KR20120069693A - 지질 생산을 위한 유전자 변형 생물체 - Google Patents

지질 생산을 위한 유전자 변형 생물체 Download PDF

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크리스티네 랑
안드레아스 라프
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오르가노발란스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 대응 야생형 생물체에 비해 아실-CoA:스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26) 및/또는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20) 및/또는 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158) 및/또는 아실 CoA-왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)의 활성이 감소하거나 또는 제거된, 분리된 유전자 변형 비-포유류 생물체, 이러한 생물체를 이용하는 방법, 이러한 생물체를 생산하기 위한 셔틀 매개물, 및 이러한 생물체를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

지질 생산을 위한 유전자 변형 생물체{GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF LIPIDS}
본 발명은 특정 효소 활성이 감소 및/또는 증가하고 지질, 특히 중성 지질의 산업적 생합성에 유용한 유전자 변형 비-포유류 생물체, 특히 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 생물체의 용도, 이러한 생물체를 만들기 위한 셔틀 매개물 및 이러한 생물체를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.
지질은 그 전부 또는 일부가 지방산 또는 폴리케타이드와 같은 티오에스테르의 탄소 음이온을 이용하는 축합반응 및/또는 프레놀 또는 스테롤과 같은 이소프렌 단위의 탄소 양이온을 이용하는 축합반응에 의해 비롯된 소수성 또는 양친매성의 작은 분자이다. 이 지질류는 경제적 중요성이 높은 여러 개의 물질을 포함한다. 트리아실글리세롤-지질류는 광범위한 각종 분야, 예를 들면 식품 성분 또는 조리용 성분으로서, 비누, 피부용 제품, 향수와 기타 개인위생과 화장품 제조용으로, 도료와 기타 목재 처리 제품 제조용으로, 전기 산업에서 생분해성 절연체로서, 생분해성 유압유 제조용으로, 윤활제로서 또는 나아가 종래의 디젤을 대체하기 위해 사용될 수 있는 바이오디젤의 기본원료로서 사용되는 오일, 지방 또는 왁스를 포함한다. 이소프레노이드-지질 스쿠알렌은 예를 들면 일반의약품뿐 아니라 백신 또는 기타 약제, 영양제, 화장품의 보조제로서 사용되고 있다. 스쿠알렌은 테르펜 합성을 위한 구성요소로서 사용될 수도 있다. 더 나아가 스쿠알렌은 생분해성 윤활제로서 산업적으로 사용될 수 있다. 다른 경제적으로 중요한 지질로는 사포닌, 스테로이드 호르몬, 비타민과 약제학 물질과 같은 화합물을 제조하기 위한 중추적인 출발물질로서 활용되는 에르고스테롤, 자이모스테롤, 에피스테롤, 7-데히드로콜레스테롤 또는 라노스테롤과 같은 스테롤이 있다.
지질, 특히 중성 지질은 보통 지질 입자로서 알려진 세포 안에 있는 특정 세포내 소기관에 저장된다. 이들 입자는 매우 소량의 단백질이 묻혀있는 소수성이 높은 단일층으로 이루어진 단순한 구조를 특징으로 한다. 지질은 가수분해에 의해 지질의 성분이 대사 및/또는 이화 경로로 복귀할 때까지 지질 입자 안에 저장된다. 이러한 지질 저장 형성 과정은 자연계에서 널리 이용되고 있고 모든 종류의 진핵세포들은 지질체, 지방 소적, 오일체 또는 올레오좀이라고도 할 수 있는 세포내 지질 입자를 함유한다. 효모 사카로마이세스 세레비시아에에는 지방 소적이 세포의 총 지질 함량의 70%까지 축적된다.
언급한 지질들의 대부분은 식물, 동물 또는 미생물과 같은 천연물로부터 유도될 수 있기 때문에 생체 세포 안에 지질의 양을 증가시키려는, 즉 지질 입자 안에 더욱 많은 지질을 축적시키려는 시도가 있었다. 이를 위해서 생물체의 대사경로를 변경하는 것이 알려져 있다. 문헌 EP-O 486 290 A는 효모 내 에르고스테롤 대사작용의 유전자를 과발현하여 세포 안에 에르고스테롤의 양을 증가시키는 것을 기재하고 있다. 문헌 WO03/064652 A는 라노스테롤-C14-데메틸라아제와 HMG-CoA-리덕타아제 활성의 증가를 바탕으로 자이모스테롤을 생산하기 위한 방법을 개시하고 있다. 문헌 WO2004/083407 A에는 Δ22-데사투라아제 활성이 감소하고 HMG-CoA 리덕타아제, 라노스테롤 C14-데메틸라아제, 스쿠알렌 에폭시다아제와 스쿠알렌 신테타아제의 활성이 증가된 유전자 이식 생물체가 기재되어 있다. 이들 생물체는 스테롤 지질 에르고스타-5,7-디엔올을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 지질을 생산하는 생물체를 생물학적으로 변형시켜 지질의 생산 수율을 크게 증가시킬 수 있다.
그러나 수득된 지질 화합물은 대부분 순수하지 않고 혼합물 상태로, 특히 추가 화학합성 또는 변형을 위한 출발물질로서 사용하고자 하는 경우에는 분리 및/또는 정제할 필요가 있다. 또한 임의의 정제 과정, 특히 산업적 규모로 실시하는 경우에는 많은 비용과 노동력이 소요되며 환경을 오염시키는 경향이 있다.
따라서 본 발명의 근본적인 기술적 문제는 노동 및 비용 집약적인 정제 과정을 피하기 위해 더욱 순수한 형태의 생물체에 의한 지질 생산을 가능하게 하는 수단과 방법을 제공하는 것을 포함한다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해서 본 발명은 청구범위 제1항에 따른 생물체를 교시한다. 바람직한 실시형태들은 제1항의 종속항에 구체화되어 있다. 본 명세서에서 "유전자 변형"이라 함은 종래기술의 유전자 공학 방법에 의해 게놈이 변형된 생물체들뿐 아니라 원하는 유전자 변형(종래의 돌연변이 생성)에 따른 돌연변이체 군으로부터 선택된 생물체들을 포함하는 것으로 한다.
본 발명은 생물체를 유전자 조작하거나 생화학적으로 변형시켜 특정(중성) 지질을 지질 입자에 더욱 순수한 형태로 축적할 수 있다는 발견을 바탕으로 한다. 본 발명의 생물체는 생물체에 의해 더욱 높은 순도로 생산하고자 하는 지질에 따라 원치 않는 스테릴 아실 에스테르 및/또는 트리아실글리세롤 및/또는 왁스 에스테르를 합성하지 못하게 하거나 합성을 감소시키는 방법으로 변형된다. 중성 지질을 더욱 순수한 형태로 축적하는 것 외에, 오염 가능성이 있는 스테릴 아실 에스테르 및/또는 트리아실글리세롤 및/또는 왁스 에스테르를 감소시키거나 제거하면 놀랍게도 원하는 지질의 농도와 수율이 증가하기도 한다. 이것은 지질 입자 안에 저장 공간이 증가하고/또는 원하는 지질의 합성을 위한 기질의 이용 가능성이 증가하기 때문일 수 있지만 이 이론에 구애되는 것은 아니다.
용어 "중성 지질"은 전하를 띤 기가 없어 실질적인 양으로 이중막에 통합할 수 없는 지질에 관한 것이다. 상기 용어는 트리아실글리세롤(TAG), 스테릴아실 에스테르(SAE)와 왁스 에스테르(WE)를 포함한다. 스쿠알렌은 "중성 지질"류로 분류되기도 한다. 보통 지질 입자의 내용물은 재조합 생물체에서 원하는 특정 중성 지질의 효율적인 생산을 방해하는 서로 다른 중성 지질들의 혼합물이다. 이 문제는 생산자 생물체를 변형시켜 상기 생물체에서 자연 발생하는 적어도 1종의 중성 지질을 지질 입자에서 더 이상 합성되지 않도록 하는 본 발명에 의해 극복된다. 그 결과, 지질 입자 내 함유된 잔류 중성 지질의 조성이 더욱 순수하게 되어 상업적인 목적으로 생산하는데 더욱 유리하게 된다.
일반적으로 더욱 높은 순도로 합성하고자 하는 중성 지질에 따라 또는 한편으로는 원하지 않는 오염물질로서 생합성에서 제거하고자 하는 중성 지질에 따라 청구범위 제1항에 따른 어느 하나의 활성 또는 서로 다른 활성(2, 3 또는 4개의 활성)의 조합을 채용할 수 있다. 이에 따라 본 발명에는 다양한 실시형태들이 존재하며 몇몇 특정 실시형태들만을 이하에서 더욱 상세하게 기재할 것이다.
본 발명에 따른 제1실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 더 이상 스테릴 아실 에스테르(SAE)를 합성하지 않도록 변형된다. 스테릴 아실 에스테르는 장쇄 지방산과 스테롤의 에스테르이다. 일반적으로 SAE는 세포 안에서 아실-CoA: 스테롤 아실 트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26)를 포함하는 효소 메커니즘에 의해 합성된다. 상기 촉매화된 반응은 장쇄 지방산과 스테롤의 에스테르화 반응이다. 본 발명에 따른 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 아실-CoA: 스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26)의 활성이 감소하도록 변형된다.
효모, 특히 S. 세레비시아에에서 스테릴 아실 에스테르를 생산하는 스테롤 에스테르화 반응은 서로 다른 스테롤 중간체에 대한 서로 다른 특이적 친화성을 갖는 스테릴 아실 트랜스퍼라아제의 2개의 동종 효소, 즉 Are1p와 Are2p에 의해 이루어진다. Are1p는 특히 라노스테롤, 자이모스테롤, 에르고스타-5,7-디엔올 및 7-데히드로 콜레스테롤과 같이 효모와 관계없는 물질들과 같은 에르고스테롤 전구체의 에스테르화 반응을 일으킨다. Are2p는 우선적으로 효모에서 에르고스테롤 생합성 경로의 최종 산물인 에르고스테롤의 에스테르화 반응을 일으킨다. 상기 생물체가 특히 사카로마이세스속의 효모 생물체, 특히 S. 세레비시아에인 경우, Are1p 또는 Are2p 또는 둘 다, 즉 Are1p와 Are2p의 활성은 대응 비-변형 효모 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 감소하거나 또는 없을 수 있다. 이 2개의 효소 활성이 모두 제거되면 세포에서 스테롤의 에스테르화 반응이 일어나지 않는다. 하나의 활성을 제거하고 나머지 하나의 활성만을 유지함으로써 그에 따라 특정 스테롤로 나타나는 효소 활성이 생물체에서 유지되거나 적응되면 경우에 따라 세포 내 특정 종류의 스테릴 아실 에스테르를 얻을 수 있다.
생물체가 스테릴 아실 에스테르를 더 이상 합성하지 않는 것을 특징으로 하는 본 발명의 제1태양과 관련하여, 본 발명에 따른 생물체는 일반적으로 가능한 모든 생물체, 식물 생물체, 진균 생물체 또는 박테리아 생물체일 수 있다. 그러나 상기 생물체는 바람직하게는 그의 지질 입자에 자연발생적으로 왁스 에스테르를 저장하지 않고 트리아실글리세롤과 스테릴 아실 에스테르와 같은 다른 지질만을 저장하는 생물체로부터 유도된다. 이에 따라 스테릴 아실 에스테르의 합성을 위한 생합성 경로를 제거함으로써 이러한 생물체는 그의 지질 입자에 기본적으로 트리아실글리세롤만을 축적하게 됨으로써 이러한 생물체의 지질 입자로부터 트리아실글리세롤이 좀더 순수한 형태로 생산하도록 한다. 자연발생적으로 그의 지질 입자에 왁스 에스테르를 축적하지 못하는 생물체에 대한 예로는 특히 대부분의 동물, 진균 세포 및 조류와 플랑크톤 세포를 제외한 대부분의 식물 세포가 있다. 본 발명의 제1태양과 관련하여 특히 바람직한 실시형태에 있어서 상기 생물체는 진균 생물체, 바람직하게는 야로위아, 로도토룰라, 리포마이세스, 칸디다, 로도스포리디움, 모르티에렐라, 무코르, 사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 아스페르길루스, 페니실리움과 딕티오스텔리움으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 진균 생물체이다. 특히 야로위아 리폴라이티카, 로도토룰라 글루티니스, 리포마이세스 스타르케이, 칸디다 쿠르바타, 로도스포리디움 토르툴로이데스, 모르티에렐라 이사벨리나, 무코르 자보니쿠스, 사카로마이세스 세레비시아에, 피키아 파스토리스, 클루이베로마이세스, 아스페르길루스종, 페니실리움종 또는 딕티오스텔리움종의 진균 생물체가 바람직하다. 본 발명의 제1태양의 특히 바람직한 실시형태에 있어서 상기 생물체는 S. 세레비시아에이다.
제2실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 더 이상 스테릴 아실 에스테르(SAE)와 왁스 에스테르(WE)를 합성하지 않도록 변형된다.
일반적으로 세포 안에서 WE의 합성은 아실 CoA-왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)를 포함하는 효소 메커니즘에 의해 이루어진다. 이에 따른 본 발명의 제2태양의 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 아실-CoA: 스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26)와 아실 CoA-왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)의 활성이 감소하도록 변형된다.
본 발명의 제2태양과 관련하여 본 발명에 따른 생물체는 스테릴 아실 에스테르와 왁스 에스테르의 합성이 감소, 바람직하게는 완전히 합성되지 않기 때문에 지질 입자에 주로 트리아실글리세롤을 축적한다. 따라서 이러한 생물체는 트리아실글리세롤을 더욱 순수한 형태로 특히 산업적 규모로 제조하기에 적합하다.
본 발명의 제2태양에 따른 생물체는 바람직하게는 자연발생적으로 왁스 에스테르를 생산하여 지질 입자에 세포 내 저장하는 생물체로부터 유도된다. 왁스 에스테르를 생산하여 저장하는 생물체의 예로는 조직의 소수성 코팅을 제공하여 표면의 탈수를 최소화하는 식물류와 곤충류, 조류, 플랑크톤 생물체 및 박테리아가 있다. 본 발명의 제2태양의 바람직한 실시형태에 있어서 상기 생물체는 바람직하게는 마이코박테리움, 스트렙토마이세스, 로도코쿠스, 노카르디아, 바실루스, 코라이네박테리움, 대장균 또는 락토바실루스속의 박테리아 생물체이다. 더 바람직하게는 상기 생물체는 대장균이다.
게다가 본 발명에 따른 이러한 생물체에서는 상기 생물체 내에서 트리아실글리세롤을 자연발생적으로 생산하거나 상기 생물체 내에서 자연발생적으로 생산되는 양으로 트리아실글리세롤을 생산할 수 있을 뿐 아니라 이러한 생물체를 유전자 변형시켜 상기 생물체에서 자연발생적으로 생산되는 하나 이상의 특정 트리아실글리세롤의 양을 증가시키거나 이러한 생물체를 유전자 변형시켜 이러한 생물체에 의해 자연발생적으로 생산되지 않는 하나 이상의 트리아실글리세롤의 합성을 유도할 수도 있다.
특히 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체에 의해 축적되는 트리아실글리세롤은 글리세롤과 적어도 하나의 불포화 지방산의 에스테르이고, 더 바람직하게는 상기 불포화 지방산은 오메가-3 지방산이다. 일반적으로 상기 오메가-3 지방산은 가능한 모든 오메가-3 지방산일 수 있지만, 바람직하게는 α-리놀렌산(ALA), 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사펜타엔산(DPA) 또는 도코사헥산엔산(DHA)이다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서 상기 트리아실글리세롤에서 불포화 지방산은 오메가-6 지방산이다. 일반적으로 상기 오메가-6 지방산은 가능한 모든 오메가-6 지방산일 수 있지만, 바람직하게는 리놀레산, 감마-리놀렌산, 에이코사디엔산, 디호모-감마-리놀렌산, 아라키돈산, 도코사디엔산, 아드렌산, 도코사펜타엔산 또는 칼렌드산이다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서 상기 트리아실글리세롤에서 불포화 지방산은 오메가-9 지방산이다. 일반적으로 상기 오메가-9 지방산은 가능한 모든 오메가-9 지방산일 수 있지만, 바람직하게는 올레산, 에이코센산, 미드산, 에루스산 또는 네르본산이다.
상기 제1 및 제2실시형태는 후술하는 바와 같이 더욱 개선될 수 있다. 트리아실글리세롤은 일반적으로 장쇄 지방산 또는 인지질과 디아실글리세롤의 에스테르화 반응에 의해 형성된다. 상기 장쇄 지방산과의 에스테르화 반응은 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20)에 의해 촉매화된다. 상기 인지질과의 에스테르화 반응은 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)에 의해 촉매화된다. 특히 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제1 또는 제2태양에 따른 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20)의 활성 및/또는 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)의 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다. 위에서 언급한 2개의 효소 중 하나 또는 둘 다 모두의 활성 증가는 생물체의 세포에서 TAG의 합성 증가로 나타난다.
이외에도, 상기 생물체를 유전자 변형시켜 생물체가 특정의 지방산을 생산하여 TGA에 도입될 수 있도록 하거나 또는 이미 지방산이 이러한 생물체에서 자연발생적으로 생산되는 경우에는 이러한 지방산의 생산을 증가시켜 상기 생물체에서 생산되는 TGA 내 지방산의 함량을 증가시킬 수도 있다. 예를 들면 상기 생물체에서 생산되는 TGA 내 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사펜타엔산(DPA) 및/또는 도코사헥산산(DHA)과 같은 오메가-3 지방산의 양을 증가시키고자 하는 경우에는 다음과 같은 효소 활성을 증가시키는 것이 유리할 것이다: Δ12 지방산 데사투라아제(EC 1.14.19), Δ15-데사투라아제(EC 1.14.19), Δ6 지방산 데사투라아제(EC 1.14.19.3), 지방산 엘롱가아제, Δ5-데사투라아제/Δ5-지방산 데사투라아제(EC 1.14.19) 및 Δ4 지방산 데사투라아제(EC 1.14.19). 본 발명에 따른 바람직한 실시형태에 있어서 상기 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20) 및/또는 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)의 활성 및 Δ12 지방산 데사투라아제(EC 1.14.19), Δ15-데사투라아제(EC 1.14.19), Δ6 지방산 데사투라아제(EC 1.14.19.3), 지방산 엘롱가아제, Δ5-데사투라아제/Δ5-지방산 데사투라아제(EC 1.14.19)와 Δ4 지방산 데사투라아제(EC 1.14.19)로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 중 적어도 하나의 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다. 예를 들면 식물류와 몇몇 진균류는 오메가-3과 오메가-6 지방산을 생산할 수 있는 반면에, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시아에는 오메가-9 지방산을 합성할 뿐이다. 이에 따라 본 발명에 따른 생물체가 사카로마이세스 세레비시아에인 경우에는 오메가-3 및/또는오메가-6 지방산을 생산하는데 필요한 효소 활성들을 세포에 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 적절한 유전자를 효모 세포에 도입하는 방법과 상기 적절한 유전자가 이미 문헌에 기재되었다(예를 들면 WO2004/101575 참조). 예를 들면 효모 세포에서 특정 지방산의 이종 생합성이 예를 들면 Beaudoin 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(2000), 6421-6426)과 Veen 등(Appl. Microbiol. Biotechnol. 63(2004), 635- 646)에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1 또는 제2태양의 생물체를 배양하는 것을 포함하는 트리아실글리세롤의 생산 방법에 관한 것이다. 상술한 바와 같이 이들 생물체는 이들의 지질 입자에 다량의 트리아실글리세롤을 기본적으로 순수한 형태로 축적할 수 있다. TAG는 상기 생물체로부터 본 기술 분야에 잘 알려진 방법에 따라 분리할 수 있다. 예를 들면 세포로부터 지질 입자를 분리하는 방법과 이들을 그 안에 함유된 중성 지질로부터 분리하는 방법이 알려져 있다. 이러한 방법의 일례로서 생물체 사카로마이세스 세레비시아에에 대해서 후술하는 실시예에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 글리세롤과 적어도 하나의 불포화 지방산의 에스테르인 트리아실글리세롤을 생산하기 위한 방법으로서,
(i) 아실-CoA: 스테롤 아실-트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26) 및/또는 아실 CoA-왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)의 활성을 억제제에 의해 감소 또는 제거하고;
(ii) 생물체에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제 /디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20) 및/또는 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)의 활성을 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 증가시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 생물체는 배양되고 TAG는 분리될 수 있다.
생산될 트리아실글리세롤에 함유될 불포화 지방산(들)과 관련하여, 다가 불포화 지방산(들)과 증가할 효소 활성의 속성에 대해 위에서 이미 기재한 것과 동일한 바가 바람직한 실시형태에 대해 적용된다. 특히 바람직한 실시형태에 있어서 상기 다가 불포화 지방산은 오메가-3 지방산이고 증가되는 효소 활성은 오메가-3 지방산과 관련하여 위에서 언급한 것들 중 적어도 하나이다.
제3실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 트리아실글리세롤(TAG)과 스테릴 아실 에스테르(SAE)를 더 이상 합성하지 않도록 변형된다. 상술한 바와 같이, 일반적으로 TAG의 합성은 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20)와 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)의 효소 활성에 의해 이루어진다. 이에 따른 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 아실-CoA: 스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26), 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20)와 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)의 의 활성이 감소하도록 변형된다.
바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제3태양에 따른 생물체는 왁스 에스테르를 자연발생적으로 생산하여 저장하는 생물체로부터 유도되는 생물체이다. 이러한 생물체는 이미 위에 기재되어 있다. 상기 생물체는 바람직하게는 이미 위에 기재된 바와 같은 박테리아 생물체이고, 가장 바람직하게는 상기 생물체는 대장균이다. TAG와 SAE의 합성을 못하게 하여 이러한 생물체는 그의 지질 입자에 왁스 에스테르를 주로 축적하기에 적합할 것이다. 특히 바람직한 실시형태에 있어서 이러한 생물체는 게다가 대응 비-변형 균주, 바람직하게는 대응 야생형 균주에 비해 아실-CoA 왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)의 활성 증가를 나타내는 것을 특징으로 한다. 이렇게 함으로써 생물체에서 합성되는 왁스 에스테르의 양은 증가할 것이다. 생물체의 세포에서 원하는 효소의 활성을 증가시키기 위한 수단과 방법은 당업자에게 알려져 있고 아래에 더 기재되어 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제3태양에 따른 생물체는 자연발생적으로 왁스 에스테르를 생산하여 저장하지 않는 생물체로부터 유도된다. 이러한 생물체는 본 발명의 제1태양과 관련하여 위에 기재하였다. 바람직하게는 이러한 생물체는 위에 기재한 진균 생물체, 더 바람직하게는 사카로마이세스속의 진균 생물체, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에종의 진균 생물체이다. TAG와 SAE의 합성을 못하게 함으로써 이러한 생물체의 지질 입자는 대상 지질, 예를 들면 아래에서 추가 기재되어 있는 스쿠알렌을 축적하기 위해 사용될 수 있다.
제4실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 왁스 에스테르(WE), 트리아실글리세롤(TAG)과 스테릴 아실 에스테르(SAE)를 더 이상 합성하지 않도록 변형된다. 이와 관련하여 상기 생물체는 기본적으로 그의 지질 입자에 WE, TAG와 SE를 저장하지 않는다. 이러한 생물체는 그의 구체적으로 바라는 지질이 지질 입자로 지향되는 생물체를 고안하는데 특히 유용하다. 예를 들면 이러한 생물체에 핵산 분자를 도입하여 이후 지질 입자에 축적되는 또 다른 종류의 지질을 합성하도록 할 수 있다. 이렇게 함으로써 지질 입자에서 기본적으로 순수한 원하는 지질을 합성할 수 있는 생물체가 제공될 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제4태양에 따른 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 아실-CoA: 스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26), 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20), 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)와 아실 CoA-왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)의 활성이 감소하도록 변형된다.
제5실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 지질 입자에 축적되는 중성 지질을 세포(들)에서 생산하고 유전자 변형되어 트리아실글리세롤(TAG)을 더 이상 합성하지 않아 그의 지질 입자에서 자연발생적으로 발생하는 상기 트리아실글리세롤을 상기 입자에 더 이상 함유하지 않게 되는 생물체이다. 상술한 바와 같이, TAG의 합성은 일반적으로 예를 들면 효모에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20)와 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)의 효소 활성에 의해 이루어진다. 이에 따른 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제5태양에 따른 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20)와 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)의 활성이 감소하도록 유전자 변형된다.
본 발명의 제5태양의 바람직한 실시형태에 있어서 상기 생물체는 왁스 에스테르를 자연발생적으로 생산하여 그의 지질 입자에 저장하지 않는 생물체로부터 유도된다. 이러한 생물체는 위에서 기재하였다. 상기 생물체는 바람직하게는 상술한 바와 같은 진균 생물체이고, 더 바람직하게는 사카로마이세스속의 진균 생물체이며, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에종의 진균 생물체이다.
제6실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 지질 입자에 축적되는 중성 지질을 세포(들)에서 생산하고 유전자 변형되어 왁스 에스테르를 더 이상 합성하지 않아 그의 지질 입자에서 자연발생적으로 발생하는 트리아실글리세롤(TAG)과 왁스 에스테르(WE)를 상기 입자에 더 이상 함유하지 않게 되는 생물체이다. 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제6태양에 따른 생물체는 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20), 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)와 아실 CoA-왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)의 활성이 감소하도록 유전자 변형된다.
바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제5 또는 제6태양에 따른 생물체, 즉 트리아실글리세롤을 더 이상 합성하지 않거나 트리아실글리세롤과 왁스 에스테르를 더 이상 합성하지 않는 생물체는 그의 지질 입자에 스테롤 지질의 아실 에스테르를 축적할 수 있다. 지질 입자에 스테롤 지질의 아실 에스테르가 축적되는 것은 상기 생물체가 자연발생적으로 이러한 에스테르를 합성한다는 사실 또는 스테롤 지질의 아실 에스테르의 생합성을 일으키는 적절한 효소를 암호화하는 유전자가 세포에 도입되었다는 사실 때문일 수 있다.
콜레스테롤과 그의 유도체와 같은 스테롤 지질은 글리세로인지질과 스핑고마이엘린과 함께 막 지질의 중요한 성분이다. 동일한 접합 4-고리 중심 구조를 함유하기도 하는 스테로이드는 호르몬과 신호전달 분자로서 서로 다른 생물학적 역할을 갖는다. C18 스테로이드는 에스트로겐 계열을 포함하는 반면, C19 스테로이드는 테스토스테론과 안드로스테론과 같은 안드로겐을 포함한다. C21 세부분류는 당류 코르티코이드와 염류 코르티코이드뿐만 아니라 프로게스토겐도 포함한다. 다양한 형태의 비타민 D를 포함하는 세코스테로이드는 중심 구조의 B 고리가 개열되어 있는 것을 특징으로 한다. 스테롤의 다른 예에는 포유류에서 콜레스테롤의 산화된 유도체이고 간에서 합성되는 담즙산과 이들의 접합체가 있다.
바람직한 실시형태에 있어서 상기 스테롤 지질은 스테롤 또는 스테로이드이다. 스테로이드는 일반적으로 6-6-6-5 방식으로 배치된 4개의 접합 고리를 가진 탄소 골격을 특징으로 하는 테르페노이드 지질이다. 스테로이드는 이들 고리에 붙어있는 작용기와 고리의 산화상태에 따라 달라진다. 수백 개의 분명한 스테로이드가 식물, 동물과 진균에서 발견되어 있다. 모든 스테로이드는 세포에서 스테롤 라노스테롤(동물과 진균)이나 스테롤 시클로아르테놀(식물)로부터 생산된다. 이 2개의 스테롤은 트리테르펜 스쿠알렌의 고리화 반응으로부터 유도된다. 스테로이드는 에스트로겐, 프로게스테론과 테스토스테론을 포함한다.
스테롤(또는 스테로이드 알코올)은 A-링의 3-위치에 히드록시기를 갖는 스테로이드의 하위 군이다. 이들은 아세틸-조효소 A로부터 합성된 양친매성 지질이다. 전체 분자는 매우 편평하다. A 고리에 있는 히드록시기는 극성이다. 나머지 지방족 사슬은 비극성이다. 식물의 스테롤은 파이토스테롤이라 하고 동물의 스테롤은 주스테롤이라 한다. 가장 중요한 주스테롤은 콜레스테롤과 몇몇 스테로이드 호르몬이고; 가장 중요한 파이토스테롤은 캄페스테롤, 시토스테롤과 스티그마스테롤이다. 스테롤은 진핵 생물체의 생리학에서 필수적인 역할을 한다. 예를 들면 콜레스테롤은 세포막의 유동성에 영향을 주고 발생 신호전달에서 제2의 전달체로서 작용하는 세포막의 일부를 형성한다. 식물 스테롤은 또한 인체의 장에서 콜레스테롤 흡수 부위를 차단하여 인체 내에서 콜레스테롤 감소를 보조하는 것으로 알려져 있다. 인체에서 스테롤은 중요한 신호 및 예를 들면 24시간 주기 리듬, 혈액 응고와 같은 대사정보를 제공하는 작용을 한다.
바람직한 실시형태에 있어서 상기 스테롤은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 7-데히드로-콜레스테롤, 라노스테롤, 라노스테롤 유도체, 자이모스테롤, 자이모스테롤 유도체, 라토스테롤, 라토스테롤 유도체, 쿠쿠르비타신, 쿠쿠르비타신 유도체, 에피스테롤, 에피스테롤 유도체, 테아스테론, 테아스테론 유도체, 카스타스테론, 카스타스테론 유도체, 타이파스테롤, 타이파스테롤 유도체, 카타스테론, 카타스테론 유도체, 사이클로유칼레놀, 사이클로유칼레놀 유도체, 시토스테롤, 시토스테롤 유도체, 이소푸코스테롤, 이소푸코스테롤 유도체, 푸코스테롤, 푸코스테롤 유도체, 고르고스테롤, 고르고스테롤 유도체, 에르고스테롤, 에르고스테롤 유도체, 스티그마스테롤 또는 스티그마스테롤 유도체이다.
특히 7-데히드로-콜레스테롤의 아실에스테르가 축적되는 생물체에서 HMG-CoA-리덕타아제(EC1.1.1.34) 및/또는 Δ24-리덕타아제 및/또는 라노스테롤 C14-데메틸라아제/사이토크롬 P450 51(EC 1.14.13.70) 및/또는 스쿠알렌-에폭시다아제/ 스쿠알렌-모노옥시게나아제(EC 1.14.99.7)의 활성은 대응 야생형 생물체에 비해 증가할 수 있다. 추가로 SAM:C-24 스테롤 메틸 트랜스퍼라아제 및/또는 C-22 스테롤 데사투라아제 및/또는 C-5 스테롤 데사투라아제의 활성은 대응 야생형 생물체에 비해 감소하거나 또는 없을 수 있다. 에르고스테롤의 아실에스테르가 축적되는 생물체에서 HMG-CoA-리덕타아제(EC1.1.1.34) 및/또는 라노스테롤 C14-데메틸라아제/사이토크롬 P450 51(EC 1.14.13.70) 및/또는 스쿠알렌-에폭시다아제/스쿠알렌-모노옥시게나아제(EC 1.14.99.7)의 활성은 대응 야생형 생물체에 비해 증가할 수 있다. 에피스테롤의 아실에스테르가 축적되는 생물체에서 HMG-CoA-리덕타아제(EC1.1.1.34) 및/또는 라노스테롤 C14-데메틸라아제/사이토크롬 P450 51(EC 1.14.13.70) 및/또는 스쿠알렌-에폭시다아제/스쿠알렌-모노옥시게나아제(EC 1.14.99.7)의 활성은 대응 야생형 생물체에 비해 증가 및/또는 Δ22-데사투라아제/사이토크롬 P450 61(EC 1.14.14.1) 활성은 대응 야생형 생물체에 비해 감소할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서 상기 스테로이드는 안드로스테론, 안드로스테론 유도체, 테스토스테론, 테스토스테론 유도체, 안드로스테네디올, 안드로스테네디올 유도체, 안드로스테네디온, 안드로스테네디온 유도체, 칼루스테론, 칼루스테론 유도체, 메탄드리올, 메탄드리올 유도체, 볼라스테론, 볼라스테론 유도체, 에피안드로스테론, 에피안드로스테론 유도체, 메스타놀론, 메스타놀론 유도체, 스타놀론, 스타놀론 유도체, 스텐볼론, 스텐볼론 유도체, 에피테스토스테론, 에피테스토스테론 유도체, 코르티솔, 코르티솔 유도체, 알도스테론, 알도스테론 유도체, 프레그네놀론, 프레그네놀론 유도체, 코르티손, 코르티손 유도체, 코르티코스테론, 코르티코스테론 유도체, 노레틴드론, 노레틴드론 유도체, 우로코르티솔 또는 우로코르티솔 유도체이다.
본 발명의 제5 및 제6태양의 바람직한 실시형태에 있어서 스테롤 지질의 아실 에스테르를 축적할 수 있는 생물체는 스테롤 지질의 합성을 유도하는 자연발생적인 생화학 경로를 갖고 더 바람직하게는 해당 경로의 효소 활성이 대응 비-변형 생물체에 비해 증가하여 각각의 스테롤 지질의 축적이 높은 생물체이다.
바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제1 내지 제6태양에 따른 생물체는 그의 지질 입자에 프레놀 지질을 축적할 수 있다. 프레놀 지질은 주로 메발론산(MVA) 경로를 통해 제조되는 5-탄소 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트와 디메틸알릴 디포스페이트로부터 합성된다. 상기 프레놀 지질은 이소프레노이드, 퀴논과 히드로퀴논, 폴리프레놀, 호파노이드와 기타 몇몇 소수의 종류를 포함한다. 단순한 이소프레노이드(선형 알코올, 디포스페이트 등)는 C5 단위를 연속적으로 첨가하여 형성되고 이들 테르펜 단위의 수에 따라 구분된다. 40개가 넘는 탄소를 함유하는 구조는 폴리테르펜으로서 알려져 있다. 카로테노이드는 산화방지제 및 비타민 A의 전구체로서 기능하는 중요하면서 단순한 이소프레노이드이다. 또 다른 생물학적으로 중요한 계열의 분자의 예로서 비-이소프레노이드로부터 비롯된 퀴노노이드 중심부에 붙어있는 이소프레노이드 꼬리부를 함유하는 퀴논과 히드로퀴논이 있다. 우비퀴논뿐 아니라 비타민 E와 비타민 K도 이 계열의 예이다. 박테리아는 산소에 붙어있는 말단의 이소프레노이드 단위가 불포화 상태인 폴리프레놀(박토프레놀이라 함)을 합성하는 반면, 동물 폴리프레놀(돌리콜)에서는 말단의 이소프레노이드가 감소한다.
바람직한 실시형태에 있어서 지질 입자에 축적되는 프레놀 지질은 이소프레노이드이다. 상기 이소프레노이드는 예를 들면 C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드(모노테르펜), C15 이소프레노이드(세퀴테르펜), C20 이소프레노이드(디테르펜), C25 이소프레노이드(세스테르테르펜), C30 이소프레노이드(트리테르펜), C40 이소프레노이드(테트라테르펜), 폴리테르펜과 레티노이드를 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에 있어서 상기 이소프레노이드는 트리테르펜이다. 트리테르펜은 6개의 이소프렌 단위로 이루어지고 기본 분자식 C30H48 -50을 갖는다. 이 군은 예를 들면 3S-스쿠알렌-2,3-에폭시드, 스쿠알렌, 프레스쿠알렌 디포스페이트, 테트라하이마놀, α-아마이린, β-아마이린, 루페올, 루페올 아세테이트, 타락사스테롤, 아자디라크틴 A, 네오쿠아신, 쿠아신과 3-아세틸-1-티글로일아자디라크티닌을 포함한다. 상어간유의 주요 구성성분인 선형 트리테르펜 스쿠알렌은 파르네실 피로포스페이트의 2개의 분자의 환원 결합반응으로부터 유도된다. 이후 스쿠알렌은 생합성적으로 처리되어 모든 스테로이드에 대한 구조적 전구체인 라노스테롤 또는 사이클로아르테놀 어느 하나를 생성한다.
특히 바람직한 실시형태에 있어서 지질 입자에 축적되는 프레놀 지질은 스쿠알렌 또는 스쿠알렌 유도체이다. 스쿠알렌 유도체는 스쿠알렌의 주쇄 탄소 원자에 결합되는 수소 원자(들) 대신에 주쇄 탄소 원자에 결합되는 하나 이상, 특히 1 내지 10개 또는 1 내지 4개의 메틸 또는 에틸기를 추가로 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체는 바람직하게는 본 발명의 제1, 제3, 제5태양과 관련하여 왁스 에스테르를 생산하여 그의 지질 입자에 저장하지 않는 생물체, 예를 들면 상술한 바와 같은 진균 생물체, 더 바람직하게는 사카로마이세스속의 진균 생물체, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에이다. 본 발명의 제1, 제3 및 제5태양에 따라 트리아실글리세롤 및/또는 스테릴 아실 에스테르를 합성하지 않도록 변형되는 이러한 생물체는 프레놀 지질, 특히 스쿠알렌을 합성하여 그의 지질 입자에 저장할 수 있어 이러한 프레놀 지질을 지질 입자에서 기본적으로 순수하거나 더욱 순수한 형태로 생산하도록 할 수 있다. 이에 따르면 효모 생물체에서 TAG 및/또는 SAE의 생합성을 위한 합성경로를 제거함으로써 이러한 생물체에 의해 생산되는 스쿠알렌의 양과 순도에 있어서 생산을 크게 향상시킬 수 있다.
이러한 생물체에서 스쿠알렌 생산의 추가 향상은 효소 활성을 증가시켜 스쿠알렌의 합성을 유도하고 스쿠알렌을 다른 화합물로 전환시키는 경로의 효소 활성을 감소시키도록 생물체의 대사를 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.
스쿠알렌 생합성 경로의 유전자는 알려져 있고 예를 들면 효모 S. 세레비시아에에서 복제된다. 주요 장애 효소는 HMG-CoA-리덕타아제(HMG1)(Basson 등(Mol. Cell. Biol. 8(1988), 3793-3808)이다. 이에 따라 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명의 제1, 제3 또는 제5태양에 따른 생물체는 지질 입자에 스쿠알렌을 축적할 수 있고 HMG-CoA-리덕타아제(EC1.1.1.34)의 활성이 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에 비해 증가하는 것을 특징으로 한다. HMG-CoA-리덕타아제 활성 증가는 당업자에게 잘 알려진 수단과 방법에 의해 이루어질 수 있는데, 이에 대해 아래에 더욱 상세히 기재되어 있다. 바람직한 실시형태에 있어서 HMG-CoA-리덕타아제의 활성 증가는 효소의 촉매 영역만을 암호화하고 막-결합된 영역은 암호화하지 않는 HMG-CoA-리덕타아제를 상기 생물체에서 발현함으로써 이루어진다. 이러한 변화는 이미 EP-A 486 290에 기재되어 있다. 이 변형에 의해 에르고스테롤 생합성 경로의 중간체에 의한 HMG-CoA- 리덕타아제의 피드백 조절이 회피된다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서 본 발명에 따른 생물체에서 HMG-CoA-리덕타아제를 암호화하는 유전자는 이종 프로모터, 즉 HMG-CoA-리덕타아제 유전자와 관계없는 프로모터에 의해 제어되고, 특히 이 프로모터는 에르고스테롤 생합성 경로의 중간체에 의해 그의 활성이 조절되지 않는 프로모터이다. 적합한 프로모터의 일례는 ADH1 프로모터, 특히 대략 구성적 발현을 보이는 "평균" ADH1 프로모터이다(Ruohonen 등, Journal of Biotechnology 39(1995), 193-203).
효모와 같은 일부 생물체에서는 스쿠알렌이 다른 화합물, 특히 에르고스테롤과 에르고스테롤 생합성 경로의 중간체로 전환될 수 있다. 스테롤 에르고스테롤((22E)-에르고스타-5,7,22-트리엔-3-베타-올)을 형성하게 하는 화학반응과 경로는 맥각, 효모와 곰팡이에서 나타난다. 이들 생물체에서 스쿠알렌은 스쿠알렌 모노옥시게나아제/스쿠알렌 에폭시다아제(EC 1.14.99.7; 스쿠알렌 에폭시다아제 또는 ERG1이라고도 함)에 의해 (S)-2,3-에폭시스쿠알렌으로 전환되고, 이어서 2,3-옥시도스쿠알렌-라노스테롤 사이클리제(EC 5.4.99.7; ERG7)에 의해 라노스테롤로 전환된다. 이후, 라노스테롤은 NADPH와 O2를 이용하는 사이토크롬 P450 라노스테롤 14a-데메틸라아제(EC 1.14.13.70; ERG11)에 의해 4,4-디메틸-콜레스타-8,14,24-트리엔올로 전환되고, 이어서 NADPH를 이용하는 C14 스테롤 리덕타아제(EC 1.3.1.70; ERG24)에 의해 4,4-디메틸-8,24-콜레스타디엔올로 전환된다. 이후, 이 화합물은 C-4 스테롤 메틸 옥시다아제(EC 1.14.13.72; ERG25)의 작용에 의해 4-메틸-8,24-콜레스타디엔올로 전환된다. 이 물질은 C-3 스테롤 데히드로게나아제(EC 1.1.1.170; ERG26)에 의해 3-케토-4-메틸자이모스테롤로 전환된다. 이어서 3-케토-4-메틸자이모스테롤은 3-케토 스테롤 리덕타아제(EC 1.1.1.270; ERG27)에 의해 자이모스테롤로 전환된다. 다음, 자이모스테롤 자신은 S-아데노실-L-메티오닌과 함께 SAM:C-24 스테롤 메틸트랜스퍼라아제(EC 2.1.1.41; ERG6)에 의해 페코스테롤과 S-아데노실-호모시스테인으로 전환된다. 다음, 페코스테롤은 C-8 스테롤 이소머라아제(ERG2)의 작용에 의해 에피스테롤로 전환된 다음, NADPH와 O2를 이용함으로써 C-5 스테롤 데사투라아제(EC 1.14.21.6; ERG3)의 작용에 의해 5,7,24(28)-에르고스타트리엔올로 전환된다. 이 화합물은 C-22 스테롤 데사투라아제(EC 1.14.14; ERG5)의 작용에 의해 5,7,22,24(28)-에르고스타테트라엔올로 더 전환된다. 다음, 5,7,22,24(28)-에르고스타테트라엔올은 C-24 스테롤 리덕타아제(EC 1.3.1.71; ERG4)의 작용에 의해 에르고스테롤로 전환된다. 본 발명에 따른 생물체가 스쿠알렌을 지질 입자에 축적하는 것이 바람직하고 이 생물체가 자연발생적으로 에르고스테롤 또는 스쿠알렌으로부터 출발하는 에르고스테롤 경로의 중간체를 합성할 수 있는 생물체로부터 유도되는 경우에는 상기 생물체에서 스쿠알렌으로부터 에르고스테롤로 이어지는 경로의 상기 언급한 효소 활성 중 하나 이상의 활성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로 상술한 에르고스테롤 경로의 상기 언급한 효소 중 어느 하나 또는 그 이상의 효소 또는 모든 효소가 감소할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서 일부 스테롤 합성은 효모 세포의 생존성을 위해 필요하므로 스쿠알렌 모노옥시게나아제(EC 1.14.99.7; 스쿠알렌 에폭시다아제 또는 ERG1라고도 함)의 활성은 감소하지만 완전하게 제거되지는 않는다. 에르고스테롤의 생합성에 관여하는 다음과 같은 효소 중 하나 이상의 활성을 감소시킬 수도 있다: SAM:C-24 스테롤 메틸 트랜스퍼라아제(EC 2.1.1.41), C-22 스테롤 데사투라아제(EC 1.14.14)과 C-5 스테롤 데사투라아제(EC 1.14.21.6). 이것은 모두 위에서 언급한 본 발명의 모든 실시형태에 적용된다.
본 발명의 일부로서 독립적 속성의 다음과 같은 특징들이 유전자 변형 생물체에 대해 적용된다.
본 발명 내에서 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 유전자 SAK1 및/또는 HAP4가 구성적으로 과발현하면 지질, 특히 스쿠알렌과 스테롤의 생산성이 크게 증가한다는 것이 밝혀지기도 하였다. 유전자 SAK1과 HAP4는 호흡-발효 플럭스 분포와 관련이 있다.
유전자 SAK1은 Snf1p/Snf4p 복합체의 인산화반응을 담당하는 앞에 위치한 세린/트레오닌 키나아제를 암호화한다. 상기 인산화반응 결과, 세포핵에 편재화되어 있는 활성 Snf1p/Snf4p 복합체가 얻어진다. 상기 Snf1p/Snf4p 복합체는 단백질 세린/트레오닌 키나아제로 분류되고 "양면 전환(diauxic shift)" 중에 글루코오스-억제를 완화하는 데 있어 중심적인 역할을 한다. 상기 양면 전환은 매질 중에서 글루코오스 또는 다른 발효 탄소원이 소비될 때 발효 대사로부터 호흡 대사로 전환되는 것을 가리킨다. Snf1/Snf4 복합체는 각각 글루코오스-억제와 탈억제를 담당하는 케스케이드의 계층구조로 상당한 영향을 미친다. 양면 전환 과정에서 사카로마이세스 세레비시아에의 6000개 유전자 중 약 1/4의 발현 수준이 크게 변한다. 이들 주요 변화는 발효 모드로부터 호흡 모드로 전환되는 중앙 대사를 주로 다룬다. 발효 모드에서 효모 세포는 글루코오스와 같은 발효성 탄소원을 에탄올과 이산화탄소로 대사한다. 호흡 모드에서는 생산된 에탄올을 호흡하여 세포에 에너지를 제공하는 아데노신 삼인산(ATP)을 얻는다. 양면 전환 과정에서 Snf1p/Snf4p 복합체는 인산화되어 Snf1-키나아제 Sak1p, Tos1p와 EIm1p에 의해 활성화된다. 활성화된 상기 복합체는 세포핵 내에서 편재화되어 2개의 전사인자인 Mig1p와 Cat8p에 영향을 미친다. 아연 손가락 단백질 Mig1p는 전사 억제제로서 단백질 Tup1p와 Cyc8p가 복합체로서 많은 수의 글루코오스 억제된 유전자의 특정 공통 서열에 결합하도록 구성함으로써 이 공통 서열의 뒤에 위치한 유전자의 전사가 억제된다. Cat8p는 전사 활성화제로서 매질 내 글루코오스가 소진될 때 적어도 34개 유전자의 발현을 유도한다. 이들 유전자는 주로 에탄올 또는 아세테이트와 같은 C2 화합물의 대사를 위해 필요한 글리옥실레이트 션트(shunt)의 유전자이다. 그 외에도 또한 구연산 사이클과 글리옥실레이트 션트의 중간체의 세포내 수송을 담당하는 유전자도 Cat8p에 의해 조절된다. 활성 Snf1p/Snf4p 복합체는 Mig1p를 인산화함으로써 이 단백질을 불활성화하고 세포핵 밖으로 전위시키며 Cat8p와 그 기능적 상동체인 Sip1p를 인산화하여 이들 2개의 단백질을 불활성화시킨다. 따라서 세포핵에 편재화되는 활성 Snf1p/Snf4p 복합체는 글루코오스 억제 완화와 발효로부터 호흡으로의 전환에 크게 기여하는데, 이는 억제 케스케이드의 몇몇 전사인자에 영향을 주기 때문이다. 따라서 본 발명에 따른 생물체는 글루코오스가 존재하는 상태에서도 더욱 활성인 Snf1p/Snf4p 복합체를 나타내도록 더 진행될 수 있다. 이 변형은 인산화반응, 결국 Snf1p/Snf4p 복합체의 활성화를 담당하는 주요 키나아제로서 단백질 Sak1p의 전사 조절 해제에 의해 이루어진다.
Hap2/3/4/5 단백질 복합체는 많은 수의 글루코오스-억제된 유전자를 조절한다. 이들 유전자는 대부분 호흡 연쇄와 구연산 회로의 유전자들이다. 활성화제로서 상기 단백질 복합체는 양면 전환 중에 이들 유전자의 전사를 유도하고 호흡 방향으로 호흡-발효 평형을 이동시키는데 크게 기여한다. 유전자 HAP2, HAP3와 HAP5는 구성적으로 발현된다. 원래 HAP4는 비-발효성 탄소원에서 성장하는 중에만 발현된다. HAP4-과발현 돌연변이주의 배양 중에 돌연변이에 의한 성장속도 증가, 바이오매스와 아세테이트의 생산 증가 및 글리세롤과 에탄올의 형성 감소가 관찰되었다. Hap2/3/4/5 단백질 복합체는 구연산 회로를 통해 호흡 용량, 미토콘드리아 발생과 탄소 플럭스를 증가시킴으로써 호흡계를 증식시킨다.
본 발명 내에서 또 다른 관찰로는 유전자 FLD1의 결실에 의해 효모, 특히 효모 사카로마이세스 세레비시아에와 같은 생물체에서 지질 생산, 특히 스쿠알렌 생산이 예상치 않게 크게 증가한다는 것이다.
유전자 FLD1는 지질 소적의 형상, 수와 크기에 관여하는 세이핀(seipin) 단백질을 암호화한다. FLD1이 과발현되면 지질 입자가 융합되어 효모 세포에서 지질 입자는 크게 확대되지만 그 수는 더 적게 된다고 보고되었다. 야생형 효모 균주에서 스쿠알렌은 스테롤 생합성 경로에서 중간체이고 세포 내 축적되지 않는다. HMG-CoA-리덕타아제의 활성 증가는 EP-A 486 290에 기재된 바와 같이 상기 효소의 촉매 부분만을 암호화하고 막-결합 영역은 암호화하지 않는 HMG-CoA-리덕타아제 유전자를 효모에서 발현함으로써 얻어지고 스쿠알렌의 세포 내 축적으로 나타난다. 이 축적은 에르고스테롤 생합성 경로의 중간체에 의해 HMG-CoA-리덕타아제의 피드백 조절이 방지되기 때문이다. 본 발명의 구성범위 내에서 유전자 FLD1의 결실에 의해 효모 균주에서 지질 생산, 특히 스쿠알렌 생산이 예상치 않게 상당히 증가하여 HMG-CoA-리덕타아제의 활성 증가를 나타낸다는 것이 관찰되었다.
SAK1, HAP4 와 FLD1과 관련한 위의 발견들은 상술한 바와 같이 본 발명의 6개의 태양 중 어느 하나 안에서 추가의 개량형태와 실시형태로 나타난다. 그러나 이들 발견은 또한 상술한 변형형태를 포함하지 않고 각각의 비변형 생물체에 의해 전형적으로 합성되는 모든 지질을 합성하는 능력을 갖는 생물체에 대해 독립적인 가치를 갖는다. 본 명세서에서 비변형 생물체에는 야생형 이외에도 대응 야생형 생물체에 비해 HMG-CoA-리덕타아제(EC1.1.1.34)의 활성이 증가된 이러한 생물체가 포함된다.
따라서 본 발명은 또한 유전자 HAP4 및/또는 SAK1가 전사 조절 해제 및/또는 과발현되고/또는 유전자 FLD1이 대응 야생형 생물체에 비해 억제 또는 불활성화 또는 결실되어 있는 분리된 유전자 변형 비-포유류 생물체를 포함한다. 구체적으로 유전자 HAP4와 SAK1 중 하나 또는 둘 다 (선택적으로) ADH1 프로모터와 같은 구성적으로 활성인 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 이 변이체의 또 다른 실시형태에 있어서 유전자 REG1은 대응 야생형 생물체에 비해 억제 또는 불활성화 또는 결실되어 있다. 이 외에도 본 발명에 대해 이미 언급한 모든 것들이 유사한 방식으로 이 독립적인 태양에 적용되고 이미 개시한 모든 특징들도 이 독립적인 태양에 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 생물체를 이용하여 배양함으로써 상기 생물체로부터 제2지질을 분리하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면 프레놀 지질을 생산하기 위한 본 발명의 방법은 그의 지질 입자에 프레놀 지질을 축적할 수 있는 본 발명의 제3 또는 제4태양의 생물체를 상술한 바와 같이 배양하는 것을 포함한다. 축적될 프레놀 지질에 대해서 본 발명의 제3 및 제4태양의 생물체와 관련하여 위에서 기재한 것과 동일한 바가 바람직한 실시형태에 대해 적용된다. 동일한 바가 대응 생물체에서 감소 또는 증가하는 효소 활성에 대해서 적용된다. 또 다른 예로서, 스테릴 아실 에스테르를 생산하는 방법은 본 발명의 제5 또는 제6태양에 따른 생물체를 배양하는 것을 포함한다.
대응 비-변형 생물체 대비 위에서 언급한 단백질 또는 효소의 활성 감소율은 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더욱더 바람직하게는 적어도 80%, 특히 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 100%이다. 100% 감소율은 상기 생물체에 존재하는 상기 효소의 단백질 또는 효소 활성이 없음을 의미한다. 대응 비-변형 생물체 대비 위에서 언급한 효소 또는 단백질의 활성 증가율은 바람직하게는 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱더 바람직하게는 적어도 200%, 특히 바람직하게는 적어도 1000%이다. "증가"라 함은 또한 (임의의 측정 가능한) 효소 또는 단백질의 효소 활성을 포함하지 않는 비-변형 생물체와 비교하여 상기 측정 가능한 활성이 있다는 것을 포함한다. "활성 증가"라 함은 또한 단백질이 효소가 아닌(HAP4와 같은) 모든 경우에서 단백질 양이 증가하는 것을 포함한다. 다음, 상기 증가 파라미터는 유사한 방법으로 양에 대해서 적용된다. 효소의 활성은 유리체로부터 경우에 따라 추가 반응성분을 필요로 하는 산물로의 반응을 촉매하는 소정량의 효소를 상기 유리체의 소정량에 첨가하고, 소정의 기간 내 합성되는 산물의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 위에서 논의한 효소의 활성 측정을 위한 구체적인 방법은 예를 들면 문헌 WO 03/064650 A1에 개시되어 있다. 위에서 언급한 효소들 중 상기 문헌에 기재되어 있지 않은 효소의 활성도 유사한 방식으로 측정한다.
세포에서 소정 효소의 활성을 감소시키기 위한 방법으로는, 예를 들면 상기 효소를 암호화하는 유전자의 유전자 발현을, 예를 들면 해당 유전자의 앞에 위치한 약한 프로모터를 실행하도록 하거나 상기 유전자 및/또는 관련 프로모터를 완전히 또는 부분적으로 결실시키고/또는 효소 억제제를 첨가하여 생물체의 세포 내에서 번역된 효소를 억제하고/또는 si RNA를 세포에 도입하여 활성 전사물의 양을 감소시키고/또는 유전자를 돌연 변이시켜 활성이 적은 변이체를 발생시킴으로써 감소 또는 제거하는 것이 있다.
유전자 발현 감소는 각각의 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 유전자 발현수준이 대응 비-변형 생물체, 바람직하게는 대응 야생형 생물체에서 상기 뉴클레오티드 서열의 유전자 발현 수준과 비교하여 감소하는 것을 의미한다. 활성과 관련하여 위에서 제공한 바와 동일한 감소 수준이 적용된다. 유전자 발현 수준을 검출하기 위한 수단과 방법은 예를 들면 해당 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하거나 각 단백질의 효소 활성을 측정하는 것을 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서 유전자 발현 수준은 예를 들면 노던 블롯에서 mRNA의 양을 측정함으로써 결정한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서 유전자 발현 수준은 예를 들면 웨스턴 블롯에서 해당 단백질의 합성되는 양을 측정하거나 해당 효소 활성의 양을 측정함으로써 결정한다. 해당 유전자를 비기능성으로 함으로써 유전자 발현을 감소시킬 수도 있다. 유전자를 비기능성으로 만들 수 있는 수단으로는 유전자 파괴가 있다.
효소의 활성을 증가시키기 위한 방법으로는 세포의 형질을 전환시켜 전사 조절을 해제하고/또는, 상기 효소를 암호화하는 유전자(이종 또는 상동)가 구성적으로 활성인(상동 또는 이종) 프로모터에 의해 제어되도록 하고/또는 상기 효소를 암호화하는 (이종 또는 상동) 유전자 복제 수가 증가하고/또는 돌연변이에 의해 활성을 증가시키는 것을 포함한다.
효소 활성 증가 또는 감소에 영향을 주는 구체적인 예가 실시예에 제공되어 있다. 그러나 당업자라면 본 명세서에 특별히 개시할 필요가 없는 본 기술분야에 잘 알려진 다른 방법도 적용할 수 있을 것이다.
이하에는 본 발명에서 사용되는 효소에 대한 적합한 유전자 서열이 개시되어 있지만, 동일한 효소 활성을 갖는 다른 유전자 서열도 마찬가지로 사용될 수 있다. 이에, 본 발명 내에서 적절한 구조적 특징들은 특정 유전자 서열 또는 암호화된 단백질 서열이 아니라 그에 상응하는 동일한 EC(효소 위원회) 번호에 따라 분류된 것들이다..
아실-CoA:스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26)에 대한 유전자 서열은: NC_001135.4, NC_001147.6, NM_005891, NM_144784, NM_153728을 포함한다.
디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20)에 대한 유전자 서열은: NC_001147.5, XM_002478787, NM_123089, XM_002378082, NM_032564, NM_001012345, NM_010046, XM_002146497을 포함한다.
레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158)에 대한 유전자 서열은: NC_001147.6, NM_008490, NM_001162568, NM_000229, NM_001005715, NM_017024, NM_001082190을 포함한다.
아실 CoA-왁스 알코올 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)에 대한 유전자 서열은: NM_123089, NM_177448을 포함한다.
HMG-Co0A-리덕타아제에 대한 유전자 서열은: NC_001145, NM_106299, NC_003421.2, NC_009784.1, NC_003028.3, NC_007308.3과 도 5의 서열(절단형, tHMG1).
C-24 스테롤 메틸 트랜스퍼라아제에 대한 유전자 서열은: NC_001145, NC_000911.1, NC_003423.3, XM_505173, XM_716615를 포함한다.
C-22 스테롤 데사투라아제에 대한 유전자 서열은: NC_003424.3, NC_009046.1, NC_001145.2, XM_500188, XM_711840을 포함한다.
C-5 스테롤 데사투라아제에 대한 유전자 서열은: NC_001144, S46162, NG_009446, NM_053642, NM_001035356, XM_503090, XM_708519를 포함한다.
HAP4에 대한 유전자 서열은: NC_001143.7, XM_448596, XM_001645329를 포함한다.
SAK1에 대한 유전자 서열은: NC_001137.2, XM_502591, XM_448319, XM_453478, NM_208704를 포함한다.
REG1에 대한 유전자 서열은: NC_001136.8, XM_500990, XM_448729, XM_455276을 포함한다.
FLD1에 대한 유전자 서열은: NC_001144.4, NM_210286, XM_001647166, XM_449778을 포함한다.
7-데히드로콜레스테롤 리덕타아제에 대한 유전자 서열은: NM_103926, NM_001360, NM_007856, NM_203904, NM_001014927, NM_201330, NM_022389, NM_001131727, NM_001087087, XM_001497598, XM_001174160, XM_001099101, BM490402, CA753545를 포함한다.
24-데히드로콜레스테롤 리덕타아제에 대한 유전자 서열은: NM_014762, NM_001016800, NM_001094456, NM_001008645, NM_001103276, NM_001080148, NM_053272, NM_00103128, XM_001488247, AB125202, XM_001153751을 포함한다.
라노스테롤 스테롤 14-데메틸라아제에 대한 유전자 서열은: NC_001140.5, XM_500518, EF059165, XM_445876, XM_454109를 포함한다.
스쿠알렌 모노옥시게나아제에 대한 유전자 서열은: NC_001139.8, M64994, XM_503994, XM_706801, XM_455763을 포함한다.
적합한 프로모터(이종 발현된 각각의 서로 다른 효소의 프로모터는 동일하거나 서로 다를 수 있음)에 대한 유전자 서열은: NC_001142, NC_001139, NC_001147, NC_001139, NC_001148, NC_001135, NC 001136을 포함한다.
일반적으로 본 발명에 따른 생물체는 (상술한 태양들의 생물체와 관계없이) 가능한 모든 비-인간, 바람직하게는 비-포유류 생물체일 수 있다. 적합한 생물체에 대한 예들이 청구범위에 제공되어 있다.
도 1은 효모 사카로마이세스 세레비시아에의 구성 돌연변이주로부터 추출된 전체 지질 추출물의 박층 크로마토그래피이다.
도 2는 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 스쿠알렌의 생합성을 개략적으로 나타내고 있다.
도 3은 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 트리아실글리세롤의 생합성을 개략적으로 나타내고 있다.
도 4는 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 스테릴 아실 에스테르의 생합성을 개략적으로 나타내고 있다.
도 5는 절단된 HMG CoA-리덕타아제인 tHMG1의 서열을 보여주고 있다.
하기 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예에서는 다음과 같은 재료와 방법을 사용하였다.
1. 제한 절단
플라스미드(1 내지 10 ㎍)를 30 ㎕ 배치에서 제한하였다. 이를 위해서 DNA를 24 ㎕의 H2O에서 취하고 3 ㎕의 적당한 완충액, 1 ㎕의 RSA(우혈청 알부민)와 2 ㎕의 효소와 혼합하였다. 상기 효소 농도는 DNA의 양에 따라 1 단위/㎕ 또는 5 단위/㎕이었다. 일부의 경우, 1 ㎕가 넘는 RN아제를 상기 배치에 첨가하여 tRNA를 분해하였다. 상기 제한 배치를 37℃에서 2시간 배양하였다. 미니겔을 이용하여 제한을 제어하였다.
2. 겔 전기영동
미니겔 또는 폭이 넓은 미니겔 장치에서 겔 전기영동을 수행하였다. 미니겔(약 20 ml, 8 봉지)과 폭이 넓은 미니겔(50 ml, 15 또는 30 봉지)은 TAE 중 1% 아가로스로 이루어졌다. 1*TAE를 이동상 완충액으로서 사용하였다. 시료(10 ㎕)를 3 ㎕의 고정상 용액과 혼합하여 도포하였다. HindIII로 절단한 I-DNA를 표준물질로 이용하였다(23.1 kb; 9.4 kb; 6.6 kb; 4.4 kb; 2.3 kb; 2.0 kb; 0.6 kb에서 띠를 가짐). 분리를 위해 80 V의 전압을 45 내지 60분간 인가하였다. 그 후, 겔을 에티듐 브롬화물 용액에서 염색하고 비디오-기록 시스템 INTAS로 UV광에 고정시키거나 오렌지 필터로 촬영하였다.
3. 겔 용출
겔 용리액을 이용하여 원하는 단편을 분리하였다. 제한용 제제를 여러 봉지의 미니겔에 넣어 분리하였다. [람다(lambda)]-HindIII과 "희생 추적자"을 에티듐 브롬화물 용액에서 염색하여 UV광으로 관찰하고, 원하는 단편을 표지하였다. 그 결과, 에티듐 브롬화물과 UV광에 의해 나머지 봉지 안에 있는 DNA가 손상되는 것이 방지되었다. 염색된 겔 조각과 염색되지 않은 겔 조각을 정렬하여 염색되지 않은 겔 조각으로부터 표지화를 이용하여 원하는 단편을 절단할 수 있었다. 분리할 단편과 함께 아가로스 조각을 투석관에 첨가하고 소량의 TAE 완충액으로 기포가 없도록 밀봉하여 BioRad-미니겔 장치에 두었다. 상기 이동상 완충액은 1*TAE로 이루어졌고 전압은 40분간 100 V이었다. 다음, 유동 극성을 2분간 변화시켜 투석관에 붙어있는 DNA가 떨어지도록 하였다. 투석관의 DAN 단편을 함유하는 완충액을 반응용기로 옮겨 에탄올로 침전시켰다. 이를 위해서 3 M 초산나트륨의 분획(1/10) 부피, tRNA(용액 50 ㎕ 당 1 ㎕)와 2.5배 부피의 빙냉 96% 에탄올을 DNA 용액에 첨가하였다. 배치를 -20℃에서 30분간 배양한 다음, 4℃에서 30분간 12,000 rpm으로 원심분리하였다. DNA 펠렛을 건조하고 10 내지 50 ㎕(DNA 양에 따라)의 H2O에 취하였다.
4. 클레노우 처리
DNA 단편의 말단을 클레노우 처리에 의해 돌출시켜 "뭉툭한 말단"을 얻었다. 1 ㎍의 DNA 당 다음과 같은 배치를 피펫으로 취하였다. 이 경우, DNA를 위해 에탄올 침전액으로부터 유도하여 오염물질이 클레노우-폴리머라아제를 억제하는 것을 방지하여야 한다. 37℃에서 30분간 배양한 다음, 70℃에서 5분에 걸쳐 더 배양하였다. 반응을 정지시켰다. 배치로부터 에탄올 침전에 의해 DNA를 얻고 10 ㎕의 H2O에 취하였다.
5. 결찰
결찰할 DNA 단편들을 조합하였다. 최종 부피 13.1 ㎕에는 벡터-삽입비 1:5를 가진 약 0.5 ㎍의 DNA를 함유되었다. 시료를 70℃에서 45초간 배양하고 상온으로 냉각한 다음(약 3분간), 10분간 얼음 위에서 배양하였다. 이후, 결찰 완충액: pH 7.5인 2.6 ㎕의 500 mmol TrisHCl과 1.3 ㎕의 100 mmol MgCl2을 첨가하고, 추가로 10분간 얼음 위에서 배양하였다. 1 ㎕의 500 mmol DTT와 1 ㎕의 10 mmol ATP를 첨가한 후, 1 ㎕의 리가아제(1 단위/㎕)를 추가로 10분간 얼음 위에 첨가하였다. 인접한 DNA 말단이 다시 분리되는 것을 방지하도록 전체 처리 과정을 최소한으로 진탕시키면서 실시하였다. 14℃에서 밤새 결찰하였다.
6. 대장균 형질전환
성분 대장균(E. coli) NM522 세포를 결찰용 제제의 DNA를 이용하여 형질전환시켰다. 양성 대조군으로서 50 ng의 pScL3 플라스미드가 공급된 배치를 이용하고, 공(null) 대조군으로서 DNA가 공급되지 않은 배치를 이용하였다. 각 형질전환용 제제를 위해서 100 ㎕의 8% PEG 용액, 10 ㎕의 DNA와 200 ㎕의 반응능 세포(대장균 NM522)를 피펫을 이용하여 탁상용 원심분리관으로 옮겼다. 상기 배치들을 30분간 얼음 위에 놓고 간헐적으로 진탕시켰다. 이후, 42℃에서 1분간 열충격하였다. 재생을 위해서 1 ml의 LB-배지를 세포에 첨가하고 진탕기 위에서 90분간 37℃로 배양하였다. 각각의 희석하지 않은 배치 100 ㎕, 1:10 희석액과 1:100 희석액을 LB+암피실린 판 위에 펼치고 37℃에서 밤새 배양하였다.
7. 대장균으로부터 플라스미드 분리(미니프렙(Miniprep))
대장균 군체를 37℃의 탁상용 원심분리관 내 1.5 ml의 LB+암피실린 배지에서 120 rpm으로 밤새 배양하였다. 다음날 세포들을 4℃에서 5분간 5000 rpm으로 원심분리하고, 펠렛을 50 ㎕의 TE-완충액에 취하였다. 각 배치를 100 ㎕의 0.2N NaOH, 1% SDS 용액과 혼합하고, 5분간 얼음 위에 두었다(세포의 융해). 다음, 400 ㎕의 Na-아세테이트/NaCl 용액(230 ㎕의 H2O, 130 ㎕의 3 M 초산나트륨과 40 ㎕의 5 M NaCl)을 첨가하고, 배치를 혼합하여 얼음 위에 추가로 15분간 두었다(단백질 침전). 15분간 11,000 rpm에서 원심분리한 후, 플라스미드-DNA를 함유하는 상청액을 에펜도르프 용기로 이송하였다. 상청액이 완전히 투명하지 않다면 한 번 더 원심분리하였다. 상청액을 360 ㎕의 빙냉 이소프로판올과 혼합하고 -20℃에서 30분간 배양하였다(DNA 침전). DNA를 원심분리하고(15분, 12,000 rpm, 4℃), 상청액을 버리고, 펠렛을 100 ㎕의 빙냉 96% 에탄올에서 세척하고, -20℃에서 15분간 배양하고, 재차 원심분리하였다(15분, 12,000 rpm, 4℃). 펠렛을 고속 진공으로 건조한 다음, 100 ㎕의 H2O에 취하였다. 플라스미드-DNA의 특성을 제한 분석에 의해 분석하였다. 이를 위해 각 배치 10 ㎕를 제한하고 폭이 넓은 미니겔에서 겔 전기영동법으로 절단하였다(위 참조).
8. 대장균에서 플라스미드-분리(맥시프렙(Maxiprep))
다량의 플라스미드-DNA를 분리하기 위해서 맥시프렙법을 수행하였다. 100 ml의 LB+암피실린 배지가 구비된 2개의 플런저에 군체 또는 분리할 플라스미드를 지닌 100 ㎕의 동결 배양물로 접종하고 37℃에서 밤새 120 rpm으로 배양하였다. 다음날, 배양물(200 ml)을 GSA 비이커로 옮기고 4000 rpm(2600*g)으로 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 6 ml의 TE-완충액에 다시 현탁시켰다. 세포벽을 분해하기 위해서 1.2 ml의 리소자임 용액(20 mg/ml의 TE-완충액)을 첨가하고, 상온에서 10분간 배양하였다. 이후, 세포를 12 ml의 0.2 N NaOH, 1% SDS로 융해하고 상온에서 5분간 추가 배양하였다. 9 ml의 차가운 3 M 초산나트륨 용액(pH 4.8)을 첨가하고 얼음 위에서 15분간 배양하여 단백질을 침전시켰다. 원심분리(GSA: 13,000 rpm(27,500*g), 20분, 4℃)한 후, DNA를 함유한 상청액을 새로운 GSA 비이커로 옮기고 DNA를 15 ml의 빙냉 이소프로판올로 침전시켜 -20℃에서 30분간 배양하였다. DNA 펠렛을 5 ml의 빙냉 에탄올에서 세척하고 공기(약 30-60분)에서 건조하였다. 이후, 1 ml의 H2O에서 다시 현탁시켰다. 제한 분석에 의해 플라스미드를 조사하였다. 미니겔 위에 희석액을 퇴적시켜 농도를 측정하였다. 염 함량을 감소시키기 위해서 30-60분간 미소 투석하였다(기공 크기 0.025 ㎛).
9. 효모 형질전환
효모 형질전환을 위해서 균주 사카로마이세스 세레비시아에(S. cerevisiae) AH22의 전배양물을 준비하였다. 20 ml의 YE-배지가 구비된 플런저에 100 ㎕의 동결 배양물을 접종하고 28℃에서 밤새 120 rpm으로 배양하였다. 10 ㎕, 20 ㎕ 또는 50 ㎕의 전배양물을 접종한 100 ml의 YE-배지가 구비된 플런저에서 동일한 조건으로 q본배양하였다.
9.1 반응능 세포 생산
다음날, 상기 플런저를 토마(Thoma) 챔버를 이용하여 계수하고 이 과정을 3-5*107 세포/ml를 유지하는 플런저를 이용하여 계속하였다. 원심분리(GSA: 5000 rpm(4000*g), 10분)에 의해 세포를 채취하였다. 세포 펠렛을 10 ml의 TE-완충액에 다시 현탁하고 2개의 탁상용 원심분리관(각 5 ml)에 나누어 넣었다. 세포를 6000 rpm으로 3분간 원심분리하고 각각 5 ml의 TE-완충액로 2번 세척하였다. 다음, 세포 펠렛을 109 세포 당 330 ㎕의 초산리튬 완충액에 취하고, 멸균 50 ml 삼각플라스크로 이송하고 28℃에서 1시간 진탕시켰다. 그 결과, 세포는 형질전환에 대한 반응능을 가졌다.
9.2 형질전환
각 형질전환용 제제를 위해서 15 ㎕의 청어 정자 DNA(10 mg/ml), 형질전환할 10 ㎕의 DNA(약 0.5 ㎍)와 330 ㎕의 성분 세포를 피펫을 이용하여 탁상용 원심분리관으로 옮기고 28℃에서 30분간 배양하였다(진탕하지 않음). 이후, 700 ㎕의 50% PEG 6000을 첨가하고 28℃에서 진탕없이 1시간 더 배양하였다. 42℃에서 5분간 열충격하였다. 100 ㎕의 현탁액을 선택 배지(YNB, Difco)에 도말하여 류신 원영양을 위해 선택하였다. G418 내성에 대해 선택하는 경우에는 열충격 후 세포를 재생하였다(9.3 재생상 참조).
9.3 재생상
상기 선택 표지자는 G418에 내성이 있기 때문에 세포들은 내성-유전자의 발현을 위한 시간이 필요하였다. 형질전환용 제제를 4 ml의 YE-배지와 혼합하고 진탕기(120 rpm)에서 28℃로 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 원심분리하고(6,000 rpm, 3분), 1 ml의 YE-배지에 취하고, 100 ㎕ 또는 200 ㎕를 YE+G418 평판 위에 펼쳤다. 상기 평판을 28℃에서 수일간 배양하였다.
10. PCR을 위한 반응조건
각 경우에 대해 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 반응조건을 최적화해야 하되 모든 배치에 대해 반드시 유효할 필요는 없다. 이에 따라 특히 DNA 사용량, 염 농도와 융점을 변경할 수 있다. 문제의 제형화를 위해 열순환기에서 사용하기 적합한 에펜도르프 캡에서 다음과 같은 물질을 조합하는 것이 유리하다고 판명되었다: PCR용 제제에 대해 총 부피 50 ㎕를 수득하기에 충분한 양의 물에 용해시킨 5 ㎕의 슈퍼 완충액, 8 ㎕의 dNTP(각 0.625
Figure pct00001
), 5'-프라이머, 3'-프라이머와 0.2 ㎍의 매트릭스 DNA를 2 ㎕(-0.1 U)의 슈퍼 택(Super Taq) 폴리머라아제에 첨가하였다. 상기 배치를 짧은 시간 원심분리하고 오일 방울로 덮었다. 37 내지 40 사이클을 선택하여 증폭하였다.
11. S. 세레비시아에로부터 지질 입자의 분리
효모 세포를 50 ml의 WMVIII 최소 배지에서 72시간 28℃에서 250 rpm으로 왕복 진탕하면서 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 채취하고 Leber 등(Leber R, Zinser E, Zellnig G, Paltauf F, Daum G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1994 Nov;10(11):1421-1428)에 따라 지질 입자를 분리 정제하였다. 스테롤 분석을 위해서 GC에 의한 총 스테롤 정량화를 위해 지질 입자를 30% 메탄올 KOH에서 16시간 상온에서 비누화하거나 또는 스테롤을 클로로포름/메탄올(4:1)로 직접 추출하고 유리 스테롤과 에스테르된 스테롤을 구별하기 위한 TLC 또는 유리 스테롤 정량화를 위한 GC에 의해 분석하였다.
12. 스쿠알렌과 스테롤 분석
전체 세포 지질과 지질 입자 내 총 지질의 양을 정량화하기 위해서 GC 분석 전에 시료를 비누화하였다. 세포의 125 OD600를 0.5 N HCl 중에서 20분간 100℃에서 처리하고 상온으로 냉각하였다. 그 후, 3 g의 KOH 및 피로갈롤(2 g/l)을 함유한 12.5 ml의 메탄올을 첨가하였다. 비누화를 위해서 상기 혼합물을 수조에서 2시간 70℃로 배양하였다. 가수분해된 에스테르를 n-헥산에서 추출하였다. 비누화되지 않은 분획은 2 ml의 n-헥산에 재현탁하였다. 스쿠알렌과 스테롤을 내부 표준물질로서 스쿠알렌과 콜레스테롤을 이용한 GC에 의해 정량화하였다. 스쿠알렌과 스테롤을 150 내지 250℃로 프로그램된 모세관 칼럼(25 m x 0.25 mm x 0.25 ㎛[막 두께]; Chrompack CPSil5)이 구비된 Hewlett-Packard 5890 가스 크로마토그래프를 이용하여 분리하였다. 초기 온도는 2분간 150℃이었고; 이후 최종 온도 250℃까지 15℃/분으로 승온하여 20분간 유지하였다. 선형 속도는 30 cm/s이었고, 운반 가스로서 헬륨을 이용하고 비분할 방식으로 주입하였다. 주입 부피는 1 ㎕이었다. 각 피크의 면적을 1 그램의 세포 건조중량으로 환산하여 계산하였다. 각 시료를 2번씩 측정하였다. 에르고스테롤과 스쿠알렌의 표준물질을 이용하여 동정하였다.
중성 지질을 추출하고 Sorger and Daum(J. Bacteriol. 184(2002), 519-524)의 방법으로 정량화하였다. 상세하게는 중성 지질의 정량화를 위해서 추출물을 실리카 겔 60 평판에 도포하고 전개 거리의 1/3에 대해 크로마토그램을 경유-디에틸 에테르-초산(25:25:1, 부피/부피/부피)으로 이루어진 용매계를 이용하여 전개하였다. 이후, 평판을 짧은 시간 건조하고 평판의 상단까지 경유-디에틸 에테르(49:1, 부피/부피로 이루어진 용매계를 이용하여 더 전개하였다. TLC-챔버에서 박층 평판을 요오드 증기로 염색하여 중성 지질을 가시화하였다. 농도 측정 스캐닝으로 정량화하였다.
스쿠알렌과 스테롤 분석을 위한 효모 사카로마이세스 세레비시아에의 균주의 표준 배양 과정은 다음과 같았다:
과정: 100 ml 진탕용 플라스크에 있는 20 ml의 WMVIII 배지에 20 ㎕의 해당 글리세롤 모액을 접종하고 30℃에서 48시간 150 rpm으로 배양하였다.
본 배양: 배플이 구비된 250 ml의 진탕 플라스미드에 있는 50 ml의 WMVIII 배지에 1%의 전배양물을 접종하고 30℃에서 72시간 150 rpm으로 배양하였다.
실시예 1
S. 세레비시아에 AH22ura3 에서 유전자 ARE1 과 ARE2 의 결실
벡터 pUG6(
Figure pct00002
U, Heck S, Fiedler T, Beinhauer JD and Hegemann JH(1996). A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res 24 2519-24)을 이용하여 유전자 ARE1과 ARE2를 결실시켰다.
동일한 방법으로 상기 2개의 유전자를 연속하여 결실시켰다. ARE1을 먼저 결실시킨 다음, ARE2을 결실시켰다. 플라스미드를 제조한 후, pUG6의 단편을 PCR에 의해 증폭하여 loxP-kanMX-loxP로 이루어진 툴을 얻었다. 프라이머를 제작하여 ARE1 내지 ARE2의 5'와 3' 서열을 pUG6 벡터의 loxP 영역에 접합시켰다.
수득한 PCR 산물은 S. 세레비시아에 AH22ura3에서 통합 형질전환을 위한 KanR 유전자, loxP 부위 및 ARE1 내지 ARE2 상동 영역으로 이루어져 있다. 효모에서 상동 재조합은 표적 서열의 결실로 나타난다.
G418에 대한 내성을 이용하여 양성 클론을 선택하였다. 이 효모 균주에서 ARE1 내지 ARE2 암호화 영역을 결실시켰다. 추가 유전자 결실을 준비하기 위해서 상기 균주로부터 G418 내성을 제거하였다. 이를 위해서 상기 균주를 pSH47에 의해 형질전환하였다(Guldner 등, 1996). 상기 벡터는 loxP 부위가 측면에 위치한 KanR 유전자를 제거하기 위한 크레(cre)-재조합효소를 갖고 있다.
균주를 5-FOA(5-플루오로오로트산)(1 g/L) 한천 평판 상에서 역선택하여 pSH47을 위치시켰다. 그 결과 수득된 균주는 유전자 ARE1과 ARE2 모두가 결실되어 있다.
실시예 2
S. 세레비시아에 AH22ura3 에서 유전자 DGA1 과 LRO1 의 결실
벡터 pUG6(Guldner 등,1996)을 이용하여 유전자 DGA1과 LR01을 결실시켰다.
동일한 방법으로 상기 2개의 유전자를 연속하여 결실시켰다. DGA1을 먼저 결실시킨 다음, LRO1을 결실시켰다. 플라스미드를 제조한 후, pUG6의 단편을 PCR에 의해 증폭하여 loxP-kanMX-loxP로 이루어진 툴을 얻었다.
프라이머를 제작하여 DGA1 내지 LRO1 각각의 5'와 3' 서열을 pUG6 벡터의 loxP 영역에 접합시켰다.
수득한 PCR 산물은 S. 세레비시아에 AH22ura3에서 통합 형질전환을 위한 KanR 유전자, loxP 부위 및 DGA1 내지 LRO1 상동 영역으로 이루어져 있다. 효모에서 상동 재조합은 표적 서열의 결실로 나타난다.
G418에 대한 내성을 이용하여 양성 클론을 선택하였다. 이 효모 균주에서 DGA1 내지 LRO1 암호화 영역을 결실시켰다. 추가 유전자 결실을 준비하기 위해서 상기 균주로부터 G418 내성을 제거하였다. 이를 위해서 상기 균주를 pSH47에 의해 형질전환하였다(Guldner 등, 1996). 상기 벡터는 loxP 부위가 측면에 위치한 KanR 유전자를 제거하기 위한 크레-재조합효소를 갖고 있다.
균주를 5-FOA(5-플루오로오로트산)(1 g/L) 한천 평판 상에서 역선택하여 pSH47을 위치시켰다.
그 결과 수득된 균주는 유전자 DGA1과 LRO1 모두가 결실되어 있다.
실시예 3
S. 세레비시아에 AH22ura3are1are2 에서 유전자 DGA1 과 LRO1 의 결실
벡터 pUG6(Guldner 등,1996)을 이용하여 유전자 DGA1과 LR01을 결실시켰다.
동일한 방법으로 상기 2개의 유전자를 연속하여 결실시켰다. DGA1을 먼저 결실시킨 다음, LRO1을 결실시켰다. 플라스미드를 제조한 후, pUG6의 단편을 PCR에 의해 증폭하여 loxP-kanMX-loxP로 이루어진 툴을 얻었다. 프라이머를 제작하여 DGA1 내지 LRO1 각각의 5'와 3' 서열을 pUG6 벡터의 loxP 영역에 접합시켰다.
수득한 PCR 산물은 S. 세레비시아에 AH22ura3에서 통합 형질전환을 위한 KanR 유전자, loxP 부위 및 DGA1 내지 LRO1 상동 영역으로 이루어져 있다. 효모에서 상동 재조합은 표적 서열의 결실로 나타난다.
G418에 대한 내성을 이용하여 양성 클론을 선택하였다. 이 효모 균주에서 DGA1 내지 LRO1 암호화 영역을 결실시켰다. 추가 유전자 결실을 준비하기 위해서 상기 균주로부터 G418 내성을 제거하였다. 이를 위해서 상기 균주를 pSH47에 의해 형질전환하였다(Guldner 등, 1996). 상기 벡터는 loxP 부위가 측면에 위치한 KanR 유전자를 제거하기 위한 크레-재조합효소를 갖고 있다.
균주를 FOA(5-플루오로오로트산)(1 g/L) 한천 평판 상에서 역선택하여 pSH47을 위치시켰다.
그 결과 수득된 균주는 4개의 유전자 ARE1, ARE2, DGA1과 LRO1가 결실되어 있다.
실시예 4
실시예 1 내지 3으로부터 얻어진 효모 균주와 대조 균주로서 AH22ura3 에서 에피솜 유사 플라스미드를 이용한 t- HMG1 의 발현
표준 방법을 이용하여 tHMG에 대한 DNA 서열(Basson 등(Mol. Cell. Biol. 8(1988), 3793-3808))을 사카로마이세스 세레비시아에 S288C의 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다(Mortimer and Johnston(Genetics 113(1986), 35-43)). 이 경우에 사용하는 프라이머는 DNA 올리고머인 tHMG-5'와 tHMG-3'이다. 얻어진 DNA-단편을 클레노우 처리한 후 클로닝 벡터 pUC19에 도입하여(Yanisch-Perron 등(1985): Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. In: Gene. Bd. 33, S. 103- 119) 벡터 pUC19-tHMG를 수득하였다. 플라스미드를 분리하고 엔도뉴클레아제 EcoRl와 BamHl로 pUC 19-tHMG를 제한한 후, 얻어진 단편을 효모 발현 벡터 pPT2b에 도입하고(Lang and Looman(Appl. Microbiol. Biotechnol. 44(1995), 147-156)) EcoRl와 BamHI로 더 처리하였다. 제조한 플라스미드 pPT2b-tHMG는 그 사이에 tHMG-DNA 단편이 있는 절단된 ADH1-프로모터(Bennetzen and Hall(Yeast 7 (1982), 475-477))와 TRP 1-종결자 (Tschumper G, Carbon J. Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and the TRP1 gene. Gene. 1980 Jul;10(2):157- 166)를 함유하고 있다. DNA 단편을 엔도뉴클레아제 EcoRV와 Nrul을 통해 벡터 pPT2b-tHMG로부터 분리하였고, 상기 DNA 단편은 소위 중간-길이의 ADH 1-프로모터, tHMG 유전자와 TRP1-종결자를 함유하고 있다. 이 DNA 단편을 효모 벡터 YEp13에 도입하고(Fischhoff 등 (Gene 27(1984), 239-251)), 엔도뉴클레아제 Sphl과 DNA 폴리머라아제로 처리하였다.
YEpH2를 S. 세레비시아에 AH22URA3are1are2, AH22URA3dga1lro1, AH22URA3are1are2dga1lro1과 AH22URA3에서 형질전환하였다. 대조 플라스미드로서 YEp13를 이용하였다.
실시예 5
염색체 통합 플라스미드 YDpUHK3 을 이용한 실시예 1 내지 3으로부터 얻어진 효모 균주와 대주 균주로서 AH22ura3 에서 t- HMG1 의 염색체 통합과 과발현
벡터 YEpH2를 엔도뉴클레아제 EcoRV와 Nrul로 처리하였다. 이에 따라 다음과 같은 영역을 가진 DNA-단편을 제작되었다: 테트라사이클린 내성 유전자로부터의 전사-활성화 영역(Sidhu and Bollon(10(1990) 157-166)), 중간 길이의 ADH1-프로모터, tHMG와 TRP1-종결자(발현 카세트). 이 DNA-단편을 벡터 YDpU(Berben 등 1991 Berben G., Dumont J., Gilliquet V, Bolle P-A. und Hilger F.(1991): "The YDp plasmids: a uniform set of vectors bearing versatile gene disruption cassettes for "Saccharomyces cerevisiae". "Yeast 7, 475-477)에 도입하고 Stul로 처리하였다. 이렇게 제조한 벡터 YDpUH2/12를 엔도뉴클레아제 Smal로 처리하고 카나마이신 내성을 암호화하는 DNA-서열로 결찰하였다(Webster, T. D., Dickson, R. C.(1983) Direct selection of Saccharomyces cerevisiae resistant to the antiobiotic G418 following transformation with a DNA vector carrying the kanamycin-resistance gene of Tn903. Gene 26: 243-252). 제조된 구조체(YDpUHK3)를 EcoRV로 처리하였다. 효모 균주 사카로마이세스 세레비시아에 AH22를 이 구조체로 형질전환하였다. 이 실시예서와 같이 상기 효모를 선형화된 벡터로 형질전환하면 URA3 유전자좌에서 전체 벡터가 염색체 통합된다. 발현 카세트(대장균 유래, 대장균-암피실린 내성 유전자, TEF-프로모터와 카나마이신 내성 유전자)의 일부가 아닌 통합된 벡터로부터의 영역들을 제거하기 위해서 우라실-영양요구성 효모를 프로모터하는 FOA 선택(Boeke 등(Methods in Enzymology 154(1987), 164-175))에 의해 형질전환된 효모를 선택 압력으로 처리하였다. 상기 선택에 기재되어 있는 우라실-영양요구성 균주의 이름은 AH22tH3ura8이고 URA3-유전자에서 염색체 통합으로서 tHMG1-발현 카세트를 갖는다.
표 1에 나타낸 효모 균주의 스쿠알렌 생산성/함량을 평가하였다. 이를 위해 상기 균주들을 30℃의 WMVIII-배지에서 72시간 150 rpm로 진탕하면서 배양하였다. 0.5 M의 끓는 HCl에서 세포를 파괴한 후, 지질을 20 ml n-헥산으로 2번 추출하여 GC/MS으로 분석/정량화하였다(상세한 내용은 항목 12를 참조할 것). 다음과 같은 데이터가 얻어졌다(표 1).
균주 스쿠알렌 [DW 당 %]
AH22tH3ura8are1are2dga1lro1 < 0.1
AH22tH3ura8are1are2dga1 0.2
AH22tH3ura8are1are2lro1 1.0
AH22tH3ura8dga1lro1are2 < 0.1
AH22tH3ura8are1are2 11.2
AH22tH3ura8dga1lro1 2.1
AH22tH3ura8 9.8
AH22ura3(야생형, 대조균주) 0.1
실시예 6
S. 세레비시아에 AH22tH3ura8are1are2 에서 유전자 FLD1 의 결실
벡터 pUG6 (Guldner 등, 1996)을 이용하여 유전자 FLD1을 결실시켰다.
플라스미드를 제조한 후, pUG6의 단편을 PCR에 의해 증폭하여 loxP-kanMX-loxP로 이루어진 툴을 얻었다. 프라이머를 제작하여 FLD1의 5'와 3' 서열을 pUG6 벡터의 loxP 영역에 접합시켰다.
수득한 PCR 산물은 S. 세레비시아에 AH22tH3ura8are1are2에서 통합 형질전환을 위한 KanR 유전자, loxP 부위 및 FLD1 상동 영역들로 이루어져 있다. 효모에서 상동 재조합은 표적 서열의 결실로 나타난다.
G418에 대한 내성을 이용하여 양성 클론을 선택하였다. 이 효모 균주에서 FLD1 암호화 영역을 결실시켰다. 추가 유전자 결실을 준비하기 위해서 상기 균주로부터 G418 내성을 제거하였다. 이를 위해서 상기 균주를 pSH47에 의해 형질전환하였다(Guldner 등, 1996). 상기 벡터는 loxP 부위가 측면에 위치한 KanR 유전자를 제거하기 위한 크레-재조합효소를 갖고 있다.
균주를 FOA(5-플루오로오로트산)(1 g/L) 한천 평판 상에서 역선택하여 pSH47을 위치시켰다.
그 결과 수득된 균주는 3개의 유전자 ARE1, ARE2와 FLD1가 결실되어 있고 AH22tH3ura8are1are2fld1로 나타낸다.
표 2에 나타낸 효모 균주의 스쿠알렌 생산성/함량을 평가하였다. 이를 위해 상기 균주들을 30℃의 WMVIII-배지에서 72시간 150 rpm로 진탕하면서 배양하였다. 0.5 M의 끓는 HCl에서 세포를 파괴한 후, 지질을 20 ml n-헥산으로 2번 추출하여 GC/MS으로 분석/정량화하였다(상세한 내용은 항목 12를 참조할 것). 다음과 같은 데이터가 얻어졌다(표 2).
균주 스쿠알렌
[DW 당 %]		 스쿠알렌/C-원[%] 스쿠알렌/발효부피[g/L]
AH22tH3ura8are1are2fld1 14.6 2.52 1.25
AH22tH3ura8are1are2 11.2 2.09 1.04
AH22tH3ura8 9.8 1.81 0.91
AH22ura3(야생형, 대조균주) 0.1 < 0.04 < 0.02
실시예 7
실시예 1 내지 5로부터 얻은 효모 균주에서 유전자 SAK1 과 HAP4 의 에피솜 유사 과발현
유전자 SAK1과 HAP4의 에피솜 유사 과발현을 위해서 이들 유전자를 각각 발현 벡터 pFlatl과 pFlat3으로 클로닝하였다. 이를 위해 상기 2개의 유전자를 프로모터를 이용하여 균주 S. 세레비시아에 S288 c의 염색체 DNA로부터 증폭하여 5' 말단과 3' 말단에 각각 Notl 제한 부위와 Xhol 제한 부위를 도입하였다. 얻어진 PCR 단편과 벡터 pFlatl과 pFlat3를 제한 엔도뉴클레아제 Xhol와 Notl로 제한하였다. 제한된 PCR 단편과 선형화된 벡터를 결찰하여 벡터 pFlat1-SAK1과 pFlat3-HAP4를 얻었다. 이들 벡터는 각각 유전자 SAK1과 HAP4의 복제물을 ADH1 프로모터의 구성 버전과 TRP1 종결자에 인접 위치에 포함하고 있어 SAK1과 HAP4의 강력한 구성적 발현을 제공한다.
플라스미드 pFlat3을 제작하기 위해서 플라스미드 YEp24를 Sphl로 절단하고 ADH1 프로모터와 플라스미드 pUC19의 다중 클로닝 부위에 의해 이격되어 있는 TRP1 종결자를 함유하는 900 bp Sphl 단편을 플라스미드 pPT2B로부터 삽입하였다. Notl와 Xhol에 대한 제한 부위를 함유하는 폴리링커를 삽입하여 다중 클로닝 부위를 연장하였다. 선택용 URA3 유전자를 포함하는 얻어진 플라스미드 pFlatl을 Ncol 제한에 의해 선형화하고 클레노우 폴리머라아제에 의해 뭉특하게 하여 효모 LEU2 유전자를 함유하는 YDpL의 뭉툭한 말단을 가진 BamHl 단편을 통합하였다. 얻어진 벡터는 pFlat3이었다.
플라스미드 pFlat1-SAK1과 pFlat3-HAP4 및 대조군으로서 빈 플라스미드 pFlatl과 pFlat 3을 실시예 1 내지 6으로부터 얻은 효모 균주에서 형질전환하였다.
표 3에 나타낸 효모 균주의 스쿠알렌 생산성/함량을 평가하였다. 이를 위해 상기 균주들을 30℃의 WMVIII-배지에서 72시간 150 rpm로 진탕하면서 배양하였다. 0.5 M의 끓는 HCl에서 세포를 파괴한 후, 지질을 20 ml n-헥산으로 2번 추출하여 GC/MS으로 분석/정량화하였다(상세한 내용은 항목 12를 참조할 것). 다음과 같은 데이터가 얻어졌다(표 3).
균주 스쿠알렌 [DW 당 %]
AH22tH3ura8are1are2lro1 pFlat1-SAK1 pFlat3 3.5
AH22tH3ura8are1are2lro1 1.0
AH22tH3ura8are1are2dga1 pFlat1 pFlat3-HAP4 5.3
AH22tH3ura8are1are2dga1 pFlat1-SAK1 pFlat3-HAP4 7.6
AH22tH3ura8are1are2dga1 pFlat1-SAK1 pFlat3 5.1
AH22tH3ura8are1are2dga1 pFlat1 pFlat3 0.2
AH22tH3ura8dga1lro1 pFlat3-HAP4 3.8
AH22tH3ura8dga1lro1 PFlat3 2.1
AH22tH3ura8 pFlat3-HAP4 28.7
AH22tH3ura8 9.8
AH22ura3 (야생형, 대조 균주) 0.1
실시예 8
박층 크로마토그래피에 의해 제작된 균주의 중성 지질 조성을 평가하였다. 전체 지질 추출과 박층 크로마토그래피를 항목 12에 따라 수행하였다. 도 1은 야생형 균주 AH22ura3, 조절 해제된 HMG-CoA 리덕타아제 AH22tH3ura8을 가진 균주 및 2개의 이중 결실 균주 AH22tH3ura8Δare1Δare2와 AH22tH3ura8Δdga1Δlro1의 전체/중성 지질조성을 나타내고 있다. 도 1로부터 야생형 균주(AH22ura3, 레인 1과 2)는 조절 해제된 HMG-CoA 리덕타아제를 발현하고 다량의 스쿠알렌을 생산하는 레인 3 내지 8에 있는 균주에 비해 매우 적은 양의 스쿠알렌을 생산함을 알 수 있다. 스테릴 에스테르(are1, are2)와 트리아실글리세롤(dga1, lro1)의 형성을 담당하는 효소를 암호화 유전자의 결실은 대응 균주에서 이들 성분의 완전한 결여로 나타난다(레인 5 내지 8에 있는 검은 색 박스로 표시함). 지질 성분은 표준물질인 스쿠알렌, 콜레스테릴-올레에이트, 트리올레에이트, 올레에이트와 에르고스테롤(미도시)을 통해 동정하였다.
<110> OrganoBalance Gmbh <120> Genetically modified organisms for the production of lipids <130> ORG/PCT/1002 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated HMG CoA-reductase <400> 1 atggaccaat tggtgaaaac tgaagtcacc aagaagtctt ttactgctcc tgtacaaaag 60 gcttctacac cagttttaac caataaaaca gtcatttctg gatcgaaagt caaaagttta 120 tcatctgcgc aatcgagctc atcaggacct tcatcatcta gtgaggaaga tgattcccgc 180 gatattgaaa gcttggataa gaaaatacgt cctttagaag aattagaagc attattaagt 240 agtggaaata caaaacaatt gaagaacaaa gaggtcgctg ccttggttat tcacggtaag 300 ttacctttgt acgctttgga gaaaaaatta ggtgatacta cgagagcggt tgcggtacgt 360 aggaaggctc tttcaatttt ggcagaagct cctgtattag catctgatcg tttaccatat 420 aaaaattatg actacgaccg cgtatttggc gcttgttgtg aaaatgttat aggttacatg 480 cctttgcccg ttggtgttat aggccccttg gttatcgatg gtacatctta tcatatacca 540 atggcaacta cagagggttg tttggtagct tctgccatgc gtggctgtaa ggcaatcaat 600 gctggcggtg gtgcaacaac tgttttaact aaggatggta tgacaagagg cccagtagtc 660 cgtttcccaa ctttgaaaag atctggtgcc tgtaagatat ggttagactc agaagaggga 720 caaaacgcaa ttaaaaaagc ttttaactct acatcaagat ttgcacgtct gcaacatatt 780 caaacttgtc tagcaggaga tttactcttc atgagattta gaacaactac tggtgacgca 840 atgggtatga atatgatttc taaaggtgtc gaatactcat taaagcaaat ggtagaagag 900 tatggctggg aagatatgga ggttgtctcc gtttctggta actactgtac cgacaaaaaa 960 ccagctgcca tcaactggat cgaaggtcgt ggtaagagtg tcgtcgcaga agctactatt 1020 cctggtgatg ttgtcagaaa agtgttaaaa agtgatgttt ccgcattggt tgagttgaac 1080 attgctaaga atttggttgg atctgcaatg gctgggtctg ttggtggatt taacgcacat 1140 gcagctaatt tagtgacagc tgttttcttg gcattaggac aagatcctgc acaaaatgtt 1200 gaaagttcca actgtataac attgatgaaa gaagtggacg gtgatttgag aatttccgta 1260 tccatgccat ccatcgaagt aggtaccatc ggtggtggta ctgttctaga accacaaggt 1320 gccatgttgg acttattagg tgtaagaggc ccgcatgcta ccgctcctgg taccaacgca 1380 cgtcaattag caagaatagt tgcctgtgcc gtcttggcag gtgaattatc cttatgtgct 1440 gccctagcag ccggccattt ggttcaaagt catatgaccc acaacaggaa acctgctgaa 1500 ccaacaaaac ctaacaattt ggacgccact gatataaatc gtttgaaaga tgggtccgtc 1560 acctgcatta aatcctaa 1578

Claims (12)

  1. 대응 야생형 생물체에 비해 아실-CoA:스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26) 및/또는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20) 및/또는 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158) 및/또는 아실-CoA:장쇄-알코올 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75)의 활성이 감소하거나 제거되고 대응 야생형 생물체에 비해 HMG-CoA-리덕타아제(EC1.1.1.34)의 활성이 증가하는 분리된 유전자 변형 비-포유류 생물체.
  2. 제1항에 있어서, 대응 야생형 생물체의 지질 입자에 축적되는 적어도 제1지질, 바람직하게는 트리아실글리세롤 및/또는 스테릴아실에스테르 및/또는 왁스 에스테르가 더 이상 합성되지 않고,
    상기 제1지질과는 다른 제2지질이 상기 유전자 변형 생물체의 지질 입자에 축적되며,
    상기 제2지질이 바람직하게는 중성 지질이고, 더 바람직하게는 프레놀 지질로 이루어진 군으로부터 선택되며, 특히 이소프레노이드이고, 더욱더 바람직하게는 트리테르펜이며, 가장 바람직하게는 스쿠알렌, 스쿠알렌 내 주쇄 탄소 원자에 결합된 수소 원자(들) 대신에 주쇄 탄소 원자에 결합되는 하나 이상, 특히 1 내지 10개 또는 1 내지 4개의 메틸 또는 에틸기를 추가로 포함하는 스쿠알렌 유도체 및 스테롤 지질의 아실 에스테르, 바람직하게는 스테롤 또는 스테로이드로부터 선택되는 생물체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대응 야생형 생물체에 비해 SAM:C-24 스테롤 메틸 트랜스퍼라아제(EC 2.1.1.41), C-22 스테롤 데사투라아제(EC 1.14.14.-)와 C-5 스테롤 데사투라아제(EC 1.14.21.6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 중 1개 또는 2개 또는 모든 활성이 감소하거나 제거되는 생물체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대응 야생형 생물체에 비해 스쿠알렌 모노옥시게나아제(EC1.14.99.7), 스테롤 14-데메틸라아제(EC1.14.13.70)와 7-데히드로콜레스테롤 리덕타아제(EC1.3.1.21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 중 1개 또는 2개 또는 모든 활성이 증가하는 생물체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 변형 활성 대신에 또는 그 외에 HAP4p 및/또는 SAK1p의 활성 및/또는 양이 증가하고/또는 REG1p 및/또는 FLD1p의 활성 및/또는 양이 감소하거나 제거되는 생물체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스테롤이 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 7-데히드로-콜레스테롤, 라노스테롤, 라노스테롤 유도체, 자이모스테롤, 자이모스테롤 유도체, 라토스테롤, 라토스테롤 유도체, 쿠쿠르비타신, 쿠쿠르비타신 유도체, 에피스테롤, 에피스테롤 유도체, 테아스테론, 테아스테론 유도체, 카스타스테론, 카스타스테론 유도체, 타이파스테롤, 타이파스테롤 유도체, 카타스테론, 카타스테론 유도체, 사이클로유칼레놀, 사이클로유칼레놀 유도체, 시토스테롤, 시토스테롤 유도체, 이소푸코스테롤, 이소푸코스테롤 유도체, 푸코스테롤, 푸코스테롤 유도체, 고르고스테롤, 고르고스테롤 유도체, 에르고스테롤, 에르고스테롤 유도체, 스티그마스테롤 또는 스티그마스테롤 유도체이고,
    상기 스테로이드가 안드로스테론, 안드로스테론 유도체, 테스토스테론, 테스토스테론 유도체, 안드로스테네디올, 안드로스테네디올 유도체, 안드로스테네디온, 안드로스테네디온 유도체, 칼루스테론, 칼루스테론 유도체, 메탄드리올, 메탄드리올 유도체, 볼라스테론, 볼라스테론 유도체, 에피안드로스테론, 에피안드로스테론 유도체, 메스타놀론, 메스타놀론 유도체, 스타놀론, 스타놀론 유도체, 스텐볼론, 스텐볼론 유도체, 에피테스토스테론, 에피테스토스테론 유도체, 코르티솔, 코르티솔 유도체, 알도스테론, 알도스테론 유도체, 프레그네놀론, 프레그네놀론 유도체, 코르티손, 코르티손 유도체, 코르티코스테론, 코르티코스테론 유도체, 노레틴드론, 노레틴드론 유도체, 우로코르티솔 또는 우로코르티솔 유도체인 생물체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물체가 원핵 생물체, 바람직하게는 박테리아, 더 바람직하게는 마이코박테리움, 스트렙토마이세스, 로도코쿠스, 노카르디아, 바실루스, 대장균, 코라이네박테리움, 아세토박터, 아시네토박터, 슈도모나스, 락토바실루스종 또는 스트렙토마이세스종으로 이루어진 군으로부터 선택되거나
    상기 생물체가 진핵 생물체, 바람직하게는 진균, 식물, 조류 또는 곤충 세포, 더 바람직하게는 야로위아 리폴라이티카, 로도투룰라 글루티니스, 리포마이세스 스타르케이, 칸디다 쿠르바타, 로도스포리디움 토르툴로이데스, 모르티에렐라 이사벨리나, 무코르 자보니쿠스, 사카로마이세스, 피키아 파스토리스, 클루이베로마이세스종, 리조푸스, 푸사리움, 푸시디움, 기베렐라, 모르티에렐라, 트리코데르마, 아스페르길루스종, 페니실리움종 또는 딕티오스텔리움종으로 이루어진 군, 특히 사카로마이세스, 사카로마이세스 세레비시아에, 사카로마이세스 델브룩키아이, 사카로마이세스 이탈리쿠스, 사카로마이세스 엘립소이데우스, 사카로마이세스 페르멘타티, 사카로마이세스 클루이베리, 사카로마이세스 크루세이, 사카로마이세스 락티스, 사카로마이세스 마륵시아누스, 사카로마이세스 마이크로엘립소이데스, 사카로마이세스 몬타누스, 사카로마이세스 노르벤시스, 사카로마이세스 올레아세우스, 사카로마이세스 파라독수스, 사카로마이세스 파스토리아누스, 사카로마이세스 프레토리엔시스, 사카로마이세스 로세이, 사카로마이세스 로욱시아이, 사카로마이세스 우바룸, 사카로마이세스 루드위기이아이, K. 락티스 K. 마륵시아누스 변종. 마륵시아누스, K. 테르모톨레란스와 같은 클루이베로마이세스속의 효모, 칸디다 우틸리스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 알비칸스, 칸디다 리포라이티카와 칸디다 베르사틸리스와 같은 칸디다속의 효모, 피키아 스티피디스, 피아키아 파스토리스와 피키아 소르비토필라와 같은 피키아속의 효모, 크라입토코쿠스, 데바로마이세스, 한세눌라, 사카로마이세코프시스, 사카로마이코데스, 쉬조사카로마이세스, 위커하미아, 데바요마이세스, 한세니아스포라, 클로에케라, 자이고사카로마이세스, 오가타에아, 쿠라이쉬아, 코마가타엘라, 메트쉬니코위아, 윌리옵시스, 나카자와에아, 크라입토코쿠스, 토룰라스포라, 불레라, 로도토룰라, 윌롭시스와 스포로볼로마이세스속의 효모로 이루어진 군, 또는 땅콩, 평지, 카놀라, 해바라기, 아플로, 양귀비, 겨자, 대마, 피마자, 올리브, 아마란스, 멕시칸 치아씨, 참깨, 금잔화, 선컵, 현삼, 엉겅퀴, 들장미, 개암, 아몬드, 마카다미아, 아보카도, 월계수, 호박, 아마, 대두, 피스타치오, 서양지치, 코코넛, 호두, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 라이밀, 쌀, 보리, 목화, 카사바, 후추, 매리 골드, 가지과, 감자, 야자수, 담배, 가지, 갈퀴나물, 완두콩, 알팔파, 커피, 코코아, 차, 버드나무, 잔디, 파이스코미트렐라 또는 세라토돈으로 이루어진 군, 또는 크라입티스타, 클로로모나도파이세아에, 크산토파이세아에, 크라입테코디니움, 크라이소파이타, 바실라리오파이타, 파에오파이타, 로도파이타, 클로로파이타, 합토파이타, 크라입티스타, 유글레노조아, 디노조아, 클로라 라크니오파이타로 이루어진 군, 또는 스포돕테라 프루기페르다, 트리코플루시아 니, 마메스트라 브라시카에, 드로소필라로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물체.
  8. 지질, 바람직하게는 제2지질을 생산하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 생물체의 용도로서, 상기 생물체를 배양하고 상기 생물체로부터 지질을 분리하는 것을 포함하는 용도.
  9. 백신용 보조제 제형의 제조, 생분해성 윤활제로서, 화장품 보조제로서 및/또는 약제의 제조에 있어서 제8항에 따라 얻어지는 제2지질의 용도로서, 상기 약제는 제2지질과는 다른 미용 활성 또는 약제학적으로 활성인 물질을 포함하고 제2지질은 미용 활성 또는 약제학적으로 활성인 물질과 혼합하여 투여용, 바람직하게는 국소 또는 경구 투여용으로 생약적으로 제조되는 용도.
  10. 아실-CoA:스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26) 및/또는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20) 및/또는 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158) 및/또는 스쿠알렌 모노옥시게나아제(EC1.14.99.7) 및/또는 스테롤 14-데메틸라아제(EC1.14.13.70) 및/또는 7-데히드로콜레스테롤 리덕타아제(EC1.3.1.21) 및/또는 HAP4p 및/또는 SAK1p의 활성 중 하나 또는 여러 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 하나의 핵산 또는 동일하거나 서로 다른 여러 개의 핵산을 포함하고 상기 핵산이 적어도 하나의 프로모터, 바람직하게는 구성적으로 활성인 프로모터에 의해 제어되는 핵산 구조체, 특히 플라스미드 또는 통합 발현 카세트.
  11. 제10항에 있어서, HMG-CoA-리덕타아제(EC1.1.1.34) 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산을 더 포함하고 상기 단백질은 바람직하게는 구성적으로 활성인 프로모터에 의해 제어되는 핵산 구조체.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 생물체를 생산하기 위한 제10항 또는 제11항에 따른 핵산 구조체의 용도로서, 전구 생물체가 형질전환되고, 상기 전구 생물체가 야생형 생물체 또는 전구 생물체이며, 대응 야생형 생물체에 비해 SAM:C-24 스테롤 메틸 트랜스퍼라아제(EC 2.1.1.41), C-22 스테롤 데사투라아제 및/또는 C-5 스테롤 데사투라아제(EC 1.14.21.6) 및/또는 아실-CoA:스테롤 아실트랜스퍼라아제/스테롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.26) 및/또는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제/디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.20) 및/또는 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제/인지질: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.158) 및/또는 아실-CoA:장쇄 알코올 O-아실트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.75) 및/또는 REG1p 및/또는 FLD1p로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 중 1개 또는 2개 또는 모든 활성이 감소하거나 제거되는 용도.
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