ES2586947T3 - Genz 112638 para tratar la enfermedad de Gaucher o de Fabry en terapia de combinación - Google Patents

Genz 112638 para tratar la enfermedad de Gaucher o de Fabry en terapia de combinación Download PDF

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ES2586947T3 ES14164650.5T ES14164650T ES2586947T3 ES 2586947 T3 ES2586947 T3 ES 2586947T3 ES 14164650 T ES14164650 T ES 14164650T ES 2586947 T3 ES2586947 T3 ES 2586947T3
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Abstract

Un primer agente terapéutico representado por la siguiente fórmula estructural:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher, en el que dicho tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz del primer agente terapéutico en combinación con una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico que es eficaz para tratar enfermedad de Gaucher.

Description

DESCRIPCION
Genz 112638 para tratar la enfermedad de Gaucher o de Fabry en terapia de combination ANTECEDENTES
Los glucoesfingoKpidos (GSLs) son una clase de compuestos de origen natural que tienen una multitud de funciones 5 biologicas, incluyendo la capacidad para promover el crecimiento celular, la diferenciacion celular, la adhesion entre celulas o entre celulas y protemas de la matriz, la union de microorganismos y virus a las celulas, y la metastasis de celulas tumorales. Los GSLs derivan de glucosilceramida (GlcCer), que se produce a partir de ceramida y UDP- glucosa mediante la enzima UDP-glucosa: N-acil-esfingosina glucosiltransferasa (GlcCer sintasa). La estructura de la ceramida se muestra a continuacion:
imagen1
La acumulacion de GSLs se ha relacionado con un numero de enfermedades, incluyendo enfermedades de Tay- Sachs, de Gaucher, y de Fabry (vease, por ejemplo, la patente U.S. n° 6.051.598). Los GSLs tambien se han relacionado con ciertos canceres. Por ejemplo, se ha encontrado que ciertos GSLs se producen solamente en 15 tumores o en concentraciones anormalmente elevadas en tumores; ejercen acciones estimulantes o inhibidoras notables sobre el crecimiento tumoral cuando se anaden a celulas tumorales en medios de cultivo; e inhiben el sistema de inmunodefensa normal del cuerpo cuando son desprendidos por tumores en el fluido extracelular circundante. La composition de GSLs tumorales cambia a medida que los tumores se hacen cada vez mas malignos y los anticuerpos contra ciertos GSLs inhiben el crecimiento de los tumores.
20 Los compuestos que inhiben GlcCer sintasa pueden reducir las concentraciones de GSL, y se ha dado a conocer que son utiles para tratar un sujeto con una de las enfermedades mencionadas anteriormente. En las patentes U.S. nos 6.051.598, 5.952.370, 5.945.442, 5.916.911 y 6.030.995 se describe un numero de inhibidores potentes de GlcCer, denominados aqm como “compuestos similares a aminoceramidas”. El compuesto de Formula (I), mostrado mas abajo, es un inhibidor de GlcCer sintasa actualmente en ensayos clmicos para el tratamiento de la enfermedad 25 de Gaucher:
imagen2
Existe la necesidad de formas salinas de este candidato farmaceutico que sean cristalinas y tengan de otro modo propiedades fisicas que sean susceptibles a la fabrication a gran escala. Tambien existe la necesidad de formulaciones farmaceuticas en las que este candidato farmaceutico sea estable y se suministre eficazmente al 30 paciente, asi como metodos de tratamiento mejorados que utilicen este compuesto.
McEachern K et al., Molecular Genetics and Metabolism, 91(3), 2007, 259-267 se refiere a un inhibidor de glucosilceramida sintasa para la terapia de inhibition del sustrato de la enfermedad de Gaucher.
El documento WO 2006/053043, se refiere a metodos para tratar un sujeto diabetico que comprenden administrar un inhibidor de glucosilceramida sintasa al sujeto.
35 El documento US 2003/050299 se refiere a la smtesis de UDP-glucosa N-acilesfingosina glucosiltransferasa. SUMARIO DE LA INVENCION
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Se ha encontrado que la sal de hemitartrato del compuesto de Formula (I) (en lo sucesivo “Hemitartrato de Formula (I)”) se puede cristalizar en condiciones bien definidas para proporcionar ciertas formas cristalinas no higroscopicas. El Hemitartrato de Formula (I) tiene varias propiedades ventajosas cuando se compara con otras sales de Formula (I). Como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1, muchas sales de la Formula (I), incluyendo citrato, malato, fumarico, metilsulfonico, y acetico, no se podnan obtener en forma solida. Aunque la sal de hidrocloruro y de tartrato 1:1 de Formula (I) se obtuvieron en forma solida, ninguna de las dos fue cristalina, y ambas fueron demasiado higroscopicas para la formulacion. El Hemitartrato de Formula (I) es mas facil de formular y sintetizar que la base libre y que las otras sales. El Hemitartrato de Formula (I) es tambien cristalino, no higroscopico, soluble en agua, y fluye mejor que la base libre correspondiente (en lo sucesivo “Base Libre de la Formula (I)”) y otras sales. De este modo, estas propiedades favorables hacen al Hemitartrato de Formula (I) susceptible para la fabricacion a gran escala como candidato farmaceutico.
Tambien se ha encontrado que los granulos estables para la formulacion en capsulas del Hemitartrato de Formula (I) se pueden preparar usando relaciones definidas de una carga insoluble en agua, una carga soluble en agua y Hemitartrato de Formula (I). Basandose en este descubrimiento, se describen formulaciones farmaceuticas estables de Hemitartrato de Formula (I).
Tambien se ha encontrado que el compuesto de Formula (I) o sus sales farmaceuticamente aceptables (incluyendo Hemitartrato de Formula (I)) son metabolizados por el hngado, principalmente por las enzimas de citocromo P450. Basandose en este descubrimiento, se describen metodos de tratamiento con el compuesto de Formula (I) o sus sales farmaceuticamente aceptables (incluyendo Hemitartrato de Formula (I)) que reducen el potencial de interacciones farmaco-farmaco.
Tambien se ha encontrado que los ratones con Gaucher a los que se les administra glucocerebrosidasa recombinante y despues Hemitartrato de Formula (I) mostraron niveles mas bajos de GL1 en organos viscerales, y redujeron el numero de celulas de Gaucher en el tngado en comparacion con el tratamiento con glucocerebrosidasa sola o con Hemitartrato de Formula (I) solo. Basandose en este descubrimiento, tambien se describen terapias de combinacion con el compuesto de Formula (I) o sus sales farmaceuticamente aceptables (incluyendo Hemitartrato de Formula (I)).
Se describe aqrn la sal de hemitartrato del compuesto representado por la Formula (I). Como se senala anteriormente, la sal de hemitartrato del compuesto representado por la Formula (I) se denomina aqrn “Hemitartrato de Formula (I)”. El compuesto representado por la Formula (I) se denomina aqrn “Base Libre de la Formula (I)”.
Tambien se describe aqrn una composicion farmaceutica que comprende un vehnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable y Hemitartrato de Formula (I).
Tambien se describe aqrn un metodo para inhibir glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glucoesfingolfpidos en un sujeto que lo necesite administrando al sujeto una cantidad eficaz de Hemitartrato de Formula (I).
Tambien se describe aqrn el uso del Hemitartrato de Formula (I) para la fabricacion de un medicamento para inhibir glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glucoesfingolfpidos en un sujeto que lo necesite.
Tambien se describe aqrn el uso del Hemitartrato de Formula (I) para inhibir glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glucoesfingolfpidos en un sujeto que lo necesite.
En un aspecto, la presente invencion proporciona un primer agente terapeutico para uso en un metodo para tratar un sujeto con la enfermedad de Gaucher. El metodo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un primer agente terapeutico en combinacion con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico. El primer agente terapeutico esta representado por la Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma; y el segundo agente terapeutico es eficaz para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un primer agente terapeutico para uso en un metodo para tratar un sujeto con la enfermedad de Fabry. El metodo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un primer agente terapeutico en combinacion con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico. El primer agente terapeutico esta representado por la Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma; y el segundo agente terapeutico es eficaz para el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
Tambien se describe aqrn una composicion farmaceutica que comprende:
la sal de hemitartrato de un compuesto representado por la Formula (I); al menos una carga soluble en agua; al menos una carga insoluble en agua; al menos un aglutinante; y al menos un lubricante.
Tambien se describe aqrn un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry. El metodo comprende las etapas de:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de Formula (I), o una sal farmaceuticamente
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aceptable del mismo;
b) estudiar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450;
c) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, determinar una cantidad eficaz ajustada del compuesto; y
d) administrar al sujeto una cantidad eficaz ajustada del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, y administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador pobre de P450.
Tambien se describe aqm un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher. El metodo comprende las etapas de:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de Formula (I), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
b) estudiar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450;
c) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, determinar una cantidad eficaz ajustada del compuesto; y
d) administrar al sujeto una cantidad eficaz ajustada del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, y administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador pobre de P450.
Tambien se describe aqm un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry. El metodo comprende las etapas de:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto representado mediante la siguiente formula estructural:
imagen3
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
b) evaluar los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto; y
c) ajustar la cantidad de compuesto administrada al sujeto de manera que los niveles plasmaticos valle del compuesto sean al menos 5 ng/ml. Como alternativa, los niveles plasmaticos valle y Cmax del compuesto en el sujeto se evaluan en la etapa b), y en la etapa c) la cantidad de compuesto administrada al sujeto se ajusta de manera que los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml y la Cmax del compuesto en el sujeto este por debajo de 100 ng/ml.
Tambien se describe aqm un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher. El metodo comprende las etapas de:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto representado mediante la siguiente formula estructural:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
b) evaluar los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto; y
c) ajustar la cantidad de compuesto administrada al sujeto de manera que los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml. Como alternativa, los niveles plasmaticos valle y Cmax del compuesto en el sujeto se evaluan en la etapa b), y en la etapa c) la cantidad de compuesto administrada al sujeto se ajusta de manera que los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml y la Cmax del compuesto en el sujeto este por debajo de 100 ng/ml.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra el patron de XRPD experimental (temperatura ambiente) para Hemitartrato de Formula (I).
La FIG. 2 es una grafica de la eficacia de terapias enzimatica y de reduction de sustrato a la hora de reducir los niveles de glucosilceramida en el higado de ratones con Gaucher. Los niveles de GL1 del higado se midieron en ratones con Gaucher de 3 meses no tratados (A) y tras 2 semanas de tratamiento con glucocerebrosidasa recombinante (B). Los ratones tratados con glucocerebrosidasa recombinante se analizaron 10 semanas mas tarde sin tratamiento posterior (C) o tras terapia con Hemitartrato de Formula (I) (D) a 150 mg/kg de comida. Tambien se muestran los niveles de GL1 en el higado de ratones a los que se les administro Hemitartrato de Formula (I) solo durante todo el periodo de estudio (E) y en controles no tratados de edad parecida (F). Los datos se expresan como media ± error estandar de la media (SEM) (n = 5). La significancia estadistica se determino usando la prueba de la t no pareada.
La FIG. 3 es una grafica de la eficacia de terapias enzimatica y de reduccion de sustrato a la hora de reducir los niveles de glucosilceramida en el bazo de ratones con Gaucher. Los niveles de GL1 del bazo se midieron en ratones con Gaucher de 3 meses no tratados (A) y tras 2 semanas de tratamiento con glucocerebrosidasa recombinante (B). Los ratones tratados con glucocerebrosidasa recombinante se analizaron 10 semanas mas tarde sin tratamiento posterior (C) o tras la terapia con Hemitartrato de Formula (I) (D). Tambien se muestran los niveles de GL1 en el bazo de ratones a los que se les administro Hemitartrato de Formula (I) solo durante todo el periodo de estudio (E) y en controles no tratados de edad parecida (F). Los datos se expresan como media ± error estandar de la media (SEM) (n = 5). La significancia estadistica se determino usando la prueba de la t no pareada.
La FIG. 4 es una grafica de la eficacia de las terapias enzimatica y de reduccion de sustrato a la hora de reducir los niveles de glucosilceramida en el pulmon de ratones con Gaucher. Los niveles de GL1 del pulmon se midieron en ratones con Gaucher de 3 meses no tratados (A) y tras 2 semanas de tratamiento con glucocerebrosidasa recombinante (B). Los ratones tratados con glucocerebrosidasa recombinante se analizaron 10 semanas mas tarde sin tratamiento posterior (C) o tras terapia con Hemitartrato de Formula (I) (D). Tambien se muestran los niveles de GL1 en el pulmon de ratones a los que se les administro Hemitartrato de Formula (I) solo durante todo el periodo de estudio (E) y en controles no tratados de edad parecida (F). Los datos se expresan como media ± error estandar de la media (SEM) (n = 5). La significancia estadistica se determino usando la prueba de la t no pareada.
La FIG. 5 es una grafica que muestra la cuantificacion del grado de tincion de CD68 en el higado. El grado de tincion positiva para CD68 en las secciones hepaticas se cuantifico usando el software MetaMorph. Se muestran niveles en higado de ratones con Gaucher de 3 meses no tratado (A) o despues del tratamiento con glucocerebrosidasa (B). Tambien se ilustran los ratones tratados con enzima y analizados despues 10 semanas mas tarde sin intervention terapeutica adicional (C) o tras terapia con Hemitartrato de Formula (I) (D). Tambien se muestra el grado de tincion en el higado de ratones con Gaucher a los que se les administro Hemitartrato de Formula (I) solo (E) y en ratones de control no tratados de edad parecida (F). Los datos se recopilaron de un analisis de diez imagenes 400x por section de cada uno de los ratones. La significancia estadistica se determino usando la prueba de la t no pareada.
La FIG. 6 es una grafica que muestra la eficacia de Hemitartrato de Formula (I) en ratones D409V/null
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jovenes. Se administro diariamente mediante administracion oral, a una dosis de 75 o 150 mg/kg durante 10 semanas, Hemitartrato de Formula (I) a ratones D409V/null de 10 semanas. Los niveles de glucosilceramida en el tngado, pulmon, vasculatura y bazo se evaluaron al final del estudio mediante HP-TLC. Los datos se presentan como un porcentaje de GL-1 en ratones de control no tratados de edad parecida. Las lmeas discontinuas indican niveles de glucosilceramida observados en ratones normales de tipo salvaje. *p < 0,05; **p < 0,01 con respecto a un control no tratado (prueba de la t no pareada, de dos colas). Los datos se representan como media + error estandar de la media (SEM) n = 5 para 75 mg/kg; n = 6 para 150 mg/kg).
La FIG. 7 muestra el efecto de la terapia con Hemitartrato de Formula (I) sobre la acumulacion de GL-3 en tngado, corazon, rinon, bazo, cerebro y sangre de ratones con Fabry.
La FIG. 8 muestra una grafica del efecto de la terapia con Hemitartrato de Formula (I) sobre el comienzo y progresion de neuropatfa periferica en ratones con Fabry.
La FIG. 9 muestra graficas de medidas de algunos marcadores de la funcion renal en ratones con Fabry tratados con Hemitartrato de Formula (I).
La FIG. 10 muestra la lmea de tiempo para estudios ERT y SRT de poblaciones de ratones que reciben diferentes terapias farmaceuticas: A) Fabrazyme bimensualmente, nada de Hemitartrato de Formula (I); B) Fabrazyme bimensualmente y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; C) Fabrazyme administrada al comienzo del estudio y en el cuarto mes del estudio, y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; D) sin Fabrazyme, Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; y E) nada de terapia con farmacos.
La FIG. 11 muestra graficas de los niveles sangumeos de GL-3, en ng/ml de sangre, en seis poblaciones (n = ?) de ratones (A-E Fabry-Rag; y F tipo salvaje); las poblaciones de ratones recibieron las siguientes terapias: A) Fabrazyme bimensualmente, nada de Hemitartrato de Formula (I); B) Fabrazyme bimensualmente y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; C) Fabrazyme administrada al comienzo del estudio y en el cuarto mes del estudio, y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; D) sin Fabrazyme, Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; E) nada de terapia con farmacos; y F) ninguna terapia con farmacos.
La FIG. 12 muestra graficas de los niveles de GL-3 en el tngado y rinon de ratones con Fabry-Rag; las poblaciones de ratones (n = ?) recibieron las siguientes terapias: A) Fabrazyme bimensualmente, sin Hemitartrato de Formula (I); B) Fabrazyme bimensualmente y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; C) Fabrazyme administrada al comienzo del estudio y en el cuarto mes del estudio, y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; D) sin Fabrazyme, Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; y E) sin terapia con farmacos.
La FIG. 13 muestra graficas de los niveles de orina de GL-3 en ratones con Fabry-Rag; las poblaciones de ratones (n = ?) recibieron las siguientes terapias: A) Fabrazyme bimensualmente, sin Hemitartrato de Formula (I); B) Fabrazyme bimensualmente, y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; C) Fabrazyme administrada al comienzo del estudio y en el cuarto mes del estudio, y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; D) sin Fabrazyme, Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; y E) sin terapia con farmacos.
La FIG. 14 es una grafica que muestra la latencia en segundos de sensibilidad termica de ratones con Fabry- Rag que reciben las siguientes terapias: Fabrazyme bimensualmente, sin Hemitartrato de Formula (I); Fabrazyme bimensualmente y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; Fabrazyme administrada al comienzo del estudio y en el cuarto mes del estudio, y Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; sin Fabrazyme, Hemitartrato de Formula (I) en el alimento; sin terapia con farmacos; ratones de tipo salvaje; y no tratados a los tres meses.
La Figura 15 es una grafica que muestra la cantidad total de area de degradacion de una traza de HPLC de diversas mezclas que comprenden Hemitartrato de Formula (I), Monohidrato de Lactosa grado encapsulante y Avicel PH 301 (celulosa microcristalina) despues de haber sido expuestas a 85°C durante 3 dfas. El area de degradacion de la traza de HPLC es la relacion del area total de picos que corresponden a la degradacion con respecto al area total de picos que corresponden a Hemitartrato de Formula (I) y productos de degradacion.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente solicitud describe formas cristalinas unicas de Hemitartrato de Formula (I) y nuevas composiciones farmaceuticas de Hemitartrato de Formula (I) que comprenden las formas cristalinas de Hemitartrato de Formula (I) descritas aqrn. La presente solicitud tambien describe metodos para inhibir glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glucoesfingolfpidos en un sujeto que lo necesite. Adicionalmente, la presente solicitud describe metodos para preparar formas cristalinas espedficas de Hemitartrato de Formula (I). La presente solicitud tambien describe formulaciones farmaceuticas estables de Hemitartrato de Formula (I), terapias de combinacion con el compuesto de Formula (I) o sus sales farmaceuticamente aceptables (incluyendo Hemitartrato de Formula (I)), y metodos de tratamiento con el compuesto de Formula (I) o sus sales farmaceuticamente aceptables (incluyendo Hemitartrato de Formula (I)) que minimizan el riesgo de interacciones farmaco/farmaco.
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En una realizacion particular, al menos un porcentaje particular en peso de Hemitartrato de Formula (I) es cristalino. Los porcentajes en peso particulares incluyen 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, o un porcentaje entre 70% y 100%.
En otra realizacion particular, al menos un porcentaje particular en peso de Hemitartrato de Formula (I) es una forma cristalina individual de Hemitartrato de Formula (I). Los porcentajes en peso particulares incluyen 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, o un porcentaje entre 70% y 100%.
Como se usa aqrn, “cristalino” se refiere a un solido que tiene una estructura de cristal en la que las moleculas individuales tienen una configuracion qmmica inmovilizada normal muy homogenea. El Hemitartrato de Formula (I) cristalino puede ser cristales de una forma cristalina individual del Hemitartrato de Formula (I), o una mezcla de cristales de diferentes formas cristalinas individuales. Una forma cristalina individual significa Hemitartrato de Formula (I) como un cristal individual o una pluralidad de cristales, en la que cada cristal tiene la misma forma de cristal.
Cuando un porcentaje particular en peso de Hemitartrato de Formula (I) es una forma cristalina individual, el resto del Hemitartrato de Formula (I) es alguna combinacion de Hemitartrato de Formula (I) amorfo, y/o una o mas formas cristalinas adicionales de Hemitartrato de Formula (I), excluyendo la forma cristalina individual. Cuando el Hemitartrato de Formula (I) cristalino se define como un porcentaje espedfico de una forma cristalina particular de Hemitartrato de Formula (I), el resto esta formado por forma amorfa y/o formas cristalinas distintas de la una o mas formas particulares que se especifican. Los ejemplos de una forma cristalina individual incluyen la Forma A de Hemitartrato de Formula (I) caracterizada por una o mas propiedades como se discute aqrn.
Debido a que el acido tartarico tiene dos grupos acido carboxflico, puede formar sales con relaciones molares diferentes del compuesto representado por la Formula (I) a tartrato (la base conjugada del acido tartarico). Por ejemplo, la sal en la que hay alrededor de una relacion molar uno a uno de tartrato a Formula (I) es Tartrato de Formula (I) (1 de tartrato: 1 de Formula (I)); y la sal en la que hay alrededor de una relacion molar uno a dos de tartrato a Formula (I) es Hemitartrato de Formula (I) (1 de tartrato: 2 de Formula (I)).
La sal de hemitartrato puede existir en diversas formas estereoisomeras. Los estereoisomeros son compuestos que difieren solamente en su disposicion espacial. Los enantiomeros son pares de estereoisomeros cuyas imagenes especulares no son superponibles, muy habitualmente debido a que contienen un atomo de carbono asimetricamente sustituido que actua como centro quiral. Los diastereomeros son estereomeros que no estan relacionados como imagenes especulares, muy habitualmente debido a que contienen dos o mas atomos de carbono asimetricamente sustituidos.
Cuando la estereoqmmica se nombra (como por ejemplo en acido L-(+)-tartarico) o se representa mediante estructura (como por ejemplo en la Formula (I)), el estereoisomero nombrado o representado es al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 99% o 99,9% en peso puro con respecto a los otros estereoisomeros. Cuando un enantiomero individual se nombra (como por ejemplo en acido L-(+)-tartarico) o se representa mediante estructura (como por ejemplo en la Formula (I)), el enantiomero representado o nombrado es al menos 80%, 90%, 99% o 99,9% en peso opticamente puro. El porcentaje en peso de pureza optica es la relacion del peso del enantiomero con respecto al peso del enantiomero mas el peso de su isomero optico.
“Racemato” o “mezcla racemica” significa un compuesto de cantidades equimolares de dos enantiomeros, en el que tales mezclas no muestran actividad optica, es decir, no rotan el plano de la luz polarizada.
El acido tartarico tiene tres estereoisomeros: acido L-(+)-tartarico o acido dextrotartarico y su enantiomero, acido levotartarico o acido D-(-)-tartarico, y la forma aquiral, acido mesotartarico. La designacion L o D no indican la capacidad del acido para rotar el plano de luz polarizada.
Cualquiera de los estereoisomeros de acido tartarico se puede usar para preparar Hemitartrato de Formula (I). Por ejemplo, el hemitartrato se puede formar a partir de uno solo de sus estereoisomeros, o una combinacion de los mismos. La sal de hemitartrato se selecciona de D-hemitartrato, L-hemitartrato, acido hemimesotartarico, o D,L- hemitartrato racemico. En una realizacion espedfica, la sal de hemitartrato es L-hemitartrato. “L-hemitartrato” significa que la sal de hemitartrato se forma a partir de acido L-tartarico. D,L-hemitartrato racemico significa que se usaron tanto D-tartrato como L-tartrato en la preparacion del Hemitartrato de Formula (I). La cantidad de D-tartrato en D,L-hemitartrato racemico puede ser mayor, igual o menor que la cantidad de L-tartrato presente.
“Levorrotatorio” significa que la luz polarizada esta girada a la izquierda cuando se hace pasar a traves de un compuesto asimetrico. El prefijo para designar levorrotatorio es “L”.
“Dextrorrotatorio” significa que la luz polarizada esta girada a la derecha cuando se hace pasar a traves de un compuesto asimetrico. El prefijo para designar levorrotatorio es “D”.
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El Hemitartrato de Formula (I) se puede preparar mezclando Formula (I) con acido L-tartarico en un disolvente adecuado. La precipitacion de Hemitartrato de Formula (I) se puede ayudar mediante la adicion de un cristal de siembra. Los disolventes que se pueden usar son metanol, agua, etanol, acetona, acetato de etilo, o sus combinaciones.
Las formas solidas particulares de Hemitartrato de Formula (I) se pueden preparar, por ejemplo, mediante evaporacion lenta, enfriamiento lento, y precipitacion con antidisolventes. Los disolventes que se pueden usar en estos metodos incluyen agua, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, etanol, alcohol isopropflico, acetonitrilo, acetato de etilo, metanol, acetona, metil terc-butil eter (denominado aqrn “TBME”), p-dioxano, y tetrahidrofurano (denominado aqrn “THF”).
Las formas solidas de Hemitartrato de Formula (I) se pueden preparar mediante evaporacion del disolvente a partir de una disolucion de Hemitartrato de Formula (I) en un disolvente o una mezcla de disolventes. Las mezclas de disolventes adecuadas incluyen metanol, etanol, acetona, agua, acetato de etilo y diclorometano. Las mezclas de disolventes preferidas incluyen etanol, metanol, agua y acetona.
Las formas solidas de Hemitartrato de Formula (I) se pueden preparar a traves del enfriamiento lento de una disolucion calentada de Hemitartrato de Formula (I) en un disolvente. Los disolventes adecuados incluyen etanol, metanol, agua, acetona, y acetato de etilo.
Las formas solidas de Hemitartrato de Formula (I) se pueden preparar a traves del enfriamiento rapido de una disolucion calentada de Hemitartrato de Formula (I) en un disolvente, colocando la disolucion en un bano de enfriamiento. Los disolventes adecuados incluyen etanol, metanol, acetona, agua, acetato de etilo, o mezclas de estos disolventes.
Las formas solidas de Hemitartrato de Formula (I) se pueden preparar anadiendo una disolucion de Hemitartrato de Formula (I) en un disolvente como se describe anteriormente a un antidisolvente a una temperatura dada. Mas particularmente, el antidisolvente es acetato de etilo, acetona, acetonitrilo, tolueno, THF, TBME, p-dioxano, isopropanol, o heptano. Las mezclas particulares disolvente/antidisolvente incluyen metanol/acetato de etilo, metanol/acetona, metanol/hexano, metanol/heptano, metanol/acetonitrilo, metanol/tolueno, metanol/THF, metanol/TBME, metanol/p-dioxano, etanol/acetato de etilo, etanol/hexano, etanol/heptano, etanol, acetona, etanol/acetonitrilo, etanol/tolueno, etanol/TBME, etanol/THF, agua/THF, agua/isopropanol, agua/acetonitrilo, agua/acetona, diclorometano/heptano, diclorometano/acetona, diclorometano/acetato de etilo, diclorometano/acetonitrilo, diclorometano/tolueno, diclorometano/THF, diclorometano/TBME, diclorometano/p- dioxano, y diclorometano/isopropanol.
Las mezclas preferidas de disolvente/antidisolvente incluyen metanol/acetato de etilo, metanol/acetona, metanol/TBME, y agua/acetona.
Como se usa aqrn, “antidisolvente” se refiere a un disolvente en el que el Hemitartrato de Formula (I) tiene baja solubilidad y provoca que el Hemitartrato precipite de la disolucion en forma de polvo fino o cristales.
Metodos adicionales para generar las formas solidas de Hemitartrato de Formula (I) incluyen precipitar el solido en acetato de etilo/acetona y secar opcionalmente el solido formado a temperatura ambiente. En otro metodo, el solido se puede recristalizar entonces en acetona, con o sin la adicion de un cristal de siembra. Como alternativa, el Hemitartrato de Formula (I) se puede precipitar en disolventes de acetato de etilo/acetona y se puede recristalizar en acetato de etilo. Como alternativa, el Hemitartrato de Formula (I) se puede recristalizar entonces en isopropanol. Como alternativa, el Hemitartrato de Formula (I) se puede preparar usando acetona solamente, sin recristalizacion adicional. Como alternativa, el Hemitartrato de Formula (I) se puede precipitar en acetona tras un reflujo breve, sin recristalizacion adicional.
Como alternativa, el Hemitartrato de Formula (I) se puede recristalizar entonces en metanol/acetona, con o sin la adicion de un cristal de siembra. Como alternativa, el Hemitartrato de Formula (I) se puede recristalizar entonces en agua/acetona, con o sin la adicion de un cristal de siembra.
Caracterizacion de formas cristalinas de Hemitartrato de Formula (I)
En una realizacion particular, la forma cristalina de Hemitartrato de Formula (I), Forma A de cristal, se caracteriza por uno, dos, tres, cuatro o cinco picos de XRPD principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°. En una realizacion incluso mas particular, la forma cristalina se caracteriza por picos de XRPD a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 13,3°, 15,1°, 15,9°, 16,5°, 17,6°, 18,6°, 18,7°, 19,0°, 20,2°, 21,7° y 23,5°. Se entiende que un angulo 20 espedfico significa el valor espedfico ± 0,2°.
Como se usa aqrn, “pico de XRPD principal” se refiere a un pico de XRPD con una intensidad relativa mayor que 25%. La intensidad relativa se calcula como una relacion de la intensidad de pico del pico de interes frente a la intensidad de pico del pico mas grande.
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Como se usa aqm, un sujeto es un mairnfero, preferiblemente un paciente humano, pero tambien puede ser un animal que necesite tratamiento veterinario, tal como un animal de comparua (por ejemplo, perros, gatos, y similares), un animal de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos, y similares) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas, y similares). Sujeto y paciente se usan de forma intercambiable.
Se describe aqm un metodo para ralentizar, por ejemplo inhibir o reducir, la actividad de glucosilceramida sintasa, o reducir las concentraciones de glucoesfingolfpidos en un sujeto que lo necesite mediante la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de sal de hemitartrato de Formula (l), incluyendo sus formas cristalinas, como se describe anteriormente.
Un sujeto que necesite tratamiento es un sujeto con una afeccion o enfermedad que se beneficia de la inhibicion de glucosilceramida sintasa o de la reduccion de las concentraciones de glucoesfingolfpidos en las celulas, particularmente el lisosoma o la membrana de celulas. Se ha demostrado que los inhibidores de glucosilceramida sintasa son utiles para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomico tales como enfermedad de Tay-Sachs, de Gaucher o de Fabry (veanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.569.889; 6.255.336; 5.916.911; 5.302.609; 6.660.749; 6.610.703; 5.472.969; 5.525.616).
Los ejemplos de afecciones o enfermedades incluyen enfermedad renal polidstica y glomerulopatfa membranosa (veanse las Solicitudes de Patentes Provisionales U.S. 61/130.401 y 61/102.541), glomerulonefritis y glomeruloesclerosis (vease la Solicitud de Patente Provisional U.S. 61/137.214), lupus (vease el documento PCT/US2009/001773), diabetes, incluyendo diabetes tipo 2 (vease el documento WO 2006/053043); tratar trastornos que implican el crecimiento y division celulares, incluyendo cancer, enfermedades vasculares de colageno, aterosclerosis, y la hipertrofia renal de pacientes diabeticos (veanse las patentes U.S. nos 6.916.802 y 5.849.326); inhibir el crecimiento de celulas epiteliales arteriales (veanse las patentes U.S. nos 6.916.802 y 5.849.326); tratar pacientes que sufren infecciones (vease Svensson, M. et al., “Epithelial Glucosphingolipid Expression as a Determinant of Bacterial Adherence and Cytokine Production”, Infect. and Immun., 62:4404-4410 (1994)); prevenir que el hospedante, es decir, el paciente, genere anticuerpos frente al tumor (vease Inokuchi, J. et al., “Antitumor Activity in Mice of an Inhibitor of Glycosphingolipid Biosynthesis”, Cancer Lett., 38:23-30(1987)); y tratar tumores (veanse Hakomori, S. “New Directions in Cancer Therapy Based on Aberrant Expression of Glycosphingolipids: Antiadhesion and Ortho-Signaling Therapy”, Cancer Cells 3:461-470 (1991), Inokuchi, J. et al., “Inhibition of Experimental Metastasis of Murine Lewis Long Carcinoma by an Inhibitor of Glucosylceramide Synthase and its Possible Mechanism of Action”, Cancer Res., 50:6731-6737 (1990) y Ziche, M. et al., “Angiogenesis Can Be Stimulated or Repressed in In Vivo by a Change in GM3:GD3 Ganglioside Ratio”, Lab. Invest., 67:711-715 (1992).
El Hemitartrato de Formula (I) tambien se puede usar para una preparacion similar a una vacuna contra el cancer (veanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.569.889; 6.255.336; 5.916.911; 5.302.609; 6.660.749; 6.610.703; 5.472.969; 5.525.616).
El compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (incluyendo su sal de hemitartrato) se puede usar en los metodos descritos como una monoterapia, es decir, como el unico ingrediente farmaceuticamente activo que se administre para tratar la indicacion.
Segun la presente invencion, el compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato del mismo) se puede usar en los metodos descritos como una terapia de combinacion con otros farmacos terapeuticamente activos conocidos en la tecnica para tratar las enfermedades o indicaciones deseadas. “Coterapia” o “combinacion” o “terapia de combinacion” o “coadministrado” se usan aqm de forma intercambiable, y significa que el compuesto de Formula (I) o sal farmaceuticamente aceptable del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato) se administra antes, despues o concurrentemente con uno o mas agentes terapeuticos adicionales. La terapia de combinacion se usa para tratar enfermedad de Gaucher o enfermedad de Fabry. El compuesto de Formula (I) o su sal farmaceuticamente aceptable (incluyendo la sal de hemitartrato) se puede coadministrar simultaneamente (por ejemplo, concurrentemente) como formulaciones separadas o como una formulacion conjunta. Como alternativa, los agentes se pueden administrar secuencialmente, como composiciones separadas, dentro de un marco de tiempo apropiado, segun se determina por el medico experto (por ejemplo, un tiempo suficiente para permitir un solapamiento de los efectos farmaceuticos de las terapias). El compuesto de Formula (I) o su sal farmaceuticamente aceptable (incluyendo la sal de hemitartrato) y uno o mas agentes terapeuticos adicionales se pueden administrar en una unica dosis o en multiples dosis, en un orden o en un calendario adecuado para lograr un efecto terapeutico deseado.
Los agentes terapeuticos eficaces para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher que se pueden usar en una realizacion de la presente invencion incluyen glucocerebrosidasa, analogos de glucocerebrosidasa, inhibidores de glucosilceramida sintasa, y chaperonas moleculares que se unen a glucocerebrosidasa y restauran su conformacion correcta. La glucocerebrosidasa o sus analogos pueden derivar de seres humanos o de mamfferos. Como alternativa, la glucocerebrosidasa y sus analogos se pueden obtener recombinantemente. Los analogos de glucocerebrosidasa incluyen formas truncadas de la enzima y/o enzimas con sustituciones de aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos nativa de la enzima nativa, con la condicion de que se retenga la actividad
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biologica. Los ejemplos de analogos de glucocerebrosidasa incluyen Imiglucerase (vendida con el nombre Cerezyme®) por Genzyme Corporation), Taliglucerase Alfa (comercializado con el nombre Uplyso® y desarrollado por Protalix Biotherapeutics, Inc.) y Velaglucerase Alfa (desarrollado por Shire PLC), que son un analogo de p- glucocerebrosidasa humana producido mediante ADN recombinante. Los ejemplos de chaperonas moleculares incluyen isofagomina (en desarrollo bajo el nombre comercial Plicera™ por Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ). Isofagomina es tambien conocida como tartrato de afegostat, y contiene la forma de sal de tartrato de isofagomina como su ingrediente activo. Los ejemplos de inhibidores de glucocerebrosidasa incluyen miglustat (desarrollado con el nombre comercial de Zavesca™ por Actelion Pharmaceuticals Ltd. Allschwil, Suiza).
Los agentes terapeuticos eficaces para el tratamiento de la enfermedad de Fabry que se pueden usar en una realizacion de la presente invencion incluyen a galactosidasa A, analogos de a galactosidasa A, y chaperonas moleculares que se unen a a galactosidasa A y restauran su conformacion correcta. La a galactosidasa A o sus analogos pueden derivar de seres humanos o de mairnferos. Como alternativa, la a galactosidasa A y sus analogos se pueden obtener recombinantemente. Los analogos de a galactosidasa A incluyen formas truncadas de la enzima y/o enzimas con sustituciones de aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos nativa de la enzima nativa, con la condicion de que se retenga la actividad biologica. Los ejemplos de analogos de a galactosidasa A incluyen Agalsidase beta (una a-galactosidasa humana recombinante vendida por Genzyme Corporation con el nombre comercial Fabrazyme® como un medicamento liofilizado) y Agalsidase alfa (una protema recombinante vendida con el nombre Replagal® por Shire PLC). Los ejemplos de chaperonas moleculares incluyen migalastat (desarrollada con el nombre Amigal™ por Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ como un farmaco que contiene hidrocloruro de migalastat como su ingrediente activo).
En una realizacion, la terapia de combinacion para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher o de Fabry se lleva a cabo en dos etapas. En una primera etapa, se usa un farmaco eficaz para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher o de Fabry (tfpicamente, glucocerebrosidasa o un analogo de la misma para enfermedad de Gaucher, y galactosidasa A o un analogo de la misma para la enfermedad de Fabry) para estabilizar el sujeto. Por ejemplo, en la enfermedad de Gaucher (o en la enfermedad de Fabry), uno de estos farmacos se usa para reducir la carga de almacenamiento de GL-1 en los organos viscerales tales como en el hngado, bazo, pulmon y/o rinon. Una vez que se ha logrado esto, se usa el compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato) en la segunda etapa como una terapia de mantenimiento conveniente. La primera etapa dura tfpicamente hasta una, dos, tres o cuatro semanas o hasta uno, dos, tres, cuatro, seis, nueve o doce meses, o hasta que el recuento plaquetario del sujeto es igual o mayor que 100.000 mm3; la concentracion de hemoglobina es igual o mayor que 11 g/dl (mujeres) o 12 g/dl (hombres); y/o el volumen del bazo del sujeto es menor o igual a 10 multiplos del normal, y los volumenes del hngado son menores o iguales a 1,5 multiplos del normal. La administracion de la primera etapa termina tfpicamente una vez que se inicia la terapia con el compuesto de Formula (I).
Como se usa aqm, una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad eficaz para aliviar los smtomas existentes del sujeto que se esta tratando, con efectos secundarios inaceptables mmimos en el sujeto. La formulacion exacta, via de administracion, y dosificacion se escogen por el medico individual a la vista del estado del paciente. La cantidad e intervalo de la dosificacion se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmaticos del compuesto activo que son suficientes para mantener los efectos terapeuticos deseados. Ademas del estado del paciente y del modo de administracion, la dosis administrada dependena de la gravedad de los smtomas del paciente y de la edad y peso del paciente. Una cantidad eficaz dara tfpicamente como resultado niveles plasmaticos valle del compuesto por encima de al menos 5 ng/ml. Si los niveles plasmaticos valle estan por debajo de 5 ng/ml tras la administracion de una cantidad eficaz del compuesto, la dosis que se administra a ese sujeto se cambia hasta una “cantidad eficaz ajustada”, de manera que los niveles valle del compuesto sean al menos 5 ng/ml. Como alternativa, si los niveles plasmaticos valle del compuesto estan por debajo de 5 ng/ml y/o la Cmax esta por encima de 100 ng/ml tras la administracion de una cantidad eficaz del compuesto, la dosis que se administra al sujeto se cambia a una “cantidad eficaz ajustada”, de manera que los niveles plasmaticos valle del compuesto sean al menos 5 ng/ml y la Cmax este por debajo de 100 ng/ml. Las cantidades eficaces pueden oscilar desde 0,1 hasta 500 mg/por dfa. Como alternativa, la cantidad eficaz oscila de 50-300 mg/dfa. En otra alternativa, la cantidad eficaz oscila de 100-300 mg/dfa. El compuesto de la presente solicitud se puede administrar de forma continua o a intervalos de tiempo espedficos. Por ejemplo, el compuesto de la presente solicitud se puede administrar 1, 2, 3 o 4 veces por dfa, tal como, por ejemplo, una formulacion diaria o de dos veces al dfa. Se pueden emplear ensayos comercialmente disponibles para determinar los intervalos de dosis optimos y/o los calendarios para la administracion.
En un caso, una cantidad eficaz para el compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato descrita anteriormente) es (ya sea como una monoterapia o como una coterapia) una dosis diaria de 25 miligramos a 300 miligramos (como alternativa, 25 miligramos a 150 miligramos; en otra alternativa, de 50 miligramos a 300 miligramos; y en otra alternativa, de 100 miligramos a 300 miligramos), tal como 25, 50, 100, 200 o 300 miligramos por dfa. En un caso espedfico, una cantidad eficaz del compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (incluyendo hemitartrato de Formula (I)) es (ya sea como una monoterapia o como una coterapia) una dosis dos veces al dfa de 50 miligramos (para un total de 100 miligramos por dfa), 100 miligramos (para un total de 200 miligramos por dfa) o 150 miligramos (para un total de 300 miligramos por dfa). En un caso alternativo, una cantidad eficaz para el compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente
aceptable del mismo (incluyendo hemitartrato de Formula (I)) se administra (ya sea como una monoterapia o como una coterapia) como una dosis una vez al dfa de 100 miligramosMa, 200 miligramosMa o 300 miligramos/dfa.
Una cantidad eficaz se puede determinar suponiendo que el sujeto es un “metabolizador pobre de P450” y evaluando entonces los niveles plasmaticos valle y/o Cmax. La cantidad administrada al sujeto se cambia entonces a 5 una cantidad eficaz ajustada, como se describe mas abajo, si los niveles plasmaticos valle estan por debajo de 5 ng/ml; o los niveles valle del compuesto estan por debajo de 5 ng/ml y/o la Cmax esta por encima de 100 ng/ml; o si se determina que el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de p450. Una cantidad eficaz para metabolizadores pobres de P450 esta (ya sea como una monoterapia o como una coterapia) habitualmente entre 100-200 miligramos por dfa, por ejemplo 100 o 200 miligramos, como una dosis una vez al dfa o una dosis dos 10 veces al dfa.
Tfpicamente, las composiciones farmaceuticas descritas aqrn se pueden administrar antes o despues de una comida, o con una comida. Como se usa aqrn, “antes” o “despues” de una comida es tipicamente dentro de dos horas, preferiblemente en una hora, mas preferiblemente en treinta minutos, lo mas preferible en diez minutos de comenzar o terminar una comida, respectivamente.
15 Ahora se ha encontrado que el compuesto de Formula (I) y sales farmaceuticamente aceptables del mismo (incluyendo Hemitartrato de Formula (I)) es metabolizado por el hngado, principalmente por las enzimas del citocromo P450. Las enzimas del citocromo P450 (“CYPs”) son las principales enzimas metabolizantes xenobioticas hepaticas. Hay once enzimas del citocromo P450s metabolizantes xenobioticas expresadas en un tngado humano tfpico (es dear, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6, CYP2E1 y CYP3A4/5). Ahora se ha 20 encontrado tambien que CYP2D6 y CYP3A4 son las isoformas primarias del citocromo P450 que son responsables de la destoxificacion del compuesto de Formula (I) y sus sales farmaceuticamente activas, tales como Hemitartrato de Formula (I). El nivel de actividad de las enzimas de P450 difiere segun el individuo. Por ejemplo, los individuos se pueden clasificar como metabolizadores pobres, intermedios y amplios/ultrarrapidos de P450. Debido a que niveles mas bajos de actividad de P450 en un individuo pueden dar lugar a interacciones farmaco/farmaco (“DDI”), otra 25 realizacion de la invencion es determinar si el sujeto es un metabolizador pobre, intermedio y amplio/ultrarrapido de P450. Si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido, entonces la dosis administrada a ese sujeto se debena elevar hasta una “dosis eficaz ajustada”, es decir, la cantidad que de como resultado niveles plasmaticos valle del compuesto de al menos 5 ng/ml; o la cantidad que de como resultado niveles valle del compuesto de al menos 5 ng/ml y una Cmax del compuesto por debajo de 100 ng/ml. La dosis se puede elevar por incrementos, y el 30 sujeto se puede volver a estudiar una vez, dos veces, tres veces, cuatro o tantas veces como sean necesarias para lograr una dosis eficaz ajustada.
Para el gen CYP 2D6, hay cuatro fenotipos predichos:
Un “metabolizador pobre de P450” posee dos alelos mutantes, que dan como resultado la perdida completa de actividad enzimatica.
35 Un “metabolizador intermedio de P450” posee un alelo de actividad reducida y un alelo nulo.
Un “metabolizador amplio de P450” posee al menos uno y no mas de dos alelos funcionales normales.
Un “metabolizador ultrarrapido de P450” posee multiples copias (3-13) de alelos funcionales y produce actividad enzimatica en exceso.
Un sujeto se evalua tipicamente como metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450 ya sea a 40 traves del genotipado o a traves de la monitorizacion de los niveles plasmaticos valle de un farmaco que es metabolizado por una enzima de P450, tal como CYP2D6 o CYP3A4. Habitualmente, los niveles plasmaticos valle y/o Cmax del compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, incluyendo hemitartrato de Formula (I), se monitorizan en el sujeto durante un tiempo de hasta una, dos, tres o cuatro semanas, o hasta uno, dos, tres, seis, nueve o doce meses o mas tras el inicio del tratamiento con el compuesto. Se realizan ajustes de la 45 dosis, segun sea necesario, para mantener los niveles dentro de los lfmites descritos, es decir, un nivel plasmatico valle en o por encima de 5 ng/ml.
Los sujetos se pueden convertir en metabolizadores pobres de P450 como resultado de ser tratados con ciertos farmacos que son inhibidores de la enzima de P450. Los ejemplos de tales farmacos incluyen paroxetina, fluoxetina, quinidina o ketoconazol. Como alternativa, un sujeto es un metabolizador pobre de P450 como resultado de una 50 expresion baja de una enzima de P450. En tales casos, la expresion baja se puede evaluar determinando la expresion de la enzima de P450 en el sujeto, es decir, genotipando el sujeto para la enzima de P450. Por ejemplo, la expresion de CYP2D6 se evalua habitualmente mediante PCR (McElroy et. al. “CYP2D6 Genotyping as an Alternative to Phenotyping for Determination of Metabolic Status in a Clinical Trial Setting”, AAPS Pharmsi (2000) 2(4):artfculo 33 (
http://www.pharmsci.org/)) o mediante un ensayo farmacogenomico a base de micromatrices 55 (Background Information, Roche Diagnostics “The CYP450 Gene Family and Drug Metabolism”, Hoffmann La Roche Ltd.). Como tal, el sujeto se puede genotipar convenientemente para determinar la expresion de P450 (por ejemplo, CYP2D6) antes del inicio del tratamiento, y se le puede administrar una cantidad eficaz ajustada, si es necesario. En el caso del genotipado antes del inicio del tratamiento, todavfa es aconsejable monitorizar los niveles plasmaticos
valle y Cmax del compuesto y ajustar la dosis, segun sea necesario.
Las cantidades eficaces para migalastat, agalsidasa p, imiglucerasa, isofagomina y miglustat son como se describen en la etiqueta del farmaco, o como se lleva a cabo en los ensayos clmicos de cada farmaco.
El compuesto de Formula (I) puede reaccionar con acidos farmaceuticamente aceptables para formar una sal 5 farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de acidos farmaceuticamente aceptables incluyen acidos inorganicos tales como acido clorlddrico, acido bromlddrico, acido yodlddrico, acido sulfurico, acido fosforico, y similares, y acidos organicos tales como acido p-toluenosulfonico, acido metanosulfonico, acido oxalico, acido p-bromofenil- sulfonico, acido carbonico, acido sucdnico, acido dtrico, acido benzoico, acido acetico, y similares. Los ejemplos de tales sales incluyen el sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenofosfato, 10 dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formiato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, 15 naftaleno-2-sulfonato, mandelato, y similares.
Composiciones farmaceuticas que incluyen Hemitartrato de Formula (I)
Las formulaciones adecuadas y modos de administracion para el compuesto de Formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato del mismo) incluyen aquellos descritos en la patente U.S. n° 7.253.185. En los siguientes parrafos se describe una formulacion preferida para Hemitartrato de 20 Formula (I).
SE describe aqu una composicion farmaceutica que comprende Hemitartrato de Formula (I), al menos una carga soluble en agua, al menos una carga insoluble en agua, al menos un aglutinante, y al menos un lubricante. Las cargas adecuadas solubles en agua pueden incluir, por ejemplo, lactosa anhidra, lactosa monohidratada, manitol, cloruro de sodio, azucar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol, y almidon pregelatinizado. Las cargas adecuadas 25 insolubles en agua pueden incluir, por ejemplo, celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidon. Los aglutinantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, almidon pregelatinizado, carboximetilcelulosa sodica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidon, sacarosa, jarabe de mafz, polietilenglicoles y alginato de sodio. Los lubricantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y behenato de glicerilo. En un caso de la composicion farmaceutica, la 30 carga soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en lactosa anhidra, lactosa monohidratada, manitol, cloruro de sodio, azucar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol y almidon pregelatinizado; la carga insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidon; el aglutinante se selecciona del grupo que consiste en almidon pregelatinizado, carboximetilcelulosa sodica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidon, sacarosa, 35 jarabe de mafz, polietilenglicoles, y alginato de sodio; y el lubricante se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y behenato de glicerilo.
La formula farmaceutica comprende entre 8% en peso y 32% en peso, entre 8% en peso y 24% en peso, entre 12% en peso y 20% en peso, o entre 14% en peso y 18% en peso de la carga insoluble en agua, sobre una base en solidos secos.
40 La formula farmaceutica comprende entre 26% en peso y 50% en peso, entre 30% en peso y 46% en peso, entre 34% en peso y 46% en peso, o entre 38% en peso y 44% en peso de la carga soluble en agua, sobre una base en solidos secos.
La composicion farmaceutica comprende entre 30% en peso y 45% en peso, entre 35% en peso y 40% en peso, y 36% en peso y 39% en peso de Hemitartrato de Formula (I), sobre una base en solidos secos.
45 La formulacion farmaceutica comprende tfpicamente entre 2% en peso y 6% en peso de aglutinante, sobre una base en solidos secos.
La formulacion farmaceutica comprende tfpicamente entre 0,1% en peso y 2% en peso de aglutinante, sobre una base en solidos secos.
En un caso espedfico, la formula farmaceutica comprende entre 8% en peso y 32% en peso de carga insoluble en 50 agua, entre 26% en peso y 50% en peso de carga soluble en agua, entre 30% en peso y 45% en peso de Hemitartrato de Formula (I), entre 2% en peso y 6% en peso de aglutinante, y entre 0,1% en peso y 2% en peso de aglutinante, todo ello sobre una base en solidos secos. Mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; y la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina. Incluso mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina; el aglutinante es 55 hidroxipropilmetilcelulosa; y el lubricante es behenato de glicerilo.
En un caso espedfico, la formula farmaceutica comprende entre 8% en peso y 32% en peso de carga insoluble en
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agua, entre 26% en peso y 50% en peso de carga soluble en agua, entre 35% en peso y 40% en peso de Hemitartrato de Formula (I), entre 2% en peso y 6% en peso de aglutinante, y entre 0,1% en peso y 2% en peso de aglutinante, todo sobre una base en solidos secos. Mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; y la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina. Incluso mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina; el aglutinante es hidroxipropilmetilcelulosa; y el lubricante es behenato de glicerilo.
En otro caso espedfico, la formula farmaceutica comprende entre 8% en peso y 24% en peso de carga insoluble en agua, entre 30% en peso y 46% en peso de carga soluble en agua, entre 35% en peso y 40% en peso de Hemitartrato de Formula (I), entre 2% en peso y 6% en peso de aglutinante, y entre 0,1% en peso y 2% en peso de aglutinante, todo sobre una base en solidos secos. Mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; y la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina. Incluso mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina; el aglutinante es hidroxipropilmetilcelulosa; y el lubricante es behenato de glicerilo.
En otro caso espedfico, la formula farmaceutica comprende entre 12% en peso y 20% en peso de carga insoluble en agua, entre 34% en peso y 46% en peso de carga soluble en agua, entre 35% en peso y 40% en peso de Hemitartrato de Formula (I), entre 2% en peso y 6% en peso de aglutinante, y entre 0,1% en peso y 2% en peso de aglutinante, todo sobre una base en solidos secos. Mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; y la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina. Incluso mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina; el aglutinante es hidroxipropilmetilcelulosa; y el lubricante es behenato de glicerilo.
En otro caso espedfico, la formula farmaceutica comprende entre 14% en peso y 18% en peso de carga insoluble en agua, entre 38% en peso y 44% en peso de carga soluble en agua, entre 35% en peso y 40% en peso de Hemitartrato de Formula (I), entre 2% en peso y 6% en peso de aglutinante, y entre 0,1% en peso y 2% en peso de aglutinante, todo sobre una base en solidos secos. Mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; y la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina. Incluso mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina; el aglutinante es hidroxipropilmetilcelulosa; y el lubricante es behenato de glicerilo.
En otro caso espedfico, la formula farmaceutica comprende entre 14% en peso y 18% en peso de carga insoluble en agua, entre 38% en peso y 44% en peso de carga soluble en agua, entre 36% en peso y 39% en peso de Hemitartrato de Formula (I), entre 2% en peso y 6% en peso de aglutinante, y entre 0,1% en peso y 2% en peso de aglutinante, todo sobre una base en solidos secos. Mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; y la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina. Incluso mas espedficamente, la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina; el aglutinante es hidroxipropilmetilcelulosa; y el lubricante es behenato de glicerilo.
La invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que de ningun modo estan destinados a ser limitantes.
Parrafo 1. La sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
imagen5
en la que la sal es una sal amorfa.
Parrafo 2. La sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
imagen6
en la que al menos 70% en peso de la sal es cristalino.
Parrafo 3. La sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
5
imagen7
en la que al menos 70% en peso de la sal esta en una forma cristalina individual.
Parrafo 4. La sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
imagen8
en la que al menos 99% en peso de la sal es cristalino.
Parrafo 5. La sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
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imagen9
en la que al menos 99% en peso de la sal esta en una forma cristalina individual.
Parrafo 6. La sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-5, en la que la sal de hemitartrato se selecciona de D-hemitartrato, L-hemitartrato, acido hemimesotartarico o D,L-hemitartrato racemico.
Parrafo 7. La sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-5, en la que la sal de hemitartrato es L- 15 hemitartrato.
Parrafo 8. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que al menos 70 % en peso de la sal esta en la forma cristalina individual Forma A.
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Parrafo 9. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por al menos un pico de difraccion de rayos x de polvo principal a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 10. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por al menos dos picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 11. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por al menos tres picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 12. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por al menos cuatro picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 13. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 14. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por picos de difraccion de rayos x de polvo a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 13,3°, 15,1°, 15,9°, 16,5°, 17,6°, 18,6°, 18,7°, 19,0°, 20,2°, 21,7° y 23,5°.
Parrafo 15. La sal de los Parrafos 3 o 5, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por el patron de difraccion de rayos x de polvo de la FIG. 1.
Parrafo 16. Una composition farmaceutica que comprende la sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
imagen10
y un vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
Parrafo 17. La composicion farmaceutica del Parrafo 16, en la que la sal es una sal amorfa.
Parrafo 18. La composicion farmaceutica del Parrafo 16, en la que al menos 70% en peso de la sal es cristalino.
Parrafo 19. La composicion farmaceutica del Parrafo 16, en la que al menos 70% en peso de la sal esta en una forma cristalina individual.
Parrafo 20. La composicion farmaceutica del Parrafo 16, en la que al menos 99% en peso de la sal es cristalino.
Parrafo 21. La composicion farmaceutica del Parrafo 16, en la que al menos 99% en peso de la sal esta en una forma cristalina individual.
Parrafo 22. La composicion farmaceutica del Parrafo 16, en la que la sal de hemitartrato se selecciona de D- hemitartrato, L- hemitartrato, acido hemimesotartarico o D,L-hemitartrato racemico.
Parrafo 23. La composicion farmaceutica del Parrafo 16, en la que la sal de hemitartrato es L-hemitartrato.
Parrafo 24. La composicion farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que al menos 70% en peso de la sal esta en la forma cristalina individual Forma A.
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Parrafo 25. La composition farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que la forma cristalina individual se
caracteriza por al menos un pico de difraccion de rayos x de polvo principal a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°,
11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 26. La composicion farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por al menos dos picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 27. La composicion farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por al menos tres picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 28. La composicion farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por al menos cuatro picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9°, y 21,7°.
Parrafo 29. La composicion farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que la forma cristalina individual se
caracteriza por picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°,
15,9°, y 21,7°.
Parrafo 30. La composicion farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por picos de difraccion de rayos x de polvo a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 13,3°, 15,1°, 15,9°, 16,5°, 17,6°, 18,6°, 18,7°, 19,0°, 20,2°, 21,7° y 23,5°.
Parrafo 31. La composicion farmaceutica del Parrafo 19 o 21, en la que la forma cristalina individual se caracteriza por el patron de difraccion de rayos x de polvo de la FIG. 1.
Parrafo 32. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-Parrafo 15.
Parrafo 33. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-Parrafo 15.
Parrafo 34. Un metodo para inhibir glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glucoesfingolipidos en un sujeto que lo necesite, administrando al sujeto una cantidad eficaz de la sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-Parrafo 15.
Parrafo 35. El metodo del Parrafo 32, 33 o 34, que comprende administrar la sal de hemitartrato a una dosis dos veces al dia de 25 miligramos a 200 miligramos.
Parrafo 36. El metodo del Parrafo 32, 33 o 34, que comprende administrar la sal de hemitartrato a una dosis dos veces al dia de 50 miligramos.
Parrafo 37. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un primer compuesto representado por la siguiente formula estructural:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en combination con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico que es eficaz para tratar enfermedad de Gaucher.
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Parrafo 38. El metodo del Parrafo 37, en el que el segundo agente terapeutico es imiglucerasa.
Parrafo 39. El metodo del Parrafo 37, en el que el segundo agente terapeutico es isofagomina.
Parrafo 40. El metodo del Parrafo 37, en el que el segundo agente terapeutico es miglustat.
Parrafo 41. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry, comprendiendo el metodo administrar
al sujeto una cantidad eficaz de un primer agente terapeutico representado por la siguiente formula estructural:
imagen12
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en combinacion con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico que es eficaz para tratar enfermedad de Fabry.
Parrafo 42. El metodo del Parrafo 41, en el que el segundo agente terapeutico es migalastat.
Parrafo 43. El metodo del Parrafo 41, en el que el segundo agente terapeutico es agalsidasa p.
Parrafo 44. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 37-43, en el que el primer agente terapeutico se administra como el hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-15.
Parrafo 45. El metodo de cualquiera de los Parrafos 37-43, en el que el tratamiento con el primer agente terapeutico se comienza despues del tratamiento durante un periodo de al menos diez semanas con el segundo agente terapeutico.
Parrafo 46. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 37-43, en el que el tratamiento con el primer agente terapeutico se comienza despues del tratamiento con el segundo agente terapeutico y en el que el tratamiento con el primer agente terapeutico se inicia despues de que el recuento plaquetario del sujeto es igual o mayor que 100,000 mm3; la concentration de hemoglobina es igual o mayor que 11 g/dl (mujeres) o 12 g/dl (hombres); y/o el volumen del bazo del sujeto es menor o igual a 10 multiplos del normal, y los volumenes del higado son menores o iguales a 1,5 multiplos del normal.
Parrafo 47. El metodo del Parrafo 45 o 46, en el que el tratamiento con el segundo agente terapeutico se termina tras iniciar el tratamiento con el primer agente terapeutico.
Parrafo 48. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 37-47, que comprende administrar el primer agente terapeutico a una dosis dos veces al dia de 25 miligramos a 200 miligramos.
Parrafo 49. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 37-47, que comprende administrar el primer agente terapeutico a una dosis dos veces al dia de 50 miligramos.
Parrafo 50. Una composition farmaceutica que comprende:
la sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
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al menos una carga soluble en agua; al menos una carga insoluble en agua; al menos un aglutinante; y al menos un lubricante.
Parrafo 51. La composition farmaceutica del Parrafo 50, en la que la sal de hemitartrato es la sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-Parrafo 15.
Parrafo 52. La composicion farmaceutica del Parrafo 50, en la que la carga soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en lactosa anhidra, lactosa monohidratada, manitol, cloruro de sodio, azucar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol y almidon pregelatinizado.
Parrafo 53. La composicion farmaceutica del Parrafo 50, en la que la carga insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidon.
Parrafo 54. La composicion farmaceutica del Parrafo 50, en la que el aglutinante se selecciona del grupo que consiste en almidon pregelatinizado, carboximetilcelulosa sodica, hidroxipropilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidon, sacarosa, jarabe de maiz, polietilenglicoles y alginato de sodio.
Parrafo 55. La composicion farmaceutica del Parrafo 50, en la que el lubricante se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y behenato de glicerilo.
Parrafo 56.La composicion farmaceutica del Parrafo 50, en la que la carga soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en lactosa anhidra, lactosa monohidratada, manitol, cloruro de sodio, azucar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol y almidon pregelatinizado; la carga insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidon; el aglutinante se selecciona del grupo que consiste en almidon pregelatinizado, carboximetilcelulosa sodica, hidroxipropilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidon, sacarosa, jarabe de maiz, polietilenglicoles y alginato de sodio; y el lubricante se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y behenato de glicerilo.
Parrafo 57. La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composicion comprende 26% en peso a 50% en peso de la carga soluble en agua sobre una base en solidos secos.
Parrafo 58.La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composicion comprende 8% en peso a 32% en peso de la carga insoluble en agua sobre una base en solidos secos.
Parrafo 59. La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composicion comprende 8% en peso a 24% en peso de la carga insoluble en agua sobre una base en solidos secos.
Parrafo 60. La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composicion comprende 12% en peso a 20% en peso de la carga insoluble en agua sobre una base en solidos secos.
Parrafo 61. La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composicion comprende 14% en peso a 18% en peso de la carga insoluble en agua sobre una base en solidos secos.
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Parrafo 62. La composition farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composition comprende 2% en peso a 6% en peso del aglutinante sobre una base en solidos secos.
Parrafo 63. La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composicion comprende 0,1% en peso a 2% en peso de un lubricante sobre una base en solidos secos.
Parrafo 64. La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la composicion comprende 35% en peso a 40% en peso de la sal de hemitartrato, 26% en peso a 50% en peso de la carga soluble en agua; 8% en peso a 32% en peso de la carga insoluble en agua; 2% en peso a 6% en peso del aglutinante; y 0,1% en peso a 2% en peso del lubricante, todos sobre una base en solidos secos.
Parrafo 65. La composicion farmaceutica del Parrafo 56, en la que la carga soluble en agua es lactosa monohidratada; la carga insoluble en agua es celulosa microcristalina; el aglutinante es hidroxipropilmetilcelulosa; y el lubricante es behenato de glicerilo.
Parrafo 66. La composicion farmaceutica del Parrafo 65, en la que la composicion comprende 35% en peso a 40% en peso de la sal de hemitartrato, 26% en peso a 50% en peso de la lactosa monohidratada; 8% en peso a 32% en peso de la celulosa microcristalina; 2% en peso a 6% en peso de la hidroxipropilmetilcelulosa; y 0,1% en peso a 2% en peso del behenato de glicerilo, todos sobre una base en solidos secos.
Parrafo 67. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry, comprendiendo el metodo:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de Formula (I):
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
b) estudiar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450;
c) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, determinar una cantidad eficaz ajustada del compuesto; y
d) administrar al sujeto una cantidad eficaz ajustada del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, y administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador pobre de P450.
Parrafo 68. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher, comprendiendo el metodo:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de Formula (I):
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
b) estudiar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450;
c) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, determinar una cantidad eficaz ajustada del compuesto; y
d) administrar al sujeto una cantidad eficaz ajustada del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, y administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto de Formula (I) si el sujeto es un metabolizador pobre de P450.
Parrafo 69. El metodo del Parrafo 67 o 68, en el que el compuesto es la sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-Parrafo 15.
Parrafo 70. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-69, en el que el ensayo comprende monitorizar los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto durante un periodo de al menos una semana.
Parrafo 71. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-69, en el que el ensayo comprende monitorizar los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto durante un periodo de al menos diez semanas.
Parrafo 72.El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-71, en el que el sujeto es un metabolizador intermedio o amplio/ultrarrapido de la enzima de P450 si los niveles valle plasmaticos del compuesto en el sujeto estan por debajo de 5 ng/ml, y la cantidad eficaz ajustada del compuesto se selecciona para dar como resultado niveles valle del compuesto en el sujeto de al menos 5 ng/mg.
Parrafo 73. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-71, en el que el sujeto es un metabolizador pobre de la enzima de P450 si los niveles valle plasmaticos del compuesto son al menos 5 ng/ml tras administrarsele una cantidad eficaz del compuesto.
Parrafo 74. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67 o 68, en el que el ensayo en la etapa b) ocurre antes o despues de que comienza el tratamiento.
Parrafo 75. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-74, en el que la enzima de P450 es la enzima CYP2D6 y/o la enzima CYP3A4.
Parrafo 76.El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-75, en el que el sujeto es un metabolizador pobre de P450 como resultado de coadministrarle un inhibidor de la enzima CYP2D6 o la enzima CYP3A4.
Parrafo 77. El metodo del Parrafo 76, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en paroxetina, fluoxetina, quinidina, y ketoconazol.
Parrafo 78. El metodo del Parrafo 67 o 69, en el que el ensayo en la etapa b) es mediante genotipado para la enzima de P450.
Parrafo 79. El metodo del Parrafo 78, en el que la enzima de P450 es CYP2D6.
Parrafo 80. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-79, en el que la cantidad eficaz del compuesto es una dosis de dos veces al dia de 25 miligramos a 200 miligramos.
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Parrafo 81. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 67-79, en el que la cantidad eficaz del compuesto es una dosis de dos veces al d^a de 50 miligramos.
Parrafo 82. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry, que comprende las etapas de:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
b) evaluar los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto; y
c) ajustar la cantidad de compuesto administrada al sujeto de manera que los niveles plasmaticos valle del compuesto sean al menos 5 ng/ml.
Parrafo 83. Un metodo para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher, que comprende las etapas de:
a) administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto representado por la siguiente formula estructural:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
b) evaluar los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto; y
c) ajustar la cantidad de compuesto administrada al sujeto de manera que los niveles plasmaticos valle del compuesto sean al menos 5 ng/ml.
Parrafo 84. El metodo del Parrafo 82 o 83, en el que el sujeto se ensaya antes del que comience el tratamiento con el compuesto para evaluar si el sujeto es un metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450, y en el que la cantidad eficaz se determina en base a si el sujeto es un metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450.
Parrafo 85. El metodo del Parrafo 82, 83 u 84, en el que el compuesto es la sal de hemitartrato de uno cualquiera de los Parrafos 1-Parrafo 15.
Parrafo 86. El metodo del Parrafo 82 o 83, en el que, en la etapa b), se evalua la Cmax del compuesto en el sujeto, y en el que, en la etapa c), la cantidad de compuesto administrada al sujeto se ajusta de manera que
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los niveles plasmaticos valle del compuesto en el sujeto son al menos 5 ng/ml y la Cmax del compuesto en el sujeto esta por debajo de 100 ng/ml.
Parrafo 87. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 82-86, en el que la enzima de P450 es CYP2D6 y/o la enzima CYP3A4.
Parrafo 88.El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 82-86, en el que el sujeto es un metabolizador pobre de la enzima de P450 como resultado de la coadministracion de un inhibidor de la enzima de P450.
Parrafo 89. El metodo del Parrafo 88, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en paroxetina, fluoxetina, quinidina, y ketoconazol.
Parrafo 90. El metodo de uno cualquiera de los Parrafos 82-86, en el que la expresion de la enzima de P450 en el sujeto se evalua para determinar si el sujeto un metabolizador pobre, intermedio o amplio/ultrarrapido de P450.
Parrafo 91. El metodo del Parrafo 90 en el que la enzima de p450 es CYP2D6 o CYP3A4.
Parrafo 92. El metodo de cualquiera de los Parrafos 82-90, en el que la cantidad eficaz del compuesto es una dosis de dos veces al dfa de 25 miligramos a 200 miligramos.
Parrafo 93. El metodo de cualquiera de los Parrafos 82-90, en el que la cantidad eficaz del compuesto es una dosis de dos veces al dfa de 50 miligramos.
EXPERIMENTAL
Ejemplo 1: Preparacion de sales de Formula (I)
La sal de hemitartrato de Formula I se cristaliza facilmente y muestra muchas propiedades beneficiosas en comparacion con otras sales. Por ejemplo, se usaron los siguientes acidos en la preparacion de sales del compuesto representado por la Formula (I): acido cftrico (que genera sales en relaciones 1:1, 1:2 y 1:3 (sal:Formula I)); acido L- malico (1:1 y 1:2); acido metanosulfonico (1:1); acido fumarico (1:1 y 1:2); acido clortndrico (1:1); acido acetico (1:1); y acido tartarico (1:1 y 1:2). Solo las sales generadas por acido clorhfdrico (1:1); acido tartarico (1:1) y acido tartarico (1:2) fueron de forma solida. De estas tres sales, se encontro que acido clortndrico (1:1) y acido tartarico (1:1) son higroscopicas y no cristalinas, y por lo tanto son inaceptables para uso en un producto farmaceutico. Se encontro que el hemitartrato (1 de sal:2 de Formula I) del compuesto representado por la Formula I es cristalino y no higroscopico.
Preparacion de Hemitartrato de Formula (I) en acetona
Se disolvio acido L-tartarico (6,02 g, 40,11 mmoles, 0,497 equivalentes) en acetona (175 ml) poniendo a reflujo la disolucion y despues enfriando hasta la temperatura ambiente. Se disolvio Base Libre de Formula (I) (32,67 g, 80,76 mmoles) en acetona (300 ml) a temperatura ambiente. La disolucion de acido L-tartarico se anadio a la disolucion de la Base Libre de Formula (I) a temperatura ambiente durante 15 min. Se formo un precipitado blanco a la mitad de la adicion. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 0,5 h horas, y despues se puso a reflujo brevemente y se enfrio hasta la temperatura ambiente. Tras agitar a temperatura ambiente durante 0,5 h, el precipitado blanco se filtro. El solido blanco se lavo dos veces con acetona (2 x 130 ml). El solido se seco al aire, y despues se seco a vado a 55-60°C. El rendimiento fue 36,66 g (95%).
Preparacion de Hemitartrato de Formula (I) en metanol al 5% en acetona.
Se disolvio Base Libre de Formula (I), 10 g/24,7 mmoles, en metanol al 5%/acetona 120 ml o 240 ml. Se disolvio acido L-tartarico, 1,85 g/12,3 mmoles, en metanol al 5%/acetona 60 ml o 120 ml (N o 2N) mediante calentamiento hasta 40-45°C, y esta disolucion se anadio a la primera disolucion. Despues de 1 hora sin precipitacion, se anadio 1 mg de Hemitartrato de Formula (I) como un cristal de siembra. La precipitacion se produjo despues de 5 minutos, y la reaccion se continuo agitando durante 30 minutos mas. La reaccion se calento entonces a reflujo durante 5 minutos (el precipitado era completamente soluble) y despues se enfrio hasta la temperatura ambiente en un bano de agua a 20-22°C. Se formo un precipitado, y la reaccion se continuo agitando durante 3 horas. El producto final se recogio mediante filtracion y se lavo con acetona, 2 x 40 ml, y despues se seco en el horno de vacfo a 55-60°C durante 16 horas. El peso del producto fue 8,72 g/74% de rendimiento.
Preparacion de Hemitartrato de Formula (I) en agua al 1% en acetona.
Se disolvio Base Libre de Formula (I) (10 g/24,7 mmoles) en agua al 1%/acetona 120 ml o 240 ml a temperatura ambiente. Se disolvio acido L-tartarico, 1,85 g/12,3 mmoles, en agua al 1%/acetona 60 ml o 120 ml (N o 2N)
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mediante calentamiento hasta 40-45°C, y esta disolucion se anadio a la primera disolucion. Despues de 1 hora sin precipitacion, se anadio 1 mg de Hemitartrato de Formula (I) como un cristal de siembra. La precipitacion se produjo despues de 5 minutos, y la reaccion se continuo agitando durante 30 minutos. La reaccion se calento entonces a reflujo durante 5 minutos (el precipitado no era completamente soluble) y despues se enfrio hasta la temperatura ambiente en un bano de agua a 20-22°C. Se formo un precipitado, y la reaccion se continuo agitando durante 3 horas. El producto final se recogio mediante filtracion y se lavo con acetona, 2 x 40 ml, y despues se seco en el horno de vado a 55-60°C durante 16 horas. El peso del producto fue 8,62 g 73% de rendimiento.
Recristalizacion de Hemitartrato de Formula (I) en metanol al 5% en acetona.
Se disolvio Hemitartrato de Formula (I) (3,06 g) en 116 ml de metanol al 5% en acetona a reflujo. La disolucion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se agito a temperatura ambiente durante 2 h. El precipitado blanco se filtro y se lavo con 10 ml de metanol al 5% en acetona y despues acetona (15 ml). Despues de secar a vado durante 18 h a 55-60°C, se recibieron 2,38 g de Hemitartrato de Formula (I) (78% de recuperacion).
Recristalizacion de Hemitartrato de Formula (I) en H2O al 1% en acetona.
Se disolvio Hemitartrato de Formula (I) (3,05 g) en 125 ml de H2O al 1% en acetona a reflujo. La disolucion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se agito a temperatura ambiente durante 2 h. El precipitado blanco se filtro y se lavo con 10 ml de H2O al 1% en acetona y despues acetona (15 ml). Despues de secar a vado toda la noche a 55-60°C, se obtuvieron 2,35 g de Hemitartrato de Formula (I) (77% de recuperacion).
Ejemplo 2: Preparacion de Hemitartrato de Formula (I) cristalino
Hemitartrato de Formula (I) se cristalizo mediante varios metodos. El Lote 1 se preparo usando disolventes de acetato de etilo/acetona, y se seco a temperatura ambiente. El Lote 3 se preparo usando disolventes de acetato de etilo/acetona, y se recristalizo en acetato de etilo. El Lote 4 se recristalizo en acetona usando material del Lote 1. El Lote 5 se recristalizo en isopropanol. El Lote 7 se preparo usando un disolvente de acetato de etilo/acetona similar al Lote 1, pero en una escala mayor; el Lote 8 se preparo usando acetona solamente, sin cristalizacion posterior. El Lote 9 se preparo usando acetona solamente con un breve reflujo, y nuevamente sin recristalizacion posterior.
Tabla 1: Sumario de la identificacion de polimorfismos de los Lotes 1-9 de Hemitartrato de Formula (I)
Lote n°
Metodo de procesamiento Punto de fusion mediante DSC (°C) Entalpia (J/g) Microscopio TGA
1
Precipitacion en acetona/acetato de etilo* 162 -81,4 Cristal 99,91% a 100°C 98,73% a 175°C
2
Precipitacion en acetona/acetato de etilo-secado a temperatura ambiente * 164 -95,6 Cristal N/A
3
Precipitacion en acetona/acetato de etilo-secado a 55-60°C 166 -97,8 Cristal 100,0% a 100°C 99,98% a 153°C
4
Recristallizacion en acetona 166 -107,2 Cristal 100,2% a 100°C 100,2% a 153°C
5
Recristalizacion en isopropanol 166 -102,6 Cristal 100,0% a 100°C 100,0% a 153°C
7
Precipitacion en acetona/acetato de etilo 166 -99,4 Cristal** 100,1% a 100°C 99,91% a 153°C
8
Precipitacion en acetona 165 -100,7 Cristal** 100,0% a 100°C 100,0% a 153°C
9
Precipitacion en acetona con reflujo breve 165 -100,2 Cristal**
*: que contiene algo de base libre en el termograma de DSC. **: que contiene habitos cambiados en estos lotes desde formas de varillas, formas de placas a formas de agujas, varillas e irregulares.
Tambien se prepararon formas de cristal de Hemitartrato de Formula (I) usando evaporacion lenta, enfriamiento lento, enfriamiento rapido y precipitacion con antidisolventes con una variedad de disolventes.
Metodo de evaporacion lenta. Se trato una muestra pesada (habitualmente 20 mg) con alfcuotas del disolvente de ensayo. Las alfcuotas teman tfpicamente 100-200 |il. Entre las adiciones de los disolventes, la mezcla se agito o se 5 trato con ultrasonidos. Cuando los solidos se disolvieron, segun se juzgo mediante inspeccion visual, la disolucion se dejo evaporar en condiciones ambientales en un vial abierto cubierto con papel de aluminio perforado con orificios de aguja. Las solubilidades se estimaron a partir de estos experimentos basandose en el disolvente total anadido para obtener una disolucion transparente.
Tabla 2: Solubilidad aproximada de Hemitartrato de Formula (I) a temperatura ambiente (20-25°C).
Disolvente organico
Solubilidad aproximada (mg/ml)
Heptano
No disponible
Hexano
No disponible
Tolueno
<5
Diclorometano
100
Etanol
29
Alcohol isopropflico
<5
Acetonitrilo
<5
Acetato de etilo
<5
Metanol
>200
Acetona
<5
Metil t-butil eter (TBME)
<5
p-Dioxano
<5
Tetrahidrofurano (THF)
<5
10
Tabla 3: Sumario de polimorfismo usando el enfoque de evaporacion lenta.
Disolvente organico
Forma solida generada a partir de evaporacion lenta Punto de fusion mediante DSC (°C) Entalpfa (J/g) Microscopio TGA
Metanol
No N/A N/A N/A N/A
Etanol
Si 165 -95,0 Cristal** 100,0% a 100°C 100,0% a 150°C
**: las partfculas tuvieron forma de placas y de varillas
Metodo de enfriamiento lento/rapido. Se disolvio Hemitartrato de Formula (I) en un disolvente de ensayo a 50-60°C. La disolucion resultante se dejo entonces enfriar hasta la temperatura ambiente (enfriamiento lento). Si no se formo 15 ningun solido despues de un dfa, los viales se colocaron en un refrigerador. Para experimentos de enfriamiento rapido, la disolucion resultante se dejo entonces enfriar en un refrigerador. Los solidos se recogieron mediante filtracion y se secaron al aire.
Tabla 4: Sumario de polimorfismo usando el enfoque de enfriamiento lento.
Disolvente organico
Forma solida generada a partir de enfriamiento lento Punto de fusion mediante DSC (°C) Entalpfa (J/g) Microscopio TGA
Etanol
Si 167 -106,2 Cristal** 100,1% a 100°C 100,1% a 150°C
**: las partfculas tuvieron forma de placas y de varillas
Tabla 5: Sumario de polimorfismo usando el enfoque de enfriamiento rapido.
Disolvente organico
Forma solida generada a partir de enfriamiento rapido Punto de fusion mediante DSC (°C) Entalpfa (J/g) Microscopio TGA
Etanol
Si 167 -106,2 Cristal** 100,0% a 100°C 100,0% a 150°C
**: las partfculas tuvieron forma de placas y de varillas
5
Metodo con antidisolventes. El Hemitartrato de Formula (I) se disolvio en un disolvente. Se anadio un antidisolvente a la disolucion. Los solidos que se formaron se recogieron mediante filtracion y se secaron al aire.
Tabla 6: Sumario de identificacion de polimorfismos usando el enfoque de antidisolventes
Disolvente organico
Forma solida generada a partir de enfoque con antidisolventes Punto de fusion mediante DSC (°C) Entalpfa (J/g) Microscopio TGA
Metanol/acetato de etilo
Si 167 -99,5 Cristal* 100,1% a 100°C 100,1% a 150°C
Metanol/acetona
Si 167 -106,2 Cristal* 100,3% a 100°C 100,2% a 150°C
Metanol/acetonitrilo
No N/A N/A N/A N/A
Metanol/tolueno
No N/A N/A N/A N/A
Metanol/THF
No N/A N/A N/A N/A
Metanol/TBME
Si 167 -102,0 Cristal* 100,2% a 100°C 100,1% a 150°C
Metanol/p-dioxano
No N/A N/A N/A N/A
Agua/THF
No N/A N/A N/A N/A
Agua/TMBE
No N/A N/A N/A N/A
Agua/isopropanol
No N/A N/A N/A N/A
Agua/acetonitrilo
No N/A N/A N/A N/A
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Disolvente organico
Forma solida generada a partir de enfoque con antidisolventes Punto de fusion mediante DSC (°C) Entalpfa (J/g) Microscopio TGA
Agua/acetona
No N/A N/A N/A N/A
Dicolorometano/heptano
Sf 165 -89,2 Cristal** 100,0% a 100°C 99,99% a 150°C
Dicolorometano/acetato de etilo
Sf 167 -97,8 Cristal* 100,2% a 100°C 100,1% a 150°C
Dicolorometano/tolueno
Sf 164 -89,8 Cristal* 99,95% a 100°C 99,86% a 150°C
Dicolorometano/TBME
Sf 167 -98,6 Cristal** 100,0% a 100°C 99,91% a 150°C
Dicolorometano/p- dioxano
Sf (poca) N/A N/A N/A N/A
Dicoloro- metano/isopropanol
No N/A N/A N/A N/A
*: Las partfculas teman forma de placa y de varilla. **: Las partfculas individuales tuvieron mas de un color de birrefringencia. ***: Las partfculas tuvieron forma de agujas y de varillas.
Ejemplo 3: Propiedades fisicas de Hemitartrato de Formula (I)
Calorimetna de barrido diferencial (DSC). Los datos de DSC se recogieron en un instrumento TA Q100 utilizando nitrogeno como el gas de purga. Se pesaron exactamente aproximadamente 2-5 mg de muestra en una bandeja de DSC de aluminio. La bandeja se cubrio con una tapa y se perforo con un forceps. La celda de muestra se equilibro a 30°C y se calento a una velocidad de 10°C por minuto hasta una temperatura final de 220°C.
Microscop^a de platina caliente. La microscopfa de platina caliente se llevo a cabo usando una platina caliente Linkam (modelo FTIR 600) montada sobre un microscopio Leica DM LP equipado con una camara Sony DXC- 970MD 3CCD para la recogida de imagenes. Se uso un objetivo 40x con luz polarizada para visualizar las muestras. Cada una de las muestras se coloco entre dos cubreobjetos. Cada muestra se observo visualmente a medida que se calentaba la platina. Las imagenes se capturaron usando Links version 2.27 (Linkam). La platina caliente se calibro usando patrones de punto de fusion USP.
Se confirmo que la transicion endotermica observada en el perfil de DSC es una transicion de fusion a una temperatura entre 160-163°C mediante microscopfa de platina caliente.
Ejemplo 4: Difraccion de rayos X de polvo de Hemitartrato de Formula (I)
Todos los analisis de difraccion de rayos X de polvo (XRPD) se realizaron en SSCI, Inc. (West Lafayette, IN 47906). Los analisis de XPRD se llevaron a cabo usando un difractometro de rayos X de polvo Shimadzu xRD-6000, usando radiacion CuKa. El instrumento esta equipado con un tubo de rayos X de foco fino. El voltaje y amperaje del tubo se ajustaron a 40 kV y 40 mA, respectivamente. Las ranuras de divergencia y de dispersion se ajustaron a 1°, y la ranura receptora se ajusto a 0,l5 mm. La radiacion difractada se detecto mediante un detector de centelleo de Nal. Se uso el barrido continuo de theta dos theta a 3°/min. (0,4 s/0,02° etapa) de 2,5 a 40° 20. Se analizo un patron de silicio para comprobar el alineamiento del instrumento. Los datos se recogieron y analizaron usando XRD-6000 v 4.1.
Ejemplo 5: Comparacion de Hemitartrato de Formula (I) con Base Libre de Formula (I)
La caracterizacion de solidos de la base libre y de la sal de hemitartrato se resume en la Tabla 7. El Hemitartrato de Formula I tiene propiedades superiores en comparacion con la base libre de Formula I. Por ejemplo, el Hemitartrato de Formula I tiene un mayor punto de fusion (> 150°C), mayor energfa de empaquetamiento (mayor entalpfa
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endotermica), menor varianza en el tamano de parffculas, mayor solubilidad acuosa (alrededor de 300 mg/ml en agua), forma de cristal adecuada, y mayor densidad aparente, en comparacion con la Base Libre de Formula I.
Tabla 7: Sumario de estado solido y propiedades ffsicas y qmmicas de Base Libre de Formula (I) y de Hemitartrato
de Formula (I)
Caracteffsticas ffsicas
Base Libre de Formula (I) Hemitartrato de Formula (I)
Punto de fusion (°C)
86-88 163
Entalpfa endotermica (J/g)
75-82 96-106
Tamano de parffculas (|im)
<10 a 100 ~3 (Media)
Solubilidad acuosa (mg/ml)
0,04 >216
Cristalina
Sf Sf
Forma del cristal
Aguja Placa, varilla, algo irregular
Higroscopfa (40°C/75% RH)
Ninguna Ninguna
Densidad aparente
~0,2 0,4-0,5
Ejemplo 6: Actividad y especificidad in vitro
Actividad de Hemitartrato de Formula (I) inhibiendo la smtesis de glucoesfingoKpidos in vitro. Se usaron dos ensayos para cuantificar la actividad inhibidora de Hemitartrato de Formula (I) para glucosilceramida sintasa. Puesto que la glucosilceramida es la primera etapa y la etapa limitante de la velocidad en la biosmtesis de glucoesfingolfpidos, se uso un ensayo de citometffa de flujo que midio los niveles de superficie celular de GM1 y GM3 para evaluar indirectamente la actividad del inhibidor en celulas intactas. La incubacion de celulas K562 o B16/F10 durante 72 h con cantidades crecientes de Hemitartrato de Formula (I) (0,6-1000 nM) dio como resultado una reduccion de los niveles de la superficie celular de tanto GM1 como GM3, dependiente de la dosis. El valor medio de IC50 para inhibir la presentacion de GM1 en la superficie celular en celulas K562 fue 24 nM (intervalo 14-34 nM) (Tabla 8), y aquel para GM3 en celulas B16/F10 fue 29 nM (intervalo 12-48 nM). No se observo toxicidad celular abierta en ninguna estirpe celular, incluso cuando se ensayo a la dosis mas elevada.
Un ensayo alternativo para la actividad midio la inhibicion de glucosilceramida sintasa en microsomas derivados de celulas humanas. En este ensayo, los microsomas se prepararon a partir de celulas A375 de melanoma humano mediante tratamiento con ultrasonidos y centrifugacion. La preparacion microsomica se incubo con un sustrato de ceramida fluorescente (NBD-C6-ceramida), UDP-glucosa, y cantidades crecientes de Hemitartrato de Formula (I) (01000 nM) durante una hora a temperatura ambiente. Tras la incubacion, la glucosilceramida marcada fluorescentemente y la ceramida sin reaccionar se separaron y cuantificaron mediante HPLC de fase inversa y deteccion de la fluorescencia. En este ensayo, el valor de IC50 para inhibir la smtesis de glucosilceramida oscilo de 20 a 40 nM. Este valor fue similar a los obtenidos anteriormente para GM1 y GM3, y sugiere que las medidas de estos glucoffpidos de la superficie celular son buenos sustitutos de la actividad de Hemitartrato de Formula (I) para glucosilceramida sintasa.
Especificidad de la inhibicion de la smtesis del sustrato por Hemitartrato de Formula (I). La especificidad de Hemitartrato de Formula (I) se evaluo en una serie de ensayos in vitro a base de celulas y libres de celulas. Las enzimas de glucosidasas intestinales se evaluaron en homogenados de tejidos de rata (vease U. Andersson, et al., Biochem. Pharm. 59 (2000) 821-829), y la enzima desramificadora de glucogeno se evaluo en un ensayo libre de celulas como se describio (vease U. Andersson, et al., Biochem. Pharm. 67 (2004) 697-705). No se encontro inhibicion detectable de glucosidasas intestinales (lactasa, maltasa, sacarasa), a-glucosidasa I y II, y la enzima desramificadora citosolica (a-1,6-glucosidasa) a concentraciones de hasta 2500 |iM (Tabla 8).
Se ensayaron glucosilceramidasa no lisosomica y glucocerebrosidasa lisosomica en celulas humanas intactas usando como sustrato C6-NBD-glucosilceramida (vease H.S. Overkleeft, et al. J. Biol. Chem. 273 (1998) 2652226527). Se uso conduritol p epoxido (un inhibidor espedfico de glucocerebrosidasa lisosomica) para diferenciar la actividad lisosomica frente a la no lisosomica. La actividad de glucocerebrosidasa tambien se midio mediante clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS). Se cultivaron celulas K562 con cantidades crecientes de Hemitartrato de Formula (I) en presencia de 1 |iM de 5-(pentafluorobenzoilamino)-fluorescein di-p-D-glucopiranosido (PFB-FDGlu, Molecular Probes/Invitrogen. Carlsbad, CA) durante 30-60 min. Las celulas se congelaron inmediatamente en hielo, y la fluorescencia se cuantifico como antes. La glucosilceramidasa no lisosomica fue inhibida debilmente con una IC50 de 1600 |iM. No hubo inhibicion de glucocerebrosidasa lisosomica, la enzima que es deficiente en la enfermedad de Gaucher, hasta la concentracion mas elevada de 2500 |iM (Tabla 8). Por tanto,
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fue necesaria una diferencia de aproximadamente 40.000 en la concentracion para inhibir glucosilceramida sintasa en comparacion con cualquiera de las otras enzimas ensayadas.
Tabla 8: Actividades bioqmmicas de Hemitartrato de Formula (I) in vitro
Potencia de inhibicion del sustrato (IC50 in vitro):
~0,024 |iM
Especificidades de la enzima, IC50:
a-Glucosidasa I y II:
>2500 |iM
glucocerebrosidasa lisosomica (GBA1):
>2500 |iM |iM
glucosilceramidasa no lisosomica (GBA2):
1600 |iM
Enzima desramificadora de glucogeno:
>2500 |iM
Especificidades de la enzima, Ki
Inhibicion de sacarasa:
Sin inhib. hasta 10 |iM
Inhibicion de maltasa:
Sin inhib. hasta 10 |iM
Ejemplo 7: Manejo mejorado de niveles de glucosilceramida lisosomica en un modelo de raton
A. Enfermedad de Fabry.
Para determinar si el uso combinado de tanto la terapia de sustitucion enzimatica (ERT) como la terapia de reduccion de sustrato (SRT) mantienen la reduccion enzimatica o proporcionan beneficios adicionales, se compararon las eficacias relativas de las terapias separadas y combinadas en un modelo murino de enfermedad de Fabry (Fabry-Rag). Los ratones con Fabry progenitores se describen en Wang, AM et al. Am. J. Hum. Genet. 59: A208 (1996). El Fabry-Rag se cruza con un raton RAG-1 y no desarrolla linfocitos maduros o celulas T (inmunocomprometido).
Estudios con animales.
Para los estudios de monoterapia, los ratones con Fabry entraron en el estudio al mes de edad (modelo de prevencion). Los grupos de tratamiento recibieron Hemitartrato de Formula (I) (Genzyme Corp., Cambridge, MA) como componente de la dieta alimentaria en peletes. El farmaco se formulo a 0,15% (p/p) en comida de raton 5053 estandar (TestDiet, Richmond, IN) y se proporciono a voluntad. Esta formulacion proporciono 300 mg/kg de Hemitartrato de Formula (I) por dfa en un raton de 25 g.
Para los estudios de terapia de combinacion, ratones Fabry-Rag entraron en el estudio a los 3 meses de edad (modelo de tratamiento). Los ratones en el grupo A recibieron inyecciones intravenosas de alfa-galactosidasa A humana recombinante (Genzyme Corp.), a una dosis de 1 mg/kg cada 2 meses (es decir, a los 3, 5, 7 y 9 meses de edad). El grupo B recibio las mismas dosis intravenosas de enzima mas recibieron Hemitartrato de Formula (I) (Genzyme Corp., Cambridge, MA) como componente de la dieta alimentaria en peletes. El farmaco se formulo a 0,15% (p/p) en comida de raton 5053 estandar (TestDiet, Richmond, IN) y se proporciono a voluntad. Esta formulacion proporciono 300 mg/kg de Hemitartrato de Formula (I) por dfa en un raton de 25 g. El grupo C recibio inyecciones de enzima cada 4 meses (es decir, a los 3 y 7 meses de edad), y estaba en la misma dieta de farmaco en alimento como en el grupo B. El grupo D recibio solo la dieta de farmaco en alimento (la misma que los grupos B y C). El grupo E fueron ratones Fabry-Rag sin tratar, y el grupo F fueron controles de tipo salvaje. Vease la FIG 10.
Cuantificacion de niveles de globotriaosilceramida tisular (GL-3, Gb3)
La cuantificacion de GL-3 fue mediante espectrometna de masas en tandem, esencialmente igual que para GL-1.
El ensayo de platina caliente se realizo como se describio previamente (Ziegler, RJ et al. Molec. Ther. 15(3), 492500 (2007).
Resultados
Monoterapia de ratones con Fabry con Hemitartrato de Formula (I)
La SRT se evaluo en un modelo de raton de enfermedad de Fabry, que esta provocada por una deficiencia de actividad de a-galactosidasa A. La terapia con Hemitartrato de Formula (I) comenzo con ratones con Fabry de un mes y continuo hasta que los ratones alcanzaron un ano de edad. A los animales se les dosifico 300 mg/kg de
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Hemitartrato de Formula (I) en su dieta cada dfa. Se llevaron a cabo bimensualmente ensayos de comportamiento (es decir, ensayo de platina caliente) y ensayos bioqmmicos (es decir, analisis de orina y analisis de los niveles de GL-3 en tejidos/sangre/orina) de los ratones.
Como se muestra en la FIGURA 7, la administracion de Hemitartrato de Formula (I) a ratones con Fabry-Rag durante un penodo de 11 meses disminuyo la velocidad de acumulacion lisosomica de globotriaosilceramida (GL-3) en los organos somaticos (hngado, rinon, corazon y bazo) en aproximadamente 50%. Esto se tradujo en un retraso en el progreso de la enfermedad, como se evidencia por una presentacion tardfa de la insensibilidad a un estfmulo caluroso repelente (vease FIGURA 8) y una prevencion del deterioro de los factores del analisis de orina, por ejemplo volumen de orina, niveles de creatinina y sodio (vease FIGURA 9). Por tanto, la inhibicion mediada por Hemitartrato de Formula (I) de glucosilceramida sintasa, que cataliza la primera etapa en la smtesis de glucoesfingolfpidos, no solo es ventajosa en modelos de animales de enfermedad de Gaucher sino tambien de la enfermedad de Fabry, y podna tambien tener efectos positivos en otras glucoesfingolipidosis.
Terapia de combinacion de ratones con Fabry con a-galactosidasa A y Hemitartrato de Formula (I)
Se evaluo la eficacia de la ERT sola y en combinacion con SRT usando Hemitartrato de Formula (I) en cinco poblaciones de ratones con Fabry-Rag (n = 12/grupo). Comenzando a los tres meses de edad, los ratones se sometieron a un programa de ensayos de comportamiento (es decir, ensayo de platina caliente) y ensayos bioqmmicos (es decir, analisis de los niveles de gL-3 en tejidos/sangre/orina), como se muestra en la FIGURA 10. En ratones sometidos a ERT, se administraron dosis de 1 mg/kg de a-galactosidasa A en el programa como se muestra en la FIGURA 10. En ratones sometidos a SRT, se administraron diariamente en la dieta de los ratones dosis de 300 mg/kg de Hemitartrato de Formula (I).
Como se muestra en la FIGURA 11, ERT reduce los niveles de GL-3 en sangre en ratones con Fabry-Rag, mientras que SRT no lo hace. Como se muestra en la FIGURA 12, la combinacion ERT/SRT es mas eficaz reduciendo los niveles de GL-3 en el hngado y rinon de ratones con Fabry-Rag.
Como se muestra en la FIGURA 13, SRT reduce los niveles de GL-3 en orina en ratones con Fabry-Rag, mientras que ERT no lo hace. Como se muestra en la FIGURA 14, SRT, pero no ERT, retrasa el comienzo de la insensibilidad al calor en ratones con Fabry-Rag.
En resumen, los ratones con Fabry-Rag tratados con una combinacion de Fabrazyme y Hemitartrato de Formula (I) mostraron mejoras en los marcadores de la enfermedad con respecto a ERT o SRT solas en un modelo de tratamiento de las siguientes maneras: acumulacion significativamente reducida de GL-3 en hngado y rinon con la terapia de combinacion; GL-3 en orina mejorada en los grupos de SRT; GL-3 en sangre mejorada en grupos de ERT; y neuropatfa periferica retrasada en grupos de SRT.
B. Enfermedad de Gaucher. Para determinar si el uso secuencial tanto de la terapia de sustitucion enzimatica (ERT) como de la terapia de reduccion de sustrato (SRT) puede proporcionar beneficios adicionales, se compararon las eficacias relativas de las terapias separadas y secuenciales en un modelo murino de enfermedad de Gaucher (D409V/null).
Metodos
Estudios con animales. Los procedimientos que implican animales se revisaron y aprobaron por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en Genzyme Corporation siguiendo las directrices expedidas por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). El raton con Gaucher (D409V/null) es un modelo de enfermedad de Gaucher tipo 1 que muestra acumulacion de glucosilceramida en hfgado, bazo y pulmones, pero carece de patologfa osea o cerebral (vease Y-H. Xu, et al., Am. J. Pathol. 163, 2003, 2093-2101). Los animales de ambos sexos entraron en el estudio a los 3 meses de edad ya que experimentos previos habfan indicado que no habfa ninguna diferencia en la respuesta entre machos y hembras a glucocerebrosidasa recombinante o Hemitartrato de Formula (I). El estudio tuvo 6 grupos de ratones, sacrificandose el grupo A despues de 2 semanas para proporcionar niveles de lmea base de glucosilceramida tisular. Los grupos B, C y D recibieron todos ellos glucocerebrosidasa humana recombinante (Genzyme Corp., Cambridge, MA) (10 mg/kg) intravenosamente via la vena de la cola (100 |il) cada 2 dfas durante un total de 8 inyecciones. El grupo B se sacrifico al final de este regimen (al mismo tiempo que el grupo A), para proporcionar niveles de glucosilceramida tisular reducidos por la enzima. Los dos grupos D y E se alimentaron con Hemitartrato de Formula (I) (Genzyme Corp., Cambridge, MA) como componente de la dieta alimentaria en peletes. El farmaco se formulo a 0,075% (p/p) en comida de ratones 5053 estandar (TestDiet, Richmond, IN), y se proporciono a voluntad. Esta formulacion proporciono 150 mg/kg de Hemitartrato de Formula (I) por dfa en un raton de 25 g. El grupo F no recibio tratamiento, y se sacrifico junto con los grupos C, D y E 12 semanas despues del comienzo del estudio. El consumo de alimento y los pesos de los ratones se monitorizaron tres veces por semana para determinar la ingesta de farmaco y el impacto potencial del farmaco sobre la salud global. Los animales se sacrificaron mediante inhalacion de dioxido de carbono, y sus tejidos se recogieron inmediatamente. La mitad de cada tejido se congelo instantaneamente en hielo seco y se almaceno a -80°C hasta que estuviese listo para el procesamiento posterior. La otra mitad se proceso para el analisis histologico.
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Cuantificacion de niveles tisulares de glucosilceramida. Los niveles de glucosilceramida se cuantificaron mediante espectrometna de masas como se describio previamente (veanse K. McEachern, et al., J. Gene. Med. 8 (2006) 719729; T. Doering, J. Biol. Chem. 274 (1999) 11038-11045). Una masa conocida de tejido se homogeneizo en cloroformo:metanol 2:1 (v/v) y se incubo a 37°C durante 15 min. Las muestras se centrifugaron, y los sobrenadantes se extrajeron con 0,2 volumenes de agua toda la noche a 4°C. Las muestras se centrifugaron, la fase acuosa se desecho, y la fase organica se seco hasta una pelfcula en nitrogeno. Para el analisis mediante espectrometna de masas por ionizacion mediante electropulverizacion (ESI/MS), las muestras tisulares se reconstituyeron hasta el equivalente de 50 ng de peso de tejido original en 1 ml de cloroformo:metanol (2:1, v/v), y se sometieron a vortice durante 5 min. Se suministraron alfcuotas (40 |il) de cada muestra a viales de recuperacion total de Waters, y se anadieron 50 |il de un patron interno d3-C16-GL-1 10 |ig/ml (Matreya, Inc., Pleasant Gap, PA). Las muestras se secaron en nitrogeno y se reconstituyeron con 200 |il de DMSO:metanol 1:4 (v/v). El analisis mediante ESI/MS de las glucosilceramidas de diferentes longitudes de cadena de carbono se llevo a cabo en una HPLC Waters alliance (Separation Module 2695) acoplada a un sistema Micromass Quattro Micro equipado con una fuente de ion por electropulverizacion. Se inyectaron muestras de extractos de lfpidos (20 |il) en una columna C8 (4 ml x 3 mm i.d.; Phenomenex, Torrance, CA) a 45°C y se eluyeron con un gradiente de 50 a 100% de acetonitrilo (2 mM de acetato de amonio, acido formico al 0,1%) a 0,5 ml/min. Los primeros 0,5 min. se mantuvieron a 50% de organico y despues se cambio rapidamente a 100% durante los 3,5 min. finales. La temperatura de la fuente se mantuvo constante a 150°C, y se uso nitrogeno como el gas de desolvatacion, a un caudal de 670 l/h. El voltaje del capilar se mantuvo a 3,80 KV, con un voltaje de cono de 23 V, mientras que el tiempo de residencia para cada especie ionica fue 100 ms. Los espectros se adquirieron mediante el modo MRM para monitorizar ocho isoformas dominantes (C16:0, C18:0, C20:0, C22:1, C22:0, C22:1-OH, C24:1, y C24.0). La cuantificacion de glucosilceramida se baso en la suma de estas ocho isoformas con respecto al patron interno, oscilando la curva de calibracion desde 0,1 a 10 |ig/ml.
Histologfa. Para el analisis histologico, los tejidos se fijaron en formalina de cinc (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) a temperatura ambiente durante 24 h, despues se almacenaron en PBS a 4°C hasta que estuvieron listos para el procesamiento posterior. Todas las muestras se deshidrataron en etanol, se aclararon en xilenos, se infiltraron y se embebieron en parafina Surgipath R (Surgipath, Richmond, IL). Se cortaron secciones de cinco micrometres usando un microtomo giratorio, y se secaron en un horno a 60°C antes de la tincion. Las secciones se desparafinaron en Hemo-De (Scientific Safety Solvents, Keller, TX) y se rehidrataron en concentraciones descendentes de etanol, seguido de un lavado con PBS. Las secciones se tineron con Hematoxilina y Eosina (H&E) y se marcaron usando anticuerpo monoclonal anti-CD68 de raton de rata (Serotec, Raleigh, NC), para identificar macrofagos. Tras lavar durante 5 min. en PBS, los portaobjetos se deshidrataron en etanol y se aclararon en Hemo- De antes de montar con medio de montaje de cubreobjetos SHUR/Mount™ (TBS, Durham, NC). El porcentaje de area de inmunopositividad de CD68 en el hugado se cuantifico usando analisis MetaMorph (MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada) de diez imagenes 400X por seccion tisular. Un patologo veterinario certificado de un panel examinador, que no conoda la designacion de los grupos, examino todas las secciones.
Resultados
Regimen de dosificacion de glucocerebrosidasa para la reduccion de GL1 acumulada en el hugado, bazo y pulmon de ratones con Gaucher de 3 meses. Para investigar las ventajas relativas de la combinacion y de la monoterapia con terapia enzimatica o de reduccion de sustrato, se determino en primer lugar el regimen enzimatico que agoto de forma maxima los niveles de GL1 en los organos viscerales de ratones con Gaucher. A ratones con Gaucher (D409V/null) de tres meses se les administraron intravenosamente 2, 4 u 8 dosis de glucocerebrosidasa humana recombinante 10 mg/kg. Los ratones que se trataron con 2 o 4 dosis de la enzima recibieron infusiones de farmaco cada 3 dfas, mientras que aquellos que se trataron con 8 dosis recibieron la enzima cada 2 dfas. El uso de un intervalo de tiempo mas corto entre infusiones en animales que recibieron 8 tratamientos se diseno para minimizar el impacto potencial de cualquier respuesta inmunitaria a la enzima humana administrada. Los animales se sacrificaron 7 dfas despues de la ultima infusion de enzima, y se midio la cantidad de GL1 que queda en sus hfgados, bazos y pulmones.
El tratamiento con 2 dosis de glucocerebrosidasa redujo los niveles de GL1 en el hfgado en un 50%. El incremento del numero de infusiones de enzima hasta 4 u 8, como se esperaba, redujo los niveles de GL1 del hfgado en un grado mayor (aproximadamente 75%). La reduccion menor del total de los niveles de GL1, incluso con 8 dosis, es consistente con la experiencia en sujetos con Gaucher que muestran que la hepatoesplenomegalia se reduce solo despues de un penodo prolongado de tratamiento (vease G.A. Grabowski, et al., Ann. Int. Med. 122 (1995) 33-39). Los niveles de sustrato en los bazos de ratones con Gaucher fueron mas refractarios al tratamiento enzimatico. La administracion de 2 dosis de glucocerebrosidasa no altero significativamente los niveles de GL1 con respecto a aquellos observados en los controles no tratados. El incremento del numero de infusiones de enzima hasta 4 u 8 redujo los niveles esplenicos de GL1 en alrededor de 50%. En el pulmon, se observo una reduccion hasta aproximadamente 60% del control no tratado despues de 8 dosis. El grado ligeramente menor de reduccion del sustrato en el pulmon fue probablemente debido a una accesibilidad mas pobre de la enzima infundida a los macrofagos alveolares llenos de lfpidos. La observacion del mayor aclaramiento de GL1 en el hfgado cuando se compara con el bazo y el pulmon refleja probablemente la biodistribucion de la enzima tras la infusion sistemica (vease S.M. Van Patten, et al. Glycobiology 17 (2007) 467-478). En base a estos resultados, el regimen de tratamiento que consiste en 8 dosis consecutivas de glucocerebrosidasa 10 mg/kg, administrada a intervalos de 2
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d^as, se uso para los estudios subsiguientes.
Capacidades relativas de la terapia enzimatica y de reduccion del sustrato para reducir los niveles de GL1 en el hngado de ratones con Gaucher. Cohortes de ratones con Gaucher de 3 meses se trataron con glucocerebrosidasa recombinante o con Hemitartrato de Formula (I), separada o secuencialmente. A los ratones en los grupos B, C y D se les administraron 8 dosis de enzima como se describe anteriormente (durante un penodo de 2 semanas) para aclarar GL1 acumulada. Los diferentes grupos se alimentaron entonces con comida normal o con comida que contiene Hemitartrato de Formula (I) (150 mg/kg/dfa) durante 10 semanas adicionales, recibiendo el grupo F ningun tratamiento y sirviendo como el control no sometido a tratamiento previo. Independientemente de la formulacion de la comida, los ratones comieron cantidades comparables de alimento, y no hubo diferencias discernibles en la ganancia de peso. Aproximadamente 80% de los niveles de GL1 almacenados se aclararon del hngado despues de 2 semanas de terapia enzimatica sola. Cuando a estos animales se les dejo progresar sin tratamiento adicional durante 10 semanas, sus niveles hepaticos de GL1 aumentaron, indicando que se habfa producido reacumulacion del sustrato durante el intervalo (Figura 2, columna C). Estos niveles no fueron significativamente diferentes de aquellos de los controles no tratados (Figura 2, columna F). Sin embargo, si los ratones se trataron con enzima y despues con Hemitartrato de Formula (I) en su alimento durante un penodo de 10 semanas, sus niveles hepaticos de GL1 fueron significativamente mas bajos que los controles no tratados (Figura 2, columna D y F). Este resultado sugiere que el tratamiento adicional con Hemitartrato de Formula (I) habfa ralentizado la reacumulacion del sustrato. De forma interesante, los ratones con Gaucher tratados con Hemitartrato de Formula (I) solo durante todo el penodo de estudio (12 semanas) tambien mostraron niveles mas bajos de GL-1 (Figura 2, columna E) cuando se compararon con controles no tratados de edad parecida (Figura 2, columna F), aunque la diferencia no fue significativa. La capacidad de SRT sola para reducir los niveles de GL1 en este modelo de animal es consistente con nuestro informe previo (vease K.A. McEachem, et al., Mol. Genet. Metab. 91 (2007) 259-267) y refleja probablemente el hecho de que los ratones con Gaucher (D409V/null) retienen actividad enzimatica residual (vease Y-H. Xu, et al., Am. J. Pathol. 163, 2003, 2093-2101).
Capacidades relativas de la terapia enzimatica y de reduccion del sustrato para disminuir los niveles de GL1 en el bazo de ratones con Gaucher. El tratamiento de ratones con Gaucher de 3 meses con glucocerebrosidasa recombinante sola durante 2 semanas redujo los niveles esplenicos de GL1 en aproximadamente 60% (Figura 3, columna B). Cuando estos animales se les dejo envejecer durante 10 semanas adicionales sin intervencion adicional, los niveles del sustrato volvieron a aquellos observados al comienzo del estudio (Figura 3, columna C) y no fueron significativamente diferentes del control no tratado (Figura 3, columna F). Esto sugiere que la velocidad de reacumulacion de GL1 en el bazo fue mayor que en el tngado. Esta suposicion tambien esta apoyada por la observacion de mayores niveles basales del sustrato en el bazo (~1500 mg/g de tejido; Figura 2, columna A) que en el hngado (~ 500 mg/g de tejido; Figura 3, columna A). Los animales que habfan sido tratados con enzima y despues con Hemitartrato de Formula (I) durante las siguientes 10 semanas mostraron la reduccion mas grande en niveles esplenicos de GL1 (Figura 3, columna D), y estos fueron significativamente menores que aquellos en los bazos de los controles no tratados (Figura 3, columna F). Esto indico que el uso de SRT no solo retraso la acumulacion de sustrato sino que tambien actuo para reducir adicionalmente la carga de almacenamiento en este organo. Parecena que al menos en este caso, el efecto neto de enzima endogena residual y reduccion de sustrato condujo a una disminucion adicional en los niveles de sustrato globales. La observacion de niveles esplenicos de GL1 en los ratones tratados con Hemitartrato de Formula (I) solo durante 12 semanas (Figura 3, columna E) menores que en los controles no tratados (Figura 3, columna F) es consistente con esta nocion, aunque la diferencia no fue significativa. Por tanto, en pacientes con Gaucher tipo 1 leve con actividad enzimatica residual elevada, el tratamiento con ERT seguido de sRt podna acelerar potencialmente la velocidad e incuso quiza el grado de aclaramiento del sustrato ofensivo.
Capacidades relativas de la terapia enzimatica y de reduccion del sustrato para reducir los niveles de GL1 en el pulmon de ratones con Gaucher. Como se senalo anteriormente, los niveles pulmonares de GL1 se aclararon de forma mucho menos eficaz mediante administracion intravenosa de glucocerebrosidasa recombinante. El tratamiento de ratones con Gaucher de 3 meses con enzima durante 2 semanas dio como resultado solamente una reduccion del 30% en los niveles de sustrato en el pulmon (Figura 4, columna B). La cohorte de animales alimentados con comida normal durante las siguientes 10 semanas subsiguientes mostro, como se esperaba, reacumulacion de GL1, y no fueron significativamente diferentes de los niveles no tratados (Figura 4, columna C y F). Por el contrario, los animales alimentados con comida que contiene Hemitartrato de Formula (I) durante el mismo intervalo mostraron una reduccion en los niveles de sustrato hasta por debajo de aquellos a los que se les administro enzima sola (Figura 4, columna D), y fueron significativamente menores que aquellos en los controles no tratados (Figura 4, columna F). Nuevamente, esto sugiere que en el pulmon, como en el bazo, el efecto neto de Hemitartrato de Formula (I) (en presencia de actividad enzimatica endogena residual) no solo retraso la reacumulacion de GL1 sino que tambien actuo para reducirlos adicionalmente hasta por debajo de los niveles de partida. Al igual que con los otros organos viscerales, el tratamiento mediante Hemitartrato de Formula (I) solo fue eficaz reduciendo los niveles pulmonares de GL1 (Figura 4, columna E) cuando se compara con controles no tratados (Figura 4, columna F).
Analisis histopatologico del hngado de ratones con Gaucher despues del tratamiento enzimatico y de reduccion de sustrato. Para visualizar los efectos de los diferentes regfmenes terapeuticos en el hngado, se tineron secciones
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tisulares para CD68, un marcador de macrofagos. El analisis de las secciones hepaticas de ratones con Gaucher de 3 meses no tratados mostro la presencia de grandes numeros de celulas de Gaucher CD68-positivas, hinchadas de Kpidos, que permanecieron en su gran mayoffa sin cambios cuando se analizaron 12 semanas mas tarde. Consistente con los datos bioqmmicos anteriores, los hffgados de animales a los que se les administro glucocerebrosidasa recombinante durante un peffodo de 2 semanas mostraron aclaramiento sustancial del lfpido en estos macrofagos anormales. Si a estos animales se les deja envejecer unas 10 semanas adicionales sin tratamiento posterior, habfa signos de reacumulacion de GL1, segun se indica mediante la reemergencia de celulas de Gaucher. Sin embargo, este incremento en celulas de Gaucher se anulo si a los ratones se les administraba terapia de reduccion de sustrato con Hemitartrato de Formula (I) durante el mismo intervalo. Como se senala previamente, los ratones con Gaucher que recibieron Hemitartrato de Formula (I) solo tambien mostraron acumulacion reducida del sustrato, aunque no en el mismo grado que aquellos que recibieron una combinacion de ERT y SRT. El grado de tincion CD68-positiva en las diversas secciones tambien se cuantifico usando software MetaMorph (Figura 18). El grado de tincion en estas secciones reflejo las cantidades de niveles hepaticos de GL1 determinados bioqmmicamente (Figura 15), apoyando adicionalmente las sugerencias sobre las ventajas relativas de los diferentes regfmenes de tratamiento.
Ejemplo 8: Eficacia de Hemitartrato de Formula (I) en un modelo de raton de enfermedad de Gaucher
Estudios con animales. Los procedimientos que implican animales se revisaron y se aprobaron por un Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) siguiendo las directrices estatales y federales de la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Los ratones gbaD409vlnuV con Gaucher (vease Y.-H. Xu. et al., Am. J. Pathol. 163 (2003) 2093-2101) se dejaron envejecer segun los requisitos del estudio. No se ha encontrado diferencia en fenotipo o respuesta a Hemitartrato de Formula (I) entre machos y hembras, de manera que se usaron ambos sexos en los estudios. El suministro de Hemitartrato de Formula (I) fue mediante una unica sonda oral diaria a un volumen de 10 ml/kg. Los animales se aclimataron a la sonda oral con un volumen similar de agua durante una semana antes del inicio del tratamiento. El Hemitartrato de Formula (I) se disolvio en agua para inyeccion (WFI; VWR, West Chester, PA) y se administro en una escala de dosis desde 75 mg/kg/dfa hasta 150 mg/kg/dfa durante el transcurso de nueve dfas, con tres dfas en cada dosis e incrementos de 25 mg/kg/dfa. Los ratones se pesaron tres veces por semana para monitorizar el impacto potencial del farmaco sobre su salud general. Los animales se sacrificaron mediante inhalacion de dioxido de carbono, y sus tejidos se recogieron inmediatamente. La mitad de cada tejido se congelo instantaneamente en hielo seco y se almaceno a -80°C hasta que estuvo listo para el procesamiento posterior. La otra mitad se recogio para el analisis histologico.
Cuantificacion de niveles tisulares de glucosilceramida mediante cromatograffa de capa fina de altas prestaciones. El analisis mediante cromatograffa de capa fina de altas prestaciones (HP-TLC) fue como se describio (A. Abe, et al., J. Clin. Inv. 105 (2000) 1563-1571; H. Zhao, et al. Diabetes 56 (2007) 1341-1349; y S.P.F. Miller, et al. J. Lab. Clin. Med. 127 (1996) 353-358). De forma breve, una fraccion lipfdica total se obtuvo homogeneizando tejido en PBS fffo, extrayendo con cloroformo:metanol 2:1 (v/v) y sometiendo a ultrasonidos en un sonicador de bano de agua. Las muestras se centrifugaron para separar las fases, y se recupero el sobrenadante. Los peletes se volvieron a tratar con ultrasonidos en cloroformo:metanol:disolucion salina, se centrifugaron, y el segundo sobrenadante resultante se recogio y se combino con el primero. Se anadio una mezcla de cloroformo:disolucion salina 1:1 (v/v) a los sobrenadantes combinados, se sometio a vortice, y se centrifugo. Despues de desechar la capa acuosa superior, se anadio metanol:disolucion salina, se sometio a vortice y se volvio a centrifugar. La fase organica se recogio y se seco en nitrogeno, se disolvio en cloroformo:metanol 2:1 (v/v) a 1 ml por 0,1 g de peso de tejido original, y se almaceno a -20°C.
Una porcion del extracto lipfdico se uso para medir fosfato total (vease B.N. Ames, Methods Enzymol. 8 (1966) 115118), es decir, el contenido de fosfolfpidos a usar como patron interno. El resto sufrio metanolisis alcalina para eliminar fosfoffpidos que migran con glucosilceramida en la placa de HP-TLC. Alfcuotas de los extractos que contienen cantidades equivalentes del fosfato total se mancharon sobre una placa de HP-TLC junto con patrones de glucosilceramida conocidos (Matreya inc. Pleasant Gap, PA). Los lfpidos se resolvieron y se visualizaron con acetato cuprico monohidratado al 3% (p/v). Acido fosforico al 15% (v/v) seguido de la coccion durante 10 min. a 150°C. Las bandas de lfpidos se escanearon en un densitometro (GS-700, Bio-Rad, Hercules, CA) y se analizaron mediante software Quantity One (Bio-Rad).
Cuantificacion de niveles tisulares de glucosilceramida mediante espectrometffa de masas. La glucosilceramida se cuantifico mediante espectrometffa de masas como se describio. (Veanse K. McEachern, et al. J. Gene Med. 8 (2006) 719-729; T. Doering, et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 11038-11045). El tejido se homogeneizo en cloroformo:metanol 2:1 (v/v) y se incubo a 37°C. Las muestras se centrifugaron, y los sobrenadantes se extrajeron con 0,2 volumenes de agua toda la noche. Las muestras se centrifugaron nuevamente, la fase acuosa se desecho, y la fase organica se seco hasta una pelfcula en nitrogeno.
Para el analisis de espectrometffa de masas mediante ionizacion por electropulverizacion (ESI/MS), las muestras tisulares se reconstituyeron hasta el equivalente de 50 ng de peso de tejido original en 1 ml de cloroformo/metanol (2:1, v/v), y se sometieron a vortice durante 5 min. Alfcuotas de cada muestra (40 |il) se suministraron a viales de recuperacion total de Waters, y se anadieron 50 |il de un patron interno d3-C16-GL-1 10 |ig/ml (Matreya, Inc., Pleasant Gap, PA). Las muestras se secaron en nitrogeno y se reconstituyeron con 200 |il de DMSO:metanol 1:4. El
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analisis mediante ESI/MS de las glucosilceramidas de diferentes longitudes de cadena de carbono se llevo a cabo en una HPLC Waters alliance (Separation Module 2695) acoplada a un sistema Micromass Quattro Micro equipado con una fuente de ion por electropulverizacion. Se inyectaron veinte microlitros de muestras de extracto lipfdico en una columna C8 (4 ml x 3 mm i.d.; Phenomenex, Torrance, CA) a 45°C y se eluyeron con un gradiente de 50-100% de acetonitrilo (2 mM de acetato de amonio, acido formico al 0,1%) a 0,5 ml/min. Los primeros 0,5 min. se mantuvieron a 50% de organico, y despues se cambio rapidamente a 100% durante los 3,5 min. finales. La temperatura de la fuente se mantuvo constante a 150°C, y se uso nitrogeno como el gas de desolvatacion, a un caudal de 670 l/h. El voltaje del capilar se mantuvo a 3,80 KV, con un voltaje de cono de 23 V, mientras que el tiempo de residencia para cada especie ionica fue 100 ms. Los espectros se adquirieron mediante el modo MRM para monitorizar ocho isoformas dominantes (C16:0, C18:0, C20:0, C22:1, C22:0, C22:1-OH, C24:1, y C24:0). La cuantificacion de glucosilceramida se baso en la suma de estas ocho isoformas respecto al patron interno, con un intervalo de la curva de calibracion desde 0,1 hasta 10 |ig/ml.
Histologfa. Para el analisis histologico, los tejidos se fijaron en formalina de cinc (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) a temperatura ambiente durante 24 h, despues se almacenaron en PBS a 4°C hasta que estuvieron listos para el procesamiento posterior. Todas las muestras se deshidrataron en concentraciones ascendentes de alcohol, se aclararon en xilenos y se infiltraron y embebieron en parafina Surgipath R (Surgipath, Richmond, IL). Se cortaron secciones de cinco micrometres usando un microtomo giratorio, y se secaron en un horno a 60°C antes de la tincion. Las secciones se desparafinaron en xilenos, y se rehidrataron en concentraciones descendentes de alcohol, seguido de un lavado con agua. Despues de un aclarado de 1 min. en acido acetico al 3%, los portaobjetos se tineron durante 40 min. en 1% de Alcian Blue 8GX (Electron Microscopy Sciences) en acido acetico al 3%, pH 2,0. Despues de aclarar en agua y oxidar en acido peryodico al 1% durante 1 min., los portaobjetos se tineron con reactivo de Schiff (Surgipath) durante 12 min. Despues de lavar durante 5 min. en agua caliente, los portaobjetos se deshidrataron en alcohol y se aclararon en xilenos antes de montarlos con medio de montaje de cubreobjetos SHUR/Mount™ (TBS, Durham, NC). Las celulas de Gaucher identificadas morfologicamente en el hfgado se cuantificaron usando un recuento celular manual por 10 campos de alta potencia (HPFs, 400x).
Resultados
Efecto de la administracion de Hemitartrato de Formula (I) a ratones D409V/null. Se evaluo el efecto de la administracion de Hemitartrato de Formula (I) a ratones D409V/null. A ratones de aproximadamente 7 meses se les administro 150 mg/kg/dfa de Hemitartrato de Formula (I) (una dosis que en los estudios preliminares mostro ser eficaz inhibiendo glucosilceramida sintasa) mediante sonda oral durante 10 semanas. Este tratamiento no tuvo efectos notables sobre el bienestar o habitos alimentarios de los ratones. Las medidas de su peso corporal durante el estudio no mostraron desviacion significativa de aquellas de los ratones no tratados, sugiriendo que el Hemitartrato de Formula (I) fue bien tolerado a una dosis que mostro ser eficaz inhibiendo la sintasa.
Eficacia de Hemitartrato de Formula (I) a la hora de tratar ratones con Gaucher jovenes presintomaticos. Se evaluo el Hemitartrato de Formula (I) para determinar la reduccion de la acumulacion lisosomica de glucosilceramida y la aparicion de celulas de Gaucher en raton D409V/null joven (10 semanas). Estos ratones con Gaucher jovenes muestran niveles bajos de GL-1 en los tejidos afectados. A animales de diez semanas se les administro 75 o 150 mg/kg/dfa de Hemitartrato de Formula (I) mediante sonda oral durante 10 semanas. La medida de los niveles de glucosilceramida mostro una reduccion dependiente de la dosis cuando se compara con controles tratados con vehreulo de edad parecida. En la cohorte que habfa sido tratada con 150 mg/kg/dfa, los niveles de glucosilceramida fueron 60, 40 y 75% de aquellos en los controles, en el hfgado, pulmon y bazo, respectivamente (FIG. 6). Los niveles estadfstica y significativamente menores de glucosilceramida observados en el hfgado y pulmon de ratones D409V/null tratados indicaron que Hemitartrato de Formula (I) fue eficaz reduciendo la acumulacion de este glucoesfingolfpido en estos tejidos.
La evaluacion histopatologica de los hfgados de ratones D409V/null no tratados al final del estudio (20 semanas) mostro la presencia de celulas de Gaucher por todo el hfgado. Los ratones tratados con 150 mg/kg/dfa de Hemitartrato de Formula (I) durante 10 semanas mostraron solamente la presencia ocasional de celulas de Gaucher que tambien tuvieron invariablemente un menor tamano. La cuantificacion de estas celulas en un numero de diferentes secciones confirmo que la frecuencia de celulas de Gaucher fue significativamente menor en los ratones tratados con Hemitartrato de Formula (I). Juntos, estos hallazgos bioqmmicos e histologicos sugieren que la administracion oral diaria de Hemitartrato de Formula (I) a ratones con Gaucher presintomaticos fue eficaz a la hora de disminuir la acumulacion de glucosilceramida en los tejidos afectados y la formacion consiguiente de celulas de Gaucher en el hfgado.
Eficacia de Hemitartrato de Formula (I) en el tratamiento de ratones con Gaucher mas viejos con patologfa preexistente. Tambien se evaluo la eficacia de Hemitartrato de Formula (I) a la hora de detener o invertir la progresion de la enfermedad en ratones con Gaucher sintomaticos mas viejos. A ratones D409V/null de siete meses se les administro 150 mg/kg/dfa de Hemitartrato de Formula (I) mediante sonda oral durante 10 semanas. Los analisis de los niveles de glucosilceramida en el hfgado, pulmon y bazo de ratones tratados a 5 y 10 semanas despues del tratamiento mostraron que no habfan aumentado mas alla de aquellos observados al comienzo del estudio. Despues de 10 semanas de tratamiento, se determino que los niveles de glucosilceramida eran 60% mas bajos en el hfgado, 50% mas bajos en el pulmon y 40% mas bajos en el bazo que en ratones tratados con el
vehuculo. Estos resultados mostraron que Hemitartrato de Formula (I) fue eficaz inhibiendo la acumulacion adicional de glucosilceramida en ratones con una carga existente de patologfa de almacenamiento.
El analisis histopatologico de secciones tisulares mostro un numero reducido de celulas de Gaucher en el hugado de ratones D409V/null tratados, cuando se compara con controles no tratados. La cuantificacion del numero de celulas 5 de Gaucher corroboro los hallazgos bioqmmicos; los ratones D409V/null tratados presentaron recuentos de celulas de Gaucher que no fueron significativamente diferentes de aquellos al comienzo del tratamiento tanto en los puntos de tiempo de 5 como de 10 semanas. Los numeros de celulas de Gaucher en ambos puntos de tiempo fueron significativamente menores que aquellos de ratones D409V/null no tratados. Juntos, estos datos demuestran que Hemitartrato de Formula (I) inhibio eficazmente la acumulacion adicional de glucosilceramida y el desarrollo de 10 celulas de Gaucher en animales con patologfa preexistente.
Discusion
El Hemitartrato de Formula (I) demostro un grado elevado de especificidad por la enzima glucosilceramida sintasa. Tampoco hubo ninguna inhibicion medible de la actividad de glucocerebrosidasa a la dosis eficaz, lo que es un rasgo importante cuando se trata a pacientes con la enfermedad de Gaucher tipo 1, la mayona de los cuales retienen 15 actividad residual de glucocerebrosidasa. A la dosis eficaz de 150 mg/kg/dfa, no hubo aspectos gastrointestinales observables, y no hubo diferencia en pesos corporales entre los grupos tratados y los grupos no tratados del control. Las concentraciones sericas a o por encima de la IC50 (24-40 nM) fueron facilmente obtenibles con dosis orales que estaban por debajo del nivel tolerado maximo. El Hemitartrato de Formula (I) tambien se metabolizo y aclaro facilmente: tanto el compuesto progenitor como los metabolitos se aclararon eficazmente en las 24 h, como se 20 muestra en estudios ADMe de dosis oral unica y repetida con compuesto radiomarcado con 14C en ratas y perros.
El uso de un regimen de dosificacion no optimizado de una sonda oral diaria unica evito con exito la acumulacion de glucosilceramida tanto en ratones presintomaticos jovenes como en ratones con Gaucher mas viejos que ya mostraron patologfa de almacenamiento. Los ratones jovenes de 10 semanas, aunque poseen niveles elevados de glucosilceramida con respecto a los controles de tipo salvaje, todavfa no habfan desarrollado los macrofagos de 25 tejidos hinchados caractensticos, denominados celulas de Gaucher. El tratamiento con 150 mg/kg/dfa de Hemitartrato de Formula (I) detuvo toda progresion medible de la enfermedad e inhibio el desarrollo de celulas de Gaucher. En ratones mas viejos que mostraron un nivel mayor de glucosilceramida lisosomica y un numero de celulas de Gaucher, no hubo incremento adicional en los niveles del glucoesfingolfpido o en el numero de celulas de almacenamiento despues de 5 semanas o 10 semanas de tratamiento. Puesto que se da a conocer que la fuente 30 principal de glucosilceramida en celulas de Gaucher tiene origen extracelular, estos resultados suponen que la inhibicion de glucosilceramida sintasa por Hemitartrato de Formula (I) fue sistemica.
La observacion de que Hemitartrato de Formula (I) fue eficaz previniendo la acumulacion adicional de glucosilceramida sugiere una estrategia terapeutica que podna potenciar adicionalmente el tratamiento de la enfermedad de Gaucher.
35 En resumen, los datos presentados aqrn demostraron que Hemitartrato de Formula (I) es un inhibidor activo y espedfico de glucosilceramida sintasa que no muestra efectos adversos abiertos en un modelo de raton de enfermedad de Gaucher. Evito con exito la progresion de la enfermedad tanto en ratones con Gaucher presintomaticos como en ratones con Gaucher enfermos mas viejos, al inhibir la acumulacion de glucosilceramida y la formacion de celulas de Gaucher. Estos hallazgos sugieren que Hemitartrato de Formula (I) puede representar 40 ademas otra opcion terapeutica tanto para enfermedad de Gaucher tipo 1 pediatrica como de adulto, y potencialmente otros trastornos de almacenamiento de glucoesfingolfpidos.
Ejemplo 9: Ensayo clinico de fase 2 de Hemitartrato de Formula (I)
Metodos. Este ensayo clinico de Hemitartrato de Formula (I), administrado oralmente dos veces al dfa 50 o 100 mg, trato 26 adultos con enfermedad de Gaucher tipo 1 (GD1) (16M:10H; edad media de 34 anos, intervalo 18-60; todos 45 caucasicos) en 7 sitios en 5 pafses. Los pacientes teman esplenomegalia (un volumen 10 veces el normal) y trombocitopenia (plaquetas 45.000-100.000/mm3) o anemia (hemoglobina 8-10 g/dl, mujeres; 8-11 g/dl, hombres). Ninguno recibio terapia de sustitucion enzimatica o de reduccion de sustrato en los 12 meses previos. El punto final de eficacia primaria compuesta es el nivel de globina (+0,5 g/dl) o el recuento plaquetario (+15%) despues de 52 semanas de tratamiento. Tambien se evaluo el volumen hepatico, quitotriosidasa, y glucosilceramida. Los pacientes 50 continuaron siendo tratados y monitorizados a largo plazo.
Resultados. Los datos en la semana 52 estuvieron disponibles para un numero de hasta 20 pacientes; otros 4 se retiraron prematuramente, y 2 estaban en desarrollo. El punto final primario compuesto fue satisfecho por 19 de los 20 pacientes. Los cambios medios (1SD) con respecto de la lmea base a la Semana 52 fueron: hemoglobina +1,6 (11,35) g/dl; recuento plaquetario +43,6% (137,59%); volumen del bazo y del hugado (multiplos del normal) 40,2% 55 (110,44%) y 15,8% (110,39%), respectivamente; y quitotriosidasa 49,9% (120,75%). Los niveles plasmaticos de
glucosilceramida se normalizaron despues de 4 semanas en todos los pacientes, el Hemitartrato de Formula (I) fue bien tolerado con un perfil de seguridad aceptable. Se han dado a conocer siete sucesos adversos relacionados en 6 pacientes; todos ellos fueron de naturaleza leve y transitoria.
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Ejemplo 10: Composicion farmaceutica de Hemitartrato de Formula (I), capsulas de 100 mg
Metodo de preparacion de capsulas de 100 mg: Hemitartrato de Formula (I), celulosa microcristalina, lactosa monohidratada, e hipromelosa, E15, se hicieron pasar separadamente a traves de un tamiz de malla 20. Las cantidades de los ingredientes tamizados indicadas en la Tabla 9 se amasaron en un granulador de alto cizallamiento durante nueve a doce minutos.
Tabla 9. formulacion farmaceutica para capsulas de 100 mg
Cantidad unitaria
Ingrediente
Capsula de cantidad unitaria de 100 mg (mg) % por dosis unitaria (% p/p) Tamano nominal del lote: 71.000 Capsulas Cantidad total 19,2 kg
Hemitartrato de Formula (I)
100,0 37,0 7,1
Celulosa microcristalina
45,0 16,7 3,2
Monohidrato de lactosa
111,5 41,3 7,9
Hipromelosa, E15
10,8 4,0 0,8
Behenato de glicerilo
2,7 1,0 0,2
Peso lleno (mg)
270 248-292 mg
composicion % Total
100,0 19,2 kg
Los ingredientes se granularon entonces en humedo mediante la adicion de agua purificada (2,2 kg; 11,7% de peso de ingredientes secos) al bol del granulador hasta su terminacion, segun se confirmo visualmente. La granulacion humeda se descargo del bol y se hizo pasar a traves de un molino tamizador con rueda de paletas giratorias. La granulacion humeda se seco entonces en un horno seco de bandeja, de lecho, solido, estatico, con calefaccion directa, a 50 ± 5°C para humedecer el contenido no mas de 3,5%, segun se confirmo mediante comprobacion en el proceso. Los granulos secos se hicieron pasar entonces a traves de un molino tamizador, y los granulos tamizados se transfirieron a una amasadora en V. Se anadio behenato de glicerilo (0,2 kg) a la amasadora en V, y la mezcla final se mezclo hasta que la mezcla fue uniforme, segun se determina mediante un ensayo de uniformidad de mezcla en lmea y fuera de lmea, tfpicamente durante diez a veinte minutos. La mezcla final se encapsulo entonces en una capsula de tamano #2, usando un recargador de capsulas semiautomatico hasta el peso de llenado apropiado (270 mg de media), y las capsulas rellenas se desempolvaron antes del envasado.
Ejemplo 11A: Composicion farmaceutica de Hemitartrato de Formula (I), capsulas de 10 mg
Metodo de preparacion de capsulas de 10 mg: Se siguio el procedimiento del Ejemplo 10 hasta la etapa de encapsulamiento. Para producir una capsula de 10 mg, la mezcla final se encapsulo en una capsula de tamano #4 o #5 usando una maquina de rellenado de capsulas hasta el peso de llenado apropiado (27 mg de media), y las capsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.
Ejemplo 11B: Composicion farmaceutica de Hemitartrato de Formula (I), capsulas de 50 mg
Metodo de preparacion de capsulas de 50 mg: Se siguio el procedimiento del Ejemplo 10 hasta la etapa de encapsulamiento. Para producir una capsula de 50 mg, la mezcla final se encapsulo en una capsula de tamano #3 usando una maquina de rellenado de capsulas hasta el peso de llenado apropiado (135 mg de media), y las capsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.
Ejemplo 11C: Composicion farmaceutica de Hemitartrato de Formula (I), capsulas de 150 mg
Metodo de preparacion de capsulas de 150 mg: Se siguio el procedimiento del Ejemplo 10 hasta la etapa de encapsulamiento. Para producir una capsula de 150 mg, la mezcla final se encapsulo en una capsula de tamano #0 usando una maquina de rellenado de capsulas hasta el peso de llenado apropiado (405 mg de media), y las capsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.
Ejemplo 12: Composicion farmaceutica de Hemitartrato de Formula (I), capsulas de 25 mg
Metodo de preparacion de capsulas de 25 mg: Se siguio el procedimiento del Ejemplo 10 hasta la etapa de
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encapsulamiento. Para producir una capsula de 25 mg, la mezcla final se encapsulo en una capsula de tamano #4 usando una maquina de rellenado de capsulas hasta el peso de llenado apropiado (67,5 mg de media), y las capsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.
Ejemplo 13: Interacciones del farmaco Hemitartrato de Formula (I) - inhibidores de CYP2D6
Se llevo a cabo un estudio para evaluar la farmacocinetica, seguridad y tolerabilidad de multiples dosis orales de Hemitartrato de Formula (I) (100 mg, dos veces al dfa) administradas con y sin paroxetina (30 mg, una vez al dfa), un potente inhibidor de CYP2D6. Esto fue un estudio de secuencia fija, de etiqueta abierta, en 36 sujetos sanos (17 hombres y 19 mujeres). Los objetivos secundarios fueron evaluar la Pk de paroxetina en combinacion con multiples dosis de Hemitartrato de Formula (I) (100 mg, dos veces al dfa) en sujetos sanos, y evaluar ademas la PK de Hemitartrato de Formula (I) tras la administracion de multiples dosis en comparacion con una unica dosis de Hemitartrato de Formula (I).
Los parametros medios de PK de la base libre de Hemitartrato de Formula (I) como existe en el plasma fueron no lineales, y mostraron una acumulacion de 2 veces en AUC y Cmax con la administracion repetida (100 mg, dos veces al dfa) en comparacion con la administracion de una unica dosis. La administracion concomitante de Hemitartrato de Formula (I) y paroxetina dio como resultado un incremento de 7 veces en Cmax y un incremento de 9 veces en AUC, en comparacion con la administracion de multiples dosis de Hemitartrato de Formula (I) solo. Estos resultados indican que paroxetina puede inhibir el metabolismo de Hemitartrato de Formula (I) e incrementar las concentraciones plasmaticas sangumeas del farmaco. Senan de esperar efectos similares con otros potentes inhibidores de CYP2D6 (por ejemplo fluoxetina y quinidina), y es necesaria una monitorizacion cuidadosa de los niveles plasmaticos del farmaco y ajustes potenciales de la dosis cuando Hemitartrato de Formula (I) se coadministra con un farmaco que se sabe que es un potente inhibidor de CYP2D6. Las concentraciones de paroxetina fueron alrededor de 1,5 a 2 veces mayores que las esperadas, lo que sugiere que Hemitartrato de Formula (I) o uno de sus metabolitos puede ser un inhibidor leve de CYP2D6.
Ejemplo 14: Interacciones del farmaco Hemitartrato de Formula (I) - inhibidores de CYP3A4 e inhibidores de p-glucoprotema (PGP)
Se llevo a cabo un estudio para evaluar la farmacocinetica, seguridad y tolerabilidad de multiples dosis de Hemitartrato de Formula (I) (100 mg, dos veces al dfa) con y sin multiples dosis de ketoconazol (400 mg, una vez al dfa) en sujetos masculinos y femeninos sanos). Esto fue un estudio de secuencia fija y de etiqueta abierta en 36 sujetos sanos (18 hombres y mujeres), que consiste en 3 penodos que incluyeron la administracion de una sola dosis de 100 mg de Hemitartrato de Formula (I), la administracion de multiples dosis de Hemitartrato de Formula (I), y la administracion concomitante de Hemitartrato de Formula (I) 100 mg (dos veces al dfa) con ketoconazol 400 mg (una vez al dfa). La administracion repetida de Hemitartrato de Formula (I) y ketoconazol, un inhibidor potente de citocromo p450 3A4 (“CYP 3A4”) y p-glucoprotema, dio como resultado un incremento de 4 veces en la exposicion de la base libre del Hemitartrato de Formula (I) tal como existe en plasma en el estado estacionario. De este modo, los pacientes que ya recibieron Hemitartrato de Formula (I) pueden necesitar una reduccion temporal de la dosis mientras se encuentren en terapia concomitante con inhibidores potentes de CYP 3A4 o p-glucoprotema.
Ejemplo 15 - Estudios de estabilidad para la formulacion de Hemitartrato de Formula (I)
Se prepararon mezclas mezclando Hemitartrato de Formula (I) y excipientes (lactosa monohidratada de grado encapsulante, Avicel PH 301 (celulosa microcristalina) y Methocel E15 Prem LV (hidroxipropilmetilcelulosa) en un vial de centelleo a alrededor de una escala de dos gramos. Se anadio agua al 15,6% a la mezcla y se mezclo para formar granulos humedos. Los granulos humedos se tamizaron usando un tamiz #10 (abertura de 2000 micrometros). Los granulos tamizados se secaron entonces en un horno a 50°C durante 2 horas. Los granulos secos se tamizaron usando un tamiz #18 (abertura de 1000 micrometros). El lubricante, behenato de glicerilo, se anadio a la mezcla y se mezclo para formar la mezcla final. Las mezclas preparadas se muestran en la tabla a continuacion:
Tabla
Lote n°
AP Lactosa monohidratada Avicel PH 101 50 mg / 100 mg formulacion Comentario
1
1
2,1 2,1 50 control
2
1 2,1 0 50 Sin Avicel
3
1 0 2,1 50 Sin Lactosa
4
1 2,1 1,1 50 Menos Avicel
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1 1,1 2,1 50 Menos Lactosa
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Lote n°
AP Lactosa monohidratada Avicel PH 101 50 mg / 100 mg formulacion Comentario
6
1 2,1 0,8 50 Relacion de Avicel y Lactosa comparable a 100 mg
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1 1,1 0,4 100 control
Methocel (HPMC) se uso en el intervalo de 2 a 4% Compritol ATO 88 se uso en el intervalo de 1 a 1,6%.
Las siete mezclas de formulacion, que tuvieron diferentes relaciones API:lactosa:Avicel, enumeradas anteriormente, se expusieron a una temperature elevada a 85°C durante 3 d^as (condicion de estudio de degradacion forzada), a fin de comprender la velocidad de degradacion y la estabilidad de cada formulacion. Esta condicion acelerada se escogio basandose en los resultados del estudio que el grado de los productos de degradacion del producto farmaceutico de 50 mg a 24 meses fue similar a los obtenidos a 85°C durante 3 dfas.
El estudio de degradacion forzada se llevo a cabo usando un metodo de HPLC de gradiente de fase inversa, que uso una columna C18 (Waters T3, 3 |im, 100 x 4,6 mm), fases moviles que consisten en agua y acetonitrilo con acido trifluoroacetico (TFA) al 0,1%, deteccion de UV a 280 nm, temperatura de la columna a 40°C, y caudal a 2 ml/min. El gradiente comenzo manteniendo a 5% de B (acetonitrilo y TFA al 0,1%) durante 0,5 minutos, y despues ascendiendo el componente organico a 4,83% de B por minuto hasta 15 minutos.
Los degradantes totales de cada mezcla de formulacion se sumaron y se representaron graficamente frente a la relacion de API:lactosa:Avicel, y los resultados se muestran en la Figura 15. Los resultados del estudio sugieren que mientras se mantiene la relacion de API y lactosa constante, la disminucion de la cantidad de Avicel mejora la estabilidad de la formulacion. Cuando se elimina Avicel, la formulacion tiene una relacion API:lactosa:Avicel de 1:2,1:0, y es la formulacion mas estable. Cuando se elimina la lactosa, la formulacion tiene una relacion API:lactosa:Avicel de 1:0:2,1, y esta formulacion no es la mas inestable en comparacion con otras relaciones. La informacion combinada sugiere que la lactosa estabiliza la formulacion, mientras que Avicel desestabiliza la formulacion. Sin embargo, cuando ambos excipientes estan presentes, interaccionan entre sf. La relacion se debe ajustar para obtener una formulacion estable.
Para ingredientes farmaceuticos activos como hemihidrato de Formula (I) que son solubles en agua, la celulosa microcristalina ayuda a formar granulos durante la granulacion humeda, ya que es insoluble en agua. Si no se uso celulosa microcristalina, se produce un cambio rntido desde la etapa de granulo a la forma de pasta. La forma de pasta fue diffcil de manipular, y las partfculas resultantes despues del secado no tienen la resistencia mecanica y distribucion de tamanos de partfculas adecuadas. La composicion farmaceutica que tiene 37% en peso de un Hemitartrato de Formula (I), 41,0% en peso de una carga soluble en agua; 16,7% en peso de una carga insoluble, 2% en peso a alrededor de 6% en peso de un aglutinante; y alrededor de 0,1% en peso a alrededor de 2% en peso de un lubricante, todos ellos sobre una base en solidos secos, tiene el mejor perfil de estabilidad con respecto a la cantidad de degradantes formados.

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un primer agente terapeutico representado por la siguiente formula estructural:
    imagen1
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher,
    5 en el que dicho tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz del primer agente terapeutico en combinacion con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico que es eficaz para tratar enfermedad de Gaucher.
  2. 2. El uso de un primer agente terapeutico representado por la siguiente formula estructural:
    imagen2
    10 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la fabrication de un medicamento para uso en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher,
    en el que dicho tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz del primer agente terapeutico en combinacion con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico que es eficaz para tratar enfermedad de Gaucher.
    15 3. El compuesto para uso de la reivindicacion 1 o el uso de la reivindicacion 2, en el que el segundo agente
    terapeutico se selecciona de glucocerebrosidasa, analogos de glucocerebrosidasa, inhibidores de glucosilceramida sintasa, y chaperonas molecular que se unen a glucocerebrosidasa y restauran su conformation correcta.
  3. 4. El compuesto para uso de la reivindicacion 1 o el uso de la reivindicacion 2, en el que el segundo agente terapeutico es imiglucerasa, isofagomina, miglustat, taliglucerasa alfa o velaglucerasa alfa.
    20 5. un primer agente terapeutico representado por la siguiente formula estructural:
    imagen3
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry,
    en el que dicho tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz del primer agente terapeutico en combinacion con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico que es eficaz para tratar enfermedad de 25 Fabry.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
  4. 6. El uso de un primer agente terapeutico representado por la siguiente formula estructural:
    imagen4
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la fabricacion de un medicamento para uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry,
    en el que dicho tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz del primer agente terapeutico en combination con una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico que es eficaz para tratar enfermedad de Fabry.
  5. 7. El compuesto para uso de la reivindicacion 5 o el uso de la reivindicacion 6, en el que el segundo agente terapeutico se selecciona de a galactosidasa A, analogos de a galactosidasa A, y chaperonas moleculares que se unen a a galactosidasa A y restauran su conformation correcta.
  6. 8. El compuesto para uso de la reivindicacion 5 o el uso de la reivindicacion 6, en el que el segundo agente terapeutico es migalastat, agalsidasa beta, o agalsidasa alfa.
  7. 9. El compuesto para uso o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer agente terapeutico se administra como la sal de hemitartrato.
  8. 10. El compuesto para uso o uso de la reivindicacion 9, en el que dicha sal es amorfa, o al menos 70% en peso de dicha sal es cristalino.
  9. 11. El compuesto para uso o uso de la reivindicacion 9, en la que al menos 70% en peso de dicha sal esta en una forma cristalina individual.
  10. 12. El compuesto para uso o uso de la reivindicacion 11, en el que la forma cristalina individual se caracteriza por uno, dos, tres, cuatro o cinco picos de difraccion de rayos x de polvo principales a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9° y 21,7°.
  11. 13. El compuesto para uso o uso de la reivindicacion 11, en el que la forma cristalina individual se caracteriza por picos de difraccion de rayos x de polvo a angulos 20 de 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 13,3°, 15,1°, 15,9°, 16,5°, 17,6°, 18,6°, 18,7°, 19,0°, 20,2°, 21,7° y 23,5°.
  12. 14. El compuesto para uso o uso de la reivindicacion 11, en el que la forma cristalina individual se caracteriza por el patron de difraccion de rayos x de polvo de la Figura 1.
  13. 15. El compuesto para uso o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el tratamiento con el primer agente terapeutico se comienza despues del tratamiento durante un periodo de al menos diez semanas con el segundo agente terapeutico.
  14. 16. El compuesto para uso o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el tratamiento con el primer agente terapeutico se comienza despues del tratamiento con el segundo agente terapeutico, y en el que el tratamiento con el primer agente terapeutico se inicia despues de que el recuento plaquetario del sujeto es igual o mayor que 100.000 mm3; la concentration de hemoglobina es igual o mayor que 11 g/dl (mujeres) o 12 g/dl (hombres); y/o el volumen del bazo del sujeto es menor o igual a 10 multiplos del normal, y los volumenes del higado son menores o iguales a 1,5 multiplos del normal.
  15. 17. El compuesto para uso o uso de la reivindicacion 15 o 16, en el que el tratamiento con el segundo agente terapeutico se termina tras el inicio del tratamiento con el primer agente terapeutico.
  16. 18. El compuesto para uso o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho tratamiento comprende administrar el primer agente terapeutico a una dosis dos veces al dia de 25 miligramos a 200 miligramos.
  17. 19. El compuesto para uso o uso de uno cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho tratamiento comprende administrar el primer agente terapeutico a una dosis dos veces al dia de 50 miligramos.
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