KR102304145B1 - 탈아세틸화용 조성물 및 이를 이용한 탈아세틸화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체의 탈아세틸화용 조성물 및 탈아세틸화 방법에 관한 것이다. 상기 단백질 및 이를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체의 특정 탄소에 결합된 아세틸기를 특이적으로 제거할 수 있는바, 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

탈아세틸화용 조성물 및 이를 이용한 탈아세틸화 방법 {Composition for deacetylation and method using the same}

본 발명은 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체에 포함된 아세틸기를 제거할 수 있는 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

화학적인 방법으로 화합물에 결합된 아세틸기를 탈아세틸화 시키는 방법은, 화학 반응을 통해서 아세틸기를 제거하기 때문에 한 번의 화학 반응을 통해서 다양한 유도체가 합성되며, 특정 유도체만을 선택적으로 합성하기 어렵다. 이 경우, 원하는 유도체를 얻기 위해서 분리 및 정제 과정이 추가적으로 더 필요하며, 이로 인해 비용과 공정 측면에서 문제점이 있다. 이러한 실정에서 화합물의 특정 위치에 아세틸기를 붙이거나 뗄 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

Zhou et al (2016) Convergence and divergence of bitterness biosynthesis and regulation in Cucurbitaceae. Nature Plants

본 발명은 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체의 탈아세틸화용 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 조성물을 이용해 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체를 탈아세틸화 시키는 방법을 제공함에 있다.

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 화합물 유도체의 탈아세틸화용 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 화합물 또는 상기 화합물 유도체의 25번 탄소에 위치하는 아세틸기를 탈아세틸화 하는 것인 탈아세틸화용 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 쿠쿠르비타신은 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 L 또는 쿠쿠르비타신 Q 인 탈아세틸화용 조성물.

4. 위 1의 단백질을 포함하는 조성물을 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 화합물 유도체와 반응시키는 단계를 포함하는 탈아세틸화 방법.

5. 위 4에 있어서, 상기 화합물 또는 상기 화합물 유도체의 25번 탄소에 위치하는 아세틸기를 탈아세틸화 하는 것인 탈아세틸화 방법.

6. 위 4에 있어서, 상기 쿠쿠르비타신은 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 L 또는 쿠쿠르비타신 Q 인 탈아세틸화 방법.

본 발명의 단백질은 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체를 탈아세틸화 할 수 있는바, 이를 포함하는 조성물은 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체의 탈아세틸화용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 ACT1을 이용한 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체의 탈아세틸화 경로를 나타낸다.
도 2는 시료 1의 표준폼 및 시료 1의 HPLC 데이터를 나타낸다.
도 3은 시료 2의 표준폼 및 시료 2의 HPLC 데이터를 나타낸다.
도 4는 시료 3의 표준폼 및 시료 3의 HPLC 데이터를 나타낸다.
도 5는 시료 4의 표준폼 및 시료 4의 HPLC 데이터를 나타낸다.
도 6은 시료 5의 표준폼 및 시료 5의 HPLC 데이터를 나타낸다.
도 7은 시료 6의 표준폼 및 시료 6의 HPLC 데이터를 나타낸다.
도 8은 시료 7의 표준폼 및 시료 7의 HPLC 데이터를 나타낸다.
도 9는 시료 8의 표준폼 및 시료 8의 HPLC 데이터를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체의 탈아세틸화용 조성물을 제공한다. 상기 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체는 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 화합물 일 수 있다.

본 발명의 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다.

서열번호 1의 아미노산 서열은 다음과 같다:

MESALKVKIIHEENIKPSIPTPQTQNHVKFSFLDQLALPVYVPLLLFYTPNHNPIPSKSHLLKSSLSKTLTLFYPFAGRVNDDNLSISCTDQGAIYVEAEANSPLSNILTQLNVDSLNQLLPFPNASAHANKGCIVLIQTTFFPCGGITVGLLISHKIADASSISSFVKTWTSIAISGNDSLFPKPEFIGDSVLPAPKDFPVATPTTPDSGIHAKGVTKRIVFSASKIASLKAKAASTKVKQPTRVEAVAGLLWKSAISAAKATSGISKASVLGQAVNLRKRLEPNLGDTSIGNSLGFVTPETAVAAEIDLQGTVGLLREAIEEFKESGYKKYQDTEAYLRHFKTLTDPDGPYSGEKNFYLCSSWSRFQFYEADFGWGLPVWFIGGISMFSNFFLLMDTRDGKGIEALVTLSEEDMAVFQCDQDLLAFASFNPNVLQLQH(서열번호 1).

본 발명에 포함되는 단백질은 천연으로부터 유래될 수도 있고, 공지의 단백질 합성 방법을 이용하여 합성될 수도 있으며, 예를 들어, 유전공학적 방법 또는 화학적 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.

본 발명의 단백질은 전술한 아미노산 서열로 이루어진 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 변이체란, 본 발명의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 갖는 단백질을 의미한다. 경우에 따라서, 본 발명의 단백질은 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)된 것 일 수도 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 이들의 기능적 동등물을 포함한다.

용어 '기능적 동등물'이란, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성' 이란 화합물을 아세틸화 및/또는 탈아세틸화 시키는 활성을 의미한다.

본 발명에 포함되는 단백질은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 상기 핵산 분자 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다. 서열번호 2의 염기서열은 다음과 같다:

ATGGAGTCAGCATTGAAAGTAAAGATCATCCATGAGGAAAACATCAAACCTTCCATTCCAACGCCTCAAACCCAAAACCATGTGAAATTCTCCTTCTTAGATCAACTAGCTTTGCCTGTTTATGTTCCATTACTTCTTTTCTACACTCCCAACCACAATCCAATTCCTTCCAAATCCCACCTTCTAAAATCTTCATTATCCAAAACTTTAACCCTATTTTACCCATTTGCAGGTCGAGTTAACGATGACAATCTCTCCATTTCTTGTACTGACCAAGGCGCTATCTATGTCGAAGCTGAAGCCAATTCCCCTCTCTCCAATATTCTCACTCAACTCAACGTTGATTCCCTCAACCAACTCCTCCCTTTTCCCAACGCATCCGCCCACGCTAACAAAGGCTGTATTGTGCTCATCCAAACTACGTTCTTTCCATGCGGTGGCATTACCGTTGGTTTACTCATTTCGCACAAGATTGCCGACGCCTCCTCCATTAGTTCCTTCGTCAAAACCTGGACTTCCATAGCCATTTCCGGGAATGATTCTCTGTTTCCGAAACCAGAGTTCATTGGCGACTCTGTTTTGCCGGCCCCTAAGGATTTCCCAGTTGCAACTCCAACAACCCCAGATTCAGGAATTCACGCAAAAGGCGTAACCAAGAGAATCGTTTTCTCCGCTTCCAAAATCGCTTCCCTCAAAGCTAAGGCTGCTAGTACAAAGGTAAAGCAACCGACACGTGTGGAAGCTGTAGCTGGTTTGTTATGGAAATCTGCCATATCTGCTGCCAAAGCAACGTCCGGGATTTCAAAGGCGTCTGTGCTAGGCCAAGCCGTGAATCTACGGAAAAGATTGGAACCCAACTTGGGCGATACATCCATCGGGAATTCTCTCGGGTTCGTTACGCCGGAGACGGCGGTGGCAGCGGAGATAGACCTGCAGGGAACAGTGGGGTTGTTGAGGGAAGCGATTGAAGAATTTAAGGAAAGTGGGTACAAGAAATATCAAGATACGGAGGCTTATTTGAGGCATTTTAAAACTCTGACAGATCCAGATGGTCCGTACAGTGGGGAGAAGAATTTCTACTTGTGTAGTAGCTGGAGCAGATTTCAATTTTATGAAGCGGATTTTGGGTGGGGATTGCCTGTTTGGTTCATTGGAGGGATTTCAATGTTTTCCAATTTTTTCTTGCTGATGGATACAAGAGATGGAAAGGGAATTGAAGCGTTGGTGACTTTGAGTGAAGAAGACATGGCTGTGTTTCAATGTGATCAAGATTTGCTTGCATTTGCTTCATTCAATCCCAATGTTCTTCAGCTCCAACACTAA(서열번호 2).

상기 핵산 분자의 서열은 이와 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 적어도 하나의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 상기 핵산 분자는 서열번호 2와 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 염기 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자의 '서열 상동성의 %' 는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 핵산 분자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열에 비해 추가 또는 삭제 즉, 켑(gap)을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산 분자 서열은 수박 식물체로부터 유래된 것 일 수 있다.

본 발명의 단백질은 상기 핵산 분자가 포함된 재조합 발현벡터를 숙주세포에 형질전환 시켜 발현이 유도될 수 있다.

본 발명에서 용어, “재조합 발현벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 숙주세포는 에스케리키아 콜라이(대장균, Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)일 수 있으며, 진균, 효모, 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 에스케리키아 콜라이 균주로는 Rosetta2(DE3), C41(DE3), SoluBL21, BL21a1 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 상기 단백질을 단독으로 포함하거나, 적어도 하나의 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 제공될 수 있다.

본 발명의 단백질을 포함하는 조성물은 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 화합물 유도체를 탈아세틸화 할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 쿠쿠르비타신 화합물 또는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체를 아세틸화 할 수 도 있다.

본 발명의 ‘화합물 유도체’는 특정 화합물을 모체로 하여 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등 모체의 구조 등을 대폭 변화 시키지 않는 한도 내에서 변화된 화합물을 의미한다.

본 발명의 ‘쿠쿠르비타신 화합물 유도체’는 쿠쿠르비타신 화합물을 모체로 하여 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등 모체의 구조 등을 대폭 변화 시키지 않는 한도 내에서 변화된 화합물을 의미한다.

쿠쿠르비타신 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 백본(backbone)으로 포함하는 화합물로, 하기 화학식 1에 포함된 적어도 하나의 탄소들에 작용기 또는 치환기가 결합되어있을 수 있다:

[화학식 1]

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상기 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체는 적어도 하나의 아세틸기를 가질 수 있다.

일 예로, 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체를 구성하는 적어도 하나의 탄소에 아세틸기가 결합되어있을 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 1 구조의 백본을 가지는 쿠쿠르비타신 화합물의 1번 탄소, 2번 탄소, 3번 탄소, 4번 탄소, 5번 탄소, 6번 탄소, 7번 탄소, 8번 탄소, 9번 탄소, 10번 탄소, 11번 탄소, 12번 탄소, 13번 탄소, 14번 탄소, 15번 탄소, 16번 탄소, 17번 탄소, 18번 탄소, 19번 탄소, 20번 탄소, 21번 탄소, 22번 탄소, 23번 탄소, 24번 탄소, 25번 탄소 및 26번 탄소 중 적어도 하나에 아세틸기가 결합되어있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 예로, 쿠쿠르비타신 화합물 또는 이의 유도체를 구성하는 적어도 하나의 탄소에 하이드록시기가 결합되어있을 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 1 구조의 백본을 가지는 쿠쿠르비타신 화합물의 1번 탄소, 2번 탄소, 3번 탄소, 4번 탄소, 5번 탄소, 6번 탄소, 7번 탄소, 8번 탄소, 9번 탄소, 10번 탄소, 11번 탄소, 12번 탄소, 13번 탄소, 14번 탄소, 15번 탄소, 16번 탄소, 17번 탄소, 18번 탄소, 19번 탄소, 20번 탄소, 21번 탄소, 22번 탄소, 23번 탄소, 24번 탄소, 25번 탄소 및 26번 탄소 중 적어도 하나에 하이드록시기가 결합되어있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 쿠쿠르비타신 화합물은 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 D, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 F, 쿠쿠르비타신 G, 쿠쿠르비타신 H, 쿠쿠르비타신 I, 쿠쿠르비타신 J, 쿠쿠르비타신 K, 쿠쿠르비타신 L, 쿠쿠르비타신 O, 쿠쿠르비타신 P, 쿠쿠르비타신 Q, 쿠쿠르비타신 R, 쿠쿠르비타신 S 또는 쿠쿠르비타신 T 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물은 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 L 또는 쿠쿠르비타신 Q 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체는 쿠쿠르비타신 A의 유도체, 쿠쿠르비타신 B의 유도체, 쿠쿠르비타신 C의 유도체, 쿠쿠르비타신 E의 유도체, 쿠쿠르비타신 L의 유도체 또는 쿠쿠르비타신 Q의 유도체 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 쿠쿠르비타신 A의 유도체는 쿠쿠르비타신 A의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물일 수 있다. 다른 예를 들어, 쿠쿠르비타신 B의 유도체는 쿠쿠르비타신 B의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 쿠쿠르비타신 C의 유도체는 쿠쿠르비타신 C의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 쿠쿠르비타신 E의 유도체는 쿠쿠르비타신 E의 16번 탄소자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 쿠쿠르비타신 L의 유도체는 쿠쿠르비타신 L의 16번 탄소자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 쿠쿠르비타신 Q의 유도체는 쿠쿠르비타신 Q의 16번 탄소자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물일 수 있다.

구체적으로, 쿠쿠르비타신 B의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물(이하, 쿠쿠르비타신 B-U)의 구조는 하기 화학식 2와 같다:

[화학식 2]

.

쿠쿠르비타신 E의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물(이하, 쿠쿠르비타신 E-U)의 구조는 하기 화학식 3과 같다:

[화학식 3]

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본 발명의 단백질을 포함하는 조성물은 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체의 25번 탄소에 결합된 아세틸기를 특이적으로 탈아세틸화 할 수 있다.

상기 조성물은 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물의 25번 탄소에 결합된 아세틸기를 특이적으로 탈아세틸화 할 수 있다.

예를 들어, 상기 조성물은 쿠쿠르비타신 A의 25번 탄소에 결합된 아세틸기, 쿠쿠르비타신 B의 25번 탄소에 결합된 아세틸기, 쿠쿠르비타신 C의 25번 탄소에 결합된 아세틸기, 쿠쿠르비타신 E의 25번 탄소에 결합된 아세틸기, 쿠쿠르비타신 L의 25번 탄소에 결합된 아세틸기 또는 쿠쿠르비타신 Q의 25번 탄소에 결합된 아세틸기를 특이적으로 탈아세틸화 할 수 있다.

상기 조성물은 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체의 25번 탄소에 결합된 아세틸기를 특이적으로 탈아세틸화 할 수 있다.

예를 들어, 상기 조성물은 쿠쿠르비타신 B-U의 25번 탄소에 결합된 아세틸기 또는 쿠쿠르비타신 E-U의 25번 탄소에 결합된 아세틸기를 특이적으로 탈아세틸화 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물이 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체의 25번 탄소에 결합된 아세틸기를 특이적으로 탈아세틸화시키는 경로를 나타낸다. 이와 같이, 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물을 이용하면, 화학적인 방법으로 아세틸기를 제거하는 방법으로 유도체를 합성하는 경우와 달리, 원하는 위치에서 탈아세틸화된 생성물만 고효율로 합성할 수 있다는 장점이 있다. 즉, 원하는 화합물을 얻기 위해 분리 및 정제 과정을 거칠 필요가 없기 때문에 비용과 공정 측면에서 장점이 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 전술한 바와 같이 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체를 탈아세틸화 할 수 있을 뿐만 아니라, 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 쿠쿠르비타신 화합물 유도체의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기 또는 25번 탄소를 특이적으로 아세틸화 할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 조성물은 쿠쿠르비타신 화합물의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기에 특이적으로 아세틸화할 수 있으며, 예를 들어, 상기 조성물은 쿠쿠르비타신 D의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기 또는 쿠쿠르비타신 I의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기를 특이적으로 아세틸화 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 조성물은 쿠쿠르비타신 화합물 유도체의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기에 특이적으로 아세틸화 할 수 있으며, 예를 들어, 상기 조성물은 쿠쿠르비타신 D-U의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기 또는 쿠쿠르비타신 I-U의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기를 특이적으로 아세틸화 할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물을 이용하면, 화학적인 방법으로 아세틸기를 붙이는 방법으로 유도체를 합성하는 경우와 달리, 원하는 위치에서 아세틸화된 생성물만 고효율로 합성할 수 있다는 장점이 있다.

나아가, 본 발명은 전술한 단백질을 또는 이를 포함하는 조성물을 이용하여 적어도 하나의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체의 탈아세틸화 방법을 제공한다.

예를 들어, 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체의 탈아세틸화 방법은, 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물을 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 또는 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체와 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

전술한 바와 같이, 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물은 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 L 또는 쿠쿠르비타신 Q 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체는 쿠쿠르비타신 A의 유도체, 쿠쿠르비타신 B의 유도체, 쿠쿠르비타신 C의 유도체, 쿠쿠르비타신 E의 유도체, 쿠쿠르비타신 L의 유도체 또는 쿠쿠르비타신 Q의 유도체 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물은 쿠쿠르비타신 B일 수 있고, 그 구조는 하기 화학식 5와 같다:

[화학식 5]

.

상기 반응을 통해 상기 쿠쿠르비타신 B가 탈아세틸화된 생성물의 구조는 하기 화학식 6과 같다:

[화학식 6]

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상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물은 쿠쿠르비타신 E일 수 있고, 그 구조는 하기 화학식 7과 같다:

[화학식 7]

.

상기 반응을 통해 상기 쿠쿠르비타신 E가 탈아세틸화된 생성물의 구조는 하기 화학식 8과 같다:

[화학식 8]

.

상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체는 쿠쿠르비타신 B-U일 수 있고, 그 구조는 상기 화학식 2와 같다.

상기 반응을 통해 상기 쿠쿠르비타신 B-U가 탈아세틸화된 생성물의 구조는 하기 화학식 9와 같다:

[화학식 9]

.

상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 유도체는 쿠쿠르비타신 E-U일 수 있고, 그 구조는 상기 화학식 3과 같다.

상기 반응을 통해 상기 쿠쿠르비타신 E-U가 탈아세틸화된 생성물의 구조는 하기 화학식 10과 같다:

[화학식 10]

.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

[실시예]

1. 서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 재조합단백질 (아세틸전이효소 1; ACT1)의 생산

수박(citrullus spp.) 식물체로부터 total RNA를 추출하였고, oligo-dT prime 및 reverse transcription enzyme을 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 제작하였다. 상기 제작된 cDNA를 주형(template)으로 하여 forward primer, reverse primer 및 pfu DNA polymerase를 이용해서 polymerase chain reaction(PCR)법으로 ACT1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하였고, gel 전기영동법으로 상기 폴리뉴클레오타이드를 분리 및 정제하였다. 상기 forward primer의 서열은 서열번호 3(CAAATGGGTCGCGGATCCATGGGGACGATGAATTAC)과 같고, 이는 ACT1를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 개시코돈과 BamH1 제한효소 염기서열 (GGATCC)이 포함된 서열이다. 상기 reverse primer의 서열은 서열번호 4(GTGGTGGTGGTGCTCGAGATTGGCACTTGGGTTCAA)와 같고, 이는 종결코돈이 제외되고 Xho1 제한효소 염기서열(CTCGAG)이 포함된 서열이다. 상기 정제된 ACT1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 infusion cloning법으로 pET28a(+) 재조합 발현벡터에 클로닝 하였다.

상기 클로닝된 ACT1 재조합 발현벡터를 단백질 발현 E. coli인 BL21a1에 형질전환 시킨 후, LB(lysogeny broth) 배양액에서 1mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 16℃에서 180rpm으로 mixing 시켜 ACT1의 발현을 유도하였다.

ACT1이 유도된 배양액(2 리터)을 원심분리기를 이용하여 원심 분리하여 BL21a1 cell을 침전 시킨 후, 침전된 BL21a1 cell을 binding buffer(20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, pH7.4)에 현탁 시켰으며, sonicator를 이용하여 BL21a1 cell을 파쇄하였다. 파쇄된 BL21a1 cell을 원심분리하여 상층액을 회수한 후, Ni sepharose를 이용하여 His-tag된 ACT1를 분리하였고, binding buffer로 washing 후 Elution buffer(350~500mM imidazole, 20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, pH7.4)로 ACT1 용액을 회수 하였다.

회수된 ACT1 용액을 30KDa cut off centricon을 이용하여 농축하였고, storage buffer(10% glycerol, 50mM sodium phosphate, 0.1M sodium citrate, pH 7.4)로 교환 후 -80℃에 보관 하여 사용하였다.

2. ACT1 효소 반응

200μM의 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 또는 이의 유도체, 400μM의 acetyl-CoA(aceryl coenzyme A) 및 40㎍의 ACT1을 효소반응 buffer(50mM sodium phosphate buffer, pH7.4)에 넣고 30℃에서 1시간 동안 효소 반응 시켰다.

상기 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 또는 이의 유도체로 쿠쿠르비타신 B(이하, CuB), 쿠쿠르비타신 D(이하, CuD), 쿠쿠르비타신 E(이하, CuE), 쿠쿠르비타신 I(이하, CuI), 쿠쿠르비타신 B의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물(이하, CuB-U), 쿠쿠르비타신 D의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물(이하, CuD-U), 쿠쿠르비타신 E의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물 (이하, CuE-U) 및 쿠쿠르비타신 I의 16번 탄소 자리에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물 (이하, CuI-U)을 이용하였다.

각 반응의 결과물을 100% etyl acetate로 분획 하였으며, 분획 용액을 centrifugal vacuum concentrator로 건조 시켰고, 각각을 120μl의 100% 메탄올에 녹여 분석용 시료로 사용하였다.

각 기질(CuB, CuD, CuE, CuI, CuB-U, CuD-U, CuE-U, CuI-U)과 ACT1의 반응으로 얻어진 결과물로부터 얻어진 분석용 시료는 하기 표 1과 같다.

시료 1	시료 2	시료 3	시료 4
CuB+ACT1 효소반응 생성물	CuD+ACT1 효소반응 생성물	CuE+ACT1 효소반응 생성물	CuI+ACT1 효소반응 생성물
시료 5	시료 6	시료 7	시료 8
CuB-U+ACT1 효소반응 생성물	CuD-U+ACT1 효소반응 생성물	CuE-U+ACT1 효소반응 생성물	CuI-U+ACT1 효소반응 생성물

3. 효소 반응 결과물의 HPLC (high performance liquid chromatography) 분석

ACT1 효소 반응 결과를 확인하기 위해, HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 표 1의 각 시료를 분석하였다.

시료의 분석에 앞서, 각 시료의 표준폼에 대한 retention time을 확인하였다. 상기 표준폼은 각 시료의 기질로 사용된 물질이며, 구체적으로 시료 1의 표준폼은 CuB, 시료 2의 표준폼은 CuD, 시료 3의 표준폼은 CuE, 시료 4의 표준폼은 CuI, 시료 5의 표준폼은 CuB-U, 시료 6의 표준폼은 CuD-U, 시료 7의 표준폼은 CuE-U, 시료 8의 표준폼은 CuI-U 이다.

효소 반응 생성물 분석에 사용한 HPLC의 조건은 하기 표 2와 같다.

	조 건
장비	Pump, autosampler, UV detector(Shimadzu, Japan)
column	Syncronis C18, 250×4.6mn(Thermo Scientific, USA)
용매조건	A용매: 100% acetonitrile, 0.1% formic acidB용매: water, 0.1% formic acid Linear gradient: 30% A용매, 70% B용매(5min) 70% A용매, 30% B용매(20~30min) 30% A용매, 70% B용매(40~45min) Flow rate: 1ml/min
검출 파장	230nm

HPLC를 통해 시료 1 내지 시료 8을 각각 분석하였고, 각 시료의 표준폼에 대한 retention time과 같은 peak 외에, 다른 retention time의 peak가 검출되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 ACT1에 의해 효소 반응이 일어난 것을 알 수 있었다.

각 시료의 표준폼 및 시료에 대한 HPLC 결과는 도 2 내지 도 9에 나타나있다.

4. 효소 반응 결과물의 LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry) 분석

HPLC 분석에 따른 새롭게 검출된 물질의 분자량을 알아내기 위해 LC-MS 분석을 실시하였다.

효소 반응 생성물의 분자량 분석에 사용한 LC-MS의 조건은 하기 표 3과 같다.

	조 건
장 비	ACQUITY UPLC system, SYNAPT G2-Si HDMS (Waters)
Column	Waters Acquity BEH C18 1.7 μm (2.1 x 100mm) column temp.:40
용매조건	A용매: water, 0.1% formic acid B용매: 100% acetonitrile, 0.1% formic acid Linear gradient: 95% A용매, 5% B용매(initial) 95% A용매, 5% B용매(2.5min) 30% A용매, 70% B용매(5.0min) 30% A용매, 70% B용매(9.0min) 0% A용매, 100% B용매(9.5min) 0% A용매, 100% B용매(10.5min) 95% A용매, 5% B용매(11min) 95% A용매, 5% B용매(12min) Flow rate: 0.3ml/min
검출파장	230nm
질량분석 조건	Mode : ESI(-) Capillary voltage : 2 kV Source temp : 400 oC Sampling cone : 10 Desolvation Gas Flow (L/hr): 900.0

하기 표 4는 각 시료의 표준폼 및 효소 반응 생성물의 LS-MS 값을 나타낸다.

	시료 1의 표준폼 (CuB)	시료 2의 표준폼 (CuD)	시료 3의 표준폼 (CuE)	시료 4의 표준폼 (CuI)
LC-MS 값	603.3170	561.3064	601.3013	559.2908
	시료 1 (CuD)	시료 2 (CuB)	시료 3 (CuI)	시료 4 (CuE)
LC-MS 값	561.3057	603.3229	559.2921	601.3026
	시료 5 표준폼 (CuB-U)	시료 6의 표준폼 (CuD-U)	시료 7의 표준폼 (CuE-U)	시료 8의 표준폼 (CuI-U)
LC-MS 값	645.3275	603.3170	643.3119	601.3013
	시료 5 (CuD-U)	시료 6 (CuB-U)	시료 7 (CuI-U)	시료 8 (CuE-U)
LC-MS 값	603.3169	645.3334	601.3020	643.3136

LC-MS분석을 통해, 시료 1에 포함된 CuB+ACT1 효소반응 생성물은 CuB 가 탈아세틸화된 CuD(화학식 6의 구조)이고, 시료 2에 포함된 CuD+ACT1 효소반응 생성물은 CuD가 아세틸화된 CuB(화학식 5의 구조)이고, 시료 3에 포함된 CuE+ACT1 효소반응 생성물은 CuE가 탈아세틸화된 CuI(화학식 8의 구조)이며, 시료 4에 포함된 CuI+ACT1 효소반응 생성물은 CuI가 아세틸화된 CuE(화학식 7의 구조)이고, 시료 5에 포함된 CuB-U+ACT1 효소반응 생성물은 CuB-U가 탈아세틸화된 CuD-U(화학식 9의 구조)이고, 시료 6에 포함된 CuD-U+ACT1 효소반응 생성물은 CuD-U가 아세틸화된 CuB-U(화학식 2의 구조)이고, 시료 7에 포함된 CuE-U+ACT1 효소반응 생성물은 CuE-U가 탈아세틸화된 CuI-U(화학식 10의 구조)이며, 시료 8에 포함된 CuI-U+ACT1 효소반응 생성물은 CuI-U가 아세틸화된 CuE-U(화학식 3의 구조) 인 것이 확인되었다.

상기 분석 결과에 따라, 본 발명의 ACT1과 반응을 통해 아세틸기를 갖는 쿠쿠르비타신 화합물 및 이의 유도체의 25번 탄소에 결합된 아세틸기가 특이적으로 탈아세틸화 되거나, 쿠쿠르비타신 화합물 및 이의 유도체의 25번 탄소에 결합된 하이드록시기가 특이적으로 아세틸화 되는 것을 확인하였다.

<110> SEJONG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for deacetylation and method using the same <130> 19P01031 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT1 <400> 1 Met Glu Ser Ala Leu Lys Val Lys Ile Ile His Glu Glu Asn Ile Lys 1 5 10 15 Pro Ser Ile Pro Thr Pro Gln Thr Gln Asn His Val Lys Phe Ser Phe 20 25 30 Leu Asp Gln Leu Ala Leu Pro Val Tyr Val Pro Leu Leu Leu Phe Tyr 35 40 45 Thr Pro Asn His Asn Pro Ile Pro Ser Lys Ser His Leu Leu Lys Ser 50 55 60 Ser Leu Ser Lys Thr Leu Thr Leu Phe Tyr Pro Phe Ala Gly Arg Val 65 70 75 80 Asn Asp Asp Asn Leu Ser Ile Ser Cys Thr Asp Gln Gly Ala Ile Tyr 85 90 95 Val Glu Ala Glu Ala Asn Ser Pro Leu Ser Asn Ile Leu Thr Gln Leu 100 105 110 Asn Val Asp Ser Leu Asn Gln Leu Leu Pro Phe Pro Asn Ala Ser Ala 115 120 125 His Ala Asn Lys Gly Cys Ile Val Leu Ile Gln Thr Thr Phe Phe Pro 130 135 140 Cys Gly Gly Ile Thr Val Gly Leu Leu Ile Ser His Lys Ile Ala Asp 145 150 155 160 Ala Ser Ser Ile Ser Ser Phe Val Lys Thr Trp Thr Ser Ile Ala Ile 165 170 175 Ser Gly Asn Asp Ser Leu Phe Pro Lys Pro Glu Phe Ile Gly Asp Ser 180 185 190 Val Leu Pro Ala Pro Lys Asp Phe Pro Val Ala Thr Pro Thr Thr Pro 195 200 205 Asp Ser Gly Ile His Ala Lys Gly Val Thr Lys Arg Ile Val Phe Ser 210 215 220 Ala Ser Lys Ile Ala Ser Leu Lys Ala Lys Ala Ala Ser Thr Lys Val 225 230 235 240 Lys Gln Pro Thr Arg Val Glu Ala Val Ala Gly Leu Leu Trp Lys Ser 245 250 255 Ala Ile Ser Ala Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ile Ser Lys Ala Ser Val 260 265 270 Leu Gly Gln Ala Val Asn Leu Arg Lys Arg Leu Glu Pro Asn Leu Gly 275 280 285 Asp Thr Ser Ile Gly Asn Ser Leu Gly Phe Val Thr Pro Glu Thr Ala 290 295 300 Val Ala Ala Glu Ile Asp Leu Gln Gly Thr Val Gly Leu Leu Arg Glu 305 310 315 320 Ala Ile Glu Glu Phe Lys Glu Ser Gly Tyr Lys Lys Tyr Gln Asp Thr 325 330 335 Glu Ala Tyr Leu Arg His Phe Lys Thr Leu Thr Asp Pro Asp Gly Pro 340 345 350 Tyr Ser Gly Glu Lys Asn Phe Tyr Leu Cys Ser Ser Trp Ser Arg Phe 355 360 365 Gln Phe Tyr Glu Ala Asp Phe Gly Trp Gly Leu Pro Val Trp Phe Ile 370 375 380 Gly Gly Ile Ser Met Phe Ser Asn Phe Phe Leu Leu Met Asp Thr Arg 385 390 395 400 Asp Gly Lys Gly Ile Glu Ala Leu Val Thr Leu Ser Glu Glu Asp Met 405 410 415 Ala Val Phe Gln Cys Asp Gln Asp Leu Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asn 420 425 430 Pro Asn Val Leu Gln Leu Gln His 435 440 <210> 2 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT1 <400> 2 atggagtcag cattgaaagt aaagatcatc catgaggaaa acatcaaacc ttccattcca 60 acgcctcaaa cccaaaacca tgtgaaattc tccttcttag atcaactagc tttgcctgtt 120 tatgttccat tacttctttt ctacactccc aaccacaatc caattccttc caaatcccac 180 cttctaaaat cttcattatc caaaacttta accctatttt acccatttgc aggtcgagtt 240 aacgatgaca atctctccat ttcttgtact gaccaaggcg ctatctatgt cgaagctgaa 300 gccaattccc ctctctccaa tattctcact caactcaacg ttgattccct caaccaactc 360 ctcccttttc ccaacgcatc cgcccacgct aacaaaggct gtattgtgct catccaaact 420 acgttctttc catgcggtgg cattaccgtt ggtttactca tttcgcacaa gattgccgac 480 gcctcctcca ttagttcctt cgtcaaaacc tggacttcca tagccatttc cgggaatgat 540 tctctgtttc cgaaaccaga gttcattggc gactctgttt tgccggcccc taaggatttc 600 ccagttgcaa ctccaacaac cccagattca ggaattcacg caaaaggcgt aaccaagaga 660 atcgttttct ccgcttccaa aatcgcttcc ctcaaagcta aggctgctag tacaaaggta 720 aagcaaccga cacgtgtgga agctgtagct ggtttgttat ggaaatctgc catatctgct 780 gccaaagcaa cgtccgggat ttcaaaggcg tctgtgctag gccaagccgt gaatctacgg 840 aaaagattgg aacccaactt gggcgataca tccatcggga attctctcgg gttcgttacg 900 ccggagacgg cggtggcagc ggagatagac ctgcagggaa cagtggggtt gttgagggaa 960 gcgattgaag aatttaagga aagtgggtac aagaaatatc aagatacgga ggcttatttg 1020 aggcatttta aaactctgac agatccagat ggtccgtaca gtggggagaa gaatttctac 1080 ttgtgtagta gctggagcag atttcaattt tatgaagcgg attttgggtg gggattgcct 1140 gtttggttca ttggagggat ttcaatgttt tccaattttt tcttgctgat ggatacaaga 1200 gatggaaagg gaattgaagc gttggtgact ttgagtgaag aagacatggc tgtgtttcaa 1260 tgtgatcaag atttgcttgc atttgcttca ttcaatccca atgttcttca gctccaacac 1320 taa 1323 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT1_forward primer <400> 3 caaatgggtc gcggatccat ggggacgatg aattac 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT1_reverse primer <400> 4 gtggtggtgg tgctcgagat tggcacttgg gttcaa 36

Claims (6)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 포함하는,
   쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 B의 16번 탄소에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물, 및 쿠쿠르비타신 E의 16번 탄소에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 25번 탄소에 결합된 아세틸기를 탈아세틸화 하는 탈아세틸화용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 청구항 1의 조성물을 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 B의 16번 탄소에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물, 및 쿠쿠르비타신 E의 16번 탄소에 결합된 하이드록시기가 아세틸화된 화합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나와 반응시키는 단계를 포함하는 탈아세틸화 방법.
5. 삭제
6. 삭제

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