JP3712285B2 - 新規ポリフェノール配糖体、その製造法およびその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、茶ポリフェノール類の配糖体、その製造法およびその用途に関し、さらに詳細には、呈味性を改良した新規構造のポリフェノール配糖体、その製造法およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
茶ポリフェノール類は、コレステロール上昇抑制作用（特公平２−４４４４９号公報）、抗菌作用（特開平２−２７６５６２号公報）、抗酸化作用（特公平１−４４２３４号公報）、抗腫瘍作用（特開昭６０−１９０７１９号公報）、血圧上昇抑制作用および酵素活性阻害作用（特開平３−１３３９２８号公報）などの生理活性作用を示し、その有効成分はエピガロカテキン、エピカテキン３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン３−Ｏ−ガレートであることが知られている。しかしながら、これらの物質は強い収斂性を持つ渋味成分であることから、呈味性が著しく損なわれ、食品をはじめ各種分野への利用を考える上で大きな欠点となっている。
【０００３】
現在、茶ポリフェノールと類似の構造を持つ（＋）−カテキンについては、（＋）−カテキンとグルコース−１−リン酸あるいはシュークロースとの混合液にシュークロースホスホリラーゼを作用させることにより、易溶性や色沢安定性を付与した（＋）−カテキン配糖体を製造する方法（特開平５−１７６７８６号公報）や（＋）−カテキン配糖体をメラニン色素の生成に関与するチロシナーゼの阻害剤として皮膚外用剤に利用する方法（特開平４−２７３８９０号公報）が開発されている。
しかし、コレステロール上昇抑制作用、抗菌作用、抗酸化作用、抗腫瘍作用や血圧上昇抑制作用などの生理活性作用においては、（＋）−カテキンはエピガロカテキン、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートおよびエピカテキン３−Ｏ−ガレートに比べ、その生理活性が著しく弱く、また場合によっては活性を持たない。
従って、配糖体についても（＋）−カテキン配糖体よりもエピガロカテキン、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートおよびエピカテキン３−Ｏ−ガレートの配糖体の方がより生理活性を期待することができる。
【０００４】
一方、茶ポリフェノールである（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート、（−）−エピガロカテキンや（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートの配糖体については、これまでに本発明に示すような構造が明らかにされたとの報告がない。従って、本発明の新規ポリフェノール配糖体の特性や機能性についても明らかになっていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の茶ポリフェノール類とデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物に、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることによって、ポリフェノール類を配糖化できることを見いだした。
さらに、得られたポリフェノール配糖体を単離して茶ポリフェノール類の３’位、３’と５位および３’と７位が配糖化された新規化合物の構造を明らかにした。また、本発明の新規ポリフェノール配糖体は、収斂性のある渋味がほとんどなく呈味性に優れていることを確認し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、一般式１（式中Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水酸基あるいは重合度２から１０のマルトオリゴ糖残基、Ｘは水酸基あるいは水素、Ｙは水酸基あるいはガロイル基を、またｎは１から９の整数を示す。）で表されるポリフェノール配糖体を提供し、さらにエピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、ガロカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、エピカテキン、エピカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、カテキン３−Ｏ−ガレ−トあるいはこれらを２種類以上含むポリフェノール類混合物とデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする上記のポリフェノール配糖体の製造方法並びに上記のポリフェノール配糖体を含む組成物を提供するものである。
【０００７】
【化５】
【０００８】
以下に、本発明を詳しく説明する。
本発明に用いるポリフェノールの基本骨格は下記の一般式５で表される。
【０００９】
【化６】
【００１０】
この構造式において、ベンゾピラン環の２位と３位はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。例えば、配糖体のアグリコン部分として（＋）あるいは（−）−ガロカテキン、（＋）あるいは（−）−エピガロカテキン、（＋）あるいは（−）カテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−ガロカテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートが挙げられる。
【００１１】
前記の一般式１で表されるポリフェノール配糖体の製造方法に関しては、特に限定するものではなく、化学合成法，植物組織培養細胞法や微生物菌体を用いる方法などが考えられる。
これらポリフェノール類の安定性や呈味性を改善するためには、当該ポリフェノール類の１種あるいは２種以上の混合物に、デキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物を添加し、これにサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させる方法を用いることができる。 サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼとしては、バチルス属由来のものが用いられ、特にバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus)由来の酵素がポリフェノール類への配糖化能が高く、有利に利用できる。
【００１２】
酵素反応の条件としては、反応のｐＨを３〜９、好ましくはｐＨ５〜８、反応温度を２０〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、基質濃度としてポリフェノール類を０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）、デキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物を１〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜３０％（ｗ／ｖ）含む反応液を用いる。また、酵素量や反応時間は、上記の反応条件に合わせ最適に設定することができる。
【００１３】
このようにして一般式１で表されるポリフェノール配糖体が得られる。ポリフェノール配糖体としては、ポリフェノールとして、例えばガロカテキンを用いた場合は、一般式２で表されるポリフェノール配糖体が得られ、カテキン３−Ｏ−ガレートを用いた場合は、一般式３で表されるポリフェノール配糖体が得られ、ガロカテキン３−Ｏ−ガレートを用いた場合は、一般式４で表されるポリフェノール配糖体が得られる。
【００１４】
【化７】
【００１５】
【化８】
【００１６】
【化９】
【００１７】
このようにして得られたポリフェノール配糖体を含有する反応溶液は、そのまま各種用途に使用することができるが、反応溶液を必要に応じてシロップや粉末とした後に使用することもできる。また、以下に述べるように精製したものを使用することもできる。
【００１８】
高純度のポリフェノール配糖体を採取する場合には、多孔性合成吸着剤、例えば三菱化学株式会社製の商品名、ダイアイオンＨＰ−１０，ダイアイオンＨＰ−２０，ダイアイオンＨＰ−４０等や、Rohm & Haas 社製の商品名、アンバーライトＸＡＤ−１，アンバーライトＸＡＤ−４，アンバーライトＸＡＤ−７，アンバーライトＸＡＤ−８等を用いて、ポリフェノール配糖体と夾雑物との吸着性の違いを利用して精製することができる。
【００１９】
例えば、ポリフェノール配糖体、ポリフェノール類および遊離の糖類を分離する場合は、反応溶液を多孔性合成吸着剤を充填したカラムに通液すれば、遊離の糖類はカラムに吸着されずに溶出するが、ポリフェノール化合物は吸着される。次いで、吸着されたポリフェノール配糖体などのポリフェノール化合物を低級アルコール溶液、例えば５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液などで溶出し、この溶出液を濃縮してシロップ化、さらには乾燥、粉末化して採取することができる。
さらに、ポリフェノール配糖体と未反応のポリフェノール類とを分離する必要がある場合には、分液などによりこれらの化合物の極性の差を利用して、酢酸エチルなどの有機溶媒相に未反応のポリフェノール類を移行させて除去することもできる。また、ポリフェノール配糖体をクロマトグラフィーなどの方法によって、特定の画分を採取して利用することもできる。
【００２０】
以上に述べたようにして採取される本発明のポリフェノール配糖体は、従来のポリフェノール類とは異なり、苦味，渋味，えぐみや収斂性などの嫌味がほとんどなく、その精製の程度や純度を問わず、そのままで、あるいは他の素材と共に含有させて食品、医薬部外品、化粧品、医薬品などの広い分野に用いることができる。
【００２１】
また、本発明のポリフェノール配糖体は、α−グルコシダーゼやグルコアミラーゼによって分解されて元のポリフェノールを遊離することが確認されている。従って、本発明のポリフェノール配糖体を人体に投与した場合、体内のα−アミラーゼやα−グルコシダーゼなどの作用により、容易にポリフェノール類が遊離し、ポリフェノール類本来の生理活性機能、例えばコレステロール上昇抑制作用、抗菌作用、抗酸化作用、抗腫瘍作用や血圧上昇抑制作用などを示すようになる。
それ故、本発明のポリフェノール配糖体は、ポリフェノール類本来の生理活性機能を低減させることなく、食品、医薬部外品、化粧品、医薬品などの広い分野に用いることができる。特に、健康増進食品、健康維持食品、健康回復食品などに有利に利用できる。
【００２２】
本発明のポリフェノール配糖体の利用分野を列挙すれば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓子、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、畜肉製品、魚肉製品、珍味類、缶詰・ビン詰類、酒類、清涼飲料、即席飲食品などの食品類、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服薬、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬など各種固形状、ペースト状、液状の嗜好品、化粧品、医薬品などやこれらの原料である。
【００２３】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、かかる説明によって本発明は何ら制限されるものではない。
実施例１
デキストリン（商品名：パインデックス＃１、松谷化学株式会社製）１００ｇと（−）−エピガロカテキン（三井農林株式会社製）５ｇを１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）５００ｍｌに溶解後、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリン固形分１グラム当たり１０００単位加え、５０℃で２４時間反応させた。
次いで、ＵＦ膜濾過により酵素を除去後、この反応液に０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１０００ｍｌとリゾプス・ニベウス由来のグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり５０単位加え、４０℃で２０時間反応を行った。反応終了後、酵素をＵＦ膜を用いて取り除いた後、得られた反応液を水で平衡化したダイアイオンＨＰ−１０（三菱化学株式会社製）１０００ｍｌを充填したカラムに吸着させた。
【００２４】
カラムを脱イオン水３０００ｍｌで洗浄後、５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液１０００ｍｌ、次いで１００％（ｖ／ｖ）メタノール２０００ｍｌを用いて溶出し、吸着画分を回収した。溶出液を減圧濃縮してメタノールを除去したのち、５００ｍｌの蒸留水に溶解した。
この溶液を酢酸エチル５００ｍｌで５回洗浄し、未反応の（−）−エピガロカテキンを除去した。次いで、この水溶液画分をダイアイオンＨＰ−２０ＳＳカラム２５００ｍｌに展開し、蒸留水で十分に洗浄後、２５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液８０００ｍｌで溶出して２０００ｍｌづつを分画した。さらに、５０％（ｖ／ｖ）メタノール溶液５リットルで溶出した。
これらの画分についてＨＰＬＣで分析を行い、エピガロカテキン配糖体を含む画分ＡおよびＢを得た。これらの画分については、分取用ＨＰＬＣで分離を行いＡ画分からエピガロカテキン配糖体１（１２７ｍｇ）とエピガロカテキン配糖体２（８５ｍｇ）、Ｂ画分からエピガロカテキン配糖体３（３２７ｍｇ）を得た。これらの配糖体はＨＰＬＣ分析で単一ピークを示した。
【００２５】
分析ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
【００２６】
これらの配糖体１、２および３をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
なお、参考として（−）−エピガロカテキン配糖体３の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよびマススペクトルを図１、図２および図３にそれぞれ示した。
【００２７】
（−）−エピガロカテキン配糖体１
（−）−エピガロカテキン３’，７−ジ−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.80(1H,dd,H-4a), 2.87(1H,dd,H-4b),3.45-3.92(12H,ring H,Glcx2), 4.21(1H,m,H-3), 4.83(1H,s,H-2),5.36(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=4 Hz), 5.41(1H,d,H-1",JH-1",H-2"=4 Hz), 6.26(1H,d,H-8), 6.31(1H,d,H-6), 6.76(1H,d,H-6'), 6.98(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 28.5(C-4), 60.5(C-6",C-6'"), 64.5(C-3),69.8(C-4",C-4'"), 71.6(C-2"), 72.0(C-2'"), 73.0(C-3"), 73.1(C-3'"), 73.5(C-5"), 73.6(C-5'"), 78.2(C-2), 95.6(C-8), 96.7(C-6), 98.0(C-1"), 100.6(C-1'"), 101.5(C-4a), 107.9(C-2'), 109.8(C-6'), 129.6(C-1'), 134.9 (C-4'), 145.1(C-3'), 145.3(C-5'), 155.6(C-8a), 156.3(C-7), 156.5(C-5)
FAB-MS(pos.)
m/z=631 =(M+H)+ , 分子量６３０
【００２８】
（−）−エピガロカテキン配糖体２
（−）−エピガロカテキン３’，５−ジ−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)) 2.79(1H,dd,H-4a), 3.03(1H,dd,H-4b),3.43-3.92(12H,ring H,Glcx2), 4.20(1H,m,H-3), 4.83(1H,s,H-2), 5.37(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=3.5 Hz), 5.52 (1H,d,H-1",JH-1",H-2"=3.5 Hz), 6.09(1H,d,H-8), 6.33(1H,d,H-6), 6.74(1H,d,H-6'), 6.97(1H,d,H-2')
FAB-MS(pos.)
m/z=631 =(M+H)+ , 分子量６３０
【００２９】
（−）−エピガロカテキン配糖体３
（−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.73(1H,dd,H-4a), 2.85(1H,dd,H-4b), 3.45(1H,dd,H-4"), 3.57(1H,dd,H-2"), 3.78(3H,m,H-3",6"), 3.88(1H,m,H-5"), 4.18(1H,m,H-3), 4.79(1H,s,H-2),5.35(1H,d,H-1", JH-1",H-2"=3.2 Hz), 5.91(1H,d,H-8), 5.93(1H,d,H-6), 6.75(1H,d,H-6'), 6.95(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 29.3(C-4), 62.4(C-6"), 67.4(C-3), 71.4(C-4"), 73.5(C-2"), 74.4(C-3"), 74.9(C-5"), 79.3(C-2), 95.9(C-8), 96.4(C-6),100.0(C-4a), 101.2(C-1"), 108.9(C-2'), 110.4(C-6'), 131.6(C-1'), 135.9 (C-4'), 146.7(C-3',5'), 157.2(C-8a), 157.6(C-7), 158.0(C-5)
FAB-MS(pos.)
m/z=469 =(M+H)+ , 分子量４６８
【００３０】
実施例２
（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（三井農林株式会社製）５ｇを用いて実施例１と同様にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ反応とグルコアミラーゼ反応を行った後、ダイアイオンＨＰ−１０を用いて未反応の糖を除去した。
吸着画分をメタノール水溶液を用いて溶出させ減圧濃縮後、分取ＨＰＬＣに供し、エピガロカテキンガレート配糖体１（３１５ｍｇ）およびエピガロカテキンガレート配糖体２（７８０ｍｇ）を得た。この配糖体は、上記条件（実施例１）によるＨＰＬＣ分析でそれぞれ単一のピークを示した。
【００３１】
分取ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
【００３２】
これらの配糖体をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
（−）−エピガロカテキンガレート配糖体１
（−）−エピガロカテキンガレート３’，７−ジ−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.94(1H,dd,H-4a), 3.08(1H,dd,H-4b),3.43-3.92(12H,ring H,Glcx2), 4.87(1H,d,H-1"", JH-1"",H-2""=4 Hz), 5.06(1H,s, H-2), 5.50(1H,d,H-1'",JH-1'",H-2'"=3.5 Hz), 5.51(1H,m,H-3), 6.38(1H,d, H-8), 6.38(1H,d,H-6), 6.71(1H,d,H-6'), 7.02(2H,s,H-2",6"), 7.13(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4))-D2O) 27.7(C-4), 62.7(C-6'"), 63.1(C-6""), 70.5(C-3), 71.7(C-4'"), 72.3(C-4""), 74.1(C-2'"), 74.2(C-2""), 74.7(C-3'"), 75.0(C-3""), 75.7(C-5'"), 75.7(C-5""), 79.6(C-2), 98.4(C-8), 99.0(C-6), 99.9(C-4a), 101.9(C-1'"), 102.9(C-1""), 109.5(C-2'), 111.1(C-6'), 111.2(C-2",6"), 122.0(C-1"), 131.4(C-1'), 136.7(C-4"), 140.8(C-4'), 147.1(C-3",5"), 147.3(C-3'), 147.8(C-5'), 157.9(C-8a), 158.5(C-7), 158.9(C-5), 168.1(C-7")
FAB-MS(pos.)
m/z=783 =(M+H)+ , 分子量７８２
【００３３】
（−）−エピガロカテキンガレート配糖体２
（−）−エピガロカテキンガレート３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.87(1H,dd,H-4a), 2.99(1H,dd,H-4b), 3.42(1H,dd,H-4'"), 3.51(1H,t,H-2'"), 3.68(1H,dt,H-5'"), 3.81(1H,t,H-3'"), 3.85(2H,m,H-6'"), 4.90(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=4 Hz), 5.94(1H,d,H-8), 5.95(1H,d,H-6), 6.64(1H,d,H-6'), 7.00(2H,s,H-2",6"), 7.11(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 27.8(C-4), 63.0(C-6'"), 70.2(C-3), 71.0(C-4'"), 74.2(C-2'"), 74.7(C-3'"), 75.5(C-5'"), 80.1(C-2),98.6(C-8), 99.3(C-6),100.2(C-4a),101.8(C-1'"), 109.8(C-2'), 111.3(C-6'), 111.5(C- 2",6"), 122.1(C-1"), 131.5(C-1'), 136.5(C-4"), 141.0(C-4'), 147.1(C-3", 5"), 147.1(C-3'), 147.5(C-5'), 158.0(C-8a), 158.5(C-7), 158.6(C-5), 168.0(C-7")
FAB-MS(pos.)
m/z=621 =(M+H)+ , 分子量６２０
【００３４】
実施例３
（−）−ガロカテキン（三井農林株式会社製）５ｇを用いて実施例１と同様にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ反応とグルコアミラーゼ反応を行った後、ダイアイオンＨＰ−１０を用いて未反応の糖を除去した。
吸着画分をメタノール水溶液を用いて溶出させ減圧濃縮後、酢酸エチルと水で溶媒分画を行った。水層を減圧濃縮した後に、分取用ＨＰＬＣに供し、ガロカテキン配糖体１（７５０ｍｇ）を得た。この配糖体は、実施例１によるＨＰＬＣ分析で単一のピークを示した。
【００３５】
分取ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
カラム：カプセルパック AG-120 ODS S-5 （５０×５００ｍｍ）
移動相：１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液; ４０ｍｉｎ
流 速：１００ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ ２８０ｎｍ（室温）
【００３６】
この配糖体をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
（−）−ガロカテキン配糖体１
（−）−ガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol-d4) 2.73(1H,dd,H-4a), 2.87(1H,dd,H-4b),3.42-3.94(6H, ring H,Glc), 4.00(1H,ddd,H-3), 5.39(1H,d,H-1", JH-1",H-2"=4.1 Hz), 5.55(1H,d,H-2) 5.88(1H,d,H-8), 5.96(1H,d,H-6), 6.63(1H,d,H-6'), 6.89(1H,d,H-2')
FAB-MS(pos.)
m/z=455 =(M+H)+ , 分子量４５４
【００３７】
実施例４
（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート（三井農林株式会社製）５ｇを用いて実施例１と同様にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ反応とグルコアミラーゼ反応を行った後、ダイアイオンＨＰ−１０を用いて未反応の糖を除去した。
吸着画分をメタノール水溶液を用いて溶出させ減圧濃縮後、分取ＨＰＬＣに供し、エピカテキンガレート配糖体１（９２３ｍｇ）を得た。この配糖体は、実施例１によるＨＰＬＣ分析で単一のピークを示した。
【００３８】
分取ＨＰＬＣ条件は、下記のとおりである。
【００３９】
この配糖体をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体１
（−）−エピカテキンガレート３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol-d4) 2.86(1H,dd,H-4a), 3.01(1H,dd,H-4b),3.30-3.87(6H, ring H,Glc), 4.93(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=3.8 Hz), 5.05(1H,s,H-2), 5.48(1H,m,H-3), 5.95(1H,d,H-8), 5.97(1H,d,H-6), 6.77(1H,d,H-5'), 7.00(1H,dd,H-6'), 7.01(2H,s, H-2",6"), 7.57(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol-d4) 26.9(C-4), 61.8(C-6'"), 70.0(C-3), 70.7(C-4'"), 73.4(C-2'"), 73.9(C-5'"), 74.9(C-3'"), 78.6(C-2), 95.9(C-8), 96.6(C-6), 99.2(C-4a), 101.1(C-1'"), 110.4(C-2",6"), 116.6(C-5'), 117.3(C-2'),121.2(C-1"), 123.0(C-6'), 131.6(C-1'), 139.9(C-4"), 146.3(C-4'), 146.3(C-3",5"), 148.0(C-3'), 157.2(C-8a), 157.8(C-7), 157.8(C-5), 167.3(C-7")
FAB-MS(pos.)
m/z=605 =(M+H)+ , 分子量６０４
【００４０】
実施例５
デキストリン（商品名：パインデックス＃１、松谷化学株式会社製）１００ｇと（−）−エピガロカテキン、（−）−エピガロカテキン ３−Ｏ−ガレート、（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート（すべて三井農林株式会社製）それぞれ５ｇずつを１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）５００ｍｌに別々に溶解した。各混合液にバチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリン固形分１グラム当たり１０００単位加え、５０℃で２４時間反応させた。次いで、反応液を１００℃で３０分加熱して酵素を失活させた。
【００４１】
得られた３種類の反応液をそれぞれ水で平衡化したダイアイオンＨＰ−１０（三菱化学株式会社製）１０００ｍｌを充填したカラムに吸着させた。カラムを脱イオン水３０００ｍｌで洗浄後、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１０００ｍｌを用いて溶出し吸着画分を回収した。溶出液を減圧濃縮してエタノールを除去し、５００ｍｌの蒸留水に溶解した。この溶液を酢酸エチル５００ｍｌで５回洗浄し、未反応のポリフェノール類を除去した。未反応のポリフェノールが除去されていることを実施例１のＨＰＬＣ法で確認した。酢酸エチルで洗浄した反応液をそれぞれ凍結乾燥してポリフェノール配糖体を得た。
このようにして得られた配糖体の収量はエピガロカテキンから２１．４ｇ、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートから１３．８ｇ、エピカテキンガレートから１６．２ｇであった。
得られた配糖体をそれぞれ蒸留水に溶解して紫外線の吸収を測定した。分子吸光係数から各ポリフェノール１分子当り平均で６〜８個グルコースが結合しているものと考えられた。
【００４２】
実施例６
実施例５で得られた３種類のポリフェノール配糖体をそれぞれ１００ｍｇずつ秤取って、１ｍｌの蒸留水に溶解した。溶解した液にそれぞれグルコアミラーゼ（グルクザイムAF６、天野製薬株式会社製）１．６ｍｇとα−グルコシダーゼ（シグマ社製）０．２３ｍｇずつを加えてよく撹拌した。混合液を３７℃で３時間インキュベートした。反応液を以下のＨＰＬＣ法で分析した。
【００４３】
ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
【００４４】
エピガロカテキン配糖体の反応液からはエピガロカテキンが、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体の反応液からはエピガロカテキン３−Ｏ−ガレートが、エピカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体の反応液からはエピカテキン３−Ｏ−ガレートがそれぞれ検出された。
【００４５】
以上の結果は、実施例５で行った配糖化反応によって実際にポリフェノール類がそのまま配糖化されていることを示すものである。さらに、本ポリフェノール配糖体はα−グルコシダーゼやグルコアミラーゼによって加水分解されて、ポリフェノール類が遊離することから、生体内においてもα−グルコシダーゼやα−アミラーゼ等の酵素によっても容易に加水分解されて、生理活性機能を持つポリフェノール類を遊離して、ポリフェノール類本来の生理活性機能を示すものと考えられる。
【００４６】
実施例７
実施例５で得られた配糖体の渋味の強さを２０人のパネラーに対して官能検査を行って調べた。結果を第１表に示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
第１表から明らかなように、ポリフェノール類が１００〜２００ｐｐｍで渋味を感じ始めるのに対して、ポリフェノール配糖体では１０００ｐｐｍでも渋味は感じられず、２０００ｐｐｍでわずかに収斂性を感じ始めるようになった。
このように、ポリフェノール配糖体は従来のポリフェノール類に比べて呈味性が改善された物質である。従って、本発明のポリフェノール配糖体は食品、嗜好品、化粧品、医薬品を問わずその呈味を味わうことのできるすべての物品に応用できる。
【００４９】
実施例８
ゼリー菓子
実施例５と同様の方法で得たエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体１０ｇとカップリングシュガー（登録商標、株式会社林原製）１２６ｇ、オリゴメイト５０（商品名：ヤクルト薬品工業社製）１３６ｇ、乳糖６ｇ、アスパルテーム（商品名、味の素株式会社製）０．３ｇに水１５０ｇを加えて混合後、撹拌しつつ溶解した。
この溶液にペクチン４．５ｇを徐々に加えて溶解後、５０％（ｗ／ｖ）クエン酸溶液３．３ｇ、１／５濃縮レモン果汁６ｇ、天然色素０．１ｇおよびレモンフレーバー０．２ｇを加えて十分に混合し、この溶液を型に流し込み、室温で１２時間放冷して固化させペクチンゼリーを作製した。
本品はポリフェノール類特有の渋味がなく、風味に優れたゼリー菓子である。また、ポリフェノール類の機能性を有するゼリー菓子として好適である。
【００５０】
実施例９
粉末乳酸発泡飲料
１カップ当り実施例５と同様の方法で得たエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体０．６ｇ、砂糖２．７ｇ、ビタミンＣ０．６ｇ、発泡剤（重曹）０．６ｇ、酸味料（クエン酸）０．６ｇ、粉末発酵乳０．５ｇ、粉末香料（ストロベリー）０．２ｇを均一に混合して粉末乳酸発泡飲料を試作した。
本品を冷水１８０ｍｌに溶かして飲んだところ、さわやかな味と香りを持つ飲みやすい飲料であった。また、本品はポリフェノール類本来の、例えばコレステロール上昇抑制作用、血糖値上昇抑制作用、抗酸化作用などの機能性を有する飲み易い粉末乳酸発砲飲料である。
【００５１】
実施例１０
化粧用クリーム
スクワラン２３ｇ、ステアリン酸５ｇ、ベヘニルアルコール０．８ｇ、モノステアリン酸ポリエチレングリコール２ｇ、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン２．５ｇ、酸化チタン２．５ｇおよびパラオキシ安息香酸メチル０．０５ｇを加熱溶解後８０℃とし、これにアラントイン０．１ｇ、１，３−ブチレングリコール２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．１５ｇ、実施例５と同様に調製したエピガロカテキンガレート配糖体１ｇおよび精製水を加熱溶解して８０℃としたものを加えて、混合乳化した。よく撹拌しながら３０℃まで冷却後、容器に充填して製品とした。
本品はポリフェノール類特有の、例えば抗酸化作用、紫外線吸収作用などの機能性を有する化粧用クリームである。
【００５２】
【発明の効果】
本発明のポリフェノール配糖体は、従来のポリフェノール類の持つ強い渋味や収斂性を効果的に改善し、呈味性に優れているだけでなく、生体内でポリフェノール類を遊離することが期待できることから、食品、嗜好品、化粧品、医薬部外品、医薬品などに応用可能な新規化合物である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 （−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】 （−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】 （−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドのマススペクトルである。
【産業上の利用分野】
本発明は、茶ポリフェノール類の配糖体、その製造法およびその用途に関し、さらに詳細には、呈味性を改良した新規構造のポリフェノール配糖体、その製造法およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
茶ポリフェノール類は、コレステロール上昇抑制作用（特公平２−４４４４９号公報）、抗菌作用（特開平２−２７６５６２号公報）、抗酸化作用（特公平１−４４２３４号公報）、抗腫瘍作用（特開昭６０−１９０７１９号公報）、血圧上昇抑制作用および酵素活性阻害作用（特開平３−１３３９２８号公報）などの生理活性作用を示し、その有効成分はエピガロカテキン、エピカテキン３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン３−Ｏ−ガレートであることが知られている。しかしながら、これらの物質は強い収斂性を持つ渋味成分であることから、呈味性が著しく損なわれ、食品をはじめ各種分野への利用を考える上で大きな欠点となっている。
【０００３】
現在、茶ポリフェノールと類似の構造を持つ（＋）−カテキンについては、（＋）−カテキンとグルコース−１−リン酸あるいはシュークロースとの混合液にシュークロースホスホリラーゼを作用させることにより、易溶性や色沢安定性を付与した（＋）−カテキン配糖体を製造する方法（特開平５−１７６７８６号公報）や（＋）−カテキン配糖体をメラニン色素の生成に関与するチロシナーゼの阻害剤として皮膚外用剤に利用する方法（特開平４−２７３８９０号公報）が開発されている。
しかし、コレステロール上昇抑制作用、抗菌作用、抗酸化作用、抗腫瘍作用や血圧上昇抑制作用などの生理活性作用においては、（＋）−カテキンはエピガロカテキン、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートおよびエピカテキン３−Ｏ−ガレートに比べ、その生理活性が著しく弱く、また場合によっては活性を持たない。
従って、配糖体についても（＋）−カテキン配糖体よりもエピガロカテキン、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートおよびエピカテキン３−Ｏ−ガレートの配糖体の方がより生理活性を期待することができる。
【０００４】
一方、茶ポリフェノールである（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート、（−）−エピガロカテキンや（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートの配糖体については、これまでに本発明に示すような構造が明らかにされたとの報告がない。従って、本発明の新規ポリフェノール配糖体の特性や機能性についても明らかになっていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の茶ポリフェノール類とデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物に、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることによって、ポリフェノール類を配糖化できることを見いだした。
さらに、得られたポリフェノール配糖体を単離して茶ポリフェノール類の３’位、３’と５位および３’と７位が配糖化された新規化合物の構造を明らかにした。また、本発明の新規ポリフェノール配糖体は、収斂性のある渋味がほとんどなく呈味性に優れていることを確認し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、一般式１（式中Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水酸基あるいは重合度２から１０のマルトオリゴ糖残基、Ｘは水酸基あるいは水素、Ｙは水酸基あるいはガロイル基を、またｎは１から９の整数を示す。）で表されるポリフェノール配糖体を提供し、さらにエピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、ガロカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、エピカテキン、エピカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、カテキン３−Ｏ−ガレ−トあるいはこれらを２種類以上含むポリフェノール類混合物とデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする上記のポリフェノール配糖体の製造方法並びに上記のポリフェノール配糖体を含む組成物を提供するものである。
【０００７】
【化５】
以下に、本発明を詳しく説明する。
本発明に用いるポリフェノールの基本骨格は下記の一般式５で表される。
【０００９】
【化６】
この構造式において、ベンゾピラン環の２位と３位はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。例えば、配糖体のアグリコン部分として（＋）あるいは（−）−ガロカテキン、（＋）あるいは（−）−エピガロカテキン、（＋）あるいは（−）カテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−ガロカテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートが挙げられる。
【００１１】
前記の一般式１で表されるポリフェノール配糖体の製造方法に関しては、特に限定するものではなく、化学合成法，植物組織培養細胞法や微生物菌体を用いる方法などが考えられる。
これらポリフェノール類の安定性や呈味性を改善するためには、当該ポリフェノール類の１種あるいは２種以上の混合物に、デキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物を添加し、これにサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させる方法を用いることができる。 サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼとしては、バチルス属由来のものが用いられ、特にバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus)由来の酵素がポリフェノール類への配糖化能が高く、有利に利用できる。
【００１２】
酵素反応の条件としては、反応のｐＨを３〜９、好ましくはｐＨ５〜８、反応温度を２０〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、基質濃度としてポリフェノール類を０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）、デキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物を１〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜３０％（ｗ／ｖ）含む反応液を用いる。また、酵素量や反応時間は、上記の反応条件に合わせ最適に設定することができる。
【００１３】
このようにして一般式１で表されるポリフェノール配糖体が得られる。ポリフェノール配糖体としては、ポリフェノールとして、例えばガロカテキンを用いた場合は、一般式２で表されるポリフェノール配糖体が得られ、カテキン３−Ｏ−ガレートを用いた場合は、一般式３で表されるポリフェノール配糖体が得られ、ガロカテキン３−Ｏ−ガレートを用いた場合は、一般式４で表されるポリフェノール配糖体が得られる。
【００１４】
【化７】
【化８】
【化９】
このようにして得られたポリフェノール配糖体を含有する反応溶液は、そのまま各種用途に使用することができるが、反応溶液を必要に応じてシロップや粉末とした後に使用することもできる。また、以下に述べるように精製したものを使用することもできる。
【００１８】
高純度のポリフェノール配糖体を採取する場合には、多孔性合成吸着剤、例えば三菱化学株式会社製の商品名、ダイアイオンＨＰ−１０，ダイアイオンＨＰ−２０，ダイアイオンＨＰ−４０等や、Rohm & Haas 社製の商品名、アンバーライトＸＡＤ−１，アンバーライトＸＡＤ−４，アンバーライトＸＡＤ−７，アンバーライトＸＡＤ−８等を用いて、ポリフェノール配糖体と夾雑物との吸着性の違いを利用して精製することができる。
【００１９】
例えば、ポリフェノール配糖体、ポリフェノール類および遊離の糖類を分離する場合は、反応溶液を多孔性合成吸着剤を充填したカラムに通液すれば、遊離の糖類はカラムに吸着されずに溶出するが、ポリフェノール化合物は吸着される。次いで、吸着されたポリフェノール配糖体などのポリフェノール化合物を低級アルコール溶液、例えば５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液などで溶出し、この溶出液を濃縮してシロップ化、さらには乾燥、粉末化して採取することができる。
さらに、ポリフェノール配糖体と未反応のポリフェノール類とを分離する必要がある場合には、分液などによりこれらの化合物の極性の差を利用して、酢酸エチルなどの有機溶媒相に未反応のポリフェノール類を移行させて除去することもできる。また、ポリフェノール配糖体をクロマトグラフィーなどの方法によって、特定の画分を採取して利用することもできる。
【００２０】
以上に述べたようにして採取される本発明のポリフェノール配糖体は、従来のポリフェノール類とは異なり、苦味，渋味，えぐみや収斂性などの嫌味がほとんどなく、その精製の程度や純度を問わず、そのままで、あるいは他の素材と共に含有させて食品、医薬部外品、化粧品、医薬品などの広い分野に用いることができる。
【００２１】
また、本発明のポリフェノール配糖体は、α−グルコシダーゼやグルコアミラーゼによって分解されて元のポリフェノールを遊離することが確認されている。従って、本発明のポリフェノール配糖体を人体に投与した場合、体内のα−アミラーゼやα−グルコシダーゼなどの作用により、容易にポリフェノール類が遊離し、ポリフェノール類本来の生理活性機能、例えばコレステロール上昇抑制作用、抗菌作用、抗酸化作用、抗腫瘍作用や血圧上昇抑制作用などを示すようになる。
それ故、本発明のポリフェノール配糖体は、ポリフェノール類本来の生理活性機能を低減させることなく、食品、医薬部外品、化粧品、医薬品などの広い分野に用いることができる。特に、健康増進食品、健康維持食品、健康回復食品などに有利に利用できる。
【００２２】
本発明のポリフェノール配糖体の利用分野を列挙すれば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓子、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、畜肉製品、魚肉製品、珍味類、缶詰・ビン詰類、酒類、清涼飲料、即席飲食品などの食品類、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服薬、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬など各種固形状、ペースト状、液状の嗜好品、化粧品、医薬品などやこれらの原料である。
【００２３】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、かかる説明によって本発明は何ら制限されるものではない。
実施例１
デキストリン（商品名：パインデックス＃１、松谷化学株式会社製）１００ｇと（−）−エピガロカテキン（三井農林株式会社製）５ｇを１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）５００ｍｌに溶解後、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリン固形分１グラム当たり１０００単位加え、５０℃で２４時間反応させた。
次いで、ＵＦ膜濾過により酵素を除去後、この反応液に０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１０００ｍｌとリゾプス・ニベウス由来のグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり５０単位加え、４０℃で２０時間反応を行った。反応終了後、酵素をＵＦ膜を用いて取り除いた後、得られた反応液を水で平衡化したダイアイオンＨＰ−１０（三菱化学株式会社製）１０００ｍｌを充填したカラムに吸着させた。
【００２４】
カラムを脱イオン水３０００ｍｌで洗浄後、５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液１０００ｍｌ、次いで１００％（ｖ／ｖ）メタノール２０００ｍｌを用いて溶出し、吸着画分を回収した。溶出液を減圧濃縮してメタノールを除去したのち、５００ｍｌの蒸留水に溶解した。
この溶液を酢酸エチル５００ｍｌで５回洗浄し、未反応の（−）−エピガロカテキンを除去した。次いで、この水溶液画分をダイアイオンＨＰ−２０ＳＳカラム２５００ｍｌに展開し、蒸留水で十分に洗浄後、２５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液８０００ｍｌで溶出して２０００ｍｌづつを分画した。さらに、５０％（ｖ／ｖ）メタノール溶液５リットルで溶出した。
これらの画分についてＨＰＬＣで分析を行い、エピガロカテキン配糖体を含む画分ＡおよびＢを得た。これらの画分については、分取用ＨＰＬＣで分離を行いＡ画分からエピガロカテキン配糖体１（１２７ｍｇ）とエピガロカテキン配糖体２（８５ｍｇ）、Ｂ画分からエピガロカテキン配糖体３（３２７ｍｇ）を得た。これらの配糖体はＨＰＬＣ分析で単一ピークを示した。
【００２５】
分析ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
これらの配糖体１、２および３をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
なお、参考として（−）−エピガロカテキン配糖体３の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよびマススペクトルを図１、図２および図３にそれぞれ示した。
【００２７】
（−）−エピガロカテキン配糖体１
（−）−エピガロカテキン３’，７−ジ−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.80(1H,dd,H-4a), 2.87(1H,dd,H-4b),3.45-3.92(12H,ring H,Glcx2), 4.21(1H,m,H-3), 4.83(1H,s,H-2),5.36(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=4 Hz), 5.41(1H,d,H-1",JH-1",H-2"=4 Hz), 6.26(1H,d,H-8), 6.31(1H,d,H-6), 6.76(1H,d,H-6'), 6.98(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 28.5(C-4), 60.5(C-6",C-6'"), 64.5(C-3),69.8(C-4",C-4'"), 71.6(C-2"), 72.0(C-2'"), 73.0(C-3"), 73.1(C-3'"), 73.5(C-5"), 73.6(C-5'"), 78.2(C-2), 95.6(C-8), 96.7(C-6), 98.0(C-1"), 100.6(C-1'"), 101.5(C-4a), 107.9(C-2'), 109.8(C-6'), 129.6(C-1'), 134.9 (C-4'), 145.1(C-3'), 145.3(C-5'), 155.6(C-8a), 156.3(C-7), 156.5(C-5)
FAB-MS(pos.)
m/z=631 =(M+H)+ , 分子量６３０
【００２８】
（−）−エピガロカテキン配糖体２
（−）−エピガロカテキン３’，５−ジ−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)) 2.79(1H,dd,H-4a), 3.03(1H,dd,H-4b),3.43-3.92(12H,ring H,Glcx2), 4.20(1H,m,H-3), 4.83(1H,s,H-2), 5.37(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=3.5 Hz), 5.52 (1H,d,H-1",JH-1",H-2"=3.5 Hz), 6.09(1H,d,H-8), 6.33(1H,d,H-6), 6.74(1H,d,H-6'), 6.97(1H,d,H-2')
FAB-MS(pos.)
m/z=631 =(M+H)+ , 分子量６３０
【００２９】
（−）−エピガロカテキン配糖体３
（−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.73(1H,dd,H-4a), 2.85(1H,dd,H-4b), 3.45(1H,dd,H-4"), 3.57(1H,dd,H-2"), 3.78(3H,m,H-3",6"), 3.88(1H,m,H-5"), 4.18(1H,m,H-3), 4.79(1H,s,H-2),5.35(1H,d,H-1", JH-1",H-2"=3.2 Hz), 5.91(1H,d,H-8), 5.93(1H,d,H-6), 6.75(1H,d,H-6'), 6.95(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 29.3(C-4), 62.4(C-6"), 67.4(C-3), 71.4(C-4"), 73.5(C-2"), 74.4(C-3"), 74.9(C-5"), 79.3(C-2), 95.9(C-8), 96.4(C-6),100.0(C-4a), 101.2(C-1"), 108.9(C-2'), 110.4(C-6'), 131.6(C-1'), 135.9 (C-4'), 146.7(C-3',5'), 157.2(C-8a), 157.6(C-7), 158.0(C-5)
FAB-MS(pos.)
m/z=469 =(M+H)+ , 分子量４６８
【００３０】
実施例２
（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（三井農林株式会社製）５ｇを用いて実施例１と同様にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ反応とグルコアミラーゼ反応を行った後、ダイアイオンＨＰ−１０を用いて未反応の糖を除去した。
吸着画分をメタノール水溶液を用いて溶出させ減圧濃縮後、分取ＨＰＬＣに供し、エピガロカテキンガレート配糖体１（３１５ｍｇ）およびエピガロカテキンガレート配糖体２（７８０ｍｇ）を得た。この配糖体は、上記条件（実施例１）によるＨＰＬＣ分析でそれぞれ単一のピークを示した。
【００３１】
分取ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
これらの配糖体をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
（−）−エピガロカテキンガレート配糖体１
（−）−エピガロカテキンガレート３’，７−ジ−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.94(1H,dd,H-4a), 3.08(1H,dd,H-4b),3.43-3.92(12H,ring H,Glcx2), 4.87(1H,d,H-1"", JH-1"",H-2""=4 Hz), 5.06(1H,s, H-2), 5.50(1H,d,H-1'",JH-1'",H-2'"=3.5 Hz), 5.51(1H,m,H-3), 6.38(1H,d, H-8), 6.38(1H,d,H-6), 6.71(1H,d,H-6'), 7.02(2H,s,H-2",6"), 7.13(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4))-D2O) 27.7(C-4), 62.7(C-6'"), 63.1(C-6""), 70.5(C-3), 71.7(C-4'"), 72.3(C-4""), 74.1(C-2'"), 74.2(C-2""), 74.7(C-3'"), 75.0(C-3""), 75.7(C-5'"), 75.7(C-5""), 79.6(C-2), 98.4(C-8), 99.0(C-6), 99.9(C-4a), 101.9(C-1'"), 102.9(C-1""), 109.5(C-2'), 111.1(C-6'), 111.2(C-2",6"), 122.0(C-1"), 131.4(C-1'), 136.7(C-4"), 140.8(C-4'), 147.1(C-3",5"), 147.3(C-3'), 147.8(C-5'), 157.9(C-8a), 158.5(C-7), 158.9(C-5), 168.1(C-7")
FAB-MS(pos.)
m/z=783 =(M+H)+ , 分子量７８２
【００３３】
（−）−エピガロカテキンガレート配糖体２
（−）−エピガロカテキンガレート３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 2.87(1H,dd,H-4a), 2.99(1H,dd,H-4b), 3.42(1H,dd,H-4'"), 3.51(1H,t,H-2'"), 3.68(1H,dt,H-5'"), 3.81(1H,t,H-3'"), 3.85(2H,m,H-6'"), 4.90(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=4 Hz), 5.94(1H,d,H-8), 5.95(1H,d,H-6), 6.64(1H,d,H-6'), 7.00(2H,s,H-2",6"), 7.11(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol(d4)-D2O) 27.8(C-4), 63.0(C-6'"), 70.2(C-3), 71.0(C-4'"), 74.2(C-2'"), 74.7(C-3'"), 75.5(C-5'"), 80.1(C-2),98.6(C-8), 99.3(C-6),100.2(C-4a),101.8(C-1'"), 109.8(C-2'), 111.3(C-6'), 111.5(C- 2",6"), 122.1(C-1"), 131.5(C-1'), 136.5(C-4"), 141.0(C-4'), 147.1(C-3", 5"), 147.1(C-3'), 147.5(C-5'), 158.0(C-8a), 158.5(C-7), 158.6(C-5), 168.0(C-7")
FAB-MS(pos.)
m/z=621 =(M+H)+ , 分子量６２０
【００３４】
実施例３
（−）−ガロカテキン（三井農林株式会社製）５ｇを用いて実施例１と同様にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ反応とグルコアミラーゼ反応を行った後、ダイアイオンＨＰ−１０を用いて未反応の糖を除去した。
吸着画分をメタノール水溶液を用いて溶出させ減圧濃縮後、酢酸エチルと水で溶媒分画を行った。水層を減圧濃縮した後に、分取用ＨＰＬＣに供し、ガロカテキン配糖体１（７５０ｍｇ）を得た。この配糖体は、実施例１によるＨＰＬＣ分析で単一のピークを示した。
【００３５】
分取ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
カラム：カプセルパック AG-120 ODS S-5 （５０×５００ｍｍ）
移動相：１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液; ４０ｍｉｎ
流 速：１００ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ ２８０ｎｍ（室温）
【００３６】
この配糖体をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
（−）−ガロカテキン配糖体１
（−）−ガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol-d4) 2.73(1H,dd,H-4a), 2.87(1H,dd,H-4b),3.42-3.94(6H, ring H,Glc), 4.00(1H,ddd,H-3), 5.39(1H,d,H-1", JH-1",H-2"=4.1 Hz), 5.55(1H,d,H-2) 5.88(1H,d,H-8), 5.96(1H,d,H-6), 6.63(1H,d,H-6'), 6.89(1H,d,H-2')
FAB-MS(pos.)
m/z=455 =(M+H)+ , 分子量４５４
【００３７】
実施例４
（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート（三井農林株式会社製）５ｇを用いて実施例１と同様にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ反応とグルコアミラーゼ反応を行った後、ダイアイオンＨＰ−１０を用いて未反応の糖を除去した。
吸着画分をメタノール水溶液を用いて溶出させ減圧濃縮後、分取ＨＰＬＣに供し、エピカテキンガレート配糖体１（９２３ｍｇ）を得た。この配糖体は、実施例１によるＨＰＬＣ分析で単一のピークを示した。
【００３８】
分取ＨＰＬＣ条件は、下記のとおりである。
この配糖体をＮＭＲおよびＭＳによる機器分析で解析した結果、下記の構造であると決定した。また、機器分析の結果も併せて列記した。
（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体１
（−）−エピカテキンガレート３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド
1H-NMR(ppm, methanol-d4) 2.86(1H,dd,H-4a), 3.01(1H,dd,H-4b),3.30-3.87(6H, ring H,Glc), 4.93(1H,d,H-1'", JH-1'",H-2'"=3.8 Hz), 5.05(1H,s,H-2), 5.48(1H,m,H-3), 5.95(1H,d,H-8), 5.97(1H,d,H-6), 6.77(1H,d,H-5'), 7.00(1H,dd,H-6'), 7.01(2H,s, H-2",6"), 7.57(1H,d,H-2')
13C-NMR(ppm, methanol-d4) 26.9(C-4), 61.8(C-6'"), 70.0(C-3), 70.7(C-4'"), 73.4(C-2'"), 73.9(C-5'"), 74.9(C-3'"), 78.6(C-2), 95.9(C-8), 96.6(C-6), 99.2(C-4a), 101.1(C-1'"), 110.4(C-2",6"), 116.6(C-5'), 117.3(C-2'),121.2(C-1"), 123.0(C-6'), 131.6(C-1'), 139.9(C-4"), 146.3(C-4'), 146.3(C-3",5"), 148.0(C-3'), 157.2(C-8a), 157.8(C-7), 157.8(C-5), 167.3(C-7")
FAB-MS(pos.)
m/z=605 =(M+H)+ , 分子量６０４
【００４０】
実施例５
デキストリン（商品名：パインデックス＃１、松谷化学株式会社製）１００ｇと（−）−エピガロカテキン、（−）−エピガロカテキン ３−Ｏ−ガレート、（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート（すべて三井農林株式会社製）それぞれ５ｇずつを１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）５００ｍｌに別々に溶解した。各混合液にバチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリン固形分１グラム当たり１０００単位加え、５０℃で２４時間反応させた。次いで、反応液を１００℃で３０分加熱して酵素を失活させた。
【００４１】
得られた３種類の反応液をそれぞれ水で平衡化したダイアイオンＨＰ−１０（三菱化学株式会社製）１０００ｍｌを充填したカラムに吸着させた。カラムを脱イオン水３０００ｍｌで洗浄後、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１０００ｍｌを用いて溶出し吸着画分を回収した。溶出液を減圧濃縮してエタノールを除去し、５００ｍｌの蒸留水に溶解した。この溶液を酢酸エチル５００ｍｌで５回洗浄し、未反応のポリフェノール類を除去した。未反応のポリフェノールが除去されていることを実施例１のＨＰＬＣ法で確認した。酢酸エチルで洗浄した反応液をそれぞれ凍結乾燥してポリフェノール配糖体を得た。
このようにして得られた配糖体の収量はエピガロカテキンから２１．４ｇ、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートから１３．８ｇ、エピカテキンガレートから１６．２ｇであった。
得られた配糖体をそれぞれ蒸留水に溶解して紫外線の吸収を測定した。分子吸光係数から各ポリフェノール１分子当り平均で６〜８個グルコースが結合しているものと考えられた。
【００４２】
実施例６
実施例５で得られた３種類のポリフェノール配糖体をそれぞれ１００ｍｇずつ秤取って、１ｍｌの蒸留水に溶解した。溶解した液にそれぞれグルコアミラーゼ（グルクザイムAF６、天野製薬株式会社製）１．６ｍｇとα−グルコシダーゼ（シグマ社製）０．２３ｍｇずつを加えてよく撹拌した。混合液を３７℃で３時間インキュベートした。反応液を以下のＨＰＬＣ法で分析した。
【００４３】
ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。
エピガロカテキン配糖体の反応液からはエピガロカテキンが、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体の反応液からはエピガロカテキン３−Ｏ−ガレートが、エピカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体の反応液からはエピカテキン３−Ｏ−ガレートがそれぞれ検出された。
【００４５】
以上の結果は、実施例５で行った配糖化反応によって実際にポリフェノール類がそのまま配糖化されていることを示すものである。さらに、本ポリフェノール配糖体はα−グルコシダーゼやグルコアミラーゼによって加水分解されて、ポリフェノール類が遊離することから、生体内においてもα−グルコシダーゼやα−アミラーゼ等の酵素によっても容易に加水分解されて、生理活性機能を持つポリフェノール類を遊離して、ポリフェノール類本来の生理活性機能を示すものと考えられる。
【００４６】
実施例７
実施例５で得られた配糖体の渋味の強さを２０人のパネラーに対して官能検査を行って調べた。結果を第１表に示した。
【００４７】
【表１】
第１表から明らかなように、ポリフェノール類が１００〜２００ｐｐｍで渋味を感じ始めるのに対して、ポリフェノール配糖体では１０００ｐｐｍでも渋味は感じられず、２０００ｐｐｍでわずかに収斂性を感じ始めるようになった。
このように、ポリフェノール配糖体は従来のポリフェノール類に比べて呈味性が改善された物質である。従って、本発明のポリフェノール配糖体は食品、嗜好品、化粧品、医薬品を問わずその呈味を味わうことのできるすべての物品に応用できる。
【００４９】
実施例８
ゼリー菓子
実施例５と同様の方法で得たエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体１０ｇとカップリングシュガー（登録商標、株式会社林原製）１２６ｇ、オリゴメイト５０（商品名：ヤクルト薬品工業社製）１３６ｇ、乳糖６ｇ、アスパルテーム（商品名、味の素株式会社製）０．３ｇに水１５０ｇを加えて混合後、撹拌しつつ溶解した。
この溶液にペクチン４．５ｇを徐々に加えて溶解後、５０％（ｗ／ｖ）クエン酸溶液３．３ｇ、１／５濃縮レモン果汁６ｇ、天然色素０．１ｇおよびレモンフレーバー０．２ｇを加えて十分に混合し、この溶液を型に流し込み、室温で１２時間放冷して固化させペクチンゼリーを作製した。
本品はポリフェノール類特有の渋味がなく、風味に優れたゼリー菓子である。また、ポリフェノール類の機能性を有するゼリー菓子として好適である。
【００５０】
実施例９
粉末乳酸発泡飲料
１カップ当り実施例５と同様の方法で得たエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート配糖体０．６ｇ、砂糖２．７ｇ、ビタミンＣ０．６ｇ、発泡剤（重曹）０．６ｇ、酸味料（クエン酸）０．６ｇ、粉末発酵乳０．５ｇ、粉末香料（ストロベリー）０．２ｇを均一に混合して粉末乳酸発泡飲料を試作した。
本品を冷水１８０ｍｌに溶かして飲んだところ、さわやかな味と香りを持つ飲みやすい飲料であった。また、本品はポリフェノール類本来の、例えばコレステロール上昇抑制作用、血糖値上昇抑制作用、抗酸化作用などの機能性を有する飲み易い粉末乳酸発砲飲料である。
【００５１】
実施例１０
化粧用クリーム
スクワラン２３ｇ、ステアリン酸５ｇ、ベヘニルアルコール０．８ｇ、モノステアリン酸ポリエチレングリコール２ｇ、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン２．５ｇ、酸化チタン２．５ｇおよびパラオキシ安息香酸メチル０．０５ｇを加熱溶解後８０℃とし、これにアラントイン０．１ｇ、１，３−ブチレングリコール２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．１５ｇ、実施例５と同様に調製したエピガロカテキンガレート配糖体１ｇおよび精製水を加熱溶解して８０℃としたものを加えて、混合乳化した。よく撹拌しながら３０℃まで冷却後、容器に充填して製品とした。
本品はポリフェノール類特有の、例えば抗酸化作用、紫外線吸収作用などの機能性を有する化粧用クリームである。
【００５２】
【発明の効果】
本発明のポリフェノール配糖体は、従来のポリフェノール類の持つ強い渋味や収斂性を効果的に改善し、呈味性に優れているだけでなく、生体内でポリフェノール類を遊離することが期待できることから、食品、嗜好品、化粧品、医薬部外品、医薬品などに応用可能な新規化合物である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 （−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】 （−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】 （−）−エピガロカテキン３’−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドのマススペクトルである。
Claims (9)
- 一般式１（式中Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水酸基あるいは重合度２から１０のマルトオリゴ糖残基、Ｘは水酸基あるいは水素、Ｙは水酸基あるいはガロイル基を、またｎは１から９の整数を示す。）で表されるポリフェノール配糖体。
- ポリフェノール配糖体が、一般式２（式中Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水酸基あるいは重合度２から１０のマルトオリゴ糖残基を、またｎは１から９の整数を示す。）で表されるガロカテキン配糖体である請求項１記載のポリフェノール配糖体。
- ポリフェノール配糖体が、一般式３（式中Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水酸基あるいは重合度２から１０のマルトオリゴ糖残基を、またｎは１から９の整数を示す。）で表されるカテキン３−Ｏ−ガレ−ト配糖体である請求項１記載のポリフェノール配糖体。
- ポリフェノール配糖体が、一般式４（式中Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水酸基あるいは重合度２から１０のマルトオリゴ糖残基を、またｎは１から９の整数を示す。）で表されるガロカテキン３−Ｏ−ガレ−ト配糖体である請求項１記載のポリフェノール配糖体。
- 渋味を低減したことを特徴とする請求項１記載のポリフェノール配糖体。
- エピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、ガロカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、エピカテキン、エピカテキン３−Ｏ−ガレ−ト、カテキン３−Ｏ−ガレ−トあるいはこれらを２種類以上含むポリフェノール類混合物とデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする請求項１記載のポリフェノール配糖体の製造方法。
- サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼが、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のものである請求項６記載のポリフェノール配糖体の製造方法。
- 請求項１記載のポリフェノール配糖体を含む飲食物用組成物。
- 請求項１記載のポリフェノール配糖体を含む化粧品用組成物。
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