ES2596777T3

ES2596777T3 - Compuestos flavonoides glicosilados

Info

Publication number: ES2596777T3
Application number: ES08703469.0T
Authority: ES
Inventors: Misa Ochiai; Harukazu Fukami; Masahiro Nakao; Akio Noguchi
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2007-01-19
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2017-01-12
Anticipated expiration: 2028-01-18
Also published as: CN101605905A; EP2128265A1; US20100256345A1; US9364492B2; WO2008088047A1; CN102702288A; AU2008205895A1; EP2128265B1; JP2008174507A; ES2743480T3; CA2675733A1; CN101605905B; EP2728008B1; EP2128265A4; EP2728008A1; JP5184786B2; CA2675733C

Abstract

Un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en: 3-O-galato de 5-O-a6alpha;-D-glucopiranosil-(-)-epigalocatequina; 3-O-galato de 7-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(-)-epigalocatequina; 4'-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(+)-catequina; 3'-O- (4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(+)catequina; y 3-O-galato de 3'-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(-)epigalocatequina.

Description

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Esta enzima permite una reacción satisfactoria a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0, particularmente de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5, o a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 55°C, particularmente de aproximadamente 45°C a aproximadamente 55°C, bajo las condiciones que se muestran en la sección de Ejemplos.

[Usos de los glicósidos]

Los glicósidos obtenidos como se describe en la presente memoria se pueden utilizar como composiciones alimenticias, composiciones farmacéuticas o composiciones cosméticas. Más específicamente, por ejemplo, semejante composición que incorpora un glicósido de un compuesto de catequina se puede utilizar como un agente para los siguientes fines, como en el caso de catequina: anti-alérgico, anti-oxidante, anti-canceroso, anti-inflamatorio, anti-bacterias/anticaries, anti-virus, desintoxicante, mejora de la flora intestinal, eliminación del olor, antihipercolesterolemia, anti-hipertensión, anti-hiperglucemia, anti-trombosis, prevención de la demencia, quema de grasa corporal, inhibición de la acumulación de grasa corporal, mejora de la resistencia, anti-fatiga o mejora de la función renal, o alternativamente, también se puede utilizar como una composición alimenticia, una composición farmacéutica o una composición cosmética.

Las composiciones alimenticias incluyen alimentos nutritivos suplementarios, alimentos saludables, alimentos dietéticos terapéuticos, alimentos para la salud general, suplementos y bebidas. Las bebidas incluyen bebidas de té, zumos, refrescos y preparaciones bebibles. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar como fármacos o cuasi fármacos, preferiblemente formulaciones orales o preparaciones externas dermatológicas, y pueden ser proporcionadas en forma de soluciones, comprimidos, gránulos, píldoras, jarabes, lociones, pulverizaciones, emplastos o pomadas. Las composiciones cosméticas se pueden proporcionar en forma de cremas, lociones líquidas, lociones en emulsión o aerosoles.

La cantidad de glicósido o glicósidos incorporada en la composición alimenticia, farmacéutica o cosmética de la presente invención no está limitada en modo alguno y puede ser diseñada según se requiera por los expertos en la técnica en la consideración, por ejemplo, de la solubilidad y el sabor haciendo referencia a ingestas diarias preferidas del compuesto o los compuestos flavonoides correspondientes. Por ejemplo, la cantidad de glicósido o glicósidos de la presente invención incorporada a una composición se puede ajustar de 0,01% a 99,9% en peso o se puede determinar de manera que el glicósido o los glicósidos de la presente invención se puedan proporcionar de 100 mg a 20 g por día en una sola dosis o en dosis divididas (p. ej., tres dosis).

La composición alimenticia, farmacéutica o cosmética de la presente invención puede comprender además diversos ingredientes aceptables para fines alimenticios, farmacéuticos o cosméticos. Los ejemplos de estos aditivos y/o ingredientes incluyen vitaminas, sacáridos, excipientes, agentes disgregantes, aglutinantes, lubricantes, emulsionantes, agentes de isotonicidad, tampones, solubilizantes, antisépticos, estabilizadores, antioxidantes, agentes colorantes, correctivos, aromas, agentes coagulantes, ajustadores del pH, espesantes, extractos de té, extractos de hierbas y minerales.

Como se describe en la presente memoria, una proteína enzimática contenida en un agente enzimático se puede inmovilizar sobre un portador apropiado para su uso como enzima inmovilizada. En cuanto al portador; se puede utilizar cualquier resina convencional utilizada para el mismo propósito, incluyendo resinas alcalinas (p. ej., MARATHON WBA (Dow Chemical), serie SA, serie WA o serie FP (Mitsubishi Chemical Corporation, Japón), y Amberlite IRA904 (Organo)), así como resinas hidrófobas (p. ej., Diaion FPHA13 (Mitsubishi Chemical Corporation, Japón), serie HP (Mitsubishi Chemical Corporation, Japón), y Amberlite XAD7 (Organo)). Además, se pueden preferir otras resinas tales como Express-Ion D (Whatman), DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh Corporation, Japón) y DEAE-Sefarosa CL4B (Amersham Biosciences) para su uso. Se puede utilizar cualquier técnica convencional para la inmovilización de enzimas, como se ilustra por medio de adsorción física, el método de unión que utiliza la unión iónica o covalente para la inmovilización, el método de entrecruzamiento que utiliza un reactivo que tiene un grupo funcional divalente para la inmovilización a través del entrecruzamiento, y el método de atrapamiento covalente que incluye una enzima dentro de un gel o de una membrana semipermeable de la estructura de red. Por ejemplo, la inmovilización puede llevarse a cabo permitiendo que una enzima (20 a 2000 mg, p. ej., 50 a 400 mg) en agua destilada sea adsorbida en 5 ml de cada resina, seguido de la eliminación del sobrenadante y secado.

También se describe un agente enzimático para la glicosilación de un compuesto flavonoide, que comprende una enzima que tiene actividad de glicosilación y que deriva del género Trichoderma (p.ej. Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma saturnisporum, Trichoderma ghanense, Trichoderma koningii, Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum o Trichoderma polysporum, preferiblemente Trichoderma viride). Semejante agente enzimático comprende una o más glicosidasas derivadas de hongos filamentosos ascomicetos, y puede comprender adicionalmente otros aditivos (p. ej., componentes estabilizadores de enzimas, componentes donadores de glicosilo, otras enzimas). Ventajas de la invención

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cultivada. Además, todo el volumen de la solución pre-cultivada se inoculó en 900 ml del mismo medio líquido y se cultivó a 30°C durante 3 días, seguido de filtración a través de un filtro para preparar una solución de sobrenadante de cultivo. Después de la adición de sulfato de amonio (387 g, saturación de 80%) al sobrenadante de cultivo (690 ml), la mezcla se agitó y se centrifugó para recoger un producto precipitado. El producto precipitado resultante se

5 diluyó con 10 ml de tampón de acetato 0,1 M (pH 5,0) para su uso como una solución de enzima bruta. A la solución de enzima bruta (100 µl), se le añadieron catequina (3 mg) y dextrina (10 mg) y se agitaron a 50°C durante 24 horas para provocar una reacción enzimática. La solución de reacción se diluyó 10 veces con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, de los cuales 10 µl se analizaron a continuación por medio de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

10 Condiciones del análisis

Columna: Develosil C30-UG-5 (4,6 x 150 mm)

Condiciones de gradiente: Eluyente B al 5% → Eluyente B al 50%/20 min

15 Eluyente A: TFA al 0,1%/agua destilada Eluyente B: acetonitrilo al 90%/TFA al 0,08% Velocidad de flujo: 1 ml/min Longitud de onda de detección: 280 nm

20 Como se muestra en la Figura 1, los resultados confirmaron la generación de un glicósido de catequina a través de la reacción anterior. Además, también se confirmó que se generaba un glicósido similar en el caso de la utilización de γ-ciclodextrina como donador de glicosilo. Estos resultados sugieren que T. viride cepa IAM5141 produce y secreta una enzima que glicosila la catequina utilizando dextrina o γ-ciclodextrina como donador de glicosilo.

25 [Ejemplo de Referencia 2: Propiedades de diversos agentes enzimáticos derivados del género Trichoderma]

Se disolvió (+)-catequina (3 mg) en 100 µl de tampón de acetato 0,1 M (pH 5) y se mezcló con cada agente enzimático (10 mg o 10 µl) y el almidón soluble (10 mg, Nacalai Tesque, Inc., Japón) o dextrina (10 mg), seguido de agitación a 50°C durante 1 día. Después de la reacción, el sobrenadante centrifugado se diluyó 10 veces y se

30 analizó por HPLC. Las condiciones de análisis se establecieron como se muestra en el Ejemplo 1.

Los agentes enzimáticos utilizados se muestran en la siguiente tabla, junto con sus resultados experimentales.

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unidos a través de enlaces α-1,4 y de que la enzima pretendida tiene la capacidad de degradar estos polímeros, se sugiere que la enzima puede ser una enzima del tipo de las de la familia de la α-amilasa.

Para un estudio adicional, con respecto a un supuesto ORF que tiene el motivo del dominio catalítico de alfa-amilasa (Núm. de acceso PF00128) en la base de datos de la familia de proteínas (PFAM), se extrajeron secuencias de 9, 6, 8 y 6 aminoácidos de las bases de datos de información genómica de Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Magnaporthe grisea y Fusarium graminearum, respectivamente, entre los microorganismos pertenecientes a los mismos hongos filamentosos ascomicetos que Trichoderma y ya identificados por sus secuencias del genoma. Para estas secuencias, se preparó un alineamiento mediante el programa de búsqueda de homología ClustalW y se preparó un dendrograma por medio de la vista de árbol del programa de preparación de dendrogramas, por medio de lo cual las secuencias se agruparon basándose en su homología. Cuatro secuencias de aminoácidos en el Grupo 1 de la figura 2, es decir, MG02772.4 (EAA47529), MG10209.4 (EAA48146), AN3388.2 (EAA63356) y FG03842.1 (EAA71544) (los números entre paréntesis son los Núms. de Acceso Genebank) fueron alineadas para sintetizar oligoADN correspondientes a las secuencias de aminoácidos de sus regiones altamente conservadas (Figura 3, subrayado).

AMY-12f: 5'-TAYTGYGGNGGNACNTTYAARGGNYT-3' (SEQ ID NO: 1) AMY-15R: 5'-TTYTCNACRTGYTTNACNGTRTCDAT-3' (SEQ ID NO: 2) AMY-17R: 5'-GGTNAYRTCYTCNCKRTTNGCNGGRTC-3' (SEQ ID NO: 3)

A partir de las células húmedas (aproximadamente 1 g) de T. viride IAM5141 cultivadas como se ha descrito anteriormente, se extrajo el ADN genómico con un DNeasy Plant Maxi Kit (QIAGEN). Este ADN genómico (50 ng) se utilizó como molde para llevar a cabo la reacción de PCR con cebadores AMY-12f y AMY-15r o cebadores AMY-12f y AMY-17r. Es decir, la PCR se llevó a cabo mediante el uso de ExTaq (Takara Bio Inc., Japón) bajo las siguientes condiciones: 94°C durante 2 minutos, (94°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto) x 30 ciclos, y 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron por medio de electroforesis en gel de agarosa, confirmando un fragmento de aproximadamente 0,6 kpb para la combinación de cebadores de AMY-12f y AMY-15r y un fragmento de aproximadamente 1,0 kpb para la combinación de cebadores de AMY-12f y AMY-17r. A continuación, estos fragmentos de ADN se extrajeron del gel de agarosa y se purificaron con un GFX PCR DNA y Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences). Cada ADN fue clonado con un kit de clonación TOPO-TA (Invitrogen) y analizado para determinar su secuencia de nucleótidos utilizando ABI 3100 Avant (Applied Biosystems). La secuencia de nucleótidos obtenida para el primer fragmento se incluye dentro de la secuencia de nucleótidos obtenida para el último fragmento. Se llevó a cabo una búsqueda de homología con Blastx para esta secuencia de nucleótidos frente a las secuencias de aminoácidos registradas en GenBank, indicando que la homología más alta se observaba con MG10209.4 (EAA48146).

2. Determinación de la secuencia del genoma del homólogo de amilasa:

Basándose en la secuencia de nucleótidos resultante de aproximadamente 1,0 kpb, se diseñaron los siguientes cebadores y se utilizaron para llevar a cabo la PCR inversa.

TRa2-2: 5'-CCAACCTGGTATCTACATAC-3' (SEQ ID NO: 4) TRa2-3: 5'-AGATGGCATCAAATCCCAT-3' (SEQ ID NO: 5)

En primer lugar, el ADN genómico preparado a partir de T. viride IAM5141 se digirió completamente con HindIII o PstI, y a continuación se cerró por auto-ligación a través de la incubación durante la noche a 16°C con una ligación elevada (Toyobo Co., Ltd., Japón). Estos ADN (0,1 µg cada uno) fueron utilizados cada uno como molde para llevar a cabo la reacción de PCR con los cebadores anteriores TRa2-2 y TRa2-3. La PCR se llevó a cabo mediante el uso de LA Taq (Takara Bio Inc., Japón) bajo las siguientes condiciones: 94°C durante 2 minutos, (95°C durante 30 segundos, 66°C durante 15 minutos) x 30 ciclos, y 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR resultantes se analizaron por electroforesis en gel de agarosa, lo que confirmó un fragmento de ADN de aproximadamente 2 kb para el caso de la utilización de ADN genómico digerido con HindIII como molde, y un fragmento de ADN de aproximadamente 4,5 kb para el caso de la utilización del genoma digerido PstI como molde. Estos fragmentos de ADN fueron escindidos cada uno del gel de agarosa y clonados de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Las secuencias de nucleótidos se determinaron a partir de ambos extremos de los fragmentos insertados. Se encontró que las secuencias de nucleótidos del genoma digerido con HindIII y el genoma digerido con PstI se solapaban entre sí hasta llegar a los sitios de las enzimas de restricción. Las secuencias de nucleótidos obtenidas de este modo se ligaron a la secuencia parcial obtenida previamente. Esta secuencia de nucleótidos se muestra en la Figura 4 (TRa2-gDNA) y el SEQ ID NO: 6. La región codificante del homólogo de α-amilasa se dedujo por comparación con las 4 secuencias del Grupo 1 de la Figura 2, la aparición de un codón de iniciación y un codón de terminación, etc. Se consideró que el codón de iniciación era ATG en los nucleótidos 423-425, mientras que se consideró que el codón de terminación era TAA en los nucleótidos 1926-1928.

3. ADNc, clonación de homología con α-amilasa:

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3-O-galato de (-)-epigalocatequina (3 mg) y dextrina (10 mg) y se hicieron reaccionar con agitación a 50°C durante 1 día. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se diluyó 10 veces con una solución de ácido trifluoroacético al 0,1% y se analizó por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en las mismas condiciones que las utilizadas en el Ejemplo 1. Como resultado, no se observó producto de reacción en la solución de reacción que se había hecho reaccionar con el sobrenadante del cultivo de la cepa de control (cepa C-1) transformada con el vector pYE22m, mientras que se confirmó la generación de glicósidos de catequina y glicósidos de 3-O-galato de epigalocatequina en el caso de la cepa TRa2-1 (Figura 7).

7. Preparación catalizada con TRa2 de glicósidos de catequina:

La cepa TRa2-1 se inoculó en 200 ml de medio líquido YPD y se cultivó con agitación a 30°C durante 3 días. Las células se recogieron por centrifugación para obtener el sobrenadante del cultivo. Este sobrenadante de cultivo (100 ml) se concentró hasta 50 ml utilizando un disco ultrafiltración NMWL 30000/celulosa regenerada mientras se añadían 100 ml de tampón de acetato 0,01 M (pH 5), y se utilizó como una solución de enzima TRa2. La solución de enzima TRa2 anterior (50 ml) se mezcló con (+)-catequina (1,5 g) y dextrina (5 g), seguido de agitación a 45°C durante 18 hr. La solución de reacción se centrifugó, y el sobrenadante se adsorbió sobre una columna de resina LH20 (Amersham Biosciences) de 60 ml/φ de 2,5 x 20 cm. Después de la elución con agua destilada (120 ml) y etanol del 10% (240 ml), se recogieron y se liofilizaron las fracciones de glicósido para dar 530 mg de polvo liofilizado, 50 mg de los cuales se disolvieron a continuación en 5 ml de agua destilada y se separaron sobre una columna Develosil C30-UG-5 de 20 x 250 mm, A: TFA al 0,1%/agua destilada, B: metanol del 90%/TFA al 0,1%, B al 30%, 3 ml/min, 280 nm. Los picos 1 a 6 se recogieron, y se liofilizaron en el orden en el que había eluido de la columna de HPLC. Los análisis de MS y RMN sugieren que el Pico 1 era 5-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-Dglucopiranosil)-(+)-catequina, el Pico 2 era 5-O-α-D-glucopiranosil-(+)-catequina, El Pico 3 era 4'-O-(4-O-α-Dglucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(+)-catequina, el Pico 4 era 4'-O-α-D-glucopiranosil-(+)-catequina, el Pico 5 era 3'O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(+)-catequina, y el Pico 6 era 3'-O-α-D-glucopiranosil-(+)-catequina.

5-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(+)-catequina: m/z 615,2, RMN δ ppm (D2O); 2,71 (1H, dd), 2,85 (1H, dd), 3,42 (1H, t), 3,56-3,85 (9H, m), 4,19 (1H, t), 4,26 (1H, dd), 4,87 (1H, d) , 5,70 (1H, d), 6,19 (1H, d), 6,39 (1H, d), 6,83 (1H, dd), 6,90-6,93 (2H, m). 5-O-Α-D-glucopiranosil-(+)-catequina: m/z 453,2, RMN δ ppm (D2O): 2,62 (1H, dd), 2,81 (1H, dd), 3,43 (1H, t), 3,453,55 (1H, m), 3,6-3,7 (3H, m), 3,83 (1H, t), 4,18 (1H, dd), 4,76 (1H, d), 5,61 (1H, d), 6,09 (1H, d), 6,31 (1H, d), 6,77 (1H, d), 6,8-6,9 (2H, m). 4'-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(+)-catequina: m/z 615,2, RMN δ ppm (D2O); 2,54 (1H, dd), 2,81 (1H, dd), 3,43 (1H, t), 3,60 (1H, dd), 3,68-3,94 (9H, m), 4,19-4,28 (2H, m), 4,82 (1H, d), 5,44 (1H, d), 5,62 (1H, d), 6,04 (1H, d), 6,11 (1H, d), 6,91 (1H, dd), 7,00 (1H, d), 7,22 (1H, d). 4'-O-Α-D-glucopiranosil-(+)-catequina: m/z 453,2, RMN, δ ppm (D2O); 2,45 (1H, dd), 2,73 (1H, dd), 3,45 (1H, t), 3,653,75 (4H, m), 4,11 (1H, dd), 4,7-4,75 (2H, m), 5,53 (1H, d), 5,95 (1H, d), 6,02 (1H, d), 6,83 (1H, dd), 6,91 (1H, d), 7,15 (1H, d). 3'-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(+)-catequina: m/z 615,2, RMN δ ppm (D2O); 2,54 (1H, dd), 2,80 (1H, dd), 3,44 (1H, t), 3,59 (1H, dd), 3,67-3,90 (9H, m), 4,17-4,24 (2H, m), 4,83 (1H, d), 5,41 (1H, d), 5,55 (1H, d), 6,03 (1H, d), 6,10 (1H, d), 7,10 (1H, d), 7,06 (1H, d), 7,26 (1H, d). 3'-O-Α-D-glucopiranosil-(+)-catequina: m/z 453,2, RMN δ ppm (D2O); 2,43 (1H, dd), 2,73 (1H, dd), 3,27 (1H, s), 3,44 (1H, t), 3.6 a 3.7 (4H, m), 3,88 (1H, t), 4,10 (1H, dd) , 4,69 (1H, d), 5,46 (1H, d), 5,93 (1H, s), 6,01 (1H, s), 6,89 (1H, d), 6,94 (1H, dd), 7,18 (1H, d).

8. Preparación catalizada por TRa2 de glicósidos de 3-O-galato de epigalocatequina:

La cepa TRa2-1 se inoculó en 100 ml de medio líquido YPD y se cultivó con agitación a 30°C durante 3 días. Las células se recogieron por centrifugación para obtener el sobrenadante del cultivo. Este sobrenadante de cultivo (45 ml) se concentró hasta 20 ml usando un disco de ultrafiltración NMWL 30000/celulosa regenerada mientras se añadían 50 ml de tampón de acetato 0,1 M (pH 5), y se utilizó como una solución de enzima TRa2. Esta solución de enzima TRa (20 ml) se mezcló con 3-O-galato de (-)-epigalocatequina (600 mg) y dextrina (2 g), seguido de agitación a 50°C durante 1 día. La solución de reacción se centrifugó, y el sobrenadante se adsorbió sobre una columna de resina LH20 25 ml/φ de 1,5 x 30 cm. Después de la elución con agua destilada (100 ml), etanol del 10% (100 ml), etanol del 20% (100 ml) y etanol del 30% (200 ml), se recogió y se liofilizó la fracción de etanol del 30%. El polvo liofilizado (120 mg) se disolvió en 12 ml de agua destilada y se separó en una columna Develosil C30-UG-5 de 20 x 250 mm, A: TFA al 0,1%/agua destilada, B: metanol del 90%/TFA al 0,1%, B al 40%, 3 ml/min, 280 nm. Los análisis de MS y RMN sugieren que el Pico 2 era 3-O-galato de 7-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(-)epigalocatequina, el Pico 5 era 3-O-galato de 3'-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(-)epigalocatequina, y el Pico 6 era (-)-3-O-galato de 3'-O-α-D-glucopiranosil-epigalocatequina. En contraste, se sugirió que el Pico 3 era una mezcla de glicósido y maltotetraósido, a juzgar por sus datos de MS (m/z 621,2, 1107,3), y el glicósido se consideró que era 3-O-galato de 7-O-α-D-glucopiranosil-(-)-epigalocatequina, a juzgar por su tiempo de retención. 3-O-galato de 7-O-(4-O-α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranosil)-(-)-epigalocatequina: m/z 783,2, RMN δ ppm (CD3OD); 2,88 (1H, dd), 2,0,1 (1H, dd), 3,26 (1H, t), 3,46 (1H, dd), 3,6-3,9 (9H, m), 4,08 (1H, t), 5,00 (1H, s), 5,20

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[Tabla 3]

imagen13: Producto (% de área)

Donador de glicosilo: 7-Glc 5-Glc

Maltosa: --

Maltotriosa: 0,51 2,54

Maltotetraosa: 1,60 7,15

Maltopentaosa: 1,98 7,87

Maltohexaosa: 2,06 7,89

Maltoheptaosa: 1,97 7,39

Dextrina: 2,15 8,80

γ-Ciclodextrina: 4,73 14,53

[Ejemplo de Referencia 6: Especificidad de sustrato]

La cepa TRa2-1 se cultivó durante la noche a 30°C con agitación en 10 ml de medio YPD. Después de alcanzar la fase de reposo, la solución de cultivo se inoculó en el mismo medio (2% (v/v)) y se cultivó con agitación a 30°C durante 3 días. Después del cultivo, el sobrenadante se recogió por centrifugación y se concentró 5 veces para dar una solución de enzima bruta TRa2. La reacción se realizó a 45°C durante 24 horas en 100 µl de solución de reacción de enzima que contenía compuesto aceptor de glicosilo (3-O-galato de (+)-catequina, 3-O-galato de (-)epigalocatequina, esculetina, naringenina, quercetina, daidzeína, genisteína o kaempferol) 0,5 mM o 10 mM, 10 mg de dextrina, tampón de acetato 100 mM (pH 5,2) y la solución de enzima bruta, seguido de análisis mediante HPLC. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8.

La razón de área (%) entre el compuesto aceptor y producto glicósido fue de 10% para (+)-catequina, 17,7% para 3O-galato de (-)-epigalocatequina, 3,5% para esculetina, 4,4% para naringenina, 9,4% para quercetina, 10,7% para daidzeína, 6,8% para genisteína, y 3,1% para kaempferol.

[Ejemplo de Referencia 7: Estudio del pH y la temperatura óptimos]

Se mezcló (+)-catequina (6 mg) con Pancellase BR (20 mg, Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd., Japón), dextrina (20 mg, Nacalai Tesque, Inc., Japón) y cada tampón (200 µl), seguido de agitación a 50°C durante 6 horas. Los tampones utilizados fueron tampón de acetato 0,1 M (pH 4-5,5), tampón de fosfato 0,1 M (pH 6-7), y tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,6 a 9). Después de la reacción, el sobrenadante centrifugado se diluyó 10 veces y se analizó por HPLC. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9 (a la izquierda).

Se disolvieron (+)-catequina (6 mg) y dextrina (20 mg, Nacalai Tesque, Inc., Japón) a 50°C en 200 µl de tampón de acetato 0,1 M (pH 5). Después de enfriar, esta solución se mezcló con Pancellase BR (20 mg, Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd., Japón) y se agitó de 20°C a 60°C durante 6 horas. Después de la reacción, el sobrenadante centrifugado se diluyó 10 veces y se analizó por HPLC. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9 (a la derecha).

[Ejemplo de Referencia 8: Estabilidad térmica del glicósido]

Después de que el tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 7,0, 30 µl) que contenía (+)-catequina o 4'-O-α-Dglucopiranosil-(+)-catequina 100 mM obtenido en el Ejemplo 4 se tratara a diferentes temperaturas que variaban de 4°C a 100°C durante 0 a 4 horas, cada muestra se transfirió a hielo y se mezcló con TFA al 0,1% (60 µl), seguido de análisis mediante HPLC de la misma manera que se muestra en el Ejemplo 1. La Figura 10 muestra el % restante de (+)-catequina o 4'-O-α-D-glucopiranosil-(+)-catequina cuando se trató a diferentes temperaturas. Los resultados indicaron que la 4'-O-α-D-glucopiranosil-(+)-catequina era más estable frente al calor que la catequina.

[Ejemplo de Referencia 9: Solubilidad de los glicósidos]

Se añadieron la (+)-catequina o la 5-O-α-D-glucopiranosil-(+)-catequina obtenidas en el Ejemplo 3 a agua a diferentes concentraciones que variaban de 10 a 450 mg/ml y se disolvieron mediante agitación vigorosa, seguido de centrifugación para eliminar los productos precipitados. El sobrenadante se analizó por medio de HPLC para cuantificar las cantidades de (+)-catequina y 5-O-α-D-glucopiranosil-(+)-catequina. También se repitió el mismo procedimiento para estudiar la solubilidad de 3-O-galato de (-)-epigalocatequina o 3-O-galato de 5-O-α-D

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

glucopiranosil-(-)-epigalocatequina. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 11.

Los resultados indicaron que la (+)-catequina era sustancialmente insoluble en agua, mientras que la 5-O-α-Dglucopiranosil-(+)-catequina mostró una solubilidad al menos 40 veces mayor o más. Del mismo modo, también se confirmó que el (-)-3-O-galato de epigalocatequina tenía una solubilidad significativamente mayor tras la glicosilación.

[Ejemplo de Referencia 10: Preparación de enzima inmovilizada]

Se estudiaron las siguientes resinas como resinas de inmovilización: Express-Ion D (Whatman), Diaion FPHA13 (Mitsubishi Chemical Corporation, Japón), DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh Corporation, Japón), DEAE-Sepharose CL4B (Amersham Biosciences) y Amberlite IRA904 (Organo). En primer lugar, se disolvió celulasa RS (240 mg) en agua destilada (8 ml) y a esto se le añadió cada una de las resinas (5 ml). Después de agitar durante 30 minutos, la resina se lavó dos veces con agua destilada y después se liofilizó para su uso como una enzima inmovilizada. Cada una de las enzimas inmovilizadas (5 ml) se cargó en una columna (12 x 150 mm) y se hizo circular con catequina (450 mg), dextrina (1500 mg) y tampón de acetato 0,1 M (15 ml, pH 5) para causar una reacción a 50°C durante 4 días. Después de la reacción, la solución de reacción se diluyó 10 veces y se analizó por medio de HPLC. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.

[Tabla 4]

Resina de: Rendimiento de

inmovilización: glicósido (% de área)

Express-Ion D: imagen14 15,3

FPHA13: imagen15 25,4

DEAE650M: imagen16 18,0

DEAECL4B: imagen17 18,3

IRA904: imagen18 11,2

[Ejemplo de Referencia 11: Glicosilación de catequina metilada]

Se mezcló (-)-epigalocatequina-3-(3"-O-metil)galato (2,7 mg) con Pancellase BR (9 mg), dextrina (9 mg) y tampón de acetato 0,1 M (90 µl, pH 5), seguido de agitación a 50°C durante 18 horas. Después de la reacción, el sobrenadante centrifugado se diluyó 10 veces y se analizó por medio de HPLC. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura

12.

[Ejemplo de Referencia 12: Glicosilación mediante el uso conjunto de agentes enzimáticos]

Un extracto de té verde rico en 3-O-galato de (-)-epigalocatequina (30 g, nombre comercial: Teavigo, DSM Nutrition Japón) se mezcló con Pancellase BR (100 g), Dextrina Clúster (100 g, Ezaki Glico Co., Ltd., Japón), α-ciclodextrina (100 g) y ciclodextrina glucanotransferasa (100 ml, Amano Enzyme Inc., Japón) en tampón de acetato 0,1 M (1000 ml, pH 5), seguido de agitación a 50°C durante 3,5 horas. Después de la reacción, el sobrenadante centrifugado se adsorbió sobre una columna de Sefarosa LH20 (1000 ml, Amersham Biosciences). La columna se lavó con agua destilada (6000 ml) y después se hizo eluir por etapas con etanol del 30% (6000 ml), seguido de concentración y liofilización para preparar una fracción de glicósido (13,9 g).

[Ejemplo 13: Evaluación del sabor de los glicósidos]

El glicósido preparado en el Ejemplo 12 (BR-1), los componentes de glicósido individuales uniformemente purificados (es decir, 3-O-galato de 5-O-α-D-glucopiranosil-(-)-epigalocatequina (5G-1), 5-O-(4-O-α-D-glucopiranosilα-D-glucopiranosil)-(-)-epigalocatequina (5GG-1) y 3-O-galato de 7-O-α-D-glucopiranosil-(-)-epigalocatequina (7G-1)) y el extracto de té verde (TVG-1) utilizado como material de partida se disolvieron cada uno en 200 ppm en agua destilada y se evaluaron para determinar la calidad del sabor mediante el uso de un sensor de sabor (Taste and Aroma Strategic Research Institute Co., Ltd., Japón) que detecta la intensidad de cada sabor como una diferencia de potencial en un electrodo de "membrana lipídica artificial" que imita la lengua humana. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 13. Los glicósidos sometidos a ensayo mostraron cada uno un nivel significativamente menor de sabor astringente que el extracto de té verde (TVG-1) que sirve como control, lo que indica que la calidad del sabor se mejoraba a través de la glicosilación. Del mismo modo, las pruebas sensoriales realizadas por los panelistas también proporcionan los resultados de la evaluación que indican una reducción de sabores amargos y astringentes y por lo tanto, el aumento de potabilidad.

Claims

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