ES2673548T3 - Organismos modificados genéticamente para la producción de lípidos - Google Patents
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Abstract
Organismo no mamifero aislado geneticamente modificado, seleccionado de Saccharomyces and Candida, donde la actividad de ambos paralogos ARE1 y ARE2 de acil-CoA:sterol aciltransferasa/esterol O-aciltransferasa (EC 2.3.1.26) se reduce o se elimina en comparacion con un organismo de tipo salvaje correspondiente y donde la actividad de HMG-CoA-reductasa (EC 1.1.1.34) aumenta en comparacion con el organismo de tipo salvaje correspondiente, donde el aumento en la actividad de HMG-CoA-reductasa se consigue bien por la expresion en el organismo de un gen de HMG-CoA-reductasa, que codifica solo el area catalitica de la enzima pero no codifica el dominio unido a la membrana o la colocacion de la HMG-CoA-reductasa en el organismo bajo el control de un promotor heterologo.
Description
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DESCRIPCIÓN
Organismos modificados genéticamente para la producción de lípidos Campo de la invención
[0001] La invención se dirige a organismos no mamíferos modificados genéticamente, en particular, microorganismos donde determinadas actividades enzimáticas disminuyen y/o aumentan, las cuales son útiles en la biosíntesis industrial de lípidos, en particular, lípidos neutrales.
La invención se refiere además a un uso de tales organismos.
[0002] Antecedentes de la invención y estado de la técnica
[0003] Los lípidos son hidrofóbicos o moléculas pequeñas amfipáticas que originan totalmente o en parte por condensaciones basadas en carbanión de tioésteres como ácidos grasos o policétidos y/o por condensaciones basadas en carbocación de unidades de isopreno como prenoles o esteroles.
Este grupo comprende diferentes sustancias de alta importancia económica.
El grupo de los lípidos de triacilglicerol comprende, por ejemplo, aceites, grasas o ceras, que se usan en una variedad grande de contextos, por ejemplo como ingredientes en alimentos o para la cocción, para hacer jabones, productos de piel, perfumes y otros cuidados personales y productos cosméticos, para hacer pinturas y otros productos de tratamiento de madera, como aislantes biodegradables en la industria eléctrica, para producir fluidos hidráulicos biodegradables, como lubricantes o incluso como la base de biodíesel, que se puede usar para sustituir díesel convencional.
El escualeno de lípido isoprenoide, por ejemplo, se usa como un adyuvante en vacunas u otros fármacos, nutrientes, cosméticos al igual que fármacos de sobre el contador.
El escualeno también se puede usar como un bloque de construcción para la síntesis de terpenos.
Además, el escualeno puede industrialmente usarse como lubricante biodegradable.
Otros lípidos importantes económicamente son esteroles como ergosterol, zimosterol, epiesterol, 7- dehidrocolesterol o lanosterol, que se utilizan como materia prima giratoria para la producción de compuestos como saponina, hormonas esteroideas, vitaminas y sustancias farmacéuticas.
[0004] Lípidos, en particular, lípidos neutrales están normalmente almacenados en la célula en organelos intracelulares específicos conocidos como partículas lipídicas.
Estas partículas se caracterizan por una estructura simple que consiste en un monoestrato hidrofóbico altamente con solo una pequeña cantidad de proteínas introducida.
Los lípidos se almacenan en las partículas lipídicas hasta que la hidrólisis dirige el regreso de sus componentes a vías metabólicas y/o catabólicas.
Este proceso de formación de depósito de lípido se usa mucho en la naturaleza y todos los tipos de células eucarióticas contienen partículas de lípido intracelular, que también se pueden llamar cuerpos lipídicos, gotitas lipídicas, cuerpos de aceite u oleosomas.
En la levadura, las gotitas de lípido de Saccharomyces cerevisiae acumulan hasta un 70 % del contenido de lípido total de la célula.
[0005] Ya que la mayor parte de los lípidos mencionados son derivables de fuentes naturales como plantas, animales o microorganismos, se intentó aumentar la cantidad lipídica en las células vivas, es decir, acumular más lípidos en las partículas lipídicas.
Para este propósito, resulta conocido modificar las vías metabólicas de organismos.
El documento EP-0 486 290 A describe la sobre-expresión de genes del metabolismo de ergosterol en la levadura, dando como resultado un aumento de la cantidad de ergosterol en las células.
El documento WO03/064652 A divulga un método para la producción de zimosterol basado en el aumento de lanosterol-C14-demetilasa y actividad de HMG-CoA-reductasa.
En el documento WO2004/083407 A se describen organismos transgénicos, que tienen una actividad A22- desaturasa reducida y una actividad aumentada de HMG-CoA reductasa, lanosterol C14-demetilasa, epoxidasa de escualeno y sintetasa de escualeno.
Estos organismos se pueden usar para la producción del lípido de esterol ergosta-5,7-dienol.
Así, por modificar biológicamente organismos de generación de lípidos, el rendimiento de los lípidos producidos se puede aumentar significativamente.
[0006] Sin embargo, los compuestos de lípido obtenidos son no puros en su mayoría y se entremezclan, y necesitan separarse y/o purificarse, en particular, si el lípido debe usarse como una materia prima para otra síntesis química o modificaciones.
Además, cualquier procedimiento de purificación, especialmente, si se realiza en una escala industrial, es costoso, laborioso y tiende a contaminar el medio ambiente.
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[0007] Varias modificaciones de organismos se describen en las referencias K. Jensen-Pergakes, et al., Journal of Bacteriologogy, 183:17 (2001), pp 4950-4957; T. Polakowski et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 49 (1998), pp 66-71; G. K. A. G. Donald et al., Applied and Environmental Microbiology, 63:9 (1997), pp 33413344; G. Daum et al., Biochimie 89:2 (2007), pp 243-248; and D. Dimister-Denk et al., Journal of Lipid Research, 40:5 (1999), pp 850-860. La EP486290 describe la expresión, en levadura, de cantidades aumentadas de reductasa HMG-CoA, lo que resulta en la producción de escualeno aumentada.
Problema técnico de la invención.
[0008] Por consiguiente, el problema técnico subyacente a la presente invención comprende proporcionar medios y métodos permitir a la producción de lípidos por organismos en una forma más pura para evitar procedimientos de purificación intensivos laboriosos y costosos.
Resumen de la invención y formas de realización preferidas
[0009] Para resolver este problema técnico, la presente invención enseña un organismo según la reivindicación 1.
Las formas de realización preferidas son específicas en las reivindicaciones dependientes en la reivindicación 1. En este la frase "geneticamente modificado" se destina a comprender no solo organismos, donde el genoma ha sido modificado por métodos del estado de la técnica de la ingeniería genética, pero también organismos, que han sido seleccionados a partir de un grupo mutante según la modificación genética deseada (mutagénesis convencional).
[0010] La invención se basa en la constatación de que es posible manipular genéticamente o modificar bioquímicamente organismos de modo que los lípidos (neutrales) específicos se acumulan en partículas lipídicas en una forma más pura.
Los organismos de la invención se modifican en cierto modo que elimina o reduce la síntesis de ésteres de acilo no deseado de sterilo dependiendo del lípido que se destina a ser producido por el organismo en la pureza más alta.
Además, la acumulación de un lípido neutral en una forma más pura, la reducción o la eliminación de los ésteres de acilo de sterilo que contaminan potencialmente también sorprendentemente llevan a niveles aumentados y rendimientos del lípido deseado.
Esto puede ser debido a que, sin estar ligado a esta teoría, al espacio de almacenamiento aumentado en las partículas lipídicas y/o debido a la disponibilidad aumentada del sustrato para la síntesis del lípido deseado.
[0011] El término "lípido neutral" se refiere a lípidos que carecen de grupos cargados y son, por lo tanto, incapaces de integrar en las membranas de doble capa en cantidades sustanciales.
El término comprende ésteres de sterilacilo (SAEs).
El escualeno también pertenece a la clase de "lípidos neutrales".
Normalmente, el contenido de la partícula lipídica es una mezcla de diferentes lípidos neutrales que obstaculiza una producción eficaz de un lípido neutral específico deseado en un organismo recombinante.
Este problema se supera por la presente invención modificando un organismo productor de manera que al menos un tipo de lípido neutral que se produce naturalmente en dicho organismo en dicho artículo lipídico ya no está sintetizado de ese modo.
Como resultado, la composición de los lípidos neutrales restantes contenidos en la partícula lipídica se vuelve más pura y así más atractiva para la producción para uso comercial.
[0012] Así, el organismo según la presente invención se modifica de modo que esta ya no sintetiza un éster de acilo de sterilo (SAE).
Los ésteres de acilo de sterilo son los ésteres de esteroles con ácidos grasos de cadena larga.
Generalmente, la síntesis de SAE se realiza en las células por un mecanismo enzimático que implica acil-CoA: esterol de aciltransferasa/esterol O-acilotransferasa (EC 2.3.1.26).
La reacción catalizada es la esterificación de esteroles con ácidos grasos de cadena larga.
Así, el organismo según la presente invención se modifica, de modo que la actividad del acil-CoA: esterol aciltransferasa/esterol O aciltransferasa (EC 2.3.1.26) se reduce en comparación con un organismo de tipo salvaje correspondiente.
[0013] En la levadura, en particular en la S. Cerevisiae, la esterificación de esterol para producir ésteres de acilo de sterilo se realiza por dos isoenzimas de la transferasa de acilo de sterilo, es decir, ARE1p y ARE2p, que tienen afinidades específicas diferentes para productos intermedios de esterol diferentes.
ARE1p guía, en particular, la esterificación de precursores de ergosterol, tales como lanosterol, zimosterol, ergosta-5,7-dienol y sustancias extrañas a levadura tal como 7-dehidro colesterol.
ARE2p guía preferentemente a la esterificación de ergosterol, el producto final de la vía de biosíntesis de ergosterol en la levadura.
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Si el organismo es un organismo de levadura, en particular, del género Saccharomyces y preferiblemente S. Cerevisiae, la actividad de ambos, ARE1p y ARE2p se reduce o suprime en comparación con un organismo de levadura no modificado correspondiente, preferiblemente, un organismo de tipo salvaje correspondiente.
Si ambas actividades enzimáticas se eliminan, ninguna esterificación de esteroles se produce en las células.
[0014] En relación con la invención donde el organismo se caracteriza por el hecho de que este ya no sintetiza un éster de acilo de sterilo, el organismo según la invención es Saccharomyces or Candida. Estos no almacenan naturalmente ésteres de ceras en sus partículas lipídicas, sino solo otros lípidos como triacilgliceroles y ésteres de acilo de sterilo.
Así, eliminando la vía biosintética para la síntesis de éster de acilo de sterilo, tal organismo acumula en sus partículas lipídicas básicamente solo triacilgliceroles, de forma que permite producir en tal organismo triacilgilceroles mejor en una forma pura desde las partículas lipídicas.
Los ejemplos para organismos que naturalmente no acumulan ésteres de cera en sus partículas lipídicas son en particular la mayoría células fúngicas.
En relación con la presente invención, el organismo es un organismo fúngico, preferiblemente, Candida o Saccharomyces cerevisiae.
[0015] El organismo de la invención es capaz de acumular en su partícula lipídica escualeno o un derivado de escualeno. Un derivado de escualeno comprende uno o más, en particular 1 a 10 o 1 a 4, metilo adicional o grupos etilos ligados a átomos de carbono de esqueleto en vez de átomo(s) de hidrógeno ligados a átomos de carbono de esqueleto en el esqualeno.
[0016] Un organismo de la invención, que se modifica para no sintetizar un éster de acilo de sterilo es capaz de la sintetización y almacenamiento de lípidos de prenol en sus partículas lipídicas, en particular, escualeno y así permite la producción de tal lípido de prenol en las partículas lipídicas básicamente en la forma pura o más pura. Así, ya eliminando en un organismo de levadura, las vías sintéticas para la biosíntesis de TAG y/o sAe es posible mejorar espectacularmente la producción sobre la cantidad y pureza del escualeno producido por tal organismo.
[0017] Otra mejora en la producción de escualeno en tal organismo podría conseguirse modificando el metabolismo del organismo para aumentar las actividades enzimáticas que conducen a la síntesis de escualeno y reducen actividades enzimáticas de vías que convierten escualeno en otros compuestos.
[0018] Los genes de la vía biosintética de escualeno se conocen y clonan, por ejemplo, en la levadura S. Cerevisiae.
La enzima de cuello de botella principal es la HMG-CoA-reductasa (HMG1) (Basson et al. (Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 3793-3808).
Así, según la presente invención, el organismo es capaz de acumular escualeno en partículas lipídicas y se caracteriza por el hecho de que la actividad de HMG-CoA-reductasa (EC1.1.1.34) se aumenta en comparación con un organismo de tipo salvaje correspondiente.
El aumento en la actividad de HMG-CoA-reductasa se puede conseguir con medios y métodos bien conocidos por el experto en la técnica que son también descritos además con más detalle abajo.
Según la invención, el aumento en la actividad de HMG-CoA-reductasa se consigue en una primera alternativa por la expresión en el organismo de un gen de HMG-CoA-reductasa que codifica solo el área catalítica de la enzima pero no codifica los dominios unidos a la membrana.
Tal alteración ya se describe en la EP-A 486 290.
Por esta modificación, la regulación de retrocontrol de la HMG-CoA-reductasa se evita por productos intermedios de la vía de biosíntesis de ergosterol.
En otra alternativa, el gen que codifica la HMG-CoA-reductasa en el organismo según la invención se coloca bajo el control de un promotor heterólogo, es decir un promotor que es extraño al gen de HMG-CoA-reductasa, en particular, este promotor es un promotor que no se regula en su actividad por productos intermedios de la vía de biosíntesis de ergosterol.
Un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor de ADH1, en particular, el promotor de ADH1 "medio" que muestra una expresión constitutiva aproximadamente (Ruohonen et al., Journal of Biotechnology 39 (1995), 193203).
[0019] En algunos organismos, tales como levadura, escualeno se pueden convertir en otros compuestos, en particular en ergosterol y en productos intermedios de la vía de biosíntesis de ergosterol.
Las reacciones químicas y vías que resultan en la formación del ergosterol de esterol ((22E)-ergosta-5,7,22-trien- 3-beta-ol) se producen en el cornezuelo, levadura y moldes.
En estos organismos, el escualeno se convierte por escualeno monooxigenasa/escualeno epoxidasa (EC 1,14,99,7; también referido como escualeno epoxidasa o ERG1) en (S)-2,3-epoxiesqualeno que se convierte posteriormente por 2,3-oxidoesqualeno-lanosterol ciclise (EC 5,4,99,7; ERG7) en lanosterol.
Lanosterol luego se convierte por citocromo P450 lanosterol 14a-demetilasa (EC 1,14,13,70; ERG11) usando NADPH y O2 en 4,4-dimetil-cholesta-8,14,24-trienol que luego se convierte por reductasa C14 esterol (EC 1,3,1,70; ERG24) usando NADPH en 4,4-dimetil-8,24-cholestadienol.
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Este compuesto luego se convierte por la acción de C-4 metil esterol oxidasa (EC 1,14,13,72; ERG25) en 4- metil-8,24-cholestadienol.
Esta sustancia se convierte por esterol C-3 deshidrogenasa (EC 1.1.1.170; ERG26) en 3-keto-4-metilzimosterol. Posteriormente 3-keto-4-metilzimosterol se convierte por 3-keto esterol reductasa (EC 1.1.1.270; ERG27) en zimosterol.
El mismo zimosterol luego junto con S-adenosil-L-metionina se convierte por la acción de SAM:C-24 esterol metiltransferasa (EC 2.1.1.41; ERG6) en fecosterol y S-adenosil-homocisteína.
El fecosterol luego se convierte por la acción de C-8 esterol isomerasa (ERG2) en epiesterol que luego se convierte por la acción de C-5 esterol desaturasa (EC 1,14,21,6; ERG3) usando NADPH y O2 en 5,7,24(28)- ergostatrienol.
Este compuesto posteriormente se convierte por la acción de C-22 esterol desaturasa (EC 1,14,14; ERG5) en 5,7,22,24(28)-ergostatetraenol. 5,7,22,24(28)-ergostatetraenol luego se convierte por la acción de C-24 esterol reductasa (EC 1,3,1,71; ERG4) en ergosterol.
Si se desea que el organismo según la invención acumule escualeno en las partículas lipídicas y si este organismo se deriva de un organismo que es naturalmente capaz de sintetizar ergosterol o productos intermedios de la vía de ergosterol empezando por escualeno, puede ser deseable reducir las actividades de una o más de las actividades enzimáticas anteriormente mencionadas de la vía que se dirige del escualeno a ergosterol en el organismo.
En principio, cualquiera una, más de una o todas las enzimas anteriormente mencionadas de la vía de ergosterol descrita anteriormente podrían ser reducidas.
En una forma de realización preferida, la actividad de escualeno monooxigenasa (EC 1.14.99.7; también referida como escualeno epoxidasa o ERG1) se reduce, sin embargo, no se elimina completamente, ya que alguna síntesis de esterol es necesaria para la viabilidad de las células de levadura.
También es posible reducir la actividad de una o varias de las siguientes enzimas implicadas en la biosíntesis de ergosterol: SAM:C-24 esterol metil transferasa (EC 2.1.1.41), C-22 esterol desaturasa (EC 1.14.14) y C-5 esterol desaturasa (EC 1.14.21.6).
Todo esto se aplica a cualquiera de las formas de realización anteriormente mencionadas de la invención.
[0020] Como parte de la invención, genéticamente se aplican las características siguientes respecto a los organismos modificados.
[0021] En la invención, se ha descubierto también que la sobreexpresión constitutiva de los genes SAK1 y/o HAP4 en la levadura Saccharomyces cerevisiae lleva a una productividad aumentada altamente de lípidos en particular de escualeno y esteroles.
Los genes SAK1 y HAP4 se relacionan con la distribución de flujo respiro-fermentativo.
[0022] El gen SAK1 codifica una quinasa de serina/treonina aguas arriba responsable de la fosforilación del complejo Snf1 p/Snf4p.
La fosforilación lleva a un complejo activo Snf1 p/Snf4p que se localiza en el núcleo.
El complejo Snf1 p/Snf4p pertenece a las quinasas de serina/treonina de proteína y juega un papel central en la liberación de la represión de glucosa durante el "cambio diáuxico".
El desvío diáuxico deNota el desvío del fermentativo al metabolismo respirativo cuando se consumen la glucosa u otras fuentes de carbón fermentativo en el medio.
Los rangos complejos se alejan Snf1/Snf4 en la jerarquía de la cascada responsable para la represión de glucosa y desrepresión, respectivamente.
En el curso del desvío diáuxico, el nivel de expresión de aproximadamente un cuarto de 6000 genes de Saccharomyces cerevisiae se cambia significativamente.
Estos cambios principales principalmente dirigen el metabolismo central que es desplazado del modo fermentativo al modo respiratorio.
En el modo fermentativo, la célula de levadura metaboliza fuentes de carbono fermentables como glucosa a etanol y dióxido de carbono.
En el modo respiratorio, el etanol producido se respira para ganar adenosintrifosfato (ATP), que proporciona energía en la célula.
En el curso del desvío diáuxico, el complejo Snf1 p/Snf4p es fosforilado y, por lo tanto, se activa por las Snf1- kinasas SAK1p, Tos1p y Elm1p.
El complejo activado se localiza en el núcleo donde este influye en los dos factores de transcripción Mig1p y Cat8p.
La proteína de dedo de zinc Mig1p es un represor transcripcional, que recluta las proteínas Tup1p y Cyc8p para enlazar una determinada secuencia de consenso de un gran número de genes reprimidos de glucosa como un complejo, por lo cual la transcripción del gen aguas abajo de esta secuencia de consenso se reprime.
Cat8p es un activador transcripcional e induce a la expresión de al menos 34 genes, cuando la glucosa en el medio está agotada.
Estos genes son principalmente genes del conector de glioxilato, que son necesarios para la metabolización de compuestos de C2 como etanol o acetato.
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Además de que también los genes responsables del transporte intracelular de productos intermedios del ciclo de ácido cítrico y el conector de glioxilato se regulan por Cat8p.
El complejo activo Snf1 p/Snf4p fosforila Mig1p, por lo cual esta proteína se inactiva y se transloca fuera del núcleo y fosforila Cat8p y Sip1 p, un homólogo funcional, que lleva a una inactivación de estas dos proteínas.
Un complejo activo Snf1 p/Snf4p localizado en el núcleo, por lo tanto, contribuye considerablemente a la liberación de la represión de glucosa y el desvío de fermentación para respiración, porque influye en diferentes factores de transcripción de la cascada de represión.
Por consiguiente, un organismo según la presente invención, puede además ser desarrollado de modo que este muestra un complejo más activo Snf1 p/Snf4p aún en presencia de glucosa.
Esta modificación se consigue por la desregulación transcripcional de la proteína SAK1p, que es responsable, como la quinasa principal de la fosforilación y, por lo tanto, la activación del complejo Snf1 p/Snf4p.
[0023] El complejo Hap2/3/4/5 de proteína regula un gran número de genes reprimidos de glucosa.
Estos son predominantemente genes de la cadena de respiración y el ciclo de ácido cítrico.
Como un activador este induce a la transcripción de estos genes durante el desvío diáuxico y contribuye fuertemente a un desvío del equilibrio respiro-fermentativo en la dirección de respiración.
Los genes HAP2, HAP3 und HAP5 se expresan constitutivamente.
Naturalmente, HAP4 solo se expresa durante el crecimiento en las fuentes de carbono no fermentables.
Durante un cultivo de una HAp4-cepa de mutante de sobreexpresión se observó que esta mutación lleva a un índice de crecimiento aumentado, biomasa- y producción de acetato y a una formación reducida de glicerol y etanol.
El complejo de proteína Hap2/3/4/5 propaga el sistema respiratorio mediante el aumento de la capacidad respiratoria, la biogénesis mitocondrial y el flujo de carbono a través del ciclo de ácido cítrico.
[0024] Otra observación en la invención es que la deleción del gen FLD1 lleva a un aumento significativo inesperado de la producción lipídica, en particular, de la producción de escualeno, en organismos como levaduras, en particular, la levadura Saccharomyces cerevisiae.
El gen FLD1 codifica, una proteína seipina implicada en la morfología de gotita lipídica, número y tamaño.
Se informó de que una sobreexpresión de FLD1 lleva a la fusión de partículas de lípido que resulta en la formación de partículas de lípido significativamente aumentadas, pero menor en la célula de levadura.
En una cepa de levadura de tipo salvaje, el escualeno es un intermedio en la vía biosintética de esterol y no se acumula en la célula.
Una actividad aumentada de la HMG-CoA-reductasa, que se consigue por la expresión en la levadura, un gen HMG-CoA-reductasa, que codifica solo la parte catalítica de la enzima, pero no codifica los dominios unidos a la membrana como se describe en la EP-A 486 290, lleva a una acumulación de escualeno en la célula.
Esta acumulación se debe a una evitación de retrocontrol de la HMG-CoA-reductasa por productos intermedios de la vía de biosíntesis de ergosterol.
En la estructura de esta invención, se observó que la deleción del gen FLD1 lleva a un aumento significativo inesperado de la producción lipídica, en particular, de la producción de escualeno en las cepas de levadura que exhiben una actividad aumentada de HMG-CoA-reductasa.
[0025] La presente invención es útil en un método para la producción del segundo lípido, donde un organismo de la invención se usa y se cultiva, y donde el segundo lípido se aisla del organismo.
[0026] La reducción en la actividad de una proteína o enzima tal y como se menciona anteriormente en comparación con un organismo no modificado correspondiente es preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 75 %, aún más preferiblemente al menos 80 %, preferido particularmente al menos 90 % y más preferido 100 %.
Una reducción del 100 % significa que no hay proteína o actividad enzimática de dicha enzima presente en dicho organismo.
El aumento en la actividad de una enzima o proteína tal y como se menciona anteriormente en comparación con un organismo no modificado correspondiente es preferiblemente al menos 10 %, más preferiblemente al menos 50 %, aún más preferiblemente al menos 200 %, preferido particularmente al menos 1000 %.
La palabra "aumento" también comprende presencia de (cualquiera que se pueda medir) la actividad enzimática de una enzima o proteína cuando el organismo no modificado no comprende cualquier tal actividad medible.
La frase "aumento en actividad" abarca además un aumento en la cantidad de una proteína en todos aquellos casos, donde la proteína es no enzimática (como HAP4).
Luego, los parámetros anteriores de aumento se aplican en una manera análoga a las cantidades.
Las actividades de enzimas se pueden medir añadiendo a una cantidad predeterminada de un educto, una cantidad predeterminada de una enzima, que cataliza la reacción del educto a un producto y opcionalmente adicionalmente componentes de reacción requeridos, y por la medición de la cantidad de producto sintetizado dentro de un periodo de tiempo predeterminado.
Los métodos específicos para la medición de actividades de enzima mencionadas anteriormente se describen por ejemplo en el documento WO 03/064650 A1.
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La medición de actividades de enzimas anteriormente mencionadas no descritas en dicho documento se realizan de manera análoga.
[0027] Métodos para la reducción de la actividad de una enzima dada en una célula son, por ejemplo, reducción o supresión de la expresión génica del gen que codifica la enzima, por ejemplo, por la implementación de un promotor más débil aguas arriba del gen correspondiente o por deleción completa o parcial del gen y/o el promotor relativo, y/o añadiendo un inhibidor enzimático para inhibir la enzima traducida dentro de una célula del organismo y/o incorporación de si ARN en las células para reducir la cantidad de transcripción activa y/o mutación del gen para generar una variante menos activa.
[0028] Una reducción en la expresión génica significa que el nivel de expresión génica de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima respectiva se reduce en comparación con el nivel de expresión génica de dicha secuencia de nucleótidos en un organismo no modificado correspondiente, preferiblemente, un organismo de tipo salvaje correspondiente.
Se aplican los mismos niveles de reducción como se han proporcionado arriba respecto a las actividades.
Los medios y métodos para la detección del nivel de expresión génica incluyen, por ejemplo, la determinación de la cantidad de ARNm correspondiente sintetizado o proteína o la determinación de la actividad enzimática de la proteína respectiva.
En una forma de realización preferida, el nivel de expresión génica se determina por la medición de la cantidad de ARNm, por ejemplo en Northern Blot.
En otra forma de realización preferida, el nivel de expresión génica se determina por la medición de la cantidad de proteína correspondiente sintetizada, por ejemplo en un Western Blot o determinando la cantidad de la actividad enzimática correspondiente.
La reducción en la expresión génica también se puede conseguir por la prestación del gen en cuestión no funcional.
Un medio posible para la prestación de un gen no funcional es la interrupción génica.
[0029] Los métodos para aumentar la actividad de una enzima incluyen la transformación de células de manera que se consigue una desregulación transcripcional, de manera que un gen (heterólogo u homólogo) que codifica la enzima está dispuesto bajo el control de un promotor activo constitutivamente (homólogo o heterólogo), y/o de manera que el número de copias del gen que codifica (heterólogo u homólogos) la enzima aumenta y/o aumenta la actividad por mutación.
[0030] Ejemplos específicos que efectúan actividades enzimáticas aumentadas o disminuidas se proporcionan en los ejemplos.
El experto en la materia, sin embargo, también será capaz de aplicar otros métodos bien conocidos en la técnica sin necesidad de divulgación específica aquí.
[0031] Las secuencias de gen adecuadas para enzimas que han sido empleadas en la presente invención se describen en las siguientes, pero diferentes secuencias genéticas con las mismas actividades enzimáticas que se pueden emplear igualmente.
Las secuencias genéticas particulares o las secuencias proteínicas codificadas así no son características estructurales pertinentes en la presente invención, pero en cambio la clasificación bajo los mismos números EC (Enzyme Commision).
[0032] Las secuencias genéticas para acil-CoA: esterol aciltransferasa/esterol O aciltransferasa (EC 2.3.1.26) incluyen: NC_ 001135.4, NC_001147.6; NM_005891; NM_144784; NM_153728.
[0033] Las secuencias genéticas para aciltransferasa/diacilglicerol O-aciltranferasa (EC 2.3.1.20) incluyen: NC_001147.5; XM_002478787; NM_123089; XM_002378082; NM_032564; NM_01012345; NM_010046; XM_002146497.
[0034] Las secuencias genéticas para transferasa/fosfolípido de acilo de colesterol de lecitina: diacilglicerol
aciltransferasa (EC 2.3.1.158) incluyen: NC_001147.6; NM_008490; NM_001162568; NM_000229;
NM_001005715; NM_017024; NM_001082190.
[0035] Las secuencias genéticas para acilo CoA-cera aciltransferasa alcohólica (EC 2.3.1.75) incluyen: NM_123089; NM_177448.
[0036] Las secuencias genéticas para HMG-Co0A-reductasas incluyen: NC 001145; NM_106299, NC_003421.2, NC_009784.1, NC_003028.3, NC_007308.3 y la secuencia de la figura 5 (truncada, tHMG1).
[0037] Las secuencias genéticas para C-24 transferasas de metilo de esterol incluyen: NC_001145, NC_000911.1, NC_ 003423.3; XM_505173; XM_ 716615.
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[0038] Las secuencias genéticas para C-22 esterol desaturasas incluyen: NC_003424.3, NC_009046.1, NC_001145.2; XM _500188; XM_711840.
[0039] Las secuencias genéticas para C-5 esterol desaturasas incluyen: NC_001144; S46162; NG_009446; NM_053642; NM_ 001035356; XM_503090; XM_708519.
[0040] Las secuencias genéticas para HAP4 incluyen: NC _001143.7; XM_448596; M_001645329.
[0041] Las secuencias genéticas para SAK1 incluyen: NC_001137.2; XM_502591, XM 448319; XM_453478; NM_208704.
[0042] Las secuencias genéticas para REG1 incluyen: NC_ 001136.8; XM_500990; XM_448729; XM_455276.
[0043] Las secuencias genéticas para FLD1 incluyen: NC_ 001144.4; NM_210286; XM_001647166; XM-449778.
[0044] Las secuencias genéticas para 7-dehidrocolesterol reductasa incluyen: NM_103926; NM_001360; NM_007856; NM_203904; NMD_001014927; NM_201330; N_022389; NM_ 001131727; NM_001087087; XM_001497598; XM_001174160; XM_001099101; BM490402; CA753545.
[0045] Las secuencias genéticas para 24-dehidrocolesterol reductasa incluyen: NM_014762; NM_001016800; NM_ 001094456; NM_001008645; NM_001103276; NM_001080148; NM_053272; NM_00103128;
XM_001488247; AB125202; XM_001153751.
[0046] Las secuencias genéticas para lanosterol esterol 14-demetilasas incluyen: NC_001140.5; XM_500518; EF059165; XM_445876; XM_454109.
[0047] Las secuencias genéticas para monooxigenasas de escualeno incluyen: NC_001139.8; M64994; XM_503994; XM_ 706801; XM_455763
[0048] Las secuencias genéticas para promotores adecuados (promotores de las enzimas diferentes respectivas expresadas heterólogamente pueden ser iguales o diferentes) incluyen: NC_ 001142; NC_001139; NC_001147; NC_001139; NC_001148; NC_ 001135; NC_001136.
La Figura 1
La Figura 2 cerevisiae. La Figura 3
La Figura 4
La Figura 5
Cromatografía en capa fina de extractos de lípido enteros de cepas mutantes construidas de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Muestra esquemáticamente la biosíntesis de escualeno en la levadura Saccharomyces
Muestra esquemáticamente la biosíntesis de triacilgliceroles en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Muestra esquemáticamente la biosíntesis de éster de acilo de sterilo en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Muestra la secuencia de una HMG CoA-reductasa truncada, tHMG1.
[0049] Los ejemplos siguientes sirven meramente para ilustrar la invención.
[0050] Los siguientes materiales y métodos han sido usados en los ejemplos.
1. Restricción de clivaje
[0051] La restricción de plásmidos (1 a 10 jg) fue realizada en lotes de 30 jl.
Con este fin, el ADN fue absorbido en 24 jl de H2O y mezclado con 3 jl del tampón correspondiente, 1 jl de RSA (albúmina de suero bovino) y 2 jl de enzima.
La concentración enzimática fue 1 unidad/jl o 5 unidades/jl dependiendo de la cantidad de ADN.
En algunos casos, 1 jl más de ribonucleasa se añadió al lote para degradar el ARNt.
El lote de restricción fue incubado durante dos horas a 37 °C.
La restricción fue controlada con un minigel.
2. Electrofóresis de gel
[0052] La electrofóresis de gel se realizó en el minigel o equipo ancho-minigel.
Los minigeles (aproximadamente 20 ml, 8 bolsas) y los anchos-minigeles (50 ml, 15 o 30 bolsas) que consistían en 1 % de agarosa en TAE. 1*TAE se usó como un tampón móvil.
Las muestras (10 jl) se mezclaron con 3 jl de solución de tapón y se aplicaron.
Corte de ADN I con HindlII se usó como un estándar (bandas a: 23.1 kb; 9.4 kb; 6.6 kb; 4.4 kb; 2.3 kb; 2.0 kb; 0.6 kb).
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Para la separación, se preparó un voltaje de 80 V durante 45 a 60 minutos.
Luego, el gel se manchó en la solución de bromuro de etidio y se sujetó bajo la luz UV con sistema de documentación de vídeo INTAS o fotografiado con un filtro naranja.
3. Elución de Gel
[0053] Los fragmentos deseados fueron aislados utilizando la elución de gel.
La preparación de restricción se aplicó en diferentes bolsas de un minigel y se separó.
Solo [lambda]-HindIII y una "marca sacrificio" se manchó en la solución de bromuro de etidio, vista bajo luz UV y el fragmento deseado se marcó.
Como resultado, se evitó dañar el ADN de las bolsas residuales por el bromuro de etidio y la luz UV.
Por la alineación de las piezas de gel manchadas y no manchadas, el fragmento deseado de la pieza de gel no manchada podría ser recortado basándose en el etiquetado.
La pieza de agarosa con el fragmento que se va a aislar se añadió en un tubo de diálisis, se selló de burbujas de aire con un tampón TAE pequeño y se colocó en el equipo BioRad-minigel.
El tampón móvil consistió en 1*TAE y el voltaje fue 100 V durante 40 minutos.
Luego, la polaridad de flujo fue variada durante 2 minutos para soltar el ADN adherido al tubo de diálisis.
El tampón que contiene los fragmentos de ADN del tubo de diálisis se movió en el recipiente de reacción y así realizó una precipitación de etanol.
Con este fin, la fracción de volumen (1/10) de 3 M acetato sódico, ARNt (1 jl por 50 jl de solución) y 2.5 veces el volumen de etanol enfriado con hielo 96 % se añadieron a la solución de aDn.
El lote se incubó durante 30 minutos a -20 °C. Y luego se centrifugó a 12,000 r.p.m. durante 30 minutos a 4 °C.
El granulado de ADN se secó y absorbió en 10 a 50 jl de H2O (dependiendo de la cantidad de ADN).
4. Tratamiento de Klenow
[0054] Las extremidades salientes de fragmentos de ADN se han realizado por el tratamiento de Klenow, de modo que resultan "extremos romos".
Por 1 |jg de ADN, el lote siguiente fue pipetado junto: en este caso, el ADN debería ser derivado a partir de una precipitación de etanol para prevenir contaminantes de la inhibición de la Klenow-polimerasa.
La incubación se efectuó durante 30 minutos a 37 °C y luego sobre otros 5 minutos a 70 °C. La reacción se detuvo.
El ADN se obtuvo del lote por una precipitación de etanol y se absorbió en 10 jl de H2O.
5. Ligamiento
[0055] Los fragmentos de ADN que debían ser ligados fueron combinados.
El volumen de extremo de 13.1 jl contenía aproximadamente 0.5 jg de ADN con una proporción de vector- inserto de 1:5.
La muestra se incubó durante 45 segundos a 70 °C, se enfrió a temperatura ambiente (aproximadamente 3 minutos) y luego se incubó en el hielo durante 10 minutos.
Luego, los tampones de ligación fueron añadidos: 2.6 jl de 500 mmol TrisHCI, pH 7.5, y 1.3 jl de 100 mmol MgCl2 y estos fueron incubados en el hielo durante otros 10 minutos.
Después 1 jl de 500 mmol DTT y 1 jl de 10 mmol ATP fueron añadidos, 1 jl de ligasa (1 unidad/jl) fue añadida en el hielo durante otros 10 minutos.
El tratamiento entero debería ser realizado con una agitación lo más pequeña posible para mantener las extremidades de ADN adyacentes de la reseparación, El ligamiento se efectuó durante toda la noche a 14 °C.
6. Transformación de E. coli
[0056] Los componentes Escherichia coli (E. coli) NM522 células fueron transformadas con el ADN de la preparación de ligamiento.
Como un control positivo, un lote fue suministrado con 50 ng del plásmido pScL3 y como un control nulo, un lote fue suministrado sin ADN.
Para cada preparación de transformación, 100 jl de 8 % de solución PEG, 10 jl de ADN y 200 jl de células competentes (E. coli NM522) fueron pipetadas en un tubo de centrifugado de tablero.
Los lotes se pusieron en hielo durante 30 minutos y se agitaron intermitentemente.
Luego, se produjo el choque térmico: 1 minuto a 42 °C.
Para regeneración, 1 ml de medio LB se añadió a las células y se incubó en una coctelera durante 90 minutos a 37b °C. Cada uno de los lotes no diluidos de 100 jl, una dilución 1:10 y una dilución 1:100 se vertieron en placas LB+ampicillina e incubados durante toda la noche a 37 °C.
7. Aislamiento de plásmido de E. coli (minipreparación)
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[0057] Las colonias de E. coli fueron cultivadas durante toda la noche en 1.5 ml de medio LB+ampiciNina en los tubos de centrifugado de tablero a 37 °C y 120 r.p.m.
Al día siguiente, las células fueron centrifugadas durante 5 minutos a 5000 r.p.m. y 4 °C y el granulado fue absorbido en un tampón TE de 50 |_il.
Cada lote se mezcló con 100 |_il de 0.2N NaoH, 1 % de solución SDS, mezclada y puesta en hielo durante 5 minutos (lisis de las células).
Luego, 400 |_il de solución Na-acetato/Nacl (230 |_il de H2O, 130 |_il de 3 M acetato sódico y 40 |_il of 5 M NaCI) se añadió, el lote fue mezclado y puesto en hielo durante otros 15 minutos (precipitación de proteína).
Después de 15 minutos del centrifugado a 11,000 r.p.m., el sobrenadante, que contiene plásmido ADN fue transferido en un vaso de Eppendorf.
Si el sobrenadante no estaba completamente claro, se centrifugaba una vez más.
El sobrenadante se mezcló con 360 |_il de isopropanol enfriado con hielo y se incubó durante 30 minutos a -20 °C (precipitación de ADN).
El ADN fue centrifugado (15 minutos, 12. 000 r.p.m., 4 °C), el sobrenadante fue descartado, el granulado fue lavado en 100 |_il de etanol enfriado con hielo 96 %, incubado durante 15 minutos a -20 °C y centrifugado nuevamente (15 minutos, 12. 000 r.p.m., 4 °C).
El granulado se secó en una velocidad de vacío y luego se absorbió en 100 |_il de H2O.
El plásmido de ADN se caracterizó por el análisis de restricción.
Con este fin, 10 |_il de cada lote fue restringido y se dividió por electroforesis en gel en un ancho-minigel (ver arriba).
8. Aislamiento de plásmido en el E. coli (Maxiprep)
[0058] Para aislar cantidades mayores de ADN de plásmido, se realizó el método maxiprep.
Dos émbolos con 100 ml de medio LB+ampicillina se inocularon con una colonia o con 100 |_il de un cultivo congelado, que lleva el plásmido que se va a aislar y se incubó durante toda la noche a 37 °C y 120 r.p.m.
Al día siguiente, el cultivo (200 ml) se movió en un vaso de precipitados GSA y se centrifugó durante 10 minutos a 4000 r.p.m. (2600*g).
El granulado celular se resuspendió en un tampón TE de 6 ml.
Para asimilar la pared celular, 1.2 ml de solución de lisozima (tampón TE de 20 mg/ml) se añadió y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Luego, la lisis de las células se efectuó con 12 ml de 0.2N NaOH, 1 % de solución SDS y durante otros 5 minutos de incubación a temperatura ambiente.
Las proteínas se precipitaron por la adición de 9 ml de 3 M solución de acetato sódico enfriado (pH 4,8) y una incubación en hielo de 15-minutos.
Después de la centrifugación (GSA: 13,000 r.p.m. (27,500*g), 20 minutos, 4 °C), el sobrenadante, que contenía el ADN se movió en un nuevo vaso de precipitados GSA y el ADN se precipitó con 15 ml de isopropanol enfriado con hielo y una incubación de 30 minutos a - 20 °C.
El granulado de ADN fue lavado en 5 ml de etanol enfriado con hielo y secado en el aire (aproximadamente 3060 minutos).
Luego, se resuspendió en 1 ml de H2O.
Se produjo un examen del plásmido por análisis de restricción.
La concentración se determinó por el depósito de diluciones en un minigel.
Para reducir el contenido en sal, se efectuó una microdiálisis de 30-60 minutos (tamaño de los poros 0.025 |_im).
9. Transformación de levadura
[0059] Para la transformación de levadura, se preparó un pre-cultivo de la cepa Saccharomyces cerevisiae (S. Cerevisiae) AH22.
Un émbolo con 20 ml de medio de YE fue inoculado con 100 |_il del cultivo congelado e incubado durante toda la noche a 28 °C y 120 r.p.m.
El cultivo principal se efectuó bajo condiciones idénticas en un émbolo con 100 ml de medio YE, que fue inoculado con 10 |_il, 20 |_il o 50 |_il del pre-cultivo.
9.1 Células competentes de producción
[0060] Al día siguiente, los émbolos se contaron utilizando una cámara Thoma y el procedimiento continuó con el émbolo, que mantuvo 3-5*107 células/ml.
Las células fueron cosechadas por el centrifugado (GSA: 5000 r.p.m. (4000*g), 10 minutos).
El granulado celular fue resuspendido en 10 ml de tampón TE y se dividió en dos tubos de centrifugado de tablero (5 ml cada uno).
Las células fueron centrifugadas durante 3 minutos a 6000 r.p.m. y se lavaron dos veces con 5 ml de cada tampón TE.
Luego, el granulado celular fue absorbido en un tampón de 330 |_il de acetato de litio por 109 células, transferido en un matraz estéril de 50 ml de Erlenmeyer y agitado durante una hora a 28 °C.
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Como resultado, las células fueron competentes para transformación.
9.2 Transformación
[0061] Para cada preparación de transformación, 15 jl de ADN de esperma de arenque (10 mg/ml), 10 jl de ADN que se va a transformar (aproximadamente 0.5 jg) y 330 jl de células de componente fueron pipetadas en un tubo de centrifugado de mesa y se incubaron durante 30 minutos a 28 °C (¡sin agitación!).
Luego, 700 jl de 50 % de PEG 6000 se añadió y se incubó durante una hora adicional a 28 °C, sin agitación. Siguió un choque térmico de 5 minutos a 42 °C. 100 jl de la suspensión se colocó en placas en el medio selectivo (YNB; Difco) para seleccionar para prototrofia de leucina.
En el caso de la selección en resistencia G418, una regeneración de las células se realiza después del choque térmico (ver bajo 9.3 fase de regeneración).
9.3 Fase de regeneración
[0062] Ya que el marcador de selección es resistencia a G418, las células necesitaron tiempo para la expresión del gen de resistencia.
Las preparaciones de transformación fueron mezcladas con 4 ml de medio YE y se incubaron durante toda la noche a 28 °C en la coctelera (120 r.p.m.).
Al día siguiente, las células fueron centrifugadas (6,000 r.p.m., 3 minutos), absorbidas en 1 ml de medio YE y 100 jl o 200 jl fueron vertidos en placas YE+G418.
Las placas fueron incubadas durante varios días a 28 °C.
10. Condiciones de reacción para el PCR
[0063] Las condiciones de reacción para la reacción en cadena de polimerasa deben ser optimizadas para el caso individual y no son necesariamente válidas para cualquier lote.
Así, entre otros, la cantidad de ADN usada, las concentraciones de sal y la temperatura de fusión se pueden variar.
Para nuestra formulación del problema, se ha demostrado que es ventajoso combinar las sustancias siguientes en una tapa de Eppendorf, que fue adecuada para su uso en un termociclador: 5 jl de tampón super, 8 jl de dNTP (0.625 jM cada uno), 5'cebador, 3'-cebador y 0.2 jg de matriz ADN, disuelto en suficiente agua para producir un volumen total de 50 jl para la preparación PCR, se añadieron a 2 jl (-0.1 U) de Super Taq polimerasa.
El lote fue brevemente centrifugado y cubierto con una gota de aceite.
Entre 37 y 40 ciclos se seleccionaron para amplificación.
11. Aislamiento de partículas de lípido S. Cerevisiae
[0064] Células de levadura crecieron en 50 ml de medio mínimo WMVIII durante 72 h a 28 °C con agitación recíproca a 250 r.p.m.
Las células fueron cosechadas por centrifugación y las partículas lipídicas fueron aisladas y purificadas según Leber et al. (Leber R, Zinser E, Zellnig G, Paltauf F, Daum G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1994 Nov;10(11):1421-1428).
Para análisis de esterol, las partículas de lípido fueron bien saponificadas durante 16 h en 30 % de hidróxido de potasio metanólico a temperatura ambiente para quanitification de esterol total por GC o esteroles fueron extraídos directamente con cloroformo/metanol (4:1) y se analizaron por TLC para distinguir entre esteroles libres y esterificados o por GC para cuantificación de esteroles libres.
12. Escualeno y análisis de esterol
[0065] Para cuantificar lípidos de célula completa y lípidos totales en partículas lipídicas, las muestras fueron saponificadas antes de análisis GC. 125 OD600 de células fueron tratadas durante 20 min a 100 °C en 0.5 N HCI y se permitieron refrescar a temperatura ambiente.
Después se añadieron 3 g de hidróxido de potasio y 12.5 ml de metanol con pirogalol (2 g/l).
Para la saponificación, la mezcla fue incubada durante 2 h a 70 °C al baño maría.
Los ésteres hidrolizados fueron extraídos en el n-hexano.
La fracción sin saponificado fue resuspendida en 2 ml de n-hexano.
El escualeno y los esteroles fueron cuantificados por GC con escualeno y colesterol como estándares internos.
El escualeno y los esteroles fueron separados en un cromatógrafo de gas Hewlett-Packard 5890 con una columna capilar (25 m por 0.25 mm por 0.25 jm [grosor de película]; Chrompack CPSil5) programado de 150 a 250 °C.
La temperatura fue inicialmente 150 °C durante 2 min; esta fue luego aumentada a 15 °C/min a una temperatura final de 250 °C a la que esta fue sujetada durante 20 min. La velocidad lineal fue 30 cm/S, el helio fue usado como el gas portador y las inyecciones pasaron al modo sin división.
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El volumen de inyección fue 1 |_il.
El área de cada valor máximo se calculó y fue relativa a un gramo de peso en seco de célula.
Cada muestra fue medida por duplicado.
Los estándares de ergosterol y escualeno fueron usados para identificación.
[0066] Los lípidos neutrales fueron extraídos y cuantificados por un método de Sorger y Daum (J. Bacteriol. 184 (2002), 519-524).
En detalle, para la cuantificación de lípidos neutrales, los extractos se aplicaron a placas de gel de sílice 60 y cromatogramas fueron desarrollados usando la luz de sistema de solvente petróleo- éter dietílico-ácido acético (25:25:1; vol/vol/vol) para el primer tercio de la distancia.
Luego las placas fueron secadas brevemente y además desarrolladas a la parte superior de la placa con la luz de sistema de solvente petróleo-éter dietílico (49:1, vol/vol).
Los lípidos neutrales fueron visualizados por la coloración de las placas de capa fina con vapor de yodo en una cámara TLC.
La cuantificación se efectuó por densitométrico escaneado.
[0067] El procedimiento de cultivo estándar de cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae para escualeno y análisis de esterol fue:
Precultivo: 20 ml de medio WMVIII en un matraz de agitación de 100 ml se inoculan con 20 |_il de la materia prima de glicerol correspondiente y se cultivaron durante 48 h a 30 °C y 150 r.p.m.
Cultivo principal: 50 ml de medio WMVIII en un matraz de agitación de 250 ml con deflectores se inocularon con 1 % del precultivo y cultivaron durante 72 h a 30 °C y 150 r.p.m.
Ejemplo 1
Deleción de los genes ARE1 y ARE2 en la S. Cerevisiae AH22ura3
[0068] El vector pUG6 (Güldener U, Heck S, Fiedler T, Beinhauer JD y Hegemann JH (1996). A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res 24 2519-24) se ha usado para eliminar los genes ARE1 y ARE2.
[0069] La deleción de ambos genes se ha realizado sucesivamente por el mismo método.
Al principio ARE1 se ha eliminado y después ARE2.
Después de la preparación de plásmido, un fragmento de pUG6 ha sido amplificado por PCR para obtener una herramienta que consiste en loxP-kanMX-loxP.
Los cebadores han sido construidos para fusionar las secuencias 5' e 3' de ARE1 respectivamente.
Las secuencias de codificación ARE2 a las regiones loxP del vector pUG6.
[0070] El producto PCR resultante consiste en un gen KanR, sitios loxP y ARE1 respectivamente.
Las regiones ARE2 homólogas para la transformación integradora en la S. Cerevisiae AH22ura3.
La recombinación homóloga en la levadura lleva a la deleción de la secuencia diana.
[0071] La resistencia contra G418 se ha usado para selección de clones positivos.
El ARE1 respec. La región ARE2 de codificación ha sido eliminada en esta cepa de levadura.
Para preparar la cepa para la deleción de otros genes, la resistencia G418 ha sido eliminada de la cepa.
Para este propósito, la cepa ha sido transformada por pSH47 (Guldner et al., 1996).
El vector lleva la cre- recombinasa para deshacerse del gen flanqueado KanR por sitios loxP.
[0072] Para disponer pSH47 la cepa ha sido seleccionada por contador en placas de agar 5-FOA (ácido 5- Fluoroorótico) (1 g/L).
La cepa resultante lleva una deleción de ambos genes ARE1 y ARE2.
Ejemplo 2
Deleción de los genes DGA1 y LRO1 en la S. Cerevisiae AH22ura3
[0073] El vector pUG6 (Guldner et al., 1996) se ha usado para eliminar los genes DGA1 y LRO1. La deleción de ambos genes se ha realizado sucesivamente por el mismo método. Al principio DGA1 se ha eliminado y después LRO1. Después de la preparación de plásmido, un fragmento de pUG6 se ha amplificado por PCR para obtener una herramienta que consiste en loxP-kanmX-loxP. Los cebadores se han construido para fusionar secuencias 5' y 3' del DGA1 respectivamente. LRO1 codifica las secuencias a las regiones loxP de vector pUG6.
[0074] El producto PCR resultante consiste en un gen KanR, sitios loxP y DGA1 respectivamente.
Las regiones homólogas LRO1 para la transformación integradora en la S. Cerevisiae AH22ura3.
La recombinación homóloga en la levadura lleva a la deleción de la secuencia diana.
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[0075] La resistencia contra G418 ha sido usada para selección de clones positivos.
El DGA1 respectivamente.
La región de codificación LRO1 ha sido eliminada en esta cepa de levadura.
Para preparar la cepa para la deleción de otros genes, la resistencia G418 ha sido retirada de la cepa.
Para este propósito, la cepa ha sido transformada por pSH47 (Guldner et al., 1996).
El vector lleva la cre-recombinasa para deshacerse del gen KanR flanqueado por sitios loxP.
[0076] Para disponer pSH47, la cepa ha sido contraseleccionada en placas de agar 5-FOA (ácido 5- Fluoroorótico) (1 g/L).
[0077] La cepa resultante lleva una deleción de ambos genes DGA1 y LRO1 Ejemplo 3
Deleción de los genes DGA1 y LRO1 en la S. Cerevisiae AH22ura3are1are2
[0078] El vector pUG6 (Gul dner et al., 1996) se ha usado para suprimir los genes DGA1 y LRO1.
[0079] La deleción de ambos genes se ha realizado sucesivamente por el mismo método.
Al principio DGA1 ha sido eliminado y después LRO1.
Después del plásmido de preparación, un fragmento de pUG6 ha sido amplificado por PCR para obtener una herramienta consistente en loxP-kanMX-loxP.
Los cebadores han sido construidos para fundir secuencias 5' y 3' del DGA1 respectivamente.
Las secuencias codificantes LRO1 a las regiones loxP del vector pUG6.
[0080] El producto PCR resultante consiste en un gen KanR, sitios loxP y DGA1 respectivamente.
Las regiones homólogas LRO1 para la transformación integradora en la S. Cerevisiae AH22ura3.
La recombinación homóloga en la levadura lleva a la deleción de la secuencia diana.
[0081] La resistencia contra G418 se ha usado para la selección de clones positivos.
El DGA1 respectivamente.
La región de codificación LRO1 ha sido eliminada en esta cepa de levadura.
Para preparar la cepa para la deleción de otros genes, la resistencia G418 se ha sido retirado de la cepa.
Para este propósito, la cepa ha sido transformada por pSH47 (Guldner et al., 1996).
El vector lleva la cre- recombinasa para desembarazarse del gen KanR flanqueado por sitios loxP.
[0082] Para disponer de pSH47 la cepa ha sido contraseleccionada en placas de agar FOA (ácido 5- Fluoroorótico) (1 g/L).
[0083] La cepa resultante lleva una deleción cuádruple de los genes ARE1, ARE2, DGA1 y LRO1.
Ejemplo 4
Expresión de t-HMG1 en las cepas de levadura resultantes de los ejemplos 1 a 3 y AH22ura3 como cepas de referencia, utilizando el plásmido episómico
[0084] La secuencia de ADN para tHMG (Basson et al. (Mol. Cell. Biol. 8 (1988); 3793-3808)) fue amplificada por PCR de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae S288C. (Mortimer and Johnston (Genetics 113 (1986); 3543)) con uso de métodos estándar.
Los cebadores que se usan en este caso son el oligómero de ADN tHMG-5 y tHMG-3'.
El fragmento de ADN que se obtuvo fue introducido en el vector de clonación pUC19 (Yanisch-Perron et al. (1985): Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors.
In: Gene. Bd. 33, S. 103-119) después un tratamiento de Klenow y vector producido pUC19-tMG.
Después del plásmido de aislamiento y restricción de pUC 19-tHMG con endonucleasas EcoRI y BamHI, el fragmento obtenido fue introducido en el vector de expresión de levadura pPT2b (Lang and Looman (Appl. Microbiol.
Biotechnol. 44 (1995); 147-156)), que también fue tratado con EcoRI y BamHI.
El plásmido pPT2b-tMG que fue producido contiene el promotor ADH1 truncado (Bennetzen and Hall (Yeast 7 (1982); 475-477)) y el terminador TRP1 (Tschumper G, Carbon J. Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and the TRP1 gene. Gene. 1980 Jul;10(2): 157-166), entre el que se ha descubierto el fragmento tMG-DNA.
Una sección de ADN fue aislada del vector pPT2b-tMG vía endonucleasas EcoRV y NruI y dicha sección de ADN contiene el denominado promotor de ADH1 de longitud media, el gen tHMG y el terminador TRP1.
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Esta sección de ADN fue introducida en el vector de levadura YEp13 (Fischhoff et al. (Gene 27 (1984); 239251)), que fue tratado con endonucleasa SphI y una polimerasa de ADN.
[0085] YEpH2 ha sido transformado en la S. Cerevisiae AH22URA3are1are2, AH22URA3DGA1LRO1, AH22URA3ARE1ARE2DGA1LRO1 und AH22URA3.
Como plásmido de referencia YEp13 ha sido usado.
Ejemplo 5
Integración cromosómica y sobreexpresión de t-HMG1 en las cepas de levadura resultantes del ejemplo 1 a 3 y AH22ura3 como cepas de referencia, utilizando el plásmido integrador cromosómico YDpUHK3
[0086] El vector YEpH2 fue tratado con las endonucleasas EcoRV y NruI.
Un fragmento de ADN con las áreas siguientes fue producido así: un área de activación de transcripción del gen de resistencia de tetraciclina (Sidhu and Bollon (10 (1990) 157-166)), el promotor ADH1 de longitud media, el tHMG y el terminador TRP1 (casete de expresión).
Este fragmento de ADN fue introducido en el vector YDpU (Berben et al. 1991 Berben G., Dumont J., Gilliquet V, Bolle P-A. und Hilger F. (1991): "The YDp plasmids: a uniform set of vectors bearing versatile gene disruption cassettes for Saccharomyces cerevisiae". "Yeast 7,475-477, que fue tratado con StuI. Vector YDpUH2/12 que fue producido así fue tratado con endonucleasa SmaI y ligado con una secuencia de ADN que codifica una resistencia de canamicina (Webster, T. D., Dickson, R. C. (1983) Direct selection of Saccharomyces cerevisiae resistant to the antibiotic G418 following transformation with a DNA vector carrying the kanamycin-resistance gene of Tn903. Gene 26: 243-252). El constructo que se produjo (YDpUHK3) fue tratado con EcoRV. La cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae AH22 fue transformada con este constructo. La transformación de la levadura con un vector linealizado, como es en este ejemplo, produce una integración cromosómica del vector total en el locus de gen URA3. Para eliminar las áreas del vector integrado que no son parte del casete de expresión (origen E. coli, gen de resistencia coli amplicina, promotor TEF y gen de resistencia de canamicina), las levaduras transformadas fueron sometidas a una presión de selección por selección FOA (Boeke et al. (Methods in Enzymology 154 (1987); 164-175)) que promueven levaduras auxotróficas de uracilo. La cepa auxotrófica de uracilo que se describe en la selección soporta el nombre AH22tH3ura8 y tiene el casete de expression tMG1 como integración cromosómica en el gen de URA3.
[0087] Las cepas de levadura indicadas en la tabla 1 han sido evaluadas en su productividad/contenido de escualeno.
Para ello las cepas han sido cultivadas durante 72 h en el medio de WMVIII a 30 °C y a una agitación de 150 r.p.m.
Después de la rotura celular en 0,5 M HCI de ebullición, los lípidos fueron extraídos con 2 veces 20 ml n-hexano y analizados/cuantificados vía GC/MS (por favor ver artículo 12 para más detalles).
Los datos siguientes han sido obtenidos (tabla 1).
Tabla 1
- Cepa
- Escualeno [% por DW]
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2DGA1LRO1
- < 0,1
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2DGA1
- 0,2
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2LRO1
- 1,0
- AH22tH3ura8 DGA1LRO1ARE2
- < 0,1
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2
- 11,2
- AH22tH3ura8 DGA1LRO1
- 2,1
- AH22tH3ura8
- 9,8
- AH22ura3 (tipo salvaje, cepa de referencia)
- 0,1
Ejemplo 6
La deleción del gen FLD1 en la S. Cerevisiae AH22tH3ura8 ARE1ARE2
[0088] El vector pUG6 (Guldner et al., 1996) ha sido usado para eliminar el gen FLD1.
[0089] Después de la preparación del plásmido, un fragmento de pUG6 se ha amplificado por PCR para obtener una herramienta consistente en loxP-kanMX-loxP.
Los cebadores se han construido para fusionar secuencias 5' y 3' de FLD1 que codifican la secuencia a las regiones loxP del vector pUG6.
[0090] El producto PCR resultante consiste en un gen KanR, sitios loxP y regiones homólogas FLD1 para la transformación integradora en la S. Cerevisiae AH22tH3ura8 are1are2.
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40
45
50
55
La recombinación homóloga en la levadura lleva a la deleción de la secuencia diana.
[0091] La resistencia contra G418 se ha usado para selección de clones positivos.
La región de codificación FLD1 ha sido eliminada en esta cepa de levadura.
Para preparar la cepa para la deleción de otros genes, la resistencia G418 se ha retirado de la cepa.
Para este propósito, se ha transformado la cepa por pSH47 (Guldner et al., 1996).
El vector lleva la cre- recombinasa para deshacerse del gen KanR flanqueado por sitios loxP.
[0092] Para disponer de pSH47, la cepa ha sido contraseleccionada en placas de agar FOA (ácido 5- Fluoroorótico) (1 g/L).
[0093] La cepa resultante lleva una deleción triple de los genes ARE1, ARE2 y FLD1 y se denomina AH22tH3ura8 are1are2fld1.
[0094] Las cepas de levadura indicadas en la tabla 2 han sido evaluadas en su productividad/contenido de escualeno.
Para ello, las cepas han sido cultivadas durante 72 h en el medio de WMVIII a 30 °C y a una agitación de 150 r.p.m.
Después de la rotura celular en 0,5 M de ebullición HCl los lípidos fueron extraídos con 2 veces 20 ml n-hexano y analizados/cuantificados vía GC/MS (por favor ver artículo 12 para más detalles).
Los datos siguientes han sido obtenidos (tabla 2).
Tabla 2
- Cepa
- Escualeno [% por DW] Esqualeno/C-fuente [%] Escualeno/volumen de fermentación [g/l]
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2FLD1
- 14,6 2,52 1,25
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2
- 11,2 2,09 1,04
- AH22tH3ura8
- 9,8 1,81 0,91
- AH22ura3 (tipo salvaje, cepa de referencia)
- 0,1 <0,04 <0,02
Ejemplo 7 (ejemplo comparativo)
Sobreexpresión episómica de los genes SAK1 y HAP4 en las cepas de levadura resultantes del ejemplo 1 a 5
[0095] Para la sobreexpresión episómica de los genes SAK1 y HAP4 estos genes fueron clonados en los vectores de expresión pFlat1 y pFlat3, respectivamente.
Para ello, los dos genes fueron amplificados de ADN cromosómico de cepa S. Cerevisiae S288 c con cebadores que introducen un sitio de restricción NotI en el extremo 5' y un sitio de restricción XhoI en el extremo 3'.
Los fragmentos de PCR resultantes, al igual que los vectores pFlat1 y pFlat3 fueron restringidos con las endo nucleasas de restricción XhoI y NotI.
Los fragmentos de PCR restringidos y los vectores linealizados fueron ligados dando como resultado vectores pFlat1-SAK1 y pFlat3-HAP4.
Estos vectores llevan una copia de los genes SAK1 y HAP4, respectivamente, adyacente a una versión constitutiva del promotor de aDH1 y al terminador TRP1 para proporcionar una expresión constitutiva fuerte de SAK1 y HAP4.
Para la construcción de plásmido pFlat3, el plásmido YEp24 fue cortado con SphI y un fragmento 900 par de bases SphI con el promotor de aDH1 y el terminador tRP1 distanciado por un sitio de clonación múltiple de plásmido pUC19 fue insertado de plásmido pPT2B.
El sitio de clonación multible fue extendido por la inserción de un poliligador con los sitios de restricción para NotI y XhoI.
El plásmido resultante pFlat1 que lleva un gen URA3 para selección fue linealizado por restricción NcoI, embotado por polimerasa Klenow y un fragmento de BamHI con extremos redondeados de YDpL con el gen de levadura LEU2 fue integrado.
El vector resultante fue pFlat3.
[0096] Los plásmidos pFlat1-SAK1 y pFlat3-HAP4 y también los plásmidos vacíos pFlat1 y pFlat 3 como control fueron transformados en las cepas de levadura resultantes del ejemplo 1 a 6.
[0097] Las cepas de levadura en la tabla indicadas 3 han sido evaluadas en su productividad/contenido de escualeno.
Para ello, las cepas han sido cultivadas durante 72 h en el medio WMVIII a 30 °C y a una agitación de 150 r.p.m.
5
10
15
20
25
30
35
Después de la rotura celular en 0,5 M HCI de ebullición los lípidos fueron extraídos con 2 veces 20 ml n-hexano y analizados/cuantificados vía GC/MS (por favor ver artículo 12 para más detalles).
Los datos siguientes ha sido obtenidos (tabla 3).
Tabla 3
- Cepa
- Escualeno [% por DW]
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2LRO1
- pFlat1-SAK1 PFlat3 3,5
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2LRO1
- 1,0
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2DGA1
- pFlat1 PFlat3-HAP4 5,3
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2DGA1
- pFlat1-SAK1 PFlat3-HAP4 7,6
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2DGA1
- pFlat1-SAK1 PFlat3 5,1
- AH22tH3ura8 ARE1ARE2DGA1
- pFlat1 PFlat3 0,2
- AH22tH3ura8 DGA1LRO1
- PFlat3-HAP4 3,8
- AH22tH3ura8 DGA1LRO1
- PFlat3 2,1
- AH22tH3ura8
- PFlat3-HAP4 28,7
- AH22tH3ura8
- 9,8
- AH22ura3 (tipo salvaje, cepa de referencia)
- 0,1
Ejemplo 8 (ejemplo comparativo)
[0098] La composición de lípido neutral de las cepas construidas se evaluó vía cromatografía en capa fina.
La extracción de lípido entero y cromatografía en capa fina fue realizada según el artículo 12.
La Figura 1 muestra la composición de lípido entero/neutral de la cepa de tipo salvaje AH22ura3, la cepa con la HMG-CoA reductasa desregulada AH22tH3ura8 y las dos cepas de deleción doble AH22tH3ura8AARElAARE2 y AH22tH3ura8ADGA1ALRO1.
La Figura 1 indica que la cepa de tipo salvaje (AH22ura3, vía 1 y 2) produce cantidades muy bajas de escualeno en comparación con las cepas en la vía 3 a 8, que expresan la HMG-CoA reductasa desregulada y producen altas cantidades de escualeno.
La deleción de los genes que codifican las enzimas responsables de la formación de ésteres de sterilo (ARE1 ARE2) y triacilgliceroles (DGA1, LRO1) produce una falta completa de estos componentes en las cepas correspondientes (indicada por las cajas negras en la vía 5 a 8).
Los componentes lipídicos fueron identificados vía los estándares de escualeno, oleato de colesteril, trioleato, oleato y ergosterol (no mostrado).
LISTADO DE SECUENCIAS
[0099]
<110> OrganoBalance GmbH
<120> Organismos modificados genéticamente para la producción de lipidos <130> ORG-EP-1201D <160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1 <211> 1578 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> HMG CoA-reductasa truncada <400> 1
Claims (6)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Organismo no mamífero aislado genéticamente modificado, seleccionado de Saccharomyces and Candida, donde la actividad de ambos parálogos ARE1 y ARE2 de acil-CoA:sterol aciltransferasa/esterol O-aciltransferasa (EC 2.3.1.26) se reduce o se elimina en comparación con un organismo de tipo salvaje correspondiente y donde la actividad de HMG-CoA-reductasa (EC 1.1.1.34) aumenta en comparación con el organismo de tipo salvaje correspondiente, donde el aumento en la actividad de HMG-CoA-reductasa se consigue bien por la expresión en el organismo de un gen de HMG-CoA-reductasa, que codifica solo el área catalítica de la enzima pero no codifica el dominio unido a la membrana o la colocación de la HMG-CoA-reductasa en el organismo bajo el control de un promotor heterólogo.
- 2. Organismo, según la reivindicación 1,donde al menos un primer lípido es un esterilacil éster, acumulado en partículas lipídicas del organismo tipo salvaje correspondiente, ya no está sintetizado y donde un segundo lípido diferente del primer lípido se acumula en las partículas lipídicas del organismo modificado genéticamente,donde el segundo lípido es un escualeno o escualeno derivado, donde un derivado de escualeno comprende uno o más, en particular 1 a 10 o 1 a 4, grupos metilo o etilo adicionales unidos a átomos de carbono de esqueleto en vez de átomo(s) de hidrógeno unidos a átomos de carbono de esqueleto en esqualeno.
- 3. Organismo, según la reivindicación 1 o 2, donde una, dos o todas las actividades seleccionadas del grupo que consiste en SAM:C-24 esterol metil transferasa (EC 2.1.1.41), C-22 esterol desaturasa (EC 1.14.14.-) y C-5 esterol desaturasa (EC 1.14.21.6) se reduce o suprime en comparación con el organismo tipo salvaje correspondiente.
- 4. Organismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde una, dos o todas las actividades seleccionadas del grupo que consiste en escualeno monooxigenasa (EC1.14.99.7), esterol 14-demetilasa (EC!.14.13.70) y 7 dehidrocolesterol reductasa (EC1.3.1.21) aumenta en comparación con el organismo de tipo salvaje correspondiente.
- 5. Organismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,donde el organismo es un organismo eucariótico seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrückii, Saccharomyces italicus, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida albicans, Candida lipolytica y Candida versatilis.
- 6. Uso de un organismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la producción del segundo lípido como se define en la reivindicación 2, que comprende el cultivo del organismo y el aislamiento del segundo lípido del organismo.
imagen1 1 2 3 4 5 6 7 8AH22 ura3 AH 22 tH3ura8 AH22 tH3ura8 AH22tH3ura8Aarel AdgalEscualenoÉsteres de estenioTriacilglicerolesÁcidos grasos Esteróles libresFigura 1imagen2 5 Figura 2imagen3 DAGácidos grasosfosfolípidos/DgaipLro1pTAGFigura 3esterólesácidos grasosácidos grasosAre ipAre2pSTEFigura 4Figura 5ATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAGTCACCAAGAAGTCTTTTACTGCTCCTGTACAAAAGGCTTCTACACCAGTTTTAACCAATAAAACAGTCATTTCTGGATCGAAAGTCAAAAGTTTATCATCTGCGCAATCGAGCTCATCAGGACCTTCATCATCTAGTGAGGAAGATGATTCCCGCGATATTGAAAGCTTGGATAAGAAAATACGTCCTTTAGAAGAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGAAATACAAAACAATTGAAGAACAAAGAGGTCGCTGCCTTGGTTATTCACGGTAAGTTACCTTTGTACGCTTTGGAGAAAAAATTAGGTGATACTACGAGAGCGGTTGCGGTACGTAGGAAGGCTCTTTCAATTTTGGCAGAAGCTCCTGTATTAGCATCTGATCGTTTACCATATAAAAATTATGACTACGACCGCGTATTTGGCGCTTGTTGTGAAAATGTTATAGGTTACATGCCTTTGCCCGTTGGTGTTATAGGCCCCTTGGTTATCGATGGTACATGTTATCATATACCAATGGCAACTACAGAGGGTTGTTTGGTAGCTTCTGCCATGCGTGGCTGTAAGGCAATCAATGCTGGCGGTGGTGCAACAACTGTTTTAACTAAGGATGGTATGACAAGAGGCCCAGTAGTCCGTTTCCCAACTTTGAAAAGATCTGGTGCCTGTAAGATATGGTTAGACTCAGAAGAGGGACAAAACGCAATTAAAAAAGCTTTTAACTCTACATCAAGATTTGCACGTCTGCAACATATTCAAACTTGTCTAGCAGGAGATTTACTCTTCATGAGATTTAGAACAACTACTGGTGACGCAATGGGTATGAATATGATTTCTAAAGGTGTCGAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAAGAGTATGGCTGGGAAGATATGGAGGTTGTCTCCGTTTCTGGTAACTACTGTACCGACAAAAAACCAGCTGCCATCAACTGGATCGAÁGGTCGTGGTAAGAGTGTCGTCGCAGAAGCTACTATTCCTGGTGATGTTGTCAGAAAAGTGTTAAAAAGTGATGTTTCCGCATTGGTTGAGTTGAACATTGCTAAGAATTTGGTTGGATCTGCAATGGCTGGGTCTGTTGGTGGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTAGTGACAGCTGTTTTCTTGGCATTAGGACAAGATCCTGCACAAAATGTTGAAAGTTCCAACTGTATAACATTGATGAAAGAAgtggacggtgatttgagaatttccgtatccatgccatccatcgaagtaggtaccatcggtggtggtactgttctagaaccacaaggtgccatgttggacttattaggtgtaagaggcccggatgctaccgctcctggtaccaacgcacgtcaattagcaagaatagttgcctgtgccgtcttggcaggtgaattatccttatgtgctgccctagcagccggccatttggttcaaagtcatatgacccacaacaggaaacctgctgaagcaacaaaacctaacaatttggacgccactgatataaatcgtttgaaagatgggtccgtcacctgcattaaatcctaa
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