmbH Targeted compounds for the site-specific coupling of chemical moieties comprising a peptide linker
WO2018011266A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Ascendis Pharma A/S Conjugation method for carrier-linked prodrugs
CN117257922A (zh) 2016-09-29 2023-12-22 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 具有低峰-谷比的pth化合物
CN109843295B (zh) 2016-09-29 2022-04-05 阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司 控释cnp激动剂的组合疗法
JP7039574B2 (ja) 2016-09-29 2022-03-22 アセンディス ファーマ ボーン ディジージズ エー／エス 放出制御ｐｔｈ化合物の漸増用量設定
CN109789189B (zh) 2016-09-29 2024-01-23 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 控释pth化合物的剂量方案
US11807671B2 (en) * 2016-11-16 2023-11-07 Auckland Uniservices Limited Methods for protein ligation and uses thereof
WO2018185131A2 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
WO2018233813A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa NOVEL RECOMBINANT BOTULINUM TOXINS WITH INCREASED DURATION
EP3418383A1 (en) * 2017-06-21 2018-12-26 XL-protein GmbH Modified l-asparaginase
US10174302B1 (en) 2017-06-21 2019-01-08 Xl-Protein Gmbh Modified L-asparaginase
AU2018287145B2 (en) * 2017-06-21 2024-04-18 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Modified L-asparaginase
WO2018234455A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Xl-Protein Gmbh CONJUGATES OF PROTEIN MEDICINAL PRODUCTS AND PEPTIDES M / S
US11155802B2 (en) 2017-07-06 2021-10-26 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Recombinant botulinum neurotoxins with increased duration of effect
EP3483619A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-15 Technische Universität München Automated noninvasive determining the sex of an embryo of and the fertility of a bird's egg
EP3713595A1 (en) * 2017-11-22 2020-09-30 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect
US20190184028A1 (en) * 2017-12-14 2019-06-20 Janssen Biotech, Inc. Targeting with firbronectin type iii like domain molecules
GB201804092D0 (en) * 2018-03-14 2018-04-25 Imperial Innovations Ltd Methods and compositions
WO2019185706A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Ascendis Pharma A/S Conjugates
AU2019246389A1 (en) 2018-03-28 2020-08-27 Ascendis Pharma Oncology Division A/S IL-2 conjugates
TWI724392B (zh) * 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法
KR20210013584A (ko) 2018-05-18 2021-02-04 아센디스 파마 본 디지즈 에이/에스 Pth 접합체의 개시 용량
MX2021003543A (es) 2018-09-27 2021-06-23 Xilio Dev Inc Polipeptidos de citocinas enmascaradas.
WO2020109978A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Novartis Ag Lpl-gpihbp1 fusion polypeptides
CA3137395A1 (en) * 2019-01-10 2020-07-16 Roswell Biotechnologies Inc. Conductive synthetic peptides for molecular electronics
US20220088149A1 (en) 2019-02-11 2022-03-24 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Liquid Pharmaceutical Formulations of PTH Conjugates
EP3923906A1 (en) 2019-02-11 2021-12-22 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Dry pharmaceutical formulations of cnp conjugates
US20220088147A1 (en) 2019-03-04 2022-03-24 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Long-acting growth hormone dosage forms with superior efficacy to daily somatropin
EP3714909A1 (en) * 2019-03-28 2020-09-30 Industrie Biomediche Insubri S.A. Improved bone implant matrix comprising proline-rich peptide and method of preparing the same
US10784093B1 (en) * 2019-04-04 2020-09-22 Thermo Finnigan Llc Chunking algorithm for processing long scan data from a sequence of mass spectrometry ion images
WO2020254602A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma A/S Conjugates of an electron-donating nitrogen or tertiary amine comprising compounds
AU2020295721A1 (en) 2019-06-21 2021-12-23 Ascendis Pharma A/S Conjugates of π-electron-pair-donating heteroaromatic nitrogen-comprising compounds
CA3143442A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma A/S Conjugates of heteroaromatic nitrogen-comprising compounds
CA3152665A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Tonix Pharma Limited Modified tff2 polypeptides
WO2021113434A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 Rodan & Fields, Llc Peptides and compositions for inhibiting hair growth
JP2023512427A (ja) 2020-01-03 2023-03-27 アセンディス ファーマ エー／エス 分子内転位を受けるコンジュゲート
WO2021144249A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Hypoparathyroidism treatment
GB202007106D0 (en) * 2020-05-14 2020-07-01 Ucl Business Plc Cyclosporine analogues
EP4161956A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 sequences and uses thereof
AU2021319863A1 (en) 2020-08-05 2023-02-16 Ascendis Pharma A/S Conjugates comprising reversible linkers and uses thereof
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
IL301411A (en) 2020-09-28 2023-05-01 Ascendis Pharma Bone Diseases As Improving the physical and mental condition of patients with hypoparathyroidism
KR20230124637A (ko) 2020-12-22 2023-08-25 엑스엘-프로테인 게엠베하 구조적으로 무질서한 서열에 대해 특이적인 항체
CN112843222B (zh) * 2021-01-21 2023-01-31 暨南大学 Ankrd22蛋白在制备治疗或延缓自身免疫性疾病的产品中的应用
KR20230164709A (ko) 2021-04-01 2023-12-04 아센디스 파마 에이에스 염증 유발 질환을 치료하기 위한 지속형 성장 호르몬의 용도
AU2022350937A1 (en) 2021-09-22 2024-03-21 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Long-acting pth compound treatments
WO2023110758A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Effective doses of cnp conjugates
WO2023227505A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Liquid pharmaceutical formulations of cnp compounds

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI92601C (fi) 1992-03-11 1994-12-12 Marja Makarow Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista
US6639050B1 (en) * 1997-07-21 2003-10-28 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US20030190740A1 (en) 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
CA2412882A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Maxygen Aps Peptide extended glycosylated polypeptides
US20020169125A1 (en) 2001-03-21 2002-11-14 Cell Therapeutics, Inc. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof
US20060252120A1 (en) * 2003-05-09 2006-11-09 Kieliszewski Marcia J Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
EP1734994A1 (en) 2004-03-15 2006-12-27 Trimeris, Inc. Site-specific chemical modification of hiv gp41-derived peptides
WO2005103235A1 (ja) * 2004-04-19 2005-11-03 Denka Seiken Co., Ltd. ウイルスの生産方法
JP5735194B2 (ja) 2005-01-25 2015-06-17 セル セラピューティクス インコーポレーテッド 改善された生体内半減期を有する生物学的に活性なタンパク質
SI2402754T2 (sl) 2006-03-06 2023-09-29 Amunix Operating Inc. Nestrukturirani rekombinantni polimeri in njihove uporabe
US20100203083A1 (en) * 2007-05-31 2010-08-12 Medigene Ag Mutated structural protein of a parvovirus
CN101970678B (zh) 2007-06-21 2014-08-20 慕尼黑科技大学 具有增加的体内和/或体外稳定性的生物学活性蛋白
TW200936156A (en) * 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
CN102348715B (zh) 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
EP2440241B1 (en) 2009-06-08 2017-08-09 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
CN102883734B (zh) 2010-05-21 2018-01-02 Xl-蛋白有限责任公司 生物合成的脯氨酸/丙氨酸无规卷曲多肽及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CA2794614A1 (en) 2011-11-24
SG185440A1 (en) 2012-12-28
US20160137698A1 (en) 2016-05-19
CN102883734A (zh) 2013-01-16
CN105477641B (zh) 2021-03-23
MX357674B (es) 2018-07-18
CN105477641A (zh) 2016-04-13
EA024755B1 (ru) 2016-10-31
BR112012029577B1 (pt) 2022-04-12
KR101872541B1 (ko) 2018-06-28
LT2571510T (lt) 2018-11-12
WO2011144756A1 (en) 2011-11-24
US10081657B2 (en) 2018-09-25
US9221882B2 (en) 2015-12-29
JP2016026149A (ja) 2016-02-12
MX338914B (es) 2016-05-06
US10844094B2 (en) 2020-11-24
JP6038248B2 (ja) 2016-12-07
HK1219902A1 (zh) 2017-04-21
EA201291010A1 (ru) 2013-09-30
EP2571510A1 (en) 2013-03-27
US20130072420A1 (en) 2013-03-21
US20180354992A1 (en) 2018-12-13
NZ602522A (en) 2014-06-27
EP2571510B1 (en) 2018-08-08
CA2794614C (en) 2020-12-15
CN102883734B (zh) 2018-01-02
JP2013531480A (ja) 2013-08-08
MX2012013286A (es) 2013-03-05
BR112012029577A2 (pt) 2016-09-20
DK2571510T3 (en) 2018-11-19
JP5828889B2 (ja) 2015-12-09
AU2011254564B2 (en) 2014-03-27
SI2571510T1 (sl) 2019-02-28
KR20130105289A (ko) 2013-09-25
AU2011254564A1 (en) 2012-12-13
EP3473261A1 (en) 2019-04-24
PL2571510T3 (pl) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2691642T3 (es) Polipéptidos de enrollamiento al azar de prolina/alanina biosintéticos y sus usos
ES2362386T3 (es) Proteínas activas biológicas que tienen estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro.
ES2877539T3 (es) Acidos nucleicos que codifican secuencias repetitivas de aminoácidos ricos en residuos de prolina y alanina que tienen bajas secuencias de nucleótidos repetitivas
ES2897935T3 (es) Método para mejorar la solubilidad de proteína y péptido mediante el uso del enlace a un fragmento Fc de inmunoglobulina
ES2641877T3 (es) Inmunotoxina recombinante dirigida a mesotelina
ES2327606T3 (es) Conjugados de g-csf.
Huang et al. Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating factor by fusion with gelatin-like-protein polymer
CN104768580B (zh) 包含gm-csf中和化合物的液体制剂
EP2502939A1 (en) Nonnatural collagen-like protein and use thereof
BR112020006189A2 (pt) conjugado de peptídeo-2 tipo glucagon (glp-2), derivado de glp-2 que compreende uma sequência de aminoácidos e seu método se preparação, ácido nucleico isolado que codifica o derivado de glp-2, vetor de expressão recombinante que compreende o ácido nucleico, transformante que compreende o vetor de expressão recombinante, composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma ou mais doenças selecionadas
Kim et al. An approach for half-life extension and activity preservation of an anti-diabetic peptide drug based on genetic fusion with an albumin-binding aptide
KR101678925B1 (ko) 기능화 폴리펩티드
CN105524147B (zh) 重组聚多肽及其应用
CA3151394C (en) Pharmaceutical constructs with enhanced binding affinity with albumin
Gerling-Driessen et al. Exploiting Oligo (amido amine) backbones for the multivalent presentation of coiled-coil peptides
Kunstelj et al. Cysteine-specific PEGylation of rhG-CSF via selenylsulfide bond
Anand et al. Polypeptides: PASylation and XTEN
US20210324010A1 (en) Fusion products and bioconjugates containing mixed charge peptides
WO2022265109A1 (en) Ghr-binding pending peptide and composition comprising same
Abbasi et al. Site Directed Disulfide PEGylation of Interferon-β-1b with Fork Peptide Linker
AU2013203326B2 (en) Biological active proteins having increased in vivo and/or in vitro stability
BR112016022844B1 (pt) Método e composição para aperfeiçoar a solubilidade de proteína e peptídeo em solução aquosa que compreende um fragmento fc de imunoglobulina