BR112012029577B1 - Conjugado de fármaco compreendendo polipeptídeos helicoidais randômicos prolina/alanina biossintéticos, e composição farmacêutica ou diagnóstica - Google Patents

Conjugado de fármaco compreendendo polipeptídeos helicoidais randômicos prolina/alanina biossintéticos, e composição farmacêutica ou diagnóstica Download PDF

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Abstract

CONJUGADO DE FÁRMACO COMPREENDENDO POLIPEPTÍDEOS HELICOIDAIS RANDÔMICOS PROLINA/ALANINA BIOSSINTÉTICOS, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO OS MESMOS, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU DIAGNOSTICA. A presente invenção refere-se a um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou um segmento polipeptídico helicoidal randômico biossintético ou conjugado biossintético compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste em pelo menos aproximadamente 50 resíduos somente de aminoácidos prolina e alanina que, opcionalmente, podem ser constituinte(s) de um polipeptídeo heterólogo ou um construto de polipeptídeo heterólogo. A invenção refere-se ainda aos usos e dos mesmos, compreendendo usos médicos, diagnósticos ou na indústria alimentícia, bem como outras aplicações industriais. Além disso, a invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos, segmento e/ou proteínas heterólogas, bem como vetores e células compreendendo as ditas moléculas de ácido nucleico. São fornecidas ainda composições compreendendo os compostos da invenção bem como usos específicos do polipeptídeo, segmento, proteínas biologicamente ativas, conjugados de fármaco ou moléculas de ácidos nucleicos, vetores e células, os métodos de produção e/ou obtenção dos mesmos, bem como de produção e/ou obtenção das proteínas inventivas biologicamente ativas heterólogas e/ou construtos de polipeptídeo ou conjugados, como conjugados de fármaco.

Description

[0001] A presente invenção se refere a um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou um segmento polipeptídico helicoidal randômico biossintético ou um conjugado, o dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou um segmento polipeptídico helicoidal randômico biossintético ou um conjugado compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala). Pelo menos aproximadamente os ditos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala) podem ser constituinte(s) de um polipeptídeo heterólogo ou um construto de polipeptídeo heterólogo. Também usos e métodos de uso destes polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos, os ditos segmentos de polipeptídeos ou os ditos conjugados são descritos. Os usos podem, inter alia, compreender usos médicos, usos diagnósticos ou usos na indústria alimentícia bem como outras aplicações industriais, como na indústria de papel, na recuperação de óleo e similares. A presente invenção se refere, também, ao uso(s) específico do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético fornecido neste pedido ou segmento polipeptídico helicoidal randômico biossintético ou conjugados, o dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico helicoidal randômico biossintético ou conjugados compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina. A sequência de aminoácidos fornecida neste pedido do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico helicoidal randômico biossintético consiste em pelo menos aproximadamente 50, de pelo menos aproximadamente 100, de pelo menos aproximadamente 150, de pelo menos aproximadamente 200, de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350 ou de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala). Pelo menos aproximadamente os ditos 50, pelo menos aproximadamente 100, pelo menos aproximadamente 150, pelo menos aproximadamente 200, pelo menos aproximadamente 250, pelo menos aproximadamente 300, pelo menos aproximadamente 350 ou pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala) são preferencialmente (a) constituinte de um polipeptídeo heterólogo ou um construto de polipeptídeo heterólogo ou são preferencialmente (b) constituinte de um conjugado, como um conjugado de fármaco, como um conjugado com um alimento ou ingrediente cosmético ou aditivo, como um conjugado com um composto biologicamente ativo ou como um conjugado com um composto ativo espectroscopicamente. Especialmente, as proteínas heterólogas são fornecidas neste pedido pelo qual estas proteínas compreendem pelo menos dois domínios, em que um primeiro domínio dos ditos pelo menos dois domínios compreende uma sequência de aminoácidos tendo e/ou mediando uma atividade, como uma atividade biológica, e um segundo domínio de pelo menos dois ditos domínios compreendendo o polipeptídeo helicoidal prolina/alanina randômico biossintético ou segmento polipeptídico prolina/alanina da presente invenção. A presente invenção se refere em particular a um conjugado de fármaco compreendendo (i) um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), e (ii) um fármaco selecionado a partir do grupo consistindo em (a) uma proteína biologicamente ativa ou um polipeptídeo compreendendo ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou medeia uma atividade biológica e (b) uma pequena molécula de fármaco. Um objeto adicional da presente invenção é um conjugado de fármaco compreendendo polipeptídeo helicoidal prolina/alanina randômico biossintético ou segmento polipeptídico prolina/alanina fornecidos neste pedido e, adicionalmente, (a) molécula(s) farmaceuticamente ou medicamente útil, como pequenas moléculas, peptídeos ou biomacromoléculas (tais como proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, vesículas de lipídio) e similares, ligada e/ou acoplada ao dito polipeptídeo helicoidal prolina/alanina randômico biossintético ou segmento polipeptídico prolina/alanina. Além disso, as moléculas de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico e/ou as proteínas biologicamente ativas, heterólogas bem como vetores e células que compreendem as ditas moléculas de ácidos nucleicos são descritas. Além disso, métodos para a produção dos polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos inventivos descritos neste pedido ou segmentos de polipeptídeos e fármaco correspondentes ou conjugados de alimentos, por exemplo, conjugados compreendendo polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos definidos neste pedido ou segmentos de polipeptídeos e um ingrediente alimentício ou um aditivo alimentício, são descritos. Também são descritos conjugados correspondentes (compreendendo como um constituinte o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético descrito neste pedido ou segmento polipeptídico) que compreendem, inter alia, um ingrediente cosmético ou aditivo ou um composto ativo biologicamente ou espectroscopicamente. Além disso, a presente invenção fornece composições que compreendem os compostos da invenção (isto é, descrito neste pedido os polipeptídeos helicoidais randômicos ou segmento de polipeptídeo helicoidal randômico compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina e moléculas de ácidos nucleicos que codificam as mesmas) bem como usos específicos do dito polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico, das proteínas biologicamente ativas compreendendo os ditos polipeptídeos helicoidais randômicos ou segmentos de polipeptídeos helicoidais randômicos, conjugados de fármaco, conjugados de alimentos ou moléculas de ácidos nucleicos, vetores e células da invenção. Também os métodos de produção e/ou obtenção dos polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos inventivos ou segmentos de polipeptídeos bem como de produção e/ou obtenção das proteínas inventivas biologicamente ativas, heterólogas, e/ou construtos de polipeptídeo ou conjugados de fármaco são fornecidos. Além disso, usos médicos, farmacêuticos bem como diagnósticos são fornecidos neste pedido para o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina (ou para moléculas e conjugados que compreendem os mesmos) como definido neste pedido. Tal uso médico ou farmacêutico pode compreender o uso do dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico como expansor plasmático e similares. Entretanto, os meios e métodos fornecidos neste pedido não são limitados a usos farmacêuticos, médicos e biológicos mas também podem ser empregados em outras áreas industriais, como na indústria de papel, na recuperação de óleo, etc.
[0002] A depuração rápida da circulação sanguínea pela filtração renal é uma propriedade típica de pequenas moléculas (incluindo pequenas proteínas e peptídeos). Entretanto, pela expansão das dimensões moleculares aparente além do tamanho de poro dos glomérulos renais a meia-vida plasmática de proteínas terapêuticas pode ser estendida a uma faixa medicamente útil de vários dias. Uma estratégia para alcançar tal efeito é a conjugação química do produto biológico com o polímero sintético polietilenoglicol (PEG). Isto levou a vários fármacos aprovados, por exemplo, PEG-interferon alfa2a (Pegasys®), PEG-G-CSF (Neulasta®) e, recentemente, um TNF alfa- fragmento Fab PEGilado (Cimzia®). No entanto, a tecnologia de "PEGilação" tem várias desvantagens: a classe clínica os derivados de PEG são caros e seu acoplamento covalente a uma proteína recombinante requer etapas de purificação e processamento a jusante adicionais, dessa forma reduzindo o rendimento e aumentando os custos. Além disso, PEG não é biodegradável, que pode causar efeitos colaterais, tais como vacuolação do epitélio renal sob tratamento contínuo; ver, por exemplo, Gaberc-Porekar (2008) Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-50; Knop (2010) Angew Chem Int Ed Engl 49:6288-308 ou Armstrong em: Veronese (Ed.), "PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications"; Birkhauser Verlag, Basiléia 2009.
[0003] A fim de superar algumas desvantagens da tecnologia de PEG, certos miméticos polipeptídicos recombinantes foram fornecidos na técnica, alguns dos quais são baseados em sequências de aminoácido de ocorrência natural ou estiramentos de aminoácido sintéticos.
[0004] A maioria das sequências de aminoácido natural não se comporta como uma cadeia randômica ideal na solução fisiológica porque tendem a adotar uma conformação enovelada (estrutura secundária) ou, se aberta, normalmente são insolúveis e formam agregados. De fato, a maioria dos experimentos clássicos para investigar o comportamento de cadeia randômico de polipeptídeos foi conduzida em condições desnaturantes, isto é, na presença de desnaturantes químicos como ureia ou cloreto de guanidínio (ver, por exemplo, Cantor (1980) Biophysical Chemistry. W.H. Freeman and Company, New York). Por isso, tais tecnologias geralmente assentam- se sobre sequências de aminoácido peculiares que resistem ao enovelamento, agregação bem como adsorção não específica e, dessa forma, fornecem cadeias randômicas estáveis sob condições fisiológicas tamponadas e de temperatura mesmo se geneticamente fundidas a um domínio proteico terapêutico enovelado. Nestas circunstâncias, tais miméticos de PEG recombinantes podem conferir um aumento de tamanho muito maior do que seria esperado normalmente com base somente em sua massa molecular, eventualmente retardando a filtração renal e efetivamente aumentando a meia-vida plasmática do produto biológico ligado por fatores consideráveis.
[0005] A maioria destas tecnologias têm, entretanto, ressalvas e desvantagens adicionais.
[0006] Por exemplo, as sequências de aminoácido repetitivas de ocorrência natural foram testadas para sua utilidade em ciências médicas e em abordagens farmacêuticas. Uma destas abordagens se refere à trans-sialidase de Trypanosoma cruzi. Ela contém um domínio catalítico de 680 resíduos de aminoácidos seguido por um domínio repetitivo C-terminal, apelidado "antígeno de fase aguda" (SAPA), que compreende um número variável de repetições de aminoácido de 12mer. Estudos farmacocinéticos (PK) em camundongos do trans- sialidase contendo 13 repetições de aminoácidos hidrofílicos carregados negativamente (em pH fisiológico) correspondentes tendo a sequência natural DSSAHSTPSTPA revelou uma meia-vida plasmática mais longa de cinco vezes em comparação com a enzima recombinante da qual a sequência repetitiva C-terminal tinha sido deletada (Buscaglia (1999) Blood 93:2025-32). Um efeito de aumento de meia-vida similar foi observado após fusão da mesma trans- sialidase, isto é, seu domínio catalítico de 76 kDa, com 13 repetições de aminoácido carregadas da sequência EPKSA que foram encontradas no antígeno de proteína 13 de Trypanosoma cruzi. Tanto as repetições de SAPA como do antígeno 13 foram capazes de prolongar a meia-vida plasmática da proteína heteróloga glutationa S- transferase (GST) de Schistosoma japonicum por um fator 7-8 após fusão genética a ambos os C-terminais desta enzima homodimérica (ver Buscaglia, loc.cit.). Contudo, enquanto estas sequências de aminoácido repetitivas de ocorrência natural de patógenos humanos em princípio podem parecer atraentes para otimizar a farmacocinética de proteínas terapêuticas, foi verificado que elas eram altamente imunogênicas (ver Affranchino (1989), Mol Biochem Parasitol 34:221-8 ou Buscaglia (1998), J Infect Dis 1998; 177:431-6).
[0007] Outra abordagem se refere ao uso de gelatina. Gelatina, colágeno animal hidrolisado e desnaturado, contém estiramentos longos de repetições de Gly-Xaa-Yaa, em que Xaa e Yaa na maior parte constituem-se de prolina e 4-hidroxiprolina, respectivamente. Succinilação da gelatina, principalmente via grupos ε-amino das cadeias laterais de lisina naturalmente entremeadas, aumenta a hidrofilicidade deste biopolímero e abaixa seu ponto isoelétrico (pI). A repulsão eletrostática intramolecular entre os grupos carboxilato negativamente carregados das cadeias laterais modificadas supostamente espalha a molécula em uma conformação mais ou menos estendida. O volume estendido resultante torna a gelatina succinilada uma macromolécula para uso como expansor plasmático em humanos e é, inter alia, vendida como Volplex® (Beacon Pharmaceuticals Ltd) ou Gelofusine® (B. Braun Melsungen AG). Além disso, um efeito de aumento de meia-vida foi alcançado pela fusão genética do fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF) a um polipeptídeo similar à gelatina artificial (Huang (2010) Eur J Pharm Biopharm 74:435-41). Para este fim, todas as cadeias laterais hidrofóbicas em uma gelatina natural foram trocadas por resíduos hidrofílicos, resultando em uma proteína similar à gelatina (GLK) de 116 aminoácidos compreendendo os aminoácidos G, P, E, Q, N, S, e K em ordem variada. G-CSF foi fundido no seu N-terminal com 4 cópias desta sequência GLK e secretado em Pichia pastoris. Pichia pastoris apareceu como um organismo para produção favorável de proteínas de fusão GLK; contudo, se GLKs também podem ser produzidas em outros organismos a ser determinado como é conhecido que os fragmentos de gelatina recombinantes podem ser expressos somente com rendimento baixo em E. coli, por exemplo, como ilustrado em Olsen (2003), Adv Drug Deliv Rev 55:1547-67.
[0008] Elastina é um componente da matriz extracelular em muitos tecidos. É formada do precursor solúvel tropoelastina, que consiste em um domínio rico em Lys/Ala hidrofílico e um domínio hidrofóbico, elastomérico com sequência repetitiva. Reticulação enzimática de cadeias laterais de lisina dentro do domínio hidrofílico leva à formação de elastina insolúvel. Os polipeptídeos similares à elastina (ELPs) são artificialmente projetados, sequências de aminoácido repetitivas derivadas do domínio hidrofóbico da tropoelastina. O motivo de sequência repetido mais comum de ELPs é V-P-G-X-G, em que "X" pode ser qualquer aminoácido exceto Pro (MacEwan (2010) Biopolymers 94:60-77; Kim (2010) Adv Drug Deliv Rev 62:1468-78). ELPs adequados podem ser fundidos com proteínas terapêuticas e produzidos em E. coli. Consequentemente, a capacidade de ELPs de formar depósitos similares a gel após injeção pode prolongar significativamente a meia-vida in vivo de um produto biológico ligado, embora por um mecanismo diferente de outros polipeptídeos não estruturados. Contudo, a ligação de ELP pode impedir a bioatividade do parceiro de fusão como demonstrado para o antagonista de receptor de interleucina 1 em um bioensaio de proliferação de linfócito induzido por IL-1 (Shamji (2007) Arthritis Rheum. 11:3650-3661). Além disso, ELPs são sujeitos à degradação por proteases endógenas, tais como colagenase. Também, as proteínas agregadas são geralmente mais suscetíveis à imunogenicidade.
[0009] As abordagens adicionais referem-se ao uso de polímeros polianiônicos. Por exemplo, poliglutamato (PG) foi quimicamente acoplado a pequenas moléculas de fármacos citotóxicos fracamente solúveis para o tratamento de câncer. Um produto correspondente seria Opaxio™, um conjugado de fármaco paclitaxel atualmente em estudos de fase clínica III. A meia-vida de um conjugado paclitaxel PG foi prolongada por um fator 3 a 14 em comparação com o composto não modificado (Singer (2005) J Control Release 109:120-6). As proteínas de fusão adicionais, por exemplo, G-CSF fundido em seu N- terminal com um estiramento de 175 resíduos Glu consecutivos ou IFN-alfa2 que carrega em seu C-terminal uma cauda PG de 84 resíduos, foram produzidas em um estado solúvel no citoplasma de E. coli (ver WO2002/077036). Para tradução eficiente, a fusão de N- terminal requereu um peptídeo líder, que foi depois removido por clivagem de protease de Vírus de Mosaico do Tabaco (TEV). As fusões de poliglutamato de G-CSF e INFα2 mostraram bioatividade em ensaios de cultura celular. Entretanto, até agora nenhum dos dados farmacocinéticos destas fusões PG foram relatados. Também, a carga altamente negativa de fusões PG é uma desvantagem geral com respeito a interações biomoleculares (por exemplo, a ligação do receptor alvo ou fator solúvel) devido à atração eletrostática artificial ou efeitos de repulsão.
[00010] WO 2006/081249 descreve uma sequência polipeptídica com aproximadamente 2 a 500 unidades repetidas de 3 a 6 aminoácidos, em que G, N ou Q representam os constituintes principais enquanto os constituintes menores podem ser A, S, T, D ou E. Esta composição de aminoácido permite a integração da sequência de glicosilação Asn-Xaa-Ser/Thr (onde Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro) para a glicosilação N-ligada da cadeia lateral Asn em sistemas de expressão eucarióticos. O tamanho macromolecular aumentado de uma proteína de fusão resultante, incluindo a modificação pós-traducional com grandes estruturas solvatadas de carboidrato, pode estender a farmacocinética da proteína geneticamente conjugada. Tais ligações oligossacarídicas ("glicoengenharia") em geral podem reduzir tanto a suscetibilidade à proteólise e aumentar o volume hidrodinâmico (Sinclair (2005) J Pharm Sci 94:1626-35). Uma desvantagem é a heterogeneidade molecular intrínseca da biomacromolécula glicosilada, que causa esforço adicional durante a produção biotecnológica e controle de qualidade.
[00011] WO 2010/091122 (e WO 2007/103515) e Schellenberger (2009) Nat Biotechnol 27:1186-90 descrevem polímeros de aminoácidos não repetitivos não estruturados englobando e compreendendo os resíduos P, E, S, T, A e G. Este conjunto de aminoácidos, que mostra uma composição não diferente da repetição de PSTAD descrita ainda acima, foi sistematicamente rastreado para sequências para produzir um polipeptídeo solvatado com grande tamanho molecular, adequado para desenvolvimento biofarmacêutico, evitando cadeias laterais hidrofóbicas - em particular F, I, L, M, V e W - que pode dar a origem à agregação e pode causar uma resposta imune mediada por HLA/MHC-II. Também, interligando potencialmente resíduos de Cys, os aminoácidos catiônicos K, R e H, que podem interagir com membranas celulares negativamente carregadas, e cadeias laterais de amida de N e Q, que são potencialmente propensas à hidrólise, foram excluídos (ver Schellenberger (2009) loc. cit.). As bibliotecas gênicas sintéticas que codificam sequências não repetitivas que compreendem o conjunto de resíduos PESTAG, que foram fundidas à proteína fluorescente verde (GFP), foram rastreadas com respeito aos níveis de expressão solúveis em E. coli, e um subconjunto resultante foi ainda investigado para estabilidade genética, solubilidade proteica, termoestabilidade, tendência de agregação, e perfil de contaminante. Consequentemente, uma sequência de 864 aminoácidos que contém 216 resíduos Ser (25,0% mol), 72 resíduos Ala (8,3% mol) e 144 aminoácidos (16,7% mol) de cada um Pro, Thr, Glu, e Gly foi ainda testado para fusão ao agonista de receptor GLP-1 Exendina-4 (E-XTEN) e alguns outros produtos biológicos. As proteínas de fusão - tipicamente carregando um domínio de ligação de celulose, que foi depois clivado - foram produzidas em um estado solúvel no citoplasma de E. coli e isoladas. A investigação de E-XTEN por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) revelou falta da estrutura secundária enquanto durante a cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) a proteína de fusão mostrou substancialmente menos retenção do que esperado para uma proteína de 84 kDa, dessa forma demonstrando um volume hidrodinâmico aumentado (Schellenberg (2009) loc. cit.). A estrutura desordenada do polipeptídeo PESTAG e o aumento associado no raio hidrodinâmico podem ser favorecidos pela repulsão eletrostática entre aminoácidos que transportam uma alta carga negativa líquida que são distribuídos através da sequência XTEN (ver WO 2010/091122). Entretanto, um estudo adicional de Geething (2010) PLoS One 2010; 5:e10175 demonstrou que XTEN reduz a potência do seu parceiro de fusão terapêutico. Em um ensaio de cultura celular, uma fusão glucagon XTEN mostrou bioatividade simplesmente de 15% do peptídeo não modificado. Uma perda ainda mais forte na afinidade do receptor (aumentou a EC50 em 17 vezes) foi descrita para uma fusão XTEN do hormônio de crescimento humano (hGH); ver WO 2010/144502. Também glicina, como o menor aminoácido e estruturalmente mais simples, foi considerada como o aminoácido conformacionalmente mais flexível fundamentado em bases teóricas; ver, por exemplo, Schulz GE, Schirmer RH. Principles of Protein Structure. Springer, New York 1979. Além disso, as simulações de computador indicaram que os polímeros Gly sem a estrutura secundária e provavelmente formarão um helicoidal randômico na solução; ver Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-402. De uma perspectiva química, a poliglicina é uma poliamida não ramificada linear que mostra certa semelhança ao poliéter PEG já que ambos são macromoléculas essencialmente unidimensionais com muitos graus rotacionais de liberdade ao longo da cadeia, que são feitos de unidades de hidrocarboneto curtas repetidas que são regularmente interrompidas pela ligação de hidrogênio e grupos polares altamente solvatados. Consequentemente, a poliglicina deve constituir o mimético de PEG mais simples geneticamente codificável com perspectivas de estender a meia-vida plasmática de proteínas terapêuticas. Este conceito foi empregado na forma do "polímero homo-aminoácido (HAP)" ou como sequência rica em glicina (GRS), respectivamente; ver, Schlapschy (2007) Protein Eng Des Sel 20:273-84; WO 2007/103515. Entretanto, há muito tempo é conhecido que polímeros puros quimicamente sintetizados de Gly mostram solubilidade fraca em água; ver, inter alia, em Bamford CH et al. Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, and Properties. Academic Press, New York 1956. Por isso, foram feitas tentativas diferentes para aumentar a hidrofilicidade, por introdução de cadeias laterais alcoólicas de serina para ligação de hidrogênio (WO 2007/103515 bem como Schlapschy (2007) loc. cit.) ou, além disso, resíduos de glutamato negativamente carregados (WO 2007/103515). É de notar que os espaçadores peptídicos com a composição (Gly4Ser)n já foram descritos na técnica a fim de ligar domínios em proteínas de fusão de uma maneira flexível. Um volume hidrodinâmico significativamente aumentado foi detectado para estas proteínas de fusão em SEC analítico. No caso da versão de HAP de 200 resíduos, o aumento de tamanho aparente foi de 120% comparado com o fragmento Fab não fundido, enquanto a massa verdadeira foi somente maior em 29%, por isso revelando o efeito de um volume hidrodinâmico aumentado devido à estrutura helicoidal randômica solvatada para marcação de poliglicina. Além disso, os espectros de diferença de CD foram característicos para a estrutura secundária desordenada da porção HAP. Finalmente, a meia-vida plasmática terminal do fragmento Fab que carrega o HAP de 200 resíduos em camundongos foi prolongada por aproximadamente um fator 3. Embora moderado, este efeito pode ser apropriado por certas aplicações diagnósticas (especializadas), tais como visualização in vivo; ver Schlapschy (2007); loc. cit. Infelizmente, a produção de proteínas de fusão com sequências repetidas (Gly4Ser)n mais longas pareceu menos factível devido a uma tendência crescente de formar agregados, dessa forma impondo uma limitação natural ao uso de polímeros - mais ou menos puros - de glicina como miméticos de PEG.
[00012] WO 2008/155134 descreve que sequências com uma mistura apropriada de resíduos Pro, Ala, e Ser (isto é, PAS) levam ao cancelamento mútuo das suas preferências distintas de estrutura secundária e, dessa forma, resultam em um polipeptídeo estavelmente desordenado. Entretanto, WO 2008/155134 também documenta que as proteínas de fusão com um domínio composto somente de resíduos serina e alanina (SA), isto é, domínio compreendendo somente dois tipos de aminoácidos, não formam uma helicoidal randômica, mas estrutura β-folha em vez disso.
[00013] A síntese química de polipeptídeos é bem conhecida e foi descrita na técnica. Izuka descreve a síntese química de polipeptídeos contendo prolina (ver Izuka (1993), Bull. Chem. Soc. Jpn 66, 12691272). Estes copolipeptídeos contêm sequências randômicas de prolina e glicina, L-alanina, ácido L-α-aminobutirico (Abu), L-norvalina (Nva) ou L-leucina, respectivamente, e são sintetizados por copolimerização química. Izuka descreve que tais copolipeptídeos na maioria têm uma conformação similar ao colágeno definida. Ainda, é descrito nesta publicação que os copolipeptídeos de prolina e alanina (ou prolina e ácido L-a-aminobutírico) são parcialmente solúveis na água, enquanto outros copolipeptídeos eram completamente insolúveis. Izuka enfatiza que os copolipeptídeos de prolina/alanina podem ter uma conformação desordenada parcial. Izuka acentua que polipeptídeos quimicamente sintetizados com uma sequência de prolina/alanina randômica ocorrem predominantemente em uma conformação similar ao colágeno, isto é, em uma conformação estruturada.
[00014] Dessa forma, o problema técnico que é a base da presente invenção é a provisão de grandes polipeptídeos com a conformação helicoidal randômica verdadeira. O problema técnico é resolvido pela provisão das modalidades caracterizadas nas reivindicações e fornecidas neste pedido.
[00015] Consequentemente, a invenção se refere à provisão e ao uso de um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos consistindo em pelo menos aproximadamente 50, em particular de pelo menos aproximadamente 100, em particular de pelo menos aproximadamente 150, em particular de pelo menos aproximadamente 200, em particular de pelo menos aproximadamente 250, em particular de pelo menos aproximadamente 300, em particular de pelo menos aproximadamente 350, em particular de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. A invenção, por isso, se refere à provisão de polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos ou segmentos de polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 50 resíduos de aminoácidos, a dita sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina e compreende pelo menos uma prolina e pelo menos uma alanina. A invenção também fornece um conjugado de fármaco compreendendo (i) um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), e (ii) um fármaco selecionado a partir do grupo consistindo em (a) uma proteína biologicamente ativa ou um polipeptídeo que compreende ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou medeia uma atividade biológica e (b) uma pequena molécula de fármaco. Os polipeptídeos com conformação helicoidal randômica verdadeira e segmentos de polipeptídeos com conformação helicoidal randômica verdadeira fornecidos neste pedido são também úteis no contexto de usos cosméticos bem como usos na indústria alimentícia e a produção de bebidas. Os grandes polipeptídeos fornecidos neste pedido que mostram a conformação helicoidal randômica verdadeira consiste somente e simplesmente de resíduos prolina (P, Pro) e alanina (A, Ala) e compreende mais de pelo menos 50 aminoácidos, em particular de pelo menos aproximadamente 100, em particular de pelo menos aproximadamente 150, em particular de pelo menos aproximadamente 200, em particular de pelo menos aproximadamente 250, em particular de pelo menos aproximadamente 300, em particular de pelo menos aproximadamente 350, em particular de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. Ambos os aminoácidos, P e A, têm que estar presentes nos grandes polipeptídeos neste pedido fornecidos com conformação helicoidal randômica verdadeira e segmentos de polipeptídeos com conformação helicoidal randômica verdadeira. Também são fornecidos neste pedido moléculas de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos descritos neste pedido ou segmentos de polipeptídeos bem como para fármaco ou conjugados de alimentos que compreendem os ditos polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos ou segmentos de polipeptídeos e uma proteína de interesse (covalentemente ligada), como uma proteína biologicamente ativa.
[00016] O polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento de polipeptídeo helicoidal randômico biossintético como descrito neste pedido e para serem usados em fármaco ou conjugados de alimentos fornecidos neste pedido e compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo em pelo menos aproximadamente 50, de pelo menos aproximadamente 100, de pelo menos aproximadamente 150, de pelo menos aproximadamente 200, de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350, de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina (P) e alanina (A) é, inter alia, para ser usado em um contexto heterólogo, isto é em uma proteína heteróloga biologicamente ativa, construto proteico e/ou em um dito conjugado de fármaco compreendendo polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico e moléculas farmaceuticamente ou medicamente úteis, como pequenas moléculas, peptídeos ou biomacromoléculas, tais como proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, vesículas de lipídio e similares. Como ilustrado nos exemplos acrescentados, os inventores podem prover com sucesso conjugados de fármaco que consistem dos polipeptídeos helicoidais randômicos verdadeiros como definido neste pedido e proteínas biologicamente ativas ou estiramentos proteicos bem como conjugados de fármaco que consistem de pequenas moléculas ou pequenas moléculas de fármacos que compreendem e/ou são ligados aos polipeptídeos helicoidais randômicos descritos neste pedido, consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina (isto é, de ambos os aminoácidos P e A)
[00017] Consequentemente, a presente invenção fornece, inter alia, para uma proteína biologicamente ativa, heteróloga, compreendendo pelo menos dois domínios em que (a) um primeiro domínio dos pelo menos dois ditos domínios compreende uma dita sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a atividade biológica; e (b) um segundo domínio dos ditos pelo menos dois domínios compreende o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico consistindo em uma sequência de aminoácidos consistindo em pelo menos aproximadamente 50, de pelo menos aproximadamente 100, de pelo menos aproximadamente 150, de pelo menos aproximadamente 200, de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350, de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. Conforme esta invenção, o dito "primeiro domínio" e o dito "segundo domínio" não estão compreendidos em uma proteína natural (isto é, que ocorre na natureza) ou uma proteína hipotética como deduzida das sequências de ácidos nucleicos codificantes de ocorrência natural, como regiões de leitura aberta etc.
[00018] Além disso, esta invenção fornece fármaco conjugado consistindo no polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos consistindo em pelo menos aproximadamente 50, de pelo menos aproximadamente 100, de pelo menos aproximadamente 150, de pelo menos aproximadamente 200, de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350, de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina e (a) molécula(s) farmaceuticamente, terapeuticamente e/ou medicamente útil, como (a) pequena molécula(s), (a) peptídeo(s) ou (a) biomacromolécula(s), tais como proteína(s), um ácido(s) nucleico, (a) carboidrato(s), (a) vesícula(s) de lipídio e similares, que é/são conjugada(s) ao dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico. Novamente, é de notar que o termo "biologicamente ativo" no contexto de conjugados descritos neste pedido não é limitado a moléculas biológicas puras mas também compreende moléculas medicamente ativas, terapeuticamente ativas, farmaceuticamente ativas e similares. É evidente para o versado que os meios e métodos fornecidos neste pedido não são limitados a usos farmacêuticos e médicos, mas podem ser empregados em uma larga variedade de tecnologias, incluindo, mas não limitados a tecnologias de cosméticos, de alimentos, de bebidas e de nutrição, indústria do óleo, indústria do papel e similares.
[00019] Em contraste com copolipeptídeos quimicamente sintetizados (como em Izuka, loc.cit.) Os polipeptídeos helicoidais randômicos fornecidos neste pedido são biossinteticamente produzidos. O termo "biossintético" como usado neste pedido se refere à síntese por meio de métodos biotecnológicos (em contraste com síntese química). Tais métodos biotecnológicos são bem conhecidos na técnica e também descritos neste pedido ainda abaixo. A biossíntese dos polipeptídeos helicoidais randômicos da presente invenção permite a produção de polipeptídeos com uma sequência definida de resíduos prolina e alanina, um comprimento definido e/ou uma proporção definida de resíduos alanina e prolina. Ainda, os polipeptídeos fornecidos conforme a presente invenção são substancialmente puros, isto é, os polipeptídeos produzidos são essencialmente uniformes e compartilham as características acima (isto é, sequência definida, comprimento definido e/ou proporção de aminoácido definida). Os polipeptídeos helicoidais randômicos consistindo em pelo menos aproximadamente 50, em particular de pelo menos aproximadamente 100, em particular de pelo menos aproximadamente 150, em particular de pelo menos aproximadamente 200, em particular de pelo menos aproximadamente 250, em particular de pelo menos aproximadamente 300, em particular de pelo menos aproximadamente 350, em particular de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina são, conforme esta invenção, por exemplo, compreendidos em polipeptídeos heterólogos/construtos de polipeptídeo biologicamente ativos, e/ou em conjugados de fármacos ou alimentos bem como em outros conjugados úteis em áreas industriais adicionais, como, mas não limitados à indústria do papel, indústria do óleo e similares.
[00020] Além de tudo, os atributos acima dos polipeptídeos da presente invenção permitem a formação de uma helicoidal randômica estável dos polipeptídeos e estes polipeptídeos helicoidais randômicos têm propriedades surpreendentes e vantajosas. Por exemplo, os polipeptídeos da presente invenção são completamente solúveis em solução aquosa e têm um volume hidrodinâmico aumentado. Inesperadamente, os polipeptídeos helicoidais randômicos como definidos neste pedido são também capazes de conferir uma estabilidade aumentada in vivo/in vitro. Isto é particularmente importante para aplicações médicas, por exemplo, para proteínas biologicamente ativas ou conjugados de fármacos compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico desta invenção. Entretanto, as numerosas propriedades vantajosas dos polipeptídeos helicoidais randômicos da presente invenção não somente permitem seu uso no campo médico mas também em outros campos, como em cosméticos/tratamentos cosméticos ou nos campos de nutrição e tecnologia de alimentos, como na indústria do leite ou no processamento de carne. Exemplos de conjugados úteis na indústria alimentícia e similares são conjugados que compreendem o polipeptídeo helicoidal randômico descrito neste pedido ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina e compostos que são úteis nestas tecnologias, como, por exemplo, polímeros de polioxipropileno ou polioxietileno, que são tensoativos não iônicos usados como emulsificantes. Também enfrentado neste pedido é o uso do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético como definido neste pedido em métodos bioquímicos e em processos técnicos, tais como produção de papel, recuperação de óleo e similares. As características surpreendentes e vantajosas dos polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos que consistem simplesmente de resíduos prolina e alanina fornecidos neste pedido (e como também dos conjugados e construtos descritos neste pedido, como conjugados/construtos de fármacos ou alimentos, compreendendo os ditos polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos, verdadeiros) sejam descritos abaixo em maiores detalhes. Além disso, os usos ilustrativos e os meios e métodos que empregam estes polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos inventivos são fornecidos abaixo. Também meios e métodos para a produção de tais polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos bem como polipeptídeos ou construtos de polipeptídeo biologicamente ativos, heterólogos, e conjugados e construtos revelados neste pedido, como construtos de fármacos, compreendendo os ditos polipeptídeos helicoidais randômicos são fornecidos neste pedido.
[00021] No contexto desta invenção, encontrou-se surpreendentemente que os polímeros/polipeptídeos prolina-alanina com uma composição uniforme formam uma conformação helicoidal randômica estável. Isto também é demonstrado nos exemplos acrescentados, onde a estrutura helicoidal randômica biossintética de (co)-polímeros/polipeptídeos prolina/alanina é confirmada por espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Obter e empregar tais polipeptídeos/polímeros helicoidais biossintéticos, realmente randômicos foram surpreendentes uma vez que o método Chou- Fasman estabelecido (Chou e Fasman (1974), Biochemistry 13, 223245) prediz 100% da estrutura secundária α-helicoidal de polímeros/polipeptídeos (ou segmentos dos mesmos) compostos de prolina e alanina, como mostrado na figura 7. Ainda, neste pedido foi surpreendentemente encontrado e experimentalmente mostrado que polímeros/polipeptídeos prolina-alanina com uma composição uniforme formam uma conformação helicoidal randômica estável. Isto também é demonstrado nos exemplos acrescentados, onde a estrutura helicoidal randômica de (co)-polímeros/polipeptídeos prolina/alanina é confirmada por técnicas experimentais como espectroscopia de dicroísmo circular (CD) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).
[00022] Em contraste com os polipeptídeos/polímeros da presente invenção, os polipeptídeos quimicamente sintetizados descritos, por exemplo, em Izuka (1993), loc. cit. têm uma sequência arbitrária/indefinida e estocástica e um comprimento diverso. Dessa forma, os polipeptídeos quimicamente sintetizados compreendem uma mistura de peptídeos completamente diferentes com várias proporções de prolina/alanina, comprimentos, e similares. Como mencionado em Izuka, os polipeptídeos quimicamente sintetizados de tal mistura não fazem (ou somente parcialmente) formam uma helicoidal randômica e, consequentemente, não têm nenhuma das propriedades vantajosas dos polipeptídeos biossintéticos fornecidos e descritos neste pedido abaixo. Consequentemente, a presente invenção compreende e se refere a composições compreendendo os polipeptídeos/polímeros helicoidais randômicos biossintéticos inventivos como descritos neste pedido, pelos quais os ditos polipeptídeos/polímeros helicoidais randômicos biossintéticos são definidos, inter alia, pela sua sequência que compreende somente resíduos alanina e prolina. Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a conjugados, como conjugados de fármacos ou de alimentos compreendendo, como um constituinte, estes polipeptídeos/polímeros helicoidais randômicos descritos neste pedido. Estes polipeptídeos/polímeros helicoidais randômicos biossintéticos inventivos compreendidos nas ditas composições são, em uma modalidade, de comprimento uniforme.
[00023] Como acima mencionado, os polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos (ou segmentos de polipeptídeos helicoidais randômicos) desta invenção que consiste somente de resíduos prolina e alanina inesperadamente formam uma conformação helicoidal randômica estável. O termo "helicoidal randômica" como usado neste pedido se refere geralmente a qualquer conformação de uma molécula polimérica, incluindo polímeros de aminoácidos/sequências de aminoácido/polipeptídeos, em que os elementos monoméricos individuais que formam a dita estrutura polimérica são essencialmente randomicamente orientados em direção aos elementos monoméricos adjacentes ainda quimicamente ligados aos ditos elementos monoméricos adjacentes. Em particular, um polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou polímero de aminoácido adotando/tendo/formando "conformação helicoidal randômica" substancialmente sem uma estrutura secundária e terciária definida. No contexto dos polipeptídeos da presente invenção, os elementos monoméricos que formam a estrutura polimérica (isto é, a sequência polipeptídica/de aminoácidos) são aminoácidos únicos, tais como prolina e alanina por si ou estiramentos de peptídeos, tais como "repetições de aminoácido" / "cassetes de aminoácido" / "repetições de cassete" / "blocos de construção" / "módulos" (ou fragmentos dos mesmos) que são descritos e definidos mais abaixo.
[00024] A natureza das helicoidais randômicas do polipeptídeo e seus métodos de identificação experimental são conhecidos pelo versado na técnica e foram descritos na literatura científica (Chantre (1980) Biophysical Chemistry, 2nd ed., W. H. Freeman and Company, New York; Creighton (1993) Proteins - Structures and Molecular Properties, 2o ed., W. H. Freeman and Company, New York; Smith (1996) Fold Des 1:R95-R106). O termo "segmento" como usado neste pedido se refere a uma parte do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético definido neste pedido, a qual tal parte pode ser uma parte interna do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético descrito neste pedido. Tal "segmento" pode ser, por exemplo, um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético como definido neste pedido onde um (ou mais) aminoácido(s) foi deletado, por exemplo, do início e/ou da extremidade do polipeptídeo da invenção. Além disso, tal "segmento" pode ser usado como ele mesmo ou pode ser parte de uma proteína ou polipeptídeo maiores, por exemplo, de uma proteína de fusão com uma proteína biologicamente ativa. Tal "proteína de fusão" também seria um exemplo de um construto de polipeptídeo/proteína/polipeptídeo heterólogo, biologicamente ativo da presente invenção. O termo "heterólogo" como usado neste pedido é definido neste pedido abaixo.
[00025] O polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento helicoidal randômico do mesmo), conforme a presente invenção e a ser empregado no contexto desta invenção, adota/forma uma conformação helicoidal randômica, por exemplo, em solução aquosa ou em condições fisiológicas. O termo "condições fisiológicas" é conhecido na técnica e se refere àquelas condições nas quais as proteínas normalmente adotam sua conformação nativa, enovelada. Mais especificamente, o termo "condições fisiológicas" se refere aos parâmetros biofísicos como são tipicamente válidos para formas superiores de vida e, particularmente, em mamíferos, ainda mais preferencialmente seres humanos. O termo "condições fisiológicas" pode referir-se aos parâmetros bioquímicos e biofísicos como são normalmente encontrados no corpo (em particular, em fluidos corporais) de mamíferos e, em particular, em humanos. As ditas "condições fisiológicas" podem referir-se aos parâmetros correspondentes encontrados no corpo saudável bem como os parâmetros encontrados sob condições de doença ou em pacientes humanos. Por exemplo, um mamífero doente ou paciente humano podem ter uma condição de temperatura mais alta ainda "fisiológica" quando o dito mamífero ou o dito ser humano sofre de febre. Com respeito "a condições fisiológicas" nas quais as proteínas adotam sua conformação/estado nativa, os parâmetros mais importantes são temperatura (37°C do corpo humano), pH (7,35 - 7,45 para o sangue humano), osmolaridade (280 - 300 mmol/kg de H2O), e, se necessário, conteúdo proteico (soro 66 - 85 g/l). Ainda, o versado na técnica sabe que em condições fisiológicas estes parâmetros podem variar, por exemplo, a temperatura, pH, osmolaridade, e conteúdo proteico podem ser diferentes nos dados fluidos corporais ou teciduais, tais como sangue, licor do fluido cérebro-espinhal, peritoneal e linfa (Klinke (2005) Physiologie, 5th ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart). Por exemplo, no licor cérebro-espinhal, a osmolaridade pode ser aproximadamente 290 mmol/kg de H2O e a concentração proteica pode estar entre 0,15 g/l e 0,45 g/l enquanto na linfa o pH pode ser aproximadamente 7,4 e o conteúdo proteico pode estar entre 3 g/l e 5 g/l. Ao determinar se um polipeptídeo (ou segmento do mesmo)/sequência de aminoácidos forma/adota a conformação helicoidal randômica sob condições experimentais usando os métodos como descritos neste pedido abaixo, os parâmetros biofísicos, tais como temperatura, pH, osmolaridade e conteúdo proteico podem ser diferentes às condições fisiológicas normalmente encontradas in vivo. As temperaturas entre 1°C e 42°C ou preferencialmente 4°C a 25°C podem ser consideradas úteis para testar e/ou verificar as propriedades biofísicas e atividade biológica de uma proteína sob condições fisiológicas in vitro.
[00026] Considera-se que vários tampões, em particular em configurações experimentais (por exemplo, na determinação de estruturas proteicas, em particular em medidas de CD e outros métodos que permitem ao versado na técnica determinar as propriedades estruturais de um estiramento de proteína/aminoácido) ou em tampões, solventes e/ou excipientes de composições farmacêuticas, representam "soluções fisiológicas" / "condições fisiológicas" in vitro. Exemplos de tais tampões são, por exemplo salina tamponada em fosfato (PBS: NaCl 115 mM, KH2PO4 4 mM, Na2HPO4 16 mM pH 7,4), tampão Tris, tampões acetato, tampões citrato ou tampões similares, tais como os usados nos exemplos acrescentados. Geralmente, o pH de um tampão que representa "condições de solução fisiológicas" deve estar em uma faixa de 6,5 a 8,5, preferencialmente em uma faixa de 7,0 a 8,0, ainda mais preferencialmente em uma faixa de 7,2 a 7,7 e a osmolaridade deve estar em uma faixa de 10 a 1000 mmol/kg de H2O, mais preferencialmente em uma faixa de 50 a 500 mmol/kg de H2O e ainda mais preferencialmente em uma faixa de 200 a 350 mmol/kg de H2O. Opcionalmente, o conteúdo proteico de umas condições de solução fisiológicas representando tampões pode estar em uma faixa de 0 a 100 g/l, negligenciando a proteína com atividade biológica própria, pelo qual as proteínas de estabilização típicas podem ser usadas, por exemplo, albumina sérica humana ou bovina.
[00027] Foi constatado neste pedido que os polipeptídeos (ou segmentos dos mesmos) não somente formam uma conformação helicoidal randômica sob condições fisiológicas mas, mais geralmente, em solução aquosa. O termo "solução aquosa" é bem conhecido na técnica. Uma "solução aquosa" pode ser uma solução com um conteúdo de água (H2O) de pelo menos aproximadamente 20%, de pelo menos aproximadamente 30%, de pelo menos aproximadamente 40%, de pelo menos aproximadamente 50%, de pelo menos aproximadamente 60%, de pelo menos aproximadamente 70%, de pelo menos aproximadamente 80% ou de pelo menos aproximadamente 90% de H2O (peso/peso). Consequentemente, o polipeptídeo (ou segmento do mesmo) da presente invenção pode formar uma conformação helicoidal randômica em solução aquosa, possivelmente contendo outros solventes miscíveis, ou em dispersões aquosas com uma mais ampla faixa de temperaturas, valores de pH, osmolaridades ou conteúdo proteico. Isto é particularmente relevante para aplicações do polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) fora da terapia médica ou diagnóstica in vivo, por exemplo, em tecnologia de cosméticos, nutrição ou alimentos.
[00028] Consequentemente, também se enfrenta no contexto desta invenção que a conformação helicoidal randômica do polipeptídeo prolina/alanina biossintético (ou segmento do mesmo) da presente invenção é mantida em e/ou é usada no contexto de composições farmacêuticas, como farmacêuticos/produtos biológicos líquidos ou composições farmacêuticas liofilizadas. Isto é particularmente importante no contexto das proteínas biologicamente ativas, heterólogas, fornecidas neste pedido ou os conjugados de fármaco compreendendo, inter alia, o polipeptídeo helicoidal randômico inventivo (ou segmento polipeptídico). Preferencialmente, "condições fisiológicas" são para ser usadas em sistemas de tampões, solventes e/ou excipientes correspondentes. Ainda, por exemplo, em composições liofilizadas ou secas (como, por exemplo, composições farmacêuticas/produtos biológicos), se enfrenta que a conformação helicoidal randômica do polipeptídeo helicoidal randômico fornecido neste pedido (ou segmento polipeptídico) não está transientemente presente e/ou não pode ser detectado. Entretanto, o dito polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico) adotará/formará novamente sua helicoidal randômica após reconstituição em tampões/soluções/excipientes/solventes correspondentes ou após administração ao corpo. Os métodos para determinar se um polipeptídeo (ou segmento do mesmo) forma/adota conformação helicoidal randômica são conhecidos na técnica (Chantre (1980) loc. cit.; Creighton (1993) loc. cit.; Smith (1996) loc. cit.). Tais métodos incluem espectroscopia de dicroísmo circular (CD) como exemplificado neste pedido abaixo. A espectroscopia de CD representa um método de espectroscopia de absorção de luz no qual a diferença na absorvância da luz polarizada circular direita e esquerda por uma substância é medida. A estrutura secundária de uma proteína pode ser determinada pela espectroscopia de CD usando espectros de ultravioleta distante e com um comprimento de onda entre aproximadamente 190 e 250 nm. Nestes comprimentos de onda, as estruturas secundárias diferentes comumente encontradas em polipeptídeos podem ser analisadas, desde a-hélice, β-folha paralela e antiparalela, e as conformações helicoidais randômicas cada uma dão origem a uma forma característica e magnitude do espectro de CD. Consequentemente, usando espectrometria de CD, o versado é prontamente capaz de determinação se o polipeptídeo (ou segmento do mesmo) forma/adota conformação helicoidal randômica em solução aquosa ou em condições fisiológicas. Outros métodos biofísicos estabelecidos incluem espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), espectrometria de absorção, espectroscopia em infravermelho e Raman, medida do volume hidrodinâmico via cromatografia por exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica ou espalhamento de luz dinâmico/estático bem como medidas do coeficiente de atrito ou viscosidade intrínseca (Chantre (1980) loc. cit.; Creighton (1993) loc. cit.; Smith (1996) loc. cit.).
[00029] Além dos métodos experimentais acima, métodos teóricos para predição de estruturas secundárias em proteínas foram descritos. Um exemplo de tal método teórico é o método Chou-Fasman (Chou e Fasman, loc.cit.) que é baseado em uma análise das frequências relativas de cada aminoácido em a-hélices, β-folhas, e deslocamentos baseados em estruturas proteicas conhecidas resolvidas, por exemplo, com cristalografia de raio x. Entretanto, conhece-se que a predição teórica da estrutura secundária proteica é insegura. Como exemplificado neste pedido abaixo, as sequências de aminoácido esperadas adotar estrutura secundária a-helicoidal encontradas experimentalmente de acordo com o método de Chou-Fasman formavam uma helicoidal randômica. Consequentemente, os métodos teóricos, tais como o algoritmo de Chou-Fasman, somente podem ter valor preditivo limitado se um dado polipeptídeo adota a conformação helicoidal randômica, como também ilustrado nos exemplos acrescentados e figuras. Todavia, a predição teórica acima descrita é muitas vezes a primeira abordagem na avaliação de uma estrutura secundária putativa de uma dada sequência polipeptídica/aminoácido. Uma predição teórica de uma estrutura helicoidal randômica também muitas vezes indica que poderia ser verificação de mérito pelos meios experimentais acima se uma dada sequência polipeptídica/aminoácido tem de fato uma conformação helicoidal randômica.
[00030] Os homopolímeros da maioria dos aminoácidos, em particular os aminoácidos hidrofóbicos, são normalmente insolúveis em solução aquosa (Bamford (1956) Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, and Properties, 2nd ed., Academic Press, New York). Conhece-se que homopolímeros de vários aminoácidos hidrofílicos formam estruturas secundárias, por exemplo, a-hélice no caso de Ala (Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-2402) e β-folha no caso de Ser (Quadrifoglio (1968) Am J Chem Soc 90:2760-2765) enquanto poliprolina, o homo-oligopeptídeo mais rígido (Schimmel (1967) Proc Natl Acad Sci USA 58:52-59), forma trans-hélice tipo II na solução aquosa (Cowan (1955) Nature 176:501-503).
[00031] Usando os princípios teóricos da biofísica de polímero, o diâmetro da helicoidal randômica de uma cadeia de 200 resíduos de aminoácidos subiria no caso de poliglicina, por exemplo, a aproximadamente 75 Â - calculado como a raiz quadrada média da J(r2) = l • Jn • C distância de um extremo a outro de
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com n = 200 ligações rotacionáveis de comprimento l = 3,8 Â para cada distância Cα-Cα e ‘proporção característica’ de C~ ~ 2,0 para poli(Gly) (Brant (1967) J Mol Biol 23:47-65; Creighton, (1993) loc.cit.). Esta relação mostra que o versado na técnica esperaria que o volume hidrodinâmico de um polímero de aminoácido de cadeia randômico pode ser estendido por (a) uso de um comprimento de cadeia mais longo l ou por (b) uso de aminoácidos que exibem uma maior proporção característica, C~. C~ é uma medida da dureza inerente da cadeia randômica molecular e tem um valor geral de 9 para a maioria de aminoácidos (Brant (1967) loc.cit.). Somente Gly, que não tem uma cadeia lateral, e também o iminoácido Pro exibe valores significativamente menores. Por isso, espera-se que Gly e Pro (em condições desnaturantes) contribuam para a redução das dimensões das proteínas helicoidais randômicas (Miller (1968) Biochemistry 7:3925-3935). Espera-se que sequências de aminoácido compreendendo resíduos prolina, consequentemente, tenham um volume hidrodinâmico relativamente compacto. Em contraste com este ensinamento, entretanto, mostra-se neste pedido que o volume hidrodinâmico dos polímeros/polipeptídeos de aminoácido da invenção compreendendo uma mistura de resíduos prolina e alanina tem um volume hidrodinâmico dramaticamente aumentado como determinado pela permeação de gel analítico/cromatografia por exclusão de tamanho quando comparado com o volume hidrodinâmico esperado. De fato, é surpreendente que os polipeptídeos que compreendem as misturas destes dois aminoácidos (prolina e alanina), dos quais cada um somente tende a formar um homo-oligopeptídeo com estrutura secundária definida, adotem a conformação helicoidal randômica sob condições fisiológicas. Tais polipeptídeos de prolina/alanina inventivos têm um maior raio hidrodinâmico do que homopolímeros que compreendem o mesmo número de resíduos Gly, por exemplo, e conferem melhor solubilidade às proteínas ou construtos biologicamente ativos, isto é proteínas heterólogas biologicamente ativas ou conjugados de fármaco, de acordo com a invenção.
[00032] Como acima mencionado, os polipeptídeos de prolina/alanina helicoidais randômicos biossintéticos da presente invenção diferenciam-se dos polipeptídeos quimicamente sintetizados em que eles podem adotar um comprimento definido, uniforme, por meios e métodos fáceis. Ao passo que a técnica prévia fornece misturas/composições de polipeptídeos com variações enormes quanto ao comprimento dos peptídeos, a presente invenção pode fornecer misturas/composições de polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos com um comprimento definido. Preferencialmente, essencialmente todos os polipeptídeos da invenção compreendidos em tal mistura/composição têm o mesmo comprimento definido, e, por isso, compartilham as mesmas características bioquímicas. Tal composição uniforme é mais vantajosa em várias aplicações médicas, cosméticas, nutritivas, em que os polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos podem ser empregados. Além disso, em particular, em um contexto médico ou farmacêutico, o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético definido neste pedido ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos consistindo em pelo menos aproximadamente 50, em particular de pelo menos aproximadamente 100, em particular de pelo menos aproximadamente 150, em particular de pelo menos aproximadamente 200, em particular de pelo menos aproximadamente 250, em particular de pelo menos aproximadamente 300, em particular de pelo menos aproximadamente 350, em particular de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina também podem ser usados na prevenção, melhoria e/ou tratamento de distúrbios ligados e/ou afiliados a uma situação prejudicada de plasma sanguíneo, por exemplo, após injúrias, queimaduras, cirurgia e similares. Um uso médico dos ditos polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos ou segmentos de polipeptídeos são, consequentemente, o uso como expansor plasmático. Entretanto, é de notar que conforme esta invenção também os conjugados de fármaco descritos neste pedido e os polipeptídeos heterólogos ou os construtos de polipeptídeo heterólogos podem ser empregados no contexto da intervenção médica ou farmacêutica de um distúrbio relacionado a uma quantidade prejudicada de plasma sanguíneo ou conteúdo de plasma sanguíneo ou de um distúrbio relacionado a um volume de sangue prejudicado.
[00033] Consequentemente, a presente invenção se refere em uma modalidade a um polipeptídeo randômico biossintético (ou segmento do mesmo) compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de pelo menos aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, de pelo menos aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, de pelo menos aproximadamente 150 resíduos de aminoácidos prolina e alanina ou de pelo menos aproximadamente 200 resíduos prolina e alanina, em particular quando compreendido em um construto de proteína/polipeptídeo/polipeptídeo heterólogo ou em um conjugado de fármaco. A presente invenção também se refere a polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de pelo menos aproximadamente 200 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, ainda mais preferencialmente de pelo menos aproximadamente 300 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, particularmente preferencialmente de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, mais particularmente preferencialmente de pelo menos aproximadamente 500 resíduos de aminoácidos prolina e alanina e ainda mais preferencialmente de pelo menos aproximadamente 600 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. A sequência de aminoácidos que forma uma conformação helicoidal randômica pode consistir no máximo de aproximadamente 3000 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, no máximo de 2000 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, no máximo de 1500 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, no máximo de 1200 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, no máximo de aproximadamente 800 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. Consequentemente, o estiramento de sequência de aminoácidos de prolina/alanina pode consistir de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400, de aproximadamente 500, de aproximadamente 600, de aproximadamente 700, de aproximadamente 800, de aproximadamente 900 a aproximadamente 3000 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos biossintética inventiva compreende aproximadamente 200 a aproximadamente 3000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 200 a aproximadamente 2500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 200 aproximadamente até 2000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 200 aproximadamente até 1500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 3000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 2500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 300 aproximadamente até 2000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 300 aproximadamente até 1500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 2500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 400 aproximadamente até 2000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 400 aproximadamente até 1500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 1000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 500 a aproximadamente 3000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 500 a aproximadamente 2500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 500 aproximadamente até 2000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 500 aproximadamente até 1500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 resíduos prolina e alanina 4 aproximadamente 600 a aproximadamente 3000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 600 a aproximadamente 2500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 600 aproximadamente até 2000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 600 aproximadamente até 1500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 3000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 2500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 700 aproximadamente até 2000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 700 aproximadamente até 1500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 1000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 3000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 2500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 800 aproximadamente até 2000 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 800 aproximadamente até 1500 resíduos prolina e alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 resíduos prolina e alanina. Como é evidente do conteúdo desta invenção, as maiores sequências de aminoácido biossintéticas (consistindo essencialmente de prolina e alanina) também estão dentro do escopo desta invenção e podem ser prontamente empregadas nas proteínas ou construtos proteicos biologicamente ativos definidos neste pedido que compreendem como um domínio, de pelo menos dois domínios, de uma dita sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia atividade biológica e como outro domínio de pelo menos dois domínios do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico consistindo em pelo menos aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, de pelo menos aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, de pelo menos aproximadamente 150 resíduos de aminoácidos prolina e alanina, de pelo menos aproximadamente 200, de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350, de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. Tal polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico corresponde à parte helicoidal randômica biossintética de um proteína/construto proteico heterólogo. Estes estiramentos de prolina/alanina biossintéticos consistem no máximo de aproximadamente 3000 resíduos de aminoácidos prolina e alanina. Estas sequências de aminoácido (estiramentos de prolina/alanina) compreendem resíduos prolina e a alanina como principais ou únicos como explicado ainda abaixo.
[00034] É contemplado que é a sequência de aminoácidos biossintética definida neste pedido consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina (P) e alanina (A), que forma/adota/tem uma conformação helicoidal randômica. No caso mais simples, o polipeptídeo biossintético ou segmento de polipeptídeo consiste da sequência de aminoácidos tendo uma conformação helicoidal randômica como definido neste pedido. Entretanto, o polipeptídeo biossintético (ou segmento do mesmo) pode compreender, além do aminoácido descrito neste pedido, a sequência que forma/adota/tem uma conformação helicoidal randômica, sequências de aminoácidos/resíduos de aminoácidos adicionais que não contribuem para a formação da conformação helicoidal randômica ou que não são capazes de formar/adotar/ter uma conformação helicoidal randômica sozinhos. Sem diferir da essência da invenção, também tais polipeptídeos biossintéticos (ou segmentos dos mesmos) são polipeptídeos "helicoidais randômicos biossintéticos" ou segmentos de polipeptídeos. Os resíduos de aminoácidos/sequências de aminoácidos adicionais, por exemplo, podem ser úteis como ligantes. Entre outras coisas, dímeros, trímeros, isto é, em multímeros gerais do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético também são contemplados no contexto da presente invenção e tais multímeros podem ser ligados por sequências/resíduos de aminoácidos que não formam a conformação helicoidal randômica. Um exemplo de uma proteína que pode compreender tal polipeptídeo helicoidal randômico é a proteína biologicamente ativa fornecida neste pedido, que pode, além do polipeptídeo helicoidal randômico consistindo em resíduos de aminoácidos prolina e alanina como definido neste pedido ainda compreendem outro polipeptídeo que têm/medeia a atividade biológica. Novamente, tal construto pode ser um proteína heteróloga, biologicamente ativa, ou construto de polipeptídeo como descrito neste pedido.
[00035] O termo "pelo menos aproximadamente 50/100/150/200/300/400/500/600/700/800/etc. resíduos de aminoácidos" não são limitados ao número conciso de resíduos de aminoácidos mas também compreendem estiramentos de aminoácido que compreendem aproximadamente 1-20% adicionais, como resíduos de 10% a 20% ou aproximadamente 1-20%, como aproximadamente 10% a 20% menos resíduos. Por exemplo, "pelo menos aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos" também podem compreender aproximadamente 80 a 100 e aproximadamente 100 a 120 resíduos de aminoácidos sem diferir da essência da presente invenção. Por exemplo, "pelo menos aproximadamente 200 resíduos de aminoácidos" também pode compreender aproximadamente 160 a 200 e aproximadamente 200 a 240 resíduos de aminoácidos sem diferir da essência desta invenção. A definição e as explicações dadas neste pedido acima aplicam-se, mutatis mutandis, também ao termo "resíduos de aminoácidos no máximo de aproximadamente 3000/2000/1500/1200/800" etc. Consequentemente, o termo "aproximadamente" não é limitado ou restringido ao número conciso de resíduos de aminoácidos no contexto de sequências de aminoácido mais longas (por exemplo, sequências de aminoácidos que compreendem ou consistem de no máximo 3000 resíduos de aminoácidos). Por isso, o termo "no máximo de aproximadamente 3000/2000/1500/1200/800 resíduos de aminoácidos" mas também pode compreender estiramentos de aminoácido que compreendem 10% a 20% a mais ou 10% a 20% menos resíduos sem diferir desta invenção.
[00036] Além disso, os polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos (ou segmentos dos mesmos) são caracterizados por um conteúdo definido ou proporção de resíduos de aminoácidos, em particular dos constituintes principais prolina e alanina. Como acima mencionado, a presente invenção se refere a um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos aproximadamente 50, de pelo menos aproximadamente 100, de pelo menos aproximadamente 150, de pelo menos aproximadamente 200 de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350, de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala) em particular quando compreendida em uma proteína/construto proteico/polipeptídeo ativos biológicos heterólogos ou conjugado de fármaco. O termo "somente" como usado neste pedido significa que preferencialmente pelo menos aproximadamente 90% ou pelo menos aproximadamente 95% dos aminoácidos são prolina e alanina, pelo qual prolina e alanina constituem a maior parte mas podem não ser os únicos resíduos de aminoácidos, isto é, estas sequências de aminoácido inventivas não são necessariamente 100% de estiramentos de aminoácido prolina e alanina. Por isso, as sequências polipeptídicas/de aminoácidos biossintéticas da presente invenção também podem compreender outros aminoácidos do que prolina e alanina como constituintes menores enquanto a sequência de aminoácidos forma/adota/tem conformação helicoidal randômica. Tal conformação helicoidal randômica pode ser facilmente determinada por meios e métodos fornecidos neste pedido. Consequentemente, também no contexto do termo "somente", uma quantidade menor (menos de aproximadamente 10% ou menos de aproximadamente 5%) de outros resíduos de aminoácidos pode estar compreendida. Os ditos "outros" resíduos de aminoácidos menores são definidos neste pedido abaixo.
[00037] Consequentemente, a presente invenção se refere em uma modalidade a um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo) pelo qual a sequência de aminoácidos consiste principalmente de prolina e alanina, e em que os resíduos prolina constituem mais de aproximadamente 10% e menos de 75% da sequência de aminoácidos. Os resíduos alanina compreendem pelo menos os 25% a 90% restantes da dita sequência de aminoácidos (ou o polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico se ele consistir da sequência de aminoácidos).
[00038] Preferencialmente, a sequência de aminoácidos compreende mais de aproximadamente 10%, preferencialmente mais de aproximadamente 12%, mesmo mais preferencialmente mais de aproximadamente 14%, particularmente preferencialmente mais de aproximadamente 18%, mais particularmente preferencialmente mais de aproximadamente 20%, até mais particularmente preferencialmente mais de aproximadamente 22%, 23% ou 24% e ainda mais preferencialmente resíduos prolina de mais de aproximadamente 25%. A sequência de aminoácidos preferencialmente compreende menos de aproximadamente 75%, mais preferencialmente resíduos prolina de menos de 70%, 65%, 60%, 55% ou de 50%, em que os valores mais baixos são preferenciais. Mesmo mais preferencialmente, a sequência de aminoácidos compreende resíduos prolina de menos de aproximadamente 48%, 46%, 44%, 42%. Particularmente preferencial são sequências de aminoácido que compreendem menos de aproximadamente resíduos prolina de 41%, 40%, 39% 38%, 37% ou 36%, pelo qual os valores mais baixos são preferenciais. Ainda mais preferencialmente, a sequência de aminoácidos compreende de resíduos prolina de menos aproximadamente 35%; ver também neste pedido abaixo de construtos de PA fornecidos.
[00039] Vice-versa, a sequência de aminoácidos preferencialmente compreende resíduos alanina de menos de aproximadamente 90%, mais preferencialmente menos de 88%, 86%, 84%, 82% ou de 80%, em que os valores mais baixos são preferenciais. Ainda mais preferencialmente, a sequência de aminoácidos compreende resíduos alanina menos de aproximadamente 79%, 78%, 77%, de 76%, pelo qual os valores mais baixos são preferenciais. O mais preferencialmente, a sequência de aminoácidos compreende menos de resíduos alanina de aproximadamente 75%.
[00040] Também preferencial neste pedido é uma sequência de aminoácidos que compreende mais de aproximadamente 25%, preferencialmente mais de aproximadamente 30%, ainda mais preferencialmente mais de aproximadamente 35%, particularmente preferencialmente mais de aproximadamente 40%, mais particularmente preferencialmente mais de aproximadamente 45% ou 50%, até mais particularmente resíduos alanina de preferencialmente mais de aproximadamente 52%, 54%, 56%, 58% ou 59%, em que os valores mais altos são preferenciais. Ainda mais preferencialmente, a sequência de aminoácidos compreende resíduos alanina de mais de aproximadamente 60%, 61%, 62%, 63% ou 64% e ainda mais preferencialmente resíduos alanina de mais de aproximadamente 65%.
[00041] Consequentemente, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) pode compreender uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos prolina de aproximadamente 25%, e resíduos alanina de aproximadamente 75%. Alternativamente, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) pode compreender uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos prolina de aproximadamente 35% e resíduos alanina de aproximadamente 65%. O termo "aproximadamente X%" como usado neste pedido acima não é limitado ao número exato da porcentagem, mas também compreende valores de 10% a 20% a mais ou 10% a 20% a menos resíduos. Por exemplo, o termo 10% também pode relacionar-se a 11% ou 12% e a 9% e 8%, respectivamente.
[00042] Entretanto, como acima mencionado e ainda detalhado neste pedido abaixo, o dito polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico), e, em particular a sequência de aminoácidos, também pode compreender aminoácidos adicionais que se diferenciam de prolina e alanina como constituintes menores. Como já discutido neste pedido acima, o dito constituinte(s) menor, isto é, outro aminoácido(s) além de prolina ou alanina, pode compreender menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 9%, menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 7%, menos de aproximadamente 6%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3% ou menos de aproximadamente 2% do polipeptídeo/polímero helicoidal randômico biossintético desta invenção.
[00043] O versado conhece que uma sequência/polipeptídeo de aminoácido (ou segmento do mesmo) também pode formar uma conformação helicoidal randômica quando outros resíduos além de prolina e alanina são compreendidos como um constituinte menor na dita sequência de aminoácidos/polipeptídeo (segmento polipeptídico). O termo "constituinte menor" como usado neste pedido significa que resíduos de aminoácidos no máximo de 5% ou no máximo de 10% são diferentes de prolina ou alanina nos polipeptídeos/polímeros helicoidais randômicos biossintéticos inventivo desta invenção. Isto significa que no máximo 10 de 100 aminoácidos podem ser diferentes de prolina e alanina, preferencialmente no máximo 8%, isto é, no máximo 8 de 100 aminoácidos podem ser diferentes de prolina e alanina, mais preferencialmente no máximo 6%, isto é, no máximo 6 de 100 aminoácidos podem ser diferentes de prolina e alanina, ainda mais preferencialmente no máximo 5%, isto é, no máximo 5 de 100 aminoácidos podem ser diferentes de prolina e alanina, particularmente preferencialmente no máximo 4%, isto é, no máximo 4 de 100 aminoácidos podem ser diferentes de prolina e alanina, mais particularmente preferencialmente no máximo 3%, isto é, no máximo 3 de 100 aminoácidos podem ser diferentes de prolina e alanina, até mais particularmente preferencialmente no máximo 2%, isto é no máximo 2 de 100 aminoácidos podem ser diferentes de prolina e alanina e ainda mais preferencialmente no máximo 1%, isto é no máximo 1 de 100 dos aminoácidos que são compreendidos no polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) pode ser diferente de prolina e alanina. Os ditos aminoácidos diferentes de prolina e alanina podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, e Val, incluindo aminoácidos pós-traducionalmente modificados ou aminoácidos não naturais (ver, por exemplo, Budisa (2004) Angew Chem Int Ed Engl 43:6426-6463 ou Young (2010) J Biol Chem 285:11039-11044). No caso em que o "constituinte menor" (isto é, um aminoácido além de prolina e alanina) do polipeptídeo/construto/polímero helicoidal randômico biossintético (ou um fragmento do mesmo) compreende como "outro aminoácido" / "aminoácido diferente" (a) Ser(s), o dito aminoácido Ser/aminoácidos Ser constituem preferencialmente menos de 50%, mais preferencialmente menos de 40%, menos de 30%, menos de 20% ou menos de 10% destes (menores) resíduos de aminoácidos. Na modalidade mais preferencial, o polipeptídeo/construto/polímero helicoidal randômico biossintético como descrito neste pedido ou parte do polipeptídeo helicoidal randômico (por exemplo) de uma proteína de fusão como descrito neste pedido não compreende (a) resíduo(s) serina. É, geralmente, preferencial neste pedido que estes aminoácidos "menores" (além de prolina e alanina) não estejam presentes no polipeptídeo/construto/polímero helicoidal randômico biossintético fornecido neste pedido como descrito neste pedido ou parte de polipeptídeo helicoidal randômico (por exemplo) de uma proteína de fusão. Conforme a invenção, um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo)/a sequência de aminoácidos pode, consistir especialmente, exclusivamente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina (isto é, nenhum outro resíduo de aminoácido está presente no polipeptídeo helicoidal randômico ou na sequência de aminoácidos).
[00044] Ao passo que o acima se refere ao comprimento total e o conteúdo de prolina/alanina da sequência de aminoácidos compreendida no polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo), o seguinte se refere em maiores detalhes às sequências de aminoácido específicas exemplares (ou fragmentos das mesmas).
[00045] Em uma modalidade, as sequências de aminoácidos/de polipeptídeos que adotam conformação helicoidal randômica (o polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento do mesmo como definido neste pedido), por exemplo, em solução aquosa ou sob condições fisiológicas podem compreender uma pluralidade de "repetições de aminoácido" / "cassetes de aminoácido" / "repetições de cassete", em que as ditas "repetições de aminoácido" / "cassetes de aminoácido" / "repetições de cassete" / "bloco de construção" / "módulos" (estes termos são usados neste pedido intercambiavelmente) principalmente ou exclusivamente consistem de resíduos de aminoácidos prolina (Pro, P) e alanina (Ala, A) (representado neste pedido como "PA", ou como "AP"), em que não mais do que 6 resíduos de aminoácidos consecutivos são idênticos. Um "bloco de construção ilustrativo" é, por exemplo, "AP" e que também foi fornecido nos exemplos ilustrativos acrescentados como o domínio helicoidal randômico biossintético funcional da presente invenção. Este exemplo ilustrativo é a sequência "P1A1" como também fornecido na forma de APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51), que é um "poli PA" "repetição de aminoácido" / "cassete de aminoácido" / "repetição de cassete". Em uma modalidade preferencial, a sequência de aminoácidos /polipeptídeos compreendendo as "repetições de aminoácido definidas" / "cassetes de aminoácido" / "repetições de cassete" acima e similares compreende não mais do que 5 resíduos de aminoácidos consecutivos idênticos. Outras modalidades alternativas são fornecidas neste pedido abaixo no contexto de blocos de construção exemplificados, individuais.
[00046] Dentro de um polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) de acordo com esta invenção as repetições de aminoácido podem ser idênticas ou não idênticas. Exemplos não limitantes de "repetições de aminoácidos", "blocos de construção", "módulos", "repetições", "cassetes de aminoácidos" etc. consistindo em resíduos prolina e alanina são fornecidos neste pedido abaixo; ver, p. ex., a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID No. 51 (a listagem de sequências em anexo também compreende sequências de ácidos nucleicos ilustrativas que codificam tais "repetições" / "módulos", etc. As sequências acrescentadas na dita listagem de sequências como depositado com este constituem parte desta especificação e relatório descritivo). Também o uso de fragmentos (idênticos e/ou não idênticos) destas sequências são contemplados neste pedido, pelo qual um "fragmento" compreende pelo menos 2 aminoácidos e compreende pelo menos uma prolina e/ou alanina, preferencialmente pelo menos uma prolina e uma alanina. "Fragmentos" destas sequências a serem empregados conforme esta invenção para a geração do polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) podem consistir de pelo menos 3, preferencialmente de pelo menos 4, mais preferencialmente de pelo menos 5, mesmo mais preferencialmente de pelo menos 6, ainda mais preferencialmente de pelo menos 8, particularmente preferencialmente de pelo menos 10, mais particularmente preferencialmente de pelo menos 12, até mais particularmente preferencialmente de pelo menos 14, ainda mais particularmente preferencialmente de pelo menos 16, e ainda mais preferencialmente de pelo menos 18 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas ditas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 51 (aqui é de notar que a SEQ ID No. 51 consiste em um "AP" ilustrativo ou repetição de "PA").
[00047] Baseado no ensinamento dado neste pedido, o versado na técnica está prontamente em uma posição para gerar sequências de aminoácidos/polipeptídeos adicionais que formam uma conformação helicoidal randômica, por exemplo, sob condições aquosas ou sob fisiológicas e são constituídas principalmente de prolina e alanina como definido neste pedido. Exemplos adicionais da conformação helicoidal randômica que forma sequências de aminoácidos/polipeptídeos a serem usadas como blocos de construção ou módulos do polipeptídeo helicoidal randômico definido neste pedido (ou segmento do mesmo) podem, inter alia, compreender combinações e/ou fragmentos ou versões permutadas circulares dos "blocos de construção específicos", "cassetes de polímero", ou "repetições de polímeros" mostrado acima. Consequentemente, módulos / unidades de sequência / repetições de polímero / cassetes de polímero exemplificados da sequência polipeptídica/de aminoácidos helicoidal randômica também podem fornecer fragmentos individuais que podem ser recentemente combinados para formar módulos / unidades de sequência / repetições de polímero / cassetes de polímero adicionais conforme esta invenção.
[00048] Os termos "módulo(s)", "unidade(s) de sequência", "repetição(ões) de polímero", "cassete(s) de polímero" e "bloco(s) de construção" são usados como sinônimos neste pedido e se referem a estiramentos de aminoácido individuais que podem ser usados para formar o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) / sequência de aminoácidos definidos neste pedido.
[00049] Uma repetição de aminoácido (usado como "bloco de construção" etc. de um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético da presente invenção) pode consistir de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais resíduos de aminoácidos, em que cada repetição compreende um resíduo(s) alanina e prolina. Entretanto, como ilustrado na SEQ ID No. 51 acrescentada, o dito "bloco de construção" também pode consistir simplesmente dos 2 resíduos de aminoácidos P e A fornecidos neste pedido, ou seja na forma de "PA" ou "AP". Em uma modalidade, a repetição de aminoácido de acordo com a presente invenção não compreende mais de 50 resíduos de aminoácidos. Entretanto, é evidente para o versado que tal "repetição" pode compreender até mais de 50 resíduos de aminoácidos, por exemplo, em casos em que o dito polipeptídeo/polímero helicoidal randômico biossintético inventivo compreende mais do que aproximadamente, por exemplo, 100 aminoácidos, mais de aproximadamente 150 aminoácidos, mais de aproximadamente 200 aminoácidos, etc. Consequentemente, a quantidade máxima de resíduos de aminoácidos compreendidos em tal "repetição" é condicionada pelo comprimento total do polipeptídeo biossintético (ou segmento do mesmo) / polímero fornecido neste pedido.
[00050] Ainda, é de notar que as sequências polipeptídicas/de aminoácidos helicoidais randômicas biossintéticas que compreendem as repetições acima etc. devem ter preferencialmente o comprimento total e/ou conteúdo de prolina/alanina como definido e explicado neste pedido acima, isto é, consistem de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoácidos e/ou compreendem mais de aproximadamente 10% e menos de aproximadamente 75% de resíduos prolina. Todas as definições dadas neste pedido acima neste contexto também se aplicam aqui, mutatis mutandis.
[00051] Como discutido detalhadamente neste pedido e como fornecido neste pedido acima, a presente invenção fornece (a) proteína(s) biologicamente ativa, heteróloga ou (a) construto(s) proteico que é particularmente útil em uma configuração farmacêutica, médica e/ou medicinal. Estas proteínas/construtos de proteína biologicamente ativos, heterólogos, compreendem como pelo menos um domínio de pelo menos dois ditos domínios do polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 resíduos prolina (Pro) e alanina (Ala).
[00052] No contexto das proteínas biologicamente ativas, heterólogas, polipeptídeos ou construtos proteicos como descrito neste pedido, o termo "heterólogo" se refere a pelo menos dois domínios dentro das ditas proteínas, os polipeptídeos ou construtos proteicos em que um primeiro dos pelo menos dois ditos domínios confere, tem e/ou medeia uma atividade biológica definida e em que um segundo dos ditos pelo menos dois domínios compreende o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina e pelo qual pelo menos os dois ditos domínios não são encontrados operacionalmente ligados um ao outro na natureza ou não são codificados por uma sequência codificante de ácidos nucleicos única (como uma região de leitura aberta) existente na natureza. O segmento polipeptídico/polipeptídeo helicoidal randômico biossintético que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina fornecido neste pedido e como empregado nos proteínas/construtos de proteínas biologicamente ativos, heterólogos, desta invenção não sejam preferencialmente ainda (quimicamente) modificados, por exemplo, não são preferencialmente nem glicosilados nem hidroxilados.
[00053] É de notar que certas proteínas de ocorrência natural ou proteínas hipotéticas como deduzidas de estiramentos ácidos nucleicos sequenciados encontrados na natureza são descritas como compreendendo um conteúdo relativamente alto (isto é, acima da média) de prolina e alanina. Por exemplo, uma proteína hipotética homóloga foi descrita para a cepa principal de Leishmania Friedlin (Ivens (2005) Science 309, 436-442.). A região de leitura descrita que compreende 1514 tripletos de códon inclui um estiramento de 412 tripletos compostos de códons de 240 Ala, 132 Pro, 34 Lys e 4 Val. Os resíduos Lys, que são positivamente carregados sob condições de tampão fisiológicas, são quase igualmente distribuídos entre esta sequência, sugerindo um efeito solubilizante. Entretanto, como é evidente da revelação neste pedido, tal proteína hipotética homóloga como deduzida de uma molécula de ácido nucleico que ocorre naturalmente ou região de leitura aberta, compreendendo um conteúdo alto de prolina e alanina acima da média não é parte desta invenção. A invenção é baseada no fato que um polipeptídeo helicoidal randômico bastante grande ou segmento polipeptídico que não ocorre na natureza de uma maneira isolada e que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 resíduos prolina (Pro) e alanina (Ala) é fornecido, que é particularmente útil no contexto médico/farmacêutico. Os polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos isolados descritos neste pedido ou segmentos de polipeptídeos que não ocorrem na natureza de uma maneira isolada também são compreendidos no descrito neste pedido (a) proteína(s) biologicamente ativa, heteróloga ou (a) construto(s) proteico que é particularmente útil em uma configuração farmacêutica, médica e/ou medicinal. Estas proteínas/construtos de proteína biologicamente ativos, heterólogos, compreendem como pelo menos um domínio de pelo menos dois ditos domínios do polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 resíduos prolina (Pro) e alanina (Ala).
[00054] Também, proteínas arabinogalactanas (AGPs), proteínas ricas em Pro, e extensinas pertencem a um grande grupo de glicoproteínas, conhecidas como glicoproteínas ricas em hidroxiprolina (Hyp) - (HRGPs), que são expressas em todas as partes do reino vegetal. Tal motivo AGP compreendendo uma repetição Ala-Pro (AP) 51 foi expresso como um peptídeo glicomódulo sintético com proteína fluorescente verde de sequência sinal N-terminal e C-terminal em Arabidopsis thaliana transgênica e investigado como um substrato de prolil hidroxilases e O-glicosilação subsequente dos resíduos hidroxiprolina (Estévez (2006) Plant Physiol. 142, 458-470). Novamente, as cadeias laterais Pro hidroxiladas e/ou glicosiladas descritas, que podem formar ligações de hidrogênio a moléculas de água, parecem ter um efeito solubilizante.
[00055] É de notar que as "proteínas biologicamente ativas descritas neste pedido ou construtos proteicos compreendendo como (pelo menos) um domínio de um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos prolina e alanina" referem-se a proteínas ou construtos proteicos que não ocorrem normalmente na natureza e, dessa forma, são "heterólogos". Além disso, e em contraste com sequências ricas em prolina descritas no reino vegetal, os polipeptídeos/segmentos de polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos descritos neste pedido não são preferencialmente quimicamente modificados, isto é, não são preferencialmente glicosilados ou hidroxilados.
[00056] Uma vantagem particular dos polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos ou segmentos de polipeptídeos desta invenção são seu caráter intrinsecamente hidrofílico mas não carregado. Consequentemente, como os aminoácidos "menores" (exceto prolina e alanina) no polipeptídeo helicoidal randômico biossintético descrito neste pedido ou estiramento de polipeptídeo, tais aminoácidos são preferenciais, que não têm cadeias laterais hidrofóbicas, como Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr ou Trp, e/ou que não tem cadeias laterais carregadas, como Lys, Arg, Asp ou Glu. Conforme esta invenção, contempla-se que (em casos onde tais aminoácidos individuais são, no entanto, compreendidos no segmento polipeptídico/polipeptídeo helicoidal randômico biossintético inventivo) o conteúdo total de cada aminoácido individual que tem uma cadeia lateral hidrofóbica, como Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr ou Trp, e/ou tem uma cadeia lateral carregada, como Lys, Arg, Asp, ou Glu, dentro do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético definido neste pedido (ou segmento do mesmo) não excede 8%, 7%, 6% 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%.
[00057] As sequências polipeptídicas/de aminoácidos helicoidais randômicas biossintéticas da presente invenção podem compreender concatâmeros de blocos individuais que compreendem os estiramentos de prolina/alanina combinados da sequência (Pro)x- (Ala)y, no qual x pode ter um valor de número inteiro de 1 a preferencialmente 15, mais preferencialmente 1 a 10, ainda mais preferencialmente 1 a 5, e y pode ter um valor de número inteiro de 1 a preferencialmente 15, mais preferencialmente 1 a 10, ainda mais preferencialmente 1 a 5, e x e y podem variar entre blocos subsequentes. Os ditos x e y também podem ser um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.
[00058] As sequências de aminoácidos/de polipeptídeos que formam conformação helicoidal randômica em solução aquosa ou sob condições fisiológicas podem ter a fórmula (I): [ProxAla y]n em que x é independentemente selecionado a partir do número inteiro 1 a 5. Além disso, para cada n, y é independentemente selecionado a partir do número inteiro 1 a 5. n, finalmente, é qualquer número inteiro fornecido que o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) / sequência de aminoácidos consista preferencialmente de pelo menos aproximadamente 50, de pelo menos aproximadamente 100, de pelo menos aproximadamente 150, de pelo menos aproximadamente 200, de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350, de pelo menos aproximadamente 400 resíduos de aminoácidos e até aproximadamente 3000 resíduos de aminoácidos. Também neste contexto é de notar que as sequências polipeptídicas/de aminoácidos que compreendem os concatâmeros acima ou têm a fórmula (I) acima devem ter preferencialmente o comprimento total e/ou conteúdo de prolina/alanina como definido e explicado neste pedido acima, isto é, consistem de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, aproximadamente 200, de aproximadamente 300, de de aproximadamente 150, de aproximadamente 250, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoácidos e/ou compreendem mais de aproximadamente 10% e menos de resíduos prolina de aproximadamente 75%. Novamente, todas as definições dadas neste pedido acima neste contexto também se aplicam aqui, mutatis mutandis.
[00059] A presente invenção também se refere a polipeptídeos helicoidais randômicos ((a) segmento(s) de polipeptídeos) / sequências de aminoácidos compreendendo um estiramento de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3 sendo um exemplo de [Pro1Ala3]5); AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5); AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6) e APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51 sendo um exemplo de [Pro1Ala1]10) ou versões permutadas circulares ou (a) multímeros(s) destas sequências como um conjunto ou partes destas sequências. Consequentemente, o polipeptídeo helicoidal randômico ((a) segmento(s) de polipeptídeo do mesmo) / sequência de aminoácidos) pode compreender o estiramento de aminoácido AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1), AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3); AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5); AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6) e APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51), bem como combinações destes motivos ou combinações de fragmentos e partes destes motivos enquanto o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético resultante consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala).
[00060] Também as versões permutadas circulares das sequências de aminoácidos acima podem ser usadas conforme a presente invenção. Versões permutadas circulares exemplares, por exemplo, AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1) podem ser facilmente geradas, por exemplo, removendo a primeira alanina e adicionando outra alanina no fim da sequência acima. Tal versão permutada circular da SEQ ID NO: 1 então seria APAAPAPAAPAAPAPAAPAA (SEQ ID NO: 7). Ainda, exemplos não limitantes de versões permutadas circulares de SEQ ID No. 1 são: PAAPAPAAPAAPAPAAPAAA (SEQ ID NO: 8), AAPAPAAPAAPAPAAPAAAP (SEQ ID NO: 9), APAPAAPAAPAPAAPAAAPA (SEQ ID NO: 10), PAPAAPAAPAPAAPAAAPAA (SEQ ID NO: 11), APAAPAAPAPAAPAAAPAAP (SEQ ID NO: 12), PAAPAAPAPAAPAAAPAAPA (SEQ ID NO: 13), AAPAAPAPAAPAAAPAAPAP (SEQ ID NO: 14), APAAPAPAAPAAAPAAPAPA (SEQ ID NO: 15), PAAPAPAAPAAAPAAPAPAA (SEQ ID NO: 16), e similares. Baseado no ensino da presente invenção, um versado está facilmente na posição de gerar versões permutadas circulares correspondentes dos estiramentos de aminoácido como mostrados na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO. 51 (a dita SEQ ID NO. 51 sendo inteiramente baseada em repetições de "AP" e uma versão circular permutada pode ser baseada inteiramente em repetições de "PA" ou "AP"/blocos de construções).
[00061] Tais versões permutadas circulares também podem ser consideradas como exemplos do "módulo"/"bloco de construção" adicional etc. das sequências polipeptídicas/de aminoácidos neste pedido fornecidas que podem ser usadas consequentemente neste pedido.
[00062] É evidente para o versado na técnica que também "módulos" e fragmentos (mais curtos) ou versões permutadas circulares dos estiramentos de aminoácido fornecidos neste pedido podem ser usados como "módulos", "repetições" e/ou blocos de construção do polipeptídeo helicoidal randômico definido neste pedido (ou segmento do mesmo) / sequência de aminoácidos.
[00063] Conforme o acima mencionado, a sequência polipeptídica/de aminoácidos helicoidal randômica que forma uma conformação helicoidal randômica pode compreender um multímero de qualquer um dos estiramentos de aminoácido acima (ou versões permutadas circulares ou fragmentos dos mesmos), preferencialmente os mostrados na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO. 51. É de se notar que estas sequências não estão limitando de modo nenhum no contexto desta invenção.
[00064] Novamente, as sequências polipeptídicas/de aminoácidos que compreendem os estiramentos de aminoácido acima (ou fragmentos dos mesmos), versões circulares mutadas (ou fragmentos das mesmas) devem ter preferencialmente o comprimento total e/ou conteúdo de prolina/alanina como definido e explicado neste pedido acima, isto é, consistir de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoácidos e/ou compreender mais de aproximadamente 10% e menos de resíduos prolina de aproximadamente 75%. Todas as definições dadas neste pedido acima neste contexto também se aplicam aqui, mutatis mutandis. Também o termo "fragmento" foi definido acima.
[00065] Como acima mencionado, no contexto desta invenção foi constatado surpreendentemente que os polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos (ou segmento polipeptídico) / polímeros fornecidos neste pedido são caracterizados por um volume hidrodinâmico relativamente grande. Este volume hidrodinâmico, também chamado tamanho aparente, pode ser facilmente determinado por filtração de gel analítico (também conhecido como cromatografia por exclusão de tamanho, SEC). Preferencialmente, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) tem um tamanho aparente de pelo menos 10 kDa, preferencialmente de pelo menos 25 kDa, mais preferencialmente de pelo menos 50 kDa, ainda mais preferencialmente de pelo menos 100 kDa, particularmente preferencialmente de pelo menos 200 kDa e ainda mais preferencialmente de pelo menos 400 kDa. O versado na técnica é prontamente capaz de determinar o volume hidrodinâmico de proteínas específicas. Tais métodos podem incluir espalhamento de luz dinâmico/estático, ultracentrifugação analítica ou filtração em gel analítico como exemplificado neste pedido abaixo. A filtração em gel analítico representa um método conhecido na técnica para medir o volume hidrodinâmico de macromoléculas. Alternativamente, o volume hidrodinâmico de um polipeptídeo globular pode ser estimado pelo seu peso molecular (Creighton (1993) loc. cit.). Como descrito neste pedido, o volume hidrodinâmico dos polipeptídeos da invenção que consiste preferencialmente de pelo menos aproximadamente 50, de pelo menos aproximadamente 100, de pelo menos aproximadamente 150, de pelo menos aproximadamente 200, de pelo menos aproximadamente 250, de pelo menos aproximadamente 300, de pelo menos aproximadamente 350, de pelo menos aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 resíduos de aminoácidos prolina e alanina e tem conformação helicoidal randômica mostra valores inesperadamente altos em relação ao volume hidrodinâmico que seria estimado para uma proteína enovelada, globular, correspondente baseada no peso molecular. O seguinte se refere a proteínas biologicamente ativas, heterólogas ou construtos proteicos compreendendo, inter alia, o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo) como descrito e definido neste pedido acima do qual representam uma modalidade preferencial da presente invenção. Sem estar ligado pela teoria, foi verificado surpreendentemente no contexto da presente invenção que o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético se estende como fornecido neste pedido e consistindo somente de prolina e alanina podem, até fornecer um volume hidrodinâmico mais alto do que um estiramento helicoidal randômico biossintético correspondente que tem o mesmo número total de resíduos de aminoácidos mas consiste somente de prolina, alanina e serina (conforme WO 2008/155134).
[00066] As proteínas plasmáticas humanas comuns, tais como albumina sérica (HSA) e imunoglobulinas (Igs), incluindo anticorpos humanizados, mostram meias-vidas longas, tipicamente de 2 a 3 semanas, que é atribuível à sua interação específica com o receptor Fc neonatal (FcRn), levando à reciclagem endossômica (Ghetie (2002) Immunol Res, 25:97-113). Ao contrário, a maioria das outras proteínas de interesse farmacêutico, em particular, fragmentos de anticorpo recombinantes, hormônios, interferons, etc. sofrem de depuração rápida (sangue). Isto particularmente é verdade para proteínas cujo tamanho está abaixo do valor liminar da filtração renal de aproximadamente 70 kDa (Caliceti (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277). Nestes casos, a meia-vida plasmática de uma proteína farmacêutica não modificada pode ser consideravelmente menos de uma hora, dessa forma tornando-a essencialmente inútil para a maioria das aplicações terapêuticas. A fim de alcançar a ação farmacológica sustentada e também complacência melhorada do paciente - com intervalos de dosagem necessários que se estendem por dias ou até semanas - várias estratégias foram anteriormente estabelecidas para fins de desenvolvimento de fármaco biofarmacêutico.
[00067] Em primeiro lugar, o mecanismo de reciclagem de proteínas plasmáticas natural foi empregado pela produção de proteínas de fusão com a porção Fc de Igs, por exemplo, Enbrel®, um híbrido entre o domínio extracelular de receptor de TNFα e IgG1 humana (Goldenberg (1999) Ther Clin 21:75-87) ou com albumina sérica, por exemplo, Albuferon® (albinterferon alfa-2b, ZALBIN™, JOULFERON®), uma fusão correspondente de IFNalfa com HSA (Osborn (2002) Pharmacol Exp Ther J 303:540-548). Albumina com sua alta concentração plasmática de 600 μm também foi utilizada de uma maneira indireta, servindo como veículo carreador de produtos biofarmacêuticos que são equipados com uma função de ligação à albumina, por exemplo, via fusão com um domínio de ligação à albumina bacteriana (ABD) da proteína G de Streptococcus (Makrides (1996) Pharmacol Exp Ther J 277:534-542) ou com um peptídeo selecionado contra HSA de uma biblioteca de exposição de fago (Dennis (2002) J Biol Chem, 277:35035-35043; Nguyen (2006) Protein Eng Des Sel 19:291-297).
[00068] Em segundo lugar, uma metodologia fundamentalmente diferente para prolongar a meia-vida plasmática de produtos biofarmacêuticos é a conjugação com polímeros químicos altamente solvatados e fisiologicamente inertes, dessa forma efetivamente alargando o raio hidrodinâmico da proteína terapêutica além do tamanho de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (Caliceti (2003) loc. cit.). Acoplamento covalente sob condições bioquimicamente brandas com derivados ativados de polietilenoglicol (PEG), randomicamente via cadeias laterais de Lys (Clark (1996) J Biol Chem 271:21969-21977) ou por meio de resíduos Cys especificamente introduzidos (Rosendahl (2005) BioProcess International:52-60) teve sucesso moderado e está sendo atualmente aplicado em vários fármacos aprovados. As vantagens correspondentes foram alcançadas especialmente em conjunto com pequenas proteínas que possuem atividade farmacológica específica, por exemplo, Pegasys®, um IFNa-2a recombinante quimicamente PEGilado (Harris (2003) Nat Rev Drug Discov, 2:214-221; Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870).
[00069] Entretanto, o acoplamento químico de uma proteína biologicamente ativa com polímeros sintéticos tem desvantagens com respeito a desenvolvimento biofarmacêutico e produção. Derivados de PEG adequados são caros, sobretudo como alta pureza é necessária, e sua conjugação com uma proteína recombinante requer etapas de purificação e processamento in vitro adicionais, que reduzem o rendimento e aumentam os custos de fabricação. De fato, PEG muitas vezes é contaminado com aldeídos e peróxidos (Ray (1985) Biochem Anal 146:307-312) e é intrinsecamente propenso à degradação química sobre o armazenamento na presença de oxigênio. Também, a função farmacêutica de uma proteína terapêutica pode ser impedida se as cadeias laterais de aminoácido na proximidade do seu sítio ativo bioquímico forem modificadas pelo processo de PEGilação. Além disso, o acoplamento químico com polímeros sintéticos normalmente resulta em uma mistura heterogênea de moléculas que podem mostrar uma variação substancial da atividade in vivo.
[00070] Em terceiro lugar, o uso de análogos de glicosilação de proteínas biologicamente ativas nas quais as novas sequências de consenso de glicosilação N-ligadas são introduzidas foi proposto para prolongar a meia-vida plasmática; ver WO 02/02597; Perlman (2003) Clin Endocrinol Metab J 88:2327-2335; ou Elliott (2003) Nat Biotechnol 21:414-420). As proteínas glicoengendradas descritas, entretanto, expuseram uma atividade in vivo alterada, que indica que as novas cadeias laterais de carboidrato influenciam na atividade biológica da proteína engendrada. Além disso, cadeias laterais de carboidrato adicionais provavelmente aumentarão a antigenicidade das moléculas ativas biológicas resultantes, que causa preocupações de segurança substanciais. Além disso, as proteínas de fusão que compreendem a sequência repetitiva artificial derivada de Trypanosoma cruzi relatou que PSTAD induz uma meia-vida plasmática prolongada de trans- sialidase (Alvarez (2004) JBC 279:3375-3381). Ainda, tais repetições derivadas de Trypanosoma cruzi têm sido relatadas induzir uma resposta imune humoral (Alvarez (2004) loc. cit.). Consequentemente, estratégias alternativas de prolongar a ação de proteínas biologicamente ativas são desejadas.
[00071] As sequências de aminoácidos/de polipeptídeos biossintéticas como descritas neste pedido e consistindo somente de prolina e alanina de acordo com a invenção foram surpreendentemente verificadas adotando conformação helicoidal randômica em particular sob condições fisiológicas. Por isso, são moléculas vantajosas para fornecer neste pedido abaixo o "segundo domínio definido" da proteína(s) / polipeptídeo(s) biologicamente ativos, isto é, compreendendo um estiramento de polipeptídeo que forma sob condições fisiológicas uma conformação helicoidal randômica e por meio disso medeia uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro para proteína(s) ou polipeptídeo(s) biologicamente ativos ("funcional"), em particular, uma meia-vida plasmática aumentada. O volume hidrodinâmico de uma proteína funcional que é fundida ao dito domínio helicoidal randômico é dramaticamente aumentado como pode ser estimado usando métodos padrão mencionados neste pedido. Uma vez que pensava-se que o domínio helicoidal randômico não interfere na atividade biológica do primeiro domínio da proteína biologicamente ativa, a atividade biológica mediada pela proteína funcional de interesse ao qual é fundida é essencialmente conservada. Além disso, pensa-se que os polímeros de aminoácidos/polipeptídeos que formam o domínio helicoidal randômico como descrito neste pedido são biologicamente basicamente inertes, especialmente com respeito à proteólise em plasma sanguíneo, imunogenicidade, ponto isoelétrico / comportamento eletrostático, ligando-se a receptores de superfície celular bem como internalização, mas ainda biodegradável, que fornece vantagens claras quanto a polímeros sintéticos, tais como PEG.
[00072] Conforme o acima mencionado, a presente invenção se refere a uma proteína biologicamente ativa compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético descrito neste pedido. Tal proteína/construto proteico biologicamente ativo compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético descrito neste pedido é uma proteína/construto proteico ativo biológico heterólogo. Em particular, descrito neste pedido também é/são (a) proteína(s) biologicamente ativa heteróloga compreendendo ou consistindo em pelo menos dois domínios em que (a) um primeiro domínio dos pelo menos dois ditos domínios compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos a atividade biológica dita que tem e/ou Okmedeia*(mediating); e (b) um segundo domínio dos pelo menos dois ditos domínios compreende ou consiste do polipeptídeo helicoidal randômico descrito neste pedido e definido ou segmento polipeptídico.
[00073] É de notar que conforme a presente invenção, que os ditos "primeiro domínio" e "segundo domínio" se relacionam a estiramentos proteicos que não ocorrem naturalmente dentro da mesma proteína ou não se espera que estes sejam parte da mesma proteína hipotética como codificada por uma sequência de ácidos nucleicos codificante (como uma região de leitura aberta) como encontrado na natureza.
[00074] As definições e explicações dadas neste pedido acima no contexto do polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento de polipeptídeo do mesmo aplicam-se, mutatis mutandis, no contexto de proteínas biologicamente ativas compreendendo o dito polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento(s) de polipeptídeo do mesmo).
[00075] Preferencialmente, a dita conformação helicoidal randômica medeia uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro da dita proteína biologicamente ativa, como estabilidade in vivo e/ou in vitro em amostras biológicas ou em ambientes fisiológicos.
[00076] Por exemplo, contempla-se neste pedido que as proteínas compreendendo um "segundo domínio" adicional definido neste pedido adotam uma conformação helicoidal randômica em solução aquosa ou sob condições fisiológicas (por exemplo, polímeros consistindo em aproximadamente 200 ou aproximadamente 400 ou aproximadamente 600 resíduos de aminoácidos e compreendendo PA#1/SEQ ID NO. 1, PA#2/SEQ ID NO. 2, PA#3/SEQ ID NO. 3, PA#4/SEQ ID NO. 4, PA#5/SEQ ID NO. 5, PA#6/SEQ ID NO. 6 e/ou P1A1/SEQ ID NO. 51 como "blocos de construção") têm uma estabilidade sérica vantajosa ou meia-vida plasmática, mesmo in vivo, (em particular se intravenosamente administradas) quando comparadas a um controle sem a dita conformação helicoidal randômica.
[00077] Em WO 2008/155134 (como discutido neste pedido acima) mostrou-se que as proteínas biologicamente ativas que compreendem um domínio com uma sequência de aminoácidos que adota uma conformação helicoidal randômica têm uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro. Os domínios helicoidais randômicos descritos em WO 2008/155134 consistem, especialmente, de resíduos prolina, alanina e serina (PAS). A presença destes três resíduos é descrita neste documento de técnica prévia como uma exigência essencial para a formação de uma helicoidal randômica estável e solúvel em solução aquosa.
[00078] Como discutido na introdução neste pedido acima, WO 2007/103515 descreve polímeros recombinantes não estruturados que compreendem como constituintes principais uma grande variedade de aminoácidos, inter alia, glicina, aspartato, alanina, serina, treonina, glutamato e prolina. Entretanto, o termo "polímero recombinante não estruturado" tem, em contraste com os termos "biossintético" e "helicoidal randômico", nenhum significado reconhecido, claro.
[00079] Também foi mencionado WO 2006/081249 neste pedido acima. Este documento descreve conjugados proteicos compreendendo uma proteína biologicamente ativa acoplada a um polipeptídeo compreendendo 2 a 500 unidades de uma repetição de aminoácido tendo Gly, Asn, e Gln como um constituinte principal e Ser, Thr, Asp, Gln, Glu, His e Asn como um constituinte menor. Os ditos conjugados proteicos são descritos para ter uma meia-vida plasmática aumentada ou reduzida quando comparados à proteína não conjugada biologicamente ativa. WO 2006/081249, entretanto, não fornece nenhum ensinamento para predizer se uma repetição de aminoácido específica reduz ou aumenta a meia-vida plasmática do conjugado. Além disso, WO 2006/081249 não ensina ou sugere que a meia-vida plasmática de proteínas possa ser aumentada quando a proteína conjugada compreende uma repetição de aminoácido que forma uma conformação helicoidal randômica como mostrada na presente invenção. Além disso, as repetições de aminoácido descritas em WO 2006/081249 compreendem pelo menos dois resíduos selecionados a partir de Gly, Asn e Gln, que estão em claro contraste com os polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos da presente invenção que compreendem uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina.
[00080] Surpreendentemente, foi encontrado neste pedido que as sequências de aminoácido helicoidais randômicas biossintéticas fornecidas neste pedido que, em contraste com a técnica prévia, somente compreendem resíduos prolina e alanina (isto é, que preferencialmente não compreendem uma quantidade substancial de nenhum outro aminoácido, também nenhuma quantidade substancial de serina ou nenhuma serina em absoluto) realmente também formem uma estrutura helicoidal randômica útil. Isto é particularmente inesperado dada a revelação em WO 2008/155134 de proteínas de fusão com um domínio composto somente de resíduos serina e alanina (SA), isto é, onde os resíduos prolina foram omitidos, demonstrando que tal domínio que compreende somente dois tipos de aminoácidos não formou uma helicoidal randômica, mas uma estrutura de β-folha. Estes domínios de alanina da serina também não mostraram um volume hidrodinâmico tão aumentado como observado com "PAS" ou, especialmente, com as sequências "P/A" fornecidas neste pedido.
[00081] Como usado neste pedido, o termo "atividade biológica" descreve o efeito biológico de uma substância na matéria viva. Consequentemente, os termos "proteína biologicamente ativa", como usados neste pedido, referem-se a proteínas que são capazes de induzir um efeito biológico em células/organismos vivos que são expostos à dita proteína ou polipeptídeo. Ainda, é de notar que no contexto da presente invenção, o termo "proteína biologicamente ativa" se refere à proteína inteira da invenção que compreende tanto uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a dita atividade biológica (o dito primeiro domínio) como a sequência de aminoácidos inventiva que adota/forma a conformação helicoidal randômica e consistindo somente de prolina e alanina (o dito segundo domínio).
[00082] Consequentemente, os termos "sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a atividade biológica" ou "sequência de aminoácidos com atividade biológica" como usados neste pedido para o "primeiro domínio definido" acima mencionado da proteína biologicamente ativa da invenção, que medeiam ou têm ou são capazes de mediar ou ter a "atividade biológica definida" acima. Também são compreendidos nos termos "sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a atividade biológica" ou "sequência de aminoácidos com atividade biológica" qualquer proteína de interesse (e fragmentos funcionais da mesma, tais como fragmentos de anticorpo, fragmentos compreendendo domínio(s) extracelular ou intracelular de um receptor de membrana, formas truncadas de um fator de crescimento ou citocina e similares), a meia-vida da qual, in vivo ou in vitro, tem que ser prolongada. Em uma modalidade desta invenção, a sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a atividade biológica conforme a presente invenção pode ser deduzida de qualquer "proteína de interesse", isto é, qualquer proteína de interesse farmacêutico ou biológico ou qualquer proteína que é útil como um agente terapêutico/diagnóstico.
[00083] Consequentemente, as proteínas biologicamente ativas podem compreender um primeiro domínio que compreende uma sequência de aminoácidos biologicamente ativa que é derivada de polipeptídeos naturalmente produzidos ou polipeptídeos produzidos pela tecnologia de DNA recombinante. Em uma modalidade preferencial, a proteína de interesse pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em proteínas de ligação/moléculas de ligação, imunoglobulinas, fragmentos de anticorpo, proteínas de transporte, receptores de membrana, proteínas/peptídeos sinalizadores, tais como citocinas, fatores de crescimento, hormônios ou enzimas e similares.
[00084] Como explicado neste pedido acima, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico) compreendido no segundo domínio da proteína biologicamente ativa forma uma conformação helicoidal randômica, em particular, sob condições fisiológicas. Isto é particularmente relevante no contexto de proteínas biologicamente ativas que podem ser parte de uma composição farmacêutica que deve ser administrada a um indivíduo ou paciente.
[00085] É de notar que o domínio helicoidal randômico biossintético inventivo (o dito "segundo domínio") da proteína biologicamente ativa nativamente (isto é, sob condições fisiológicas) adota/forma/tem conformação helicoidal randômica, em particular in vivo e quando administrado a mamíferos ou pacientes humanos em necessidade de intervenção médica. Pelo contrário, é conhecido na técnica que proteínas tendo uma estrutura secundária e/ou terciária não randômica como conformação nativa tendem a adotar uma conformação helicoidal randômica sob condições não fisiológicas (isto é, em condições desnaturantes). Entretanto, tais proteínas desnaturadas têm características completamente diferentes em comparação com a proteína biologicamente ativa compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico da presente invenção. Por isso, é a essência desta invenção que a "proteína biologicamente ativa" e a parte biologicamente ativa das proteínas de fusão/construtos de fusão fornecidos neste pedido mantenha sua função biológica também quando combinados e/ou ligados com o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento polipeptídico) desta invenção.
[00086] Além disso, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico) conserva a solubilidade sob condições fisiológicas. Consequentemente, também é contemplado que o construto proteico da presente invenção (compreendendo o "primeiro" e "segundo domínio" acima definidos) pode compreender o "segundo", domínio que forma/adota helicoidal randômica transientemente ou temporariamente em não conformação helicoidal randômica, por exemplo, quando na forma de uma composição específica, como um liofilizado ou composição seca. Ainda, é importante que tal "segundo domínio" do construto proteico inventivo novamente adote, por exemplo, após reconstituição em tampões correspondentes (tampões/excipientes e/ou solventes preferencialmente "fisiológicos"), a conformação helicoidal randômica neste pedido definida. O dito "segundo domínio" é (se necessário, após reconstituição correspondente) capaz de mediar uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro da proteína inventiva biologicamente ativa. É preferencial neste pedido que "o segundo domínio" como definido neste pedido consiste do polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico) da presente invenção.
[00087] Como usado neste pedido, o termo "domínio" se refere a qualquer região/parte de uma sequência de aminoácidos que é capaz de autonomamente adotar uma estrutura e/ou função específicas. No contexto da presente invenção, consequentemente, um "domínio" pode representar um domínio funcional ou um domínio estrutural. Como descrito neste pedido, as proteínas da presente invenção compreendem pelo menos um domínio/parte que tem e/ou medeia a atividade biológica e pelo menos um domínio/parte que forma uma conformação helicoidal randômica. Além disso, as proteínas da invenção também podem consistir de mais de dois domínios e podem compreender, por exemplo, um ligante adicional ou estrutura espaçadora entre os dois domínios/partes definidos neste pedido ou outro domínio/parte como, por exemplo, um sítio de clivagem sensível à protease, um marcador de afinidade, tal como o marcador His6 ou marcador Strep, um peptídeo sinal, peptídeo de retenção, um peptídeo de direcionamento como um peptídeo de translocação de membrana ou domínios efetores adicionais como fragmentos de anticorpo para o direcionamento do tumor associado a uma toxina antitumoral ou uma enzima da ativação do pró-fármaco etc.
[00088] Em outra modalidade, a proteína biologicamente ativa da invenção tem um volume hidrodinâmico como determinado pela filtração em gel analítico (também conhecido como cromatografia por exclusão de tamanho, SEC) de pelo menos 50 kDa, preferencialmente de pelo menos 70 kDa, mais preferencialmente de pelo menos 80 kDa, ainda mais preferencialmente de pelo menos 100 kDa, particularmente preferencialmente de pelo menos 125 kDa e ainda mais preferencialmente de pelo menos 150 kDa. O versado na técnica é prontamente capaz de determinar o volume hidrodinâmico de proteínas específicas. Métodos exemplares foram descritos neste pedido acima no contexto do polipeptídeo helicoidal randômico. Um versado está facilmente na posição de adaptar tais métodos também no contexto da proteína biologicamente ativa da presente invenção. Como descrito neste pedido abaixo, o volume hidrodinâmico das proteínas biologicamente ativas da invenção que compreendem o segundo domínio definido acima, isto é, o domínio que compreende ou consiste do polipeptídeo helicoidal randômico neste pedido fornecido (ou segmento do mesmo) é mostrado ter um volume hidrodinâmico inesperadamente grande em relação ao volume hidrodinâmico estimado de uma proteína enovelada, globular correspondente baseado em seu peso molecular ou número/composição de resíduos de aminoácidos.
[00089] Deve ser observado que o primeiro domínio que compreende "uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a atividade biológica" também pode adotar sua atividade biológica no contexto ou após associação com outra sequência de polipeptídeos ou de aminoácidos. Por exemplo, o fragmento Fab de um anticorpo, tal como aquele do anticorpo antitumoral Herceptina (Eigenbrot (1993) J. Mol. Biol. 229:969-995) consiste em duas cadeias polipeptídicas diferentes, a cadeia leve de imunoglobulina e um fragmento da imunoglobulina cadeia pesada, que pode ser além disso ligada através de uma ligação(ões) intercadeia dissulfeto. De acordo com a presente invenção, pode ser suficiente ligar uma daquelas cadeias (por exemplo, através de fusão gênica) ao polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico) enquanto a proteína completa biologicamente ativa é reconstituída por meio de associação a outra cadeia. Tal reconstituição pode ser alcançada, por exemplo, pela coexpressão dos polipeptídeos diferentes (por um lado, uma proteína de fusão de uma cadeia e o polipeptídeo helicoidal randômico, por outro lado, a outra cadeia) na mesma célula hospedeira, como descrito nos exemplos acrescentados, ou pela reconstituição in vitro, por exemplo, como parte de um protocolo de re-enovelamento.
[00090] Consequentemente, também tais proteínas (compreendendo duas cadeias polipeptídicas separadas) são consideradas como proteínas biologicamente ativas conforme a presente invenção. Em tal caso, o primeiro domínio como definido neste pedido pode compreender duas cadeias polipeptídicas separadas que somente são ligadas não covalentemente. Além disso, as cadeias independentes da proteína/domínio biologicamente ativos podem ser cada um ligado ao polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico). Junto de fragmentos de anticorpo há muitas outras proteínas homo- ou hetero-oligoméricas de interesse (por exemplo, insulina, hemoglobina e similares) que são compostos de várias cadeias polipeptídicas associadas e que são assunto a esta invenção.
[00091] Como usado neste pedido, o termo "proteína de ligação" se refere a uma molécula que é capaz de interagir especificamente com o parceiro(s) de ligação potencial para que seja capaz de discriminar entre o dito parceiro(s) de ligação potencial e uma pluralidade de moléculas diferentes como o dito parceiro(s) de ligação potencial a tal ponto que, de um agrupamento da dita pluralidade de moléculas diferentes como parceiro(s) de ligação potencial, somente o dito parceiro(s) de ligação potencial está ligado, ou está significativamente ligado. Os métodos da medida de ligação entre uma proteína de ligação e um parceiro de ligação potencial são conhecidos na técnica e podem ser rotineiramente realizados, por exemplo, pelo uso de ELISA, calorimetria de titulação isotérmica, diálise de equilíbrio, ensaios pull down, ressonância de plásmons de superfície ou um aparelho Biacore. Proteínas de ligação/moléculas de ligação exemplares que são úteis no contexto da presente invenção incluem, mas não são limitadas a anticorpos, fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), regiões variáveis isoladas de anticorpos (regiões VL e/ou VH), CDRs, anticorpos/imunoglobulinas de domínio único, peptideomiméticos derivados de CDR, lectinas, domínios de imunoglobulina, domínios de fibronectina, domínios de proteína A, domínios de SH3, domínios de repetição de anquirina, lipocalinas ou vários tipos de proteínas de ligação derivadas de estruturas como descrito, por exemplo, em Skerra (2000) J Mol Recognit 13:167-187, Gebauer (2009) Curr Opin Chem Biol 13:245-255, Binz (2005) Nat Biotechnol 23:1257-1268 ou Nelson (2009) Nat Biotechnol 27:331-337.
[00092] Outras proteínas exemplares biologicamente ativas de interesse (em particular proteínas compreendidas no primeiro domínio ou constituindo/sendo o primeiro domínio da proteína biologicamente ativa) que são úteis no contexto da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, fator estimulante de colônia de granulócito, hormônio de crescimento humano, alfa-interferon, beta-interferon, gama-interferon, lambda-interferon, fator de necrose tumoral, eritropoietina, fatores de coagulação, tais como fator de coagulação VIII, fator de coagulação VIIa, fator de coagulação IX, gp120/gp160, receptor I e II de fator de necrose tumoral solúvel, trombolíticos, tais como reteplase, peptídeos com efeitos metabólicos, tais como GLP-1 ou exendina-4, proteínas imunossupressivas/imunorregulatórias como antagonistas de receptor de interleucina 1 ou anakinra, interleucina 2 e lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos ou outras lipocalinas naturais ou engendradas ou aquelas proteínas ou compostos listados, por exemplo, em Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870 ou Walsh (2004) Eur J Pharm Biopharm 58:185-196 ou listados em bancos de dados online tal como http:// www.biopharma.com/approvals.html ou http:// www.drugbank.ca. Mais proteínas biologicamente ativas (em particular, proteínas compreendidas no primeiro domínio ou constituindo/sendo o primeiro domínio da proteína biologicamente ativa) que podem ser empregadas no contexto da presente invenção são, inter alia, hormônio estimulante de folículo, glicocerebrosidase alfa-timosina 1, glucagon, somatostatina, adenosina deaminase, interleucina 11, hematida, leptina, interleucina 20, subunidade alfa de receptor de interleucina 22 (IL-22ra), interleucina 22, hialuronidase, fator de crescimento de fibroblasto 18, fator de crescimento de fibroblasto 21, peptídeo 1 similar a glucagon, osteoprotegerina, proteína de ligação a IL-18, fator de liberação de hormônio de crescimento, receptor de TACI solúvel, trombospondina-1, receptor de VEGF solúvel Flt-1, α-galactosidase A, antagonista de miostatina, polipeptídeo inibitório gástrico, alfa-antitripsina 1, muteína de IL-4, e similares. Como será evidente da revelação neste pedido, a presente invenção também se refere à compreensão do polipeptídeo helicoidal prolina/alanina randômico biossintético ou segmento polipeptídico prolina/alanina e moléculas farmaceuticamente ou medicamente úteis, como pequenas moléculas, peptídeos ou biomacromoléculas, tais como proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, vesículas de lipídio e similares, em particular proteínas farmaceuticamente ou medicamente úteis, como (mas não limitado a) as moléculas de proteínas/ligação de ligação, imunoglobulinas, fragmentos de anticorpo, proteínas de transporte, receptores de membrana, proteínas/peptídeos sinalizadores, citocinas, fatores de crescimento, hormônios ou enzimas e similares podem ser compreendidos em construtos de fármaco definidos neste pedido mas também podem ser parte da proteína biologicamente ativa heteróloga definida neste pedido, compreendendo ou consistindo em pelo menos dois ditos domínios definidos. Em tal caso, as ditas particulares proteínas farmaceuticamente ou medicamente úteis (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser o "primeiro domínio" de pelo menos dois ditos domínios compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a dita atividade biológica. Fragmentos funcionais, neste contexto, são fragmentos das ditas proteínas farmaceuticamente ou medicamente úteis que são ainda capazes de elucidar a resposta biológica ou farmacêutica desejada in vivo e/ou in vitro e/ou ainda ter ou mediar a atividade biológica desejada.
[00093] O ligante/espaçador do polipeptídeo supracitado, inserido entre o dito primeiro e o dito segundo domínio, compreende preferencialmente aminoácidos hidrofílicos plurais ligados a peptídeo que são covalentemente ligados a ambos os domínios. Ainda em outra modalidade, o dito ligante/espaçador de polipeptídeo compreende um sítio de clivagem de protease plasmática que permite a liberação controlada do dito primeiro domínio compreendendo um polipeptídeo que tem e/ou medeia uma atividade biológica. Os ligantes de diferentes tipos ou comprimentos podem ser identificados sem sobrecarga para obter a atividade biológica ótima de proteínas específicas.
[00094] Em uma modalidade preferencial, as proteínas biologicamente ativas da presente invenção são proteínas de fusão. Uma proteína de fusão como descrita neste pedido pode compreender pelo menos um domínio que pode mediar uma atividade biológica e pelo menos um outro domínio que compreende o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento polipeptídico) como descrito neste pedido em um polipeptídeo de multidomínio único. Novamente, é de notar que a presente invenção não é limitada a proteínas de fusão em que um domínio medeia uma atividade biológica. Também outras "proteínas de fusão" / "construtos de fusão" são fornecidos neste pedido em que uma parte/domínio é ou compreende o polipeptídeo/polímero helicoidal randômico inventivo de prolina/alanina e outra parte/domínio compreende outro estiramento/estrutura proteica.
[00095] Em particular, no caso de proteínas de fusão, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico) de acordo com esta invenção não necessariamente transporta resíduos Pro ou Ala em seu terminal amino ou carboxila. Em uma modalidade alternativa, a proteína biologicamente ativa conforme a presente invenção pode representar um conjugado proteico em que uma proteína de interesse ou um polipeptídeo/estiramento de polipeptídeo/peptídeo/sequência de aminoácido que tem e/ou medeia a atividade biológica é conjugada através de uma ligação não peptídica a uma sequência de aminoácidos que forma/adota a conformação helicoidal randômica, especialmente, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico) fornecido neste pedido e consistindo somente de resíduos alanina e prolina. Ligações não peptídicas que são úteis para interligar proteínas são conhecidas na técnica com o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala) fornecidos neste pedido. Tais ligações não peptídicas podem incluir ligações dissulfeto, por exemplo, entre cadeias laterais Cys, ligações tioéter ou ligações não peptídicas covalentes induzidas por interligantes químicos, tais como disuccinimidil suberato (DSS) ou sulfosuccinimidil 4-[p-maleimidofenil] butirato (Sulfo-SMPB), quelantes metálicos/grupos complexantes, bem como interações proteína- proteína não covalentes.
[00096] É de notar que a "proteína biologicamente ativa" da presente invenção também pode compreender mais de uma "sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica". Além disso, a proteína biologicamente ativa também pode compreender mais do que o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo). No caso mais simples, a proteína biologicamente ativa consiste em dois domínios, isto é, o primeiro domínio que compreende uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica e um segundo domínio que compreende o polipeptídeo biossintético (ou segmento do mesmo). É de notar que a presente invenção não é limitada a "proteínas biologicamente ou terapeuticamente ativas" ligadas ao polipeptídeo helicoidal randômico biossintético descrito neste pedido ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala). Também outras proteínas ou moléculas de interesse, como relevante para outras indústrias, como indústria de alimentos ou bebidas, indústria cosmética e similares, podem ser manufaturadas pelos meios e métodos fornecidos neste pedido.
[00097] O versado na técnica está ciente que o "domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica" e o "segundo domínio compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico" (ou segmento do mesmo) como compreendido nas proteínas biologicamente ativas da invenção pode ser organizado em uma ordem específica.
[00098] Consequentemente, e no contexto da invenção, a ordem do "primeiro" e "segundo" domínio definido neste pedido do polipeptídeo inventivo biologicamente ativo pode ser arranjada em uma ordem, na qual o dito "primeiro domínio" (isto é, a proteína de interesse; "sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a dita atividade biológica") está localizado no amino (N-) terminal e o dito "segundo domínio" (isto é, o domínio que compreende o polipeptídeo helicoidal randômico fornecido neste pedido (ou segmento do mesmo)) está localizado no carbóxi (C-) terminal da proteína biologicamente ativa. Entretanto, esta ordem também pode ser invertida, por exemplo, o dito "primeiro domínio" (isto é, a proteína de interesse; "a dita atividade biológica que tem e/ou medeia a sequência de aminoácidos") está localizado no carbóxi (C-) terminal e o dito "segundo domínio" (isto é, o domínio que compreende o polipeptídeo helicoidal randômico neste pedido fornecido (ou segmento do mesmo)) está localizado no amino (N-) terminal da proteína biologicamente ativa. Se a proteína biologicamente ativa consistir somente de um primeiro domínio e um segundo domínio, a ordem de domínio pode ser, consequentemente, (do N-terminal ao C-terminal): primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)). Vice-versa, a ordem de domínio pode ser (do N-terminal ao C- terminal): segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia de uma atividade biológica).
[00099] Também é contemplado que mais de um domínio compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a dita atividade biológica deve ser usado no contexto do construto proteico inventivo. Por exemplo, a proteína biologicamente ativa pode compreender dois "primeiros domínios", isto é, duas sequências de aminoácido específicas que têm e/ou medeiam uma atividade biológica, pelo qual esta atividade biológica pode ser a mesma atividade ou uma diferente. Se a proteína biologicamente ativa consistir de dois tais "primeiros domínios", isto é, duas sequências de aminoácido específicas que têm e/ou medeiam uma atividade biológica, e um "segundo domínio" (compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo), a ordem de domínio pode ser (do N-terminal ao C-terminal)): primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica (opcionalmente diferente)).
[000100] As mesmas explicações aplicam-se em casos onde a proteína biologicamente ativa compreende mais de um "segundo domínio" (isto é, a proteína biologicamente ativa compreende mais de um polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo). Se a proteína biologicamente ativa consistir de dois tais "segundos domínios", isto é, dois domínios que compreendem o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo), e um "primeiro domínio" (compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica), a ordem de domínio pode ser do (N-terminal ao C-terminal): segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)). Se a proteína biologicamente ativa compreender mais de um "segundo domínio" contempla-se neste pedido que estes "segundos domínios" podem ser idênticos ou podem ser diferentes.
[000101] Como acima mencionado, a proteína biologicamente ativa pode compreender mais de um "primeiro domínio", isto é, mais de uma sequência de aminoácidos específica que tem e/ou medeia uma atividade biológica e mais de um "segundo domínio" (polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo)) pelo qual estes "primeiros domínios" podem ser idênticos ou diferentes e/ou pelo qual os ditos "segundos domínios" podem ser idênticos ou diferentes. Em tais casos, as seguintes ordens exemplares de domínio são concebíveis (do N-terminal ao C-terminal): - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)); - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)); - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica); - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica); - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica); ou - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - primeiro domínio (sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)) - segundo domínio (polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo)).
[000102] Para um versado na técnica, ordens de domínio correspondentes adicionais (em particular em casos onde mais de dois "primeiros domínios" ou "mais de dois "segundos domínios" são compreendidos na proteína biologicamente ativa) são facilmente concebíveis.
[000103] Como com todas as modalidades do presente polipeptídeo/proteína biologicamente ativo inventivas, o dito domínio(s) compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a atividade biológica acima citada também pode ser um fragmento biologicamente ativo de uma dada proteína com uma função biológica desejada. Por isso, o "segundo domínio" definido neste pedido (preferencialmente compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico fornecido neste pedido (ou segmento dos mesmos)) também pode ser localizado entre dois fragmentos biologicamente ativos de uma proteína de interesse ou entre fragmentos biologicamente ativos de duas proteínas de interesse. Todas as explicações e definições dadas neste pedido acima no contexto de proteínas/polipeptídeos de interesse de "comprimento completo" (isto é, quando as sequências de aminoácido têm/medeiam somente certa atividade biológica) aplicam-se, mutatis mutandis, no contexto de tais fragmentos.
[000104] Novamente a invenção acima não é limitada aos construtos que compreendem um "domínio" com uma "função ativa biológica". Os construtos da presente invenção também podem compreender domínios com outras funções e não são limitados a atividades biológicas. Estes são simplesmente as modalidades da presente invenção e é evidente para o versado que outros construtos facilmente podem ser feitos e usados sem diferir da essência da presente invenção. Consequentemente, neste dito pedido no contexto da "sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia uma atividade biológica específica" aplica-se, mutatis mutandis, para outros construtos, por exemplo, construtos a serem usados em outros campos técnicos, como em cosméticos, processamento de alimentos, produtos laticínios, produção de papel, etc. Como mencionado neste pedido acima, os polipeptídeos/polímeros biossintéticos da presente invenção também podem ser usados para serem ligados com, por exemplo, pequenas moléculas e similares.
[000105] Novamente, tem que ser indicado que o termo "sequência de aminoácidos que tem e/ou medeia a primeira atividade biológica" não é limitado a polipeptídeos completos que têm e/ou medeiam a dita atividade ou função biológica, mas também a fragmentos biologicamente e/ou farmacologicamente ativos dos mesmos. Especialmente, mas não somente, em um contexto em que dois ou mais "primeiros domínios" como definidos neste pedido são compreendidos na "proteína biologicamente ativa inventiva" também é contemplado que estes "primeiros domínios" são ou representam partes diferentes de um complexo proteico ou fragmentos de tais partes do complexo proteico.
[000106] Como exemplificado neste pedido abaixo, as proteínas biologicamente ativas da invenção que são modificadas para compreender um polipeptídeo helicoidal randômico surpreendentemente exibem uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro quando comparadas a proteínas não modificadas biologicamente ativas sem o dito domínio helicoidal randômico. Como usado neste pedido, o termo "estabilidade in vivo" se refere à capacidade de uma substância específica que é administrada ao corpo vivo para permanecer biologicamente disponível e biologicamente ativa. In vivo, uma substância pode ser removida e/ou inativada devido à excreção, filtração renal, absorção hepática, agregação, degradação e/ou outros processos metabólicos. Consequentemente, no contexto da presente invenção, as proteínas biologicamente ativas que têm uma estabilidade in vivo aumentada podem ser menos rapidamente excretadas pelos rins (urina) ou através das fezes e/ou podem ser mais estáveis contra proteólise, em particular, contra proteólise in vivo em fluidos biológicos, como sangue, licor cérebro-espinhal, fluido peritoneal e linfa. Em uma modalidade, a estabilidade in vivo aumentada de uma proteína biologicamente ativa se manifesta em uma meia-vida plasmática prolongada da dita proteína biologicamente ativa. Especialmente, a estabilidade in vivo aumentada da proteína biologicamente ativa é uma meia-vida plasmática prolongada da dita proteína biologicamente ativa compreendendo o dito segundo domínio quando comparada à proteína biologicamente ativa sem o segundo domínio.
[000107] Métodos para medida da estabilidade in vivo de proteínas biologicamente ativas são conhecidos na técnica. Como exemplificado neste pedido abaixo, proteínas biologicamente ativas podem ser especificamente detectadas no plasma sanguíneo a usando técnicas de Western blotting ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Ainda, o versado na técnica está ciente que outros métodos podem ser empregados para medir especificamente a meia-vida plasmática de uma proteína de interesse. Tais métodos incluem, mas não são limitados à detecção física de uma proteína de interesse marcada radioativamente. Métodos para marcação radioativa de proteínas, por exemplo, por radioiodação são conhecidos na técnica.
[000108] O termo "estabilidade aumentada in vitro" como usado neste pedido se refere à capacidade de uma proteína biologicamente ativa de resistir à degradação e/ou agregação e manter sua atividade biológica original em um ambiente in vitro. Métodos para medida da atividade biológica de proteínas biologicamente ativas são bem conhecidos na técnica.
[000109] Além disso, um conjugado de fármaco é fornecido que compreende o polipeptídeo helicoidal randômico descrito e definido neste pedido ou segmento polipeptídico e uma pequena molécula de fármaco que é conjugado ao dito polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico. Exemplos não limitantes das pequenas moléculas são digoxigenina, fluoresceína, doxorrubicina, caliqueamicina, camptotecina, fumagilina, dexametasona, geldanamicina, paclitaxel, docetaxel, irinotecano, ciclosporina, buprenorfina, naltrexona, naloxona, vindesina, vancomicina, risperidona, aripiprazol, palonosetron, granisetron, citarabina, NX1838, leuprolida, goserelina, buserelina, octreotida, teduglutida, cilengitida, abarelix, enfuvirtida, grelina e derivados, tubulisinas, derivados de platina, inibidores de alfa-integrina 4, ácidos nucleicos antissentido, pequenos RNAs de interferência, micro RNAs, esteroides, aptâmeros de DNA ou RNA, peptídeos, peptideomiméticos. Em geral, a presente invenção também se refere a construtos de fármacos que compreendem o polipeptídeo helicoidal randômico definido neste pedido ou segmento polipeptídico e em particular moléculas farmaceuticamente ou medicamente úteis, como pequenas moléculas, peptídeos ou biomacromoléculas, tais como proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, vesículas de lipídio e similares. Na parte experimental ilustrativa acrescentada (ver, por exemplo, Exemplo 22), geração bem sucedida de construtos/conjugados da presente invenção é fornecida, também construtos em que "pequenas moléculas químicas" foram conjugadas ao polipeptídeo helicoidal randômico descrito neste pedido. Por isso, as figuras presentes e a informação experimental nas legendas das figuras correspondentes fornecem exemplos ilustrativos, em que os conjugados de fármaco descritos neste pedido compreendem (i) um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), e (ii) uma pequena molécula, que é, como ilustração, selecionada a partir de digoxigenina e fluoresceína. É de notar que estes não são exemplos somente acadêmicos. Fluoresceína ou derivados de fluoresceína são comumente usados como diagnósticos, e soluções médicas de fluoresceína são vendidas sob os nomes comerciais Fluoescite®, AK-FLUOR® ou Fluress®. Tais compostos podem se beneficiar certamente dos meios e métodos fornecidos neste pedido. Digoxigenina é a parte esteroide da digoxina, um metabólito vegetal secundário bem conhecido com função cardioativa que, além disso, contém três açúcares digitoxose. Digoxina e, até em uma menor extensão, o composto estritamente relacionado digitoxina, é largamente usada para o tratamento de taquiarritmias ventriculares e insuficiência cardíaca congestiva (Hauptman (1999) Circulation 99: 1265-1270). Todos os esteroides cardioativos são inibidores potentes e altamente específicos da Na+/K+-ATPase localizada na membrana plasmática celular, por meio disso exercendo efeitos simpatolíticos ou inotrópicos positivos.
[000110] As definições e explicações dadas neste pedido acima no contexto do polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento de polipeptídeo do mesmo aplicam-se, mutatis mutandis, no contexto do conjugado de fármaco compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico do mesmo) e um fármaco selecionado a partir do grupo consistindo em uma proteína ou um polipeptídeo biologicamente ativo que compreende ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou medeia uma atividade biológica e (b) uma pequena molécula de fármaco.
[000111] O polímero de aminoácido que forma uma conformação helicoidal randômica/polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) como definido e fornecido neste pedido pode ser conjugado a uma pequena molécula/pequeno fármaco de molécula. Por meio disto, a meia-vida plasmática e/ou a solubilidade da pequena molécula / pequeno fármaco de molécula podem ser aumentadas, a toxicidade não específica pode ser reduzida, e a exposição prolongada do fármaco ativo para visar células ou estruturas no corpo pode resultar em farmacodinâmica aumentada.
[000112] Uma conjugação específica para o sítio N-terminal do polipeptídeo helicoidal randômico com um derivado de fármaco ativado, por exemplo, como o derivado de éster de N- hidroxisuccinimida (NHS) (Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, Academic Press, San Diego, CA), é possível. Geralmente, o grupo amino N-terminal pode ser quimicamente acoplado a uma larga variedade de grupos funcionais, tais como aldeídos e cetonas (para formar bases de Schiff, que podem ser reduzidas a aminas usando boro-hidreto de sódio ou cianoboro- hidreto de sódio, por exemplo) ou a derivados de ácidos carbônicos ativados (anidridos, cloretos, ésteres e similares, para formar amidas) ou a outros produtos químicos reativos, tais como isocianatos, isotiocianatos, cloretos de sulfonila etc. Também, o N-terminal do polímero/polipeptídeo de aminoácido pode ser primeiro modificado com um grupo protetor adequado, por exemplo, um grupo acetila, um grupo BOC ou um grupo FMOC (Jakubke (1996) Peptide. Spektrum Akdemischer Verlag, Heidelberg, Alemanha). Além disso, o terminal amino pode ser protegido por um grupo piroglutamila, que pode ser formado por um resíduo de aminoácido Gln codificado que precede o polipeptídeo Pro/Ala ou segmento polipeptídico. Após ativação do grupo C-terminal do carboxilato, por exemplo, usando os reagentes comuns EDC (N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida) e NHS, o acoplamento sítio-específico para o C-terminal do polipeptídeo helicoidal randômico protegido pode ser alcançado se o fármaco transportar um grupo amino livre, por exemplo.
[000113] Alternativamente, o N-terminal ou o C-terminal do polímero de aminoácido que forma uma conformação helicoidal randômica / polipeptídeo helicoidal randômico pode ser modificado com um reagente ligante comercialmente disponível que fornece um grupo maleimido, dessa forma permitindo acoplamento químico a um grupo tiol como parte da molécula de fármaco. Desta maneira, conjugados de fármaco uniformes podem ser facilmente obtidos. Técnicas similares, que são bem conhecidas na técnica (Hermanson (1996) loc. cit.), podem ser usadas para acoplar o polipeptídeo helicoidal randômico a um peptídeo ou até a um fármaco proteico. Tais peptídeos ou proteínas podem ser facilmente preparados carregando um cadeia lateral Lys ou Cys, que permite seu acoplamento in vitro ao polímero de aminoácido que forma uma conformação helicoidal randômica através de éster de NHS ou grupos maleimido ativos. Geralmente, conjugados de fármaco similares podem ser preparados com proteínas de fusão compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo). Ainda, e como ilustrado nos exemplos e figuras acrescentados, a presente invenção também fornece a preparação de polipeptídeos helicoidais randômicos ou segmentos de polipeptídeo helicoidal randômico como compreendido nos conjugados inovadores da presente invenção.
[000114] Como uma alternativa para uma conjugação sítio-específica única, o polipeptídeo helicoidal randômico pode ser equipado de cadeias laterais adicionais, no N- ou C-terminal ou internamente, adequado para a modificação química, tais como resíduos lisina com seu grupos ε-amino, resíduos cisteína com seus grupos tiol, ou mesmo aminoácidos não naturais, permitindo a conjugação de múltiplas pequenas moléculas usando, por exemplo, éster de NHS ou grupos maleimido ativos.
[000115] Além da conjugação estável, um pró-fármaco pode ser ligado transientemente ao polipeptídeo helicoidal randômico. A ligação pode ser projetada para ser clivada in vivo, de uma maneira predizível, através de um mecanismo enzimático ou por hidrólise lenta iniciada no pH fisiológico similarmente como, por exemplo, o agente antitumoral camptotecina fracamente solúvel foi conjugada a um polímero PEG, dessa forma alcançando biodistribuição aumentada, toxicidade reduzida, eficácia aumentada e acúmulo tumoral (Conover (1998) Cancer Chemother Pharmacol, 42:407-414). Exemplos de pró- fármacos adicionais são agentes quimioterápicos como docetaxel (Liu (2008) J Pharm Sci. 97:3274-3290), doxorrubicina (Veronese (2005) Bioconjugate Chem. 16: 775-784) ou paclitaxel (Greenwald (2001) J Control Release 74:159-171).
[000116] Além disso, a pequena molécula pode ser acoplada a uma proteína de fusão compreendendo o polímero/polipeptídeo de aminoácido geneticamente fundido a um domínio de direcionamento, por exemplo, um fragmento de anticorpo, dessa forma resultando em uma entrega específica da pequena molécula de fármaco. Em último caso, as imunotoxinas podem ser facilmente geradas pela conjugação com uma pequena molécula citotóxica se o domínio de direcionamento for dirigido contra um receptor de superfície celular e que sofre internalização, por exemplo.
[000117] Conforme o acima mencionado, a presente invenção também se refere, portanto, à provisão do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético descrito neste pedido ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina para acoplamento adicional com outros compostos de escolha. O dito acoplamento adicional pode ser e/ou pode compreender o primeiro acoplamento do dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico helicoidal randômico biossintético com ou a outro composto.
[000118] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a moléculas de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos helicoidais randômicos (ou segmentos dos mesmos) ou proteínas biologicamente ativas como descrito neste pedido. Consequentemente, a dita molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo tendo atividade biológica e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo). O termo "molécula de ácido nucleico", como usado neste pedido, é destinado a incluir moléculas de ácidos nucleicos, tais como moléculas de DNA e moléculas de RNA. A dita molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla. Preferencialmente, a dita molécula de ácido nucleico pode ser compreendida em um vetor.
[000119] Consequentemente, a presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico como compreendido nos conjugados fornecidos neste pedido, como um conjugado de fármaco como definido neste pedido, ou molécula de ácido nucleico que codifica um conjugado proteico que compreende uma proteína biologicamente ativa como definido acima e que compreende, adicionalmente, um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala).
[000120] Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico é fornecido que codifica um conjugado, como um conjugado de fármaco ou conjugado de alimento como definido acima, a dita molécula de ácido nucleico compreendendo: (i) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um aminoácido traduzido e/ou uma sequência líder; (ii) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala); (iii) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica proteína biologicamente ativa ou um dito polipeptídeo que compreende ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade biológica ou uma proteína de interesse, como uma proteína a ser empregada em outras áreas industriais como a indústria alimentícia; e (iv) uma sequência de ácidos nucleicos que representa ou é um códon de parada de tradução.
[000121] O "aminoácido traduzido e/ou uma sequência líder" acima mencionados sob (i) por exemplo, podem ser o "M" inicial, isto é, uma metionina derivada de um códon inicial correspondente, também pode compreender sequências não traduzidas de um mRNA como a sequência 5’ até um códon de partida que compreende, por exemplo, um sítio de ligação a ribossomo. Tal sequência também pode, entretanto, compreender sequências líder e/ou sinal clássicas, por exemplo, da secreção de uma proteína expressa no periplasma ou em meio de cultura. Peptídeos sinal procarióticos são, por exemplo, OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII. Peptídeos sinal eucarióticos são, por exemplo, sequência sinal de melitina de abelha melífera, sequência sinal de glicoproteína acídica gp67, sequência sinal de IgM de camundongo, sequência sinal de hGH.
[000122] Proteínas ou polipeptídeos biologicamente ativos que compreendem ou são uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade biológica bem como outras proteínas de interesse, como uma proteína a ser empregada em outras áreas industriais, foram fornecidas neste pedido acima. As ditas modalidades aplicam-se, mutatis mutandis, para a molécula de ácido nucleico (parte/segmentos (iii)) como ilustradas neste pedido acima.
[000123] Os códons de parada de tradução a serem empregados na molécula de ácido nucleico fornecidos neste pedido são bem conhecidos na técnica e são, por exemplo, códons UAA, UAG ou UGA.
[000124] Em uma modalidade da molécula de ácido nucleico como fornecida neste pedido acima de partes/segmentos da dita molécula de ácido nucleico (ii) e (iii) são permutadas em sua posição na dita molécula de ácido nucleico que codifica um conjugado, como um conjugado de fármaco ou um conjugado de alimento. Tal molécula de ácido nucleico compreenderia a seguinte ordem de partes/segmentos: (i) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um aminoácido traduzido e/ou uma sequência líder; (ii) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína biologicamente ativa ou um dito polipeptídeo que compreende ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade biológica ou uma proteína de interesse, como uma proteína a ser empregada em outras áreas industriais, como a indústria alimentícia; (iii) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala); e (iv) uma sequência de ácidos nucleicos que representa ou é um códon de parada de tradução.
[000125] As moléculas de ácidos nucleicos fornecidas neste pedido acima também, opcionalmente, podem compreender, entre partes/segmentos (i) e (ii) e/ou entre partes/segmentos (ii) e (iii), uma protease e/ou um sítio de clivagem químico e/ou um sítio de reconhecimento. Tais sítios de clivagem química são bem conhecidos na técnica, e compreendem sequências de aminoácidos, por exemplo, específicas, individuais (ver, por exemplo, Lottspeich e Engels (Hrsg). (2006) Bioanalytik. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier, Munchen, Alemanha). Por exemplo, brometo de cianogênio ou cloreto de cianogênio clivam a ligação peptídica após um resíduo Met; hidroxilamina cliva a ligação asparaginila-glicila; ácido fórmico cliva Asp-Pro; 2-(2’-nitrofenilsulfenil)-3-metil-3-bromoinolenina, ácido 2- iodosobenzoico ou N-clorosuccinimida após Trp; ácido 2-nitro-5- tiocianatobenzoico após Cys. Também é contemplado e possível que o resíduo que precede o polipeptídeo ou segmento polipeptídico Pro/Ala possa ser substituído por Met através de mutagênese sítio- dirigida e a proteína de fusão resultante então pode ser clivada por BrCN. Similarmente outras sequências de aminoácidos compreendendo sítio de clivagem podem ser introduzidas na proteína de fusão recombinante ou seu ácido nucleico codificante por meio da mutagênese sítio-dirigida.
[000126] Também os sítios de reconhecimento/clivagem de protease úteis são conhecidos na técnica. Estes compreendem, mas não são limitados a: tripsina, quimiotripsina, enteroquinase, protease do Vírus de Mosaico do Tabaco (TEV), protease PreScission, Protease HRV 3C, Protease SUMO, Sortase A, granzima B, furina, trombina, fator Xa ou mesmo inteínas cliváveis. O fator Xa hidrolisa a ligação peptídica na extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos IleGluGlyArg, que pode ser inserido entre o parceiro de fusão N-terminal e o polipeptídeo ou segmento polipeptídico Pro/Ala. Um método particularmente simples para realizar a clivagem proteolítica seria por inserção ou substituição de uma cadeia lateral Lys ou Arg na extremidade N-terminal do polipeptídeo ou segmento polipeptídico Pro/Ala seguido pela digestão com tripsina, que não se cliva dentro do polipeptídeo ou segmento polipeptídico Pro/Ala enquanto as cadeias laterais internas Lys ou Arg são evitadas. Sítios de reconhecimento ilustrativos são, sem ser limitados, D-D-D-D-K (enteroquinase), ENLYFQ (G/S) (protease de TEV), I-(E/D)-G-R (Fator Xa), L-E-V-L-F- Q-G-P (HRV 3C), R-X-(K/R)-R (Furina), LPXTG (Sortase A), L-V-P-R- G (Trombina) ou I-E-X-D-X-G (Granzima B).
[000127] Como é evidente a partir da revelação neste pedido acima, a presente invenção fornece polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos recombinantemente produzidos e segmentos de polipeptídeos que podem ser conjugados com moléculas de escolha, como proteínas úteis, polipeptídeos farmaceuticamente ativos ou pequenas moléculas, polipeptídeos diagnosticamente úteis ou pequenas moléculas ou, inter alia, outras proteínas úteis ou as pequenas moléculas de outras áreas industriais, como indústria de alimentos ou do papel ou na recuperação de óleo. Por isso, a presente invenção também fornece um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina em que a dita sequência de aminoácidos consiste pelo menos de 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), a dita molécula de ácido nucleico compreendendo (i) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um aminoácido traduzido e/ou sequência líder; (ii) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina; e (iii) uma sequência de ácidos nucleicos que representa ou é um códon de parada de tradução.
[000128] Tal molécula de ácido nucleico pode compreender, opcionalmente, entre (i) e (ii) uma protease e/ou um sítio de clivagem químico e/ou um sítio de reconhecimento.
[000129] Também para esta molécula de ácido nucleico, as modalidades fornecidas neste pedido acima no contexto de duas primeiras moléculas de ácidos nucleicos descritas (isto é, uma protease e/ou um sítio de clivagem químico e/ou um reconhecimento), se aplicam aqui mutatis mutandis.
[000130] Sequências sinal úteis e ilustrativas a serem empregadas no contexto desta invenção compreendem, mas não são limitadas a sequências procarióticas como: OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII ou sequências eucarióticas como: sequência sinal de melitina de abelha melífera, sequência sinal de glicoproteína acídica gp67, sequência sinal de IgM de camundongo, sequência sinal de hGH.
[000131] Em particular, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina da presente invenção é útil em métodos como também fornecido neste pedido abaixo e como ilustrado nos exemplos e figuras acrescentados. Tal polipeptídeo helicoidal randômico expresso ou segmento polipeptídico helicoidal randômico podem ser isolados, por exemplo, de células hospedeiras que expressam tal polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico helicoidal randômico. Tais células hospedeiras podem ser células transfectadas, por exemplo, com um vetor fornecido neste pedido.
[000132] Por isso, é contemplado transfectar células com a molécula de ácido nucleico ou vetores como descrito neste pedido. Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere a moléculas de ácidos nucleicos que de acordo com a expressão codificam o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) ou as proteínas biologicamente ativas da invenção. Ainda, em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere a moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a expressão que codificam os polipeptídeos descritos neste pedido que, inteiramente ou em parte, formam/adotam uma conformação helicoidal randômica em solução aquosa ou sob condições fisiológicas. As ditas moléculas de ácidos nucleicos podem ser fundidas a sequências controle de expressão adequadas conhecidas na técnica para assegurar a transcrição própria e a tradução do polipeptídeo bem como sequências sinal para assegurar a secreção celular ou visando organelas. Tais vetores podem compreender genes adicionais, tais como genes marcadores que permitem seleção do dito vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas.
[000133] Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico da invenção é compreendida em um vetor recombinante no qual uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína neste pedido descrita biologicamente ativa é operativamente ligada a sequências controle de expressão que permitem expressão em células procarióticas ou eucarióticas. A expressão da dita molécula de ácido nucleico compreende a transcrição da molécula de ácido nucleico em um mRNA traduzível. Os elementos reguladores que permitem expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, os promotores lambda PL, lac, trp, tac, ara, phoA, tet ou T7 em E. coli. Os elementos reguladores possíveis que asseguram a expressão em células eucarióticas, preferencialmente células mamíferas ou levedura, são bem conhecidos pelos versados na técnica. Normalmente compreendem sequências reguladoras que asseguram a iniciação da transcrição e opcionalmente sinais poli-A que efetuam a terminação de transcrição e estabilização do transcrito. Elementos reguladores adicionais podem incluir potencializadores transcricionais bem como de tradução, e/ou regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas. Exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticas são os promotores AOX1 ou GAL1 na levedura ou promotores de CMV, SV40, RSV (vírus de sarcoma de Rous), potencializador de CMV, potencializador de SV40 ou um íntron de globina em células animais mamíferos e outras. Além dos elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição tais elementos reguladores também podem compreender sinais de terminação de transcrição, tais como o sítio SV40-poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante da região de codificação.
[000134] Métodos que são bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para construir vetores recombinantes (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory NY e Ausubel (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, NY). Neste contexto, vetores de expressão adequados são conhecidos na técnica, tal como vetor de expressão pcDV1 de cDNA de Okayama-Berg (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3, pPICZalfa (Invitrogen), ou pSPORT1 (GIBCO BRL). Além disso, dependendo do sistema de expressão que é usado, as sequências líder capazes de dirigir o polipeptídeo a um compartimento celular ou secretá-lo em meio de cultura podem ser adicionadas à sequência de codificação da molécula de ácido nucleico da invenção.
[000135] A presente invenção também se relaciona a vetores, particularmente plasmídeos, cosmídeos, vírus, e bacteriófagos que são convencionalmente empregados na engenharia genética, compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) ou a proteína biologicamente ativa da invenção. Preferencialmente, o dito vetor é um vetor de expressão e/ou um vetor de direcionamento ou de transferência gênica. Os vetores de expressão derivados de vírus, tais como retrovírus, vírus de vacínia, vírus adeno-associado, vírus de herpes ou vírus de papiloma bovino podem ser usados para entrega dos polinucleotídeos ou vetor da invenção em populações celulares visadas.
[000136] Os vetores contendo as moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem ser transfectados na célula hospedeira por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo da célula. Consequentemente, a invenção ainda se refere a uma célula que compreende a dita molécula de ácido nucleico ou o dito vetor. Tais métodos, por exemplo, incluem as técnicas descritas em Sambrook (1989), loc. cit. e Ausubel (1989), loc. cit. Consequentemente, a transfecção em cloreto de cálcio ou eletroporação são comumente utilizadas para células procarióticas, ao passo que o tratamento em fosfato de cálcio ou eletroporação podem ser usados para outros hospedeiros celulares (Sambrook (1989), loc. cit.). Como uma alternativa adicional, moléculas de ácidos nucleicos e vetores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para a entrega a células alvo. A molécula de ácido nucleico ou vetor da invenção que está presente na célula hospedeira podem estar integrados no genoma da célula hospedeira ou podem ser mantidos extracromossomicamente. Consequentemente, a presente invenção também se relaciona a uma célula hospedeira que compreende a molécula de ácido nucleico e/ou vetor desta invenção. Células hospedeiras para expressão de polipeptídeos são bem conhecidas na técnica e compreendem células procarióticas bem como células eucarióticas, por exemplo, células de E. coli, células de levedura, células de invertebrados, células CHO, células CHO-K1, células HEK 293, células Hela, células COS-1 de macaco, células de melanoma, tais como células de Bowes, células L-929 de camundongo, linhagens celulares derivadas de camundongos suíços 3T3, Balb-c ou linhagens celulares de hamster NIH, BHK ou HaK e similares.
[000137] Em um aspecto adicional, a presente invenção compreende métodos para a preparação dos conjugados da presente invenção bem como o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo) ou proteínas biologicamente ativas fornecidas neste pedido e compreendendo cultura de célula (hospedeira) desta invenção e isolamento do dito polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) ou conjugado ou uma proteína biologicamente ativa da cultura como descrito neste pedido. Em geral, o polipeptídeo helicoidal randômico inventivo (ou segmento do mesmo), conjugado ou proteína biologicamente ativa compreendendo um domínio helicoidal randômico podem ser produzidos pela tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, pela cultura de uma célula compreendendo a molécula de ácido nucleico descrita ou vetores que codificam a proteína biologicamente ativa inventiva ou polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) e o isolamento da dita proteína/polipeptídeo da cultura. A proteína biologicamente ativa inventiva ou polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) pode ser produzido em qualquer sistema de cultura celular adequado incluindo células procarióticas, por exemplo, E. coli BL21, KS272 ou JM83, ou células eucarióticas, por exemplo, Pichia pastoris, cepa de levedura X-33 ou células CHO. Linhagens celulares adequadas adicionais conhecidas na técnica são obteníveis de depósitos de linha celular como American Type Culture Collection (ATCC).
[000138] O termo "procariótico" está destinado a incluir células bacterianas enquanto o termo "eucariótico" está destinado a incluir levedura, planta superior, inseto e células mamíferas. Os hospedeiros transformados podem ser cultivados em fermentadores e cultivados de acordo com as técnicas conhecidas na técnica para alcançar crescimento celular ótimo. Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere a um processo para preparação de um polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) ou uma proteína biologicamente ativa descrita acima da compreensão de cultivação de uma célula da invenção sob condições adequadas para a expressão da proteína biologicamente ativa ou polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) e o isolamento da dita proteína/polipeptídeo da célula ou meio de cultura.
[000139] O polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) per se da presente invenção preferencialmente não compreende qualquer grupo quimicamente reativo, exceto por, possivelmente, um grupo amino N-terminal primário (ou, no caso de prolina, secundário) e um grupo carboxilato no C-terminal do polímero. Entretanto, é evidente para o versado que o polipeptídeo/polímero helicoidal randômico biossintético fornecido neste pedido pode compreender um grupo quimicamente reativo, por exemplo, quando o dito polipeptídeo/polímero helicoidal randômico é parte de uma "proteína de fusão" / "construto de fusão". Como também descrito acima, o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento do mesmo) pode ser preparado pela expressão recombinante em uma célula transformada de vários modos de acordo com métodos bem conhecidos pelo versado na técnica, por exemplo: (i) expressão direta no citoplasma com ajuda de um resíduo Met N-terminal / códon de partida; (ii) secreção através de um peptídeo sinal N-terminal, por exemplo, OmpA, PhoA (Monteilhet (1993) Gene. 1993 125:223-228), melitina (Tessier (1991) Gene 98: 177-183), interleucina 2 (Zhang (2005) Gene Med J 7: 354-365), hGH (Pecceu (1991) Gene 97 (2):253-258) e similares, seguido por clivagem intracelular que resulta no N-terminal maduro, tal como Ala ou Pro; (iii) expressão como uma proteína de fusão com outra proteína solúvel, por exemplo, proteína de ligação por maltose no N-terminal e com um sítio de clivagem de protease entremeado (Kapust e Waugh (2000) Protein Expr. Purif. 19:312-318), seguido por clivagem de protease específica in vitro ou in vivo, dessa forma liberando o polímero/polipeptídeo de aminoácido com seu N-terminal maduro tal como Ala ou Pro. Outro parceiro de fusão adequado é a proteína SUMO, que pode ser clivada pela protease SUMO, como descrito nos exemplos 20 e 21. Parceiros de fusão adicionais incluem, sem limitação, glutationa-S-transferase, tiorredoxina, um domínio de ligação à celulose, um domínio de ligação à albumina, uma proteína fluorescente (tal como GFP), proteína A, proteína G, uma inteína e similares (Malhotra (2009) Methods Enzymol. 463:239-258).
[000140] Como explicado acima, polipeptídeos/polímeros helicoidais randômicos (ou segmentos de polipeptídeos) descritos consistem predominantemente de resíduos alanina e prolina, ao passo que serina, treonina ou asparagina, que são necessárias para O- ou N- glicosilação, estão preferencialmente ausentes. Dessa forma, a produção do próprio polipeptídeo ou de uma proteína biologicamente ativa compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico do mesmo) ou, geralmente, uma proteína de fusão compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico do mesmo) surpreendentemente pode resultar em um produto monodisperso preferencialmente destituído de modificações pós-tradução dentro da sequência Pro-Ala. Isto é uma vantagem para produção proteica recombinante em células eucarióticas, como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou levedura, que muitas vezes são escolhidas para biossíntese de proteínas complexas. Por exemplo, levedura foi usada para a produção de proteínas terapêuticas aprovadas, tais como insulina, fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago, fator de crescimento derivado de plaqueta ou hirudina (Gerngross (2004) Nat. Biotechnol. 22:1409-1414). Células CHO serviram para a produção de proteínas terapêuticas, tais como fator de coagulação IX, interferon β- 1a, tenecteplase (Chu (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187) ou gonadotropinas, onde o glicocomponente pode influenciar positivamente em vários aspectos como atividade funcional, enovelamento, dimerização, secreção bem como interação de receptor, transdução de sinal, e depuração metabólica (Walsh (2006) Nat. Biotechnol. 24:-1241-1252). Consequentemente, a preparação dos construtos inventivos, polipeptídeos helicoidais randômicos e conjugados em sistemas de expressão eucarióticos também é descrita no contexto da presente invenção.
[000141] Com os meios e métodos fornecidos neste pedido é possível agora manufaturar e fornecer os conjugados descritos neste pedido e moléculas compreendendo (i) um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina e (ii) uma molécula adicional de interesse, como uma proteína útil, um segmento proteico ou uma pequena molécula. A presente invenção, por isso, também fornece métodos para preparação ou manufatura de tais conjugados bem como de polipeptídeos helicoidais randômicos biossintéticos e/ou moléculas ou conjugados que compreendem os mesmos. Consequentemente, a presente invenção também fornece um método para preparação e/ou produção de um polipeptídeo helicoidal randômico ou um segmento polipeptídico helicoidal randômico como compreendido nos conjugados, como conjugados de fármaco, conjugados de alimentos, conjugados diagnósticos e similares. Também, métodos para a preparação e/ou produção da proteína biologicamente ativa ou conjugado compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico helicoidal randômico são fornecidos. Além disso, métodos para preparação e/ou produção e/ou para preparação e/ou produção de um polipeptídeo compreendendo ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade biológica e que adicionalmente compreende dito que o polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico helicoidal randômico são fornecidos. Estes métodos, em particular, compreendem (como uma etapa) a cultura de célula (hospedeira) fornecida neste pedido acima e (como uma etapa adicional) o isolamento do dito polipeptídeo helicoidal randômico ou proteína biologicamente ativa e/ou a dita proteína biologicamente ativa e/ou o dito conjugado de polipeptídeo da cultura ou da célula dita. Este helicoidal randômico isolado, um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina bem como conjugado isolado podem ainda ser processados. Por exemplo, o dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina podem ser quimicamente ligados ou acoplados a uma molécula de interesse, como também mostrado nos exemplos acrescentados. Além disso e como uma alternativa, a molécula de interesse pode ser enzimaticamente conjugada, por exemplo, via transglutaminase (Besheer (2009) J Pharm Sci. 98:4420-8) ou outras enzimas (Subul (2009) Org. Biomol. Chem. 7:3361-3371) ao polipeptídeo helicoidal randômico biossintético acima citado ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos prolina e alanina.
[000142] O polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) e/ou um conjugado proteico compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) e uma proteína de interesse, como uma proteína biologicamente ou terapeuticamente ativa ou uma proteína a ser usada em, por exemplo, métodos diagnósticos, podem ser isolados (inter alia) a partir de meios de crescimento, lisados celulares, periplasma ou frações de membrana celular. (Novamente, a presente invenção não é limitada a conjugados (proteicos) que são úteis em uma colocação médica ou farmacêutica. Os meios e métodos fornecidos neste pedido são também de uso em outras áreas industriais como, mas não limitados à indústria de alimentos e bebida, indústria nutritiva, indústria do papel, indústria de biorreagentes, indústria de instrumentos de pesquisa e reagentes, indústrias onde enzimas devem ser usadas, indústria cosmética, processamento de óleo e recuperação de óleo, e similares). O isolamento e a purificação dos polipeptídeos expressos da invenção podem ser realizados por qualquer meio convencional (Scopes (1982) "Protein Purification", Springer, New York, NY), incluindo precipitação em sulfato de amônio, purificação por afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese em gel e similares e podem envolver o uso de anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos, por exemplo, contra uma marcador fundido com a proteína biologicamente ativa da invenção. Por exemplo, a proteína pode ser purificada via marcador Strep-II usando cromatografia de afinidade por estreptavidina (Skerra (2000) Methods Enzymol. 326:271-304) como descrito nos exemplos acrescentados. Polipeptídeos substancialmente puros de pelo menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidade (em nível proteico) são preferenciais, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são mais preferenciais, em particular para o uso/aplicações farmacêuticas. Dependendo da célula /organismo hospedeiros empregados no procedimento de produção, os polipeptídeos da presente invenção pode ser glicosilados ou não glicosilados.
[000143] A invenção se refere ainda ao uso da proteína biologicamente ativa, polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) ou conjugados, como os conjugados de fármaco da invenção, a molécula de ácido nucleico da invenção, o vetor da invenção ou a célula (hospedeira) da invenção para preparação de um medicamento, em que a dita proteína biologicamente ativa ou fármaco (ou qualquer outra pequena molécula ou proteína de interesse) têm uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro quando comparada a uma molécula controle que não compreende ou que não é ligada a um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala).
[000144] Ainda em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para o tratamento de doenças e/ou distúrbios que se beneficiam da estabilidade melhorada da dita proteína biologicamente ativa ou fármaco, compreendendo administração da proteína biologicamente ativa ou conjugado de fármaco como descrito neste pedido a um mamífero em necessidade de tal tratamento. Dependendo da atividade biológica da proteína inventiva ou conjugado de fármaco, o versado é prontamente capaz de determinação que doença/distúrbio deve ser tratada com uma proteína específica biologicamente ativa ou conjugado de fármaco da invenção. Alguns exemplos não limitantes são listados na seguinte tabela:
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[000145] Conforme o acima mencionado, a proteína biologicamente ativa, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo), o conjugado de fármaco, o ácido nucleico, o vetor ou a célula podem ser usados para a preparação de um medicamento que preferencialmente tem ou confere uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro, em particular, para a proteína biologicamente ativa e/ou componente de fármaco, para o tratamento de deficiências hormonais ou distúrbios relacionados, doença auto-imune, câncer, anemia, doenças neovasculares, doenças infecciosas/inflamatórias, trombose, enfarte miocárdico, diabetes, infertilidade, doença de Gaucher, hepatite, hipoglicemia, acromegalia, deficiência de adenosina deaminase, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidade, mal de Alzheimer, lipodistrofia, psoríase, melanoma metastásico, osteoartrite, dislipidemia, artrite reumatoide, lúpus sistêmico eritematoso, esclerose múltipla, asma, osteoporose, e injúria de reperfusão ou outras doenças renais, por exemplo. Em uma modalidade, a proteína biologicamente ativa, o conjugado de fármaco, o ácido nucleico, o vetor ou a célula são para uso como um medicamento que tem uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro da dita proteína biologicamente ativa / conjugado de fármaco. Similarmente, a proteína biologicamente ativa, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo), o conjugado de fármaco, o ácido nucleico, o vetor ou a célula é para uso no tratamento de deficiências hormonais ou distúrbios relacionados, doença autoimune, distúrbios proliferativos, como câncer, anemia, doenças neovasculares, doenças infecciosas e/ou inflamatórias, trombose, enfarte miocárdico, derrame, diabetes, infertilidade, disfunção peniana, doença de Gaucher, doença de Fabry, sarcopenia, fibrose cística, doenças pulmonares obstrutivas, síndrome respiratória aguda, hepatite, hipoglicemia, acromegalia, adenosina deaminase deficiência, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidade, mal de Alzheimer, lipodistrofia, psoríase, melanoma metastásico, osteoartrite, dislipidemia, artrite reumatoide, lúpus sistêmico eritematoso, esclerose múltipla, asma, osteoporose, e injúria de reperfusão ou outras doenças renais, por exemplo.
[000146] A presente invenção também se refere ao uso das moléculas de ácidos nucleicos, vetores bem como células transfectadas fornecidos neste pedido e compreendendo as moléculas de ácidos nucleicos ou vetores da presente invenção em abordagens médicas, como, por exemplo, abordagens de terapia gênica baseadas em célula ou abordagens de terapia gênica baseadas em ácido nucleico.
[000147] Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico do mesmo) fornecido neste pedido, a proteína heteróloga/construto proteico biologicamente ativo, ou fármaco ou conjugado de alimentos ou outros conjugados que compreendem o polipeptídeo helicoidal randômico biossintético (ou segmento polipeptídico do mesmo) e/ou a molécula de ácido nucleico ou o vetor ou a célula hospedeira da presente invenção) é parte de uma composição. A dita composição pode compreender um ou mais dos polipeptídeos helicoidais randômicos inventivos (ou segmentos polipeptídicos dos mesmos), proteínas biologicamente ativas, conjugados de alimentos, conjugados de interesse, conjugados de fármaco ou moléculas de ácidos nucleicos, os vetores e/ou células hospedeiras que codificam e/ou expressam os mesmos. A dita composição pode ser uma composição farmacêutica, compreendendo opcionalmente ainda um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere ao uso da proteína biologicamente ativa descrita neste pedido, o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento do mesmo) ou o conjugado de fármaco para preparação de uma composição farmacêutica para prevenção, tratamento ou melhora de doenças que requerem a absorção de tal composição farmacêutica.
[000148] Como mencionado neste pedido acima, não somente os conjugados descritos neste pedido, como conjugados de fármaco ou conjugados diagnósticos, e/ou proteínas heterólogas/construtos de proteína biologicamente ativos, (compreendendo polipeptídeo helicoidal randômico inventivo ou segmento polipeptídico do mesmo) são em particular para uso médico ou farmacêutico. Também o dito polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico podem ser per se empregados em tal contexto médico, por exemplo, como "expansor plasmático" ou como substituto de sangue, na melhora, prevenção e/ou tratamento de um distúrbio relacionado a uma quantidade de plasma sanguíneo prejudicada ou conteúdo de plasma sanguíneo ou na melhora, prevenção e/ou tratamento de um distúrbio relacionado a um volume de sangue prejudicado. Os distúrbios que são tratados com dilatadores plasmáticos são, mas não limitados aos distúrbios afiliados à perda de sangue, como injúrias, cirurgia, queimaduras, feridas, ou emergência abdominal, infecções, desidratações etc. Ainda, tal uso médico não é limitado ao polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico desta invenção mas também pode ser estendido a certos conjugados de fármaco como descritos neste pedido ou até a certas proteínas heterólogas / construtos de proteína biologicamente ativos.
[000149] Em uma modalidade, a composição como descrita neste pedido pode ser uma composição diagnóstica, por exemplo, um reagente de visualização, compreendendo ainda opcionalmente meios adequados para detecção, em que a dita composição diagnóstica tem uma estabilidada aumentada in vivo e/ou in vitro.
[000150] As composições da invenção podem estar em forma sólida ou líquida e podem ser, inter alia, em uma forma de pó(s), comprimido(s), solução(ões) ou aerossol(óis). Além disso, contempla- se que o medicamento da invenção poderia compreender ainda agentes biologicamente ativos, dependendo do uso desejado da composição farmacêutica.
[000151] A administração das composições adequadas (farmacêuticas) pode ser efetuada por caminhos diferentes, por exemplo, por administração parenteral, subcutânea, intravenosa, intraarterial, intraperitonial, tópica, intrabrônquica, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para o tratamento local, administração intralesional. Administrações parenterais incluem administração intraperitonial, intramuscular, intradérmica, subcutânea, intravenosa ou intra-arterial. As composições da invenção também podem ser administradas diretamente ao sítio alvo, por exemplo, pela entrega biolística a um sítio alvo externo ou interno, como um órgão especificamente efetuado.
[000152] Exemplos de veículos, excipientes e/ou diluentes farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas em fosfato ou outras soluções de tampões, água, emulsões, tais como emulsões óleo/ água, vários tipos de agentes umidificantes, soluções estéreis etc. As composições que compreendem tais veículos podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Veículos adequados podem compreender qualquer material que, quando combinado com a proteína biologicamente ativa/conjugado de fármaco da invenção, conserva sua atividade biológica e/ou farmacêutica (ver Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edição, Osol, A. Ed, Mack Publishing Company, Easton, PA). Preparações para administração parenteral podem incluir soluções, suspensões e emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Tampões, solventes e/ou excipientes como empregados no contexto da composição farmacêutica são preferencialmente "fisiológicos" como definido neste pedido acima. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo salina e meios tamponados. Veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato, ou óleos fixos. Veículos intravenosos podem incluir fluido e repositores de nutrientes, repositores de eletrólitos (tal como os baseados em dextrose de Ringer), e similares. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes, incluindo antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e/ou gases inertes e similares. Além disso, uma composição farmacêutica da presente invenção poderia compreender veículos proteicos, como, por exemplo, albumina sérica ou imunoglobulina, preferencialmente de origem humana.
[000153] Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao indivíduo em uma dose adequada. O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens de qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, composto particular a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outros fármacos que são administrados concorrentemente. A matéria farmaceuticamente ativa pode estar presente em quantidades entre 1 μg e 20 mg/kg de peso corporal por dose, por exemplo, entre 0,1 mg e 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, entre 0,5 mg e 5 mg/kg de peso corporal. Se o regime for uma infusão contínua, também deve estar na faixa de 1 μg a 10 mg por quilograma de peso corporal por minuto. Ainda, as doses abaixo ou acima das faixas exemplares indicadas também são idealizadas, especialmente considerando os fatores acima mencionados.
[000154] Além disso, contempla-se que a composição farmacêutica da invenção poderia compreender ainda agentes biologicamente ou farmaceuticamente ativos, dependendo do uso desejado da composição farmacêutica. Estes agentes biologicamente ou farmaceuticamente ativos adicionais podem ser, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo, hormônios, fatores de crescimento, enzimas, moléculas de ligação, citocinas, quimiocinas, moléculas de ácidos nucleicos e fármacos.
[000155] É de notar que a presente invenção não é limitada a composições farmacêuticas. Também as composições a serem usadas na pesquisa ou como diagnóstico(s) são contempladas, por exemplo, contempla-se que as proteínas biologicamente ativas ou compreendendo conjugados de fármaco de um domínio helicoidal randômico ou componente como definido neste pedido, são usados em um cenário diagnóstico. Com tal objetivo, a proteína inventiva biologicamente ativa ou conjugado de fármaco desta invenção podem ser marcados a fim de permitir a detecção. Tais marcadores compreendem, mas não são limitados a, marcadores radioativos (como [3H]hidrogênio [125I]iodeto ou [123I]iodeto), marcadores fluorescentes (incluindo proteínas fluorescentes, como proteína fluorescente verde (GFP) ou fluoróforos, como isotiocianato de fluoresceína (FITC)) ou marcadores de NMR (como quelatos de gadolínio). Os marcadores aqui definidos ou marcadores não estão limitando de modo nenhum e simplesmente representam exemplos ilustrativos. As composições diagnósticas desta invenção são particularmente úteis em experimentos de visualização ou investigação ou em um cenário de diagnósticos médicos. Nos exemplos e figuras acrescentados, a preparação de um construto correspondente é fornecida que compreende conjugados que compreendem (i) um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), e (ii) fluoresceína ou digoxigenina; ver a figura 13 e 14 acrescentadas e a legenda da figura correspondente bem como o exemplo ilustrativo 22.
[000156] Mas não somente os usos farmacêuticos ou diagnósticos dos meios e métodos fornecidos neste pedido estão dentro da essência da presente invenção. Os compostos/conjugados fornecidos neste pedido são também úteis em certas outras áreas industriais, como na indústria alimentícia, indústria de bebidas, indústria cosmética, indústria do óleo, indústria do papel e similares. Por isso, a presente invenção também fornece usos do polipeptídeo helicoidal randômico biossintético fornecidos neste pedido em tais áreas industriais. Também parte desta invenção é, consequentemente, um método para a produção de um cosmético, de um composto a ser usado em tratamentos cosméticos, de um alimento ou de uma bebida, o dito método compreendendo a cultura da célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico (ou um vetor) que codifica um polipeptídeo helicoidal randômico como definido neste pedido ou que codifica uma proteína biologicamente ativa e/ou uma proteína biologicamente ativa e/ou um polipeptídeo compreendendo ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade. Tal método também inclui o dito isolamento do polipeptídeo helicoidal randômico, a dita proteína biologicamente ativa e/ou a dita proteína biologicamente ativa ou o dito polipeptídeo compreendendo ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade, como uma atividade biológica, e que adicionalmente compreende o dito polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico helicoidal randômico da cultura ou da dita célula. No mesmo contexto, outros conjugados de interesse podem ser produzidos, por exemplo, conjugados que são úteis em áreas diferentes da indústria, como na indústria do óleo ou do papel. O versado na técnica está prontamente em uma posição para adaptar os meios fornecidos neste pedido e métodos para a geração de construtos recombinantes/moleculares correspondentes bem como para a geração de conjugados que compreendem um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), e uma pequena molécula ou um polipeptídeo de interesse.
[000157] Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit compreendendo o polipeptídeo helicoidal randômico (ou segmento polipeptídico do mesmo), proteína biologicamente ativa, conjugado de fármaco, a molécula de ácido nucleico que codifica a dita proteína biologicamente ativa que codifica a dita proteína biologicamente ativa e/ou que codifica a dita proteína biologicamente ativa e/ou que codifica o dito polipeptídeo que compreende ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade (por exemplo, uma atividade biológica), o vetor compreendendo a dita molécula de ácido nucleico ou a dita célula compreendendo o dito ácido nucleico ou o dito vetor como descrito neste pedido. O kit da presente invenção pode compreender ainda, tampão(ões), soluções de armazenamento e/ou reagentes adicionais ou materiais necessários para a conduta de ensaios e fins médicos, científicos ou diagnósticos. Além disso, as partes do kit da invenção podem ser empacotadas individualmente em frascos ou garrafas ou em combinação em recipientes ou unidades multicontainer.
[000158] O kit da presente invenção pode ser vantajosamente usado, inter alia, para realizar o método da invenção e pode ser empregado em uma variedade de aplicações referidas neste pedido, por exemplo, como kits diagnósticos, como instrumentos de pesquisa ou como instrumentos médicos. Adicionalmente, o kit da invenção pode conter meios para detecção adequada para fins científicos, médicos e/ou diagnósticos. A produção dos kits preferencialmente segue procedimentos padrão que são conhecidos pelo versado na técnica.
[000159] A invenção é ainda ilustrada pelas figuras e Exemplos seguintes, não limitantes. Figura 1. Desenho gênico para o polímero/sequência polipeptídica Pro/Ala PA#1.
[000160] O nucleotídeo e a sequência de aminoácidos codificada de um bloco de construção para PA#1 (SEQ ID NO: 1) obtido pela hibridização de dois oligodesoxinucleotídeos complementares (oligodesoxinucleotídeo de fita superior / de codificação SEQ ID NO: 17, oligodesoxinucleotídeo de fita inferior/não codificante SEQ ID NO: 18). O ácido nucleico resultante tem duas extremidades adesivas (mostradas em letras minúsculas), correspondente a um códon Ala e anti-códon, respectivamente, e é mutuamente compatível. Na ligação repetida de tal bloco de construção, concatâmeros codificando os polipeptídeos Pro-Ala de comprimentos variados podem ser obtidos e posteriormente clonados, por exemplo, via sítio(s) de restrição SapI. Figura 2. Estratégias de clonagem de um polímero/sequência polipeptídica Pro/Ala como fusão para um fragmento Fab ou para IFNa2b humano.
[000161] (A) Estiramento de sequência de nucleotídeos e aminoácidos codificado (fita superior/codificante SEQ ID NO: 19, fita inferior/não codificante SEQ ID NO: 20, sequência de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 21) em volta do C-terminal da cadeia leve de imunoglobulina de um fragmento de Fab de anticorpo como codificado em pASK88-Fab-2xSapI (SEQ ID NO: 22), um derivado de pASK75, usado para subclonagem de sequências de polímero/polipeptídeo Pro/Ala e expressão de proteínas correspondentes biologicamente ativas. A sequência nucleotídica transporta dois sítios de reconhecimento SapI em orientação mutuamente reversa, que conduz ao digerir em extremidades de DNA salientes que são compatíveis com o cassete gênico sintético mostrado na figura 1. As sequências de reconhecimento e aminoácidos C-terminais da cadeia leve são sublinhados.
[000162] (B) Sequência nucleotídica e sequência de aminoácidos codificada (fita superior/codificante SEQ ID NO: 23, fita inferior/não codificante SEQ ID NO: 24, sequência de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 25) de um polímero/polipeptídeo PA#1 com 20 resíduos após inserção de um cassete único como mostrado na figura 1 no plasmídeo pASK88-Fab-2xSapI. A ligação/inserção similar de tais 10 cassetes repetidos resultou no vetor de plasmídeo pFab-PA#1(200) (SEQ ID NO: 28) codificando um polímero/polipeptídeo com 200 resíduos (SEQ ID NO: 26 e 27). Os sítios de restrição SapI que flanqueiam a sequência Pro/Ala que codifica o polímero são marcados (as sequências de reconhecimento são sublinhadas).
[000163] (C) Mapa do plasmídeo pFab-PA#1(200) (SEQ ID NO: 28). Os genes estruturais da cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) do Fab-PA#1(200) estão sob controle transcricional do promotor/operador de tetraciclina (tetp/o) e as extremidades de operon com o terminador de lipoproteína (tlpp). HC compreende o peptídeo sinal de OmpA bacteriano, o primeiro domínio C da cadeia pesada variável (VH) e constante (CH) de IgG1 humana bem como o marcador His6. LC compreende o peptídeo sinal de PhoA bacteriano, o domínio variável (VL) e constante (CL) da cadeia leve humana, o polímero/polipeptídeo PA#1 com 200 resíduos. O esqueleto de plasmídeo de pFab- PA#1(200) fora do cassete de expressão flanqueado dos sítios de restrição XbaI e HindIII é idêntico àquele vetor genérico de clonagem e de expressão pASK75 (Skerra (1994) Gene 151:131-135). Sítios de restrição singulares são indicados.
[000164] (D) Estiramento de sequência de nucleotídeos e aminoácidos (fita superior/codificante SEQ ID NO: 29, fita inferior/não codificante SEQ ID NO: 30, sequência de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 31) em volta do N-terminal de IFNa2b humano como clonado em pASK-IFNa2b (SEQ ID NO: 32). O sítio de restrição SapI único que pode ser usado para a inserção da sequência Pro/Ala que codifica o polímero é marcado (a sequência de reconhecimento é sublinhada). Os dois aminoácidos C-terminais do marcador Strep II são sublinhados. O primeiro aminoácido do IFNa2b maduro é marcado com +1.
[000165] (E) Estiramento de sequência de nucleotídeos e aminoácidos codificado (fita superior/codificante SEQ ID NO: 33, fita inferior/não codificante SEQ ID NO: 34, sequência de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 35) do N-terminal de IFNa2b após inserção de um cassete de sequência de polímero PA#1 como mostrado na figura 1. O sítio de restrição único SapI, que permanece após inserção da sequência que codifica o polímero Pro/Ala, é marcado (as sequências de reconhecimento são sublinhadas). O primeiro aminoácido de IFNa2b como parte da proteína de fusão é marcado (1) e os dois aminoácidos C-terminais do marcador Strep II são sublinhados. A ligação/inserção similar de 10 cassetes repetidos de sequência de polímero PA#1 resultou no vetor de plasmídeo pPA#1(200)-IFNa2b que codifica um polímero/polipeptídeo com 200 resíduos (SEQ ID NO: 36)
[000166] (F) Mapa de plasmídeo pPA#1(200)-IFNa2b (SEQ ID NO: 37). O gene estrutural da proteína biologicamente ativa PA#1(200)- IFNa2b (compreendendo o peptídeo sinal de OmpA bacteriano, o marcador Strep II, o polímero/segmento de polipeptídeo PA#1 com 200 resíduos, e IFNa2b humano) está sob controle transcricional do promotor/operador de tetraciclina (tetp/o) e termina no terminador de lipoproteína (tlpp). O esqueleto de plasmídeo fora do cassete de expressão flanqueado dos sítios de restrição XbaI e HindIII é idêntico àquele vetor genérico de clonagem e de expressão pASK75 (Skerra (1994) loc. cit.). Sítios de restrição singulares são indicados. Figura 3. Análise do fragmento Fab recombinante purificado e o IFNa2b recombinante purificado bem como suas fusões de polipeptídeo/polímero Pro/Ala por SDS-PAGE.
[000167] As proteínas recombinantes foram produzidas em E. coli KS272 (Strauch (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1576-80) via secreção periplasmática e purificadas por meio do marcador His6 (Fab) ou marcador Strep II (IFNa2b) usando metal imobilizado ou cromatografia por afinidade de estreptavidina, respectivamente.
[000168] (A) Análise do Fab recombinante purificado e sua fusão PA#1 com 200 resíduos por SDS-PAGE 12%. O gel mostra 2 μg de amostras proteicas cada uma de Fab e Fab-PA#1(200). As amostras à esquerda foram reduzidas com 2-mercaptoetanol ao passo que as amostras repetidas à direita foram deixadas não reduzidas. Os tamanhos dos marcadores proteicos - aplicados em condições redutoras - são indicados na margem esquerda. Na redução da ponte dissulfeto intercadeia, o fragmento Fab e sua fusão PA#1 de 200 resíduos aparecem como duas bandas homogêneas. No caso do fragmento Fab reduzido, as duas bandas com tamanhos moleculares de aproximadamente 24 e 26 kDa, respectivamente, correspondem a LC e HC separados. No caso de proteína de fusão Fab-PA#1(200) reduzida, a banda em 24 kDa corresponde a HC, ao passo que a banda em aproximadamente 90 kDa corresponde a LC fundido com o segmento polipeptídico PA#1(200). Em condições não redutoras, o fragmento Fab e sua fusão PA#1(200) aparecem como bandas homogêneas únicas com tamanhos moleculares aparentes de aproximadamente 45 kDa e 100 kDa, respectivamente. Dois valores de tamanhos aparentes para a proteína de fusão Fab-PA#1(200) são significativamente maiores do que as massas calculadas de 64,3 kDa do Fab-PA#1(200) não reduzido e de 39,1 kDa do LC-PA#1(200) isolado. Este efeito é devido à adição do polímero/segmento de polipeptídeo Pro/Ala porque o próprio fragmento Fab, com uma massa calculada de 48,0 kDa, ou sua cadeia leve não fundida exibe mobilidade eletroforética essencialmente normal.
[000169] (B) Análise do IFNa2b recombinante purificado e sua proteína de fusão PA#1 com 200 resíduos por SDS-PAGE 12%. O gel mostra amostras proteicas de 2 μg cada uma de IFNa2b e de PA#1(200)-IFNa2b. As amostras à esquerda foram reduzidas com 2- mercaptoetanol ao passo que as amostras correspondentes à direita foram deixadas não reduzidas. Os tamanhos de marcadores proteicos - aplicados em condições redutoras - são indicados na margem esquerda. As duas proteínas aparecem como bandas homogêneas únicas com tamanhos moleculares aparentes de aproximadamente 20 kDa e aproximadamente 80 kDa na forma reduzida. O último valor é significativamente maior do que a massa calculada de 37,0 kDa para PA#1(200)-IFNa2b. Este efeito é devido à adição do polímero/segmento de polipeptídeo Pro/Ala porque o próprio IFNa2b, com uma massa calculada de 20,9 kDa, exibe mobilidade eletroforética essencialmente normal. IFNa2b no estado não reduzido tem uma mobilidade eletroforética levemente mais alta, indicando uma forma mais compacta em consequência das suas duas pontes dissulfeto intramoleculares. Figura 4. Análise quantitativa dos volumes hidrodinâmicos do Fab recombinante purificado e IFNa2b bem como suas fusões PA#1(200).
[000170] (A) Cromatografia por exclusão de tamanho analítica (SEC) de Fab e Fab-PA#1(200). 250 μl da proteína purificada em uma concentração de 0,25 mg/mL foram aplicados a uma coluna Superdex S200 10/300 GL equilibrada com tampão PBS. A absorção em 280 nm foi monitorada e o pico de cada corrida de cromatografia foi normalizado a um valor de 1. A flecha indica o volume nulo da coluna (7,8 mL).
[000171] (B) Curva de calibração dos cromatogramas de (A) usando uma coluna Superdex S200 10/300 GL. O logaritmo do peso molecular (MW) de proteínas marcadoras (citocromo c, 12,4 kDa; anidrase carbônica, 29,0 kDa; ovoalbumina, 43,0 kDa; albumina sérica bovina, 66,3 kDa; álcool desidrogenase, 150 kDa, β-amilase, 200 kDa, apoferritina, 440 kDa) foi traçado contra seus volumes de eluição (círculos pretos) e ajustado por uma linha direta. Dos volumes de eluição observados do fragmento Fab e sua proteína de fusão PA#1 (quadrados pretos) seus tamanhos moleculares aparentes foram determinados como se segue. Fab: 31 kDa (massa verdadeira: 48,0 kDa); Fab-PA#1(200): 237 kDa (massa verdadeira: 64,3 kDa). Estes dados mostram que a fusão com o polipeptídeo PA#1 confere um volume hidrodinâmico muito ampliado.
[000172] (C) Cromatografia por exclusão de tamanho analítica de IFNa2b e PA#1(200)-IFNa2b. 250 μl de cada proteína purificada em uma concentração de 0,25 mg/mL foram aplicados a uma coluna Superdex S200 10/300 GL equilibrada com salina tamponada em fosfato, PBS. A absorção em 280 nm foi monitorada e o pico de cada corrida de cromatografia foi normalizado a um valor de 1. A flecha indica o volume nulo da coluna (7,8 mL).
[000173] (D) Curva de calibração do cromatograma de (C) usando uma coluna Superdex S200 10/300 GL. O logaritmo do peso molecular (MW) de proteínas marcadoras (ver B) foi traçado contra seus volumes de eluição (círculos pretos) e ajustado por uma linha direta. Dos volumes de eluição observados de IFNa2b e sua proteína de fusão PA#1 (quadrados pretos) seus tamanhos moleculares aparentes foram determinados como se segue. IFNa2b: 22,5 kDa (massa verdadeira: 20,9 kDa); PA#1(200)-IFNa2b: 229,0 kDa (massa verdadeira: 37,0 kDa). Estes dados mostram que a fusão com o polipeptídeo PA#1 confere um volume hidrodinâmico muito ampliado. Figura 5. Análise de estrutura secundária experimental de proteínas recombinantes e suas fusões de polímero/polipeptídeo PA#1 por espectroscopia de dicroísmo circular (CD).
[000174] Os espectros foram registrados à temperatura ambiente em K2SO4 50 mM, K-fosfato 20 mM pH 7,5 e normalizados à elipticidade molar, θM, para cada proteína.
[000175] (A) Espectros de CD do Fab recombinante purificado e Fab-PA#1(200). O espectro de CD do fragmento Fab mostra os atributos típicos de uma proteína β-folha predominante com um máximo largo negativo aproximadamente de 216 nm (Sreerama em: Circular Dichroism - Principles and Applications (2000) Berova, Nakanishi e Woody (Eds.) Wiley, New York, NY, pp. 601-620), que indica o enovelamento correto do fragmento Fab bacterianamente produzido. O espectro de sua proteína de fusão com o polímero/polipeptídeo Pro/Ala revela uma banda negativa dominante abaixo de 200 nm, que é indicativa da conformação helicoidal randômica. Além disso, há um ombro aproximadamente de 220 nm, que resulta da contribuição de β-folha do fragmento Fab e indica seu enovelamento correto mesmo como parte da proteína de fusão.
[000176] (B) Espectro de CD de diferença molar para Fab-PA#1(200) obtido por subtração do espectro do fragmento Fab. O espectro de CD de diferença representa a estrutura secundária do polímero PA#1/segmento de polipeptídeo de 200 resíduos e revela um mínimo forte de aproximadamente 200 nm, que é uma indicação clara da conformação helicoidal randômica em solução aquosa tamponada (Greenfield (1969) Biochemistry 8: 4108-4116; Sreerama (2000) loc. cit.; Fandrich (2002) EMBO J. 21:5682-5690).
[000177] (C) Espectros de CD do IFNa2b recombinante purificado e PA#1(200)-IFNa2b. O espectro de CD de IFNa2b mostra os atributos típicos de uma proteína a-hélice predominante com duas bandas negativas de aproximadamente 208 nm e 220 nm (Sreerama (2000) loc. cit.), que indica o enovelamento correto do IFNa2b humano bacterianamente produzido. O espectro da sua proteína de fusão com o polímero/polipeptídeo Pro/Ala revela desvios característicos com um mínimo dominante de aproximadamente 200 nm, que é indicativo da conformação helicoidal randômica. Além disso, há um ombro de aproximadamente 220 nm, que resulta acontribuição α-helicoidal de IFNa2b e indica o enovelamento correto do IFNa2b mesmo como parte da proteína de fusão.
[000178] (D) O espectro de CD de diferença molar para PA#1(200)- IFNa2b obtido pela subtração do espectro de IFNa2b. O espectro de CD de diferença representa a estrutura secundária do polímero PA#1/segmento de polipeptídeo de 200 resíduos e revela um mínimo forte de aproximadamente 200 nm, essencialmente idênticos a um mostrado em (B). Isto é novamente uma indicação clara da conformação helicoidal randômica em solução aquosa tamponada de um polímero biológico que compreende resíduos Pro e Ala de acordo com a invenção. Figura 6. Produção secretória de uma proteína de fusão entre hormônio de crescimento humano (hGH) e polímero PA#1 geneticamente codificado em células CHO.
[000179] (A) Estiramento de sequência de nucleotídeos e aminoácidos (fita superior/codificante SEQ ID NO: 38, fita inferior/não codificante SEQ ID NO: 39, sequência de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 40) em volta do N-terminal de hGH como clonado em pASK75- His6-hGH (SEQ ID NO: 41). Os sítios de restrição únicos NheI, que pode ser usado em conjunto com HindIII (não mostrado) para a subclonagem, e SapI, que pode ser usado para a inserção da sequência Pro/Ala que codifica o polímero, são marcados (a sequência de reconhecimento é sublinhada). Os seis aminoácidos do marcador His6 são sublinhados. O primeiro aminoácido do hGH é marcado com +1.
[000180] (B) Sequência de nucleotídeos e aminoácidos codificada (fita superior/codificante SEQ ID NO: 42, fita inferior/não codificante SEQ ID NO: 43, sequência de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 44) do N-terminal de hGH após inserção de um cassete de sequência de polímero PA#1 como mostrado na figura 1. Os sítios de restrição únicos NheI, que podem ser usados para subclonagem, e SapI, que permanece após inserção da sequência Pro/Ala que codifica o polímero, são marcados (as sequências de reconhecimento são sublinhadas). O primeiro aminoácido de hGH como parte da proteína de fusão é marcado (1) e os aminoácidos do marcador His6 são sublinhados. A ligação/inserção similar de 10 cassetes de sequência de polímero PA#1 repetidos resultou no vetor de plasmídeo pASK75- His6-PA#1(200)-hGH que codifica a proteína de fusão madura SEQ ID NO: 45.)
[000181] (C) Mapa de plasmídeo pASK75-His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 46). O gene estrutural da proteína biologicamente ativa His6-PA#1(200)-hGH (compreendendo o peptídeo sinal de OmpA bacteriano, marcador His6, o polímero PA#1 /segmento de polipeptídeo com 200 resíduos, e GH humano) está sob controle transcricional do promotor/operador de tetraciclina (tetp/o) e termina no terminador de lipoproteína (tlpp). O esqueleto de plasmídeo fora do cassete de expressão flanqueado dos sítios de restrição XbaI e HindIII é idêntico àquele vetor genérico de clonagem e de expressão pASK75 (Skerra (1994) loc. cit.). Sítios de restrição singulares são indicados.
[000182] (D) O mapa de plasmídeo pCHO-PA#1(200)-hGH, que codifica uma proteína de fusão His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 47). O gene estrutural, compreendendo o peptídeo sinal de hormônio de crescimento humano (Sp), marcador His6, sequência de polímero/polipeptídeo PA#1 com 200 resíduos (PA#1(200)), o hormônio de crescimento humano (hGH), e contendo o sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (bGH pA), está sob controle transcricional do promotor de vírus citomegalus (CMVp). Sítios de restrição singulares NheI e HindIII são indicados. O gene de resistência à neomicinfosfotransferase (neo) está sob controle do promotor SV40 (SV40p) e seguido por um sinal de poliadenilação SV40 (SV40 pA). Além disso, o plasmídeo contém a origem ColE1 bacteriana de replicação (ColE1-ori), a origem da replicação de bacteriófago f1 (f1-ori), e gene de β-lactamase (bla) para permitir a propagação e seleção em E. coli.
[000183] (E) Análise de Western blot de uma proteína de fusão entre hGH e o polímero PA#1 geneticamente codificado de 200 resíduos produzidos em células CHO comparado com hGH recombinante. Células CHO-K1 foram transfectadas com pCHO-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 48) ou com pCHO-hGH (SEQ ID NO: 49), um plasmídeo similar que codifica hGH sem a sequência de PA#1(200) (mas também carrega o marcador His6). Dois dias após transfecção, uma amostra do sobrenadante de cultura celular foi submetida a SDS-PAGE e Western blotting com um anticorpo anti-hGH conjugado com peroxidase de rábano-silvestre. As duas proteínas aparecem como bandas únicas indicadas por flechas, com tamanhos moleculares aparentes de aproximadamente 23 kDa (His6-hGH) e aproximadamente 90 kDa (His6-PA#1-hGH). Há também uma banda fraca de aproximadamente 60 kDa que resultam de proteínas séricas em meio de cultura. Ao passo que hGH marcado com His6 aparece na massa calculada de 23,5 kDa, o tamanho molecular aparente de His6- PA#1-hGH é significativamente maior do que sua massa calculada de 39,5 kDa. Este efeito é devido à natureza helicoidal randômica hidrofílica do polímero Pro-Ala. Figura 7. Predição teórica de estrutura secundária para a sequência polipeptídica Pro/Ala/polímero PA#1.
[000184] Esta ilustração mostra a produção do algoritmo de computador CHOFAS de acordo com o método Chou-Fasman (Chou e Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245) como implementado no servidor de predição de Comparação de Sequência e de Estrutura Secundária na Universidade de Virginia (URL: http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2). Para evitar efeitos divisionais nos terminais amino e carbóxi, a repetição de aminoácido de 20mer de acordo com a figura 1 foi colada em três cópias consecutivas (resultando em um concatâmero similar como codificado após ligação/inserção repetida do cassete gênico sintético) e somente a saída para o bloco de sequência central de 20mer (na caixa) foi considerada. No caso da sequência/segmento polipeptídico PA#1 (SEQ ID NO: 1) o algoritmo Chou-Fasman prediz 100% da estrutura secundária α-helicoidal. Isto é, em contraste com a conformação helicoidal randômica predominante experimentalmente observada para o polipeptídeo/segmento polipeptídico PA#1 como parte de uma proteína de fusão (ver a figura 5B/D). Figura 8. Análise quantitativa da farmacocinética do fragmento Fab recombinante purificado e suas fusões de polímero PA#1 com 200 e 600 resíduos em camundongos BALB/c.
[000185] As amostras plasmáticas do exemplo 16 foram analisadas para concentrações de Fab, Fab-PA#1(200), e Fab-PA#1 (600) usando um ELISA sanduíche. Para estimar a meia-vida plasmática de Fab, Fab-PA#1(200), e Fab-PA#1 (600), os valores de concentração medidos foram traçados contra tempo de pós-injeção intravenosa e ajustados numericamente assumindo um decaimento bi-exponencial. O fragmento Fab não fundido exibiu uma depuração muito rápida com uma meia-vida de eliminação de 1,3 ± 0,1 h. Ao contrário, a fase de eliminação determinada para Fab-PA#1(200) e Fab-PA#1 (600) foi significativamente mais lenta, com meias-vidas terminais de 4,1 ± 1,8 h e 38,8 ± 11,2 h, respectivamente, dessa forma manifestando uma circulação prolongada de aproximadamente 3 vezes e de aproximadamente 30 vezes devido à fusão do polímero Pro/Ala com 200 ou 600 resíduos comparados com o fragmento Fab não fundido. Figura 9. Análise do fragmento Fab recombinante purificado como fusão com o polímero P1A1 ou P1A3 tendo 200 resíduos.
[000186] As proteínas recombinantes foram produzidas em E. coli KS272 através de secreção periplasmática e purificadas por meio do marcador His6 usando cromatografia de afinidade de metal imobilizado. As proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE 12%. O gel mostra amostras proteicas de 2 μg cada uma de Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200) bem como, para comparação, do fragmento Fab não fundido (cf. figura 3A). As amostras à esquerda foram reduzidas com 2-mercaptoetanol ao passo que as amostras análogas à direita foram deixadas não reduzidas. Os tamanhos dos marcadores proteicos - aplicados em condições redutoras - são indicados na margem esquerda. Após redução das pontes dissulfeto intercadeia, o fragmento Fab e suas fusões Pro/Ala de 200 resíduos aparecem como duas bandas homogêneas. No caso do fragmento Fab reduzido, as duas bandas com tamanhos moleculares de aproximadamente 24 e 26 kDa, respectivamente, correspondem a fragmentos separados da cadeia leve (LC) e da cadeia pesada (HC). No caso da proteína de fusão Fab-P1A1 reduzida (200), a banda em 24 kDa corresponde a HC, ao passo que a banda em aproximadamente 90 kDa corresponde a LC fundido com o polipeptídeo P1A1 (200). No caso da proteína de fusão Fab-P1A3 reduzida (200), a banda em 24 kDa corresponde a HC, ao passo que a banda em aproximadamente 75 kDa corresponde a LC fundido com o polipeptídeo P1A5 (200). Em condições não redutoras, o fragmento Fab, sua fusão P1A1 (200) e sua fusão P1A3 (200) aparece como bandas proeminentes únicas com tamanhos moleculares aparentes de aproximadamente 45 kDa, 110 kDa, e 90 kDa, respectivamente. Os tamanhos aparentes das proteínas de fusão Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200) são significativamente maiores do que as massas calculadas de 65,3 kDa de Fab-P1A1 não reduzido (200) e de 64,0 kDa de Fab-P1A3 não reduzido (200). Também, os tamanhos aparentes das cadeias leves reduzidas correspondentes são significativamente maiores do que as massas calculadas de 40,7 kDa de P1A1 (200) LC e de 39,4 kDa de P1A3 (200) LC. Este efeito é devido à adição do polímero/segmento de polipeptídeo Pro/Ala porque o próprio fragmento Fab, com uma massa calculada de 48,0 kDa, ou sua cadeia leve não fundida, com uma massa calculada de 23,4 kDa, exibe mobilidade eletroforética essencialmente normal. Figura 10. Análise quantitativa dos volumes hidrodinâmicos de proteínas de fusão recombinantes purificadas Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200).
[000187] Cromatografia por exclusão de tamanho analítica (SEC) de Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200). 250 μl da proteína purificada em uma concentração de 0,25 mg/mL foram aplicados a uma coluna Superdex S200 10/300 GL equilibrada com PBS. A absorção em 280 nm foi monitorada e o pico de cada corrida de cromatografia foi normalizado a um valor de 1. A flecha indica o volume nulo da coluna (7,8 mL). Dos volumes de eluição observados das proteínas de fusão, seus tamanhos moleculares aparentes foram determinados usando uma curva de calibração similar como mostrada na figura 4B como se segue. Fab-P1A1 (200): 180,7 kDa (massa verdadeira: 65,3 kDa); Fab- P1A3 (200): 160,2 kDa (massa verdadeira: 64,0 kDa). Estes dados mostram que a fusão de uma proteína com o polipeptídeo P1A1 e/ou P1A5 confere um volume hidrodinâmico muito ampliado. Figura 11. Análise de estrutura secundária experimental de fusões Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200) por espectroscopia de dicroísmo circular (CD).
[000188] Os espectros foram registrados à temperatura ambiente em K2SO4 50 mM, K-fosfato 20 mM pH 7,5 e normalizados em ellipticidade molar, θM, para cada proteína.
[000189] (A) Espectros de CD do Fab-P1A1 recombinante purificado (200) e Fab-P1A3 (200). Os espectros de CD das proteínas de fusão Fab com ambos os polímeros/polipeptídeos Pro/Ala cada um revela uma banda negativa dominante abaixo de 200 nm, que é indicativa de conformação helicoidal randômica. Além disso, há um ombro aproximadamente 220 nm, que resulta da contribuição de β-folha do fragmento Fab e indica seu enovelamento correto mesmo como parte da proteína de fusão.
[000190] (B) Os espectros de CD de diferença molar de Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200) obtidos pela subtração do espectro do fragmento Fab não fundido (ver figura 5A). Os espectros de CD de diferença representam as estruturas secundárias de segmentos de P1A1 (SEQ ID NO: 51) e P1A3 (SEQ ID NO: 3) de polímeros/polipeptídeo de 200 resíduos, respectivamente, e revelam um mínimo forte de aproximadamente 200 nm, que é uma indicação clara de sua conformação helicoidal randômica em solução aquosa tamponada (Greenfield (1969) Biochemistry 8: 4108-4116; Sreerama (2000) loc. cit.; Fandrich (2002) EMBO J. 21:5682-5690). Figura 12: Preparação de um polímero/polipeptídeo Pro/Ala biossintético isolado.
[000191] (A) Mapa de plasmídeo pSUMO-PA#1(200) (SEQ ID NO: 60). O gene estrutural da proteína de fusão MK-His(6)-SUMO- PA#1(200) compreendendo um códon de partida metionina seguido por um códon lisina, um marcador de afinidade N-terminal de seis resíduos His consecutivos, uma pequena proteína modificadora Smt3p similar a ubiquitina clivável (SUMO) (Panavas (2009) Methods Mol Biol. 497: 303-17), e o polímero/segmento de polipeptídeo PA#1 com 200 resíduos (SEQ ID NO: 60) está sob controle transcricional do gene do promotor 10 do bacteriófago T7 e termina no terminador t^. Elementos de plasmídeos adicionais compreendem a origem de replicação (ori), o gene de resistência à ampicilina (bla), e a origem f1 de replicação. O esqueleto de plasmídeo fora do cassete de expressão flanqueado de sítios de restrição NdeI e HindIII é, exceto um sítio de restrição SapI que foi eliminado por mutação silenciosa, idêntico àquele vetor genérico de clonagem e de expressão pRSET5a (Schoepfer (1993) 124: 83-85).
[000192] A SEQ ID NO: 60 é fornecida na listagem de sequência anexada (que é também parte desta descrição e relatório descritivo) e é reproduzida neste pedido abaixo. gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 60 atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 120 agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180 ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240 gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300 gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 360 tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 420 acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 480 aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 540 cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 600 gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 660 cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 720 tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 780 tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 840 ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 900 tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 960 gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1020 ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1080 tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1140 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1200 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1260 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 1320 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1380 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1440 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1500 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1560 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1620 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1680 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1740 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1800 acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 1860 gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 1920 cggagaagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1980 ggatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc 2040 tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat atgaaacatc accaccatca 2100 ccattcggac tcagaagtca atcaagaagc taagccagag gtcaagccag aagtcaagcc 2160 tgagactcac atcaatttaa aggtgtccga tggatcttca gaaatcttct ttaagatcaa 2220 aaagaccact cctttaagaa ggctgatgga agcgttcgct aaaagacagg gtaaggaaat 2280 ggactcctta agattcttgt acgacggtat tagaattcaa gctgatcaga cccctgaaga 2340 tttggacatg gaggataacg atattattga ggctcacaga gaacagattg gtggcgccgc 2400 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2460 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2520 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2580 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2640 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2700 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2760 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2820 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2880 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2940 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgcctg 3000 aagagcaagc ttgatccggc tgctaacaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 3060 accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 3120 ttgctgaaag gaggaactat atccggatct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 3180 gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat 3240 taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 3300 cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 3360 aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 3420 ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 3480 ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 3540 caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 3600 cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 3660 taacgcttac aatttaggtg 3680
[000193] (B) Análise da proteína de fusão bacterianamente produzida His(6)-SUMO-PA#1(200) e sua clivagem por SDS-PAGE 12%. O gel mostra a proteína de fusão SUMO-PAS#1 (200) extraída de E. coli e purificada através de cromatografia de afinidade em metal imobilizado (IMAC) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) antes (banda 1) e após clivagem proteolítica com a protease 1 específica para Ubl (protease SUMO) (banda 2) como descrito no exemplo 21. Todas as amostras foram reduzidas com 2- mercaptoetanol. Os tamanhos de marcadores proteicos (M), aplicado em condições redutoras, são indicados na margem esquerda. A proteína de fusão His(6)-SUMO-PA#1(200) aparece como uma banda homogênea única com um tamanho molecular aparente de aproximadamente 100 kDa. Dessa forma, o tamanho aparente para a proteína de fusão His(6)-SUMO-PA#1(200) observada em SDS-PAGE é significativamente maior do que a massa calculada de 28,3 kDa, que é devido à presença do polímero/polipeptídeo Pro/Ala. Após clivagem, o polipeptídeo hidrofílico PA#1(200) não é detectavelmente marcado por azul de Coomassie; por isso, somente uma pequena fração residual da proteína de fusão e a proteína clivada His(6)-SUMO é visível no gel de SDS poliacrilamida (banda 2). A proteína His(6)- SUMO mostra uma banda homogênea com o tamanho molecular aparente de aproximadamente 16 kDa (banda 2) que está bem de acordo com sua massa molecular calculada de 12,2 kDa. Figura 13: Conjugação de um polímero/polipeptídeo Pro/Ala biossintético com compostos químicos e/ou fármacos.
[000194] (A-D) Produção de um conjugado de fluoresceína com um polímero/polipeptídeo PA#1(200) biossintético (SEQ ID NO: 61) monitorado através de cromatografia por exclusão de tamanho analítica (SEC). Os painéis mostram (de cima para baixo) corridas de SEC de His(6)-SUMO-PA#1(200) purificado (A), His(6)-SUMO- PA#1(200) após reação de clivagem na presença da protease SUMO (B), a carga de His(6)-SUMO-PA#1(200) clivado após acoplamento químico com um éster de NHS fluoresceína (C), e o conjugado fluoresceína-PA#1(200) após purificação com IMAC (D). 250 μl da proteína/polipeptídeo em uma concentração de aproximadamente 0,5 mg/mL foram aplicados a uma coluna Superdex S200 10/300 GL equilibrada com PBS em um sistema purificador Ãkta. A absorção em 225 nm, 280 nm, e 494 nm foi monitorada usando um detector UV-900 UV/VIS (GE Healthcare) e um pico proeminente de cada cromatograma foi normalizado a um valor de 1. A flecha indica o volume nulo da coluna (7,3 mL).
[000195] (E-K) Caracterização da fluoresceína livre, o polímero/polipeptídeo PA#1(200) biossintético, e seu conjugado com fluoresceína através de SEC e espectroscopia UV/VIS. Os três cromatogramas mostram (de cima para baixo) PA#1(200) purificado (E), o composto químico fluoresceína (F) e o conjugado purificado fluoresceína-PA#1(200) (G). Quatro espectros UV/VIS mostram a proteína de fusão purificada His(6)-SUMO-PA#1(200) (H), o polímero/polipeptídeo purificado PA#1(200) (I), fluoresceína livre (J), e o conjugado purificado fluoresceína-PA#1(200) (K) (todos em PBS). As flechas indicam bandas/ombros de absorção característicos de SUMO (280 nm), PA#1(200) (225 nm), e fluoresceína (494 nm).
[000196] (L) Curva de calibração dos cromatogramas de (A-G) usando uma coluna Superdex S200 10/300 GL. O logaritmo do peso molecular (MW) de proteínas marcadoras (aprotinina, 6,5 kDa; citocromo C, 12,4 kDa; anidrase carbônica, 29,0 kDa; albumina sérica bovina, 66,3 kDa; álcool desidrogenase, 150 kDa; β-amilase, 200 kDa; apoferritina, 440 kDa) foi traçado contra seus volumes de eluição (x) e ajustado por uma linha reta. Dos volumes de eluição observados de His(6)-SUMO-PA#1(200) (10,81 mL), PA#1(200) (11,51 mL), fluoresceína-PA#1(200) (11,49 mL) e fluoresceína (27,57 mL), seus tamanhos moleculares aparentes foram determinados como se segue. His(6)-SUMO-PA#1(200): 215,6 kDa, PA#1(200): 154,1 kDa (massa verdadeira: 16,1 kDa), fluoresceína-PA#1(200): 155,6 kDa (massa verdadeira: 16,6 kDa); SUMO: 25,7 kDa (massa verdadeira: 12,2 kDa); fluoresceína: 0,09 kDa (massa verdadeira: 0,33 kDa). Estes dados mostram que a fusão com o polipeptídeo/polímero Pro/Ala confere um volume hidrodinâmico muito ampliado ao fármaco conjugado comparado com o composto não modificado.
[000197] (M) Caracterização do conjugado químico entre o polipeptídeo/polímero PA#1(200) biossintético e o composto esteroide digoxigenina através da Espectrometria de Massa de Ionização por Eletropulverização (ESI-MS). Um espectro de ESI-MS deconvolucionado de digoxigenina-PA#1(200) revela uma massa de 16671,4 Da, que essencialmente coincide com a massa calculada para o conjugado digoxigenina-PA#1(200) (16670,6 Da). Figura 14: Ilustração de conjugados químicos entre o polipeptídeo/polímero PA#1(200) biossintético e pequenas moléculas de fármaco.
[000198] (A) Fluoresceína acoplada ao N-terminal do PA#1(200) biossintético.
[000199] (B) Digoxigenina acoplada ao N-terminal do PA#1(200) biossintético.
EXEMPLOS
[000200] A presente invenção é adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos não limitantes ilustrativos que fornecem uma melhor compreensão da presente invenção e muitas de suas vantagens.
[000201] A menos que de outra maneira indicado, os métodos estabelecidos da tecnologia gênica recombinante foram usados como descrito, por exemplo, em Sambrook (2001) loc. cit. Exemplo 1: Síntese gênica de polímeros/polipeptídeos de aminoácido Pro/Ala.
[000202] Como descrito neste pedido acima, as repetições de aminoácido consistindo em resíduos Pro e Ala são representadas neste pedido como Pro/Ala ou "PA". Os fragmentos gênicos que codificam uma sequência de polímero repetitiva que compreende Pro e Ala (PA#1 que corresponde a SEQ ID NO: 1) foram obtidos por hibridização de dois oligodesoxinucleotídeos complementares (SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18) mostrada na figura 1, seguido pela formação de concatâmero de uma maneira direcionada através da ligação de DNA das suas extremidades adesivas mutuamente compatíveis mas não palindrômicas. Os oligodesoxinucleotídeos foram adquiridos de ThermoScientific (Ulm, Alemanha) e purificados por eletroforese em gel de poliacrilamida de ureia preparativa. As sequências de ácidos nucleicos do oligodesoxinucleotídeos são representadas na figura 1 (SEQ ID NOs 17 e 18 compreendendo um códon GCC adicional para alanina, que se torna parte da seguinte sequência de repetição PA#1 na ligação das extremidades adesivas correspondentes. Fosforilação enzimática foi realizada misturando 200 pmol de ambos os oligodesoxinucleotídeos em 100 μl de Tris/HCl 50 mM pH 7,6, MgCh 10 mM, DTT 5 mM, ATP 1 mM e incubação por 30 min a 37°C na presença de 10 u de polinucleotídeo quinase (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha). Após desnaturação por 10 min a 80°C, a mistura foi resfriada à temperatura ambiente durante a noite para alcançar a hibridização. Então 50 μl desta solução foram ligados adicionando 1 u de T4 DNA ligase (MBI Fermentas) e 10 μl de Tris/HCl 100 mM pH 7,4, MgCl2 50 mM, DTT 20 mM, ATP 10 mM, e em alguns casos, 5 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, em um volume total de 100 μl e incubação por 55 min em gelo. Após inativação térmica por 10 min a 70°C, os produtos de ligação foram separados em gel 1,5% (p/v) de agarose de eletroforese na presença do tampão TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM). Após marcação com brometo de etídeo, a banda correspondente ao segmento gênico montado de 300 bp de comprimento foi extirpada e isolada. Exemplo 2: Construção de pFab-PA#1(200) como vetor de expressão para uma proteína de fusão Fab-PA#1.
[000203] Para clonar de uma repetição 10mer do fragmento gênico sintético que codifica a sequência de 20 aminoácidos de PA#1 do exemplo 1, o vetor de plasmídeo pASK88-Fab-2xSapI (SEQ ID NO: 22), um plasmídeo de expressão de um fragmento Fab (Schlapschy (2007) Protein Eng. Des. Sel. 20:273-284) abrigando uma sequência nucleotídica com dois sítios de restrição SapI na orientação complementar reversa na extremidade 3’ da cadeia leve (figura 2A), foi empregado. Este vetor, que é um derivado de pASK75 (Skerra, A. (1994) Gene 151:131-135), foi cortado com SapI, desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão (USB, Cleveland, o Ohio), e ligado com um cassete de 300 bp do fragmento de DNA sintético obtido do exemplo 1. O plasmídeo intermediário resultante pFab-PA#1 (100) foi novamente cortado com SapI, desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão, e ligado com um cassete de 300 bp do fragmento de DNA sintético obtido do exemplo 1 (como exemplificado com a figura 2B, entretanto somente com um cassete de polímero/polipeptídeo PA#1(20)). O plasmídeo resultante foi designado pFab-PA#1(200) (SEQ ID NO: 28) (figura 2C). Deve ser observado que neste plasmídeo, a região de codificação para a repetição de sequência PA#1 de 200 resíduos foi flanqueada de duas restrições SapI, que permite excisão exata e subclonagem adicional do cassete de sequência inteiro, transportando protuberâncias de nucleotídeo 5’- GCC.
[000204] Após transformação de E. coli XL1-Blue (Bullock (1987) Biotechniques 5: 376-378), o plasmídeo foi preparado e a sequência do inserto de ácido nucleico sintético clonado foi confirmada por análise de restrição e sequenciamento de DNA de fita dupla (analisador ABI-Prism™310 Genetic, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha) usando kit terminador BigDye™ bem como iniciadores de oligodesoxinucleotídeo que permitiram o sequenciamento de ambos os lados. Exemplo 3: Construção de pASK-PA#1(200)-IFNa2b como um vetor de expressão para uma proteína de fusão PA#1(200) -IFNa2b.
[000205] Para a construção de um plasmídeo de expressão que codifica IFNa2b como fusão com uma repetição de sequência PA#1 de 200 resíduos, PA#1(200), pASK-IFNa2b (SEQ ID NO: 32) (figura 2D) foi cortado com SapI, desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão, e ligado com o fragmento gênico que codifica o polipeptídeo PA#1 de 200 resíduos extirpado do plasmídeo anteriormente construído pFab-PA#1(200) (Exemplo 2) pela digestão de restrição com SapI (como exemplificado com a figura 2E, entretanto somente com um cassete de polímero/polipeptídeo PA#1 (20)). Após transformação de E. coli JM83 (Yanisch-Perron. (1985) Gene 33:103119), o plasmídeo foi preparado e a presença do inserto correto foi confirmada pela análise de restrição. O plasmídeo resultante foi designado pPA#1(200)-IFNa2b (SEQ ID NO: 37) (figura 2F). Exemplo 4: Produção bacteriana e purificação de proteínas de fusão entre um fragmento Fab e polímero/polipeptídeo PA#1geneticamente codificado.
[000206] O fragmento Fab (massa calculada: 48,0 kDa) e fusão Fab- PA#1(200) (massa calculada: 64,3 kDa) foram produzidos a 22°C em E. coli KS272 que abriga os plasmídeos de expressão correspondentes do exemplo 3, em conjunto com o plasmídeo auxiliar flexível pTUM4 (Schlapschy (2006) Protein Eng. Des. Sel. 19:385390), usando culturas de frasco em agitador com 2 L de meio LB contendo ampicilina 100 mg/l e cloranfenicol 30 mg/l. A indução da expressão gênica recombinante foi realizada pela adição de 0,4 mg de anidrotetraciclina em OD550 = 0,5 ao longo da noite (tipicamente resultando em OD550 de aproximadamente 1,0 na coleta). A extração periplasmática na presença de sacarose 500 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl 100 mM pH 8,0 contendo lisozima 50 μg/mL foi realizada como descrito em outro lugar (Breustedt (2005) Biochim. Biophys. Acta 1764:161-173) e seguido por purificação por meio do marcador His6 usando cromatografia de afinidade em metal imobilizado (Skerra (1994) Gene 141: 79-84) com um gradiente de imidazol de 0 a 200 mM em betaína 500 mM, Na-fosfato 50 mM pH 7,5).
[000207] Preparações proteicas homogêneas foram obtidas para ambos fragmentos Fab recombinantes (figura 3A) com rendimentos de 0,2 mg L-1 OD-1 para Fab não fundido e 0,1 mg L-1 OD-1 para Fab- PA#1(200). SDS-PAGE foi realizado usando um sistema de tampão Tris de alta molaridade (Fling (1986) Anal. Biochem. 155: 83-88). As concentrações proteicas foram determinadas de acordo com a absorção em 280 nm usando coeficientes de extinção calculados (Gill (1989) Anal. Biochem. 182: 319-326) de 68290 M-1 cm-1 tanto para Fab não fundido como para sua fusão de polímero PA#1 como o polímero Pro/Ala não contribuiu para a absorção UV em razão de sua falta de aminoácidos aromáticos. Exemplo 5: Produção bacteriana e purificação de proteínas de fusão entre IFNa2b e polímero/polipeptídeo PA#1 geneticamente codificado.
[000208] IFNa2b (massa calculada: 20,9 kDa) e PA#1(200)-IFNa2b (massa calculada: 37,0 kDa) foram produzidos a 22°C em E. coli KS272 que abriga os plasmídeos de expressão correspondentes do exemplo 3, em conjunto com o plasmídeo auxiliar flexível pTUM4 (Schlapschy (2006) loc. cit.), usando culturas de frasco de agitador com 2 L de meio LB contendo ampicilina 100 mg/l e cloranfenicol 30 mg/l. A indução da expressão gênica recombinante foi realizada pela adição de 0,4 mg de anidrotetraciclina em OD550 = 0,5 ao longo da noite (tipicamente resultando em OD550 de aproximadamente 1,0 na coleta). A extração periplasmática na presença de sacarose 500 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl100 mM pH 8,0 contendo lisozima 50 μg/mL foi realizada como descrito em outro lugar (Breustedt (2005) loc. cit.) e seguido por purificação via marcador Strep II usando cromatografia de afinidade de estreptavidina (Schmidt (2007) Nat. Protoc. 2:1528-1535) na presença de NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 8,0.
[000209] As preparações proteicas homogêneas foram obtidas para ambas as proteínas IFNa2b recombinantes (figura 3B) com rendimentos de 0,15 mg L-1 OD-1 para IFNa2b e 0,1 mg L-1 OD-1 para PA#1(200)-IFNa2b. SDS-PAGE foi realizado usando um sistema de tampão Tris de alta molaridade (Fling (1986) loc. cit.). As concentrações proteicas foram determinadas de acordo com a absorção em 280 nm usando coeficientes de extinção calculados (Gill (1989) loc. cit.) de 23590 M-1 cm-1 tanto para IFNa2b não fundido como para sua fusão de polímero PA#1. Exemplo 6: Medida do volume hidrodinâmico da proteína de fusão recombinante entre um fragmento Fab e polímero geneticamente codificado PA#1 de 200 resíduos por filtração em gel analítico.
[000210] A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) foi realizada em uma coluna Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare Europe, Freiburg, Alemanha) em uma taxa de fluxo de 1 mL/min usando um sistema Purificador Ãkta 10 (GE Healthcare) com PBS (NaCl 115 mM, KH2PO4 4 mM, Na2HPO4 16 mM; pH 7,4) como tampão de corrida. Amostras de 250 μl do fragmento Fab purificado e sua fusão PA#1 de 200 resíduos, obtida da cromatografia por afinidade metálica como descrito no exemplo 4, foram individualmente aplicadas em uma concentração de 0,25 mg/mL em PBS. Ambas as proteínas eluídas em um pico homogêneo único como mostrado na figura 4A.
[000211] Para a calibração de coluna (figura 4B), 250 μl de uma mistura apropriada das seguintes proteínas globulares (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) foram aplicados em PBS em concentrações proteicas entre 0,2 mg/mL e 0,5 mg/mL: citocromo c, 12,4 kDa; anidrase carbônica, 29,0 kDa; ovoalbumina, 43,0 kDa; albumina sérica bovina, 66,3 kDa; álcool desidrogenase, 150 kDa; β-amilase, 200 kDa; apoferritina, 440 kDa.
[000212] Como resultado, a proteína de fusão com o polímero/polipeptídeo PA#1 de 200 resíduos exibiu um tamanho significativamente maior do que proteínas globulares correspondentes com o mesmo peso molecular. O aumento de tamanho aparente para Fab-PA#1(200) foi de 7,4 vezes comparado com o fragmento Fab não fundido ao passo que a massa verdadeira foi somente maior por 1,3 vezes. Esta observação claramente indica um volume hidrodinâmico muito aumentado conferido ao fragmento Fab biologicamente ativo pelo segmento polipeptídico Pro/Ala de acordo com esta invenção. Exemplo 7: Medida do volume hidrodinâmico da proteína de fusão recombinante entre IFNa2b e polímero geneticamente codificado PA#1 de 200 resíduos por filtração em gel analítico.
[000213] A cromatografia por exclusão de tamanho foi realizada com IFNa2b e PA#1(200)-IFNa2b em uma coluna Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare) em uma taxa de fluxo de 1 mL/min usando um sistema Purificador Ãkta 10 (GE Healthcare) similarmente como descrito no exemplo 6. Ambas as proteínas eluídas em um pico homogêneo único como mostrado na figura 4C.
[000214] Como resultado, a proteína de fusão com o polímero/polipeptídeo PA#1 de 200 resíduos exibiu um tamanho significativamente maior do que proteínas globulares correspondentes com o mesmo peso molecular (figura 4D). O aumento de tamanho aparente para PA#1(200)-IFNa2b foi de 10,2 vezes comparado com a proteína IFNa2b não fundida ao passo que a massa verdadeira foi somente maior por 1,8 vezes. Esta observação claramente indica um volume hidrodinâmico muito aumentado conferido ao interferon biologicamente ativo pelo polímero/polipeptídeo Pro/Ala de acordo com esta invenção. Exemplo 8: Detecção de conformação helicoidal randômica do polímero biossintético PA#1 fundido a um fragmento Fab através de espectroscopia de dicroísmo circular.
[000215] A estrutura secundária foi analisada usando um espectropolarímetro J-810 (Jasco, Groβ-Umstadt, Alemanha) equipado com uma cubeta de quartzo 106-QS (comprimento de caminho 0,1 mm; Hellma, Mullheim, Alemanha). Os espectros foram registrados de 190 a 250 nm à temperatura ambiente pelo acúmulo de 16 corridas (largura de banda 1 nm, velocidade de exame 100 nm/min, resposta 4 s) usando soluções proteicas de 3,12 a 15,4 μM obtidas do exemplo 4 em K2SO4 50 mM, K-fosfato 20 mM pH 7,5. Após correção para brancos de solução, os espectros foram suavizados usando o programa do instrumento, e a elipticidade molar θM foi calculada de acordo com a equação:
Figure img0006
pelo qual θobs denota a elipticidade medido, c, a concentração proteica [mol/l], d, o comprimento de caminho da cubeta de quartzo [cm]. Os valores de θM foram traçados contra o comprimento de onda usando Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA).
[000216] O espectro de dicroísmo circular (CD) medido do Fab recombinante estava de acordo com o enovelamento da imunoglobulina dominado por β-folha, ao passo que o espectro para a proteína de fusão Fab-PA#1(200) revelou uma contribuição significante da conformação helicoidal randômica (figura 5A). Para analisar a contribuição espectroscópica pelo segmento polipeptídico Pro/Ala em maiores detalhes, o espectro de CD de diferença molar com respeito ao fragmento Fab não fundido foi calculado (figura 5B) pela subtração do último espectro daquele para Fab-PA#1(200). Como resultado, um mínimo forte aproximadamente 200 nm, que é característico da conformação helicoidal randômica, foi observado. Dessa forma, a sequência Pro/Ala como parte da proteína de fusão recombinante parece estar presente como um polímero helicoidal randômico sob condições de tampões fisiológicos. Exemplo 9: Detecção de conformação helicoidal randômica para polímero geneticamente codificado PA#1 fundido a IFNa2b através de espectroscopia de dicroísmo circular.
[000217] A estrutura secundária foi analisada por medidas de CD de IFNa2b e PA#1(200)-IFNa2b (obtidos do exemplo 5) como descrito no exemplo 8 usando soluções proteicas de 3,6 a 38,7 μM. O espectro de PA#1(200)-IFNa2b revelou contribuições significantes da estrutura secundária α-helicoidal, indicativa do conhecido enovelamento do feixe a-hélice do interferon, bem como da conformação helicoidal randômica (figura 5C). Para analisar as contribuições espectroscópicas pelo parceiro de fusão de polímero Pro/Ala em maiores detalhes, o espectro de CD de diferença molar com respeito ao IFNa2b não fundido foi calculado pela subtração de dois espectros individuais (figura 5D). Como resultado, um mínimo forte característico de aproximadamente 200 nm de conformação helicoidal randômica foi observada. Dessa forma, o segmento polipeptídico Pro/Ala como parte da proteína de fusão recombinante parece estar presente como um polímero helicoidal randômico sob condições de tampões aquosos. Exemplo 10: Análise quantitativa da estrutura secundária do fragmento Fab, de IFNa2b e de suas fusões de polímero PA#1 de 200 resíduos.
[000218] O conteúdo de estrutura secundária do fragmento Fab, Fab-PA#1(200), IFNa2b, e PA#1(200)-IFNa2b foi individualmente quantificado dos espectros de CD correspondentes medidos nos exemplos 8 e 9 usando o programa de deconvolução de estrutura secundária CDNN ver. 2.1 (Bohm (1992) Protein Eng. 5:191-195) com o grupo de 33 espectros baseados da deconvolução de espectros de CD complexos. Os resultados desta análise são fornecidos na seguinte tabela:
Figure img0007
[000219] Comparado com conteúdo de estrutura secundária predominantemente de β-folha do fragmento Fab recombinante, que está de acordo com seu enovelamento de imunoglobulina conhecido (ver Eigenbrot (1993) J. Mol. Biol. 229:969-995), a fração da conformação não estruturada (compreendendo helicoidal randômica e β-deslocamento) claramente aumenta se o polímero PA#1 for fundido ao fragmento Fab. O espectro de CD de diferença do segmento polipeptídico Pro/Ala revela uma conformação helicoidal randômica clara. A análise da estrutura secundária mostra a presença de uma alta fração de conformações não estruturadas (compreendendo helicoidal randômica e β-deslocamento) que quase compreendem 100% da estrutura secundária total. Similarmente comparado com o conteúdo de estrutura secundária α-helicoidal predominantemente do IFNa2b recombinante, que está de acordo com sua estrutura tridimensional conhecida como proteína do feixe a-hélice (Radhakrishnan (1996) Structure 4:1453-1463), a fração da conformação não estruturada da proteína inteira claramente aumenta se o polímero PA#1 for fundido a IFNa2b. O espectro de CD de diferença do segmento polipeptídico Pro/Ala revela uma conformação helicoidal randômica clara. A análise da estrutura secundária mostra a presença de uma alta fração de conformações não estruturadas (compreendendo helicoidal randômica e β-deslocamento) que quase compreendem 100% da estrutura secundária total.
[000220] Resultados diferentes foram obtidos quando uma análise teórica da sequência de polímero PA#1 foi realizada usando o algoritmo de Chou-Fasman (Chou e Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245). Os resultados desta análise são ilustrados na figura 7. Este algoritmo prediz 100% da estrutura secundária α-helicoidal, que está em contraste claro com os dados experimentais. Dessa forma, este algoritmo não é útil para predizer confiantemente a conformação não estruturada de um polímero de aminoácido de acordo com a invenção. Exemplo 11: Construção de pASK75-His6-PA#1(200)-hGH como um vetor de expressão para uma proteína de fusão His6-PA#1(200)-hGH.
[000221] Para a construção de um plasmídeo de expressão que codifica hGH como fusão com uma repetição de sequência PA#1 de 200 resíduos, PA#1(200), pASK75-His6-hGH (SEQ ID NO: 41) (figura 6A) foi cortado com SapI, desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão, e ligado com o fragmento gênico que codifica o polipeptídeo PA#1 de 200 resíduos extirpado do plasmídeo anteriormente construído pFab-PA#1(200) (Exemplo 2) pela digestão de restrição com SapI (como exemplificado com a figura 6B, com somente um cassete de polímero/polipeptídeo PA#1 (20)). Após transformação de E. coli JM83 (Yanisch-Perron. (1985) loc. cit.), o plasmídeo foi preparado e a presença do inserto correto foi confirmada pela análise de restrição. O plasmídeo resultante foi designado pASK75-His6- PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 46) (figura 6C). Exemplo 12: Construção de um vetor de expressão para a produção secretória do hormônio de crescimento humano fundido com um polímero/polipeptídeo PA#1 de 200 resíduos em células de ovário de hamster chinês.
[000222] O vetor pASK75-His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 46), um derivado de pASK75 (Skerra (1994) loc. cit.), permitindo a produção procariótica da proteína de fusão hGH PA#1, foi cortado com NheI e HindIII. Este fragmento foi purificado através de eletroforese em gel de agarose e ligado com vetor de corte pCHO correspondente (SEQ ID NO: 50). Após transformação de E. coli XL1-Blue (Bullock (1987) loc. cit.), o plasmídeo foi preparado e a inserção correta do fragmento foi verificada através de análise de restrição. O plasmídeo resultante, que codifica o peptídeo sinal de hGH fundido ao marcador His6, um segmento polipeptídico PA#1(200), e o hormônio de crescimento humano (hGH), foi designado pCHO-PA#1(200) SEQ ID NO:-hGH 48) e é representado na figura 6D. Exemplo 13: Produção secretória de uma proteína de fusão entre hormônio de crescimento humano (hGH) e polímero geneticamente codificado PA#1 em células CHO.
[000223] Células CHO-K1 ATCC N. CCL-61 foram cultivadas no meio Quantum 263 (PAA Laboratories, Colbe, Alemanha) em uma placa de plástico de 100 mm até que confluência de 50% fosse alcançada. As células foram transfectadas com 8 μg de pCHO- PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 48) ou, para controle, pCHO-hGH (SEQ ID NO: 49), um plasmídeo similar que codifica hGH sem a sequência de PA#1(200), usando o Kit de Nanofectina (PAA Laboratories, Colbe, Alemanha). Após 6 h, meio de cultura celular foi trocado por 7 mL de meio Opti-MEM®-I de soro reduzido (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) e as células foram incubadas a 37°C em uma atmosfera umedecida com CO2 5%. Após dois dias, 20 μl do sobrenadante de cultura celular foi tomado e diluído com 5 μl de tampão de carregamento SDS-PAGE contendo β-mercaptoetanol. Após 5 min de aquecimento a 95°C, 15 μl de cada amostra foram submetidos a SDS-PAGE 12%. A seguir, eletrotransferência para uma membrana de nitrocelulose (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) por meio de um aparelho de blotting semiseco, a membrana foi lavada 3 vezes por 15 min com 10 mL de PBST (PBS contendo Tween 20 0,1% v/v). A membrana foi incubada com 10 mL de uma diluição 1:1000 do anticorpo de hormônio de crescimento humano anti ab1956 conjugado com peroxidase de rábano-silvestre (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Após incubação por 1 h e lavagem da membrana duas vezes por 5 min com 20 mL de PBST e duas vezes por 5 min com PBS, reação cromogênica foi realizada na presença de 15 mL de solução de 3,3-diaminobenzidina SIGMAFAST™ (Sigma-Aldrich Chemie, Munich, Alemanha). A reação foi parada lavando com água e secagem ao ar da membrana. O blot revelou sinais de ambas as amostras proteicas recombinantes (figura 6E), dessa forma comprovando produção secretória da proteína de fusão hGH com o polipeptídeo PA#1 em células CHO. Exemplo 14: Produção bacteriana e purificação de proteínas de fusão entre hGH e polímero/polipeptídeo geneticamente codificado PA#1.
[000224] Hormônio de crescimento humano (hGH) (massa calculada: 23,4 kDa), PA#1(200)-hGH (massa calculada: 39,6 kDa), PA#1 (400)- hGH (massa calculada: 55,8 kDa) e PA#1 (600)-hGH (massa calculada: 72,0 kDa) foram produzidos em E. coli KS272 que abriga os plasmídeos de expressão correspondentes do exemplo 11 ou seus derivados com um duplo (que codifica 400 resíduos) ou triplo (600 resíduos) cassete de sequência de PA#1, respectivamente. A produção bacteriana foi realizada a 22°C em culturas de frasco de agitador com 2 L de meio LB contendo glicose 2,5 g/L, prolina 0,5 g/L e ampicilina 100 mg/l. A indução da expressão gênica recombinante foi realizada pela adição de 0,4 mg de anidrotetraciclina em OD550 = 0,5 por 3 h. A extração periplasmática na presença de sacarose 500 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl100 mM pH 8,0 contendo lisozima 50 μg/mL foi realizada como descrito em outro lugar (Breustedt (2005) loc. cit.) e seguido por purificação através do marcador His6 usando coluna de afinidade de Alto Desempenho HisTrap (GE Healthcare) com Na- fosfato 40 mM pH 7,5, NaCl 0,5 M como tampão. As proteínas foram eluídas usando um gradiente de concentração de imidazol de 0 a 150 mM (dissolvidas no tampão de corrida e ajustado com HCl para pH 7,5) e ainda purificadas através de cromatografia por exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex 200-HR 10/30 (GE Healthcare) equilibrada com PBS (NaCl 115 mM, KH2PO4 4 mM, Na2HPO4 16 mM, pH 7,4).
[000225] Após cromatografia por exclusão de tamanho, as preparações proteicas homogêneas foram obtidas para todas as proteínas de fusão hGH recombinantes sem sinais da agregação e com rendimentos de 1 mg L-1 OD-1 para hGH, 0,3 mg l-1 OD-1 para PA#1(200)-hGH, 0,3 mg L-1 OD-1 para PA#1 (400)-hGH e 0,2 mg l-1 OD-1 para PA#1 (600)-hGH. SDS-PAGE foi realizado usando um sistema de tampão Tris de alta molaridade (Fling (1986) loc. cit.). As concentrações proteicas foram determinadas de acordo com a absorção em 280 nm usando coeficientes de extinção calculados (Gill (1989) loc. cit.) de 16050 M-1 cm-1 para hGH não fundido e todos suas fusões de polipeptídeo PA#1. Exemplo 15: Medida de afinidade de ligação de hormônio de crescimento humano e suas fusões de polímero PA#1 em direção ao domínio extracelular de receptor de hormônio de crescimento humano usando ressonância de plásmons de superfície.
[000226] A afinidade de hGH e suas fusões de polipeptídeo PA#1 por uma proteína de fusão de receptor de hormônio de crescimento humano - Fc (hGHR-Fc; R&D Systems) foi determinada através da ressonância de plásmons de superfície (SPR) medida em tempo real em um sistema Biacore 2000 (GE Healthcare). Em primeiro lugar, 15 μl de anticorpo de captura IgG anti-humana - Fc de camundongo (Jackson Immuno Research) em uma concentração de 100 μg/mL em Na-acetato 10 mM pH 5,0 foram imobilizados na superfície de dois canais de fluxo de um chip CMDP (XanTec bioanalytics) usando um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare). Isto resultou em aproximadamente 2700 unidades de resposta (RU). Após equilíbrio com PBS/T (PBS contendo Tween 20 0,05% (v/v)) como tampão de fluxo, um canal do chip foi carregado com 2 μg/mL de hGHR-Fc em uma taxa de fluxo de 5 μl/min até um sinal adicional de aproximadamente 300 RU foi alcançado. Então, 75 μl de hGH ou suas fusões de polipeptídeo PA#1 em PBS/T foram injetados em concentrações variadas e a associação e as fases de dissociação foram medidas sob fluxo contínuo de tampão de 20 μL/min. Para regeneração, três pulsos de 6 μl de glicina/HCl 10 mM pH 2,7 foram aplicados. Os sensogramas foram corrigidos pela subtração dupla dos sinais correspondentes medidos para o canal sem receptor imobilizado e uma base média determinada de várias injeções em brancos de tampões (Myszka (1999) Mol. Recognit. 12: 279-284). A avaliação de dados cinéticos foi realizada por um ajuste global dos traços de pelo menos sete injeções de amostra diferentes de acordo com o modelo de ligação de Langmuir 1:1 usando a versão 3.1 do programa BIAevaluation (GE Healthcare). Os valores obtidos de medidas de SPR das constantes de equilíbrio cinético e derivadas dos complexos entre hGH ou suas fusões PA#1 e o receptor de hormônio de crescimento humano são resumidos na seguinte tabela:
Figure img0008
[000227] Estes dados mostram que a fusão de hGH com polipeptídeos PA#1 de comprimentos diferentes não interfere significativamente na ligação de receptor. Todas as fusões de hGH polipeptídeo PA#1 conservam a atividade de ligação de receptor dentro de um fator 5 comparada ao hGH recombinante sem um polipeptídeo PA#1. Exemplo 16: Detecção de meia-vida plasmática prolongada in vivo das proteínas de fusão recombinantes entre um fragmento Fab e polímeros geneticamente codificados PA#1.
[000228] Camundongos BALB/c adultos (criação de SPF; TU München, Freising, Alemanha) foram injetados intravenosamente de acordo com a seguinte tabela:
Figure img0009
Figure img0010
[000229] O volume total do item de teste intravenosamente administrado foi calculado de acordo com o peso corporal individual (p.c.) registrado no dia da administração (por exemplo, um animal com peso corporal 20 g recebeu 100 μl de item de teste 1 mg/mL). A amostragem de sangue foi realizada de acordo com a seguinte tabela:
Figure img0011
[000230] Para cada substância (Item de teste) ao todo nove animais - divididos em três subgrupos 1-3 com cada um tendo três animais - foram injetados, cada um fornecendo quatro amostras em pontos de tempo diferentes. Amostras de sangue (aproximadamente 50 μl) foram tomadas da veia da cauda e armazenadas a 4°C por 30 min. Após centrifugação por 10 min em 10000 g e 4°C, o sobrenadante (plasma) foi imediatamente congelado e armazenado a -20°C.
[000231] Para detecção quantitativa da proteína de fusão Fab em um ELISA, os poços de uma placa de 96 poços de microtítulo (Maxisorb, NUNC, Dinamarca) foram recobertos durante a noite a 4°C com 50 μl de uma solução 10 μg/mL de antígeno de ectodomínio Her2/ErbB2 recombinante em NaHCO3 50 mM pH 9,6. Então, os poços foram bloqueados com 200 μl de BSA 3% (p/v) em PBS por 1 h e lavados três vezes com PBS/T (PBS contendo Tween 20 0,1% (v/v)). As amostras plasmáticas foram aplicadas em série de diluição em PBS/T contendo plasma 0,5% (v/v) de camundongo de um animal não tratado e incubadas por 1 h. Os poços então foram lavados três vezes com PBS/T e incubados por 1 h com 50 μl de uma solução diluída 1:1000 de um conjugado anticorpo anti-CK humano - fosfatase alcalina em PBS/T. Após lavar duas vezes com PBS/T e duas vezes com PBS, a reação cromogênica foi iniciada pela adição de 50 μl de fosfato de p- nitrofenila 0,5 μg/mL em Tris/HCl 100 mM pH 8,8, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM como substrato, e após 15 min a 25°C, a absorvância em 405 nm foi medida. As concentrações de Fab, Fab-PA#1(200), e Fab- PA#1 (600) nas amostras plasmáticas foram quantificadas pela comparação dos sinais medidos com curvas padrão que foram determinadas para a série de diluição das proteínas purificadas correspondentes em concentrações definidas em PBS/T contendo 0,5% (v/v) de plasma de camundongo de animais não tratados.
[000232] Para estimar a meia-vida plasmática de Fab, Fab- PA#1(200), e Fab-PA#1 (600), os valores de concentração, c (t), foram determinados para cada ponto de tempo das medidas de ELISA e traçadas contra o tempo pós-injeção intravenosa, t. Estes dados foram numericamente ajustados usando programa KaleidaGraph que assume um decaimento bi-exponencial de acordo com a equação
Figure img0012
na qual T“I/2 e TPI/2 são os valores de meia-vida da fase de distribuição α e a fase de eliminação β, respectivamente. co é a concentração de sangue total no ponto de tempo zero enquanto cα é a amplitude de concentração da fase de distribuição.
[000233] A figura 8 representa a farmacocinética dos três itens de teste em camundongos BALB/c. Enquanto Fab recombinante mostra uma depuração de sangue rápida com uma meia-vida de eliminação somente de aproximadamente 1,3 h, as proteínas de fusão Fab- PA#1(200) e Fab-PA#1 (600) têm uma meia-vida estendida mais do que 3 vezes e 29 vezes com valores correspondentes de aproximadamente 4,1 h e 38,8 h, respectivamente. Estes dados comprovam que a meia-vida de plasma in vivo de um fragmento de Fab é significativamente prolongada devido à fusão com um polímero/polipeptídeo Pro/Ala, pelo qual a meia-vida fica mais longa com o comprimento crescente do polímero de aminoácido. Exemplo 17: Síntese gênica para P1A1 e polímeros/polipeptídeos de aminoácido P1A3 e construção de pFab-P1A1 (200) e pFab-P1A3 (200) como vetores de expressão de proteínas de fusão Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200).
[000234] Os fragmentos gênicos que codificam uma sequência repetitiva de polímero compreendendo os polipeptídeos/polímeros Pro/Ala P1A1 (SEQ ID NO: 51) e P1A3, também designado PA#3, (SEQ ID NO: 3) foram obtidos pela hibridização de pares de oligodesoxinucleotídeos complementares, respectivamente, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 53 para P1A1 e SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55 para P1A3 como descrito no exemplo 1. PFab-P1A1 (200) (SEQ ID NO: 58) e pFab-P1A3 (200) (SEQ ID NO: 59) que codificam fragmentos Fab com os segmentos de polímeros/polipeptídeo Pro/Ala correspondentes de 200 resíduos no C-terminal da cadeia leve (LC) (sequência de aminoácidos de LC Fab-P1A1 (200): SEQ ID NO: 56; sequência de aminoácidos de LC Fab-P1A3 (200): SEQ ID NO: 57) foram construídos de uma maneira análoga a pFab-PA#1(200), que foi descrito no exemplo 2.
[000235] A seguir, as SEQ ID NOs: 56, 57, 58 e 59 também são reproduzidas. Entretanto, estas sequências também estão compreendidas na listagem de sequências acrescentada que é uma parte específica desta revelação e a descrição da presente invenção. SEQ ID NO: 56 Asp He Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Vai Asπ Thr Ala 20 25 30 Vai Ala Tro Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys leu. Leu lie 35 40 4 5 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Fhe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 7 0 7 5 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Elfl Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu .Lie l.ys Arg Thr Vai Ala Ala L00 105 ’-13 Fro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 U5 Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn PA-S Tyr Fro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ahi Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 ’ 1T0 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr C-lu Lys His Lys Vai Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser 195 200 205 Ph.e Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 210 ' 215 220 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Al a Pro Ala Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro 245 250 255 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 260 265 270 Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Pro ALa Pro Ala Pro Ala Pro 275 280 285 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 290 295 3Ú0 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Fro Ala Pro Ala Pro 305 310 315 320 Ahi Pro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Pro A", a Pro 325 330 335 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Fro Ala Pro 340 345 350 Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 355 360 365 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 370 375 380 Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 355 390 395 400 Ahi Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Fro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 405 41C 415 Al a SEQ ID NO: 57 Asp He Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg VaJ. Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Vai Asn Thr Ala 20 25 30 Vai Ala Tip Tyr Gin Gin Lys Pre Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 SO Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala 100 105 HO Pro Ser Vai Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pre Arg G’-u Ala J 30 135 140 Lys Vai Gin Iru Lys VaJ. Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Ris Lys Vai Tyr 190 1$5 190 Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser J 95 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 210 215 220 Ala Alá Ala Pro Ala Alá Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Ala Ala Ala Pro .Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 245 250 255 Ala Ala Al? Pro Al? A-a Al? Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 260 265 270 Ala Ala Ala Pro Ala a Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 275 2B0 2B5 .Ala Ala Ala Fro Ala Ala Ala Pre Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 290 295 200 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pre A.la Ala Ala Pre Ala Ala Ala Pro 305 310 315 320 Ala Ala Ala Pro .Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 325 330 335 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 340 345 350 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 355 360 3 65 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pre Ala Ala Ala Fro Ala Ala Ala Pro 370 375 380 A: a Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala, Pro 385 390 395 400 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 405 410 415 A1 a SEQ ID NO: 58 acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt 60 gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac 120 aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac 180 tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaact gcaggaatcc ggtggtggtc 240 tggttcagcc aggtggttcc ctgcggctct cgtgtgctgc ttccggtttc aacatcaaag 300 acacctacat ccactgggtt cgtcaggctc cgggtaaagg cctggaatgg gttgctcgta 360 tctacccgac caacggttac accaggtatg ccgattcagt taaaggtcgt ttcaccatct 420 cggccgacac ttccaaaaac accgcttacc tccagatgaa ctccctgcgt gctgaagaca 480 cagctgttta ttattgctcc cgttggggtg gtgacggttt ctacgctatg gactactggg 540 gtcagggtac cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 600 tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 660 actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720 acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780 tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840 acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900 aaccatggag tttacccctg tccgttggcg gcgtggtatc ctgtattccg acgatatcct accccgccga tctgtcttca tgcctgctga ctccaatcgg agcctcagca tgcgaagtca tgctcttctg cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cgacattttt gcggcgcatt gcgccctagc ttccccgtca acctcgaccc agacggtttt aaactggaac cgatttcggc acaaaatatt ctatttgttt gataaatgct cccttattcc tgaaagtaaa tcaacagcgg cttttaaagt tcggtcgccg agcatcttac ataacactgc ttttgcacaa aagccatacc gcaaactatt tggaggcgga aaaataaagt tgacaaaagc accgtgttac agcagaaacc gagttccgag ccctccagcc ccttcggtca tcttcccgcc ataacttcta gtaactccca gcaccctgac cccatcaggg cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cccctgctcc cctgaagagc tttgtctgcc aagcgcggcg gcccgctcct agctctaaat caaaaaactt tcgccctttg aacactcaac ctattggtta aacgtttaca atttttctaa tcaataatat cttttttgcg agatgctgaa taagatcctt tctgctatgt catacactat ggatggcatg ggccaactta catgggggat aaacgacgag aactggcgaa taaagttgca gaaacaaagc cgacatcgag catcacgtgt cgggaaagct caggttcagt ggaagacttc gggtaccaaa atctgatgag tcccagagag ggagagtgtc gctgagcaaa cctgagttcg tgctccagca tgctccagca tgctccagca tgctccagca tgctccagca tgctccagca tgctccagca tgctccagca tgctccagca tgctccagca ttaagcttga gtttaccgct ggtgtggtgg ttcgctttct cgggggctcc gattagggtg acgttggagt cctatctcgg aaaaatgagc atttcaggtg atacattcaa tgaaaaagga gcattttgcc gatcagttgg gagagttttc ggcgcggtat tctcagaatg acagtaagag cttctgacaa catgtaactc cgtgacacca ctacttactc ggaccacttc actattgcac ctcacccaat agggcctcgc ccgaaactgc ggttcccgtt gctacctact ctcgagatca cagttgaaat gccaaagtac acagagcagg gcagactacg cccgtcacaa cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgcaccag cctgtgaagt actgcgtcac ttacgcgcag tcccttcctt ctttagggtt atggttcacg ccacgttctt tctattcttt tgatttaaca gcacttttcg atatgtatcc agagtatgag ttcctgtttt gtgcacgagt gccccgaaga tatcccgtat acttggttga aattatgcag cgatcggagg gccttgatcg cgatgcctgt tagcttcccg tgcgctcggc tggcactctt ccccgtcctc aagacgtaaa tgatctatag ccggtaccga actgtcaaca aacggactgt ctggaactgc agtggaaggt acagcaagga agaaacacaa agagcttcaa cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc cacctgctcc gaaaaatggc ggatctccac cgtgaccgct tctcgccacg ccgatttagt tagtgggcca taatagtgga tgatttataa aaaatttaac gggaaatgtg gctcatgaga tattcaacat tgctcaccca gggttacatc acgttttcca tgacgccggg gtactcacca tgctgccata accgaaggag ttgggaaccg agcaatggca gcaacaattg ccttccggct accgttactg cctgtccgct caccgccgta cgcttccttc cttcaccctg gcactacacc ggctgcacca ctctgttgtg ggataacgcc cagcacctac agtctacgcc ccgcggagag agcaccagct agcaccagct agcaccagct agcaccagct agcaccagct agcaccagct agcaccagct agcaccagct agcaccagct agcaccagct gcacattgtg gcgccctgta acacttgcca ttcgccggct gctttacggc tcgccctgat ctcttgttcc gggattttgc gcgaatttta cgcggaaccc caataaccct ttccgtgtcg gaaacgctgg gaactggatc atgatgagca caagagcaac gtcacagaaa accatgagtg ctaaccgctt gagctgaatg acaacgttgc atagactgga ggctggttta ttgctgataa cagatggtaa atgaacgaaa taatgatgtc aggtcggaat ctacattgta tgttagatag tacgtaataa tacatttagg ttttatgcca attttacttt aaacacctac accaaggtgc aacaacttaa ttcactagtt cttaacgtga cttgagatcc cagcggtggt tcagcagagc tcaagaactc ctgccagtgg aggcgcagcg cctacaccga ggagaaaggc agcttccagg ttgagcgtcg acgcggcctt SEQ ID NO: acccgacacc gatagagtta aaaaatctag tggctggttt tggttcagcc acacctacat tctacccgac cggccgacac cagctgttta gtcagggtac tggcaccctc actacttccc acaccttccc tgccctccag acaccaaggt aaccatggag tttacccctg atctggagcc gccctcccgt tagacagatc tcgtttagat cgaaggttta ttggcatgta gcaccatact cgctaaaagt tacacggcct acaaggtttt aggttgcgta tactgatagt agagccagcc atgtgaaagt taaaaggatc gttttcgttc tttttttctg ttgtttgccg gcagatacca tgtagcaccg cgataagtcg gtcgggctga actgagatac ggacaggtat gggaaacgcc atttttgtga tttacggttc 59 atcgaatggc ttttaccact ataacgaggg cgctaccgta aggtggttcc ccactgggtt caacggttac ttccaaaaac ttattgctcc cctggtcacc ctccaagagc cgaaccggtg ggctgtccta cagcttgggc cgacaagaaa aaaataaagt tgacaaaagc ggtgagcgtg atcgtagtta gctgagatag aaaagtaaag acaacccgta aaaaataagc cacttttgcc tttagatgtg acagaaaaac tcactagaga ttggaagatc atgccgccat ttcttattcg gggtcttaaa taggtgaaga cactgagcgt cgcgtaatct gatcaagagc aatactgtcc cctacatacc tgtcttaccg acggggggtt ctacagcgtg ccggtaagcg tggtatcttt tgctcgtcag ctggcctttt cagatgatta ccctatcagt caaaaaatga gcgcaggccg ctgcggctct cgtcaggctc accaggtatg accgcttacc cgttggggtg gtctcctcag acctctgggg acggtgtcgt cagtcctcag acccagacct gttgagccca gaaacaaagc cgacatcgag gctctcgcgg tctacacgac gtgcctcact tgattaacag aactcgccca gggctttgct ctttagaagg ctttactaag agtatgaaac atgcattata aagagcatca tattacgaca gccttgaatt agcagcataa tcctttttga cagaccccgt gctgcttgca taccaactct ttctagtgta tcgctctgct ggttggactc cgtgcacaca agctatgaga gcagggtcgg atagtcctgt gggggcggag gctggccttt attcctaatt gatagagaaa aaaagacagc aagttaaact cgtgtgctgc cgggtaaagg ccgattcagt tccagatgaa gtgacggttt cctccaccaa gcacagcggc ggaactcagg gactctactc acatctgcaa aatcttgcca actattgcac ctcacccaat tatcattgca ggggagtcag gattaagcat cgcattagag gaagctaggt cgacgcctta ggaaagctgg tcatcgcgat tctcgaaaat tgcactcagc agtcgctaaa agctatcgaa gatcatatgc cctttttccg taatctcatg agaaaagatc aacaaaaaaa ttttccgaag gccgtagtta aatcctgtta aagacgatag gcccagcttg aagcgccacg 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aaactggaac cgatttcggc acaaaatatt ctatttgttt gataaatgct cccttattcc tgaaagtaaa tcaacagcgg cttttaaagt tcggtcgccg agcatcttac ataacactgc ttttgcacaa aagccatacc gcaaactatt tggaggcgga ttgctgataa cagatggtaa accgtgttac agcagaaacc gagttccgag ccctccagcc ccttcggtca tcttcccgcc ataacttcta gtaactccca gcaccctgac cccatcaggg ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc ccgctgcacc cctgaagagc tttgtctgcc aagcgcggcg gcccgctcct agctctaaat caaaaaactt tcgccctttg aacactcaac ctattggtta aacgtttaca atttttctaa tcaataatat cttttttgcg agatgctgaa taagatcctt tctgctatgt catacactat ggatggcatg ggccaactta catgggggat aaacgacgag aactggcgaa taaagttgca atctggagcc gccctcccgt catcacgtgt cgggaaagct caggttcagt ggaagacttc gggtaccaaa atctgatgag tcccagagag ggagagtgtc gctgagcaaa cctgagttcg tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca tgctgcagca ttaagcttga gtttaccgct ggtgtggtgg ttcgctttct cgggggctcc gattagggtg acgttggagt cctatctcgg aaaaatgagc atttcaggtg atacattcaa tgaaaaagga gcattttgcc gatcagttgg gagagttttc ggcgcggtat tctcagaatg acagtaagag cttctgacaa catgtaactc cgtgacacca ctacttactc ggaccacttc ggtgagcgtg atcgtagtta agggcctcgc ccgaaactgc ggttcccgtt gctacctact ctcgagatca cagttgaaat gccaaagtac acagagcagg gcagactacg cccgtcacaa cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgctgcag cctgtgaagt actgcgtcac ttacgcgcag tcccttcctt ctttagggtt atggttcacg ccacgttctt tctattcttt tgatttaaca gcacttttcg atatgtatcc agagtatgag ttcctgtttt gtgcacgagt gccccgaaga tatcccgtat acttggttga aattatgcag cgatcggagg gccttgatcg cgatgcctgt tagcttcccg tgcgctcggc gctctcgcgg tctacacgac aagacgtaaa tgatctatag ccggtaccga actgtcaaca aacggactgt ctggaactgc agtggaaggt acagcaagga agaaacacaa agagcttcaa ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc ctccagcagc gaaaaatggc ggatctccac cgtgaccgct tctcgccacg ccgatttagt tagtgggcca taatagtgga tgatttataa aaaatttaac gggaaatgtg gctcatgaga tattcaacat tgctcaccca gggttacatc acgttttcca tgacgccggg gtactcacca tgctgccata accgaaggag ttgggaaccg agcaatggca gcaacaattg ccttccggct tatcattgca ggggagtcag caccgccgta cgcttccttc cttcaccctg gcactacacc ggctgcacca ctctgttgtg ggataacgcc cagcacctac agtctacgcc ccgcggagag tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca tgctcctgca gcacattgtg gcgccctgta acacttgcca ttcgccggct gctttacggc tcgccctgat ctcttgttcc gggattttgc gcgaatttta cgcggaaccc caataaccct ttccgtgtcg gaaacgctgg gaactggatc atgatgagca caagagcaac gtcacagaaa accatgagtg ctaaccgctt gagctgaatg acaacgttgc atagactgga ggctggttta gcactggggc gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat 3780 taatgatgtc tcgtttagat aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg 3840 aggtcggaat cgaaggttta acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc 3900 ctacattgta ttggcatgta aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga 3960 tgttagatag gcaccatact cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt 4020 tacgtaataa cgctaaaagt tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag 4080 tacatttagg tacacggcct acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct 4140 ttttatgcca acaaggtttt tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc 4200 attttacttt aggttgcgta ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg 4260 aaacacctac tactgatagt atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc 4320 accaaggtgc agagccagcc ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa 4380 aacaacttaa atgtgaaagt gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac 4440 ttcactagtt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4500 cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4560 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4620 cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4680 tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4740 tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4800 ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4860 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4920 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4980 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 5040 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 5100 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 5160 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 5210 Exemplo 18: Medida do volume hidrodinâmico da proteína de fusão recombinante entre um fragmento Fab e um polipeptídeo/polímero geneticamente codificado P1A1 ou P1A3 por filtração em gel analítico.
[000236] SEC foi realizado em uma coluna Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare Europe, Freiburg, Alemanha) em uma taxa de fluxo de 1 mL/min usando um sistema Purificador Ãkta 10 (GE Healthcare) com PBS como tampão de corrida. Amostras de 250 μl de proteínas de fusão Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200), que foram similarmente produzidas e purificadas (figura 9) como descrito para Fab-PA#1(200) no exemplo 4, foram individualmente aplicadas em uma concentração de 0,25 mg/mL em PBS. Ambas as proteínas eluídas em um pico homogêneo único como mostrado na figura 10.
[000237] Como resultado, as proteínas de fusão com polímeros/polipeptídeos P1A1 ou P1A3 de 200 resíduos exibiram tamanhos significativamente maiores do que o correspondente fragmento Fab não fundido. O aumento de tamanho aparente de Fab- P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200) foi de 5,8 vezes e de 5,2 vezes, respectivamente, comparado com o fragmento Fab (cf. figura 4B) ao passo que a massa verdadeira foi somente maior por 1,4 vezes e 1,3 vezes. Esta observação claramente indica um volume hidrodinâmico muito aumentado conferido ao fragmento Fab biologicamente ativo pelos segmentos de polipeptídeos biossintéticos P1A1 e P1A3 de acordo com esta invenção. Exemplo 19: Detecção de conformação helicoidal randômica de polímeros/polipeptídeos biossintéticos P1A1 e P1A3 fundidos a um fragmento Fab através de espectroscopia de dicroísmo circular (CD).
[000238] Os espectros de CD de Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200) foram registrados como descrito no exemplo 8 usando soluções proteicas 4,2 e 6,5 μM, respectivamente, preparadas similarmente como descrito no exemplo 4 usando K2SO4 50 mM, K-fosfato 20 mM pH 7,5 como tampão.
[000239] Os espectros de proteínas de fusão Fab-P1A1 (200) e Fab- P1A3 (200) revelaram uma fração significante da conformação helicoidal randômica (figura 11A). Para analisar a contribuição espectroscópica pelo segmento polipeptídico Pro/Ala em maiores detalhes, o espectro de CD de diferença molar com respeito ao fragmento Fab não fundido (ver o exemplo 8) foi calculado (figura 11B) subtraindo o último espectro daquele de Fab-P1A1 (200) e Fab-P1A3 (200), respectivamente, após normalização à mesma concentração molar. Como resultado, um mínimo forte em um comprimento de onda de aproximadamente 200 nm, que é característico da conformação helicoidal randômica, foi observado. Dessa forma, as sequências de P1A1 e P1A3 como parte da proteína de fusão recombinante parecem estar presentes na conformação helicoidal randômica sob condições de tampão fisiológico. Exemplo 20: Construção de pSUMO-PA#1(200) como vetor de expressão para uma proteína de fusão His(6)-SUMO-PA#1(200).
[000240] Para a construção de um plasmídeo de expressão que codifica um marcador His de seis resíduos e a pequena proteína modificadora similar à ubiquitina (SUMO) (Panavas (2009) Methods Mol. Biol. 497: 303-17) fundidos a uma repetição de sequência PA#1 de 200 resíduos, a proteína SUMO) de Saccharomyces cerevisiae [também conhecido como Smt3p; Uniprot: Q12306] foi amplificado através de reação de polimerase em cadeia (PCR) de um cDNA clonado. O iniciador 5’ introduziu um sítio de restrição NdeI, contendo um códon de partida Met (ATG) e um códon Lys adicional, bem como a sequência de codificação do marcador His6 enquanto o iniciador 3’ introduziu um sítio de restrição HindIII e SapI no produto de PCR. O fragmento de DNA resultante foi digerido com NdeI e HindIII e ligado com um derivado digerido correspondente do plasmídeo pSA1 (Schmidt (1994) J. Chromatogr. 676: 337-345), em que o sítio de restrição SapI tinha sido eliminado por mutação silenciosa. O plasmídeo resultante foi cortado com SapI, desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão, e ligado com o fragmento gênico que codifica o segmento polipeptídico PA#1 de 200 resíduos extirpado do plasmídeo pFab-PA#1(200) (descrito no exemplo 2) pela digestão de restrição com SapI (de um modo análogo como exemplificado com a figura 2E). O plasmídeo resultante foi designado pSUMO-PA#1(200) (SEQ ID NO: 60) e é representado na figura 12A. Exemplo 21: Expressão bacteriana e isolamento de polímero/polipeptídeo geneticamente codificado PA#1(200).
[000241] O polipeptídeo PA#1(200) (massa calculada: 16,1 kDa) foi inicialmente produzido como proteína de fusão com a pequena proteína modificadora similar à ubiquitina (SUMO) (massa calculada: 12,2 kDa) no citoplasma de E. coli BLR (DE3) (NEB, Ipswich, MA, EUA) abrigando o plasmídeo de expressão pSUMO-PA#1(200) (descrito no exemplo 21) em conjunto com o plasmídeo pLysE (Studier (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44), que suprime o promotor T7. A produção bacteriana foi realizada a 30°C em culturas de frasco de agitação com 2 L de meio LB contendo D-glicose 2,5 g/L, L-prolina 0,5 g/L, ampicilina 100 mg/l, e cloranfenicol 30 mg/l. A expressão gênica recombinante foi induzida pela adição de isopropil-β-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 0,5 mM. As bactérias foram coletadas 3 h após indução, ressuspensas em NaCl 100 mM, Na-fosfato 40 mM pH 7,5 e lisadas usando uma célula de pressão francesa (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Após centrifugação (15 min, 15000 g) do lisado nenhum corpo de inclusão foi observado.
[000242] O sobrenadante contendo proteína de fusão solúvel foi incubado a 70°C por 15 min e centrifugado (15 min, 15000 g) para remover proteínas termicamente instáveis da célula hospedeira. A proteína de fusão His(6)-SUMO-PA#1(200) foi purificada do sobrenadante através de IMAC (Skerra (1994) Gene 141: 79-84) usando uma coluna HisTrap de alto desempenho carregada com 12 mL de NÍ2+ (GE Healthcare) unido a um sistema de purificador Ãkta (GE Healthcare) e eluída com um gradiente de imidazol de 0 a 150 mM em NaCl 500 mM, Na-fosfato 40 mM pH 7,5. Após uma etapa de SEC preparativa subsequente, uma preparação homogênea da proteína de fusão His(6)-SUMO-PA#1(200) (figura 12B) com um rendimento de aproximadamente 5 mg por 1 L de cultura bacteriana com OD550 = 1 foi obtida. A concentração proteica foi determinada de acordo com a absorção em 280 nm usando um coeficiente de extinção calculado (Gill (1989) loc. cit) de 1280 m-1 cm-1 para a fusão do polipeptídeo His(6)-SUMO-PA#1(200). Observar que o segmento polipeptídico PA#1(200) não contribui para a absorção em 280 nm devido à sua falta de cadeias laterais de aminoácido aromático ou contendo enxofre.
[000243] O polipeptídeo biossintético PA#1(200) foi liberado da proteína de fusão pelo sítio de clivagem proteolítica específico (a jusante de um motivo Gly-Gly que precede o segmento polipeptídico Pro/Ala) com protease 1 Ubl-específica 2 U/mg de Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por 1 h a 30°C no tampão de clivagem (Igepal 0,2% p/v, DTT 1 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0). O processo de clivagem foi verificado por SDS-PAGE (figura 12B) usando um sistema de tampão Tris de alta molaridade (Fling (1986) Anal. Biochem. 155: 83-88). A fim de remover a proteína clivada His(6)-SUMO, a proteína de fusão não clivada residual, e também a protease SUMO, todos carregando o marcador His6, a mistura de reação foi submetida a outro IMAC usando uma coluna de alto desempenho HisTrap carregada com 5 mL de Ni2+ (GE Healthcare) e NaCl 500 M, fosfato 20 mM, pH 7,5 como tampão de corrida. Este tempo, o eluído continha o polipeptídeo biossintético puro PA#1(200) (figura 13 E). Observar que o polipeptídeo/polímero biossintético PA#1(200) (SEQ ID NO: 61) preparado desta maneira compreende ao todo 201 resíduos de aminoácidos, que resultam do produto gênico combinado codificado de 10 blocos de construção de oligodesoxinucleotídeo de fita dupla ligados, cada um codificando 20 resíduos de aminoácidos, como mostrado na figura 1, e um resíduo Ala adicional codificado pela protuberância de DNA de tripleto do sítio de restrição SapI a jusante que foi usado para a clonagem. Exemplo 22: Preparação e caracterização de conjugados de pequena molécula/fármaco com PA#1(200).
[000244] A mistura de reação de clivagem proteolítica não purificada da proteína de fusão His(6)-SUMO-PA#1(200) do exemplo 21 foi duas vezes dialisada a 4°C contra NaHCO3 50 mM pH 8,3 e incubada à temperatura ambiente por 1 h após misturar com excesso molar de 10 vezes de uma solução de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 6- [fluoresceína-5(6)-carboxamido] hexanoico (éster de Fluoresceína- NHS; Sigma-Aldrich) em dimetilformamida seca (DMF). Para este fim, 200 μl de uma solução 2,5 mg/mL da mistura de clivagem His(6)- SUMO-PA#1(200) foi adicionada a 17,6 μl de uma solução 10 mM do éster de Fluoresceína-NHS dissolvida em DMF. A mistura resultante foi incubada à temperatura ambiente por 1 h e aplicada a IMAC como descrito no exemplo 21 para remover a proteína clivada His(6)-SUMO, proteína de fusão não clivada residual, e protease SUMO e ainda purificada por SEC preparativo em uma coluna Superdex S200 10/300 GL equilibrada com PBS em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.
[000245] As amostras das etapas diferentes então foram analisadas via SEC analítica em uma coluna Superdex S200 10/300 GL equilibrada com PBS em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. A proteína SUMO foi detectada através de suas cadeias laterais aromáticas em 280 nm e as ligações peptídicas, incluindo aquelas do polipeptídeo ou segmento polipeptídico Pro/Ala, foram detectadas em 225 nm enquanto fluoresceína foi detectada em 494 nm (figura 13 A-G). Para comparação, os espectros de UV/VIS de uma solução da fluoresceína livre (Sigma-Aldrich) e de frações de cada pico distinto detectado no SEC foram medidos usando um instrumento Lambda 9 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) (figura 13 H-K). Para calibração do tamanho da coluna de cromatografia (figura 13 L), 250 μl de uma mistura apropriada das seguintes proteínas globulares (Sigma-Aldrich) foram aplicados em PBS em concentrações entre 0,2 e 0,5 mg/mL: aprotinina, 6,5 kDa; citocromo c, 12,4 kDa; anidrase carbônica, 29,0 kDa; albumina sérica bovina, 66,3 kDa; álcool desidrogenase, 150 kDa; β-amilase, 200 kDa; apoferritina, 440 kDa.
[000246] Como resultado, após acoplamento do polipeptídeo/polímero biossintético PA#1(200) com éster de Fluoresceína-NHS, um conjugado macromolecular foi isolado através de IMAC e SEC que essencialmente exibe as propriedades de tamanho do polipeptídeo/polímero PA#1(200) e a assinatura espectroscópica da pequena molécula, isto é, o grupo de fluoresceína. Isto demonstra que a pequena molécula foi acoplada com sucesso ao polipeptídeo/polímero Pro/Ala biossintético, que de acordo com esta invenção dramaticamente aumenta o volume hidrodinâmico da pequena molécula de fármaco conjugado ou composto.
[000247] Para preparar um conjugado similar entre o polipeptídeo/polímero Pro/Ala biossintético e o esteroide vegetal digoxigenina, 0,1 mg do polipeptídeo purificado PA#1(200) do exemplo 21 foi dialisado contra NaHCO3 50 mM pH 8,3 como descrito acima. A concentração do polipeptídeo purificado PA#1(200) foi determinada de acordo com a absorção em 205 nm (Gill (1989) loc. cit). O polipeptídeo PA#1(200) foi acoplado com excesso molar de 10 vezes de éster de NHS de ácido digoxigenina-3-O-metilcarbonil-ε-aminocaproico (éster DIG-NHS; Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Para este fim, 100 μl de uma solução 1 mg/mL do polipeptídeo purificado PA#1(200) em NaHCO3 50 mM pH 8,3 foi adicionado a 2 μl de uma solução de éster DIG-NHS 30 mM dissolvido em DMF seco e a mistura de reação foi incubada por 1 h à temperatura ambiente. A solução resultante do conjugado foi purificada usando uma coluna de dessalinização por rotação Zeba™ com um corte de 7 kDa (Thermo Scientific), duas vezes dialisada contra o tampão acetato de amônio 10 mM pH 6,8 e analisada através de espectrometria de massa ESI em um instrumento Q-Tof Ultima (Waters, Eschbronn, Alemanha) usando o modo iônico positivo. Como resultado, o espectro do conjugado Digoxigenina- PA#1(200) revelou uma massa de 16671,4 Da, que essencialmente coincide com a massa calculada de 16670,6 Da (figura 13M). Isto claramente demonstra que um polipeptídeo/polímero Pro/Ala biossintético, em particular PA#1(200), pode ser eficientemente conjugado com uma pequena molécula de fármaco.
[000248] A presente invenção se refere a e se refere às seguintes sequências exemplificadas, pelo qual a listagem de sequência acrescentada é apresentada como parte da descrição e é, consequentemente, uma parte deste relatório descritivo.
[000249] A SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de aminoácidos de PA#1.
[000250] A SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos de PA#2.
[000251] A SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de aminoácidos de PA#3.
[000252] A SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácidos de PA#4.
[000253] A SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de aminoácidos de PA#5.
[000254] A SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácidos de PA#6.
[000255] A SEQ ID NO: 7 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1
[000256] A SEQ ID NO: 8 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000257] A SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000258] A SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000259] A SEQ ID NO: 11 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000260] A SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000261] A SEQ ID NO: 13 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000262] A SEQ ID NO: 14 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000263] A SEQ ID NO: 15 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000264] A SEQ ID NO: 16 mostra uma sequência de aminoácidos de uma versão circular permutada da SEQ ID NO: 1.
[000265] A SEQ ID NO: 17 mostra uma sequência de ácidos nucleicos do oligodesoxinucleotídeo de fita superior/codificante usada para a geração do bloco de construção PA#1.
[000266] A SEQ ID NO: 18 mostra uma sequência de ácidos nucleicos do oligodesoxinucleotídeo de fita inferior/não codificante usada para a geração do bloco de construção para PA#1.
[000267] A SEQ ID NO: 19 mostra um estiramento de sequência de ácidos nucleicos (fita superior/codificante) em volta do C-terminal da cadeia leve de imunoglobulina de um fragmento Fab de anticorpo como codificado em pASK88-Fab-2xSapI.
[000268] A SEQ ID NO: 20 mostra um estiramento de sequência de ácidos nucleicos (fita inferior/não codificante) em volta do C-terminal da cadeia leve de imunoglobulina de um fragmento Fab de anticorpo como codificado em pASK88-Fab-2xSapI.
[000269] A SEQ ID NO: 21 mostra uma sequência de aminoácidos do C-terminal da cadeia leve do fragmento Fab como codificado em pASK88-Fab-2xSapI.
[000270] A SEQ ID NO: 22 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pASK88-Fab-2xSapI.
[000271] A SEQ ID NO: 23 mostra um estiramento da sequência de ácidos nucleicos (fita superior/codificante) que codifica sequência de aminoácidos do C-terminal da cadeia leve de Fab após inserção de um polímero PA#1 (20).
[000272] A SEQ ID NO: 24 mostra uma sequência de ácidos nucleicos (fita inferior/não codificante) para um estiramento de aminoácidos do C-terminal de uma cadeia leve de Fab após inserção de um polímero PA#1 (20).
[000273] A SEQ ID NO: 25 mostra um estiramento de sequência de aminoácidos do C-terminal de uma cadeia leve de Fab após inserção de um polímero PA#1 (20).
[000274] A SEQ ID NO: 26 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de Fab como codificado em pFab-PA#1(200).
[000275] A SEQ ID NO: 27 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia leve Fab fundida com o polímero PA#1(200) como codificado em pFab-PA#1(200).
[000276] A SEQ ID NO: 28 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pFab-PA#1(200).
[000277] A SEQ ID NO: 29 mostra a sequência de ácidos nucleicos (fita superior/codificante) que codifica a sequência de aminoácidos do N-terminal de INFa2b e marcador Strep II (somente os últimos dois aminoácidos).
[000278] A SEQ ID NO: 30 mostra uma sequência de ácidos nucleicos (fita inferior/não codificante) que codifica a sequência de aminoácidos do N-terminal de INFa2b e marcador Strep II (somente os últimos dois aminoácidos).
[000279] A SEQ ID NO: 31 mostra a sequência de aminoácidos do C-terminal do marcador Strep II e o N-terminal de INFa2b.
[000280] A SEQ ID NO: 32 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pASK-IFNa2b.
[000281] A SEQ ID NO: 33 mostra um estiramento de sequência de ácidos nucleicos (fita superior/codificante) que codifica o C-terminal do marcador Strep II e o N-terminal de IFNa2b após inserção de um cassete de sequência de polímero PA#1.
[000282] A SEQ ID NO: 34 mostra um estiramento de sequência de ácidos nucleicos (fita inferior/não codificante) do C-terminal do marcador Strep II e o N-terminal de IFNa2b após inserção de um cassete de sequência de polímero PA#1.
[000283] A SEQ ID NO: 35 mostra um estiramento de sequência de aminoácidos do C-terminal do marcador Strep II e o N-terminal de IFNa2b após fusão com um cassete de polímero PA#1.
[000284] A SEQ ID NO: 36 mostra a sequência de aminoácidos de IFNa2b e marcador Strep II fundido com o polímero PA#1(200) como codificado em pPA#1(200)-IFNa2b.
[000285] A SEQ ID NO: 37 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pPA#1(200)-IFNa2b.
[000286] A SEQ ID NO: 38 mostra um estiramento de sequência de ácidos nucleicos (fita superior/codificante) em pASK75-His6-hGH que codifica a sequência de aminoácidos em torno do N-terminal de His6- hGH.
[000287] A SEQ ID NO: 39 mostra um estiramento de sequência de ácidos nucleicos (fita inferior/não codificante) em pASK75-His6-hGH que codifica a sequência de aminoácidos em torno do N-terminal de hGH.
[000288] A SEQ ID NO: 40 mostra um estiramento de sequência de aminoácidos do N-terminal de His6-hGH como codificado em pASK75- His6-hGH.
[000289] A SEQ ID NO: 41 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pASK75-His6-hGH.
[000290] A SEQ ID NO: 42 mostra um estiramento da sequência de ácidos nucleicos (fita superior/codificante) que codifica sequência de aminoácidos do N-terminal de His6-hGH após inserção do polímero PA#1 (20).
[000291] A SEQ ID NO: 43 mostra uma sequência de ácidos nucleicos (fita inferior/não codificante) que codifica o N-terminal de hGH após inserção de um cassete de sequência de polímero PA#1.
[000292] A SEQ ID NO: 44 mostra a sequência de aminoácidos do N-terminal de His6-hGH após inserção do polímero PA#1 (20).
[000293] A SEQ ID NO: 45 mostra a sequência de aminoácidos de His6-PA#1(200)-hGH maduro como codificado em pASK75-His6- PA#1(200)-hGH.
[000294] A SEQ ID NO: 46 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pASK75-His6-PA#1(200)-hGH.
[000295] A SEQ ID NO: 47 mostra a sequência de aminoácidos de His6-PA#1(200)-hGH como codificado em pCHO-PA#1(200)-hGH.
[000296] A SEQ ID NO: 48 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pCHO-PA#1(200)-hGH.
[000297] A SEQ ID NO: 49 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pCHO-hGH.
[000298] A SEQ ID NO: 50 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pCHO.
[000299] A SEQ ID NO: 51 mostra a sequência de aminoácidos de P1A1.
[000300] A SEQ ID NO: 52 mostra a sequência de ácidos nucleicos de fita superior/codificante do oligodesoxinucleotídeo usado para a geração do bloco de construção para P1A1.
[000301] A SEQ ID NO: 53 mostra a sequência de ácidos nucleicos de fita inferior/não codificante do oligodesoxinucleotídeo usado para a geração do bloco de construção para P1A1.
[000302] A SEQ ID NO: 54 mostra a sequência de ácidos nucleicos de fita superior/codificante oligodesoxinucleotídeo usado para a geração do bloco de construção para P1A3.
[000303] A SEQ ID NO: 55 mostra a sequência de ácidos nucleicos da fita inferior/não codificante do oligodesoxinucleotídeo usado para a geração do bloco de construção para P1A3.
[000304] A SEQ ID NO: 56 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia leve de Fab fundida com o polímero P1A1 (200) como codificado em pFab-P1A1 (200).
[000305] A SEQ ID NO: 57 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia leve de Fab fundida com o polímero P1A3 (200) como codificado em pFab-P1A3 (200).
[000306] A SEQ ID NO: 58 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pFab-P1A1 (200).
[000307] A SEQ ID NO: 59 mostra a sequência de ácidos de pFab- P1A3 (200).
[000308] A SEQ ID NO: 60 mostra a sequência de ácidos nucleicos de pSUMO-PA#1(200).
[000309] A SEQ ID NO: 61 mostra o polipeptídeo/polímero PA#1(200) usado para a preparação de conjugados de fármaco (feito por ligação de 10 20mer que codifica cassetes gênicos, incluindo um resíduo Ala C-terminal adicional resultando do sítio de ligação a jusante.

Claims (6)

1. Conjugado de fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo somente de resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), em que o dito polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3); AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5); AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6); e APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51); e (ii) um fármaco que é uma proteína biologicamente ativa ou um polipeptídeo que compreende ou é uma sequência de aminoácidos que tem ou medeia uma atividade biológica, em que a referida proteína biologicamente ativa ou o referido polipeptídeo que compreende ou que é uma sequência de aminoácidos que tem ou que medeia uma atividade biológica é selecionado a partir do grupo que consiste em proteínas de ligação, fragmentos de anticorpos, citocinas, fatores de crescimento, hormônios ou enzimas.
2. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos consistindo em aproximadamente 50 a aproximadamente 3000 resíduos de aminoácidos.
3. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os ditos resíduos prolina constituem mais de aproximadamente 10% e menos de aproximadamente 75% da sequência de aminoácidos.
4. Conjugado de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico medeia uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro do dito conjugado de fármaco.
5. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita estabilidade aumentada in vivo é uma meia-vida plasmática prolongada do dito conjugado de fármaco que compreende o dito polipeptídeo helicoidal randômico biossintético ou segmento polipeptídico compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste somente em resíduos de aminoácidos prolina e alanina, em que a dita sequência de aminoácidos consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos prolina (Pro) e alanina (Ala), quando comparada com a estabilidade de um polipeptídeo controle ou um conjugado controle sem o dito polipeptídeo helicoidal randômico ou segmento de polipeptídeo.
6. Composição farmacêutica ou diagnóstica, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado de fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
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