RS53503B2 - Amorfna i kristalna forma genz 112638 hemitartarata kao inhibitor glikozilkeramid sintaze - Google Patents

Amorfna i kristalna forma genz 112638 hemitartarata kao inhibitor glikozilkeramid sintaze

Info

Publication number
RS53503B2
RS53503B2 RS20140446A RSP20140446A RS53503B2 RS 53503 B2 RS53503 B2 RS 53503B2 RS 20140446 A RS20140446 A RS 20140446A RS P20140446 A RSP20140446 A RS P20140446A RS 53503 B2 RS53503 B2 RS 53503B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
hemitartrate
formula
water
pharmaceutical composition
salt
Prior art date
Application number
RS20140446A
Other languages
English (en)
Inventor
Hanlan Liu
Chris Willis
Renu Bhardwaj
Diane P Copeland
Abizer Harianawala
Jeffrey Skell
John Marshall
Jianmei Kochling
Gerard Palace
Judith Peterschmitt
Craig Siegel
Seng Cheng
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43431870&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS53503(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS53503B1 publication Critical patent/RS53503B1/sr
Publication of RS53503B2 publication Critical patent/RS53503B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/235—Saturated compounds containing more than one carboxyl group
    • C07C59/245—Saturated compounds containing more than one carboxyl group containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C59/255—Tartaric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D319/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D319/10—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes
    • C07D319/14—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D319/16—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D319/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D319/10—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes
    • C07D319/14—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D319/16—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C07D319/18—Ethylenedioxybenzenes, not substituted on the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Opis
POZADINA
Glikosfingolipidi (GSL) su klasa prirodnih jedinjenja koja imaju puno bioloških funkcija, uključujući sposobnost da potiču ćelijski rast, ćelijsku diferencijaciju, adheziju između ćelija ili između ćelija i belančevina iz matriksa, vezanje mikroorganizama i virusa na ćelije, i metastazu tumorskih ćelija. GSL su izvedeni iz glikozilkeramida (GlcCer), koji se proizvodi iz keramida i UDP-glikoze uz pomoć encima UDP-glikoza: N-acilsfingozin glikoziltransferaza (GlcCer sintaza). Struktura keramida je prikazana ispod:
Akumulacija GSL se povezuje sa brojnim bolestima, uključujući Tay-Sachs-ovu bolest, Gaucher-ovu bolest, i Fabry-evu bolest (difuzni angiokeratom) (vidi, na primer, U.S. Patent Br. 6,051,598). GSL se takođe povezuju sa određenim tumorima. Na primer, pronađeno je da se određeni GSL pojavljuju jedino u tumorima ili barem u veoma velikim koncentracijama u pomenutim tumorima; pokazuju značajnu stimulativno ili inhibitorno delovanje na rast tumora kada se dodaju tumorskim ćelijama u kulturi; i inhibiraju normalni telesni imunoodbrambeni sistem kada ih tumori ispuštaju u okolnu ekstraćelijsku tečnost. Sastav tumorskih GSL se menja kada tumori postaju pojačano maligni, a antitela protiv nekih GSL inhibiraju rast tumora.
Jedinjenja koja inhibiraju GlcCer sintazu mogu da smanje koncentracije GSL i za njih se predlaže da su korisna u tretmanu subjekta sa nekom od malopre pomenutih bolesti. Brojni snažni inhibitori GlcCer, ovde označeni kao "jedinjenja slična amino keramidu", su razotkriveni u U.S. Patentnim Br. 6,051,598, 5,952,370, 5,945,442, 5,916,911 i 6,030,995. Jedinjenje sa Formulom (I), koje je prikazano ispod, je inhibitor GlcCer sintaze koje se momentalno koristi u kliničkim pokušajima da se tretira Gaucher-ova bolest:
Autori McEachern et al., Molecular Genetics and Metabolism, 91 (2007), 259 su 16 maja 2007 objavili članak pod naslovom "A specific and potent inhibitor of glucerylceramide synthese for substrate inhibition therapy of Gaucher disease ". Dokument WO 2006/053043, objavljen 18 maja 2006, nosi naslov "Methods of treating diabetes mellitus".
Postoji potreba da se razviju solne forme pomenutog kandidata za lek koje su kristalne, a i u drugom smislu imaju fizičke karakteristike koje omogućavaju njihovu proizvodnju na velikoj (industrijskoj) skali. Takođe postoji potreba za farmaceutskim formulacijama u kojim će ovaj kandidat za lek biti stabilan tako da može da se efektivno dostavi pacijentu, kao i za poboljšanim postupcima tretmana uz pomoć ovog jedinjenja.
SAŽETAK PRONALASKA
Bilo je pronađeno da hemitartaratna so jedinjenja sa Formulom (I) (ovde označena kao "Formula (I) hemitartarata") može da se kristalizuje u dobro definisanim uslovima tako da se obezbede određene ne-higroskopne kristalne forme. Formula (I) hemitartarata ima nekoliko karakteristika koje joj daju prednost kada se uporedi sa drugim solima Formule (I). Kao šta je opisano u Primeru 1, mnoge soli Formule (I), uključujući citrate, malate, fumarate, metilsulfonate, i acetate, mogu da se dobiju u krutoj formi. Mada su hlorovodonične i 1:1 tartaratne soli Formule (1) dobivene u krutoj formi, nijedna nije bila kristalna i obe su bile previše higroskopne za formulaciju. Formula (I) hemitartarata je jednostavnija za formulisanje i za sintezu od slobodne baze i drugih soli. Formula (I) hemitartarata je takođe kristalna, ne-higroskopna, rastvorljiva u vodi i bolje cirkuliše od odgovarajuće slobodne baze (nadalje označena kao "Formula (I) slobodne baze") i drugih soli. Tako, ove poželjne karakteristike čine Formulu (I) hemitartarata prikladnom za proizvodnju na velikoj skali kao kandidata za lek.
Takođe je bilo pronađeno da se stabilne granule za kapsulirane formulacije Formule (I) hemitartarata mogu pripremiti uz pomoć definisanih omera filera koji nije rastvorljiv u vodi, filera koji je rastvorljiv u vodi i Formule (I) hemitartarata. Na bazi ovog otkrića, ovde su razotkrivene stabilne farmaceutske formulacije Formule (I) hemitartarata.
Takođe je bilo pronađeno da se jedinjenje sa Formulom (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli (uključujući Formulu (I) hemitartarata) metabolizuju u jetri, primarno uz pomoć citohrom P450 encima. Na bazi tog otkrića, ovde su razotkriveni postupci za tretman sa jedinjenjem sa Formulom (I) ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli (uključujući Formulu (I) hemitartarata) koji smanjuju potencijal za interakcije tipa lek/lek.
Takođe je bilo pronađeno da miševi sa Gaucher-ovom bolesti, koji su primili rekombinantnu glikocerebrozidazu, a nakon toga i Formulu (I) hemitartarata, imaju niže nivoe GL1 u visceralnim organima i smanjeni broj Gaucher-ovih ćelija u jetra u uporedbi sa tretmanom kada se koristi samo glikocerebrozidaza ili samo Formula (I) hemitartarata. Na bazi tog otkrića, ovde su takođe razotkrivene terapije sa jedinjenjem sa Formulom (I) ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli (uključujući Formulu (I) hemitartarata).
Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži hemitartratnu so jedinjenja Formule (I) i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač u kome je najmanje 70% (po težini) soli kristalno.
Jedna izvedba ove aplikacije je hemitartaratna so jedinjenja koje je predstavljeno sa Formulom (I) gde najmanje 70% (po težini) soli je kristalno. Kao šta je malopre primećeno, pomenuta hemitartaratna so jedinjenja koje je predstavljeno sa Formulom (I) ovde se naziva "Formula (I) hemitartarata". Pomenuto jedinjenje koje je predstavljeno sa Formulom (I) ovde se naziva "Formula (I) slobodne baze".
Druga izvedba obezbeđuje hemitartaratnu so jedinjenja koje je predstavljeno sa formulom I, gde najmanje 70% (po težini) soli je kristalno za upotrebu u postupku za inhibiranje glikozilkeramid sintaze ili snižavanje koncentracija glikosfingolipida u subjektu koji treba takav tretman.
Takođe, ovde je opisana i upotreba Formule (I) hemitartarata za proizvodnju leka za inhibiranje glikozilkeramid sintaze ili snižavanje koncentracija glikosfingolipida u subjektu koji treba takav tretman.
Takođe, ovde je opisana upotreba Formule (I) hemitartarata za inhibiranje glikozilkeramid sintaze ili snižavanje koncentracija glikosfingolipida u subjektu koji treba takav tretman.
Druga izvedba je hemitartaratna so jedinjenja koje je predstavljeno sa formulom I, gde najmanje 70% (po težini) soli je kristalno za upotrebu u postupku za tretman subjekta koji pati od Gaucher-ove bolesti. Takođe, ovde je opisan i postupak koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine prvog terapeutskog agensa u kombinaciji sa efektivnom količinom drugog terapeutskog agensa. Prvi terapeutski agens je predstavljen sa Formulom (I) ili sa nekom njegovom farmaceutski prihvatljivom soli; a drugi terapeutski agens je efektivan za tretman Gaucher-ove bolesti.
Druga izvedba je hemitartaratna so jedinjenja koje je predstavljeno sa formulom I, gde najmanje 70% (po težini) soli je kristalno za upotrebu u postupku za tretman subjekta koji pati od Fabry-eve bolesti. Takođe, ovde je opisan postupak koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine prvog terapeutskog agensa u kombinaciji sa efektivnom količinom drugog terapeutskog agensa. Prvi terapeutski agens je predstavljen sa Formulom (I) ili sa nekom njegovom farmaceutski prihvatljivom soli; a drugi terapeutski agens je efektivan za tretman Fabry-eve bolesti.
Druga izvedba obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata: hemitartaratnu so jedinjenja koje je predstavljeno sa Formulom (I) gde najmanje 70% (po težini) soli je kristalno, najmanje jedan filer koji je rastvorljiv u vodi; najmanje jedan filer koji nije rastvorljiv u vodi; najmanje jedan veznik; i najmanje jedan lubrikant.
Takođe, ovde je opisan postupak za tretman subjekta koji pati od Fabry-eve bolesti, a koji obuhvata korake:
a) administriranja subjektu efektivne količine jedinjenja sa Formulom (I), ili neke njegove farmaceutski prihvatljive soli;
b) testiranje subjekta sa ciljem da se odredi da li je slabi, srednji ili ekstenzivni/ultra brzi metabolizator P450;
c) a ukoliko je subjekt intermedijarni (srednji) ili ekstenzivni/ultra brzi metabolizator P450,
određivanje podešene efektivne količine pomenutog jedinjenja; i
d) administriranje subjektu podešene efektivne količine jedinjenja sa Formulom (I) ako je utvrđeno da je subjekt intermedijarni ili ekstenzivni/ultra brzi metabolizator P450 i administriranje pomenutom subjektu efektivnu količinu jedinjenja sa Formulom (I) ukoliko subjekt je slabi metabolizator P450.
Takođe, ovde je opisan postupak za tretman subjekta koji pati od Gaucher-ove bolesti, koji obuhvata korake:
a) administriranja subjektu efektivne količine jedinjenja sa Formulom (I), ili neke njegove farmaceutski prihvatljive soli;
b) testiranje subjekta sa ciljem da se odredi da li je slabi, srednji ili ekstenzivni/ultra brzi metabolizator P450;
c) a ukoliko je subjekt intermedijarni ili ekstenzivni/ultra brzi metabolizator P450, određivanje podešene efektivne količine pomenutog jedinjenja; i
d) administriranje subjektu podešene efektivne količine jedinjenja sa Formulom (I) ako je utvrđeno da je subjekt intermedijarni ili ekstenzivni/ultra brzi metabolizator P450 i administriranje pomenutom subjektu efektivnu količinu jedinjenja sa Formulom (I) ukoliko je subjekt slabi metabolizator P450.
Takođe, ovde je opisan postupak za tretman subjekta koji pati od Fabry-eve bolesti, koji obuhvata korake:
a) administriranja subjektu efektivne količine jedinjenja koje je predstavljeno sa sledećom strukturnom formulom:
ili neke njegove farmaceutski prihvatljive soli;
a) određivanje jedinjenja u subjektu preko najnižeg nivoa u plazmi; i
b) podešavanje količine jedinjenja koje je bilo administrirano subjektu tako da su njegovi najniži nivoi u plazmu najmanje 5 ng/ml. Alternativno, najniži nivoi u plazmi i Cmaksjedinjenja u subjektu se procenjuju u koraku b), a u koraku c) količina jedinjenja koje je bilo administrirano subjektu se podešava tako da njegovi najniži nivoi u plazmi u subjektu su najmanje 5 ng/ml, a Cmaksjedinjenja u subjektu je ispod 100 ng/ml.
Takođe, ovde je opisan postupak za tretman subjekta koji pati od Gaucher-ove bolesti, a koji obuhvata korake:
a) administriranja subjektu efektivne količine jedinjenja koje je predstavljeno sa sledećom strukturnom formulom:
ili neke njegove farmaceutski prihvatljive soli;
b) određivanje jedinjenja u subjektu preko najnižeg nivoa u plazmi;
i
c) podešavanje količine jedinjenja koje je bilo administrirano subjektu tako da su njegovi najniži nivoi u plazmu najmanje 5 ng/ml. Alternativno, najniži nivoi u plazmi i Cmaksjedinjenja u subjektu se procenjuju u koraku b), a u koraku c) količina jedinjenja koje je bilo administrirano subjektu se podešava tako da njegovi najniži nivoi u plazmi u subjektu su najmanje 5 ng/ml, a Cmaksjedinjenja u subjektu je ispod 100 ng/ml.
KRATKI OPIS SLIKA SL. 1 prikazuje eksperimentalni XRPD obrazac (sobna temperatura) za Formulu (I) hemitartarata.
SL. 2 je grafikon efikasnosti terapija sa encimom i terapija redukovanja supstrata kod opadajućih nivoa glikozilkeramida u jetra miševa sa Gaucher-ovom bolesti. Nivoi GL1 u jetra su izmereni u netretiranim miševima sa Gaucher-ovom bolesti koji su bili stari 3 meseca (A) i nakon 2 sedmice tretiranja sa rekombinantnom glikocerebrozidazom (B). Miševi tretirani sa rekombinantnom glikocerebrozidazom su analizirani 10 sedmica kasnije bez dodatnog tretmana (C) ili nakon terapije sa Formulom (I) hemitartarata (D) kod 150 mg/kg u hrani. Takođe su prikazani nivoi GL1 u jetra miševa koji su primali samo Formulu (I) hemitartarata tokom celog perioda istraživanja (E) i kod netretiranih kontrola iste starosti (F). Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna pogreška srednje vrednosti (SEM) (n=5). Statistički značaj je određen uz pomoć nesparenog t-testa.
SL. 3 je grafikon efikasnosti terapija sa encimom i terapija redukovanog supstrata kod opadajućih nivoa glikozilkeramida u slezini miševa sa Gaucher-ovom bolesti. Nivoi GL1 u slezini su izmereni kod netretiranih miševa sa Gaucher-ovom bolesti starih 3 meseca (A) i nakon 2 sedmice tretiranja sa rekombinantnom glikocerebrozidazom (B). Miševi tretirani sa rekombinantnom glikocerebrozidazom su analizirani 10 sedmica kasnije bez dodatnog tretmana (C) ili nakon terapije sa Formulom (I) hemitartarata (D). Takođe su prikazani i nivoi GL1 u slezini miševa koji su primali samo Formulu (I) hemitartarata tokom celog perioda istraživanja (E) i kod netretiranih kontrola iste starosti (F). Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna pogreška srednje vrednosti (SEM) (n=5). Statistički značaj je određen uz pomoć nesparenog t-testa.
SL. 4 je grafikon efikasnosti terapija sa encimom i terapija redukovanog supstrata kod opadajućih nivoa glikozilkeramida u slezini miševa sa Gaucher-ovom bolesti. Nivoi GL1 u plućima su izmereni kod netretiranih miševa sa Gaucher-ovom bolesti starih 3 meseca (A) i nakon 2 sedmice tretiranja sa rekombinantnom glikocerebrozidazom (B). Miševi tretirani sa rekombinantnom glikocerebrozidazom su analizirani 10 sedmica kasnije bez dodatnog tretmana (C) ili nakon terapije sa Formulom (I) hemitartarata (D). Takođe su prikazani i nivoi GL1 u plućima miševa koji su primali samo Formulu (I) hemitartarata tokom celog perioda istraživanja (E) i kod netretiranih kontrola iste starosti (F). Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna pogreška srednje vrednosti (SEM) (n=5). Statistički značaj je određen uz pomoć nesparenog t-testa.
SL. 5 je grafikon koji prikazuje kvantifikovanje količine CD68 bojanja jetra. Količina CD68-pozitivnog bojanja jetrinih preseka je kvantifikovano uz pomoć programa MetaMorph. Prikazani su nivoi u jetra netretiranih miševa sa Gaucher-ovom bolesti starih 3 meseca (A) ili nakon tretmana sa glikocerebrozidazom (B). Takođe su prikazani i miševi tretirani sa encimom, koji su nakon toga analizirani 10 sedmica kasnije bez dodatne terapeutske intervencije (C) ili nakon terapije sa Formulom (I) hemitartarata (D). Takođe je prikazana i količina bojanja jetra miševa sa Gaucherovom bolesti koji su primali samo Formulu (I) hemitartarata (E) i netretiranih kontrolnih miševa iste starosti (F). Podaci su sakupljeni na osnovu analize deset slika (400x) po preseku za svakog miša. Statistički značaj je određen uz pomoć nesparenog t-testa.
SL. 6 je grafikon koji prikazuje efikasnost Formule (I) hemitartarata kod mladih D409V/nul miševa. Formula (I) hemitartarata je administrirana miševima D409V/nul koji su bili stari 10 sedmica uz pomoć oralne gavaže kod doze od 75 ili 150 mg/kg tokom 10 sedmica. Nivoi glikozilkeramida u jetra, pluća, vaskulaturi i slezini su procenjeni na kraju istraživanja uz pomoć HP-TLC. Podaci su predstavljeni kao procenat GL-1 kod netretiranih kontrolnih miševa iste starosti. Iscrtane linije pokazuju nivoe glikozilkeramida kod normalnih miševa, divljeg tipa. *p< 0.05; *p < 0.01 u odnosu na netretiranu kontrolu (dvo-repi, nespareni t-test). Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti standardne pogreške srednje vrednosti (SEM) n= 5 kod 75 mg/kg; n = 6 kod 150 mg/kg).
SL. 7 prikazuje efekt terapije sa Formulom (I) hemitartarata na akumulaciju GL-3 u jetra, srce, bubreg, slezinu, mozak i krv miša sa Fabry-evom bolesti.
SL. 8 prikazuje grafikon efekta terapije sa Formulom (I) hemitartarata na pojavu i napredovanje periferne neuropatije kod miševa sa Fabry-evom bolesti.
SL. 9 prikazuje grafikone merenja nekih markera bubrežne funkcije kod miševa sa Fabry-evom bolesti koji su bili tretirani sa Formulom (I) hemitartarata.
SL. 10 prikazuje vremensku liniju ERT i SRT studija mišje populacije koja je podvrgnuta različitim terapijama sa lekovima: A) Fabrazim, jednom u dva meseca, bez Formule (I) hemitartarata; B) Fabrazim, jednom u dva meseca i Formula (I) hemitartarata u hrani; C) Fabrazim, koji se administrira na početku istraživanja i tokom četvrtog meseca istraživanja i Formula (I) hemitartarata u hrani; D) bez Fabrazima, Formula (I) hemitartarata u hrani; i E) bez terapije sa lekovima.
SL. 11 prikazuje grafikone nivoa GL-3 u krvi u ng/mL iz primeraka krvi šest populacija (n=?) miševa (A-E Fabry-Rag; i F divlji tip); mišje populacije su primile sledeće terapije: A) Fabrazim, jednom u dva meseca, bez Formule (I) hemitartarata; B) Fabrazim, jednom u dva meseca i Formula (I) hemitartarata u hrani; C) Fabrazim, koji se daje na početku istraživanja i tokom četvrtog meseca istraživanja i Formula (I) hemitartarata u hrani; D) bez Fabrazima, Formula (I) hemitartarata u hrani; E) bez terapije sa lekovima; i F) bez terapije sa lekovima.
SL. 12 prikazuje grafikone nivoa GL-3 u jetra i bubrega kod miševa Fabry-Rag; mišje populacije (n=?) su primile sledeće terapije: A) Fabrazim, jednom u dva meseca, bez Formule (I) hemitartarata; B) Fabrazim, jednom u dva meseca i Formula (I) hemitartarata u hrani; C) Fabrazim, koji se daje na početku istraživanja i tokom četvrtog meseca istraživanja i Formula (I) hemitartarata u hrani; D) bez Fabrazima, Formula (I) hemitartarata u hrani; E) bez terapije sa lekovima.
SL. 13 prikazuje grafikone nivoa GL-3 u mokraći miševa Fabry-Rag; mišje populacije (n=?) su primile sledeće terapije: A) Fabrazim, jednom u dva meseca, bez Formule (I) hemitartarata; B) Fabrazim, jednom u dva meseca i Formula (I) hemitartarata u hrani; C) Fabrazim, koji se daje na početku istraživanja i tokom četvrtog meseca istraživanja i Formula (I) hemitartarata u hrani; D) bez Fabrazima, Formula (I) hemitartarata u hrani; E) bez terapije sa lekovima.
SL. 14 je grafikon koji pokazuje odsustvo (u sekundama) osetljivosti na toplinu kod miševa Fabry-Rag koji su primili sledeće terapije: Fabrazim, jednom u dva meseca, bez Formule (I) hemitartarata; Fabrazim, jednom u dva meseca i Formula (I) hemitartarata u hrani; Fabrazim, koji se daje na početku istraživanja i tokom četvrtog meseca istraživanja i Formula (I) hemitartarata u hrani; bez Fabrazima, Formula (I) hemitartarata u hrani; bez terapije sa lekovima; divlji tip miša; i netretirani miševi od tri meseca starosti.
Slika 15 je grafikon koji pokazuje ukupnu površinu degradacije HPLC traga kod
1
različitih mešavina koji sadrže Formulu (I) hemitartarata, laktozu monohidrata u gradijentu za kapsule i Avicel PH 301 (mikrokristalna celuloza) nakon izlaganja toplino od 85° C tokom 3 dana. Površina degradacije HPLC traga je omer ukupne površine linija koje odgovaraju degradaciji u odnosu na ukupnu površinu linija koje odgovaraju Formuli (I) hemitartarata i produkata degradacije.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Ova aplikacija obezbeđuje jedinstvene kristalne forme Formule (I) hemitartarata i nove farmaceutske kompozicije Formule (I) hemitartarata koje obuhvataju kristalne forme Formule (I) hemitartarata, koje su ovde opisane. Ova aplikacija takođe obezbeđuje postupke za inhibiranje glikozilkeramid sintazu ili smanjivanje koncentracija glikosfingolipida kod subjekta u potrebi. Dodatno, ova aplikacija obezbeđuje postupke za pripremu specifičnih kristalnih forma Formule (I) hemitartarata. Ova aplikacija takođe obezbeđuje stabilne farmaceutske formulacije Formule (I) hemitartarata, kombinovane terapije sa jedinjenjem sa Formulom (I) ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli (uključujući Formulu (I) hemitartarata) i postupke za tretman sa jedinjenjem sa Formulom (I) ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli (uključujući Formulu (I) hemitartarata) koji minimizuju rizik interakcija tipa lek/lek.
Kristalne forme Formule (I) hemitartarata
Takođe, ovde su opisani i posebni težinski procenti kristala u Formuli (I) hemitartarata. Posebni težinski procenti uključuju 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% ili procenat između 70% i 100%.
U drugoj posebnoj izvedbi, barem neki posebni težinski procenti Formule (I) hemitartarata predstavljaju pojedinačnu kristalnu formu Formule (I) hemitartarata. Posebni težinski procenti uključuju 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% ili procenat između 70% i 100%.
Kao šta se ovde koristi, "kristal" se odnosi na krutu materiju koja ima kristalnu strukturu gde pojedinačni molekuli imaju visoko homogenu, zaključanu hemijsku konfiguraciju. Kristalna Formula (I) hemitartarata može da bude kristal neke pojedinačne kristalne forme Formule (I) hemitartarata, ili smeša kristala različitih pojedinačnih kristalnih formi. Određena pojedinačna kristalna forma označava da je Formula (I) hemitartarata pojedinačni kristal ili mnoštvo kristala gde svaki kristal ima istu kristalnu formu.
Kada pomenuti poseban težinski procenat Formule (I) hemitartarata ima pojedinačnu kristalnu formu, ostatak Formule (I) hemitartarata je kombinacija amorfne Formule (I) hemitartarata, i/ili jedne ili druge kristalne forme Formule (I) hemitartarata isključujući pomenutu pojedinačnu kristalnu formu. Kada je pomenuta kristalna Formula (I) hemitartarata definisana kao specifični procenat neke posebne kristalne forme Formule (I) hemitartarata, ostatak je načinjen od amorfne forme i/ili kristalnih formi koje su različite od pomenute jedne ili više posebnih specifičnih formi. Primeri pojedinačne kristalne forme uključuju Formu A Formule (I) hemitartarata, koja je karakterizovana sa jednom ili više karakteristika kao šta je malopre diskutovano.
Budući tartarna kiselina ima dve karboksilne kisele grupe, može da formira soli sa različitim molarnim omerima jedinjenja koje je predstavljeno sa Formulom (I) sa ciljem da nastanu tartarati (konjugovana baza tartarne kiseline). Na primer, so sa jedan na jedan molarnim omerom tartarata u odnosu na Formulu (I) je Formula (I) tartarat (1 tartarat: 1 Formula (I)); a so sa jedan na dva molarnim omerom tartarata u odnosu na Formulu (I) je Formula (I) hemitartarata (1 tartarat: 2 Formula (I)).
Pomenuta hemitartaratna so može da postoji u brojnim stereoizomernim formama. Stereoizomeri su jedinjenja koja se jedino razlikuju u svojim prostornim aranžmanima. Enantiomeri su parovi stereoizomera čije ogledalne slike ne mogu da se preklope, najčešće zbog toga šta sadrže jedan asimetrično postavljeni atom ugljenika koji deluje kao hiralni centar. Dijastereomeri su stereoizomeri koji nisu ogledalne slike, najčešće zbog toga šta sadrže dva ili diše asimetrično postavljenih atoma ugljenika.
Kada se stereohemija označava (kao, na primer, kod L-(+)-tartarne kiseline) ili izražava uz pomoć strukture (kao, na primer, kod Formule (I)), imenovani ili prikazani stereoizomer je najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99.9% (težinski) čist u odnosu na druge stereoizomere. Kada se imenuje pojedinačan enantiomer (kao, na primer, kod L-(+)-tartarne kiseline) ili izražava uz pomoć strukture (kao, na primer, kod Formule (I)), imenovani ili prikazani enantiomer je najmanje 80%, 90%, 99% ili 99.9% (po težini) optički čist. Težinski procenat optičke čistoće je omer težine enantiomera u odnosu na težinu pomenutog enantiomera plus težine njegovog optičkog izomera.
"Racemat" ili "racematna smeša" označava jedinjenje sa ekvimolarnim količinama dva enantiomera, pri čemu pomenute smeše nemaju optičku aktivnost; na primer, ne okreću ravninu polarizovanog svetla.
Tartarna kiselina ima tri stereoizomera: L-(+)-tartarna kiselina ili dekstrotartarna kiselina i njen enantiomer, levotartarna kiselina ili D-(-)-tartarna kiselina, i ahiralna forma, mezotartarna kiselina. Oznaka L ili D ne ukazuje na sposobnost kiseline da rotira ravninu polarizovanog svetla.
Bilo koji od stereoizomera tartarne kiseline može da se koristi za pripremanje Formule (I) hemitartarata. Na primer, pomenuti hemitartarat može da se formira iz samo jednog njegovog stereoizomera, ili njihove kombinacije. So hemitartarata je izabrana iz D-hemitartarata, L-hemitartarata, hemimezotartarne kiseline ili racemskog D,L-hemitartarata. U jednoj specifičnoj izvedbi, so hemitartarata je L-hemitartarat. "L-hemitartarat" označava so hemitartarata koja je nastala iz L-tartarne kiseline. Racemski D,L-hemitartarat označava da su D-tartarat i L-tartarat korišćeni za pripremanje Formule (I) hemitartarata. Količina D-tartarata u racemskom D,L-hemitartaratu može da bude veća, jednaka ili manja od količine prisutnog L-tartarata.
"Levorotirajući" označava da se polarizovano svetlo rotira prema levo kada prolazi kroz neko asimetrično jedinjenje. Prefiks za označavanje leve rotacije je "L".
"Dekstrorotirajući" označava da se polarizovano svetlo rotira prema desno kada prolazi kroz neko asimetrično jedinjenje. Prefiks za označavanje desne rotacije je "D".
Priprema Formule (I) hemitartarata
Formula (I) hemitartarata može da se pripremi uz pomoć mešanja jedinjenja sa Formulom (I) sa L-tartarnom kiselinom u nekom prikladnom rastvaraču. Precipitacija Formule (I)
1
hemitartarata može da se omogući uz pomoć dodavanja kristalnog semena. Rastvarači koji mogu da se koriste su metanol, voda, etanol, aceton, etil acetat ili njihove kombinacije.
Posebne forme krute materije Formule (I) hemitartarata mogu da se pripreme, na primer, uz pomoć sporog isparavanja, sporog hlađenja i precipitacije antirastvarača. Rastvarači koji mogu da se koriste u ovim postupcima uključuju vodu, heptan, heksan, toluen, dihlorometan, etanol, izopropil alkohol, acetonitril, etil acetat, metanol, aceton, metil tercijarni-butil etar (ovde označen kao "TBME"), p-dioksan i tetrahidrofuran (ovde označen kao "THF").
Krute forme Formule (I) hemitartarata mogu da se pripreme uz pomoć isparavanja rastvarača iz rastvora Formule (I) hemitartarata u nekom rastvaraču ili smeši rastvarača. Prikladne smeše rastvarača uključuju metanol, etanol, aceton, vodu, etil acetat i dihlorometan. Preferirane smeše rastvarača uključuju etanol, metanol, vodu i aceton.
Krute forme Formule (I) hemitartarata mogu da se pripreme uz pomoć sporog hlađenja ugrejanog rastvora Formule (I) hemitartarata u nekom rastvaraču. Prikladni rastvarači uključuju etanol, metanol, vodu, aceton i etil acetat.
Krute forme Formule (I) hemitartarata mogu da se pripreme uz pomoć sporog hlađenja ugrejanog rastvora Formule (I) hemitartarata u nekom rastvaraču, tako da se rastvor postavi u hladnu banju. Prikladni rastvarači uključuju etanol, metanol, aceton, vodu, etil acetat ili njihove smeše.
Krute forme Formule (I) hemitartarata mogu da se pripreme uz pomoć dodavanja rastvora Formule (I) hemitartarata u nekom rastvaraču, kao šta je već opisano, u neki anti-rastvarač na određenoj temperaturi. Preciznije, pomenuti anti-rastvarač je etil acetat, aceton, acetonitril, toluen, THF, TBME, p-dioksan, izopropanol ili heptan. Posebne smeše rastvarač/antirastvarač uključuju metanol/etil acetat, metanol/aceton, metanol/heksan, metanol/heptan, metanol/acetonitril, metanol/toluen, metanol/THF, metanol/TBME, metanol/p-dioksan, etanol/etil acetat, etanol/heksan, etanol/heptan, etanol, aceton, etanol/acetonitril, etanol/toluen, etanol/TBME, etanol/THF, voda/THF, voda/izopropanol, voda/acetonitril, voda/aceton, dihlorometan/heptan, dihlorometan/aceton, dihlorometan/etil acetat, dihlorometan/acetonitril, dihlorometan/toluen, dihlorometan/THF, dihlorometan/TBME, dihlorometan/p-dioksan i dihlorometan/izopropanol.
Preferirane smeše rastvarač/antirastvarač uključuju metanol/etil acetat, metanol/aceton, metanol/TBME i voda/aceton.
Kao šta se ovde koristi, "anti-rastvarač" se odnosi na rastvarač u kojem Formula (I) hemitartarata ima nisku rastvorljivost i omogućava da pomenuti hemitartarat precipitira u rastvoru u formi finog praha ili u formi kristala.
Dodatni postupci koji mogu da stvore krute forme Formule (I) hemitartarata uključuju precipitiranje krute forme etil acetat/acetona i ponekad sušenje nastale krute materije na sobnoj temperaturi. U drugom postupku, pomenuta kruta materija može tada da se ponovo kristalizuje iz acetona sa ili bez dodavanja semena kristala. Alternativno, Formula (I) hemitartarata može da se precipitira iz rastvarača etil acetat/aceton i ponovo kristalizuje iz etil acetata. Alternativno, Formula (I) hemitartarata tada može da se ponovo kristalizuje iz izopropanola. Alternativno, Formula (I) hemitartarata može da se pripremi samo uz pomoć acetona bez dodatnog ponovnog kristalizovanja. Alternativno, Formula (I) hemitartarata može da se precipitira iz acetona nakon kratkog refluksa, bez dodatnog ponovnog kristalizovanja.
Alternativno, Formula (I) hemitartarata može tada da se ponovo kristalizuje iz metanol/acetona sa ili bez dodavanja semena za kristalizovanje. Alternativno, Formula (I) hemitartarata tada može da se ponovo kristalizuje iz voda/acetona sa ili bez dodavanja semena za kristalizovanje.
Karakterizovanje kristalnih forma Formule (I) hemitartarata
U jednoj posebnoj izvedbi, kristalna forma Formule (I) hemitartarata, kristalna Forma A, je karakterizovana sa jednim, dva, tri, četiri ili pet glavnih XRPD linija (šiljaka) kod 2θ uglova od 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9° i 21.7°. U jednoj još specifičnijoj izvedbi, pomenuta kristalna forma je karakterizovana sa XRPD linijama kod 2θ uglova od 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 13.3°, 15.1 °, 15.9°, 16.5°, 17.6°, 18.6°, 18.7°, 19.0°, 20.2°, 21.7° i 23.5°. Treba da se razume da navedeni 2θ uglovi označavaju specifičnu vrednost ± 0.2°.
1
Kao šta se ovde koristi, "glavna XRPD linija" se odnosi na XRPD liniju sa relativnim intenzitetom koji je veći od 25%. Relativni intenzitet se izračunava kao omer intenziteta linije u odnosu na intenzitet najizraženije linije.
Postupci za tretman kada se koristi Formula (I) hemitartarata
Kao šta je ovde predviđeno, subjekt je sisar, preferirano ljudski pacijent, ali takođe može da bude neka životinja koja treba veterinarski tretman, poput mezimca (na primer, psi, mačke i slično), domaće životinje (na primer, krave, ovce, svinje, konji i slično) ili laboratorijske životinje (na primer, pacovi, miševi, zamorci i slično). Pojmovi subjekt i pacijent ovde se koriste kao sinonimi.
Jedna izvedba ove aplikacije je hemitartaratna so jedinjenja koje je predstavljeno sa formulom I, gde najmanje 70% (po težini) same soli je kristal, za upotrebu u postupku usporavanja, na primer inhibiranja ili redukovanja delovanja glikozilkeramid sintaze ili snižavanja koncentracija glikosfingolipida u nekom subjektu u potrebi.
Subjekt u potrebi je neki subjekt sa stanjem ili bolesti koja može da se tretira inhibiranjem glikozilkeramid sintaze ili snižavanjem koncentracija glikosfingolipida u ćelijama, a posebno u lizosomu ili membrani pomenute ćelije. Inhibitori glikozilkeramid sintaze su se pokazali korisnima kod tretmana bolesti koje su povezane sa skladištenjem lizosomima poput Tay-Sachs-ove, Gaucher-ove ili Fabry-eve bolesti (vidi, na primer, U.S. Patentne Br. 6,569,889; 6,255,336; 5,916,911; 5,302,609; 6,660,749; 6,610,703; 5,472,969; 5,525,616, koji su ovde uključeni referencom).
Primeri pomenutih stanja ili bolesti uključuju bolest policističnih bubrega i membranski glomerulonefritis (vidi U.S. Provizijske Patentne Aplikacije 61/130,401 i 61/102,541), glomerulonefritis i glomerulosklerozu (vidi U.S. Provizijsku Patentnu Aplikaciju 61/137,214) lupus (vidi dokument PGT/US2009/001773); dijabetes, uključujući dijabetes tipa 2 (vidi dokument WO 2006/053043); tretman poremećaja koji pokazuju ćelijski rast i deobu, uključujući rak, bolesti vaskularnog kolagena, aterosklerozu, i bubrežnu hipertrofiju kod pacijenata sa dijabetesom (vidi U.S. Patentne Br. 6,916,802 i 5,849,326); inhibiranje rasta ćelija epitela arterija (vidi U.S. Patentne Br. 6,916,802 i 5,849,326); tretman pacijenata koji pate od infekcija (vidi Svensson, M. et al., "Epithelial Glucosphingolipid Expression as a
1
Determinant of Bacterial Adherence and Cytokine Production", Infect. and Immun., 62:4404-4410 (1994)); sprečavanje domaćina, na primer pacijenta, da stvara antitela protiv tumora (vidi Inokuchi, J. et al., "Antitumor Activity in Mice of an Inhibitor of Glycosphingolipid Biosynthesis", Cancer Lett., 38:23-30(1987)); i tretman tumora (vidi Hakomori, S. "New Directions in Cancer Therapy Based on Aberrant Expression of Glycosphingolipids: Antiadhesion and Ortho-Signaling Therapy", Cancer Cells 3:461-470 (1991), Inokuchi, J. et al., "Inhibition of Experimental Metastasis of Murine Lewis Long Carcinoma by an Inhibitor of Glucosylceramide Synthase and its Possible Mechanism of Action", Cancer Res., 50:6731-6737 (1990) i Ziche, M. et al., "Angiogenesis Can Be Stimulated or Repressed In Vivo by a Change in GM3:GD3 Ganglioside Ratio", Lab. Invest., 67:711-715 (1992)).
Takođe, ovde razotkrivena formula (I) hemitartarata može da se koristi za pripremu preparata koji su slični vakcini protiv raka (vidi, na primer, U.S. Patentne Br. 6,569,889; 6,255,336; 5,916,911; 5,302,609; 6,660,749; 6,610,703; 5,472,969; 5,525,616).
Jedinjenje sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, može da se koristi u ovde razotkrivenim postupcima kao mono-terapija, na primer, kao jedini farmaceutski aktivni sastojak koji se administrira sa ciljem da se tretira navedeno stanje.
Alternativno, jedinjenje sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, može da se koristi u ovde razotkrivenim postupcima kao kombinovana terapija sa drugim terapeutski aktivnim lekovima za koje se u stanju tehnike zna da se koriste za tretman određenih bolesti ili stanja. Termini "ko-terapija" ili "kombinacija" ili "kombinovana terapija" ili "ko-administriranje" se ovde koriste kao sinonimi i označavaju da se jedinjenje sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, administrira pre, nakon ili zajedno sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa. Takođe ovde razotkrivena kombinovana terapija može da se koristi sa ciljem da se tretiraju lizosomalne bolesti poput Gaucher-ove bolesti i Fabry-eve bolesti. Alternativno, jedinjenje sa Formulom (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so (uključujući so hemitartarata) se ko-administrira simultano (na primer, konkurentski) kao posebna formulacija ili kao spojena formulacija. Alternativno, agensi mogu da se administriraju jedan iza drugoga, kao odvojene kompozicije, u okvirima određenog vremenskog perioda, kao šta je već određeno od strane iskusnog kliničara (na primer, vreme koje je dovoljno da omogući preklapanje farmaceutskih efekata pomenutih terapija). Takođe, ovde razotkriveno jedinjenje
1
sa Formulom (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so (uključujući so hemitartarata) i jedan ili više terapeutskih agenasa mogu da se administriraju kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze, u redosledu i rasporedu koji je prikladan da se omogući željeni terapeutski efekat.
Terapeutski agensi koji su efektivni u tretmanu Gaucher-ove bolesti uključuju glikocerebrozidazu, analoge glikocerebrozidaze, inhibitore glikozilkeramid sintaze i molekularne šaperone koji se vežu na glikocerebrozidazu i obnavljaju njenu ispravnu konformaciju. Glikocerebrozidaza ili njeni analozi mogu da budu poreklom ljudski ili od ostalih sisara. Alternativno, glikocerebrozidaza i njeni analozi mogu da se dobiju rekombinantno. Analozi glikocerebrozidaze uključuju skraćene forme jednog encima i/ili više encima sa amino-kiselinskim supstitucijama u odnosu na nativnu amino-sekvencu nativnog encima, pod uslovom da je biološka aktivnost očuvana. Primeri analoga glikocerebrozidaze uključuju Imiglucerazu (koja se prodaje pod komercijalnim imenom Cerezyme<®>preko Gencim Corporation), Taliglucerazu Alfa (koja se nalazi pod komercijalnim imenom Uplyso<®>i koja je bila razvijena u Protalix Biotherapeutics, Inc.) i Velaglucerazu Alfa (razvijena kod Shire PLC), koje su rekombinantni analozi humane β-glikocerebrozidaze proizvedeni na osnovu DNK. Primeri molekularnih šaperona uključuju izofagomin (razvijen pod komercijalnim imenom Plicera™ u Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ). Izofagomin je takođe poznat kao afegostat tartarat i sadrži tartaratu so izofagomina kao njegov aktivni sastojak. Primeri inhibitora glikocerebrozidaze uključuju miglustat (razvijen pod komercijalnim imenom Zavesca™ u Actelion Pharmaceuticals Ltd. Allschwil, Švajcarska).
Terapeutski agensi koji su efektivni za tretman Fabry-eve bolesti uključuju α-galaktozidazu A, analoge α-galaktozidaze A i molekularne šaperone koji se vežu na α-galaktozidazu A i obnavljaju njenu tačnu konformaciju. α-galaktozidaza A ili njeni analozi mogu da budu humanog porekla ili iz drugih sisara. Alternativno, α-galaktozidaza A i njeni analozi mogu da se dobiju rekombinantno. Analozi α-galaktozidaze A uključuju skraćene forme jednog encima i/ili više encima sa amino-kiselinskim supstitucijama u odnosu na nativnu amino sekvencu nativnog encima, pod uslovom da se biološka funkcija ne menja. Primeri analoga αgalaktozidaze A uključuju Agalzidazu beta (rekombinantna humana α-galaktozidaza koja se prodaje pod komercijalnim imenom Fabrazyme<®>kao smrznuto-osušeni lek od strane Gencim Corporation) i Agalzidazu alfa (rekombinantna belančevina koja se prodaje pod
1
komercijalnim imenom Replagal<®>preko Shire PLC). Primeri molekularnih šaperona uključuju migalastat (razvijen pod komercijalnim imenom Amigal™ od Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ kao lek koji sadrži migalastat hidrohlorid kao njegov aktivan sastojak).
Takođe, ovde razotkrivena kombinovana terapija za tretman Gaucher-ove ili Fabry-eve bolesti se provodi u dve faze. U prvoj fazi se koristi lek koji je efektivan u tretmanu Gaucherove bolesti ili Fabry-eve bolesti (tipično, glikocerebrozidaza ili neki njen analog za Gaucherovu bolest i galaktozidaza A ili neki njen analog za Fabry-evu bolest) sa ciljem da se stabilizuje subjekt. Na primer, kod Gaucher-ove bolesti (ili Fabry-eve bolesti), jedan od pomenutih lekova se koristi sa ciljem da se smanji opterećenje zbog skladištenja GL-1 u visceralnim organima kao šta su jetra, slezina, pluća i/ili bubreg. Jednom kada se ovo postigne, jedinjenje sa Formulom (I) ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so (uključujući so hemitartarata) se koristi u drugoj fazi kao prikladna terapija održavanja. Prva faza tipično traje jednu, dve, tri ili četiri sedmice ili najviše jedan, dva, tri, četiri, šest, devet ili dvanaest meseci, ili dok vrednost krvnih pločica subjekta ne dosegne vrednost koja je jednaka ili veća od 100,000 mm<3>; koncentracija hemoglobina je jednaka ili veća od 11 g/dl (žene) ili 12 g/dl (muškarci); i/ili kada je volumen slezine subjekta manji ili jednak 10 višekratnika od normale i kada je volumen jetra manji ili jednak 1.5 višekratnika od normale. Administracija prve faze tipično završava kada se započne sa terapijom sa jedinjenjem sa Formulom (I).
Kao šta se ovde koristi, "efektivna količina" se odnosi na količinu koja je dovoljna da omogući ublažavanje postojećih simptoma kod subjekta koji se tretira uz minimalne neprihvatljive nus-pojave kod samog subjekta. Tačna formulacija, ruta administracije i doza se bira od strane lekara uzimajući u obzir pacijentovo stanje. Dozna količina i interval mogu da se podešavaju pojedinačno sa ciljem da se obezbede nivoi u plazmi aktivnog jedinjenja koji su dovoljni da se održavaju željeni terapeutski efekti. Osim od stanja pacijenta i modusu administracije, administrirana doza će zavisiti o jačini simptoma kod pacijenta i o pacijentovoj dobi i težini. Efektivna količina će tipično da rezultuje u nivoima jedinjenja u plazmi od barem iznad 5 ng/ml. Ako su plazmini nivoi ispod 5 ng/ml nakon administracije efektivne količine jedinjenja, doza koja se administrira subjektu može da se promeni u "podešenu efektivnu količinu" tako da nivoi jedinjenja u plazmi iznose barem 5 ng/ml.
1
Alternativno, ako su nivoi jedinjenja u plazmi ispod 5 ng/ml i/ili Cmaksje iznad 100 ng/ml nakon administracije efektivne količine jedinjenja, doza koja se administrira subjektu može da se promeni u "podešenu efektivnu količinu" tako da su nivoi jedinjenja u plazmi barem najmanje 5 ng/ml, a Cmaksje ispod 100 ng/ml. Efektivne količine mogu da se kreću od 0.1 do 500 mg/po danu. Alternativno, efektivna količina se kreće od 50-300 mg/danu. U drugoj alternativi, efektivna količina se kreće od 100-300 mg/danu. Jedinjenje iz ove aplikacije može da se administrira kontinuirano ili kroz specifične vremenske intervale. Na primer, jedinjenje iz ove aplikacije može da se administrira 1, 2, 3 ili 4 puta na dan, poput na primer kroz dnevnu formulaciju ili formulaciju za dva puta na dan. Komercijalno dostupni testovi mogu da se koriste za određivanje optimalnih doznih raspona i/ili rasporeda administracije.
U jednoj izvedbi, efektivna količina za jedinjenje sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, je (bilo kao monoterapija ili kao ko-terapija) dnevna doza od 25 miligrama do 300 miligrama (alternativno, 25 miligrama do 150 miligrama; alternativno od 50 miligrama do 300 miligrama; alternativno od 100 miligrama do 300 miligrama), poput 25, 50, 100, 200 ili 300 miligrama dnevno. U specifičnoj izvedbi, efektivna količina jedinjenja sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, je (bilo kao monoterapija ili kao ko-terapija) dvokratna dnevna doza od 50 miligrama (za totalno 100 miligrama dnevno), 100 miligrama (ukupno 200 miligrama dnevno) ili 150 miligrama (ukupno 300 miligrama dnevno). U jednoj alternativnoj izvedbi, efektivna količina za jedinjenje sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, se (bilo kao monoterapija ili kao ko-terapija) administrira jednom dnevno u dozi od 100 miligrama/dan, 200 miligrama/dan ili 300 miligrama/dan.
U drugoj izvedbi, efektivna količina se određuje uz pomoć pretpostavke da subjekt "sporo metabolizuje P450", a tada se određuju nivoi u plazmi i/ili Cmaks. Količina koja je administrirana subjektu se tada menja do podešene efektivne količine, kao šta je opisano ispod, ako su ukupni nivoi u plazmi ispod 5 ng/ml; ili su nivoi jedinjenja u plazmi ispod 5 ng/ml i/ili Cmaksje iznad 100 ng/ml; ili ako je za subjekta određeno da P450 metabolizuje intermedijarno ili ekstenzivno/ultra brzo. Efektivna količina za sporo metabolizovanje P450 je (bilo kao monoterapija ili kao ko-terapija) uobičajeno između 100-200 miligrama dnevno, na primer 100 ili 200 miligrama, kao jednokratna dnevna doza ili kao dvokratna dnevna doza.
Tipično, farmaceutske kompozicije iz ove aplikacije mogu da se administriraju pre ili nakon
2
obroka, ili uz obrok. Kao šta se ovde koristi, "pre" ili "nakon" obroka označava tipično dva časa, preferirano jedan čas, bolje trideset minuta, a najbolje deset minuta pre početka ili nakon završetka obroka.
Sada je pronađeno da se jedinjenje sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, metabolizuje u jetra, primarno uz pomoć citohrom P450 encima. Citohrom P450 ("CYP") su primarno jetrini encimi koji metabolizuju ksenobiotike. Postoji jedanaest citohrom P450 encima koji metabolizuju ksenobiotike u tipičnoj humanoj jetri (na primer, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4/5). Sada je takođe pronađeno da su CYP2D6 i CYP3A4 primarne izoforme citohrom P450 koje su odgovorne za de-toksifikaciju jedinjenja sa Formulom (I) i njegovih farmaceutski aktivnih soli, poput Formule (I) hemitartarata. Nivo delovanja P450 encima se individualno razlikuje. Na primer, individue mogu da se klasifikuju kao oni koji metabolizuju P450 slabo, intermedijarno i ekstenzivno/ultra brzo. Zbog toga šta niži nivoi delovanja P450 u nekoj individui mogu da dovedu do interakcije tipa lek/lek ("DDI"), druga izvedba ovoga pronalaska je da se odredi da li subjekt metabolizuje P450 slabo, intermedijarno ili ekstenzivno/ultra brzo. Ako subjekt metabolizuje intermedijarno ili ekstenzivno/ultra brzo, tada doza koja se administrira pomenutom subjektu treba da se poveća do "podešene efektivne doze", na primer količina koja rezultuje u nivoe jedinjenja u plazmi od najmanje 5 ng/ml; ili količina koja rezultuje u nivoe jedinjenja u plazmi do najmanje 5 ng/ml i Cmaksjedinjenja ispod 100 ng/ml. Doza može da se poveća postupno, a subjekt treba da se testira jednom, dva puta, tri puta, četiri puta ili onoliko puta koliko treba kako bi se postigla podešena efektivna doza.
Za CYP 2D6 gen postoje četiri predviđena fenotipa:
Onaj koji "slabo metabolizuje P450" sadrži dva mutirana alela, šta dovodi do potpunog gubitka encimske aktivnosti.
Onaj koji "intermedijarno metabolizuje P450" sadrži samo jedan alel sa smanjenom aktivnosti i jedan nul-alel.
Onaj koji "ekstenzivno metabolizuje P450" sadrži najmanje jedan i ne više od dva normalna funkcionalna alela.
Onaj koji "ultra brzo metabolizuje P450" sadrži više kopija (3-13) funkcionalnih alela i pokazuje povećanu encimsku aktivnost.
Subjekt je tipično označen kao onaj koji metabolizuje P450 slabo, intermedijarno ili ekstenzivno/ultra brzo uz pomoć genotipiziranja ili uz pomoć praćenja nivoa leka koji se metabolizuje uz pomoć P450 encima poput CYP2D6 ili CYP3A4 u plazmi. Uobičajeno, nivoi i/ili Cmaksjedinjenja sa Formulom (I), kao šta je ovde razotkriveno, u plazmi se prate kod subjekta tokom jedne, dve, tri ili četiri sedmica, ili tokom jednog, dva, tri, šest, devet ili dvanaest meseci nakon početka tretmana sa pomenutim jedinjenjem. Podešavanja doze se provode, ako je potrebno, sa ciljem da se nivoi održavaju u zadanim granicama, na primer, nivoi u plazmi ili iznad 5 ng/ml.
Subjekti mogu da postanu slabi metabolizatori P450 kao rezultat tretmana sa određenim lekovima koji su inhibitori P450 encima. Primeri takvih lekova uključuju paroksetin, fluoksetin, hinidin ili ketokonazol. Alternativno, subjekt je slabi metabolizator P450 kao rezultat niske ekspresije P450 encima. U takvim slučajevima, pomenuta niska ekspresija može da se proceni uz pomoć određivanja ekspresije P450 encima u subjektu, na primer, preko genotipiziranja subjekta na P450 encim. Na primer, ekspresija CYP2D6 se uobičajeno procenjuje uz pomoć PCR (McElroy et. al. "CYP2D6 Genotyping as an Alternative to Phenotyping for Determination of Metabolic Status in a Clinical Trial Setting", AAPS Pharmsi (2000) 2(4): članak 33 (http://www.pharmsci.org/) ili uz pomoć mikročipa na bazi farmakogenomskog testiranja (Background Information, Roche Diagnostics "The CYP450 Gene Family and Drug Metabolism", Hoffmann La Roche Ltd.). Kao takav, subjekt može prikladno da se genotipizira za ekspresiju P450 (na primer, CYP2D6) pre početka tretmana i administriranja podešene efektivne količine, ako je potrebno. Kada se genotipiziranje radi pre početka tretmana, još uvek je preporučljivo da se prate nivoi i Cmaksjedinjenja u plazmi sa ciljem da se doza podesi, ako je potrebno.
Efektivne količine migalastata, agalzidaze β, imigluceraze, izofagomina i miglustata su kao šta je navedeno na etiketi leka ili onako kako je određeno u kliničkim ispitivanjima svakog leka.
Kao šta je ovde razotkriveno, slobodna baza jedinjenja sa Formulom (I) može da reaguje sa farmaceutski prihvatljivim kiselinama sa ciljem da se formira neka farmaceutski prihvatljiva so. Primeri farmaceutski prihvatljivih kiselina uključuju anorganske kiseline poput hlorovodonične kiseline, bromovodonične kiseline, jodovodonične kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline i slično, i organske kiseline poput p-toluensulfonske kiseline, metansulfonske kiseline, oksalne kiseline, p-bromofenil-sulfonske kiseline, ugljene kiseline, sukcinske kiseline, limunske kiseline, benzoične kiseline, sirćetne kiseline i slično. Primeri takvih soli uključuju sulfat, pirosulfat, bisulfat, sulfit, bisulfit, fosfat, monohidrogenfosfat, dihidrogenfosfat, metafosfat, pirofosfat, hlorid, bromid, jodid, acetat, propionat, dekanoat, kaprilat, akrilat, format, izobutirat, kaproat, heptanoat, propiolat, oksalat, malonat, sukcinat, suberat, sebakat, fumarat, maleat, butin-1,4-dioat, heksin-1,6-dioat, benzoat, hlorobenzoat, metilbenzoat, dinitrobenzoat, hidroksibenzoat, metoksibenzoat, ftalat, sulfonat, ksilensulfonat, fenilacetat, fenilpropionat, fenilbutirat, citrat, laktat, gama-hidroksibutirat, glikolat, tartarat, metansulfonat, propansulfonat, naftalen-1-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, mandelat i slično.
Farmaceutske kompozicije koje uključuju Formulu (I) hemitartarata
Prikladne formulacije i modusi za administraciju jedinjenja sa Formulom (I) ili neke njegove farmaceutski prihvatljive soli (uključujući so hemitartarata) uključuju one koje su opisane u U.S. Patentnom Br. 7,253,185. Preferirana formulacija za Formulu (I) hemitartarata je opisana u sledećim paragrafima. Jedna izvedba ovoga pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži Formulu (I) hemitartarata, kako je definisano u patentnim zahtevima od 1 do 10, najmanje jedan filer koji se rastvara u vodi, najmanje jedan filer koji se ne rastvara u vodi, najmanje jedan veznik i najmanje jedan lubrikant. Prikladni fileri koji se rastvaraju u vodi mogu da uključe, na primer, bezvodnu laktozu, laktozu monohidrat, manitol, natrijum hlorid, šećer u prahu, sorbitol, saharozu, inozitol i skrob u želatini. Prikladni fileri koji nisu rastvorljivi u vodi mogu da uključe, na primer, mikrokristalnu celulozu, kalcijum fosfat i skrob. Prikladni veznici mogu da uključe, na primer, škrob u želatini, natrijum karboksimetil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metil celulozu, polivinil pirolidon, kopolividon, želatin, prirodne gume, skrobnu pastu, saharozu, kukuruzni sirup, polietilen glikole i natrijum alginat. Prikladni lubrikanti mogu da uključe, na primer, hidrogenovano biljno ulje, kalcijum stearat i gliceril behenat. U jednoj izvedbi ove farmaceutske kompozicije, filer koji se rastvara u vodi je izabran iz grupe koja obuhvata bezvodnu laktozu, laktozu monohidrat, manitol, natrijum hlorid, šećer u prahu, sorbitol, saharozu, inozitol i skrob u želatini; filer koji se ne rastvara u vodi je izabran iz grupe koja se sastoji od mikrokristalne celuloze, kalcijum fosfata i skroba; veznik je izabran iz grupe koja obuhvata skrob u želatini, natrijum karboksimetil celulozu, hidroksipropil celulozu,
2
hidroksipropil metil celulozu, polivinil pirolidon, kopolividon, želatin, prirodne gume, skrobnu pastu, saharozu, kukuruzni skrob, polietilen glikole i natrijum alginat; a lubrikant je izabran iz grupe koja obuhvata hidrogenovano biljno ulje, kalcijum stearat i gliceril behenat.
Pomenuta farmaceutska formula sadrži između 8 wt% do 32 wt%, između 8 wt% do 24 wt% , između 12 wt% do 20 wt% ili između 14 wt% do 18 wt% filera koji ne može da se rastvara na bazi suvih krutih materija.
Pomenuta farmaceutska formula sadrži između 26 wt% do 50 wt%, između 30 wt% do 46 wt%, između 34 wt% do 46 wt% ili između 38 wt% do 44 wt% filera koji se rastvara u vodi na bazi suvih krutih materija.
Pomenuta farmaceutska kompozicija sadrži između 30 wt% i 45 wt%, između 35 wt% i 40 wt % i 36 wt% do 39 wt% Formule (I) hemitartarata na bazi suvih krutih materija.
Pomenuta farmaceutska formulacija tipično sadrži između 2 wt% i 6 wt% veznika na bazi suvih krutih materija.
Pomenuta farmaceutska formulacija tipično sadrži između 0.1 wt% i 2 wt% veznika na bazi suvih krutih materija.
U jednoj specifičnoj izvedbi, pomenuta farmaceutska formula sadrži između 8 wt% do 32 wt% filera koji ne može da se rastvara u vodi, između 26 wt% do 50 wt% filera koji se rastvara u vodi, između 30 wt% i 45 wt% Formule (I) hemitartarata, između 2 wt% i 6 wt% veznika i između 0.1 wt% i 2 wt% veznika sve na bazi suvih krutih materija. Još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; a filer koji ne može da se rastvori u vodi je mikrokristalna celuloza. Čak još specifičnije pomenuti filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; filer koji ne može da se rastvori u vodi je mikrokristalna celuloza; veznik je hidroksipropil metilceluloza; a lubrikant je gliceril behenat.
U jednoj specifičnoj izvedbi, pomenuta farmaceutska formula sadrži između 8 wt% do 32 wt% filer koji se ne rastvara u vodi, između 26 wt% do 50 wt% filera koji se rastvara u vodi, između 35 wt% i 40 wt% Formule (I) hemitartarata, između 2 wt% i 6 wt% veznika i između 0.1 wt% i 2 wt% veznika, sve na bazi suvih krutih materija. Još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; a filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza. Čak još specifičnije, filer koji se rastvara uz vodi je laktoza monohidrat; filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza; veznik je hidroksipropil metilceluloza; a lubrikant je gliceril behenat.
U drugoj specifičnoj izvedbi, pomenuta farmaceutska formula sadrži između 8 wt% do 24 wt% filera koji se ne rastvara u vodi, između 30 wt% do 46 wt% filera koji se rastvara u vodi, između 35 wt% i 40 wt% Formule (I) hemitartarata, između 2 wt% i 6 wt% veznika i između 0.1 wt% i 2 wt% veznika, sve na bazi suvih krutih materija. Još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; a filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza. Čak još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza; veznik je hidroksipropil metilceluloza; a lubrikant je gliceril behenat.
U drugoj specifičnoj izvedbi, farmaceutska formula sadrži između 12 wt% do 20 wt% filer koji se ne rastvara u vodi, između 34 wt% do 46 wt% filera koji se rastvara u vodi; između 35 wt% i 40 wt% Formule (I) hemitartarata, između 2 wt% i 6 wt% veznika i između 0.1 wt% i 2 wt% veznika, sve na bazi suvih krutih materija. Još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; a filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza. Čak još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza; veznik je hidroksipropil metilceluloza; a lubrikant je gliceril behenat.
U drugoj specifičnoj izvedbi, farmaceutska formula sadrži između 14 wt% do 18 wt% filera koji se ne rastvara u vodi, između 38 wt% do 44 wt% filera koji se rastvara u vodi, između 35 wt% i 40 wt% Formule (I) hemitartarata, između 2 wt% i 6 wt% veznika i između 0.1 wt% i 2 wt% veznika, sve na bazi suvih krutih materija. Još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; a filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza. Čak još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza; veznik je hidroksipropil metilceluloza; a lubrikant je gliceril behenat.
2
U drugoj specifičnoj izvedbi, farmaceutska formula sadrži između 14 wt% do 18 wt% filera koji se ne rastvara u vodi, između 38 wt% do 44 wt% filera koji se rastvara u vodi, između 36 wt% i 39 wt% Formule (I) hemitartarata, između 2 wt % i 6 wt% veznika i između 0.1 wt% i 2 wt% veznika, sve na bazi suvih krutih materija. Još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; a filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza. Čak još specifičnije, filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza; veznik je hidroksipropil metilceluloza; a lubrikant je gliceril behenat.
Ovaj pronalazak je ilustrovan sa sledećim primerima, koji ga ne ograničavaju na bilo koji način.
EKSPERIMENTALNI DEO
Primer 1: Priprema soli Formule (I)
Hemitartaratna so Formule (I) lako kristalizuje i pokazuje mnoge korisne karakteristike u odnosu na druge soli. Na primer, sledeće kiseline su korišćene za pripremu soli jedinjenja koje je predstavljeno sa Formulom (I): limunska kiselina (stvara soli u 1:1, 1:2 i 1:3 (so:Formula I) omerima); L-malična (1:1 i 1:2); metan sulfonska kiselina (1:1); fumarna kiselina (1:1 i 1:2); hlorovodonična kiselina (1:1); sirćetna kiselina (1:1) i tartarna kiselina (1:1 i 1:2). Jedino soli nastale uz pomoć hlorovodonične kiseline (1:1); tartarne kiseline (1:1) i tartarne kiseline (1:2) su u krutoj formi. Od tri pomenute, samo su se soli hlorovodonične kiseline (1:1) i tartarne kiseline (1:1) pokazale higroskopnima i ne-kristalnima pa zbog toga nisu korisne za upotrebu u farmaceutskom produktu. Hemitartarat (1 so: 2 Formula I) jedinjenja koje je predstavljeno sa Formulom I se pokazao kristalnim i ne-higroskopnim.
Priprema Formule (I) hemitartarata uz pomoć acetona
L-tartarna kiselina (6.02 g , 40.11 mmol, 0.497 ekvivalenata) je rastvorena u acetonu (175 mL) uz pomoć refluksovanja rastvora, a nakon toga slijedi hlađenja do sobne temperature. Formula (I) slobodne baze (32.67 g, 80.76 mmol) je rastvorena u acetonu (300 mL) na sobnoj temperaturi. Rastvor L-tartarne kiseline je dodan u rastvor Formule (I) slobodne baze na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Tokom dodavanja se stvarao beli precipitat. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 0.5 h, a tada je kratko refluksovana i ohlađena do sobne temperature. Nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom 0.5 h, beli precipitat je filtriran.
2
Bela kruta materija je isprana dva puta sa acetonom (2 x 130 mL). Kruta materija je osušena na vazduhu, a tada je osušena u vakuumu na 55-60° C. Prinos je 36.66 g (95%).
Priprema Formule (I) hemitartarata uz pomoć 5% metanola u acetonu
Formula (I) slobodne baze, 10 g/24.7 mmol, je rastvorena u 5% metanol/acetonu, 120 mL ili 240 mL. L-tartarna kiselina, 1.85 g/12.3 mmol, je rastvorena u 5% metanol/acetonu, 60 mL ili 120 mL (N ili 2N) uz pomoć grejanja do 40-45° C, a ovaj rastvor je dodan u prvi rastvor. Nakon 1 h bez precipitacije je dodan 1 mg Formule (I) hemitartarata kao seme za kristalizovanje. Precipitacija je započela nakon 5 min, a reakciona smeša je mešana tokom dodatnih 30 min. Reakciona smeša je tada grejana kod refluksa tokom 5 min (precipitat je potpuno rastvorljiv), a tada je ohlađena do sobne temperature u vodenoj banji na 20-22° C. Nastao je precipitat, a reakciona smeša je mešana tokom 3 h. Konačni produkt je sakupljen uz pomoć filtracije pa je ispran sa acetonom, 2 x 40 mL, a tada je osušen u vakuumu na 55-60° C tokom 16 h. Težina produkta je bila 8.72 g uz 74% prinos.
Priprema Formule (I) hemitartarata uz pomoć 1% vode u acetonu
Formula (I) slobodne baze (10 g/24.7 mmol) je rastvorena u 1% voda/acetonu, 120 mL ili 240 mL na sobnoj temperaturi. L-tartarna kiselina, 1.85 g/12.3 mmol, je rastvorena u 1% voda/acetonu, 60 mL ili 120 mL (N ili 2N) uz pomoć grejanja do 40-45° C, a ovaj rastvor je dodan u prvi rastvor. Nakon 1 h bez precipitacije je dodan 1 mg Formule (I) hemitartarata kao seme za kristalizovanje. Precipitacija je počela nakon 5 min, a reakciona smeša je mešana tokom 30 min. Reakciona smeša je tada grejana kod refluksa tokom 5 min (precipitat nije potpuno rastvorljiv), a tada je ohlađena do sobne temperature u vodenoj banji na 20-22° C. Nastao je precipitat, a reakciona smeša je mešana tokom 3 h. Konačni produkt je sakupljen uz pomoć filtracije pa je ispran sa acetonom, 2 x 40 mL, a tada je osušen u vakuumu na 55-60° C tokom 16 h. Težina produkta je bila 8.62 g uz 73% prinos.
Rekristalizovanje Formule (I) hemitartarata iz 5% metanola u acetonu
Formula (I) hemitartarata (3.06 g) je rastvorena u 116 mL 5% metanola u acetonu kod refluksa. Rastvor je ohlađen do sobne temperature pa je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Beli precipitat je filtriran i ispran sa 10 mL 5% metanola u acetonu, a nakon toga sa acetonom (15 mL). Nakon sušenja u vakuumu tokom 18 h na 55-60° C dobija se 2.38 g Formule (I) hemitartarata (78% obnova).
2
Rekristalizovanje Formule (I) hemitartarata iz 1% H2O u acetonu
Formula (I) hemitartarata (3.05 g) je rastvorena u 125 mL 1% H2O u acetonu kod refluksa. Rastvor je ohlađen do sobne temperature pa je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Beli precipitat je filtriran i ispran sa 10 mL 1% H2O u acetonu, a tada sa acetonom (15 mL). Nakon sušenja u vakuumu preko noći na 55-60° C dobiveno je 2.35 g Formule (I) hemitartarata (77% obnova).
Primer 2: Priprema kristalne Formule (I) hemitartarata
Formula (I) hemitartarata je kristalizovana uz pomoć nekoliko postupaka. Šarža 1 je pripremljena uz pomoć rastvarača etil acetat/aceton pa je osušena na sobnoj temperaturi. Šarža 3 je pripremljena uz pomoć rastvarača etil acetat/aceton pa je rekristalizovana iz etil acetata. Šarža 4 je rekristalizovana iz acetona uz pomoć materijala iz Šarže 1. Šarža 5 je rekristalizovana iz izopropanola. Šarža 7 je pripremljena uz pomoć rastvarača etil acetat/aceton slično kao i Šarža 1, ali na većoj skali. Šarža 8 je pripremljena samo uz pomoć acetona bez dodatnog rekristalizovanja. Šarža 9 je pripremljena samo uz pomoć acetona uz kratak refluks, ali opet bez dodatnog rekristalizovanja.
Tabela 1: Sažetak pretraživanja polimorfizma Šarža 1-9 Formule (I) hemitartarata
2
Kristalne forme Formule (I) hemitartarata su takođe pripremljene uz pomoć sporog isparavanja, sporog hlađenja, brzog hlađenja i precipitacije anti-rastvarača uz pomoć brojnih tipova rastvarača.
Postupak sporog isparavanja. Izvagani primerak (obično 20 mg) je tretiran sa alikvotima testnog rastvarača. Alikvoti su tipično 100-200 µL. Između faza dodavanja rastvarača, smeša je okretana ili sonifikovana. Kada su se krute materije rastvorile, na osnovi vizualne procene, rastvor je ostavljen da ispari u ambijentalnim uslovima u otvorenoj posudi koja je bila pokrivena sa folijom od aluminijuma sa rupicama. Rastvorljivosti su bile procenjene ne osnovu ovih eksperimenata uzimajući u obzir ukupni dodani rastvarač koji je dovoljan da se dobije bistar rastvor.
2
Tabela 2: Približna rastvorljivost Formule (I) hemitartarata na sobnoj temperaturi (20-25°
C).
Tabela 3: Sažetak polimorfizma kada se primenjuje sporo isparavanje.
Postupak sporog/brzog hlađenja. Formula (I) hemitartarata je rastvorena u testnom rastvaraču na 50-60° C. Nastao rastvor je tada ostavljen da se ohladi do ambijentalne temperature (sporo hlađenje). Ako kruta materija nije nastala nakon jednog dana, posude su stavljene u frižider. Za eksperimente brzog hlađenja, nastao rastvor je tada ostavljen da se hladi u frižideru. Krute materije su sakupljene uz pomoć filtracije pa su osušene na vazduhu.
Tabela 4: Sažetak polimorfizama kada se primenjuje sporo hlađenje.
Tabela 5: Sažetak polimorfizama kada se primenjuje brzo hlađenje.
Postupak sa anti-rastvaračem. Formula (I) hemitartarata je rastvorena u nekom rastvaraču. U taj rastvor je dodan anti-rastvarač. Krute materije koje su nastale su sakupljene uz pomoć filtracije pa su osušene na vazduhu.
1
Tabela 6: Sažetak pretrage polimorfizma kada se primenjuje pristup sa anti-rastvaračem.
2
Primer 3: Fizičke karakteristike Formule (I) hemitartarata
Diferencijalna skening kalorimetrija (DSC). DSC podaci su bili sakupljeni uz pomoć aparata TA Q100 koristeći azot kao gas za čišćenje. Približno 2-5 mg primerka je tačno izvagano u aluminijumsku posudu za DSC. Pomenuta posuda je pokrivena sa poklopcem koji je probušen sa pincetom. Ćelija za primerak je bila uravnotežena (ekvilibrisana) na 30° C pa je grejana ratom od 10° C po minuti do konačne temperature od 220° C.
Mikroskopija vrućeg stanja. Mikroskopija vrućeg stanja je provedena uz pomoć aparata Linkam hot stage (model FTIR 600) koji je bio montiran na mikroskop Leica DM LP opremljen sa kamerom Sony DXC-970MD 3CCD za skupljanje slika. Za posmatranje primeraka je korišćen objektiv sa povećanjem od 40x i sa polarizovanim svetlom. Svaki primerak je postavljen između dva stakalca za pokrivanje. Svaki primerak je vizualno posmatran tokom grejanja. Slike su ulovljene uz pomoć programa Links version 2.27 (Linkam). Vruće stanje je kalibrisano uz pomoć USP standardnih tačaka topljenja.
Endotermička tranzicija koja je primećena u DSC profilu je potvrđena kao tranzicija topljenja na temperaturi između 160-163° C uz pomoć mikroskopije vrućeg stanja.
Primer 4: Difrakcija X-zraka na prahu Formule (I) hemitartarata
Sve analize difrakcije X-zraka na prahu (XRPD) su privedene na SSCI, Inc. (West Lafayette, IN 47906). XPRD analiza he provedena uz pomoć difraktometra za prah Shimadzu XRD-6000 X-ray uz korišćenje Cu K α-radijacije. Pomenuti aparat je bio opremljen sa tubom za X-zrake sa preciznim fokusom. Voltaža i amperaža tube su bile podešena na 40 kV i 40 mA. Divergencija i procep za raspršenje su bili podešeni na 1°, a procep za primanje je bio podešen na 0.15 mm. Radijacija prelamanja je detekovana uz pomoć detektora scincilacije NaI. Korišćen je teta-dva teta kontinuirani sken kod 3°/min (0.4 s/0.02° korak) od 2.5 do 40 °2θ. Silikonski standard je analiziran sa ciljem da se proveri podešenost aparata. Podaci su sakupljeni i analizirani uz pomoć programa XRD-6000 v 4.1.
Primer 5: Uporedba Formule (I) hemitartarata sa Formulom (I) slobodne baze Karakterizovanje krute materije slobodne baze i hemitartaratne soli je sažeto u Tabeli 7. Formula I hemitartarata ima bolje karakteristike u odnosu na Formulu I slobodne baze. Na primer, Formula I hemitartarata ima višu tačku topljenja (> 150° C), višu energiju pakovanja (veću endotermičku entalpiju), manju varijaciju u veličini čestica, veću rastvorljivost u vodi (preko 300 mg/mL u vodi), prikladan oblik kristala i veću ukupnu gustoću u odnosu na Formulu I slobodne baze.
Tabela 7: Sažetak krutog stanja i fizičkih i hemijskih karakteristika Formule (I) slobodne baze i Formule (I) hemitartarata.
4
Primer 6: In vitro delovanje i specifičnost
Aktivnost Formule (I) hemitartarata kod inhibiranja sinteze glikosfingolipida in vitro. Dva testa su korišćena da se kvantifikuje aktivnost Formule (I) hemitartarata u inhibiranju sinteze glikozilkeramida. Budući je glikozilkeramid prvi i ograničavajući korak u biosintezi glikosfingolipida, korišćena je protočna citometrija, koja meri nivoe GM1 i GM3 na površini ćelija, se ciljem da se proceni delovanje pomenutog inhibitora u funkcionalnim ćelijama. Inkubiranje K562 ili B16/F10 ćelija tokom 72 h sa rastućim količinama Formule (I) hemitartarata (0.6-1000 nM) je rezultovalo u smanjenje nivoa GM1 i GM3 na površinama ćelija kao funkciju doze. Srednja IC50vrednost za inhibiranje prisutnosti GM1 na površini K562 je bila 24 nM (raspon 14-34 nM) (Tabela 8), a za GM3 na površini B16/F10 ćelija je bila 29 nM (raspon 12-48 nM). Vidljiva ćelijska toksičnost nije bila primećena u celoj ćelijskoj liniji tokom testiranja sa najvišim dozama.
Alternativan test aktivnosti je merio inhibiciju sinteze glikozilkeramida u mikrosomima na bazi ljudskih ćelija. U ovom testu, mikrosomi su pripremljeni iz humanih ćelija melanoma (A375 ćelije) uz pomoć sonifikovanja i centrifugovanja. Pripremljeni mikrosomi su inkubirani sa fluorescentnim keramid supstratom (NBD-C6-keramid), UDP-glikoza i rastućim količinama Formule (I) hemitartarata (0-1000 nM) tokom jednog časa na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, fluorescentno označeni glikozilkeramid i nereagovani keramid su odvojeni i kvantifikovani uz pomoć HPLC reverzne faze i detekcije fluorescencije. U ovom testu, vrednost IC50kija je dovoljna za inhibiranje sinteze glikozilkeramida je bila u rasponu od 20 do 40 nM. Ova vrednost je slična onima koje su dobivene malopre kod GM1 i GM3 i sugeriše da su merenja pomenutih glikolipida sa površine ćelija dobri surogati delovanja Formule (I) hemitartarata na sintezu glikozilkeramida.
Specifičnost supstrata za inhibiciju sinteze uz pomoć Formule (I) hemitartarata. Specifičnost Formule (I) hemitartarata je procenjena u serijama in vitro testova na bazi ćelija i bez ćelija.
Crevne glikozidaze (encimi) su analizirane u homogenatima tkiva pacova (vidi U. Andersson, et al., Biochem. Pharm. 59 (2000).821-829), a encim koji odstranjuje ogranke sa glikogena je testiran u testu bez ćelija kao šta je već opisano (vidi U. Andersson, et al., Biochem. Pharm.
67 (2004) 697-705). Nije pronađena vidljiva inhibicija crevnih glikozidaza (laktaze, maltaze, sukraze, α-glikotzidaze I i II) i citosolnog encima za otklanjanje ogranaka (α-1,6-glikozidaza) kod koncentracija od najviše 2500 µM (Tabela 8).
Ne-lizosomalna glikozilkeramidaza i lizosomalna glikocerebrozidaza su testirane u funkcionalnim humanim ćelijama koristeći C6-NBD-glikozilkeramid kao supstrat (vidi H.S. Overkleeft, et al. J. Biol. Chem. 273 (1998) 26522-26527). Konduritol β epoksid (specifični inhibitor lizosomalne glikocerebrozidaze) je korišćen sa ciljem da se razlikuje lizosomalna od ne-lizosomalne aktivnosti. Aktivnost glikocerebrozidaze je takođe izmerena uz pomoć ćelijskog sortiranja indukovanog fluorescencijom (FACS). K562 ćelije su uzgojene u kulturi sa rastućim količinama Formule (I) hemitartarata u prisutnosti 1 µM 5-(pentafluorobenzoilamino)-fluorescein di-β-D-glikopiranozida (PFB-FDGlu, Molecular Probes/Invitrogen. Carlsbad, CA) tokom 30-60 min. Ćelije su odmah ohlađene na ledu, a fluorescencija je kvantifikovana kao malopre. Ne-lizosomalna glikozilkeramidaza je blago inhibirana sa IC50od 1600 µM. Nije primećena inhibicija lizosomalne glikocerebrozidaze, encim koji nedostaje kod Gaucher-ove bolesti, sve do najveće koncentracije od 2500 µM (Tabela 8). Tako, bila je potrebna razlika u koncentraciji reda veličine od približno 40,000 kako bi se inhibirala sinteza glikozilkeramida u odnosu na bilo koji drugi testirani encim.
Tabela 8: Biohemijske aktivnosti Formule (I) hemitartarata in vitro
Primer 7: Poboljšano upravljanje sa nivoima lizosomalnog glikozilkeramida u mišjem modelu
A. Fabry-eva bolest.
Sa ciljem da se odredi da li upotreba kombinovane terapije zamene encima (ERT) i terapije redukovanja supstrat (SRT) može da održava encimski nedostatak ili da obezbedi dodatne koristi, upoređene su relativne efikasnosti odvojenih i kombinovanih terapija u mišjem modelu Fabry-eve bolesti (Fabry-Rag). Parentalni miševi sa Fabry-evom bolesti su opisni kod Wang, AM et al. Am. J. Hum. Genet. 59: A208 (1996). Fabry-Rag je ukršten sa RAG-1 mišem pa zbog toga ne može da proizvede zrele limfocite ili T-ćelije (imuno-kompromitiran).
Studije na životinjama.
Za potrebe studija monoterapije, miševi sa Fabry-evom bolesti su uvedeni u istraživanje u dobi od 1 meseca (preventivni model). Grupe za tretman su primile Formulu (I) hemitartarata (Gencim Corp., Cambridge, MA) kao komponentu u krutoj hrani. Lek je bio formulisan na 0.15% (w/w) u standardnoj mišjoj hrani 5053 (TestDiet, Richmond, IN) i miševima ostavljen na upotrebu po volji (ad libitum). Ova formulacija je obezbedila 300 mg/kg Formule (I) hemitartarata po danu po mišu od 25 g.
Za potrebe studija kombinovanih terapija, Fabry-Rag miševi su uvedeni u istraživanje u dobi od 3 meseca (model sa tretmanom). Miševi iz grupe A su primili intravenozne injekcije rekombinantne humane alfa-galaktozidaze A (Gencim Corp.) u dozi od 1 mg/kg svaka 2 meseca (na primer, u starosti od 3, 5, 7 i 9 meseci). Grupa B je primila iste intravenozne doze encima plus Formulu (I) hemitartarata (Gencim Corp., Cambridge, MA) kao komponentu u krutoj hrani. Lek je bio formulisan na 0.15% (w/w) u standardnoj mišjoj hrani 5053 (TestDiet, Richmond, IN) i ostavljen miševina na upotrebu ad libitum. Ova formulacija je obezbedila 300 mg/kg Formule (I) hemitartarata po danu po mišu od 25 g. Grupa C je primala encimske injekcije svaka 4 meseca (na primer, u starosti od 3 i 7 meseci) i bila je držana na istoj dijeti „lek-u-hrani“ kao i grupa B. Grupa D je primila samo dijetu „lek-uhrani“ (isto kao i grupe B i C). Grupa E su netretirani Fabry-Rag miševi, a grupa F su kontrole divljeg tipa. Vidi SL 10.
Kvantifikacija nivoa tkivnog globotriaozilkeramida (GL-3, Gb3)
Kvantifikacija GL-3 je provedena uz pomoć Tandemske masene spektrometrije u osnovi kao i kod GL-1. Test vruće plohe je proveden kao šta je prethodno opisano (Ziegler, RJ et al. Molec. Ther.15(3), 492-500 (2007).
Rezultati
Monoterapija miševa sa Fabry-evom bolesti sa Formulom (I) hemitartarata
SRT je procenjen u mišjem modelu Fabry-eve bolesti, koja je uzrokovana nedostatkom delovanja α-galaktozidaze A. Terapija sa Formulom (I) hemitartarata je započela sa miševima sa Fabry-evom bolesti u starosti od jednog meseca, a nastavljena je sve dok miševi nisu napunili godinu dana. Životinje su bile dnevno dozirane sa 300 mg/kg Formule (I) hemitartarata kroz njihovu svakodnevnu prehranu. Testovi ponašanja (na primer, test vruće plohe) i biohemijski testovi (na primer, analiza mokraće i analiza nivoa GL-3 u tkivu/krvi/mokraći) miševa su bili provođeni jednom u dva meseca.
Kao šta je prikazano na SLICI 7, administracija Formule (I) hemitartarata Fabry-Rag miševima tokom perioda od 11 meseci smanjuje ratu lizosomalne akumulacije globotriaozilkeramida (GL-3) u telesnim organima (jetra, bubrezi, srce i slezina) za približno 50%. Ovo je dovelo do usporavanja napredovanja bolesti, kao šta je bilo ustanovljeno preko neosetljivosti na neugodni toplotni podražaj (vidi SLIKU 8), i sprečavanju pogoršanja faktora urinoanalize, na primer, volumen mokraće, nivoa kreatinina i natrijuma (vidi SLIKU 9). Tako, inhibicija glikozilkeramid sintaze, koja katalizuje prvi korak u sintezi glikosfingolipida uz pomoć Formule (I) hemitartarata, nije samo korisna u životinjskim modelima Gaucher-ove bolesti već takođe i kod Fabry-eve bolesti, i takođe može da ima pozitivne efekte i na drugim glikosfingolipidozama.
Kombinovana terapija miševa sa Fabry-evom bolesti sa α-galaktozidazom A i Formulom (I) hemitartarata
Efikasnost samo ERT i kombinovane terapije sa SRT koristeći Formulu (I) hemitartarata je procenjena na pet populacija Fabry-Rag miševa (n=12/grupi). Započinjući u starosti od tri meseca, miševi su bili podvrgavani testovima ponašanja (na primer, test vruće plohe) i biohemijskim testovima (na primer, analiza nivoa GL-3 u tkivu/krvi/mokraći), kao šta je prikazano na SLICI 10. Miševima koji su bili podvrgnuti ERT su bile davane doze od 1 mg/kg α-galaktozidaze A prema rasporedu prikazanom na SLICI 10. Miševima koji su bili podvrgnuti SRT davane su doze 300 mg/kg Formule (I) hemitartarata dnevno preko hrane. Kao šta je prikazano na SLICI 11, ERT smanjuje nivoe GL-3 u krvi kod Fabry-Rag miševa, dok SRT ne. Kao šta je prikazano na SLICI 12, kombinovana terapija ERT/SRT je najefektivnija u smanjivanju nivoa GL-3 u jetra i bubrezima kod Fabry-Rag miševa.
Kao šta je prikazano na SLICI 13, SRT smanjuje nivoe GL-3 u mokraći kod Fabry-Rag miševa, dok ERT ne. Kao šta je prikazano na SLICI 14, SRT, ali ne i ERT odgađa pojavu toplotne neosetljivosti kod Fabry-Rag miševa.
Sve zajedno, Fabry-Rag miševi tretirani sa kombinacijom Fabrazima i Formule (I) hemitartarata pokazuju poboljšanje markera bolesti u odnosu na pojedinačnu upotrebu ERT ili SRT u tretiranom modelu na sledeće načine: značajno smanjena akumulacija GL-3 u jetra i bubrege kod kombinovane terapije; poboljšani GL-3 u mokraći kod SRT grupa; poboljšani GL-3 u krvi kod ERT grupa; i odgođena periferna neuropatija kod SRT grupa.
B. Gaucher-ova bolest. Sa ciljem da se odredi da li sekvencijalna upotreba terapije zamene encima (ERT) i terapije smanjivanja supstrata (SRT) može da obezbedi dodatne koristi, upoređene su relativne efikasnosti odvojenih i sekvencijalnih terapija u mišjem modelu Gaucher-ove bolesti (D409V/nul).
Postupci
Životinjske studije. Procedure koje uključuju životinje su pregledane i odobrene od strane Internacionalnog komiteta za brigu i upotrebu životinja (IACUC) pri Gencim Corporation sledeći instrukcije koje je izdalo Društvo za procenu i akreditaciju brige o laboratorijskim životinjama (AAALAG). Miš sa Gaucher-ovom bolesti (D409V/nul) je model za Gaucherovu bolest tipa 1 gde je očita akumulacija glikozilkeramida u jetra, slezini i pluća, ali izostaje patologija kostiju ili mozga (vidi Y-H. Xu, et al., Am. J. Pathol. 163, 2003, 2093-2101). Životinje oba pola su uvedene u istraživanje u dobi od 3 meseca na osnovu nalaza prethodnih eksperimenata koji su pokazali da ne postoji razlika u odgovoru između mužjaka i ženke na rekombinantnu glikocerebrozidazu ili na Formulu (I) hemitartarata. Studija je obuhvatala 6 grupa miševa pri čemu je grupa A bila žrtvovana nakon 2 sedmice sa ciljem da se doznaju osnovni nivoi tkivnog glikozilkeramida. Grupe B, C i D su primile rekombinantnu humanu glikocerebrozidazu (Gencim Corp., Cambridge, MA) (10 mg/kg) intravenozno preko repne vene (100 µL) svaka 2 dana kroz ukupno 8 injekcija. Grupa B je žrtvovana na kraju ovog režima (istovremeno kad i grupa A) sa ciljem da se odrede redukovani nivoi tkivnog glikozilkeramida. Grupe D i E su hranjene sa Formulom (I) hemitartarata (Gencim Corp., Cambridge, MA) koja je bila komponenta u krutoj hrani. Lek je bio formulisan na 0.075% (w/w) u standardnoj mišjoj hrani 5053 (TestDiet, Richmond, IN) koja je bila ostavljena na upotrebu ad libitum. Ova formulacija je obezbedila 150 mg/kg Formule (I) hemitartarata po danu po mišu od 25 g. Grupa F nije bila tretirana, a žrtvovana je zajedno sa grupama C, D i E 12 sedmica nakon početka istraživanja. Konzumacija hrane i težina miševa su praćeni tri puta sedmično sa ciljem da se odredi unos leka i potencijalni uticaj leka na ukupno zdravlje. Životinje su usmrćene uz pomoć udisanja ugljenik dioksida, a tkiva su korišćena odmah. Pola svakog tkiva je smrznuto na suvom ledu i uskladišteno na -80° C do sledeće potrebe. Druga polovica je pripremljena za histološku analizu.
Kvantifikovanje nivoa tkivnog glikozilkeramida. Nivoi glikozilkeramida su kvantifikovani uz pomoć masene spektrometrije kao šta je prethodno opisano (vidi K. McEachern, et al., J. Gene. Med.8 (2006) 719-729; T. Doering, J. Biol. Chem. 274 (1999) 11038-11045). Poznata masa tkiva je homogenizovana u hloroform:metanolu u omeru od 2:1 (v/v) i inkubirana na 37° C tokom 15 min. Primerci su centrifugovani, a supernatanti su ekstrahovani sa 0.2 volumena vode preko noći na 4° C. Primerci su centrifugovani, vodena faza je odbačena, a organska faza je osušena do filma pod azotom. Za potrebe analize uz pomoć masene spektrometrije uz jonizaciju u elektrospreju (ESI/MS), tkivni primerci su obnovljeni do ekvivalenta od 50 ng originalne tkivne težine u 1 ml hloroform:metanola (2:1, v/v) pa su vorteksovani tokom 5 min. Alikvoti (40 µL) svakog primerka su stavljeni u posude za totalnu obnovu (Waters) pa je dodano 50 µL internog standarda d3-C16-GL-1 (10 µg/mL) (Matreya, Inc., Pleasant Gap, PA). Primerci su osušeni u azotu pa su obnovljeni sa 200 µL DMSO:metanola, 1:4 (v/v). ESI/MS analiza glikozilkeramida sa različitim dužinama lanaca ugljenika je provedena na Waters Alliance HPLC (Separation Module 2695) koji je bio spojen na sistem Micromass Quattro Micro opremljen sa jonskim izvorom preko elektrospreja. Primerci sa lipidnim ekstraktima (20 µL) su injektirani u C8 kolonu (4 mL X 3 mm i.d; Phenomenex, Torrance, CA) na 45° C, a sve je eluirano u gradijentu od 50 do 100% acetonitrila (2 mM amonijum acetat, 0.1% formička kiselina) na 0.5 mL/min. Prvih 0.5 min sistem je održavan na 50% organsko, a tada je brzo prebačen na 100% tokom zadnjih 3.5 min. Temperatura izvorišta je održavana na 150° C, a azot je korišćen kao gas za
4
odstranjivanje rastvarača kod rate protoka od 670 L/h. Kapilarna voltaža je bila održavana na 3.80 KV sa voltažom konusa od 23 V, dok je vreme boravka za svaku jonsku vrstu bilo 100 ms. Spektari su snimljeni u MRM modusu sa ciljem praćenja osam dominantnih izoforma (C16:0, C18:0, C20:0, C22:1, C22:0, C22:1-OH, C24:1 i C24.0). Kvantifikovanje glikozilkeramida je bazirano na sumi pomenutih osam izoforma u odnosu na interni standard, sa krivom kalibracije u rasponu od 0.1 do 10 µg/mL.
Histologija. Za histološku analizu, tkiva su bila fiksirana u cink formalinu (Electron Mikroscopy Sciences, Hatfield, PA) na sobnoj temperaturi tokom 24 h, a tada su uskladištena u PBS na 4° C do sledeće prilike. Svi primerci su dehidrirani u etanolu, izbistreni sa ksilenima, infiltrirani i uklopljeni u Surgipath R parafinu (Surgipath, Richmond, IL). Načinjeni su preseci od pet mikrona uz pomoć rotirajućeg mikrotoma koji su pre bojanja osušeni u pećnici na 60°. Presecima je odstranjen parafin u pomoć Hemo-De (Scientific Safety Solvents, Keller, TX) pa su rehidrirani u opadajućim koncentracijama etanola, a nakon toga su isprani sa PBS. Preseci su obojeni sa hematoksilinom i eozinom (H&E) i označeni uz pomoć anti-mišjeg monoklonskog antitela CD68 (Serotec, Raleigh, NC) sa ciljem da se identifikuju makrofagi. Nakon ispiranja tokom 5 min u PBS, preseci su dehidrirani u etanolu i izbistreni sa Hemo-De pre uklapanja sa medijumom za uklapanje SHUR/Mount™ (TBS, Durham, NC). Procenat površine koja je bila imunopozitivna na CD68 u jetra je kvantifikovana uz pomoć MetaMorph (MDS Analytical Technologies, Toronto, Kanada) analize deset slika (400x) po tkivnom preseku. Široko specijaliziran veterinarni patolog koji nije znao svrhu istraživanja je pregledao sve preseke.
Rezultati
Dozni režim glikocerebrozidaze za odstranjivanje nakupljenog GL1 u jetra, slezini i pluća miševa sa Gaucher-ovom bolesti koji su bili stari 3 meseca. Sa ciljem da se istraži relativna važnost kombinovane terapije i monoterapije sa encimom ili terapije sa smanjivanjem supstrata, najpre je određen režim encima koji je maksimalno smanjio nivoe GL1 u visceralnim organima kod miševa sa Gaucher-ovom bolesti. Tri meseca stari miševi sa Gaucher-ovom bolesti (D409V/nul) su intravenozno dobili 2, 4 ili 8 doza od po 10 mg/kg rekombinantne humane glikocerebrozidaze. Miševi koji su tretirani sa 2 ili 4 doze encima, infuzije su primali svaka 3 dana dok oni koji su tretirani sa 8 doza encim su primali svaka 2 dana. Upotreba kraćih vremenskih intervala između infuzija kod životinja koje su primile 8 tretmana je namenjena da minimizuje potencijalni uticaj na bilo kakav imuno odgovor na unos humanog encima. Životinje su usmrćene 7 dana nakon poslednje infuzije encima, a količina GL1 koji je preostao u jetra, slezini i pluća je izmerena.
Tretman sa 2 doze glikocerebrozidaze je smanjio nivoe GL1 u jetra za 50%. Povećavanje broja encimskih infuzija na 4 ili 8, ako šta je i bilo očekivano, smanjilo je jetrine nivoe GL1u većem omeru (za približno 75%). Odsustvo kompletnog snižavanja nivoa GL1, čak i kod 8 doza, je u skladu sa iskustvom subjekata sa Gaucher-ovom bolesti šta pokazuje da se hepatosplenomegalija smanjuje samo nakon produženog tretmana (vidi G.A. Grabowski, et al., Ann. Int. Med.122 (1995) 33-39). Nivoi supstrata u slezinama miševa sa Gaucher-ovom bolesti nisu reagovali na tretman sa encimom. Administracija 2 doza glikocerebrozidaze nije značajno promenilo nivoe GL1 od onih koji su bili primećeni kod netretiranih kontrola. Povećanje broja encimskih infuzija na 4 ili 8 je smanjilo nivoe GL1 u slezini za oko 50%. U plućima, smanjivanje za približno 60% u odnosu na netretiranu kontrolu je primećeno nakon 8 doza. Blago niži raspon smanjivanja supstrata u plućima je verojatno posledica slabije dostupnosti uvedenog encima alveolarnim makrofagima (tipa lipid-laden). Primećeni veći nedostatak GL1 u jetra u odnosu na slezinu i pluća se verojatno odnosi na biodistribuciju encima nakon sistemske infuzije (vidi S.M. Van Patten, et al. Glikobiology 17 (2007) 467-478). Na osnovu ovih rezultata, režim za tretman koji se sastoji od 8 uzastopnih doza od po 10 mg/kg glikocerebrozidaze administriranih u intervalima od 2 dana je bio korišten u svim ostalim studijama.
Relativne sposobnosti encimske terapije i terapije smanjivanja supstrata da smanje nivoe GL1 u jetra miševa sa Gaucher-ovom bolesti. Grupe miševa sa Gaucher-ovom bolesti starih 3 meseca su tretirane sa rekombinantnom glikocerebrozidazom ili sa Formulom (I) hemitartarata, odvojeno ili sekvencijalno. Miševi u grupama B, C i D su dobili 8 doza encima kao šta je malopre opisano (tokom period od 2 sedmice) sa ciljem da se odstrani akumulirani GL1. Različite grupe su tada hranjene sa regularnom hranom ili sa hranom koja je sadržavala Formulu (I) hemitartarata (150 mg/kg/danu) tokom dodatnih 10 sedmica pri čemu grupa F nije bila tretirana pa je služila kao naivna kontrola. Bez razlike na formulaciju hrane, miševi su pojeli uporedivu količinu hrane pa nisu primećene značajne razlike u telesnoj težini. Približno 80% uskladištenih nivoa GL1 je nestalo iz jetra nakon 2 sedmice terapije samo sa encimom. Kada su ove životinje ostavljene da se razvijaju bez daljnjeg tretmana tokom 10 sedmica, nivoi GL1 u njihova jetra su se povećali šta ukazuje na ponovnu akumulaciju supstrata koja se pojavila tokom među-perioda (Slika 2, kolona C). Ovi nivoi nisu bili značajno različiti od onih kod netretiranih kontrola (Slika 2, kolona F). Međutim, ako su miševi bili tretirani sa encimom, a tada sa Formulom (I) hemitartarata u njihovoj hrani tokom perioda od 10 sedmica, nivoi GL1 u jetra su bili značajno niži u odnosu na netretirane kontrole (Slika 2, kolona D & F). Ovaj rezultat sugeriše da je dodatan tretman sa Formulom (I) hemitartarata usporio ponovnu akumulaciju supstrata. Interesantno, miševi sa Gaucherovom bolesti koji su bili tretirani samo sa Formulom (I) hemitartarata tokom cele studije (12 sedmica) takođe pokazuju snižene nivoe GL-1 (Slika 2, kolona E) u odnosu na netretirane kontrole iste starosti (Slika 2, kolona F), ali razlika nije bila značajna. Sposobnost SRT (samog za sebe) da smanji nivoe GL1 u ovom životinjskom modelu je u skladu sa prethodnim izveštajem (vidi K.A. McEachem, et al., Mol. Genet. Metab.91 (2007) 259-267) i verojatno ukazuje na fakt da miševi sa Gaucher-ovom bolesti (D409V/nul) zadržavaju rezidualnu encimsku aktivnost (vidi Y-H. Xu, et al., Am. J. Pathol.163, 2003, 2093-2101).
Relativne sposobnosti terapije sa encimom i terapije smanjivanja supstrata da smanje nivoe GL1 u slezini miševa koji imaju Gaucher-ovu bolest. Tretman miševa sa Gaucher-ovom bolesti koji su bili stari 3 meseca samo sa rekombinantnom glikocerebrozidazom tokom 2 sedmice je smanjio nivoe GL1 u slezini za približno 60% (Slika 3, kolona B). Kada su ove životinje bile ostavljene da se razvijaju tokom dodatnih 10 sedmica bez dodatne intervencije, nivo supstrata se vratio na onaj koji je primećen na početku studije (Slika 3, kolona C) i nije bio značajno različit od onog kod netretirane kontrole (Slika 3, kolona F). Ovo sugeriše da je rata ponovne akumulacije GL1 u slezini bila veća od one u jetra. Ovo je takođe u skladu sa primećenim višim bazalnim nivoima supstrata u slezini (~1500 mg/g tkiva; Slika 2, kolona A) u odnosu na jetra (~500 mg/g tkiva; Slika 3, kolona A). Životinje koje su bile tretirane sa encimom, a tada sa Formulom (I) hemitartarata tokom sledećih 10 sedmica su pokazale najveću redukciju nivoa GL1 u slezini (Slika 3, kolona D) koji su bili značajno niži od onih kod netretiranih kontrolnih slezina (Slika 3, kolona F). Ovo ukazuje na implementacija SRT ne samo da usporava ponovnu akumulaciju supstrata već takođe da deluje na dodatno smanjivanje opterećenja koje nastupa usled skladištenja u ovom organu. Trebalo bi biti vidljivo da barem u ovom slučaju, ukupan efekt rezidualnog endogenog encima i smanjivanja supstrata dovodi do dodatnog pada ukupnih nivoa supstrata. Primećeni niži nivoi GL1 u slezini kod miševa tretiranih samo sa Formulom (I) hemitartarata tokom 12 sedmica (Slika 3,
4
kolona E) u odnosu na netretirane kontrole (Slika 3, kolona F) su u skladu sa prethodnom primedbom, mada razlika nije bila značajna. Tako, kod pacijenata sa blagim oblikom Gaucher-ove bolesti (tip 1) koji imaju visoku rezidualnu aktivnost encima, tretman sa ERT, a nakon toga sa SRT može potencijalno da ubrza ratu, a možda čak i količini gubitka lošeg supstrata.
Relativne sposobnosti terapije sa encimom i terapije smanjivanja supstrata da snize nivo GL1 u plućima miševa koji imaju Gaucher-ovu bolest. Kao šta je već primećeno, plućni nivoi GL1 su najmanje efikasno odstranjeni uz pomoć intravenozne administracije rekombinantne glikocerebrozidaze. Tretman miševa sa Gaucher-ovom bolesti koji su bili stari 3 meseca sa encim tokom 2 sedmice rezultovao je u samo 30% smanjenje nivoa supstrata u plućima (Slika 4, kolona B). Grupe životinja koje su bile hranjene sa normalnom hranom tokom sledećih 10 sedmica su pokazale, kao šta je bilo očekivano, ponovnu akumulaciju GL1 koja se nije značajno razlikovala od one kod netretiranih kontrola (Slika 4, kolona C & F). Suprotno, životinje koje su hranjene sa hranom koja je sadržavala Formulu (I) hemitartarata tokom istog perioda su pokazale smanjivanje nivoa supstrata do ispod onih kada je administriran samo encim (Slika 4, kolona D), a pomenuti nivoi su bili značajno niži od onih kod netretiranih kontrola (Slika 4, kolona F). Ovo ponovo sugeriše da u plućima, kao i u slezini, ukupan efekt Formule (I) hemitartarata (u prisutnosti delovanja rezidualnog endogenog encima) ne samo zaustavio ponovnu akumulaciji GL1 već takođe delovao da dodatno smanji nivo ispod početnog. Kao i kod drugih visceralnih organa, tretman samo sa Formulom (I) hemitartarata je bio efektivan u smanjivanju plućnih nivoa GL1 (Slika 4, kolona E) u odnosu na netretirane kontrole (Slika 4, kolona F).
Histopatološka analiza jetra miševa sa Gaucher-ovom bolesti nakon terapije sa encimom i terapije smanjivanja supstrata. Sa ciljem da se vizualiziraju efekti različitih terapeutskih režima u jetra, tkivni preseci su bili obojeni sa CD68 (marker za makrofage). Analiza jetrinih preseka iz netretiranih miševa sa Gaucher-ovom bolesti starih 3 meseca je pokazala prisutnost velikog broja Gaucher-ovih ćelija pozitivnih na CD68 u lipidnom sloju koji su ostali uglavnom nepromenjeni kada ih se analiziralo 12 sedmica kasnije. U sladu sa biohemijskim podacima, jetra životinja koje su dobile rekombinantnu glikocerebrozidazu tokom period od 2 sedmice su pokazala značajni nedostatak lipida u pomenutim abnormalnim makrofazima. Kada su ove životinje bile ostavljene da se razvijaju tokom dodatnih 10 sedmica bez dodatnog tretmana, pojavio se dokaz o ponovnoj akumulaciji GL1 kao šta je vidljivo preko ponovne pojave Gaucher-ovih ćelija. Međutim, ovakvo povećanje količine Gaucher-ovih ćelija nije bilo vidljivo kada su miševi primili terapiju smanjivanja supstrata sa Formulom (I) hemitartarata tokom istog perioda. Kao šta je već navedeno, miševi sa Gaucher-ovom bolesti koji su primali samo Formulu (I) hemitartarata takođe su pokazali smanjenu akumulaciju supstrata, mada ne u istom rangu kao i one koje su primale kombinovanu terapiju sa ERT i SRT. Količina bojanja pozitivnog na CD68 u različitim presecima je takođe kvantifikovana uz pomoć programa MetaMorph (Slika 18). Stepen bojanja u ovim presecima odgovara količini GL1 u jetra koja je bila određena biohemijski (Slika 15) šta dodatno podržava predlog o relativnim važnostima različitih režima za tretman.
Primer 8: Efikasnost Formule (I) hemitartarata u mišjem model Gaucher-ove bolesti Studije na životinjama. Procedure koje uključuju životinje su pregledane i odobrene od strane Internacionalnog komiteta za brigu i upotrebu životinja (IACUC) sledeći instrukcije koje je izdalo Društvo za procenu i akreditaciju brige o laboratorijskim životinjama (AAALAC) i državna i federalna pravila. gba<D409v/nul>miševi sa Gaucher-ovom bolesti (vidi Y.-H. Xu. et al., Am. J. Pathol. 163 (2003) 2093-2101) su ostavljeni da se razvijaju u skladu sa zahtevima istraživanja. Fenotipska razlika i razlika u odgovoru na Formulu (I) hemitartarata nije bila primećena između mužjaka i ženki, pa su stoga oba pola korišćena u ovim studijama. Dostava Formule (I) Hemitartarata je provedena uz pomoć pojedinačne dnevne oralne gavaže sa volumenom od 10 mL/kg. Životinje su bile prilagođene na oralnu gavažu sa sličnim volumenom vode tokom jedne sedmice pre početka tretmana. Formula (I) hemitartarata je rastvorena u vodi za injekciju (WFI; VWR, West Chester, PA) pa je administrirana u dozama koje su rasle od 75 mg/kg/danu do 150 mg/kg/danu tokom devet dana, sa periodom od po tri dana za svaku dozu i povećanjima od 25 mg/kg/danu. Miševi su vagani tri puta tokom sedmice sa ciljem da se prati potencijalni uticaj leka na njihovo ukupno zdravlje. Životinje su usmrćene uz pomoć udisanja ugljenik dioksida, a njihova tkiva su odmah pripremljena. Pola svakog primerka je odmah smrznuto na suvom ledu i uskladišteno na -80° C do sledeće prilike. Druga polovica je sačuvana za histološku analizu.
Kvantifikovanje nivoa glikozilkeramida u tkivima uz pomoć tanko-slojne hromatografije visoke performanse. Analiza uz pomoć tanko-slojne hromatografije visoke performanse (HP-TLC) je provedena kao šta je već opisano (A. Abe, et al., J. Clin. Inv.105 (2000) 1563-1571;
4
H. Zhao, et al. Diabetes 56 (2007) 1341-1349; and S.P.F. Miller, et al. J. Lab. Clin. Med.127 (1996) 353-358). Ukratko, ukupna lipidna frakcija je dobivena uz pomoć homogenizovanja tkiva u hladnom PBS, ekstrahovanja sa hloroform:metanolom, 2:1 (v/v), i sonifikovanja u sonikatoru sa vodenom banjom. Primerci su centrifugovani sa ciljem da se odvoje faze, a supernatant je sačuvan. Pelet je ponovo sonifikovana u hloroform:metanol:slanom rastvoru, centrifugovana, a ovaj sekundarni supernatant je sakupljen i spojen sa prvim. U spojenim supernatantima je dodana smeša hloroform:slani rastvor, A 1:1 (v/v), sve je vorteksovano i centrifugovano. Nakon odbacivanja gornjeg vodenog sloja, dodan je metanol:slani rastvor, sve je vorteksovano i ponovo centrifugovano. Organska faza je sačuvana i osušena u azotu, rastvorena u hloroform:metanolu, 2:1 (v/v), 1 mL na 0.1 g originalne težine tkiva, i sve je uskladišteno na -20° C.
Deo lipidnog ekstrakta je korišćen za merenje ukupnog fosfata, (vidi B.N. Ames, Methods Enzymol. 8 (1966) 115-118); na primer, fosfolipidni sadržaj može da se koristi kao unutrašnji standard. Ostatak je podvrgnut alkalnoj metanolizi sa ciljem da se odstrane fosfolipidi koji migriraju zajedno sa glikozilkeramidom na HP-TLC ploči. Alikvoti pomenutih ekstrakata koji sadrže ekvivalentne količine ukupnog fosfata su uočene na HP-TLC ploči zajedno sa poznatim standardima za glikozilkeramid (Matreya Inc. Pleasant Gap, PA). Lipidi su razrešeni i vizualizirani uz pomoć 3% bakar acetat monohidrata (w/v). Nakon pečenja tokom 10 min na 150° C dodana je 15% fosforna kiselina (v/v). Linije sa lipidima su skenirane na denzitometru (GS-700, Bio-Rad, Hercules, CA) i analizirane uz pomoć programa Quantity One (Bio-Rad).
Kvantifikovanje nivoa glikozilkeramida u tkivu uz pomoć masene spektrometrije. Glikozilkeramid je bio kvantifikovan uz pomoć masene spektrometrije kao šta je već opisano (vidi K. McEachern, et al. J. Gene Med.8 (2006) 719-729; T. Doering, et al., J. Biol. Chem.
274 (1999) 11038-11045; pri čemu su pomenuti radovi ovde uklopljeni referencom). Tkivo je bilo homogenizovano u hloroform:metanolu, 2:1 (v/v), pa inkubirano na 37° C. Primerci su centrifugovani, supernatanti su ekstrahovani sa 0.2 volumena vode preko noći. Primerci su ponovo centrifugovani, vodena faza je odbačena, a organska faza je osušena do filma u azotu.
Za analizu masenom spektrometrijom uz jonizaciju sa elektrosprejom (ESI/MS), tkivni primerci su obnovljeni do ekvivalenta od 50 ng originalne tkivne težine uz pomoć 1 mL
4
hloroform/metanola (2:1, v/v) i vorteksovani tokom 5 min. Alikvoti svakog primerka (40 µL) su stavljeni u posude za potpuno obnavljanje (Waters) pa im je dodano 50 µL internog standarda d3-C16-GL-1 (10 µg/mL) (Matreya, Inc., Pleasant Gap, PA). Primerci su osušeni u azotu i obnovljeni uz pomoć 200 µL DMSO:metanola, 1:4. ESI/MS analiza glikozilkeramida sa različitim dužinama lanaca ugljenika je provedena na aparatu Waters Alliance HPLC (Separation Module 2695) koji je bio spojen na sistem Micromass Quattro Micro opremljen sa jonskim izvorom preko elektrospreja. Dvadeset mikrolitara lipidnog ekstrakta iz primeraka je injektirano u C8 kolonu (4 ml x 3 mm i.d; Phenomenex, Torrance, CA) na 45° C i eluirano u gradijentu od 50-100% acetonitrila (2 mM amonijum acetat, 0.1% formička kiselina) kod 0.5 mL/min. Prvih 0.5 min sve je držano na 50% organsko, a tada prebačeno na 100% tokom poslednjih 3.5 min. Temperatura izvora je držana konstantnom na 150° C, a azot je korišćen kao gas za odstranjivanje rastvarača kod rate protoka od 670 L/h. Kapilarna voltaža je održavana na 3.80 KV sa voltažom konusa od 23 V, dok je vreme boravka za svaku jonsku vrstu bilo 100 ms. Spektari su snimljeni uz pomoć MRM modusa sa ciljem da se prati osam dominantnih izoforma (C16:0, C18:0, C20:0, C22:1. C22:0. C22:1-OH, C24:1 i C24:0). Kvantifikovanje glikozilkeramida se bazira na sumi pomenutih osam izoforma u odnosu na interni standard sa krivom kalibracije koja ima raspon od 0.1 do 10 µg/mL.
Histologija. Za histološku analizu, tkiva su fiksirana u cink formalinu (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) na sobnoj temperaturi tokom 24 h, a tada su uskladištena u PBS na 4° C do sledeće prilike. Svi primerci su dehidrirani u rastućim koncentracijama alkohola, izbistreni u ksilenima i infiltrirani i uklopljeni u Surgipath R parafinu (Surgipath, Richmond, IL). Preseci od pet mikrona su prerezani koristeći rotacioni mikrotom i osušeni u pećnici na 60° C pre bojenja. Presecima je odstranjen parafin koristeći ksilene, pa su rehidrirani u padajućim koncentracijama alkohola nakon čega su isprani u vodi. Nakon 1 min ispiranja sa 3% sirćetnom kiselinom, preseci su obojeni držanjem tokom 40 min u 1% Alcian Blue 8GX (Electron Microscopy Sciences) u 3% sirćetnoj kiselini, pH 2.0. Nakon ispiranja sa vodom i oksidiranja u 1% perjodnoj kiselini tokom 1 min, primerci su obojeni sa Schiff-ovim reagensom (Surgipath) tokom 12 min. Nakon ispiranja sa vrućom vodom tokom 5 min, preseci su dehidrirani u alkoholu i izbistreni u ksilenima pre uklapanja u medijumu za uklapanje SHUR/Mount<™>(TBS, Durham, NC). Gaucher-ove ćelije koje su bile morfološki identifikovane u jetra su kvantifikovane uz pomoć ručnog brojanja ćelija u 10 polja visoke snage (HPF, 400x).
4
Rezultati
Efekt administracije Formule (I) hemitartarata D409V/nul miševima. Procenjen je efekt administriranja Formule (I) hemitartarata D409V/nul miševima. Miševi stari približno 7 meseci su primili 150 mg/kg/danu Formule (I) hemitartarata (doza koja se u preliminarnim studijama pokazala efikasnom u inhibiranju sinteze glikozilkeramida) uz pomoć oralne gavaže tokom 10 sedmica. Ovaj tretman nije delovao na dobrobit ili na prehrambene navike miševa. Merenja njihovih telesnih težina tokom studije nije pokazalo značajno odstupanje od istih kod netretiranih miševa šta je sugerisalo da je Formula (I) hemitartarata bila dobro tolerisana u dozama za koje se zna da efektivno inhibiraju sintazu.
Efikasnost Formule (I) hemitartarata u tretmanu mladih miševa koji ne pokazuju simptome Gaucher-ove bolesti. Formula (I) hemitartarata je procenjena na mogućnost smanjivanja lizosomalne akumulacije glikozilkeramida i pojave Gaucher-ovih ćelija kod mladih (10 sedmica starih) D409V/nul miševa. Ovi mladi miševi sa Gaucher-ovom bolesti pokazuju niske nivoe GL-1 u zahvaćenim tkivima. Životinje stare deset sedmica su primile 75 ili 150 mg/kg/danu Formule (I) hemitartarata uz pomoć oralne gavaže tokom 10 sedmica. Merenja nivoa glikozilkeramida su pokazala smanjivanje zavisno o dozi u odnosu na kontrole iste starosti koje su bile tretirane sa prenosnikom. U grupi koja je bila tretirana sa 150 mg/kg/danu, nivoi glikozilkeramida u jetra, pluća i slezine su bili 60, 40 i 75% manje od onih u kontrola (SL. 6). Značajno manji nivoi glikozilkeramida koji su bili primećeni u jetra i pluća tretiranih D409V/nul miševa pokazuju da je Formula (I) hemitartarata bila efikasna u smanjivanju akumulacije ovog glikosfingolipida u pomenutim tkivima.
Histopatološka evaluacija jetra netretiranih D409V/nul miševa na kraju studije (20 sedmica starosti) pokazala je prisutnost Gaucher-ovih ćelija u jetra. Miševi tretirani sa 150 mg/kg/danu Formule (I) hemitartarata tokom 10 sedmica su pokazali samo sporadično prisustvo Gaucher-ovih ćelija koje su takođe bile ujednačeno manje. Kvantifikacija ovih ćelija u brojnim različitim presecima je potvrdila da je frekvencija Gaucher-ovih ćelija značajno manja kod miševa koji su bili tretirani sa Formulom (I) hemitartarata. Sve zajedno, ovi biohemijski histološki nalazi sugerišu da je dnevna oralna administracija Formule (I) hemitartarata miševima koji ne pokazuju simptome Gaucher-ove bolesti bila efikasna u smanjivanju akumulacije glikozilkeramida u zahvaćenim tkivima i u odnosu na pojavu
4
Gaucher-ovih ćelija u jetra.
Efikasnost Formule (I) hemitartarata u tretmanu starijih miševa sa Gaucher-ovom bolesti i koji pokazuju patološke znakove. Ovde je procenjena efikasnost Formule (I) hemitartarata na zaustavljanje i vraćanje napredovanja bolesti kod miševa sa Gaucher-ovom bolesti koji pokazuju simptome. D409V/nul miševi stari sedam meseci su primili 150 mg/kg/danu Formule (I) hemitartarata uz pomoć oralne gavaže tokom 10 sedmica. Analiza nivoa glikozilkeramida u jetra, pluća i slezini tretiranih miševa 5 i 10 sedmica nakon tretmana je pokazala da nivoi nisu bili veći od onih koji su bili primećeni na početku studije. Nakon 10 sedmica tretmana, nivoi glikozilkeramida su bili 60% niži u jetra, 50% niži u plućima i 40% niži u slezini u odnosu na miševe koji su tretirani samo sa prenosnikom. Ovi rezultati pokazuju da je Formula (I) hemitartarata efikasno inhibirala daljnju akumulaciju glikozilkeramida kod miševa sa postojećim problemom patološkog skladištenja.
Histopatološka analiza tkivnih preseka je pokazala smanjeni broj Gaucher-ovih ćelija u jetra tretiranih D409V/nul miševa u odnosu na netretirane kontrole. Kvantifikovanje broja Gaucher ćelija je potvrdilo biohemijske nalaze; tretirani D409V/nul miševi su pokazivali brojeve Gaucher-ovih ćelija koje se nisu značajno razlikovale od onih sa početka tretmana za obe vremenske tačke, 5 i 10 sedmica. Brojevi Gaucher-ovih ćelija u obe vremenske tačke su značajno niži od onih kod netretiranih D409V/nul miševa. Sve zajedno, ovi podaci pokazuju da Formula (I) hemitartarata efikasno inhibira daljnju akumulaciju glikozilkeramida i pojavu Gaucher-ovih ćelija kod životinja sa već postojećim patološkim znakovima.
Diskusija
Formula (I) hemitartarata je pokazala visok stepen specifičnosti za encim glikozilkeramid sintazu. Takođe, nije primećena merljiva inhibicija delovanja glikocerebrozidaze kod efektivne doze, šta je važno kada se tretiraju pacijenti sa Gaucher-ovom bolesti tipa 1, gde većina njih zadržava rezidualnu aktivnost glikocerebrozidaze. Kod efektivne doze od 150 mg/kg/danu nije primećen vidljiv gastro-intestinalni problem i nije zabeležena razlika u telesnim težinama između tretiranih i kontrolnih netretiranih grupa. Koncentracije seruma do i iznad IC50(24-40 nM) su lako dostižne sa oralnim dozama koje su bile ispod maksimalnog nivoa koje može da se toleriše. Takođe, Formula (I) hemitartarata se lako metabolizuje i nestaje: parentno jedinjenje i metaboliti se efikasno gube tokom 24 h kao šta je pokazano kod
4
pojedinačnih i ponovljenih doza tokom ADME studija kod pacova i pasa sa jedinjenjem koje je bilo označeno sa<14>C.
Korišćenje ne-optimiziovanog doznog režima sa pojedinačnom dnevnom oralnom gavažom je uspešno sprečilo akumulaciju glikozilkeramida kod mladih miševa sa Gaucher-ovom bolesti bez simptoma i kod starijih miševa sa Gaucher-ovom bolesti koji su već patili od patološke akumulacije. Mladi miševi, u dobi od 10 sedmica, mada su pokazivali povećane nivoe glikozilkeramida u odnosu na kontrole divljeg tipa, nisu razvili karakteristične udebljane tkivne makrofage, poznate pod imenom Gaucher-ove ćelije. Tretman sa 150 mg/kg/danu Formule (I) hemitartarata je izlečio svako merivo napredovanje bolesti i inhibirao pojavu Gaucher-ovih ćelija. Kod starijih miševa koji su pokazivali viši nivo lizosomalnog glikozilkeramida i brojne Gaucher-ove ćelije, nije bilo daljnjeg povećanja nivoa glikosfingolipida ili broja ćelija za skladištenje nakon tretmana od 5 ili 10 sedmica. Budući se čini da je glavni izvor glikozilkeramida u Gaucher-ovim ćelijama vanćelijskog porekla, ovi rezultati pokazuju da je inhibicija sinteze glikozilkeramida sa Formulom (I) hemitartarata bila sistemska.
Opservacija da je Formula (I) hemitartarata bila efektivna u sprečavanju daljnje akumulacije glikozilkeramida sugeriše terapeutsku strategiju koja može dodatno da ubrza tretman Gaucher-ove bolesti.
Sumarno, podaci koji su ovde prezentovani pokazuju da je Formula (I) hemitartarata aktivni i specifični inhibitor glikozilkeramid sintaze koja ne pokazuje negativne efekte u mišjem modelu Gaucher-ove bolesti. Uspešno je sprečila napredovanje bolesti kod mladih miševa sa Gaucher-ovom bolesti koji ne pokazuju simptome, ali i kod starijih miševa sa Gaucher-ovom bolesti inhibirajući akumulaciju glikozilkeramida i pojavu Gaucher-ovih ćelija. Ovi nalazi sugerišu da Formula (I) hemitartarata može da predstavlja još jednu terapeutsku opciju za pedijatrijsku i odraslu Gaucher-ovu bolest tipa 1, a potencijalno i za druge poremećaje skladištenja glikosfingolipida.
Primer 9: Faza 2 kliničkog ispitivanja Formule (I) hemitartarata
Postupci. Ovo kliničko ispitivanje Formule (I) hemitartarata, koja se daje dva puta na dan oralno u dozama od 50 ili 100 mg, obuhvatilo je 26 odraslih osoba sa Gaucher-ovom bolesti tipa 1 (GD1) (16Ž:10M; srednja starost je 34 godine, a raspon je 18-60; svi su bili belci) na 7 mesta u 5 zemalja. Očekuje se da pacijenti pate od splenomegalije (volumen 10 od normale) i trombocitopenije (krvne pločice 45,000-100,000/mm<3>) ili anemije (hemoglobin 8-10 g/dl, žene; 8-11 g/dl, muškarci). Niti jedna osoba nije bila podvrgnuta terapiji zamene encima ili terapiji smanjivanja supstrata u prethodnih 12 meseci. Krajnja tačka kompozitne primarne efikasnosti je nivo globina (+0.5 g/dl) ili broj krvnih pločica (+15%) nakon 52 sedmica tretmana. Volumen jetra, hitotriozidaza, glikozilkeramid su takođe procenjeni. Pacijenti su bili tretirani i posmatrani tokom dužeg vremenskog perioda.
Rezultati. Podaci za 52. sedmicu su bili dostupni za najviše 20 pacijenata; 4 pacijenta su se povukla pre vremena, a 2 su nastavila tretman. Kompozitna primarna krajnja tačka je bila postignuta kod 19 od 20 pacijenata. Srednja promena (1SD) od osnovne linije za 52. sedmicu je: hemoglobin 1.6 (11.35) g/dL; broj krvnih pločica 43.6% (137.59%); volumen slezine i jetra (višestruka razlika od normale) 40.2% (110.44%) i 15.8% (110.39%); a hitotriozidaza 49.9% (120.75%). Nivoi glikozilkeramida u plazmi su se normalizovali nakon 4 sedmice kod svih pacijenata, Formula (I) hemitartarata je bila dobro tolerisana uz prihvatljiv bezbednosni profil. Bilo je prijavljeno sedam otkrivenih negativnih događaja kod 6 pacijenata navodno povezanih sa tretmanom; svi su bili blagi i prolazni.
Primer 10: Farmaceutska kompozicija Formule (1) hemitartarata, kapsule od 100 mg Postupak za pripremu kapsula od 100 mg: Formula (I) hemitartarata, mikrokristalna celuloza, laktoza monohidrat i hipromeloza, E15 su odvojeno protisnuti kroz sito sa otvorima veličine 20. Količine pomenutih sastojaka su navedene u Tabeli 9 gde su prikazani kao smeša koja je nastala u krupnom granulatoru tokom devet do dvanaest min.
1
Tabela 9. Farmaceutska formulacija za kapsule od 100 mg.
Pomenuti sastojci su bili vlažno granulirani uz pomoć dodavanja prečišćene vode (2.2 kg; 11.7% suve težine sastojaka) u posudu granulatora do završetka procesa, šta se potvrđuje vizualno. Vlažno granulirana materija je izlivena iz posude kroz mlin sa rotirajućim impelerom. Vlažno granulirana materija je tada osušena direktnim grejanjem u statičkoj, krutoj, ravnoj suvoj pećnici na 50±5° C do postizanja vlažnosti od najviše 3.5%, šta je potvrđeno proverom tokom samog procesa. Suve granule su tada propuštene kroz mlin, a nastale granule su prenesene u V-blender. Dodan je gliceril behenat (0.2 kg) u V-blender, a konačna smeša je bila mešana do postizanja uniformnosti, kao šta je određeno uz pomoć testa uniformnosti smeše (in-line ili off-line), tipično tokom deset do dvanaest min. Konačna smeša je kapsulirana u kapsulama veličine #2 uz pomoć polu-automatskog punjača kapsula do postizanja približne težine punjenja (270 mg u proseku), a tako pripremljene kapsule su bile obrisane od praha pre pakovanja.
2
Primer 11A: Farmaceutska kompozicije Formule (I) hemitartarata, kapsule od 10 mg Postupak pripreme kapsula od 10 mg: Korišćena je procedura iz Primera 10 sve do koraka kapsuliranja. Sa ciljem da se proizvedu kapsule od 10 mg, konačna smeša je kapsulirana u kapsulama veličine #4 ili #5 uz pomoć aparata za punjenje kapsula do postizanja približne težine punjenja (27 mg u proseku), a napunjene kapsule su bile očišćene od praha pre pakovanja.
Primer 11B: Farmaceutska kompozicija Formule (I) hemitartarata, kapsule od 50 mg Postupak za pripremu kapsula od 50 mg: Korišćena je procedura iz Primera 10 sve do koraka kapsuliranja. Sa ciljem da se proizvedu kapsule od 50 mg, konačna smeša je kapsulirana u kapsule veličine #3 uz pomoć aparata za punjenje kapsula do postizanja približne težine punjenja (135 mg u proseku), a konačne kapsule su bile obrisane od praha pre pakovanja.
Primer 11C: Farmaceutska kompozicija Formule (I) hemitartarata, kapsule od 150 mg Postupak za pripremu kapsula od 150 mg: Korišćena je procedura iz Primera 10 sve do koraka kapsuliranja. Sa ciljem da se proizvedu kapsule od 150 mg, konačna smeša je kapsulirana u kapsule veličine #0 uz pomoć aparata za punjenje kapsula do postizanja približne težine punjenja (405 mg u proseku), a konačne kapsule su bile obrisane od praha pre pakovanja.
Primer 12: Farmaceutska kompozicija Formule (I) hemitartarata, kapsule od 25 mg Postupak za pripremu kapsula od 25 mg: Korišćena je procedura iz Primera 10 sve do koraka kapsuliranja. Sa ciljem da se proizvedu kapsule od 25 mg, konačna smeša je kapsulirana u kapsule veličine #4 uz pomoć aparata za punjenje kapsula do postizanja približne težine punjenja (67.5 mg u proseku), a konačne kapsule su bile obrisane od praha pre pakovanja.
Primer 13: Interakcije Formule (I) hemitartarata sa lekovima - CYP2D6 inhibitori Provedena je studija sa ciljem da se proceni farmakokinetika, bezbednost i tolerabilnost višestrukih doza Formule (I) hemitartarata (100 mg BID) koja je administrirana sa i bez paroksetina (30 mg jednom na dan) (potentan inhibitor CYP2D6). Ovo je bila studija tipa „open-label fixed-sequence“ koja je provedena na 36 zdravih subjekata (17 muškaraca i 19 žena). Sekundarni ciljevi su bili da se proceni PK paroksetina u kombinaciji sa višestrukim dozama Formule (I) hemitartarata (100 mg BID) kod zdravih subjekata i da se dodatno proceni PK kada se Formula (I) hemitartarata administrira kao višestruka doza u odnosu na slučaj kada se Formula (I) hemitartarata administrira kao jednostruka doza.
Srednji PK parametri slobodne baze Formule (I) hemitartarata, kao šta postoji u plazmi, su nelinearni i pokazuju 2-kratnu akumulaciju u AUC i Cmakskod ponovljene administracije (100 mg BID) u odnosu na administraciju pojedinačne doze. Uporedna administracija Formule (I) hemitartarata i paroksetina rezultuje u 7-kratni porast Cmaksi 9-kratni porast u AUC u odnosu na višestruku administraciju samo Formule (I) hemitartarata. Ovi rezultati pokazuju da paroksetin može da inhibira metabolizam Formule (I) hemitartarata i da poveća koncentracije leka u plazmi. Slični efekti su očekivani sa drugim potentnim CYP2D6 inhibitorima (na primer, fluoksetin i hinidin), a pažljivo praćenje nivoa leka u plazmi i potencijalna podešavanja doze su neophodni kada se Formula (I) hemitartarata koadministrira sa lekom za kojeg se zna da je potentni CYP2D6 inhibitor. Koncentracije paroksetina su bile oko 1.5- do 2-puta veće od očekivanih šta sugeriše da je Formula (I) hemitartarata ili jedan od njenih metabolita blagi inhibitor CYP2D6.
Primer 14: Interakcije Formule (I) hemitartarata sa lekovima - CYP3A4 inhibitori i pglikoprotein (PGP) inhibitori
Provedena je studija sa ciljem da se proceni farmakokinetika, bezbednost i tolerabilnost višekratnih doza Formule (I) hemitartarata (100 mg dva puta dnevno) sa ili bez višekratnih doza ketokonazola (400 mg jednom dnevno) kod zdravih muškaraca i žena. Ovo je bila studija tipa „open-label fixed-sequence“ koja je provedena na 36 zdravih subjekata (18 muškaraca i žena) i koja je obuhvatala 3 perioda koji su uključivali administraciju pojedinačne doze od 100 mg Formule (I) hemitartarata, administraciju višekratne doze Formule (1) hemitartarata i uporednu administraciju 100 mg Formule (I) hemitartarata (dva puta dnevno) sa 400 mg ketokonazola (jednom dnevno). Ponovljena administracija Formule (I) hemitartarata i ketokonazola, jakog inhibitora citohrom p450 3A4 ("CYP 3A4") i pglikoproteina, rezultuje u 4-kratni porast izlaganja slobodne baze Formule (I) hemitartarata, kao šta postoji u plazmi kod početnog stanja. Tako, pacijenti koji su već primali Formulu (I) hemitartarata mogu da imaju potrebu od smanjivanja doze dok su na uporednoj terapiji sa jakim inhibitorima CYP 3A4 ili p-glikoproteina.
4
Primer 15 – Studije stabilnosti formulacije sa Formulom (I) hemitartarata Smeše su pripremljene uz pomoć mešanja Formule (I) hemitartarata i ekscipijenata (Laktoza monohidrat za kapsuliranje, Avicel PH 301 (Mikrokristalna celuloza) i Metocel E15 Prem LV (Hidroksipropilmetilceluloza) u scintilacijskoj boci na skali od oko dva grama. Smeši je dodano 15.6% vode pa je mešana da se vlažne granule ugreju. Vlažne granule su prosejane kroz sito sa porama veličine #10 (otvori od 2000 mikrona). Prosejane granule su tada osušene u pećnici na 50° C tokom 2 h. Osušene granule su prosejane uz pomoć sita veličine #18 (otvori od 1000 mikrona). Smeši su dodani lubrikant, gliceril behenat pa je mešana sa ciljem da se formira konačna smeša. Pripremljene smeše su prikazane u tabeli ispod:
Tabela
Sedam formulacija smeša, koje su imale različite omer API:laktoza:Avice1 (navedeni malopre), su izloženi visokoj temperaturi od 85° C tokom 3 dana (uslovi za istraživanje nametnute degradacije) sa ciljem da se utvrdi stopa degradacije i stabilnost svake formulacije. Ovi ubrzani uslovi su izabrani na bazi rezultata studije koja je pokazala da je stepen degradacije produkata sa 50 mg leka tokom 24 meseci bio sličan onom koji je dobiven na 85° C tokom 3 dana.
Istraživanje nametnute degradacije je provedeno uz pomoć gradijenta u HPLC sa reverznom fazom pri čemu je korišćena C18 kolona (Waters T3, 3 µm, 100 x 4.6 mm), a mobilne faze su se sastojale od vode i acetonitrila sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom (TFA), UV detekcija na 280 nm, temperatura kolone je bila 40° C, a rata protoka je bila 2 mL/min. Gradijent je započeo zaustavljanjem kod 5% B (acetonitril i 0.1% TFA) tokom 0.5 min, a tada je usledilo povećanje organske komponente kod 4.83% B po min najviše tokom 15 min.
Ukupni degradanti za svaku formulaciju smeše su sažeti i prikazani kao funkcija omera API:Laktoza:Avicel, a rezultati su prikazani na SLICI 15. Rezultati studije sugerišu da dok je omer API i Laktoze održavan konstantnim, smanjivanje količine avicela se pokazalo korisnim za poboljšanje stabilnosti formulacije. Kada se avicel odstrani, formulacija ima omer API:Laktoza:Avicel od 1:2.1:0, i tada je najstabilnija. Kada se odstrani laktoza, formulacija ima omer API:Laktoza:Avicel od 1:0:2.1, ali ova formulacija nije najmanje stabilna u odnosu na ostale omere. Kombinovani podaci sugerišu da laktoza stabilizuje formulaciju, dok avicel destabilizuje formulaciju. Međutim, kada su oba eksipijenta prisutna, međusobno reaguju. Ovaj omer mora da se podesi sa ciljem da se dobije stabilna formulacija.
Kod aktivnih farmaceutskih sastojaka poput Formule (I) hemihidrata koja je rastvorljiva u vodi, mikrokristalna celuloza pomaže da se formiraju granule tokom vlažne granulacije upravo zbog rastvorljivosti u vodi. Ako se mikrokristalna celuloza ne koristi, izražena promena se pojavljuje na prelazu između granuliranog stanja u formu paste. Forma paste je bila teška za rukovanje, a nastale čestice nakon sušenja nisu imale prikladnu mehaničku jačinu i raspored čestičnih veličina. Farmaceutska kompozicija koja je sadržavala 37 wt% Formule (I) hemitartarata, 41.0 wt% filera koji je rastvorljiv u vodi; 16.7 wt% filera koji nije rastvorljiv u vodi, 2 wt% do oko 6 wt% veznika; i oko 0.1 wt% do oko 2 wt% lubrikanta, svi na bazi suvih krutih materija, je pokazala najbolji profil stabilnosti u odnosu na količinu nastalih degradanata.

Claims (24)

  1. Patentni zahtevi 1. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži hemitartaratnu so jedinjenja koje je predstavljeno sa sledećom strukturnom formulom:
    i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, pri čemu je najmanje 70% (po težini) soli kristalno.
  2. 2. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 1, naznačena time, što najmanje 70% (po težini) pomenute soli je monokristalni oblik.
  3. 3. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 1 ili Zahteva 2, naznačena time, što najmanje 99% (po težini) same soli je kristalno.
  4. 4. Farmaceutska kompozicija iz bilo kojeg od Zahteva 1 do 3, naznačena time, što najmanje 99% (po težini) same soli je monokristalni oblik.
  5. 5. Farmaceutska kompozicija iz bilo kojeg od Zahteva 1 do 4, naznačena time što je hemitartaratna so je izabrana iz D-hemitartarata, L-hemitartarata, hemimezotartarne kiseline ili racemskog D,L-hemitartarata.
  6. 6. Farmaceutska kompozicija iz bilo kojeg od Zahteva 1 do 5, naznačena time, što pomenuta hemitartaratna so je L-hemitartarat.
  7. 7. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 2 ili Zahteva 4, naznačena time, što najmanje 70% (po težini) same soli je u formi pojedinačnog tipa kristala, Forma A.
  8. 8. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 2 ili Zahteva 4, pri čemu je pojedinačna kristalna forma naznačena time što: (a) najmanje jedna glavna lenta prelamanja x-zrake na prahu ima 2θ ugao od 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9° ili 21.7°; (b) najmanje dvije glavne lente prelamanja x-zrake na prahu imaju 2θ uglove od 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9° i 21.7°; (c) najmanje tri glavne lente prelamanja x-zrake na prahu imaju 2θ uglove od 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9° i 21.7°; (d) najmanje četiri glavne lente prelamanja x-zrake na prahu imaju 2θ uglove od 5.1 °, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9° i 21.7°; ili (e) glavne lente prelamanja x-zrake na prahu imaju 2θ uglove od 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9° i 21.7°.
  9. 9. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 2 ili Zahteva 4, pri čemu je pojedinačna kristalna forma naznačena time što se lente prelamanja x-zrake na prahu nalaze kod sledećih 2θ uglova: 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 13.3°, 15.1°, 15.9°, 16.5°, 17.6°, 18.6°, 18.7°, 19.0°, 20.2°, 21.7° i 23.5°.
  10. 10. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 2 ili Zahteva 4, pri čemu je pojedinačna kristalna forma naznačena time što ima difrakcijski profil x-zrake na prahu koji je prikazan na SL.1.
  11. 11. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži: • hemitartaratnu so kao šta je definisano u bilo kojem od Zahteva 1 do 10; • najmanje jedan filer koji se rastvara u vodi; • najmanje jedan filer koji se ne rastvara u vodi; • najmanje jedan veznik; i • najmanje jedan lubrikant.
  12. 12. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 11, naznačena time, što je: (a) pomenuti filer koji se rastvara u vodi izabran iz grupe koja obuhvata bezvodnu laktozu, laktozu monohidrat, manitol, natrijum hlorid, šećer u prahu, sorbitol, saharozu, inozitol i skrob u želatinu; (b) pomenuti filer koji se ne rastvara u vodi izabran iz grupe koja obuhvata mikrokristalnu celulozu, kalcijum fosfat i skrob; (c) pomenuti veznik izabran iz grupe koja obuhvata skrob u želatinu, natrijum karboksimetil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metil celulozu, polivinil pirolidon, kopolividon, želatin, prirodne gume, skrobnu pastu, saharozu, sirup od kukuruza, polietilen glikole i natrijum alginat; ili (d) pomenuti lubrikant izabran iz grupe koja obuhvata hidrogenovano biljno ulje, kalcijum stearat i gliceril behenat.
  13. 13. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 11, naznačena time, što je: • pomenuti filer koji se rastvara u vodi izabran iz grupe koja obuhvata bezvodnu laktozu, laktozu monohidrat, manitol, natrijum hlorid, šećer u prahu, sorbitol, saharozu, inozitol i skrob u želatinu; • pomenuti filer koji se ne rastvara u vodi izabran iz grupe koja obuhvata mikrokristalnu celulozu, kalcijum fosfat i skrob; • pomenuti veznik izabran iz grupe koja obuhvata skrob u želatinu, natrijum karboksimetil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metil celulozu, polivinil pirolidon, kopolividon, želatin, prirodne gume, skrobnu pastu, saharozu, kukuruzni sirup, polietilen glikole i natrijum alginat; i • pomenuti lubrikant izabran iz grupe koja obuhvata hidrogenovano biljno ulje, kalcijum stearat i gliceril behenat.
  14. 14. Farmaceutska kompozicija iz Zahteva 13, naznačena time, što ista sadrži: (a) 26 wt% do 50 wt% filera, koji se rastvara u vodi, na bazi suvih krutih materija; (b) 8 wt% do 32 wt%, 8 wt% do 24 wt% ili 12 wt% do 20 wt% filera, koji se ne rastvara u vodi, na bazi suvih krutih materija; (c) 2 wt% do 6 wt% veznika na bazi suvih krutih materija; ili (d) 0.1 wt% do 2 wt% lubrikanta na bazi suvih krutih materija.
  15. 15. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 13, naznačena time, što pomenuta sadrži 14 wt% do 18 wt% filera, koji se ne rastvara u vodi, na bazi suvih krutih materija.
  16. 16. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 13, naznačena time, što pomenuta sadrži: • 35 wt% do 40 wt% hemitartaratne soli; • 26 wt% do 50 wt% filera koji se rastvara u vodi; • 8 wt% do 32 wt% filera koji se ne rastvara u vodi; • 2 wt% do 6 wt% veznika; i • wt% do 2 wt% lubrikanta, sve na bazi suvih krutih materija.
  17. 17. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 13, naznačena time, što: • filer koji se rastvara u vodi je laktoza monohidrat; • filer koji se ne rastvara u vodi je mikrokristalna celuloza; • veznik je hidroksipropil metilceluloza; a • lubrikant je gliceril behenat.
  18. 18. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 13, naznačena time, što pomenuta sadrži: • 35 wt% do 40 wt% hemitartaratne soli; • 26 wt% do 50 wt% laktoze monohidrata; • 8 wt% do 32 wt% mikrokristalne celuloze; • 2 wt% do 6 wt% hidroksipropil metilceluloze; i • wt% do 2 wt% gliceril behenata, sve na bazi suvih krutih materija.
  19. 19. Hemitartaratna so, naznačena time, što je definisana u bilo kojem od Zahteva 1 do 10.
  20. 20. Hemitartaratna so u skladu sa Zahtevom 19, naznačena time, što se upotrebljava u tretmanu Gaucher-ove bolesti.
  21. 21. Hemitartaratna so u skladu sa Zahtevom 19, naznačena time, što se upotrebljava za tretman Fabry-eve bolesti.
  22. 22. Hemitartaratna so u skladu sa Zahtevom 19, naznačena time, što se upotrebljava za inhibiranje sinteze glikozilkeramida ili za smanjivanje koncentracija glikosfingolipida u subjektu u potrebi.
  23. 23. Hemitartaratna so za upotrebu u skladu sa bilo kojem od zahteva od Zahteva od 20 do 22, naznačena time, što se pomenuta so administrira preko dve dnevne doze od 25 miligrama do 200 miligrama.
  24. 24. Hemitartaratna so za upotrebu u skladu sa bilo kojem od Zahteva od 20 do 22, naznačena time, što se pomenuta so administrira preko dve dnevne doze od 50 miligrama. 1
RS20140446A 2009-11-27 2010-11-24 Amorfna i kristalna forma genz 112638 hemitartarata kao inhibitor glikozilkeramid sintaze RS53503B2 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26474809P 2009-11-27 2009-11-27
EP10785289.9A EP2504332B2 (en) 2009-11-27 2010-11-24 An amorphous and a crystalline form of genz 112638 hemitartrate as inhibitor of glucosylceramide synthase
PCT/US2010/057952 WO2011066352A1 (en) 2009-11-27 2010-11-24 An amorphous and a crystalline form of genz 112638 hemitartrat as inhibitor of glucosylceramide synthase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS53503B1 RS53503B1 (sr) 2015-02-27
RS53503B2 true RS53503B2 (sr) 2021-07-30

Family

ID=43431870

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20140446A RS53503B2 (sr) 2009-11-27 2010-11-24 Amorfna i kristalna forma genz 112638 hemitartarata kao inhibitor glikozilkeramid sintaze
RS20160645A RS54978B1 (sr) 2009-11-27 2010-11-24 Genz 112638 za lečenje gošeove ili fabrijeve bolesti u kombinacionoj terapiji
RS20191404A RS59543B1 (sr) 2009-11-27 2010-11-24 Eliglustat (genz 112638) kao inhibitor glukozikleramid sintaze za upotrebu u metodi lečenja fabrijeve ili gošeove bolesti, metoda obuhvata podešavanje pojedinačne terapeutske doze metabolizmu p-450 kod pacijenta

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160645A RS54978B1 (sr) 2009-11-27 2010-11-24 Genz 112638 za lečenje gošeove ili fabrijeve bolesti u kombinacionoj terapiji
RS20191404A RS59543B1 (sr) 2009-11-27 2010-11-24 Eliglustat (genz 112638) kao inhibitor glukozikleramid sintaze za upotrebu u metodi lečenja fabrijeve ili gošeove bolesti, metoda obuhvata podešavanje pojedinačne terapeutske doze metabolizmu p-450 kod pacijenta

Country Status (40)

Country Link
US (6) US11458119B2 (sr)
EP (5) EP2504332B2 (sr)
JP (6) JP2013512252A (sr)
KR (6) KR20200013105A (sr)
CN (5) CN112521366A (sr)
AR (3) AR079152A1 (sr)
AU (3) AU2010324810B2 (sr)
BR (1) BR112012012947B8 (sr)
CA (3) CA3140959A1 (sr)
CL (2) CL2012001348A1 (sr)
CR (1) CR20120277A (sr)
CY (3) CY1115880T1 (sr)
DK (3) DK2796457T3 (sr)
DO (2) DOP2012000141A (sr)
EA (3) EA029990B1 (sr)
EC (2) ECSP12011926A (sr)
ES (4) ES2586947T3 (sr)
GT (1) GT201200161A (sr)
HR (3) HRP20140780T4 (sr)
HU (2) HUE045784T2 (sr)
IL (4) IL310635A (sr)
LT (2) LT2796457T (sr)
MA (1) MA33838B1 (sr)
ME (1) ME02477B (sr)
MX (2) MX381242B (sr)
MY (2) MY192644A (sr)
NI (1) NI201200096A (sr)
NZ (3) NZ600155A (sr)
PE (2) PE20121337A1 (sr)
PH (2) PH12015502514B1 (sr)
PL (4) PL3599237T3 (sr)
PT (4) PT2796457T (sr)
RS (3) RS53503B2 (sr)
SG (2) SG10201407881WA (sr)
SI (3) SI2796457T1 (sr)
SM (1) SMT201600273B (sr)
TN (1) TN2012000237A1 (sr)
TW (3) TWI586663B (sr)
UA (1) UA113491C2 (sr)
WO (1) WO2011066352A1 (sr)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8889127B2 (en) 2004-07-01 2014-11-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Targeted protein replacement for the treatment of lysosomal storage disorders
SI2796457T1 (sl) 2009-11-27 2016-10-28 Genzyme Corporation Genz 112638 za zdravljenje Gaucherjeve ali Fabryjeve bolezni v kombinirani terapiji
CN103764824B (zh) * 2011-06-20 2018-04-24 西奈山医学院 粘多糖贮积症和其它溶酶体病症的抗TNF-α疗法
SI2753346T1 (sl) 2011-09-07 2020-09-30 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidaza in diferenciacija celic
WO2013078413A1 (en) * 2011-11-22 2013-05-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modulators of lipid storage
LT2854910T (lt) 2012-06-01 2020-05-25 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Ceramido lygiai infekcijos gydymo ir prevencijos metu
HUE046113T2 (hu) 2013-03-14 2020-02-28 Icahn School Med Mount Sinai Terápiás sav ceramidáz készítmények és azok elõállítási és felhasználási eljárásai
US10227323B2 (en) * 2013-09-20 2019-03-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Glucosylceramide synthase inhibitors for the treatment of diseases
EP3164128A4 (en) * 2014-07-03 2018-02-28 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Amorphous form of eliglustat hemitartarate
ES2716420T3 (es) 2015-04-14 2019-06-12 Sandoz Ag Clorhidrato de eliglustat cristalino
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
MX2018006250A (es) 2015-11-18 2018-09-05 Genzyme Corp Biomarcador de enfermedad poliquistica renal y usos del mismo.
MX381953B (es) 2016-02-25 2025-03-13 Asceneuron S A Sales de derivados de piperazina obtenidas por adicion de acidos.
CN107445938B (zh) * 2016-05-31 2020-04-03 北京启慧生物医药有限公司 依利格鲁司他半酒石酸盐的结晶形式、制备方法和含有所述结晶形式的药用组合物
CN106349210A (zh) * 2016-08-24 2017-01-25 北京阳光诺和药物研究有限公司 一种制备酒石酸艾力骨司坦的方法
EP3318277A1 (en) 2016-11-04 2018-05-09 Institut du Cerveau et de la Moelle Epiniere-ICM Inhibitors of glucosylceramide synthase for the treatment of motor neuron diseases
WO2018193090A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Amneal Pharmaceuticals Company Gmbh Process for preparation of eliglustat hemitartrate and intermediates thereof
ZA201803719B (en) 2017-06-05 2019-04-24 Cipla Ltd Stable solid dispersions of eliglustat hemitartrate
JP7045726B2 (ja) 2017-06-16 2022-04-01 ベータ ファーマ，インコーポレイテッド Ｎ－（２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）－４－メトキシ－５－（（４－（１－メチル－１ｈ－インドール－３－イル）ピリミジン－２－イル）アミノ）フェニル）アクリルアミドおよびその塩の医薬品製剤
US12472144B2 (en) * 2017-08-08 2025-11-18 Amneal Pharmaceuticals Llc Pharmaceutical composition comprising eliglustat
WO2019030645A1 (en) 2017-08-08 2019-02-14 Kashiv Pharma Llc Pharmaceutical composition comprising eliglustat
AU2018386182B2 (en) 2017-12-15 2024-03-28 Genzyme Corporation Methods for treating Gaucher disease
US12064414B2 (en) 2017-12-20 2024-08-20 Aizant Drug Research Solutions Private Limited. Stable amorphous Eliglustat premix and process for the preparation thereof
US11760741B2 (en) 2018-05-02 2023-09-19 Kashiv Biosciences, Llc Pro-drugs of eliglustat
US20210113703A1 (en) * 2018-05-27 2021-04-22 Bioasis Technologies Inc. Treatment of gaucher disease
CN110878079A (zh) * 2018-12-31 2020-03-13 北京启慧生物医药有限公司 一种高纯度依利格鲁司他的制备方法
IL309862A (en) * 2021-07-05 2024-02-01 Ferrer Int Medicines that include glycosidase inhibitors
CN116120274A (zh) 2021-11-12 2023-05-16 曙方(上海)医药科技有限公司 依利格鲁司他可药用盐及其晶型

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8311286D0 (en) 1983-04-26 1983-06-02 Searle & Co Carboxyalkyl peptide derivatives
DE3522475A1 (de) 1985-06-22 1987-01-02 Kali Chemie Pharma Gmbh Neue aromatische verbindungen, ihre herstellung und verwendung
US5041441A (en) 1988-04-04 1991-08-20 The Regents Of The University Of Michigan Method of chemotherapy using 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol
ZA929008B (en) 1991-12-13 1993-05-21 Bristol Myers Squibb Co Piperazinyl- and piperidinyl-cyclohexanols.
US5302609A (en) 1992-12-16 1994-04-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diabetic nephropathy
US5399567A (en) 1993-05-13 1995-03-21 Monsanto Company Method of treating cholera
NZ269847A (en) 1993-08-13 1996-11-26 Seikagaku Kogyo Co Ltd 2-alkylamino-3-morpholino-1-propanol derivative in a composition for neuronal disease treatment
US6309823B1 (en) 1993-10-26 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same
AU691886B2 (en) 1994-02-02 1998-05-28 Transave, Inc. Pharmaceutically active compounds and liposomes, and methods of use thereof
CA2192555C (en) 1994-06-10 2005-01-11 Jinichi Inokuchi 2-acylaminopropanol compound and medicinal composition
FR2734819B1 (fr) 1995-05-31 1997-07-04 Adir Nouveaux composes de la piperazine, de la piperidine et de la 1,2,5,6-tetrahydropyridine, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant
US6255336B1 (en) 1995-09-20 2001-07-03 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US20030073680A1 (en) 1995-09-20 2003-04-17 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
WO1997010817A1 (en) 1995-09-20 1997-03-27 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
WO2001004108A1 (en) 1999-07-09 2001-01-18 Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
JP3993908B2 (ja) 1995-12-08 2007-10-17 生化学工業株式会社 アミノアルコール誘導体及び該誘導体の製造方法
NO965193L (no) 1995-12-08 1997-06-09 Seikagaku Kogyo Kk Seikagaku C Aminalkoholderivat og fremgangsmåte for fremstilling derav
JP4140984B2 (ja) 1995-12-20 2008-08-27 生化学工業株式会社 分化誘導作用を有する薬剤
US5972928A (en) 1997-05-21 1999-10-26 Johns Hopkins University Methods for treatment of conditions associated with lactosylceramide
JP4036500B2 (ja) 1997-05-23 2008-01-23 生化学工業株式会社 アミノアルコール誘導体及びそれを含有する医薬
JP4176170B2 (ja) 1997-06-06 2008-11-05 生化学工業株式会社 アミノアルコール誘導体を含む医薬及び異常増殖性疾患治療薬
US6465488B1 (en) 1997-12-11 2002-10-15 Chancellor, Masters & Scholars Of The University Of Oxford Inhibition of glycolipid biosynthesis
EP1098642B1 (en) 1998-07-27 2007-04-04 Johns Hopkins University Diamino-propanol-compounds for treating ischemia
US6610703B1 (en) 1998-12-10 2003-08-26 G.D. Searle & Co. Method for treatment of glycolipid storage diseases
JP2003521479A (ja) * 1999-07-09 2003-07-15 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン アミノセラミド様化合物および治療目的での使用方法
EP1384719A1 (en) 1999-07-09 2004-01-28 The Regents of The University of Michigan Inhibitors of the glucosyl ceramide synthase enzyme useful for the treatment of cancers, sphingolipidosis and microbial infections
AU2930501A (en) * 2000-01-07 2001-07-24 Transform Pharmaceuticals, Inc. High-throughput formation, identification, and analysis of diverse solid-forms
US6977723B2 (en) 2000-01-07 2005-12-20 Transform Pharmaceuticals, Inc. Apparatus and method for high-throughput preparation and spectroscopic classification and characterization of compositions
CZ20023775A3 (cs) 2000-04-24 2003-10-15 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Zolpidem hemitartrát
US6436987B1 (en) 2000-06-08 2002-08-20 Pfizer Inc. Crystalline forms of (3S-trans)-2-[3,4-dihydro-4-hydroxy-3-(phenylmethyl)-2H-1-benzopyran-7-yl]-4-(trifluoromethyl)-benzoic acid
US20040260099A1 (en) 2001-01-10 2004-12-23 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US7148251B2 (en) 2001-01-10 2006-12-12 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
EP1358172B1 (en) 2001-01-10 2009-11-18 The Regents of The University of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US20020198240A1 (en) 2001-01-10 2002-12-26 Shayman James A. Amino ceramide - like compounds and therapeutic methods of use
BR0116803A (pt) * 2001-01-18 2004-02-17 Merck Patent Gmbh Proteìnas de fusão bifuncionais com atividade de glicocerebrosidase
CA2453978C (en) 2001-07-16 2011-10-11 Genzyme Corporation Synthesis of udp-glucose: n-acylsphingosine glucosyltransferase inhibitors
EP1281755A3 (en) 2001-07-31 2003-06-18 Pfizer Products Inc. Variants of the human cyp2d6 gene
ATE539062T1 (de) 2001-08-08 2012-01-15 Tobira Therapeutics Inc Bizyklishe verbindung, ihre herstellung und verwendung
US7893101B2 (en) 2002-03-20 2011-02-22 Celgene Corporation Solid forms comprising (+)-2-[1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-methylsulfonylethyl]-4-acetylaminoisoindoline-1,3-dione, compositions thereof, and uses thereof
US20060217560A1 (en) 2002-04-29 2006-09-28 Shayman James A Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US6916802B2 (en) 2002-04-29 2005-07-12 Genzyme Corporation Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
EP2011489A3 (en) 2002-07-09 2009-04-22 Roberta Gottlieb Method to inhibit ischemia and reperfusion injury
US20050032070A1 (en) 2003-08-05 2005-02-10 Sebastian Raimundo Polymorphisms in the human gene for CYP2D6 and their use in diagnostic and therapeutic applications
WO2005070938A1 (en) * 2004-01-27 2005-08-04 Synthon B.V. Stable salts of olanzapine
CA2580537C (en) 2004-09-17 2015-04-21 University Of Massachusetts Compositions and their uses for lysosomal enzyme deficiencies
CA2582022C (en) 2004-09-30 2021-05-18 Vanda Pharmaceuticals, Inc. Methods for the administration of iloperidone
MX2007004514A (es) 2004-10-13 2007-05-09 Pharmacia & Upjohn Co Llc Formas cristalinas de 3-[5-cloro-4-[(2,4-difluorobencil)oxi]-6 oxopirimidin-1(6h)-il]-n-(2-hidroxetil)-4-metilbenzamida.
US8003617B2 (en) 2004-11-10 2011-08-23 Genzyme Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US20070088082A1 (en) * 2005-09-28 2007-04-19 Judith Aronhime Polymorphic forms of ladostigil tartrate
CA2624340A1 (en) * 2005-10-03 2007-04-12 Mallinckrodt Inc. Process for preparing zolpidem hemitartrate and tartrate polymorphs
MX2007016179A (es) 2006-04-17 2008-03-11 Teva Pharma Formas cristalinas de o-desmetilvenlafaxina.
WO2007134086A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Genzyme Corporation Methods of treating fatty liver disease comprising inhibiting glucosphingolipid synthesis
KR101271225B1 (ko) 2006-10-31 2013-06-03 삼성디스플레이 주식회사 발광 다이오드 칩 및 발광 다이오드 광원 모듈의 제조 방법
TWI314226B (en) 2006-12-07 2009-09-01 Ind Tech Res Inst Piezoelectricity-driving optical lens module
EP1961765A1 (en) * 2006-12-08 2008-08-27 Zealand Pharma A/S Truncated PTH peptides with a cyclic conformation
MX2009007254A (es) * 2007-01-12 2009-08-12 Wyeth Corp Composiciones de tableta en tableta.
JP2010523578A (ja) * 2007-03-30 2010-07-15 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド 薬理シャペロンを用いるファブリー病の治療方法
MX2009011473A (es) * 2007-04-26 2010-01-18 Amicus Therapeutics Inc Regimenes de dosificacion para el tratamiento de enfermedades por almacenamiento lisosomal que utilizan chaperonas farmacologicas.
EP2594565B1 (en) * 2007-05-31 2018-10-24 Genzyme Corporation 2-acylaminopropanol-type glucosylceramide synthase inhibitors
DE102007029581B4 (de) 2007-06-26 2020-04-09 GM Global Technology Operations LLC (n. d. Ges. d. Staates Delaware) Kraftfahrzeugdach und Kraftfahrzeugkarosserie
US20090307181A1 (en) 2008-03-19 2009-12-10 Brandon Colby Genetic analysis
WO2009117150A2 (en) 2008-03-20 2009-09-24 Genzyme Corporation Method of treating lupus with ceramide derivatives
SI2796457T1 (sl) 2009-11-27 2016-10-28 Genzyme Corporation Genz 112638 za zdravljenje Gaucherjeve ali Fabryjeve bolezni v kombinirani terapiji
FR2953139B1 (fr) 2009-11-27 2012-04-13 Servier Lab Composition pharmaceutique comprenant un sel de strontium, de la vitamine d et une cyclodextrine
EP3646859A1 (en) 2009-11-27 2020-05-06 Boehringer Ingelheim International GmbH Treatment of genotyped diabetic patients with dpp-iv inhibitors such as linagliptin
DK3415515T3 (da) 2009-11-27 2020-03-16 Adverio Pharma Gmbh Fremgangsmåde til fremstilling af methyl-{4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzyl)-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl]pyrimidin-5-yl}methylcarbamat
CN103619840B (zh) 2011-06-21 2016-01-20 诺华股份有限公司 (s)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-{4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]噻唑-2-基}酰胺的多晶型物
JO3316B1 (ar) 2013-05-30 2019-03-13 Lilly Co Eli مركبات 3، 4-داي هيدرو أيزو كوينولين -2(1h)-يل
JP6728842B2 (ja) 2016-03-24 2020-07-22 オムロン株式会社 光学計測装置
CN107445938B (zh) 2016-05-31 2020-04-03 北京启慧生物医药有限公司 依利格鲁司他半酒石酸盐的结晶形式、制备方法和含有所述结晶形式的药用组合物
WO2018193090A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Amneal Pharmaceuticals Company Gmbh Process for preparation of eliglustat hemitartrate and intermediates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN105753846B (zh) 2019-11-15
DK2796457T3 (en) 2016-08-29
ECSP18063798A (es) 2020-02-28
EP2796457A1 (en) 2014-10-29
IL283935A (en) 2021-07-29
RS53503B1 (sr) 2015-02-27
ME02477B (me) 2017-02-20
KR20200013105A (ko) 2020-02-05
NI201200096A (es) 2012-10-30
SG10201407881WA (en) 2015-01-29
IL310635A (en) 2024-04-01
PT2504332E (pt) 2014-09-02
MA33838B1 (fr) 2012-12-03
SI2796457T1 (sl) 2016-10-28
HK1203485A1 (en) 2015-10-30
EP3599237A1 (en) 2020-01-29
WO2011066352A1 (en) 2011-06-03
TWI586663B (zh) 2017-06-11
KR20120115972A (ko) 2012-10-19
CL2012001348A1 (es) 2012-08-24
SI3133070T1 (sl) 2019-11-29
KR20180049255A (ko) 2018-05-10
PL2796457T3 (pl) 2017-04-28
NZ715108A (en) 2017-06-30
CY1117996T1 (el) 2017-05-17
PH12012501048A1 (en) 2013-02-04
MY192644A (en) 2022-08-29
EP2504332B1 (en) 2014-06-04
JP2013512252A (ja) 2013-04-11
ES2754398T3 (es) 2020-04-17
JP6370264B2 (ja) 2018-08-08
CR20120277A (es) 2012-09-05
PL2504332T3 (pl) 2014-10-31
KR102073207B1 (ko) 2020-02-05
MX358345B (es) 2018-08-14
PL2504332T5 (pl) 2021-08-23
EA201592195A1 (ru) 2016-04-29
US20130137743A1 (en) 2013-05-30
CA3140959A1 (en) 2011-06-03
AR121612A2 (es) 2022-06-22
NZ625712A (en) 2016-02-26
PE20121337A1 (es) 2012-10-12
JP7150528B2 (ja) 2022-10-11
HUE045784T2 (hu) 2020-01-28
CN102712629A (zh) 2012-10-03
EP3896069A1 (en) 2021-10-20
IL260299A (en) 2018-08-30
MY160542A (en) 2017-03-15
AU2017265180A1 (en) 2017-12-14
AU2016202591B2 (en) 2017-11-30
TW201737910A (zh) 2017-11-01
CA2781676A1 (en) 2011-06-03
AU2016202591A1 (en) 2016-05-19
PL3133070T3 (pl) 2020-01-31
HK1172031A1 (en) 2013-04-12
ES2493940T3 (es) 2014-09-12
US11458119B2 (en) 2022-10-04
CN102712629B (zh) 2016-10-12
RS54978B1 (sr) 2016-11-30
SG10201800136QA (en) 2018-02-27
EP3133070A1 (en) 2017-02-22
AU2010324810A1 (en) 2012-06-07
JP2016138124A (ja) 2016-08-04
EP3133070B1 (en) 2019-08-14
LT3133070T (lt) 2019-11-11
TW201639562A (zh) 2016-11-16
HRP20191647T1 (hr) 2019-12-13
PL3599237T3 (pl) 2021-09-27
BR112012012947B1 (pt) 2021-04-06
CA2781676C (en) 2020-05-05
IL219892A0 (en) 2012-07-31
RS59543B1 (sr) 2019-12-31
CY1115880T1 (el) 2017-01-25
JP2020189873A (ja) 2020-11-26
JP2019001809A (ja) 2019-01-10
GT201200161A (es) 2014-01-27
TW201130822A (en) 2011-09-16
JP2015212291A (ja) 2015-11-26
PH12015502514B1 (en) 2022-07-29
CN105777707B (zh) 2020-10-13
US12465586B2 (en) 2025-11-11
US20160166542A1 (en) 2016-06-16
KR20250005503A (ko) 2025-01-09
EA023923B1 (ru) 2016-07-29
DK3133070T3 (da) 2019-11-11
MX381242B (es) 2025-03-12
EP2504332B2 (en) 2021-03-17
EA029990B1 (ru) 2018-06-29
HRP20140780T4 (hr) 2021-08-06
ES2875382T3 (es) 2021-11-10
WO2011066352A8 (en) 2011-08-11
EA201890254A3 (ru) 2019-02-28
CA3075788A1 (en) 2011-06-03
BR112012012947A2 (pt) 2017-03-01
EP3599237B1 (en) 2021-03-24
PT2796457T (pt) 2016-07-14
EP2796457B1 (en) 2016-05-18
CA3075788C (en) 2021-12-21
CY1122698T1 (el) 2021-03-12
LT2796457T (lt) 2016-09-12
DK2504332T4 (da) 2021-06-07
KR20220162824A (ko) 2022-12-08
BR112012012947B8 (pt) 2021-05-25
TN2012000237A1 (en) 2013-12-12
JP2023116764A (ja) 2023-08-22
HRP20140780T1 (en) 2014-11-07
UA113491C2 (xx) 2017-02-10
SI2504332T1 (sl) 2014-09-30
AU2010324810B2 (en) 2016-05-12
CN105753846A (zh) 2016-07-13
DOP2016000250A (es) 2017-02-15
US10888547B2 (en) 2021-01-12
KR20150125734A (ko) 2015-11-09
US20230172903A1 (en) 2023-06-08
DOP2012000141A (es) 2012-09-30
DK2504332T3 (da) 2014-08-25
ECSP12011926A (es) 2012-07-31
PT3133070T (pt) 2019-11-11
JP6452635B2 (ja) 2019-01-16
ES2493940T5 (es) 2021-11-23
CL2016002589A1 (es) 2017-05-19
PT3599237T (pt) 2021-04-28
CN112521366A (zh) 2021-03-19
AR121611A2 (es) 2022-06-22
CN105777707A (zh) 2016-07-20
NZ600155A (en) 2014-10-31
ES2586947T3 (es) 2016-10-19
TWI656873B (zh) 2019-04-21
AU2017265180B2 (en) 2019-08-01
EA201890254A2 (ru) 2018-10-31
EA201270646A1 (ru) 2013-01-30
SI2504332T2 (sl) 2021-08-31
HUE029371T2 (en) 2017-02-28
SMT201600273B (it) 2016-08-31
PE20171255A1 (es) 2017-08-28
HRP20161038T1 (hr) 2016-10-21
TWI606827B (zh) 2017-12-01
US20210393590A1 (en) 2021-12-23
CN112521367B (zh) 2024-01-02
CN112521367A (zh) 2021-03-19
MX2012006083A (es) 2012-06-19
EP2504332A1 (en) 2012-10-03
US20160120842A1 (en) 2016-05-05
US20210369672A1 (en) 2021-12-02
PH12015502514A1 (en) 2016-08-15
AR079152A1 (es) 2011-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12465586B2 (en) Inhibitors of glucosylceramide synthase
HK40062640A (en) Pharmaceutical composition of the glucosylceramide synthase inhibitor eliglustat for the treatment gaucher&#39;s disease comprising adjusting the individual therapeutical dose to the p450 metabolism of the patient
HK40021462B (en) Pharmaceutical composition of the glucosylceramide synthase inhibitor eliglustat for the treatment of gaucher&#39;s disease comprising adjusting the individual therapeutical dose to the p450 metabolism of the patient
HK40021462A (en) Pharmaceutical composition of the glucosylceramide synthase inhibitor eliglustat for the treatment of gaucher&#39;s disease comprising adjusting the individual therapeutical dose to the p450 metabolism of the patient
HK1234743B (en) Eliglustat (genz 112638) as inhibitor of glucosylceramide synthase for use in a method of treating fabry&#39;s or gaucher&#39;s disease, the method comprising adjusting the individual therapeutical dose to the p-450 metabolism of the patient
HK1234743A1 (en) Eliglustat (genz 112638) as inhibitor of glucosylceramide synthase for use in a method of treating fabry&#39;s or gaucher&#39;s disease, the method comprising adjusting the individual therapeutical dose to the p-450 metabolism of the patient
HK1172031B (en) An amorphous and a crystalline form of genz 112638 hemitartrate as inhibitor of glucosylceramide synthase
HK1203485B (en) Genz 112638 for treating gaucher or fabry disease in combination therapy