ES2617924T3

ES2617924T3 - Medios de cultivo para células de desarrollo que contienen concentraciones elevadas de ácido lipoico

Info

Publication number: ES2617924T3
Application number: ES08745495.5T
Authority: ES
Inventors: David K. Gardner; Mark G. Larman; Donald Linck
Original assignee: Vitrolife Sweden AB
Current assignee: Vitrolife Sweden AB
Priority date: 2007-05-01
Filing date: 2008-04-10
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2028-04-10
Also published as: HUE033456T2; EP2167644B1; US20130344595A1; DK2167644T3; US8859280B2; CN101679944A; JP2010525818A; PL2167644T3; AU2008245916A1; WO2008134220A1; PT2167644T; EP2167644A1; US20100173409A1

Abstract

Método para el cultivo de células de desarrollo, comprendiendo el método cultivar una célula madre, gameto, cigoto o embrión en un medio de cultivo de células de desarrollo que comprende: (a) agua; (b) sales inorgánicas; (c) al menos una fuente de energía; y (d) ácido lipoico, los derivados de ácido lipoico, ácido lipoico metilado o dihidrolipoato, o una combinación de los mismos a una concentración de 5 μM a 40 μM.

Description

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DESCRIPCION

Medios de cultivo para celulas de desarrollo que contienen concentraciones elevadas de acido lipoico Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a la fecundacion in vitro (FIV) de mamiferos y a medios de cultivo y a procedimientos utiles para llevar a cabo la fecundacion y desarrollo del embrion y para llevar a cabo el crecimiento de celulas madre. En particular, la invencion proporciona un metodo de cultivo de celulas de desarrollo en un medio de cultivo que comprende una concentracion elevada de acido lipoico que sustenta el crecimiento y desarrollo de celulas de desarrollo, incluyendo embriones, y aumenta significativamente la probabilidad de embarazo exitoso en FIV.

Antecedentes de la invencion

La fecundacion in vitro es una tecnica usada para superar diversas formas de esterilidad masculina y femenina. El procedimiento implica fecundar un ovocito con un espermatozoide in vitro y posteriormente transferir el embrion en desarrollo al cuerpo femenino. Aunque hace casi 30 anos del primer nacimiento por FIV (Steptoe, P.C. y Edwards, R.G., Lancet 2(8085): 366 (1978)), el procedimiento se enfrenta a constantes desafios de tasas de implantacion y embarazo bajas. En los primeros diez anos tras el nacimiento del primer “bebe probeta”, la tasa de exito notificada para FIV era solo del 8 a 10%. Esta baja tasa de exito se debia, al menos en parte, a la pobre calidad de los medios de cultivo para embriones. Lamentablemente, a pesar de un continuo esfuerzo por mejorar y especializar los medios de cultivo de FIV durante los ultimos 30 anos, la tasa de exito solo ha aumentado hasta de aproximadamente del 30 al 35% en casos en los que se emplea transferencia unica (basado en los registros nacionales de FIV en Finlandia y Suecia en 2005). Este dato de transferencia unica es el dato mas comparable a los datos de 1978. Este lento progreso en la mejora de las tasas de exito de FIV refleja la dificultad e imprevisibilidad de alterar y potenciar los medios de cultivo para celulas de desarrollo, tales como gametos, cigotos y embriones.

Los tipos de medios actualmente usados para FIV humana se han incluido dentro de dos categorias; sencillos y complejos. Los medios sencillos son aquellos, tales como fluido tubarico humano (HTF) y de Earle, que son soluciones salinas equilibradas con fuentes de energia de hidratos de carbono anadidas tales como piruvato, lactato y glucosa. Los medios complejos, tales como F-10 de Ham, incluyen ademas aminoacidos esenciales y no esenciales asi como otros aditivos, tales como vitaminas, antibioticos y suero o proteinas.

Aunque algunos medios de cultivo de FIV estan destinados a sustentar el desarrollo del embrion hasta la fase de 8 celulas o mas alla en un medio unico, la tendencia ha sido optimizar medios de cultivo separados para sustentar el embrion en desarrollo en diferentes fases de desarrollo. Esto ha conducido al uso extendido de medios de cultivo secuenciales en FIV. Por ejemplo, un sistema de medios de cultivo secuencial puede usar un medio de cultivo para el crecimiento de un embrion desde un cigoto de una celula hasta un embrion de 8 celulas durante las primeras 48 horas de desarrollo y otro medio de cultivo para hacer crecer el embrion de 8 celulas hasta la fase de blastocisto. Como el aparato reproductor femenino proporciona un entorno cambiante para el embrion en desarrollo, los medios de cultivo secuenciales se disenan para imitar mas estrechamente el aparato reproductor femenino durante el crecimiento del embrion in vivo. Las composiciones de medios normalmente difieren con respecto a componentes tales como aminoacidos y azucares para mejorar la optimizacion de los medios para sustentar el crecimiento y desarrollo embrionarios.

Los medios de cultivo empleados en FIV han experimentado alguna evolucion en el transcurso de los ultimos 30 anos. Sin embargo, en algunos aspectos los medios de cultivo han permanecido sorprendentemente sin cambios. El foco al que la mayoria de las investigaciones se dirigia en la mejora de medios de cultivo para embriones ha estado en los componentes que componen la parte central o principal de los medios (fuentes de energia de hidratos de carbono, aminoacidos, suero y sales/tampones). Otros componentes han recibido mucha menos atencion. En algunos casos parece que estos componentes se han incluido en medios de cultivo para embriones simplemente porque estaban presentes en los medios de cultivo de celulas somaticas tempranos a partir de los que evolucionaron inicialmente los medios de cultivo para embriones. El acido lipoico (LA) es un componente de este tipo.

El acido lipoico, tambien conocido como acido a-lipoico o acido tioctico, se conoce ampliamente por su papel como la coenzima de la subunidad E2 (dihidrolipoato aciltransferasa) de complejos multienzimaticos que catalizan la descarboxilacion oxidativa de piruvato, a-cetoglutarato y a-cetoacidos de cadena ramificada. Sin embargo, en los ultimos diez anos mas o menos, se ha hecho evidente que el acido lipoico tambien es un antioxidante. La eficacia del acido lipoico se ha atribuido a las propiedades antioxidantes unicas del sistema lipoato/dihidrolipoato, a su capacidad de eliminacion de especies reactivas del oxigeno (ROS) y al efecto significativo sobre las concentraciones tisulares de formas reducidas de otros antioxidantes, incluyendo uno de los mas poderosos, glutation. Los datos a partir de la bibliografia sugieren que el acido lipoico y dihidrolipoato (DHLA) pueden tener o no tener efectos promotores del crecimiento sobre tipos celulares especificos como celulas de leucemia murina y celulas T Jurkat. Vease Dovinova et al., Neoplasma, vol. 46, pags. 237-241 (1999); y Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 200, pags. 1134-1136 (1994).

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El acido lipoico es un compuesto de disulfuro anfifilico, que contiene un centro quiral que crea dos formas enantiomericas (R y L), siendo la mas activa biologicamente el enantiomero R. El componente disulfuro proporciona la molecula con propiedades quelantes de metales mientras que las propiedades anfifilicas del compuesto permiten que la molecula relativamente pequena (PM=206,34 g/mol) se difunda facilmente a traves de la membrana celular en la que se convierte facilmente en su ditiol, forma reducida, DHLA mediante varios complejos multienzima celulares implicados en la descarboxilacion de a-cetoacidos; etapas aerobicamente importantes en el metabolismo energetico. Ademas, el par DHLA/LA tiene un potencial redox notificado de -0,29 V, lo que le hace una fuerte unidad eliminadora de radicales oxigeno/aceptora de electrones. Este fuerte potencial redox permite que la molecula actue como recicladora potencial de otros antioxidantes tales como vitamina C, vitamina E, glutation, coenzima Q10 y ubiquinona. Aunque se presupone que la reduccion de acido lipoico tiene lugar dentro de las celulas, se cree que el DHLA generado sale de las celulas al medio circundante lo que implica capacidades antioxidantes tanto intracelulares como extracelulares.

El acido lipoico esta presente generalmente en procariotas y eucariotas. El lipoato, la base sin protonar, es la forma mas prevalente en condiciones fisiologicas y se cree que se sintetiza dentro de la celula mediante la acido lipoico sintetasa a partir del acido octanoico de los precursores y una fuente de azufre, mas probablemente un residuo de cisteina. Esto hace de la molecula un nutriente no esencial, aunque se ha notificado que es un suplemento de la dieta valioso en enfermedades asociadas con estres oxidativo excesivo, incluyendo artritis, diabetes, aterosclerosis, sindrome metabolico y Alzheimer. Vease, por ejemplo, Pershadsingh HA, Expert Opin Investig Drugs 16:291-302 (2007); Holquist etal., Pharmacol Ther. 113: 154-64 (2007).

A pesar del conjunto de conocimientos en aumento con respecto al papel del acido lipoico en el cuerpo, se sabe muy poco sobre su efecto sobre el crecimiento de celulas de desarrollo, tales como embriones, en cultivo. Aunque el acido lipoico se incluye a veces a bajas concentraciones en medios de cultivo para embriones, habitualmente esta ausente. Los dos estudios que han estudiado sistematicamente el papel del acido lipoico en medios de cultivo para embriones concluyeron que la omision de acido lipoico en medios de cultivo para embriones no tenia efecto sobre el resultado. El primer estudio examino el efecto de 11 vitaminas solubles en agua, incluyendo acido lipoico, a partir de medio F10 de Ham sobre el desarrollo de embriones de hamster de 8 celulas con respecto a blastocistos en eclosion y eclosionados in vitro (Kane et al., Biology of Reproduction, 39, 1137 (1988)). El estudio concluyo que la omision de acido lipoico en el desarrollo de embriones de hamster de 8 celulas dio como resultado un efecto no significativo sobre el desarrollo en cualquier fase de cultivo. El segundo estudio observo el efecto de la omision de las 11 vitaminas solubles en agua, incluyendo acido lipoico, de medio F10 de Ham sobre el cultivo de morulas de conejo con respecto a blastocistos expandidos (Kane, J. of Expt. Zoology, 245, 220 (1988)). Este estudio tambien concluyo que no habia un efecto significativo debido a la omision de acido lipoico. Sin embargo, se ha incluido acido lipoico en algunos medios de cultivo para embriones.

Por motivos que no estan claros a partir de la bibliografia publicada, aquellos medios de cultivo para embriones que incluyen acido lipoico limitan la concentracion a 1 pM o menos. Esto se debe probablemente al hecho de que muchos medios de cultivo para embriones evolucionaron inicialmente a partir de medios F10 y F12 de Ham, medios de cultivo somaticos antiguamente y todavia comunes, que incluian acido lipoico a una concentracion de 1 pM. Sin embargo, queda claro a partir de los estudios citados anteriormente que la necesidad o incluso conveniencia de incluir acido lipoico en tales medios no era una consideracion durante la adopcion temprana de medios F10 y F12 de Ham como base para medios de cultivo para embriones tempranos. Esto se muestra tambien claramente por el hecho de que ninguno de los actuales productos de medios de cultivo para embriones comerciales principales parece contener nada de acido lipoico. De hecho, la tendencia en la evolucion de medios de cultivo de F10 y F12 de Ham demuestra que el papel del acido lipoico en medios de cultivo se ha pasado por alto y no se ha apreciado.

El acido lipoico se ha incluido tambien en medios de cultivo de celulas somaticas a otras concentraciones, sin embargo, la concentracion de acido lipoico usada en tales medios varia en muchos ordenes de magnitud y se ha reconocido que “el cultivo in vitro con exito de diferentes tipos celulares requerira a menudo el uso de diferentes formulaciones de medios” (vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud PCT numero WO 98/08934). Esto es particularmente cierto para medios de cultivo para celulas de desarrollo, tales como embriones, que tienen requisitos muy diferentes que celulas somaticas. Ademas, incluso dentro del campo de cultivo de celulas somaticas, hay desacuerdo en cuanto a si el acido lipoico es beneficioso en un medio de cultivo (vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud PCT numero WO 99/35242, pagina 44, que declara que el “acido a-lipoico (acido tioctico) se anade a veces a medios de cultivo, pero hay pocas pruebas de que en realidad se necesite”). Como tal, la bibliografia con respecto al uso de acido lipoico en medios de cultivo de celulas somaticas no arroja luz en la conveniencia o efecto del acido lipoico en medios de cultivo para celulas de desarrollo, tales como gametos, cigotos y embriones.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona metodos mejorados para el cultivo de celulas de desarrollo de mamiferos, particularmente embriones, y celulas madre de mamiferos. Los medios de cultivo usados en los metodos se caracterizan por un intervalo de concentracion de acido lipoico y/o derivado de acido lipoico bien definido que es al menos 5 veces, y mas deseablemente al menos 10 veces, el de cualquier otro medio de cultivo para embriones

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conocido. Los medios de cultivo que incluyen acido lipoico o derivados de acido lipoico a concentraciones dentro del intervalo identificado por los inventores pueden proporcionar blastocistos con supervivencia aumentada, numeros de celulas aumentados, masas celulares internas aumentadas y/o porcentaje aumentado de la masa total compuesta por las celulas internas en relacion con los blastocistos cultivados en un medio de control. Esto es significativo porque estos factores se reconocen como indicadores de bienestar del embrion y desarrollo futuro exitoso hacia un feto dentro del utero.

En un metodo de la invencion, el medio de cultivo usado incluye agua, sales inorganicas, al menos una fuente de energia, y acido lipoico a una concentracion de 5 pM a 40 pM. En una realizacion, el medio incluye ademas uno o mas aminoacidos. Esto incluye medios de cultivo que tienen concentraciones de acido lipoico de 5 pM a 20 pM, ademas incluye medios de cultivo que tienen concentraciones de acido lipoico de 5 pM a 15 pM, ademas incluye medios de cultivo que tienen concentraciones de acido lipoico de 8 pM a 12 pM y aun mas incluye medios de cultivo que tienen concentraciones de acido lipoico de aproximadamente 10 pM. Los medios de cultivo pueden incluir opcionalmente otros componentes, tales como, pero sin limitarse a, factores de crecimiento, hormonas, vitaminas y antibioticos.

Los medios de cultivo pueden adaptarse para sustentar el crecimiento de celulas de desarrollo desde una primera fase de desarrollo hasta una segunda fase de desarrollo. Por ejemplo, un medio de cultivo puede disenarse para sustentar un embrion de mamifero hasta la fase de 4 celulas, hasta la fase de 8 celulas o hasta la fase de blastocisto. Por tanto, los diversos medios de cultivo abarcados por la presente invencion pueden incluir diferentes componentes a concentraciones variables.

Objetos, caracteristicas y ventajas adicionales de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada cuando se tome conjuntamente con los dibujos adjuntos.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 presenta datos que muestran el desarrollo de blastocistos de embriones de raton in vitro al 20% de O2 segun la presente invencion.

La figura 2 presenta datos que muestran el desarrollo de blastocistos de embriones de raton in vitro al 5% de O2 segun la presente invencion.

La figura 3 presenta datos que muestran la inhibicion de especies reactivas del oxigeno (ROS) en presencia de acido lipoico.

Descripcion detallada

Los metodos de la presente invencion implican FIV y composiciones de medios de cultivo de celulas madre que comprenden elevadas concentraciones de acido lipoico y/o derivados de acido lipoico que sustentan el desarrollo de gametos, cigotos y/o embriones in vitro antes de la implantacion. Mas especificamente, los presentes medios de cultivo de FIV comprenden acido lipoico y/o derivados de acido lipoico a una concentracion de 5 pM a 40 pM. Dentro de este intervalo, la maxima mejora con respecto al desarrollo del embrion se produce a aproximadamente 10 pM. Por tanto, los medios de cultivo de uso en la presente invencion tambien abarcan medios que tienen una concentracion de acido lipoico y/o derivado de acido lipoico dentro de intervalos mas definidos, incluyendo, por ejemplo, de 5 pM a 20 pM, de 5 pM a 15 pM y de 8 pM a 12 pM, de manera preferible aproximadamente 10 pM. Por tanto, la presente invencion implica medios de cultivo para embriones de mamiferos que tienen al menos un aumento de cinco veces, y deseablemente al menos un aumento de diez veces, en la concentracion de acido lipoico en comparacion con medios de cultivo para embriones conocidos que incluyen acido lipoico.

Los medios de cultivo y usos de los mismos descritos en el presente documento tienen usos significativos no comerciales y no industriales (por ejemplo, investigacion) ademas de (o como alternativa a) usos comerciales e industriales. Esta invencion no pretende sustentar usos comerciales de embriones humanos que estan prohibidos por ley.

El termino “medio de cultivo” se usa en la totalidad de la presente memoria descriptiva para referirse a medios acuosos que contienen sales e hidratos de carbonos preparados a pH y osmolaridad definidos que se usa para el cultivo in vitro de celulas de desarrollo de mamiferos tales como celulas madre, gametos, cigotos y embriones. Tales medios pueden prepararse en el laboratorio por cualquier medico experto en la tecnica y estan tambien disponibles comercialmente. Aunque gran parte de la discusion que sigue se centra en medios de cultivo para embriones en desarrollo, debe entenderse que los medios de cultivo pueden usarse tambien para desarrollar y cultivar celulas madre, gametos y cigotos.

El termino “embrion” se usa para referirse a celulas en todas las fases de desarrollo desde un ovulo fecundado hasta los primeros 5 o 6 dias.

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El termino “celula de desarrollo” se usa para referirse a celulas madre, gametos, cigotos y embriones.

La invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de los inventores de que los medios de cultivo que comprenden acido lipoico a una concentracion en el intervalo de 5 pM a 40 pM mejora sustancialmente la tasa de exito de procedimientos de FIV en comparacion con medios de cultivo que omiten acido lipoico, o que incluyen acido lipoico a concentraciones fuera de este intervalo. Sin desear o pretender vincularse a ninguna teoria, los inventores creen que los beneficios proporcionados por una concentracion elevada de acido lipoico en un medio de cultivo para celulas de desarrollo es el resultado de la interaccion de una variedad de efectos. Los efectos antioxidantes del acido lipoico desempenan probablemente un importante papel en el medio. Especificamente, se cree que la adicion de acido lipoico al cultivo desempena un papel en la proteccion de celulas en desarrollo frente al dano oxidativo producido por radicales libres y especies reactivas del oxigeno. Sin embargo, otros efectos tambien contribuyen probablemente a los beneficios y ayudan a definir el estrecho intervalo eficaz para el acido lipoico en un medio de cultivo para gametos, cigotos y embriones. Estos efectos incluyen la posibilidad de un aumento en los niveles intercelulares de GSH y efectos quelantes. Ademas, los beneficios debidos a niveles aumentados de acido lipoico en un medio de cultivo pueden ser el resultado de diversos productos metabolicos de acido lipoico que existen en diversas fases del metabolismo de acido lipoico dentro de las celulas de desarrollo. Por ejemplo, los beneficios pueden originarse con derivados de acido lipoico, tales como acido lipoico metilado o DHLA.

Las mejoras proporcionadas por los presentes medios pueden medirse mediante uno o mas de varios parametros. Estos incluyen tasas de supervivencia aumentadas para blastocistos hasta la fase de 4 o 5 dias, blastocistos con un mayor numero de celulas, blastocistos que tienen mayores masas celulares internas y blastocisto que tiene masas celulares internas que componen un porcentaje mayor del total. Los presentes inventores han encontrado que los medios de cultivo que tienen una concentracion de acido lipoico fuera del intervalo de 5 pM a 40 pM no consiguen proporcionar estos efectos beneficiosos, y pueden tener incluso un efecto perjudicial sobre el desarrollo del embrion. Por ejemplo, los inventores han descubierto que anadir acido lipoico a cultivos a menos de 5 pM muestra poco efecto, si es que lo hay, sobre (i) la progresion de embriones en cultivo a la fase de blastocisto, (ii) el numero de celulas en los blastocistos in vitro; o (iii) la masa celular interna de los blastocistos. En cambio, los embriones cultivados en medios que comprenden al menos acido lipoico 5 pM muestran todos estos efectos beneficiosos. Asimismo, los efectos beneficiosos del acido lipoico se pierden cuando se anade a medios de cultivo a concentraciones mayores de aproximadamente 40 pM. Por encima de esta concentracion, hay una tendencia hacia un desarrollo mas bajo de blastocisto de dia 4 y numeros de celulas reducidos. Por tanto, parece que el acido lipoico solo es eficaz a lo largo de un intervalo critico.

La mejora en el desarrollo del embrion que resulta del uso de los presentes medios de cultivo puede cuantificarse mediante comparacion de embriones cultivados en un medio mejorado que contiene altas concentraciones de acido lipoico y/o derivados del mismo (es decir, 5 pM a 40 pM) con embriones cultivados en un medio de control que difiere del medio mejorado solo en que el acido lipoico o derivados del mismo estan ausentes en el control. Por ejemplo, cuando se cultivan cigotos de mamifero fecundados (por ejemplo, cigotos de raton CF1) en el presente medio hasta el dia 4 o dia 5, los presentes medios de cultivo pueden proporcionar un aumento de al menos el 5%, al menos el 10%, o incluso al menos el 15% en uno o mas de los siguientes: (1) porcentaje de compactacion en el dia 3; (2) porcentaje total de desarrollo de blastocistos en el dia 4; (3) porcentaje total de desarrollo de blastocistos en el dia 5; y (4) porcentaje de eclosion de blastocisto en el dia 5. Ademas, los presentes medios pueden proporcionar blastocistos con un numero de celulas interno total y/o un aumento en el porcentaje de la masa total debido a las celulas internas que son al menos el 10% mayor, o incluso al menos el 15% o mayor, que aquellos de los blastocistos cultivados en el medio de control.

Los medios de cultivo de la presente invencion pueden optimizarse para sustentar el desarrollo del embrion en diversas fases. Por ejemplo, los medios pueden optimizarse para cultivar un embrion hasta la fase de 4 celulas, hasta la fase de 8 celulas, desde la fase de 4 celulas hasta la fase de 8 celulas, hasta la fase de blastocisto, o desde las fases de 4 u 8 celulas hasta la fase de blastocisto. Por tanto, la naturaleza y concentracion de los componentes esenciales y no esenciales de los cultivos puede variar; sin embargo, en cada medio de cultivo que incluye acido lipoico (o un derivado del mismo) la concentracion de acido lipoico es deseablemente de desde 5 pM hasta 40 pM. En un cultivo de celulas de desarrollo secuencial, el acido lipoico o derivados de acido lipoico pueden estar presentes en un medio y ausente en otros.

Las mejoras ofrecidas por los presentes medios de cultivo pueden conseguirse para blastocistos maduros y desarrollados en condiciones de oxigeno ambientales (por ejemplo, aproximadamente el 20%) y condiciones de oxigeno reducidas (por ejemplo, aproximadamente el 5%). Esto es importante porque la mayoria de los programas de FIV cultivan gametos y embriones en condiciones de oxigeno ambientales, a pesar del hecho de que las condiciones de oxigeno reducidas simulan mejor el entorno del utero y proporcionan mejores resultados. Quinn, P., Harlow, G.M., “The effect of oxygen on the development of preimplantation mouse embryos in vitro", J. Exp. Zool., octubre de 1978, 206(1):73-80.; Thompson, J.G., Simpson, A.C., Pugh, P.A., Donnelly, P.E., Tervit, H.R., “Effect of oxygen concentration on in-vitro development of preimplantation sheep and cattle embryos”, J. Reprod. Fertil., julio de 1990, 89(2):573-8. El motivo de esto es a menudo el coste de una incubadora de gas triple requerida para cultivar

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en condiciones de oxigeno bajas. Las presentes composiciones de medios ofrecen por tanto un medio de cultivo mas adecuado para acomodar embriones cultivados bajo estres oxidativo mayor.

Un medio de cultivo tipico para el cultivo de celulas de desarrollo, tales como embriones, incluira agua, sales inorganicas, una o mas fuentes de energia, uno o mas aminoacidos (incluyendo aminoacidos no esenciales y, opcionalmente, esenciales), como componentes centrales. Las fuentes de energia tipicas en un medio de cultivo para embriones incluyen fuentes de energia de hidratos de carbono, tales como piruvato, lactato y glucosa. Las sales inorganicas adecuadas incluyen, CaCl2-2H2O, CuSCL^hbO, FeSO4-7H2O, KCl, MgSO4, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, ZnSO4-7H2O y KH2PO4. Los aminoacidos no esenciales incluyen alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteina, glutamato, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina. Los aminoacidos esenciales incluyen histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano y valina. Ademas del acido lipoico y componentes centrales, los medios de cultivo incluiran normalmente otros aditivos. Estos incluyen vitaminas, tales como biotina, pantotenato, acido folico, niacinamida, piridoxina, riboflavina y tiamina, e incluyen ademas factores de crecimiento, hormonas y antibioticos, tales como penicilina G y sulfato de estreptomicina. Tambien pueden anadirse albumina (por ejemplo, albumina serica humana o albumina humana recombinante), polivinilpirrolidona, hialuronano, quelantes, tales como EDTA, y tampones, tales como tampon HEPES o tampon MOPS, al medio de cultivo. Los diversos componentes especificos que pueden incluirse tambien en los medios de cultivo incluyen, pero no se limitan a, cloruro de colina, hipoxantina, inositol, timidina, cianocobalamina, cisteamina, rojo de fenol y glutation.

La concentracion de los componentes centrales y otros aditivos en un medio de cultivo puede variar dependiendo de la fase de desarrollo del embrion para la que se optimiza el medio. Concentraciones tipicas para las sales inorganicas en los medios de cultivo pueden ser de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 140 mM. Concentraciones tipicas para las fuentes de energia en los medios pueden ser de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM. Concentraciones tipicas para la cantidad total de aminoacidos en los medios de cultivo pueden ser de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 15 mM o de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 12 mM, o de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 6 mM. La composicion de aminoacidos y concentraciones de los mismos puede variar dependiendo de la fase de desarrollo de las celulas en los medios de cultivo. Las vitaminas, factores de crecimiento, hormonas y otros diversos componentes en el medio de cultivo tienden a anadirse a concentraciones bastante bajas, por ejemplo, 1 mM o menor, 0,5 mM o menor, o incluso 0,1 mM o menor.

Los presentes medios de cultivo pueden formularse anadiendo suficiente acido lipoico o derivados de acido lipoico a los medios de cultivo para embriones existentes para proporcionar una concentracion de acido lipoico o derivado de acido lipoico de 5 pM a 40 pM. Los derivados de acido lipoico incluyen moleculas derivadas del acido lipoico que tienen efecto biologico equivalente o sustancialmente equivalente con respecto a la mejora de la supervivencia o desarrollo de celulas de desarrollo en cultivo. Por tanto, los derivados de acido lipoico incluyen, pero no se limitan a, acido lipoico metilado y DHLA. Para el fin de esta solicitud, los derivados tambien se refieren a otras moleculas de disulfuro/tioctico anfifilicas biologicamente activas que tienen propiedades fisiologicas esencialmente equivalentes.

Puede anadirse el acido lipoico o derivados de acido lipoico como una mezcla de formas enantiomericas, o como un unico enantiomero. En el ultimo caso, el enantiomero R puede ser mas deseable ya que es biologicamente mas activo. Por ejemplo, el acido lipoico podria anadirse a medios de cultivo sencillos disponibles comercialmente, tales como fluido tubarico humano (HTF), medio T6 de Whittingham y solucion salina de Earle equilibrada (EBSS) (disponible de Irvine Scientific) que se han complementado con piruvato, glucosa y lactato como fuentes de energia. Estos medios sencillos se han empleado generalmente en entornos clinicos de FIV para inseminacion de ovocitos y cultivo de embriones hasta transferencia en el dia 2 o 3. El acido lipoico puede anadirse tambien a medios de cultivo para embriones mas complejos disenados para sustentar el crecimiento de embrion temprano. Tales medios incluyen medio de cultivo G1™ disponible de Vitrolife. Este medio se disena para sustentar el desarrollo de embriones de fase de escision hasta alrededor de la fase de 8 celulas. El medio contiene hidratos de carbono, aminoacidos, y quelantes para sustentar al embrion temprano. La formulacion completa para el medio G1 se proporciona en la tabla 1.

Tabla 1. Composicion de un medio de cultivo G1

Componente: A Concentracion mas preferida B Intervalo preferido

NaCl: 90,08 80,0-100

KCl: 5,5 3,5-7,5

NaH2PO4: 0,25 0,05-1,5

MgSO4: 1 0,2-2,0

NaHCO3: 25 15,0-30

CaCl2: 1,8 0,8-2,8

Glucosa: 0,5 0,05-5,0

Lactato de Na (isomero L): 10,5 5,0-20,

Piruvato de Na: 0,32 0,1-1,0

Alanina: 0,1 0,01-0,5

Aspartato: 0,1 0,01-0,5

Asparagina: 0,1 0,01-0,5

Glutamato: 0,1 0,01-0,5

Alanil-glutamina: 0,5 0,1-1,0

Glicina: 0,1 0,01-0,5

Prolina: 0,1 0,01-0,5

Serina: 0,1 0,01-0,5

Taurina: 0,1 0,01-10,0

EDTA: 0,01 0,005-0,20

HSA: 5 mg/ml 1-10,0 mg/ml

Hialuronato: 0,1 mg/ml 0,02-0,5 mg/ml

(Las concentraciones en la tabla 1 se proporcionan en mM, a no ser que se indique lo contrario.)

Alternativamente, el acido lipoico o derivados de acido lipoico pueden anadirse a medio de cultivo de FIV disponible comercialmente que puede sustentar embriones mas alla del dia 3 (fase de 8 celulas). Estos medios de cultivo se han disenado para llevar embriones hasta la fase de blastocisto antes de la implantacion. Segun la presente 5 invencion, puede anadirse el acido lipoico a estos medios para potenciar incluso adicionalmente el desarrollo de blastocistos. Un ejemplo incluye medio esencial modificado a (aMEM), descrito en Desai et al., Human Reprod 12: 328-335 (1997). Un segundo ejemplo incluye medio HECM-6 mas pantotenato. McKiernan SH y Bavister BD, Human Reprod 15: 157-164 (2000). Otros ejemplos incluyen los medios G2 disponibles de Vitrolife. G2 es un medio que se disena para sustentar el desarrollo del embrion desde alrededor de la fase de 8 celulas (dia 3) hasta la fase de 10 blastocisto. El medio (tabla 2) contiene hidratos de carbonos, aminoacidos, y vitaminas para sustentar al embrion de ultima fase.

Tabla 2 - Composicion de un medio de cultivo G2

Componente: A Concentracion mas preferida B Intervalo preferido

NaCl: 90,08 80,0-100

KCl: 5,5 3,5-7,5

NaH2PO4: 0,25 0,05-1,5

MgSO4: 1 0,2-4,0

NaHCOs: 25 15-30,0

CaCl2: 1,8 0,8-2,8

Glucosa: 3,15 0,5-5,5

Lactato de Na (isomero L): 5,87 2,0-20,0

Piruvato de Na: 0,1 0,01-1,0

Alanina: 0,1 0,01-0,5

Aspartato: 0,1 0,01-0,5

Asparagina: 0,1 0,01-0,5

Glutamato: 0,1 0,01-0,5

Alanil-glutamina: 1 0,01-2,0

Glicina: 0,1 0,01-0,5

Prolina: 0,1 0,01-0,5

Serina: 0,1 0,01-0,5

L-Arginina-HCl: 0,6 0,1-1,2

L-Cistina 2HCl: 0,1 0,05-0,25

L-Histidina-HCl-H2O: 0,2 0,1-0,4

L-Isoleucina: 0,4 0,1-0,8

L-Leucina: 0,4 0,1-0,8

L-Lisina-HCl: 0,4 0,1-0,8

L-Metionina: 0,1 0,05-0,25

L-Fenilalanina: 0,2 0,1-0,4

L-Treonina: 0,4 0,1-0,8

L-Triptofano: 0,5 0,1-0,9

L-Tirosina 2Na: 0,2 0,1-0,4

L-Valina: 0,4 0,1-0,8

D-Ca Pantotenato: 0,002 0,001-0,004

Cloruro de colina: 0,007 0,003-0,01

Acido folico: 0,0023 0,001-0,0045

i-Inositol: 0,0111 0,005-0,02

Niacinamida: 0,0082 0,004-0,016

Piridoxal HCl: 0,0049 0,002-0,01

Riboflavina: 0,0003 0,0001-0,0006

Tiamina HCl: 0,003 0,001-0,006

HSA: 5 mg/ml 1-10 mg/ml

Hialuronato: 0,1 mg/ml 0,02-0,5 mg/ml

(Las concentraciones en la tabla 2 se proporcionan en mM, a no ser que se indique lo contrario.)

En una realizacion, los embriones en fase de 8 celulas se transfieren desde un medio de cultivo para embriones optimizado para sustentar el crecimiento de fase temprana (es decir, hasta la fase de 8 celulas) complementado con acido lipoico hasta un medio de cultivo para embriones optimizado para sustentar el crecimiento de fase tardia (es 5 decir, hasta la fase de blastocisto). El acido lipoico puede anadirse o no a los ultimos medios.

Los presentes medios de cultivo pueden formularse tambien anadiendo suficiente acido lipoico o derivados de acido lipoico a los medios de congelacion o cultivo para gametos (ovocitos o espermatozoides) existentes para proporcionar una concentracion de acido lipoico de 5 pM a 40 pM. Las tablas 3-5 a continuacion proporcionan 10 medios de cultivo para gametos en los que puede incluirse acido lipoico para proporcionar una supervivencia y un desarrollo celular mejorados.

Tabla 3 - Composicion de medio de maduracion de ovocitos

Componente: A Concentracion mas preferida B Intervalo preferido

NaCl: 90,08 80,0-100

KCl: 5,5 3,5-7,5

NaH2PO4: 0,25 0,05-1,5

MgSO4: 2 0,2-4,0

NaHCO3: 25 15-30,0

CaCl2: 1 0,8-2,8

Glucosa: 3,15 0,5-5,5

Lactato de Na (isomero L): 5,87 2,0-20,0

Piruvato de Na: 0,1 0,01-1,0

Alanina: 0,1 0,01-0,5

Aspartato: 0,1 0,01-0,5

Asparagina: 0,1 0,01-0,5

Glutamato: 0,1 0,01-0,5

Alanil-glutamina: 1 0,01-2,0

Glicina: 0,1 0,01-0,5

Prolina: 0,1 0,01-0,5

Serina: 0,1 0,01-0,5

Cisteamina: 0,5 0,1-2,0

L-Arginina-HCl: 0,6 0,1-1,2

L-Cistina 2HCl: 0,1 0,05-0,25

L-Histidina-HCl-H2O: 0,2 0,1-0,4

L-Isoleucina: 0,4 0,1-0,8

L-Leucina: 0,4 0,1-0,8

L-Lisina-HCl: 0,4 0,1-0,8

L-Metionina: 0,1 0,05-0,25

L-Fenilalanina: 0,2 0,1-0,4

L-Treonina: 0,4 0,1-0,8

L-Triptofano: 0,5 0,1-0,9

L-Tirosina 2Na: 0,2 0,1-0,4

L-Valina: 0,4 0,1-0,8

D-Ca Pantotenato: 0,002 0,001-0,004

Cloruro de colina: 0,007 0,003-0,01

Acido folico: 0,0023 0,001-0,0045

i-Inositol: 0,0111 0,005-0,02

Niacinamida: 0,0082 0,004-0,016

Piridoxal HCl: 0,0049 0,002-0,01

Riboflavina: 0,0003 0,0001-0,0006

Tiamina HCl: 0,003 0,001-0,006

HSA: 5 mg/ml 1-10,0 mg/ml

Hialuronato: 0,25 mg/ml 0,05-0,5 mg/ml

ITS: 10 ng/ml 1-100 ng/ml

IGF-I: 100 ng/ml 10-1000 ng/ml

EGF: 100 ng/ml 10-1000 ng/ml

FSII: 0,1 U/ml 0,01-10 U/ml

hCG: 0,1 U/ml 0,01-10 U/ml

*Las concentraciones estan en mM, a no ser que se indique lo contrario; el medio es acuoso.

Tabla 4 - Composicion de medio de preparacion de espermatozoides y fecundacion*

Componente: A Concentracion mas preferida B Intervalo preferido

NaCl: 100 75-100

KCl: 5,5 3,5-7,5

NaH2PO4: 0,5 0,05-1,5

MgSO4: 1 0,2-4,0

Glucosa: 3,15 0,5-5,6

Lactato de Na (isomero L): 5 2,0-20

Piruvato de Na: 0,32 0,1-0,5

NaHCOs: 25 15-30

CaCl2: 1,8 0,8-2,8

Glutation: 1 mg/ml 0,5-5,0 mg/ml

Alanina: 0,1 0,01-0,5

Aspartato: 0,1 0,01-0,5

Asparagina: 0,1 0,01-0,5

Glutamato: 0,1 0,01-0,5

Glicina: 0,1 0,01-0,5

Prolina: 0,1 0,01-0,5

Serina: 0,1 0,01-0,5

Taurina: 0,1 0,01-10,0

HSA: 5 mg/ml 1,0-10,0 mg/ml

Hialuronato: 0,1 mg/ml 0,02-0,5 mg/ml

Penicilina: 0,06 mg/ml 0,01-0,1 mg/ml

Estreptomicina: 0,05 mg/ml 0,01-0,1 mg/ml

5 Tabla 5 - Composicion de un medio para inyeccion de espermatozoides intracitoplasmica *

Componente: A Concentracion mas preferida B Intervalo preferido

NaCl: 90,08 75,0-105

KCl: 5,5 3,5-7,5

MgSO4: 2 0,4-4

NaHCO3: 5 2,0-10

MOPS/HEPES: 20 10-25,0

CaCl2: 1 0,5-2,0

Lactato de Na (isomero L): 10,5 5,0-20

Piruvato de Na: 0,32 0,1-1,0

Alanil-glutamina: 0,5 0,1-2,0

Glicina: 0,5 0,1-2,0

Prolina: 0,1 0,05-2,0

Serina: 0,1 0,05-2,0

Taurina: 0,1 0,05-5,0

HSA: 5 mg/ml 1-10,0 mg/ml

Hialuronato: 0,1 mg/ml 0,02-0,5 mg/ml

PVP: 10% 1 -20%

Ejemplos

10 Ejemplo 1 - Acido lipoico aumenta el numero de celulas del blastocisto de embriones cultivados

Segun la presente invencion, se uso una composicion de medio de cultivo que comprende acido lipoico durante el desarrollo de embriones de raton in vitro. El acido lipoico a una concentracion de 5 pM a 40 pM muestra tener

5

10

15

20

25

30

35

40

efectos significativos beneficiosos sobre el desarrollo del embrion de raton, incluyendo un aumento significativo en el numero de celulas del blastocisto y masa celular.

Se llevo a cabo el siguiente procedimiento. Se disolvio acido lipoico en etanol. Se preparo una disolucion de trabajo 100 mM en EtOH al 100% con las diluciones apropiadas hechas a los medios de cultivo despues de esto (concentraciones finales de 1 pM, 10 pM y 100 pM). Se uso un control vehicular, equivalente a la dilucion de la disolucion de mayor concentracion (0,1%), en todos los experimentos de cultivo. Se recogieron los cigotos de ratones hembra exogamicas CF1 de 4 semanas de edad. Se recogieron los cigotos encerrados en cumulos a las 21 h tras hCG y se desollaron con 1 mg/ml de hialuronidasa en G-MOPS complementada con 5 mg/ml de albumina serica humana. Se incubaron los cultivos o bien al 5% o bien al 20% de O2. Tras cuatro dias de cultivo, se analizo el desarrollo del blastocisto y se conto el numero de celulas en 200 embriones cultivados por tratamiento.

Los resultados se muestran en las figuras 1 (20% de O2) y 2 (5% de O2). Los datos se basan en 200 embriones cultivados por estudio. Cuando se sometio a prueba el acido lipoico por encima de una concentracion de 1 a 100 pM en embriones de raton (CF1) exogamicos en cultivo, los blastocistos resultantes tuvieron un numero de celulas significativamente mayor cuando se expusieron a 10 pM. A una concentracion de 1 pM de acido lipoico, no se observo un aumento estadisticamente significativo en el numero de celulas a una concentracion de o bien el 5% o bien el 20% de oxigeno. Ademas, el efecto beneficioso del acido lipoico se perdia a concentraciones mayores. De hecho, a una concentracion de 100 pM de acido lipoico, los embriones tenian un numero de celulas significativamente menor que los embriones correspondientes madurados en el medio de control. Los datos para las figuras 1 y 2 se presentan en las tablas 6 y 7, respectivamente, que tambien proporcionan los resultados para el trofectodermo, la masa celular interna (ICM) y la razon ICM.

Tabla 6

: n Dia 5, % de blast. trofectodermo n.° de celulas total ICM Razon ICM

Control: 202 58,91% 51,17 64,49 13,28 20,60%

Vehiculo: 216 42,59% 50,51 62,11 11,60 18,68%

1 pM: 198 59,18% 55,30 68,37 13,07 19,12%

10 pM: 231 61,47%* 61,054** 77,527*** 16,4731**** 21,25%

100 pM: 201 42,57% 43,6667 53,9583 10,2916 19,07%

Student

Tabla 7


: Dia 5, % de blast. trofectodermo n.° de celulas total ICM Razon ICM

Control: n = 205 66,34% 71,91 92,12 20,21 21,93%

Vehiculo: n = 209 66,03% 69,99 87,81 17,82 20,29%

1 pM: n = 209 76,15% 68,57 85,40 16,83 19,71%

10 pM: n = 215 76,74%# 79,28## 101,77### 22,49#### 22,10%

100 pM: n = 196 53,13% 60,61 74,21 13,61 18,33%

# P < 0,023; ## P < 0,013; ### P < 0,002; #### P < 0,001, tal como se calcula usando la prueba de la t de Student

Ejemplo 2 - Acido lipoico en cultivos de FIV secuenciales de embriones de raton de dia 4

Se hicieron crecer embriones de raton CF1 o bien en G1 solo o bien en G1 mas 10 pM de acido lipoico. Tras 48 horas, se movieron los embriones de ambos grupos de tratamiento a G2. Se incubaron todos los cultivos en O2 bajo. Se evaluaron las tasas de compactacion y se midieron las tasas de desarrollo de blastocistos a las 71 y 78 horas. Entonces se tineron y contaron los blastocistos de manera diferenciada. Los resultados se muestran en la tabla 8. La adicion de acido lipoico a G1 aumento el numero de masa celular interna y el porcentaje de masa celular interna del total.

Tabla 8

Tratamiento: n Dia 3, %, a.m. Dia 4, % de blast., a.m Dia 4, % de blast., p.m % expandido en el dia 4 TE ICM Total % de ICM

G1 (Control): 58 81,0 22,7 51,7 19,0 34±2 11,4±1 45±2 25%

5

10

15

20

25

30

35

40

G1 + LA 10 pM: 58 81,0 22,4 65,5 39,7 34±2 16±1 ** 50±2** 31%**

Significativamente diferente del control; *, P<0,05; **, P<0,01, tal como se calcula usando la prueba de la t de Student

Ejemplo 3- Intervalo de concentracion eficaz para acido lipoico en el desarrollo del embrion de raton

Se establecio el intervalo eficaz de concentraciones de acido lipoico para potenciar el desarrollo de blastocistos y numero de celulas usando embriones de raton CF1. Los resultados se muestran en la tabla 9. Los datos muestran que el acido lipoico es eficaz entre 5 y 40 pM en promover el desarrollo de blastocistos y aumentar el numero de celulas. Por encima de estas concentraciones, el acido lipoico produce un menor desarrollo de blastocistos hacia el dia 5 y un menor numero de celulas relativo al control.

Tabla 9. Efecto de la concentracion de acido lipoico sobre el desarrollo de cigotos de raton CF1 cultivados al 20% de

oxigeno

: n Dia 3 (% de compactacion) Dia 4 (% de blast. total) Dia 5 (% de blast. total) Dia 5 (% de eclosion) Numero de celulas total

Control: 66 34,3% 50,0% 75,0% 34,4% 80,2±4,9

LA 5 pM: 62 38,9% 51,6% 81,8% 40,9% 90,2±4,8

LA 10 pM: 62 51,4% 62,9% 92,7% 40,0% 91,3±4,7

LA 20 pM: 63 26,5% 42,9% 73,1% 31,3% 94,0±7,2

LA 40 pM: 67 22,9% 37,3% 74,6% 28,4% 69,4±5,8

LA 80 pM: 65 22,9% 4,6% 29,7% 9,4% 34,0

Ejemplo 4 - Efectos protectores del acido lipoico frente a especies reactivas del oxigeno.

Con el fin de determinar si el acido lipoico tiene un efecto antioxidante, se realizaron una serie de experimentos usando la tincion fluorescente diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina (H2DFFDA), que reacciona con productos intermedios de especies reactivas del oxigeno (ROS). Se anadio H2DFFDA 200 pM en DMSO a GMOPS-Plus (disponible de Vitrolife). Se disolvio el acido lipoico en EtOH siendo la concentracion final dentro del medio de EtOH al 0,1%. Entonces se fotooxido cada gota con 4 exposiciones sucesivas de 2,5 minutos usando luz UV para generar ROS.

La figura 3 muestra los efectos de acido lipoico sobre la reduccion de la generacion de ROS dentro de los medios de cultivo. Todos los resultados se basan en la comparacion con respecto al grupo vehicular (EtOH al 0,95%), que no fue significativo en comparacion con el grupo de control. La inclusion de acido lipoico a todas las concentraciones dio como resultado un descenso dependiente de la concentracion en la generacion de oxigeno reactivo, indicando por tanto que el acido lipoico tiene un efecto antioxidante.

Ejemplo 5 - Efecto de los medios G de acido lipoico sobre el desarrollo de embriones humanos.

Segun la presente invencion, se examina el efecto de medios de cultivo que contienen acido lipoico sobre el desarrollo de embriones humanos. La mitad de los embriones de pacientes con buen pronostico se cultivan en medios de cultivo G1 libres de acido lipoico (es decir, el control), mientras que la otra mitad se cultivan en medio G1 que contiene acido lipoico 10 pM (es decir, el medio de acido lipoico elevado).

Los datos son consistentes con los obtenidos en el modelo de raton. Los embriones se desarrollan mas rapido hasta la fase de 8 celulas y de blastocisto en el medio de acido lipoico elevado en comparacion con el control.

Para los fines de esta divulgacion y a no ser que se especifique lo contrario, “un” o “uno/una” significa “uno/una o mas”.

Claims

10

15 2.
3.

20
4.
5.

25
6.

30

35

40
7.

45
8.
9.

50
10.

55 11.

REIVINDICACIONES

Metodo para el cultivo de celulas de desarrollo, comprendiendo el metodo cultivar una celula madre, gameto, cigoto o embrion en un medio de cultivo de celulas de desarrollo que comprende:

(a) agua;

(b) sales inorganicas;

(c) al menos una fuente de energia; y

(d) acido lipoico, los derivados de acido lipoico, acido lipoico metilado o dihidrolipoato, o una combinacion de los mismos a una concentracion de 5 pM a 40 pM.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el medio de cultivo de celulas de desarrollo comprende ademas uno o mas aminoacidos.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la celula madre, gameto, cigoto o embrion se cultiva en condiciones de oxigeno ambientales.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la celula madre, gameto, cigoto o embrion se cultiva en condiciones de oxigeno reducidas.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de cultivo de una celula madre, gameto, cigoto o embrion comprende cultivar un embrion humano.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de cultivo de una celula madre, gameto, cigoto o embrion comprende:

cultivar un embrion hasta la fase de 4 celulas; cultivar un embrion hasta la fase de 8 celulas; cultivar un embrion hasta la fase de blastocisto;

cultivar un embrion desde la fase de 8 celulas hasta la fase de blastocisto; cultivar un embrion hasta la fase de 3 dias; o cultivar un embrion hasta la fase de 5 dias.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el medio de cultivo sustenta el desarrollo de embriones de mamiferos hasta la fase de blastocisto, y en el que los embriones de mamiferos son embriones de raton CF1.

Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el medio de cultivo de celulas de desarrollo tiene una concentracion de acido lipoico de 5 pM a 20 pM.

Metodo segun la reivindicacion 8, en el que el medio de cultivo de celulas de desarrollo tiene una concentracion de acido lipoico de 5 pM a 10 pM.

Metodo segun la reivindicacion 8, en el que el medio de cultivo de celulas de desarrollo tiene una concentracion de acido lipoico de 8 pM a 12 pM.

Metodo segun la reivindicacion 8, en el que el medio de cultivo de celulas de desarrollo tiene una concentracion de acido lipoico de 10 pM.