EA029990B1 - Способы лечения ингибиторами глюкозилцерамидсинтазы - Google Patents

Способы лечения ингибиторами глюкозилцерамидсинтазы Download PDF

Info

Publication number
EA029990B1
EA029990B1 EA201592195A EA201592195A EA029990B1 EA 029990 B1 EA029990 B1 EA 029990B1 EA 201592195 A EA201592195 A EA 201592195A EA 201592195 A EA201592195 A EA 201592195A EA 029990 B1 EA029990 B1 EA 029990B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
formula
hemitartrate
subject
administered
Prior art date
Application number
EA201592195A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201592195A1 (ru
Inventor
Ханлан Лиу
Крис Уиллис
Рену Бардваж
Диане П. Коупланд
Абизер Харианавала
Джеффри Скелл
Джон Маршалл
Джианмеи Кочлинг
Джерард Палас
Джудит Петершмитт
Крейг Сигел
Сенг Ченг
Original Assignee
Джензим Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43431870&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA029990(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Джензим Корпорэйшн filed Critical Джензим Корпорэйшн
Publication of EA201592195A1 publication Critical patent/EA201592195A1/ru
Publication of EA029990B1 publication Critical patent/EA029990B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7004—Monosaccharides having only carbon, hydrogen and oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D319/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D319/10—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes
    • C07D319/14—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D319/16—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D319/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D319/10—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes
    • C07D319/14—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D319/16—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C07D319/18—Ethylenedioxybenzenes, not substituted on the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего болезнью Гоше, который был определен как характеризующийся слабым, средним или быстрым метаболизмом посредством Р450, включающему введение субъекту соединения, представленного следующей структурной формулой:или его фармацевтически приемлемой соли, где если субъект характеризуется слабым метаболизмом, то соединение вводится в эффективном количестве, и если субъект характеризуется средним или быстрым метаболизмом, то соединение вводится в уточненном эффективном количестве, где указанное уточненное эффективное количество больше указанного эффективного количества.

Description

Изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего болезнью Гоше, который был определен как характеризующийся слабым, средним или быстрым метаболизмом посредством Р450, включающему введение субъекту соединения, представленного следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой соли, где если субъект характеризуется слабым метаболизмом, то соединение вводится в эффективном количестве, и если субъект характеризуется средним или быстрым метаболизмом, то соединение вводится в уточненном эффективном количестве, где указанное уточненное эффективное количество больше указанного эффективного количества.
029990
Родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США № 61/264748, поданной 27 ноября 2009 года, все содержание которой включено в настоящий документ.
Уровень техники
Глюкосфинголипиды (СЗБ) представляют собой класс природных соединений, которые характеризуются множеством биологических функций, включая способность стимулировать клеточный рост, клеточную дифференциацировку, адгезию между клетками или между клетками и матриксными белками, прикрепление микроорганизмов и вирусов к клеткам и метастазирование опухолевых клеток. СЗЬ образуются из глюкозилцерамида (С1сСег), образующегося из церамида, и ИБР-глюкозы ферментом υΌΡглюкоза: Ν-ацилсфингозинглюкозилтрансферазой (С1сСег-синтазой). Структура церамида показана ниже
Накопление СЗЬ связывали с рядом заболеваний, включая болезни Тея-Сакса, Гоше и Фабри (см., например, патент США № 6051598). СЗЬ также связывали с определенными злокачественными опухолями. Например, было обнаружено, что определенные СЗЬ встречаются только в опухолях или содержатся в опухолях в аномально высоких концентрациях; проявляют выраженное стимулирующее или ингибирующее действие на рост опухоли при добавлении к опухолевым клеткам в культуральной среде; и ингибируют нормальную систему иммунной защиты организма при выделении опухолями в окружающую внеклеточную жидкость. Состав опухолевых СЗЬ меняется по мере увеличения злокачественности опухолей, а антитела против некоторых СЗЬ ингибируют рост опухолей.
Соединения, ингибирующие С1сСег-синтазу, могут снижать концентрацию СЗЬ, и сообщалось, что они применимы для лечения субъектов, страдающих одним из вышеупомянутых заболеваний. Ряд эффективных ингибиторов С1сСег, в настоящем документе называемых "аминоцерамидоподобными соединениями", раскрыт в патентах США №№ 6051598, 5952370, 5945442, 5916911 и 6030995. Соединение формулы (I), показанной ниже, является ингибитором С1сСег-синтазы, проходящим в настоящий момент клинические испытания на предмет лечения болезни Гоше
Существует необходимость в солевых формах этого потенциального лекарственного средства, которые являются кристаллическими и обладают иными физическим свойствами, позволяющими наладить их крупномасштабное производство. Также существует необходимость в фармацевтических композициях, в которых это потенциальное лекарственное средство было бы стабильным и могло бы эффективно доставляться субъекту, а также в усовершенствованных способах лечения, предусматривающих использование этого соединения.
Сущность изобретения
Было обнаружено, что гемитартратная соль соединения формулы (I) (далее "гемитартрат соединения формулы (I)") может быть кристаллизована при вполне определенных условиях с получением определенных негигроскопичных кристаллических форм. Гемитартрат соединения формулы (I) характеризуется несколькими предпочтительными свойствами по сравнению с другими солями соединения формулы (I). Как описано ниже в примере 1, множество солей соединения формулы (I), включая цитрат, малат, фумарат, метилсульфонат и ацетат, не может быть получено в твердой форме. Хотя гидрохлорид и тартратная соль 1: 1 соединения формулы (I) были получены в твердой форме, ни одна из них не была кристаллической, и обе были слишком гигроскопичными для использования в композиции. Гемитартрат соединения формулы (I) легче включать в композиции и синтезировать, чем свободное основание или другие соли. Также гемитартрат соединения формулы (I) является кристаллическим, негигроскопичным, растворимым в воде, характеризуется лучшей текучестью, чем соответствующее свободное основание (далее "свободное основание соединения формулы (I)") и другие соли. Таким образом, эти благоприятные свойства делают гемитартрат соединения формулы (I) применимым в качестве потенциального лекарственного средства для крупномасштабного производства.
Также было обнаружено, что стабильные гранулы для композиций капсул, содержащих гемитартрат соединения формулы (I), могут быть изготовлены при использовании определенных соотношений
- 1 029990
нерастворимого в воде наполнителя, растворимого в воде наполнителя и гемитартрата соединения формулы (I). На основе этой находки раскрыты стабильные фармацевтические композиции гемитартрата соединения формулы (I).
Также было обнаружено, что соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемые соли (включая гемитартрат соединения формулы (I)) метаболизируются в печени, преимущественно ферментами цитохромами Р450. На основе этой находки раскрыты способы лечения соединением формулы (I) или его фармацевтически приемлемыми солями (включая гемитартрат соединения формулы (I)), которые уменьшают вероятность взаимодействия между лекарственными средствами.
Также было обнаружено, что у мышей Оаисйег, которым вводили рекомбинантную глюкоцереброзидазу и затем гемитартрат соединения формулы (I), наблюдалось более низкое содержание 01.1 во внутренних органах и уменьшалось число клеток Г оше в печени по сравнению с таковыми, получавшими лечение только глюкоцереброзидазой или только гемитартратом соединения формулы (I). На основе этой находки также раскрыты комбинированные способы лечения с использованием соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемых солей (включая гемитартрат соединения формулы (I)).
В настоящем изобретении предложен способ лечения субъекта, страдающего болезнью Гоше, который был определен как характеризующийся слабым, средним или быстрым метаболизмом посредством Р450, включающий введение субъекту соединения, представленного следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой соли, где если субъект характеризуется слабым метаболизмом, то соединение вводится в эффективном количестве, и если субъект характеризуется средним или быстрым метаболизмом, то соединение вводится в уточненном эффективном количестве, где указанное уточненное эффективное количество больше указанного эффективного количества.
В одном из вариантов осуществления изобретения Р450 представляет собой ΟΥΡ2Ό6 или СУР3А4.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект определен как характеризующийся слабым, средним или быстрым метаболизмом посредством генотипирования.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект определен как характеризующийся слабым метаболизмом, имея два мутантных аллеля гена СΥΡ2^6, которые в результате дают полную потерю ферментной активности.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект определен как характеризующийся слабым метаболизмом в результате низкой экспрессии Р450.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект определен как характеризующийся слабым метаболизмом в результате получения лечения лекарственным средством, являющимся ингибитором Р450.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект имеет один аллель со сниженной активностью и один нулевой аллель СΥΡ2^6, или субъект имеет по меньшей мере один и не более чем два нормальных функциональных аллеля СΥΡ2^6.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанное лекарственное средство представляет собой пароксетин, флуоксетин или квинидин.
В одном из вариантов осуществления изобретения соединение вводят в ежедневной дозе от 25 до 150 мг.
В одном из вариантов осуществления изобретения соединение вводят в ежедневной дозе от 50 до 100 мг.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект определен как характеризующийся средним метаболизмом, имея один аллель со сниженной активностью и один нулевой аллель гена СΥΡ2^6.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект определен как характеризующийся быстрым метаболизмом, имея по меньшей мере один и не более чем два нормальных функциональных аллеля гена СΥΡ2^6.
В одном из вариантов осуществления изобретения соединение вводят в уточненном эффективном количестве, представляющем собой дозу более 100 мг в сутки.
В одном из вариантов осуществления изобретения соединение вводят в ежедневной дозе от 100 до 300 мг.
В одном из вариантов осуществления изобретения соединение вводят в ежедневной дозе от 150 до 200 мг.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъект представляет собой человека.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанная болезнь Гоше представляет собой бо- 2 029990
лезнь Г оше типа 1.
В одном из вариантов осуществления изобретения соединение представлено гемитартратной солью соединения указанной структурной формулы.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана экспериментальная ΧΚΡΌ-дифрактограмма гемитартрата соединения формулы (I) (при комнатной температуре).
На фиг. 2 представлен график эффективности лечения, основанного на снижении содержания фермента и субстрата, по снижению содержания глюкозилцерамида в печени мышей Саисйег. Содержание СЬ1 в печени измеряли у мышей Саисйег в возрасте 3 месяцев, не получавших лечение, (А) и после 2 недель лечения рекомбинантной глюкоцереброзидазой (В). Мышей, получавших лечение рекомбинантной глюкоцереброзидазой, анализировали через 10 недель без дополнительного лечения (С) или после лечения гемитартратом соединения формулы (I) при введении с пищей 150 мг/кг (Ό). Также показано содержание СЬ1 в печени мышей, которым вводили только гемитартрат соединения формулы (I) в течение всего периода исследования (Е), и у не получавшего лечение контроля той же возрастной группы (Р). Данные выражены как среднее±стандартная ошибка среднего (8ЕМ) (п=5). Статистическую значимость определяли с помощью двухвыборочного (-критерия для независимых выборок.
На фиг. 3 представлен график эффективности лечения, основанного на снижении содержания фермента и субстрата, по снижению содержания глюкозилцерамида в селезенке мышей Саисйег. Содержание СЬ1 в селезенке измеряли у мышей Саисйег в возрасте 3 месяцев, не получавших лечение, (А) и после 2 недель лечения рекомбинантной глюкоцереброзидазой (В). Мышей, получавших лечение рекомбинантной глюкоцереброзидазой, анализировали через 10 недель без дополнительного лечения (С) или после лечения гемитартратом соединения формулы (I) (Ό). Также показано содержание СЬ1 в селезенке мышей, которым вводили только гемитартрат соединения формулы (I) в течение всего периода исследования (Е), и у не получавшего лечение контроля той же возрастной группы (Р). Данные выражены как среднее±стандартная ошибка среднего (8ЕМ) (п=5). Статистическую значимость определяли с помощью двухвыборочного (-критерия для независимых выборок.
На фиг. 4 представлен график эффективности лечения, основанного на снижении содержания фермента и субстрата, по снижению содержания глюкозилцерамида в легком мышей Саисйег. Содержание СЬ1 в легком измеряли у мышей Саисйег в возрасте 3 месяцев, не получавших лечение, (А) и после 2 недель лечения рекомбинантной глюкоцереброзидазой (В). Мышей, получавших лечение рекомбинантной глюкоцереброзидазой, анализировали через 10 недель без дополнительного лечения (С) или после лечения гемитартратом соединения формулы (I) (Ό). Также показано содержание СЬ1 в легком мышей, которым вводили только гемитартрат соединения формулы (I) в течение всего периода исследования (Е), и у не получавшего лечение контроля той же возрастной группы (Р). Данные выражены как среднее±стандартная ошибка среднего (8ЕМ) (п=5). Статистическую значимость определяли с помощью двухвыборочного (-критерия для независимых выборок.
На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий количественную оценку степени окрашивания С.Нб8 в печени. Степень СЭб8-положительного окрашивания в гистологических срезах печени количественно оценивали с помощью программного обеспечения Ме(аМогрй. Показаны уровни у не получавших лечение мышей Саисйег в возрасте 3 месяцев (А) и после лечения глюкоцереброзидазой (В). Также показаны результаты, полученные на мышах, получавших лечение ферментом и затем проанализированных через 10 недель без дополнительного терапевтического вмешательства (С) или после терапии гемитартратом соединения формулы (I) (Ό). Также показана степень окрашивания печени у мышей Саисйег, которым вводили только гемитартрат соединения формулы (I) (Е) и у не получавших лечение контрольных мышей той же возрастной группы (Р). Были сопоставлены данные анализа десяти 400х изображений на срез от каждой мыши. Статистическую значимость определяли с помощью двухвыборочного (-критерия для независимых выборок.
На фиг. б представлен график, иллюстрирующий эффективность гемитартрата соединения формулы (I) на молодых Н409У/пи11 мышах. Гемитартрат соединения формулы (I) вводили Н409У/пи11 мышам в возрасте 10 недель ежедневно путем перорального зондового питания в дозе 75 или 150 мг/кг в течение 10 недель. Содержание глюкозилцерамида в печени, легком, сосудистой системе и селезенке оценивали в конце исследования методом ΗΡ-ТЬС. Данные представлены как относительное содержание СЬ-1 у не получавших лечение контрольных мышей той же возрастной группы. Пунктирными линиями показано содержание глюкозилцерамида, наблюдаемое у нормальных мышей дикого типа. *р<0,05; **р<0,01 относительно не получавшего лечение контроля (двусторонний, двухвыборочный (-критерий для независимых выборок). Данные выражены как среднее±стандартная ошибка среднего (8ЕМ) (п=5 для 75 мг/кг; п=б для 150 мг/кг).
На фиг. 7 показано воздействие терапии гемитартратом соединения формулы (I) на накопление СЬ3 в печени, сердце, почке, селезенке, головном мозге и крови мышей Райгу.
На фиг. 8 показан график воздействия терапии гемитартратом соединения формулы (I) на возникновение и развитие периферической невропатии у мышей Райгу.
- 3 029990
На фиг. 9 показаны графики измерений некоторых маркеров функции почек у мышей РаЬту, получавших лечение гемитартратом соединения формулы (I).
На фиг. 10 показана временная шкала исследований ЕКТ и §КТ популяций мышей, получающих различную медикаментозную терапию: А) Фабразим раз в два месяца без гемитартрата соединения формулы (I); В) Фабразим раз в два месяца и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; С) Фабразим, вводимый в начале исследования и на четвертом месяце исследования, и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; Ό) гемитартрат соединения формулы (I) в пище без Фабразима; и Е) без медикаментозной терапии.
На фиг. 11 показаны графики содержания ОЬ-3 в крови у шести популяций (п=?) мышей, выраженные в нг/мл крови (А-Е РаЬгу-Кад, а Р дикий тип). Популяции мышей получали следующее лечение: А) Фабразим раз в два месяца без гемитартрата соединения формулы (I); В) Фабразим раз в два месяца и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; С) Фабразим, вводимый в начале исследования и на четвертом месяце исследования, и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; Ό) гемитартрат соединения формулы (I) в пище без Фабразима; Е) без лекарственной терапии и Р) без медикаментозной терапии.
На фиг. 12 показаны графики содержания ОЬ-3 в печени и почке мышей РаЬгу-Кад; популяции мышей (п=?) получали следующее лечение: А) Фабразим раз в два месяца без гемитартрата соединения формулы (I); В) Фабразим раз в два месяца и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; С) Фабразим, вводимый в начале исследования и на четвертом месяце исследования, и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; Ό) гемитартрат соединения формулы (I) в пище без Фабразима; и Е) без медикаментозной терапии.
На фиг. 13 показаны графики содержания ОЬ-3 в моче мышей РаЬгу-Кад; популяции мышей (п=?) получали следующее лечение: А) Фабразим раз в два месяца без гемитартрата соединения формулы (I); В) Фабразим раз в два месяца и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; С) Фабразим, вводимый в начале исследования и на четвертом месяце исследования, и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; Ό) гемитартрат соединения формулы (I) в пище без Фабразима и Е) без медикаментозной терапии.
На фиг. 14 представлен график, показывающий выраженный в секундах латентный период термочувствительности мышей РаЬгу-Кад, получавших следующее лечение: Фабразим раз в два месяца без гемитартрата соединения формулы (I); Фабразим раз в два месяца и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; Фабразим, вводимый в начале исследования и на четвертом месяце исследования, и гемитартрат соединения формулы (I) в пище; гемитартрат соединения формулы (I) в пище без Фабразима; без медикаментозной терапии; мыши дикого типа; и не получавшие лечение в течение 3 месяцев.
На фиг. 15 представлен график, показывающий общее значение площади разложения под кривыми НРЬС различных смесей, содержащих гемитартрат соединения формулы (I), моногидрат лактозы для капсулирования и Λνίοοί РН 301 (микрокристаллическую целлюлозу) после того, как они были выдержаны при 85°С в течение 3 суток. Площадь разложения под кривой НРЬС представляет собой отношение общей площади пиков, соответствующих продуктам разложения, к общей площади пиков, соответствующих гемитартрату соединения формулы (I) и продуктам разложения.
Подробное описание изобретения
Настоящий документ относится к уникальным кристаллическим формам гемитартрата соединения формулы (I) и новым фармацевтическим композициям гемитартрата соединения формулы (I), содержащим кристаллические формы гемитартрата соединения формулы (I), описанные в настоящем документе. Настоящий документ также относится к способам ингибирования глюкозилцерамидсинтазы или снижения концентрации глюкосфинголипидов у нуждающегося в этом субъекта. Дополнительно, настоящий документ относится к способам получения определенных кристаллических форм гемитартрата соединения формулы (I). Настоящий документ также относится к стабильным фармацевтическим композициям гемитартрата соединения формулы (I), комбинированным способам лечения соединением формулы (I) или его фармацевтически приемлемыми солями (включая гемитартрат соединения формулы (I)) и способам лечения соединением формулы (I) или его фармацевтически приемлемыми солями (включая гемитартрат соединения формулы (I)), которые минимизируют риск взаимодействия между лекарственными средствами.
Кристаллические формы гемитартрата соединения формулы (I).
Согласно конкретному варианту осуществления, по меньшей мере, определенная относительная массовая доля гемитартрата соединения формулы (I) является кристаллической. Конкретная относительная массовая доля включает 70, 72, 75, 77, 80, 82, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9% или относительную долю в диапазоне между 70 и 100%.
Согласно другому конкретному варианту осуществления, по меньшей мере, конкретная относительная массовая доля гемитартрата соединения формулы (I) является единой кристаллической формой гемитартрата соединения формулы (I). Конкретная относительная массовая доля включает 70, 72, 75, 77, 80, 82, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9% или относительную долю в промежутке между 70 и 100%.
Используемый в настоящем документе термин "кристаллический" относится к твердому веществу, характеризующемуся кристаллической структурой, в которой отдельные молекулы характеризуются вы- 4 029990
сокогомогенным постоянным устойчивым химическим строением. Кристаллический гемитартрат соединения формулы (I) может представлять собой кристаллы единой кристаллической формы гемитартрата соединения формулы (I) или смесь кристаллов различных отдельных кристаллических форм. Термин "единая кристаллическая форма" означает гемитартрат соединения формулы (I) в виде единственного кристалла или множества кристаллов, в котором каждый кристалл имеет одну и ту же кристаллическую форму.
Когда конкретная относительная массовая доля гемитартрата соединения формулы (I) представляет собой единую кристаллическую форму, оставшийся гемитартрат соединения формулы (I) представляет собой некую комбинацию аморфного гемитартрата соединения формулы (I) и/или одной или нескольких других кристаллических форм гемитартрата соединения формулы (I), исключая эту единую кристаллическую форму. Когда кристаллический гемитартрат соединения формулы (I) определен в виде конкретной относительной доли определенной кристаллической формы гемитартрата соединения формулы (I), оставшееся количество изготовлено из аморфной формы и/или кристаллических форм, отличных от одной или нескольких определенных форм, указанных конкретно. Примеры единой кристаллической формы включают форму А гемитартрата соединения формулы (I), характеризующуюся одним или более свойством, как обсуждается выше.
Поскольку винная кислота имеет две карбоксильные группы, она может образовывать соли с различным мольным соотношением соединения, представленного формулой (I), и тартрата (основания, сопряженного с винной кислотой). Например, соль, в которой молярное соотношение тартрата к соединению формулы (I) составляет около один к одному, является тартратом соединения формулы (I) (1 тартрат: 1 соединение формулы (I)), а соль, в которой молярное соотношение тартрата к соединению формулы (I) составляет около один к двум, является гемитартратом соединения формулы (I) (1 тартрат:2 соединения формулы (I)).
Г емитартратная соль может существовать в различных стереоизомерных формах. Стереоизомерами являются соединения, которые отличаются только своей пространственной ориентацией. Энантиомеры представляют собой пары стереоизомеров, чьи зеркальные отображения не совпадают друг с другом чаще всего из-за того, что они содержат ассиметрично замещенный атом углерода, действующий как хиральный центр. Диастереоизомеры представляют собой стереоизомеры, которые не соотносятся между собой как зеркальные отображения чаще всего из-за того, что они содержат два или более ассиметрично замещенных атомов углерода.
Кода стереоизомер назван (как в случае, например, Ь-(+)-винной кислоты) или изображен в виде структуры (как в случае, например, соединения формулы (I)), названный или изображенный стереоизомер является по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 99 или 99,9 мас.% чистым относительно других стереоизомеров. Когда один стереоизомер назван (как в случае, например, Ь-(+)-винной кислоты) или изображен в виде структуры (как в случае, например, соединения формулы (I)), названный или изображенный стереоизомер является по меньшей мере на 80, 90, 99 или 99,9 мас.% оптически чистым. Массовый процент оптической чистоты представляет собой отношение массы энантиомера к массе энантиомера плюс масса его оптического изомера.
"Рацемат" или "рацемическая смесь" означает смесь эквимолярных количеств двух энантиомеров, которая не проявляет оптической активности, например, не вращает плоскость поляризованного света.
Винная кислота имеет три стереоизомера: Ь-(+)-винную кислоту или левовращающую винную кислоту, ее энантиомер - правовращающую винную кислоту или Э-(-)-винную кислоту и ахиральную форму - мезовинную кислоту. Обозначение Ь и Ό указывает на способность кислоты вращать плоскость поляризованного света.
Для изготовления гемитартрата соединения формулы (I) могут быть использованы любые стереоизомеры винной кислоты. Например, гемитартрат может быть образован из только одного из ее стереоизомеров или из их комбинации. Гемитартратную соль выбирают из Ό-гемитартрата, Ь-гемитартрата, гемимезотартрата или рацемического Н,Ь-гемитартрата. В определенном воплощении гемитартратной солью является Ь-гемитартрат. Термин "Ь-гемитартрат" означает, что гемитартратная соль образована из Ь-винной кислоты. Термин "рацемический Ό,Τ-гемитартрат" означает, что для изготовления гемитартрата соединения формулы (I) использовали и Ό-тартрат, и Ь-тартрат. Количество Ό-тартрата в рацемическом Ό,Τ-гемитартрате может быть больше, равно или меньше количества присутствующего Ь-тартрата.
Термин "левовращающий" означает, что поляризованный свет вращается влево при прохождении через ассиметричное соединение. Префикс для обозначения левовращающих соединений - "Ь".
Термин "правовращающий" означает, что поляризованный свет вращается вправо при прохождении через ассиметричное соединение. Префикс для обозначения правовращающих соединений - "Ό".
Получение гемитартрата соединения формулы (I).
Гемитартрат соединения формулы (I) может быть получен путем смешивания соединения формулы (I) с Ь-винной кислотой в приемлемом растворителе. Осаждению гемитартрата соединения формулы (I) можно способствовать добавлением затравочного кристалла. Растворителями, которые могут быть использованы, являются метанол, вода, этанол, ацетон, этилацетат или их комбинации.
Определенные твердые формы гемитартрата соединения формулы (I) могут быть изготовлены, на- 5 029990
пример, с помощью медленного упаривания, медленного охлаждения и осаждения осадителем. Растворители, которые могут быть использованы в этих способах, включают воду, гептан, гексан, толуол, дихлорметан, этанол, изопропиловый спирт, ацетонитрил, этилацетат, метанол, ацетон, метил-третбутиловый эфир (обозначенный в настоящем документе как "МТВЕ"), п-диоксан и тетрагидрофуран (обозначенный в настоящем документе как "ТНР").
Твердые формы гемитартрата соединения формулы (I) могут быть получены с помощью выпаривания растворителя из раствора гемитартрата соединения формулы (I) в растворителе или смеси растворителей. Приемлемые смеси растворителей включают метанол, этанол, ацетон, воду, этилацетат и дихлорметан. Предпочтительные смеси растворителей включают этанол, метанол, воду и ацетон.
Твердые формы гемитартрата соединения формулы (I) могут быть получены посредством медленного охлаждения нагретого раствора гемитартрата соединения формулы (I) в растворителе. Приемлемые растворители включают этанол, метанол, воду, ацетон и этилацетат.
Твердые формы гемитартрата соединения формулы (I) могут быть получены посредством быстрого охлаждения нагретого раствора гемитартрата соединения формулы (I) в растворителе путем помещения раствора в ледяную баню. Приемлемые растворители включают этанол, метанол, воду, этилацетат или смеси этих растворителей.
Твердые формы гемитартрата соединения формулы (I) могут быть получены с помощью добавления раствора гемитартрата соединения формулы (I) в растворителе, как описано выше, в осадитель при данной температуре. Более конкретно, осадителем является этилацетат, ацетон, ацетонитрил, толуол, ТНР, МТВЕ, п-диоксан, изопропанол или гептан. В частности, смеси растворитель/осадитель включают метанол/этилацетат, метанол/ацетон, метанол/гексан, метанол/гептан, метанол/ацетонитрил, метанол/толуол, метанол/ТНР, метанол/МТВЕ, метанол/п-диоксан, этанол/этилацетат, этанол/гексан, этанол/гептан, этанол/ацетон, этанол/ацетонитрил, этанол/толуол, этанол/МТВЕ, этанол/ТНР, вода/ТНР, вода/изопропанол, вода/ацетонитрил, вода/ацетон, дихлорметан/гептан, дихлорметан/ацетон, дихлорметан/этилацетат, дихлорметан/ацетонитрил, дихлорметан/толуол, дихлорметан/ТНР, дихлорметан/МТВЕ, дихлорметан/п-диоксан и дихлорметан/изопропанол.
Предпочтительные смеси растворитель/осадитель включают метанол/этилацетат, метанол/ацетон, метанол/МТВЕ и вода/ацетон.
Используемый в настоящем документе термин "осадитель" касается растворителя, в котором гемитартрат соединения формулы (I) имеет низкую растворимость и который вызывает осаждение гемитартрата из раствора в форме мелкого порошка или кристаллов.
Дополнительные способы для образования твердых форм гемитартрата соединения формулы (I) включают осаждение твердого вещества из этилацетата/ацетона и необязательно сушку образовавшегося твердого вещества при комнатной температуре. В другом способе твердое вещество может быть затем перекристаллизовано в ацетоне с добавлением или без добавления затравочного кристалла. Альтернативно, гемитартрат соединения формулы (I) может быть осажден из растворителей этилацетат/ацетон и перекристаллизован в этилацетате. Альтернативно, гемитартрат соединения формулы (I) затем может быть перекристаллизован в изопропаноле. Альтернативно, гемитартрат соединения формулы (I) может быть изготовлен с использованием только ацетона без дополнительной перекристаллизации. Альтернативно, гемитартрат соединения формулы (I) может быть осажден из ацетона после краткого кипячения в колбе с обратным холодильником без дополнительной перекристаллизации.
Альтернативно, гемитартрат соединения формулы (I) затем может быть перекристаллизован в метаноле/ацетоне с добавлением или без добавления затравочного кристалла. Альтернативно, гемитартрат соединения формулы (I) затем может быть перекристаллизован в воде/ацетоне с добавлением или без добавления затравочного кристалла.
Характеристика кристаллических форм гемитартрата соединения формулы (I).
Согласно конкретному варианту осуществления кристаллическая форма гемитартрата соединения формулы (I), кристаллическая форма А, характеризуется одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью основными пиками на рентгеновской порошковой дифрактограмме при углах 2Θ 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 15,9° и 21,7°. В еще более частном воплощении кристаллическая форма характеризуется пиками на рентгеновской порошковой дифрактограмме при углах 2Θ 5,1°, 6,6°, 10,7°, 11,0°, 13,3°, 15,1°, 15,9°, 16,5°, 17,6°, 18,6°, 18,7°, 19,0°, 20,2°, 21,7° и 23,5°. Должно быть понятно, что определенный угол 2Θ означает определенное значение ±0.2°.
Используемый в настоящем документе термин "основной пик на рентгеновской порошковой дифрактограмме" относится к пику на рентгеновской порошковой дифрактограмме с относительной интенсивностью, большей чем 25%. Относительная интенсивность рассчитывается как отношение интенсивности пика, представляющего интерес, к интенсивности наибольшего пика.
Способы лечения с использованием гемитартрата соединения формулы (I).
Используемый в настоящий заявке термин "субъект" означает млекопитающее, предпочтительно пациента человека, но также может означать животное, нуждающееся в ветеринарном лечении, такое как домашнее животное (например, собаки, кошки и т.п.), сельскохозяйственное животное (например, коро- 6 029990
вы, овцы, свиньи, лошади и т.п.) или лабораторное животное (например, крысы, мыши, морские свинки и т.п.). Термины "субъект" и "пациент" используются взаимозаменяемо.
Одним из воплощений настоящей заявки является способ замедления, например ингибирования или снижения активности глюкозилцерамидсинтазы, или снижения концентраций глюкосфинголипидов у нуждающегося в этом субъекта путем введения субъекту эффективного количества гемитартратной соли соединения формулы (I), включая ее кристаллические формы, как описано выше.
Нуждающимся в лечении субъектом является субъект с состоянием или заболеванием, требующим ингибирования глюкозилцерамидсинтазы или снижения концентраций глюкосфинголипидов в клетках, в частности в лизосомах или мембранах клеток. Ингибиторы глюкозилцерамидсинтазы показаны пригодными для лечения лизосомальных болезней накопления, таких как болезни Тея-Сакса, Гоше или Фабри (см., например, патенты США №№ 6569889; 6255336; 5916911; 5302609; 6660749; 6610703; 5472969; 5525616, все сведения из которых включаются в настоящую заявку путем ссылки).
Примеры состояний или заболевания включают поликистозную болезнь почек и мембранную гломерулопатию (см. предварительные заявки США №№ 61/130401 и 61/102541, все сведения из которых включаются в настоящую заявку путем ссылки); гломерулонефрит и гломерулосклероз (см. предварительную заявку США 61/137214); волчанку (см. РСТ/ϋδ 2009/001773, все приведенные в ней сведения включаются в настоящую заявку путем ссылки); сахарный диабет, включая сахарный диабет 2 типа (см. \νϋ 2006/053043, все приведенные в ней сведения включаются в настоящую заявку путем ссылки); лечение нарушений, вызывающих рост и деление клеток, включая раковые заболевания, коллагеноз сосудов, атеросклероз и гепертрофию почек у пациентов с сахарным диабетом (см. патенты США №№ 6916802 и 5849326, все приведенные в них сведения включаются в настоящую заявку путем ссылки); ингибирование роста артериальных эпителиальных клеток (см. патенты США №№ 6916802 и 5849326); лечение пациентов, страдающих от инфекций (см. 8уепккоп М. е! а1., "Ерййе11а1 О1исокрЫпдобр1б Ехртеккюп ак а ОеЮпшпаШ о£ Вае1ет1а1 АбНетепсе апб Су!окше Ртобисбоп," 1Пее1, апб 1ттип., 62:4404-4410 (1994), все приведенные в ней сведения включаются в настоящую заявку путем ссылки); предотвращение генерирования организмом реципиента, например пациента, антител против опухоли (см. 1покиеЫ 1. е! а1. "Апб!итог Асбуйу ш М1ее о£ ап 1пЫЫ1ог о£ О1усокрЫп§обр1б Вюкуп!Ьек1к," Сапсег Ье!!., 38:23-30(1987), все приведенные в ней сведения включаются в настоящую заявку путем ссылки); и лечение опухолей (см. Накотоп 8. "Ыете Обесбопк ш Сапсег Тйегару Вакеб оп АЫеггап! Ехртеккюп о£ 01усокрЫпдобр1бк: Апбабйекюп апб ОбЬо-81дпабп§ Тйегару," Сапсег Се11к 3:461-470 (1991), 1покисЫ 1. е! а1. 'бпЫЫйюп о£ Ехрег1тейа1 Ме1ак1ак1к о£ Митте Ьетк Ьопд Сатсшота Ыу ап 1пЫЫйот о£ О1исоку1сегат1бе 8уййаке апб йк Рокк1Ы1е Месйаткт о£ Асбоп," Сапсег Кек., 50:6731-6737 (1990) и 21сйе М. е! а1. "Апдюдепеык Сап Ве 8бти1а!еб ог Кергеккеб ш 1п У1уо Ыу а Сйапде ш ОМ3 :ΟΌ3 Оапдйоыбе Кабо," ЬаЫ. 1пуек!., 67:711-715 (1992), все приведенные в них сведения включаются в настоящую заявку путем ссылки).
Гемитартрат соединения формулы (I) может быть также использован для опухолевых вакциноподобных композиций (см., например, патенты США №№ 6569889; 6255336; 5916911; 5302609; 6660749; 6610703; 5472969; 5525616).
Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль (включая его гемитартратную соль) могут быть использованы в раскрытых способах в качестве монотерапии, например в качестве единственного фармацевтически активного ингредиента, вводимого для лечения показания.
Альтернативно, соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль (включая его гемитартратную соль) могут быть использованы в раскрытых способах виде комбинированной терапии совместно с другими терапевтически активными лекарственными средствами, известными из уровня техники как предназначенные для лечения требуемых заболеваний или показаний. Термины "совместная терапия", или "комбинация", или "комбинированная терапия", или "совместно вводимые" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и означают, что соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль (включая гемитартратную соль) вводят до, после или одновременно с одним или более другим терапевтическим средством. Согласно одному из вариантов осуществления комбинированную терапию используют для лечения лизосомального заболевания, такого как болезнь Гоше. Альтернативно, соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль (включая гемитартратную соль) вводят одновременно (например, параллельно) в виде отдельных композиций или в виде единой композиции. Альтернативно, средства могут быть введены в виде отдельных композиций последовательно в пределах подходящих временных рамок, определяемых квалифицированным практикующим врачом (например, времени, достаточного для перекрывания фармацевтических эффектов от лечения). Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль (включая гемитартратную соль) и одно или несколько других терапевтических средств могут быть введены одной дозой или множеством доз по графику, приемлемому для того, чтобы достичь желаемого терапевтического эффекта.
Терапевтические агенты, эффективные для лечения болезни Гоше, включают глюкоцереброзидазу, аналоги глюкоцереброзидазы, ингибиторы глюкозилцерамидсинтазы и молекулярные шапероны, которые связываются с глюкоцереброзидазой и восстанавливают ее правильную конформацию. Глюкоцереброзидаза или ее аналоги могут быть глюкоцереброзидазой или ее аналогами человека или млекопитающего. Альтернативно, глюкоцереброзидаза или ее налоги могут быть получены рекомбинантно. Аналоги
- 7 029990
глюкоцереброзидазы включают процессированные формы фермента и/или ферменты с измененной последовательностью аминокислот по сравнению с природной последовательности нативного фермента, обеспечивающей сохранение биологической активности. Примеры аналогов глюкоцереброзидазы включают имиглюцеразу (продаваемую Ссп/утс Согрогайоп под торговым наименованием Ссгс/утс®). талиглюцеразу альфа (доступную на рынке под торговым наименованием Ир1у8О® и разработанную Рго!айх ВюШетареийск, 1пс.) и велаглюцеразу альфа (разработанную 8Ыте РЬС), которые являются аналогами β-глюкоцереброзидазы человека, произведенными с помощью рекомбинантной ДНК. Примеры молекулярных шаперонов включают изофагомин (находится в разработке Атюик ТЬетареийск, СтаиЪшу, N1 под торговым наименованием Рйсета™). Изофагомин также известен как тартрат афегостата, содержащий тартратную форму изофагомина в качестве активного ингредиента. Примеры ингибиторов глюкоцереброзидазы включают миглустат (разработанный Ас!ейои РйагтасеийсаП Ий. АШсйетй, 5>\\Д/ег1апй под торговым наименованием 2ауекса ™).
Согласно одному из вариантов осуществления комбинированная терапия для лечения болезни Гоше осуществляется в две стадии. На первой стадии используют лекарственное средство, эффективное для лечения болезни болезни Гоше (обычно глюкоцереброзидаза или ее аналог для болезни Гоше), для того чтобы стабилизировать субъекта. Например, при болезни Г оше используют одно из этих лекарственных средств, для того чтобы снизить нагрузку на внутренние органы, такие как печень, селезенка, легкие и/или почки, вызванную накоплением СЬ-1. Как только эта стадия завершена, на второй стадии используют соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль (включая гемитартратную соль) в качестве подходящей поддерживающей терапии. Первая стадия длится обычно вплоть до одной, двух, трех или четырех недель или вплоть до одного, двух, трех, четырех, шести, девяти или двенадцати месяцев, или до тех пор, пока количество тромбоцитов у субъекта не станет равным или большим чем 100000 на мм3; концентрация гемоглобина не станет равной или большей чем 11 г/дл (женщины) или 12 г/дл (мужчины); и/или до тех пор пока объем селезенки субъекта не станет меньше или равным 10кратному нормальному объему, а объемы печени не станут меньше или равными 1,5-кратным нормальным объемам. Введение по первой стадии обычно заканчивается, как только начинается терапия соединением формулы (I).
Используемый в настоящем документе термин "эффективное количество" относится к количеству, эффективному для облегчения симптомов, имеющихся у получающего лечение пациента, с минимальными побочными эффектами для пациента. Определенная композиция, путь введения и доза подбираются врачом исходя из состояния пациента. Доза и интервал могут быть субъектуально уточнены для того, чтобы обеспечить содержание активного соединения в плазме, достаточное для поддержания желаемых терапевтических эффектов. В дополнении к состоянию пациента и режиму введения вводимая доза будет зависеть от степени тяжести симптомов у пациента, возраста пациента и его веса. Эффективное количество обычно будет давать в результате содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы выше по меньшей мере 5 нг/мл. Если содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы после введения эффективного количества соединения составляет меньше 5 нг/мл, вводимую этому субъекту дозу меняют на "уточненное эффективное количество", такое, что содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы составляет по меньшей мере 5 нг/мл. Альтернативно, если после введения эффективного количества соединения содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы составляет меньше 5 нг/мл и/или Смакс составляет свыше 100 нг/мл, вводимую субъекту дозу изменяют на "уточненное эффективное количество", такое, что содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы в плазме составляет по меньшей мере 5 нг/мл, а Смакс составляет меньше 100 нг/мл. Эффективные количества могут находиться в диапазоне от 0,1 до 500 мг/сутки. Альтернативно, эффективное количество лежит в диапазоне 50-300 мг/сутки. В другой альтернативе, эффективное количество лежит в диапазоне 100-300 мг/сутки. Соединение по настоящей заявке может вводиться непрерывно или через определенные временные интервалы. Например, соединение по настоящей заявке может быть введено 1, 2, 3 или 4 раза в сутки, в виде, например, ежедневной композиции или композиции, вводимой дважды в сутки. Для определения оптимального диапазона доз и/или графиков введения могут быть использованы коммерчески доступные методы анализа.
Согласно одному из вариантов осуществления эффективным количеством соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли (включая описанную выше гемитартратную соль) является (вне зависимости от того, вводятся они в качестве монотерапии или в качестве совместной терапии) ежедневная доза от 25 до 300 мг (альтернативно от 25 до 150 мг, в другой альтернативе от 50 до 300 мг и в другой альтернативе от 100 до 300 мг), такая как 25, 50, 100, 200 или 300 мг в сутки. В определенном воплощении эффективным количеством соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли (включая гемитартрат соединения формулы (I)) является (вне зависимости от того, вводятся они в качестве монотерапии или в качестве совместной терапии) вводимая дважды в сутки доза 50 мг (всего 100 мг в сутки), 100 мг (всего 200 мг в сутки) или 150 мг (всего 300 мг в сутки). В альтернативном воплощении эффективным количеством соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой
- 8 029990
соли (включая гемитартрат соединения формулы (I)) является (вне зависимости от того, вводятся они в качестве монотерапии или в качестве совместной терапии) вводимая один раз в сутки доза 100, 200 или 300 мг/сутки.
В другом воплощении эффективное количество определяют исходя из предположения, что субъект "характеризуется слабым метаболизмом посредством Р450", и затем определяют содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы и/или Смакс. Вводимое субъекту количество затем заменяют на уточненное эффективное количество, как описано ниже, если содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы составляет меньше 5 нг/мл; или содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы составляет меньше 5 нг/мл и/или Смакс больше 100 нг/мл; или если субъект определен как характеризующийся средним или быстрым/сверхбыстрым метаболизмом посредством Р450. Количество, эффективное для субъектов, характеризующихся слабым метаболизмом посредством Р450, обычно составляет (вне зависимости от того, вводится оно в качестве монотерапии или в качестве совместной терапии) обычно от 100 до 200 мг в сутки, например 100 или 200 мг в виде вводимой один раз в сутки дозы или в виде вводимой два раза в сутки дозы.
Обычно фармацевтические композиции по настоящей заявке могут вводиться до или после приема пищи или совместно с приемом пищи. Использованные в настоящем документе термины "до" или "после" приема пищи означают в пределах двух часов, предпочтительно в пределах одного часа, более предпочтительно в пределах 30 мин, наиболее предпочтительно в пределах 10 мин до начала или после завершения приема пищи соответственно.
Было обнаружено, что соединение формулы (I) и его фармацевтически приемлемые соли (включая гемитартрат соединения формулы (I)) метаболизируются в печени, преимущественно ферментами цитохрома Р450. Ферменты цитохрома Р450 ("СУРк") являются главными метаболизирующими ксенобиотики печеночными ферментами. Существует 11 выделяемых обычной печенью человека метаболизирующих ксенобиотики ферментов цитохрома Р450 (например, СУР1Л2, СУР2Л6, СУР2В6, СУР2С8/9/18/19, СУР2Э6. СУР2Е1 и СУР3Л4/5). В настоящее время также было обнаружено, что СУР2Э6 и СУР3Л4 являются основными изоформами цитохрома Р450, которые ответственны за детоксикацию соединения формулы (I) и его фармацевтически приемлемых солей, таких как гемитартрат соединения формулы (I). Уровень активности ферментов Р450 различается в зависимости от субъектуальных особенностей организма. Например, организмы могут быть классифицированы как характеризующиеся слабым, средним и быстрым/сверхбыстрым метаболизмом посредством Р450. Поскольку низкие уровни активности Р450 в организме могут приводить к возникновению взаимодействий между лекарственными средствами ("ΌΌΓ'), другое воплощение изобретения состоит в том, чтобы определить, характеризуется ли субъект слабым, средним или быстрым/сверхбыстрым метаболизмом посредством Р450. Если субъект характеризуется средним или быстрым/сверхбыстрым метаболизмом, то вводимая такому субъекту доза должна быть повышена до "уточненной эффективной дозы", например количества, которое в результате дает содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы по меньшей мере 5 нг/мл; или количества, которое в результате дает содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы по меньшей мере 5 нг/мл и С,,,|кс соединения ниже 100 нг/мл. Доза может повышаться постепенно с повторным тестированием субъекта однократно, двукратно, трехкратно, четырехкратно или столько раз, сколько необходимо для того, чтобы достичь уточненной эффективной дозы.
Для гена СУР 2Ό6 существует четыре прогнозных фенотипа:
фенотип "слабого метаболизма посредством Р450" имеет два мутантных аллеля, которые в результате дают полную потерю ферментной активности,
фенотип "среднего метаболизма посредством Р450" имеет один аллель со сниженной активностью и один нулевой аллель,
фенотип "быстрого метаболизма посредством Р450" имеет по меньшей мере один и не более чем два нормальных функциональных аллеля,
фенотип "сверхбыстрого метаболизма посредством Р450" имеет множество копий (3-13) функциональных аллелей и проявляет избыточную ферментную активность.
Субъект обычно определяется как характеризующийся слабым, средним или быстрым/сверхбыстрым метаболизмом посредством Р450 посредством генотипирования или посредством мониторинга содержания метаболизируемого ферментом Р450, таким как СУР2И6 или СУР3Л4, лекарственного средства в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы. В основном мониторинг содержания соединения в плазме у пациента непосредственно перед приемом его очередной дозы и/или С„|кс соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, включая гемитартрат соединения формулы (I), проводят в течение вплоть до одной, двух, трех или четырех недель, или вплоть до одного, двух, трех, шести, девяти или двенадцати месяцев, или больше после начала лечения соединением. Уточнения дозы осуществляют в той мере, как необходимо для того чтобы поддерживать содержание внутри описанных пределов, например содержание соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы в плазме 5 нг/мл или больше.
- 9 029990
Субъекты могут приобрести слабый метаболизм посредством Р450 в результате получения лечения определенными лекарственными средствами, являющимися ингибиторами фермента Р450. Примеры таких лекарственных средств включают пароксетин, флуоксетин, квинидин или кетоконазол. Альтернативно, субъект характеризуется слабым метаболизмом посредством Р450 в результате низкой экспрессии фермента Р450. В таком случае низкая экспрессия может быть обнаружена с помощью определения экспрессии фермента Р450 у субъекта, например с помощью генотипирования субъекта по ферменту Р450. Например, экспрессию СУР2Э6 в основном определяют путем ПЦР (МсЕ1гоу с1.а1. "СУР2Э6 СепоЦршд а8 ап Акегпайуе Ю РкепоЦршд Гог ОеЮтипаИоп оГ МсЫЬоПс δίαίιΐδ ίη а СИшса1 Тпа1 8еШпд", ААР8 РЬагт81 (2000) 2(4):агйс1е 33 (11ир://\у\у\у.ркапп5с1.огд/)) или путем микроматричного анализа, основанного на фармакогеномном тестировании (ВаскдгоипЛ 1пГоппа1юп, Коске П1адпо8кс8 "Тке СУР450 Сепе РатЛу апб Эгид Ме1акок5т", НоГГтапп Ьа Коске ЫЛ.). Все сведения, содержащиеся в этих документах, включаются в настоящую заявку путем ссылки. Фактически, субъект может быть удобно генотипирован по экспрессии Р450 (например, СУР2Э6) перед началом лечения, и ему, если необходимо, может быть введено уточненное эффективное количество. В случае генотипирования перед началом лечения попрежнему рекомендуется проводить мониторинг содержания соединения в плазме непосредственно перед приемом его очередной дозы и Смакс соединения и уточнять дозу как необходимо.
Эффективные количества мигаластата, агалзидазы, имиглюцеразы, изофагомина и миглустата являются теми же, что указаны в инструкции по применению лекарственного средства, или теми же, что реализовывались в клинических исследованиях каждого лекарственного средства.
Соединение формулы (I) могут вступать во взаимодействие с фармацевтически приемлемыми кислотами для образования фармацевтически приемлемой соли. Примеры фармацевтически приемлемых кислот включают неорганические кислоты, такие как хлороводородная кислота, бромоводородная кислота, йодоводородная кислота, серная кислота, ортофосфорная кислота и т.п., и органические кислоты, такие как п-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, пбромфенилсульфоновая кислота, капроновая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и т.п. Примеры таких солей включают сульфат, пирофосфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат, изобутират, капронат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксиленсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гаммагидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат и т.п.
Фармацевтические композиции, содержащие гемитартрат соединения формулы (I).
Приемлемые композиции и режимы введения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемых солей (включая его гемитартратную соль) включают составы и режимы, описанные в патенте США № 7253185, все сведения, содержащиеся в которой, включены в настоящую заявку путем ссылки. Предпочтительная композиция для гемитартрата соединения формулы (I) описывается в следующих параграфах.
Одним из воплощений изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая гемитартрат соединения формулы (I), по меньшей мере один растворимый в воде наполнитель, по меньшей мере один нерастворимый в воде наполнитель, по меньшей мере одно связующее вещество и по меньшей мере одно смазывающее вещество. Приемлемые растворимые в воде наполнители могут включать, например, безводную лактозу, моногидрат лактозы, маннитол, хлорид натрия, сахарную пудру, сорбитол, сахарозу, инозитол и прежелатинизированный крахмал. Приемлемые нерастворимые в воде наполнители могут включать, например, микрокристаллическую целлюлозу, фосфат кальция и крахмал. Приемлемые связующие вещества могут включать, например, прежелатинизированный крахмал, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, сополивидон, желатин, натуральные камеди, крахмальный клейстер, сахарозу, кукурузный сироп, полиэтиленгликоли и альгинат натрия. Приемлемые смазывающие вещества могут включать, например, гидрогенезированное растительное масло, стеарат кальция и глицерилбегенат. Согласно одному из вариантов осуществления фармацевтической композиции растворимый в воде наполнитель выбирают из группы, состоящей из безводной лактозы, моногидрата лактозы, маннитола, хлорида натрия, сахарной пудры, сорбитола, сахарозы, инозитола и прежелатинизированного крахмала; нерастворимый в воде наполнитель выбирают из группы, состоящей из микрокристаллической целлюлозы, фосфата кальция и крахмала; связующее вещество выбирают из группы, состоящей из прежелатинизированного крахмала, натрийкарбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилпирролидона, сополивидона, желатина, натуральных камедей, крахмального клейстера, сахарозы, кукурузного сиропа, полиэтиленгликолей и альгината натрия; а смазывающее вещество выбирают из группы, состоящей из гидрогенезированного растительного масла, стеарата кальция и глицерилбегената.
Фармацевтическая композиция содержит от 8 до 32 мас.%, от 8 до 24 мас.%, от 12 до 20 мас.% или от 14 до 18 мас.% нерастворимого в воде наполнителя в пересчете на сухое вещество.
- 10 029990
Фармацевтическая композиция содержит от 26 до 50 мас.%, от 30 до 46 мас.%, от 34 до 46 мас.% или от 38 до 44 мас.% растворимого в воде наполнителя в пересчете на сухое вещество.
Фармацевтическая композиция содержит от 30 до 45 мас.%, от 35 до 40 мас.% и от 36 до 39 мас.% гемитартрата соединения формулы (I) в пересчете на сухое вещество.
Фармацевтическая композиция обычно содержит от 2 до 6 мас.% связующего вещества в пересчете на сухое вещество.
Фармацевтическая композиция обычно содержит от 0,1 до 2 мас.% смазывающего вещества в пересчете на сухое вещество.
В конкретном воплощении фармацевтическая композиция содержит от 8 до 32 мас.% нерастворимого в воде наполнителя, от 26 до 50 мас.% растворимого в воде наполнителя, от 30 до 45 мас.% гемитартрата соединения формулы (I), от 2 до 6 мас.% связующего вещества и от 0,1 до 2 мас.% смазывающего вещества, все в пересчете на сухое вещество. Более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы, а нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза. И даже более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы; нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза; связующим веществом является гидроксипропилметилцеллюлоза; а смазывающим веществом является глицерилбегенат.
В конкретном воплощении фармацевтическая композиция содержит от 8 до 32 мас.% нерастворимого в воде наполнителя, от 26 до 50 мас.% растворимого в воде наполнителя, от 35 до 40 мас.% гемитартрата соединения формулы (I), от 2 до 6 мас.% связующего вещества и от 0,1 до 2 мас.% смызывающего вещества, все в пересчете на сухое вещество. Более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы, а нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза. И даже более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы; нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза; связующим веществом является гидроксипропилметилцеллюлоза; а смазывающим веществом является глицерилбегенат.
В другом конкретном воплощении фармацевтическая композиция содержит от 8 до 24 мас.% нерастворимого в воде наполнителя, от 30 до 46 мас.% растворимого в воде наполнителя, от 35 до 40 мас.% гемитартрата соединения формулы (I), от 2 до 6 мас.% связующего вещества и от 0,1 до 2 мас.% смазывающего вещества, все в пересчете на сухое вещество. Более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы, а нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза. И даже более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы; нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза; связующим веществом является гидроксипропилметилцеллюлоза; а смазывающим веществом является глицерилбегенат.
В другом конкретном воплощении фармацевтическая композиция содержит от 12 до 20 мас.% нерастворимого в воде наполнителя, от 34 до 46 мас.% растворимого в воде наполнителя, от 35 до 40 мас.% гемитартрата соединения формулы (I), от 2 до 6 мас.% связующего вещества и от 0,1 до 2 мас.% смазывающего вещества, все в пересчете на сухое вещество. Более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы, а нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза. И даже более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы; нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза; связующим веществом является гидроксипропилметилцеллюлоза; а смазывающим веществом является глицерилбегенат.
В другом конкретном воплощении фармацевтическая композиция содержит от 14 до 18 мас.% нерастворимого в воде наполнителя, от 38 до 44 мас.% растворимого в воде наполнителя, от 35 до 40 мас.% гемитартрата соединения формулы (I), от 2 до 6 мас.% связующего вещества и от 0,1 до 2 мас.% смазывающего вещества, все в пересчете на сухое вещество. Более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы, а нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза. И даже более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы; нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза; связующим веществом является гидроксипропилметилцеллюлоза; а смазывающим веществом является глицерилбегенат.
В другом конкретном воплощении фармацевтическая композиция содержит от 14 до 18 мас.% нерастворимого в воде наполнителя, от 38 до 44 мас.% растворимого в воде наполнителя, от 36 до 39 мас.% гемитартрата соединения формулы (I), от 2 до 6 мас.% связующего вещества и от 0,1 до 2 мас.% смазывающего вещества, все в пересчете на сухое вещество. Более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы, а нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза. И даже более конкретно, растворимым в воде наполнителем является моногидрат лактозы; нерастворимым в воде наполнителем является микрокристаллическая целлюлоза; связующим веществом является гидроксипропилметилцеллюлоза; а смазывающим веществом является глицерилбегенат.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не предназначены для ограничения каким-либо образом.
Экспериментальная часть.
Пример 1. Получение солей соединения формулы (I).
Г емитартратная соль соединения формулы (I) легко кристаллизуется и проявляет множество полезных свойств по сравнению с другими солями. Например, для получения солей соединения, представлен- 11 029990
ного формулой (I), были использованы следующие кислоты: лимонная кислота (с образованием солей с соотношениями (соль:соединение формулы (I)) 1:1, 1:2 и 1:3); Ь-яблочная кислота (1:1 и 1:2); метансульфоновая кислота (1:1); фумаровая кислота (1:1 и 1:2), хлороводородная кислота (1:1); уксусная кислота (1:1) и винная кислота (1:1 и 1:2). Только образованные хлороводородной кислотой (1:1), винной кислотой (1:1) и винной кислотой (1:2) соли были в твердой форме. Из этих трех солей для солей хлороводородной кислоты (1:1) и винной кислоты (1:1) было обнаружено, что эти соли являются гигроскопичными и некристаллическими, а потому неприемлемы для использования в фармацевтическом продукте. Для гемитартрата (1 соль:2 соединения формулы I) соединения, представленного формулой I было обнаружено, что он является кристаллическим и негигроскопичным.
Получение гемитартрата соединения формулы (I) с использованием ацетона.
Ь-винную кислоту (6,02 г, 40,11 ммоль, 0,497 экв.) растворяли в ацетоне (175 мл) путем кипячения раствора в колбе с обратным холодильником и последующим охлаждением до комнатной температуры. Свободное основание формулы (I) (32,67 г, 80,76 ммоль) растворяли в ацетоне (300 мл) при комнатной температуре. Раствор Ь-винной кислоты добавляли в раствор свободного основания формулы (I) при комнатной температуре в течение 15 мин. В середине процесса добавления образовывался белый осадок. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч и затем недолго кипятили в колбе с обратным холодильником и охлаждали до комнатной температуры. После перемешивания при комнатной температуре в течение 0,5 ч фильтровали белый осадок. Белое твердое вещество дважды отмывали ацетоном (2x130 мл). Твердое вещество сушили на воздухе и затем под вакуумом при 55-60°С. Выход составил 36,66 г (95%).
Получение гемитартрата соединения формулы (I) с использованием 5%-ного раствора метанола в ацетоне.
10 г/24,7 ммоль свободного основания формулы (I) растворяли в 120 мл или 240 мл 5%-ного раствора метанола в ацетоне. 1,85г/12,3 ммоль Ь-винной кислоты растворяли в 60 мл или 120 мл 5%-ного раствора метанола в ацетоне (Ν или 2Ν) путем нагревания до 40-45°С, и этот раствор добавляли в первый раствор. После 1 ч без осаждения добавляли 1 мг гемитартрата соединения формулы (I) в качестве затравочного кристалла. Осаждение происходило спустя 5 мин, и реакционную смесь продолжали перемешивать в течение еще 30 мин. Затем реакционную смесь в течение 5 мин нагревали в колбе с обратным холодильником (осадок полностью растворялся) и затем охлаждали до комнатной температуры в водяной бане 20-22°С. Образовывался осадок, и реакционную смесь продолжали перемешивать в течение 3 ч. Конечный продукт собирали путем фильтрации и отмывали ацетоном 2x40 мл и затем сушили в вакуумной печи при 55-60°С в течение 16 ч. Масса продукта составила 8,72 г/выход 74%.
Получение гемитартрата соединения формулы (I) с использованием 1%-ного раствора воды в ацетоне.
Свободное основание соединения формулы (I) (10 г/24,7 ммоль) растворяли в 120 или 240 мл 1%ного раствора воды в ацетоне при комнатной температуре. 1,85г/12,3 ммоль Ь-винной кислоты растворяли в 60 или 120 мл 1%-ного раствора воды в ацетоне (Ν или 2Ν) путем нагревания до 40-45°С, и этот раствор добавляли в первый раствор. После 1 ч без осаждения добавляли 1 мг гемитартрата соединения формулы (I) в качестве затравочного кристалла. Осаждение происходило спустя 5 мин, и реакционную смесь продолжали перемешивать еще в течение 30 мин. Затем реакционную смесь в течение 5 мин нагревали в колбе с обратным холодильником (осадок растворялся не полностью) и затем охлаждали до комнатной температуры в водяной бане 20-22°С. Образовывался осадок, и реакционную смесь продолжали перемешивать в течение 3 ч. Конечный продукт собирали путем фильтрации и отмывали ацетоном 2x40 мл и затем сушили в вакуумной печи при 55-60°С в течение 16 ч. Масса продукта составила 8,62 г/выход 73%.
Перекристаллизация гемитартрата соединения формулы (I) в 5%-ном растворе метанола в ацетоне.
Гемитартрат соединения формулы (I) (3,06 г) растворяли в 116 мл 5%-ного раствора метанола в ацетоне при кипячении в колбе с обратным холодильником. Раствор охлаждали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Белый осадок фильтровали и отмывали 10 мл 5%-ного раствора метанола в ацетоне и затем ацетоном (15 мл). После вакуумной сушки в течение 18 ч при 55-60°С получено 2,38 г гемитартрата соединения формулы (I) (78% выход).
Перекристаллизация гемитартрата соединения формулы (I) в 1%-ном растворе Н2О в ацетоне.
Гемитартрат соединения формулы (I) (3,05 г) растворяли в 125 мл 1%-ного раствора Н2О в ацетоне при кипячении в колбе с обратным холодильником. Раствор охлаждали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Белый осадок фильтровали и отмывали 10 мл 1%-ного раствора Н2О в ацетоне и затем ацетоном (15 мл). После вакуумной сушки в течение ночи при 55-60°С было получено 2,35 г гемитартрата соединения формулы (I) (77% выход).
Пример 2. Получение кристаллического гемитартрата соединения формулы (I).
Г емитартрат соединения формулы (I) кристаллизовали несколькими способами. Партию 1 готовили с использованием растворителей этилацетат/ацетон и сушили при комнатной температуре. Партию 3 готовили с использованием растворителей этилацетат/ацетон и перекристаллизовали из этилацетата.
- 12 029990
Партию 4 перекристаллизовали из ацетона с использованием материала партии 1. Партию 5 перекристаллизовали из изопропанола. Партию 7 готовили с использование растворителя этилацетат/ацетон аналогично партии 1, но в большом количестве. Партию 8 готовили с использованием только ацетона без дополнительной перекристаллизации. Партию 9 готовили с использованием только ацетона с кратким кипячением в колбе с обратным холодильником снова без дополнительной перекристаллизации.
Таблица 1
Обобщенные результаты скрининга полиморфизма партий 1-9 гемитартрата соединения формулы (I)
Партия № Способ обработки ДСК Микроскопия Термогравиметрический анализ
Точка плавления (°С) Энтальпия (Дж/г)
1 Осаждение в ацетоне/этил ацетате* 162 -81,4 Кристаллы 99,91% при 100 °С 98,73% при 175 °С
2 Осаждение в ацетоне/этилацетате сушка при комнатной температуре* 164 -95,6 Кристаллы н/д
3 Осаждение в ацетоне/этилацетате сушка при 55-60 °С 166 -97,8 Кристаллы 100,0% при 100 °С 99,98% при 153 °С
4 Перекристаллизация из ацетона 166 -107,2 Кристаллы 100,2% при 100 °С 100,2% при 153 °С
5 Перекристаллизация из изопропанола 166 -102,6 Кристаллы 100,0% при 100 °С 100,0% при 153 °С
7 Осаждение в ацетоне/этилацетате 166 -99,4 Кристаллы ** 100,1% при 100 °С 99,91% при 153 °С
8 Осаждение в ацетоне 165 -100,7 Кристаллы ** 100,0% при 100 °С
100,0% при 153 °С
9 Осаждение в ацетоне с кратким кипячением в колбе с обратным холодильником 165 -100,2 Кристаллы
* - содержащие некоторое количество свободного основания по данным ДСК-термограммы,
** - в этих партиях имеются изменения внешнего вида кристаллов со столбчатого, пластинчатого на игольчатый, столбчатый и неправильной формы.
Кристаллические формы гемитартрата соединения формулы (I) также готовили с использованием медленного упаривания, медленного охлаждения, быстрого охлаждения и осаждения осадителем в разнообразных растворителях.
Способ медленного упаривания.
Взвешенный образец (обычно 20 мг) обрабатывали аликвотными количествами тестового растворителя. Аликвотные количества обычно составляли 100-200 мкл. В промежутках между добавлениями растворителя смесь встряхивали и обрабатывали ультразвуком. Когда твердое вещество растворялось, о чем судили путем визуального осмотра, раствор оставляли упариваться при условиях окружающей среды в открытом сосуде, прикрытом перфорированной мелкими отверстиями алюминиевой фольгой. Растворимости в этих экспериментах оценивали, основываясь на общем количестве растворителя, добавленного
- 13 029990
чтобы получить прозрачный раствор.
Таблица 2
Приблизительная растворимость гемитартрата соединения формулы (I) при комнатной температуре (20-25°С)
Органический растворитель Приблизительная растворимость (мг/мл)
Гептан нет данных
Гексан нет данных
Толуол <5
Дихлорметан 100
Этанол 29
Изопропиловый спирт <5
Ацетонитрил <5
Этилацетат <5
Метанол >200
Ацетон <5
Метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ) <5
п-диоксан <5
Тетрагидрофуран (ТНР) <5
Обобщенные результаты о полиморфизме при использовании подхода медленного упаривания
Таблица 3
Органический растворитель Твердое вещество образуется при медленном упаривании дек Микроскопия Термогравиметрический анализ
Точка плавления (°С) Энтальпия (Дж/г)
Метанол Нет н/д н/д н/д н/д
Этанол Да 165 -95,0 Кристаллы 100,0% при 100 °С 100,0% при 150 °С
** - частицы были пластинчатыми и столбчатыми.
Способ медленного/быстрого охлаждения. Гемитартрат соединения формулы (I) растворяли в тестовом растворителе при 50-60°С. Полученный в результате раствор оставляли остывать до комнатной температуры (медленное охлаждение). Если по истечении суток твердых веществ не образовывалось, сосуды помещали в холодильный шкаф. Для экспериментов по быстрому охлаждению полученный в результате раствор оставляли остывать в холодильном шкафу. Твердые вещества собирали путем фильтрования и сушили на воздухе.
Таблица 4
Обобщенные результаты о полиморфизме при использовании подхода медленного охлаждения
Органический растворитель Твердое вещество образуется при медленном охлаждении ДСК Микроскопия Термогравиметрический анализ
Точка плавления (°С) Энтальпия (Дж/г)
Этанол Да 167 -106,2 Кристал лы** 100,1% при 100 °С 100,1% при 150 °с
** - частицы были пластинчатыми и столбчатыми.
- 14 029990
Таблица 5
Обобщенные результаты о полиморфизме при использовании подхода быстрого охлаждения .
Органический растворитель Твердое вещество образуется при быстром охлаждении ДСК Микроскопия Термогравиметрический анализ
Точка плавления (°С) Энтальпия (Дж/г)
Этанол Да 167 -106,2 Кристал лы** 100,0% при 100 °С 100,0% при 150 °с
** - частицы были пластинчатыми и столбчатыми.
Способ осадителя.
Гемитартрат соединения формулы (I) растворяли в растворителе. В раствор добавляли осадитель. Образовавшиеся твердые вещества собирали путем фильтрации и сушили на воздухе.
Таблица 6
Обобщенные результаты скрининга полиморфизма при использования подхода осадителя
Органический растворитель Твердое вещество образуется при использовании подхода осадителя ДСК Микроскопия Термогравиметрический анализ
Точка плавления (°С) Энтальпия (Дж/г)
Метанол/ этил ацетат Да 167 -99,5 Кристал лы* 100,1% при 100 °С 100,1% при 150 °С
Метанол/ацетон Да 167 -106,2 Кристал лы* 100,3% при 100 °С 100,2% при 150 °С
Метанол/ ацетонитрил Нет н/д н/д н/д н/д
Метанол/толуол Нет н/д н/д н/д н/д
Метанол/ТНР Нет н/д н/д н/д н/д
Метанол/МТВЕ Да 167 -102,0 Кристал лы* 100,2% при 100 °С 100,1% при 150 °С
Метанол/пдиоксан Нет н/д н/д н/д н/д
Вода/ТНР Нет н/д н/д н/д н/д
Вода/МТВЕ Нет н/д н/д н/д н/д
Вода/изопропан ол Нет н/д н/д н/д н/д
Вода/ацетонитр ил Нет н/д н/д н/д н/д
Вода/ацетон Нет н/д н/д н/д н/д
Дихлорметан/ гептан Да 165 -89,2 Кристал лы* 100,0% при 100 °С
- 15 029990
99,99% 150 °С при
Дихлорметан/ этилацетат Да 167 -97,8 Кристал лы* 100,2% 100 °С 100,1% 150 °С при при
Дихлорметан/ толуол Да 164 -89,8 Кристал лы* 99,95% 100 °С 99,86% 150 °С при при
Дихлорметан/М ТВЕ Да 167 -98,6 Кристал лы* 100,0% 100 °С 99,91% 150 °С при при
Дихлорметан/пдиоксан Да (немного) н/д н/д н/д н/д
Дихлорметан/ изопропанол Нет н/д н/д н/д н/д
: частицы были пластинчатыми и столбчатыми,
** - отдельные частицы имели более чем один цвет двойного лучепреломления, *** - частицы были игольчатыми и столбчатыми.
Пример 3. Физические свойства гемитартрата соединения формулы (I).
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).
Данные ДСК собирали на приборе ТА ^100 использованием азота в качестве продувочного газа. Точно взвешивали приблизительно 2-5 мг пробы в алюминиевой чаше ДСК. Чашу накрывали крышкой и перфорировали пинцетом. Ячейку с образцом приводили в состояние равновесия при 30°С и нагревали со скоростью 10°С в минуту до конечной температуры 220°С.
Высокотемпературная микроскопия.
Высокотемпературную микроскопию осуществляли с использованием нагревательного столика Ыпкат (тойе1 ΡΉΚ 600), смонтированного на микроскопе кекса ΌΜ ЬР, оснащенном камерой 8опу ВХС-970МИ 3ССИ для получения фотографий. Для наблюдения за образцами использовали 40 х объектив с поляризованным светом. Каждую пробу помещали между двух покровных стекол. Каждую пробу визуально наблюдали при нагревании столика. Фотографии получали с использованием программы Ьтк§ версии 2.27 (Ьткат). Нагревательный столик калибровали с использованием стандартов определения точки плавления фармакопеи США.
Эндотермический переход, наблюдаемый на кривой ДСК, подтверждали наличием фазового перехода в расплав при температуре от 160 до 163°С с помощью высокотемпературной микроскопии.
Пример 4. Рентгеновская порошковая дифрактометрия гемитартрата соединения формулы (I).
Все анализы рентгеновской порошковой дифрактометрии (ΧΚΡΌ) выполняли в 38СС Ыс. (^е§1 ЬаГауейе, ΓΝ 47906). ΧΚΡΌ анализы проводили с использованием рентгеновского порошкового дифрактометра ЗЫтай/ц ΧΚΌ-6000 и СиКа излучения. Прибор оснащен рентгеновской трубкой с точной фокусировкой. Напряжение и силу тока трубки устанавливали на 40 кВ и 40 мА соответственно. Рассеивающие щели устанавливали на 1°, а принимающую щель устанавливали на 0,15 мм. Рассеянное излучение определяли с помощью NаI сцинтилляционного детектора. Использовали θ-2θ непрерывное сканирование при скорости 3°/мин (шаг 0,4с/0,02°) с 2,5 до 40° 2θ. Для проверки настройки прибора анализировали кремниевый стандарт. Данные собирали и анализировали с использованием ΧΚΌ-6000 ν 4.1.
Пример 5. Сравнение гемитартрата соединения формулы (I) и свободного основания формулы (I).
Характеристики свободного основания и гемитартратной соли как твердого вещества кратко приведены в табл. 7. Гемитартрат соединения формулы (I) имел лучшие свойства по сравнению со свободным основанием формулы (I). Например, гемитартрат соединения формулы I имел более высокую точку плавления (>150°С), более высокую энергию упаковки (большую эндотермическую энтальпию), меньший разброс размера частиц, более высокую растворимость в воде (свыше 300 мг/мл в воде), приемлемую форму кристаллов и более высокую насыпную плотность по сравнению со свободным основанием формулы I.
- 16 029990
Таблица 7
Краткие сведения о твердой фазе и физических и химических свойствах свободного основания формулы (I) и гемитартрата соединения формулы (I)
Физические характеристики Свободное основание формулы (I) Гемитартрат формулы (I) соединения
Точка плавления (°С) 86-88 163
Эндотермическая энтальпия (Дж/г) 75-82 96-106
Размер частиц (мкм) <10 до 100 ~ 3 (в среднем)
Растворимость в воде (мг/мл) 0,04 >216
Кристаллическое вещество Да Да
Форма кристаллов Игольчатая Пластинчатая, столбчатая, некоторое количество неправильной формы
Гигроскопичность (40°С/75 % относительная влажность) Отсутствует Отсутствует
Насыпная плотность ~0,2 0,4-0,5
Пример 6. Активность и специфичность ΐη νίΐΓΟ.
Активность гемитартрата соединения формулы (I) при ингибировании синтеза глюкосфинголипидов ΐη νίΐΓΟ.
Для количественной оценки ингибирующей глюкозилцерамидсинтазу активности гемитартрата соединения формулы (I) использовали два метода анализа. Поскольку синтез глюкозилцерамида является первой и лимитирующей скорость стадией в биосинтезе глюкосфинголипидов, для непрямого определения активности ингибитора в интактных клетках использовали метод проточной цитометрии, которым измеряется содержание ΘΜ1 и ΘΜ3 на поверхности клеток. Инкубирование в течение 72 ч клеток К562 или В16/Т10 совместно с повышенными количествами гемитартрата соединения формулы (I) (0,6-1000 нмоль) давало в результате дозозависимое снижение содержания ΘΜ1 и ΘΜ3 на поверхности клеток. Среднее значение Юо для ингибирования присутствия ΘΜ1 на поверхности клеток для клеток К562 составило 24 нмоль (диапазон 14-34 нмоль) (табл. 8), а для ингибирования присутствия ΘΜ3 на поверхности клеток для клеток В16/Т10 составило 29 нмоль (диапазон 12-48 нмоль). Даже при тестировании самых высоких доз для обеих линий клеток не отмечалось никакой явной клеточной токсичности.
Альтернативным методом анализа активности измерялось ингибирование глюкозилцерамидсинтазы в полученных из клеток человека микросомах. В этом анализе микросомы готовили из А375 клеток меланомы человека путем обработки их ультразвуком и центрифугированием. Микросомальный препарат в течение одного часа инкубировали при комнатной температуре вместе с флуоресцентным церамидным субстратом (ИВИ-С6-церамид), УДФ-глюкозой и повышенными количествами гемитартрата соединения формулы (I) (0-1000 нмоль). После инкубирования разделяли флуоресцентно-меченый глюкозилцерамид и непрореагировавший церамид и количественно оценивали при помощи обращенно-фазовой ИРЬС и флуоресцентного детектирования. Для этого метода анализа значение Κ70 для ингибирования синтеза глюкозилцерамида находилось в диапазоне от 20 до 40 нмоль. Это значение было похоже на значение, полученное выше для ΘΜ1 и ΘΜ3, и это дает основание полагать, что измерения этих сфинголипидов на поверхности клеток являются хорошими идентификаторами активности гемитартрата соединения формулы (I) для глюкозилцерамидсинтазы.
Специфичность ингибирования синтеза субстрата гемитартратом соединения формулы (I).
Специфичность гемитартрата соединения формулы (I) оценивали в серии клеточных и бесклеточных анализов ΐη νίΐΓΟ. Кишечные ферменты глюкозидазы анализировали на крысиных тканевых гомогенатах (см. и. Апбегззоп, еΐ а1., Вюсйеш. Рйагш. 59 (2000) 821-829, все сведения из которой включаются в настоящую заявку путем ссылки). При концентрациях вплоть до 2500 мкмоль не было обнаружено поддающегося обнаружению ингибирования кишечных глюкозидаз (лактазы, мальтазы, сахаразы), аглюкозидазы I и II и цитозольного деветвящего фермента (а-1,6-глюкозидазы) (табл. 8).
Нелизосомальную глюкозилцерамидазу и лизосомальную глюкоцереброзидазу анализировали в интактных клетках человека с использованием в качестве субстрата С6-ИВИ-глюкозилцерамида (см. И.8. Ονе^к1еей, еΐ а1. I. Вю1. Сйеш. 273 (1998) 26522-26527, все сведения из которой включаются в настоящую заявку путем ссылки). Для того чтобы различить лизосомальную от нелизосомальной активности использовали кондуритол-р-эпоксид (специфический ингибитор лизосомальной глюкоцереброзидазы). Активность глюкоцереброзидазы также измеряли с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (ТАС8). Клетки К562 в течение 30-60 мин выращивали в питательной среде с повышенными количествами гемитартрата соединения формулы (I) в присутствии 1 мкмоль 5-(пентафторбензоиламино)флуоресцеина ди-р-И-глюкопиранозидазы (РРВ-ТИС1и, Μο^^γ РгоЪезАпуйгодеп. Саг1зЬаб, СА). Клет- 17 029990
ки немедленно замораживали на льду и количественно оценивали флуоресценцию, как указано выше. Нелизосомальная глюкозилцерамидаза слабо ингибировалась ГС50 1600 мкмоль. Ингибирования лизосомальной глюкоцереброзидазы, повреждающегося при болезни Гоше фермента, не было вплоть до самой высокой концентрации 2500 мкмоль (табл. 8). Следовательно, для того чтобы ингибировать глюкозилцерамидсинтазу по сравнению с любыми другими протестированными ферментами, требуется разница в концентрации примерно 40000.
Таблица 8
Биохимическая активность гемитартрата соединения формулы (I) ΐη νΐΐΓΟ
Активность ингибирования субстрата (ίη νίίτο Ю50): -0,024 мкмоль
Специфичность к ферменту, Ю50:
α-глюкозидаза I и II: >2500 мкмоль
Лизосомальная глюкоцереброзидаза (ОВА1): >2500 мкмоль
Нелизосомальная глюкозилцерамидаза(ОВ А2): 1600 мкмоль
Глюкоген-деветвящий фермент: >2500 мкмоль
Специфичности к ферментам, К;:
Ингибирование сахаразы: Не ингибируется до 10 мкмоль
Ингибирование мальтазы: Не ингибируется до 10 мкмоль
Пример 7. Улучшенное управление содержанием лизосомального глюкозилцерамида на мышиной модели.
Болезнь Гоше.
Для того чтобы определить, может ли последовательное использование ферментозаместительной терапии (ЕКТ) и субстратснижающей терапии (8КТ) привести к дополнительным благоприятным эффектам, сравнивали относительные эффективности отдельных и последовательной терапий на мышиной модели болезни Гоше (В409У/пи11).
Методы.
Исследования на животных.
Процедуры с использованием животных рассматривались и утверждались ^81114110^1 Ашта1 Саге апй И§е СоттШее ^ЛСИС) при Сеп/уте Согрогайоп, следуя нормам, установленным Αδδοοΐαΐΐοη &г А88е88теп1 апй Аеегеййайоп о£ ЬаЬога1огу Ашта1 Саге (АААБАС). Мыши Саиейег (В409У/пи11) являются моделью болезни Гоше типа 1, проявляющейся в накоплении глюкозилцерамида в печени, селезенке и легких, но без костной патологии или патологии головного мозга (см. Υ.-Η. Хи, е1 а1., Ат. 1. Ра1йо1. 163, 2003, 2093-2101, все сведения из которой включаются в настоящую заявку путем ссылки). Животные обоего пола вводились в исследование в возрасте 3 месяцев, поскольку предыдущие эксперименты показали, что между самцами и самками не было разницы в ответах на рекомбинантную глюкоцереброзидазу или гемитартрат соединения формулы (I). В исследовании участвовали 6 групп мышей совместно с группой А, умерщвленной после 2 недель исследования, для того чтобы определить исходное содержание глюкозилцерамида в тканях. Группы В, С и Ό каждые 2 суток получали рекомбинантную глюкоцереброзидазу человека (Сеп/уте Согр., СатЪгЫде, МА) (10 мг/мг) внутривенно через хвостовую вену (100 мкл), всего 8 инъекций. Группу В умерщвляли в конце этой схемы лечения (в тоже самое время, что и группу А), чтобы получить сниженное ферментом содержание глюкозилцерамида в тканях. Группы Ό и Е получали с пищей гемитартрат соединения формулы (I) (Сепгуте Согр., СатЪгЫде, МА) в виде компонента гранул корма. Лекарственное средство составляло 0,075% (мас./мас.) в стандартной пище 5053 мышей (Те8Ю1е1, Кгейтопй, ΓΝ) и предоставлялось свободно. Эта композиция обеспечивала дозу гемитартрата соединения формулы (I) 150 мг/кг в сутки для 25 г мыши. Группа Р не получала лечения и была умерщвлена наряду с группами С, Ό и Е 12 недель спустя после начала исследования. Потребление пищи и массы мышей контролировали 3 раза в неделю, чтобы определить потребление лекарственного средства и возможное влияние лекарственного средства на общее самочувствие. Животных забивали ингаляцией углекислого газа и немедленно собирали их ткани. Половину каждой ткани быстро замораживали на сухом льду и хранили при -80°С до готовности для дополнительной обработки. Другую половину подвергали гистологическому исследованию.
Количественное определение содержания глюкозилцерамида в тканях.
Содержание глюкозилцерамида количественно определяли с помощью масс-спектрометрии как ранее описано (см. К. МеЕаейегп, е1 а1., I. Сепе. Мей. 8 (2006) 719-729; Т. Ооегшд, I. Вю1. Сйет. 274 (1999) 11038-11045, все сведения из которой включаются в настоящую заявку путем ссылки). Ткань известной массы гомогенизировали в хлороформе:метаноле 2:1 (об./об.) и выдерживали при 37°С в течение 15 мин. Образцы центрифугировали, и надосадочные жидкости экстрагировали 0,2 объемами воды в течение ночи при 4°С. Образцы центрифугировали, водную фазу сбрасывали, а органическую фазу осушали в азоте до пленки. Для масс-спектрометрического исследования с ионизацией электрораспылением (Е8I/М8) образцы ткани ресуспендировали до массы, эквивалентной 50 нг исходной ткани, в 1 мл хлороформа:метанола (2:1, об./об.) и перемешивали в вортексе в течение 5 мин. Аликвоты (40 мкл) каждого
- 18 029990
образца помещали в сосуды торговой марки То1а1 Кесоуегу ΥίαΕ фирмы \Уа1ег5 и добавляли 50 мкл 10 мкг/мл внутреннего стандарта б3-С16-ОЬ-1 (Ма1геуа. Шс., Иеакаи! Оар, РА). Образцы высушивали в азоте и ресуспендировали в 200 мкл 1:4 (об./об.) ДМСО:метанола. ЕШ/МЗ анализ глюкозилцерамидов с различной длиной углеродной цепи проводили на НРЬС системе \Уа1ег5 аШапсе НРЬС (Зерагайоп Моби1е 2695), подсоединенном к системе М1сгота88 ОиаИго Мюго куЧет, оснащенной электрораспылительным ионным источником. Образцы липидного экстракта (20 мкл) вводили в колонку С8 (4 млх3 мм внутреннего диаметра, РЬепотепех, Тоггаисе, СА) при 45°С и элюировали с градиентом от 50 до 100% ацетонитрилом (2 ммоль ацетата аммония, 0,1% муравьиной кислоты) при 0,5 мл/мин. Первые 0,5 мин поддерживали 50% органической фазы и затем в течение последних 3,5 мин переключали на 100%. Температуру источника поддерживали постоянной при 150°С, а в качестве осушающего газа использовали азот при расходе 670 л/ч. Поддерживали капиллярное напряжение 3,8 кВ с напряжением на конусе 23 В, в то время как время выдержки для каждого вида ионов составляло 100 мс. С помощью режима МКМ была получена спектральная функция для мониторинга восьми доминантных изоформ (С16:0, С18:0, С20:0, С22:1, С22:0, С22:1-ОН, С24:1 и С24:0). Количественное определение содержания глюкозилцерамида основывалось на суммировании содержаний этих восьми изоформ относительно внутреннего стандарта с калибровочной кривой в диапазоне от 0,1 до 10 мкг/мл.
Г истология.
Для гистологического исследования ткани в течение 24 ч при комнатной температуре фиксировали в цинк-формалине (Е1ес!гои Мюгоксору Зшепсек, На4йе1б, РА), затем хранили в физиологическом растворе с фосфатным буфером при 4°С до готовности для дополнительной обработки. Все образцы дегидрировали в этаноле, светляли в ксилоле, инфильтрировали и заключали в парафин ЗигдраШ К (§иг§1раШ, КюЬтопб, ГЬ). С помощью микротома вырезали пятимикронные гистологические срезы и до окрашивания высушивали их в печи при 60°С. Гистологические срезы депарафинизировали в Нето-Эе (Заеиййс 5>а1с1у §о1уеи18, Ке11ег, ТХ) и регидратировали в уменьшающихся концентрациях этанола с последующей отмывкой физиологическим раствором с фосфатным буфером. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и метили с помощью крысиного антимышиного моноклонального антитела СЭ68 (§его!ес, Ка1е1дЬ, КС), для того чтобы определить макрофаги. После отмывки физиологическим раствором с фосфатным буфером в течение 5 мин микроскопические препараты дегидратировали в этаноле и очищали в Нето-Эе для заливки покровной гистологической средой ЗНИК/Моии!™ (ТВЗ, ЭигНат, ЫС). Процент площади СЭ68 иммуноположительности в печени количественно оценивали с помощью МеШМогрН анализа (МО§ Аиа1уйса1 ТесНпо1од1е8, ТогоЫо, Сапаба) десяти 400х фотографий на гистологический срез ткани. Все срезы в слепом относительно группы назначения режиме оценивал получивший профессиональную сертификацию ветеринар.
Результаты.
Режим дозирования глюкоцереброзидазы для снижения объема накопления ОЬ1 в печени, селезенке и легких 3 -месячных мышей Оаискег.
Для того чтобы исследовать относительные преимущества комбинации и монотерапии ферментили субстратснижающей терапией, вначале определяли режим введения фермента, максимально снижающий содержание ОЬ-1 во внутренних органах мышей Оаискег. Трехмесячным мышам ОаисЬег (Ό409ν/ηιι11) внутривенно вводили 2, 4 или 8 доз рекомбинантной глюкоцереброзидазы человека 10 мг/кг. Мыши, получавшие лечение 2 или 4 дозами фермента, получали инфузии лекарственного средства каждые 3 суток, в то время как мыши, получавшие лечение 8 дозами, получали фермент каждые 2 суток. Использование более коротких интервалов между инфузиями животным, получавшим лечение 8 дозами, было разработано для того чтобы минимизировать возможное воздействие на какой-либо иммунный ответ на вводимый человеческий фермент. Животных забивали 7 суток спустя после последней инфузии и измеряли количество ОЬ1, оставшееся в печени, селезенке и легких.
Лечение 2 дозами глюкоцереброзидазы на 50% снижало содержание ОЬ1 в печени. Увеличение количества инфузии фермента до 4 или 8, как и ожидалось, в большей степени снижало содержания ОЬ1 в печени (приблизительно на 75%). Неполное снижение содержаний ОЬ1 даже 8 дозами соотносится с опытом с субъектами с болезнью Гоше, показывающим, что гепатоспленомегалия снижается только после продолжительного лечения (см. О.А. ОгаЪоуккц е1 а1., Апп. Ση!. Меб. 122 (1995) 33-39, все сведения которой включаются в настоящую заявку путем ссылки). Еще труднее поддавались снижению лечением ферментом содержания субстрата в селезенке мышей Оаискег. Введение 2 доз глюкоцереброзидазы значимо не меняло содержания ОЬ1 по сравнению с содержаниями, обнаруженными в не получавшем лечения контроле. Увеличение числа инфузии фермента до 4 или 8 снижало селезеночные содержания ОЬ1 на около 50%. В легких после 8 доз наблюдалось снижение до 60% уровня не получавшего лечения контроля. Немного более низкая степень снижения субстрата в легких возможно вызвана более слабой доступностью вводимого фермента для содержащих большое количество липидов альвеолярных макрофагов. Обнаружение большего очищения печени от ОЬ1 по сравнению с селезенкой и легкими правдоподобно отражает биораспределение фермента после систематического введения (см. М. Vаη РаИеп, е1 а1. О1усоЫо1о§у 17 (2007) 467-478, все сведения которой включаются в настоящую заявку путем ссылки).
- 19 029990
Основываясь на этих результатах, для последующих исследований использовали режим лечения, состоящий из 8 последовательных доз глюкоцереброзидазы 10 мг/кг, вводимых с 2-дневными интервалами.
Относительные способности фермент- и субстратснижающей терапии снижать содержания ОЬ1 в печени мышей ОаисЬет.
Когорты 3-месячных мышей ОаисЬег получали лечение рекомбинантной глюкоцереброзидазой или гемитартратом соединения формулы (I) по отдельности или последовательно. Мышам в группах В, С и Ό давали 8 доз фермента как описано выше (в течение 2 недель) для очистки от накопленного ОЬ1. Затем различные группы получали питание обычной пищей или пищей, содержащей гемитартрат соединения формулы (I) (150 мг/кг/сутки), в течение дополнительных 10 недель, с не получавшей лечение группой Р и служившей в качестве естественного контроля. Вне зависимости от состава пищи мыши съедали сравнимые количества пищи, и не было заметных различий в увеличении массы. Приблизительно 80% накопленных содержаний ОЬ1 выводилось из печени после 2-недельной терапии исключительно ферментом. Если этим животным позволяли развиваться без дополнительного лечения в течение 10 недель, содержания ОЬ1 в их печени повышались, указывая на то, что в наступающем периоде происходило повторное накопление субстрата (фиг. 2, колонка С). Эти содержания незначительно отличались от содержаний не получавшего лечения контроля (фиг. 2, колонка Р). Однако если мыши получали лечение ферментом и затем в течение 10-недельного периода гемитартратом соединения формулы (I) в пище, содержания ОЬ1 в их печени были значительно меньше, чем у не получавшего лечения контроля (фиг. 2, колонки Ό и Р). Эти результаты дают основание полагать, что дополнительное лечение гемитартратом соединения формулы (I) замедляло повторное накопление субстрата. Примечательно, что мыши ОаисЬег, получавшие лечение только гемитартратом соединения формулы (I) в течение всего периода исследования (12 недель), также демонстрировали более низкие содержания ОЬ1 (фиг. 2, колонка Е) по сравнению с не получавшим лечение контролем той же возрастной группы (фиг. 2, колонка Р), хотя различие было незначительным. Способность §КТ в одиночку снижать содержания ОЬ1 в этой животной модели согласуется с нашим предыдущим докладом (см. К.А. МсЕасНегп, е! а1, Мо1. Оепе!. Ме!аЬ. 91 (2007) 259-267, все сведения которой включаются в настоящую заявку путем ссылки), и правдоподобно отражает тот факт, что мыши ОаисНет (Э409У/пи11) сохраняют остаточную ферментную активность (см. Υ.-Н. Хи, е! а1, Ат. 1. Ра!Но1. 163, 2003, 2093-2101, все сведения которой включаются в настоящую заявку путем ссылки).
Относительные способности фермент- и субстратснижающей терапии снижать содержания ОЬ1 в селезенке мышей ОаисНет.
Лечение 3-месячных мышей ОаисНет рекомбинантной глюкоцереброзидазой в течение 2 недель в одиночку снижало селезеночные содержания ОЬ1 приблизительно на 60% (фиг. 3, колонка В). Если этим животным позволяли созревать в течение дополнительных 10 недель без дополнительного вмешательства, содержания субстрата возвращались к содержаниям, наблюдавшимся в начале исследования (фиг. 3, колонка С), и незначительно отличались от не получавшего лечения контроля (фиг. 3, колонка Р). Это дает основание полагать, что скорость повторного накопления ОЬ1 в селезенке была выше, чем в печени. Это предположение также подтверждалось наблюдением более высоких базальных содержаний субстрата в селезенке (~1500 мг/г ткани; фиг. 2, колонка А), чем в печени (~500 мг/г ткани; фиг. 3, колонка Ό). Животные, которые получали лечение ферментом и затем в течение следующих 10 недель гемитартратом соединения формулы (I), демонстрировали самое высокое снижение селезеночных содержаний ОЬ1 (фиг. 3, колонка Ό), и эти содержания были значительно ниже, чем содержания в селезенке не получавшего лечения контроля (фиг. 3, колонка Р). Это указывает на то, что применение §КТ не только задерживает повторное накопление субстрата, но также способна дополнительно снижать тяжесть накопления в этом органе. Похоже, что, по меньшей мере, в данном случае совокупный эффект остаточного эндогенного фермента и снижение субстрата приводят к дополнительному снижению общих содержаний субстрата. Наблюдение у получавших в течение 12 недель лечение только гемитартратом соединения формулы (I) мышей (фиг. 3, колонка Е) более низких селезеночных содержаний ОЬ1, чем у не получавшего лечения контроля (фиг. 3, колонка Р), согласовывалось с этой точкой зрения, хотя различия были незначительными. Следовательно, лечение с помощью ЕКТ с последующей §КТ потенциально может повысить скорость и возможно даже степень выведения провоцирующего субстрата у пациентов с болезнью Гоше типа 1 средней тяжести.
Относительные способности фермент- и субстратснижающей терапии снижать содержания ОЬ1 в легких мышей ОаисНет.
Как указано ранее, легочные содержания ОЬ1 наименее эффективно выводились с помощью внутривенного введения рекомбинантной глюкоцереброзидазы. Лечение 3-месячных мышей ОаисНет ферментом в течение 2 недель давало в результате только 30% снижение содержаний субстрата в легких (фиг. 4, колонка В). Когорта животных, получавших в течение последующих 10 недель обычную пищу, как и ожидалось, демонстрировала повторное накопление ОЬ1 и при этом не было значительной разницы с содержаниями ОЬ1 не получавшей лечения группы (фиг. 4, колонки С и Р). В отличие от этого животные, получавшие пищу, содержащую гемитартрат соединения формулы (I), в течение такого же периода вмешательства, демонстрировали снижение содержаний субстрата ниже, чем у животных, которым вводили только фермент (фиг. 4, колонка Ό), и значительно ниже, чем у животных в не получавшем лечении
- 20 029990
контроле (фиг. 4, колонка Р). И снова это дает основание полагать, что в легких, также как и селезенке, совокупный эффект гемитартрата соединения формулы (I) (в присутствии остаточной активности эндогенного фермента) не только замедляет повторное накопление СЬ1, но также дополнительно снижает его содержание ниже исходных уровней. Так же как и для других внутренних органах, лечение только гемитартратом соединения формулы (I) было эффективным для снижения легочных содержаний СЬ1 (фиг. 4, колонка Е) по сравнению с не получавшим лечение контролем (фиг. 4, колонка Р).
Гистопатологический анализ печени мышей Саисйег поле энзим- и субстратснижающего лечения.
Для того чтобы визуализировать воздействие различных схем лечения на печень, гистологические срезы ткани окрашивали маркером макрофагов ί'.Ό68. Анализ срезов печени не получавших лечение 3месячных мышей Саисйег показал присутствие большого числа наполненных липидами СЭб8положительных клеток Гоше, которые оставались в основном неизменными при анализе 12 недель спустя. В соответствии с биохимическими данными выше печень животных, которым вводили рекомбинантную глюкоцереброзидазу в течение 2 недель, демонстрировала существенное очищение от липидов в этих аномальных макрофагах. Если этим животным позволяли развиваться дополнительно 10 недель без дополнительного лечения, подтверждалось повторное накопление СЬ1, на что указывало повторное возникновение клеток Гоше. Однако это увеличение числа клеток Гоше устранялось, если мыши получали субстрат-снижающую терапию гемитартратом соединения формулы (I) в течение такого же периода вмешательства. Как указано ранее, мыши Саисйег, получавшие только гемитартрат соединения формулы (I), также демонстрировали снижение накопления субстрата, хотя и не в той же самой степени, что мыши Саисйег, получавшие комбинацию ЕКТ и §КТ. Степень СОб8-положительного окрашивания на разнообразных срезах оценивалась также количественно с использованием программного обеспечения Ме(аМогрй (фиг. 18). Степень окрашивания в этих гистологических срезах, отражающая содержания СЬ1 в печени, дополнительно подтверждает предположения о сравнительной эффективности различных схем лечения.
Пример 8. Эффективность гемитартрата соединения формулы (I) на мышиной модели болезни Гоше.
Исследования на животных.
Процедуры с использованием животных рассматривались и утверждались !п5111и11опа1 Ашта1 Саге апб Ике СоттШее ДАСИС), следуя нормам Аккошайоп Гог Ак8е88теп( апб АссгеФ(а(юп о£ Ьайога(огу Атта1 Саге (АААЬАС), нормам Штата и Федеральным нормам. Мышам Саисйег §йаС409У/пи11 (см. Υ.-Η. Хи. е( а1., Ат. Г Ра(йо1. 1б3 (2003) 2093-2101, все сведения из которой включаются в настоящую заявку путем ссылки) позволяли созреть в соответствии с требованиями исследования. Поскольку у самцов и самок не было обнаружено никакой разницы в фенотипе или ответе на гемитартрат соединения формулы (I), в исследованиях использовались оба пола. Гемитартрат соединения формулы (I) вводили путем однократного суточного принудительного вспаивания при объеме 10 мл/кг. Животных в течение одной недели перед началом исследования приучали к принудительному вспаиванию аналогичным объемом воды. Гемитартрат соединения формулы (I) растворяли в воде для инъекций (\УРЕ У\УК. \Уек1 Сйек(ег, РА) и вводили с увеличением дозы от 75 до 150 мг/кг/сутки в течение 9-дневного курса, с 3 сутками на каждую дозу и шагом повышения дозы 25 мг/кг/сутки. Мышей взвешивали три раза в неделю, чтобы отследить потенциальное воздействие лекарственного средства на их общее самочувствие. Животных забивали с помощью ингаляции углекислого газа и немедленно собирали их ткани. Половину каждой ткани быстро замораживали на сухом льду и хранили при -80°С до готовности для дополнительной обработки. Другую половину подвергали гистологическому исследованию.
Количественное определение содержаний глюкозилцерамида с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии.
Анализ высокоэффективной тонкослойной хроматографией (НРТЬС) был таким же как описано А. Айе, е( а1. в I С1ш. Шу. 105 (2000) 1563-1571; Н. 2йао, е( а1. 1®1Йе1ек 5б (2007) 1341-1349 и 8.Р.Р. МШег, е( а1. в I Ьай. С1ип Меб. 127 (199б) 353-358, все сведения из которых включаются в настоящую заявку путем ссылки). Коротко, общую липидную фракцию получали гомогенезированием ткани в холодном физиологическом растворе с фосфатным буфером, экстрагируя смесью хлороформ:метанол 2:1 (об./об.) и обрабатывая ультразвуком в ультразвуковом аппарате с водяной баней. Чтобы разделить фазы, образцы центрифугировали и отделяли надосадочную жидкость. Гранулы повторно обрабатывали ультразвуком в смеси хлороформ:метанол:физиологический раствор, центрифугировали, и полученную в результате вторую надосадочную жидкость собирали и комбинировали с первой. К скомбинированным надосадочным жидкостям добавляли смесь хлороформ:физиологический раствор 1:1 (об./об.), перемешивали в вортексе и центрифугировали. После отбрасывания верхнего водного слоя добавляли смесь метанол:физиологический раствор, перемешивали в вортексе и повторно центрифугировали. Органическую фазу отбирали и сушили в азоте, растворяли в смеси хлороформ:метанол 2:1 (об./об.) из расчета 1 мл на 0,1 г исходной массы ткани и хранили при -20°С.
Часть липидного экстракта использовали, чтобы измерить содержание общего фосфата (см. Β.Ν. Атек, Ме(йобк Еп/уто1. 8 (19бб) 115-118, все сведения которой включаются в настоящую заявку путем ссылки), например, содержание фосфолипида, чтобы использовать его в качестве внутреннего стандарта.
- 21 029990
Остатки подвергали щелочному метанолизу, чтобы удалить фосфолипиды, переносимые вместе с глюкозилцерамидом на НРТЬС планшет. Аликвоты экстарактов, содержащих эквивалентные количества общего фосфата, наносили в виде пятен на НРТЬС планшет совместно с известными стандартами глюкозилцерамида (МаЛеуа шс. Р1еакай Сар, РА). Липиды повторно растворяли и визуализировали 3%-ным моногидратом ацетата меди (мас./об.), 15%-ной фосфорной кислотой (об./об.) с последующей термической обработкой в течение 10 мин при 150°С. Липидные полосы сканировали на денситометре (С8-700, ΒίοРаб, Негси1ек, СА) и анализировали с помощью программного обеспечения ЦиапШу Опе (Вю-Раб).
Количественный анализ содержания глюкозилцерамида в тканях с помощью масс-спектрометрии.
Глюкозилцерамид количественно анализировали с помощью масс-спектроскопии как описано (см. К. МсЕасЬегп, е1 а1. 1. Сепе Меб. 8 (2006) 719-729; Т. Боеппд, е1 а1, 1. Вю1. СЬет. 274 (1999) 11038-11045, полное содержание каждого из документов включено в настоящее описание посредством ссылки). Ткань гомогенизировали в 2:1 (об./об.) хлороформ:метанол и инкубировали при 37°С. Образцы центрифугировали, и надосадочные жидкости экстрагировали с использованием 0,2 объемов воды в течение ночи. Образцы центрифугировали снова, водную фазу отбрасывали, а органическую фазу полностью высушивали до пленки в атмосфере азота.
Для масс-спектрометрического исследования с ионизацией электрораспылением (Е8КМ8) образцы ткани ресуспендировали до эквивалента 50 нг первоначальной массы ткани в 1 мл смеси хлороформ/метанол (2:1, об./об.) и перемешивали в вортексе в течение 5 мин. Аликвоты каждого образца (40 мкл) помещали в сосуды торговой марки То1а1 Ресоуету У1а1к фирмы \Уа1егк и добавляли 50 мкл внутреннего стандарта б3-С16-СЬ-1 с концентрацией 10 мкг/мл (МаЛеуа, Шс., Р1еакай Сар, РА). Образцы сушили в атмосфере азота и ресуспендировали с использованием 200 мкл 1:4 ОМ8О:метанола. Е8КМ8 анализ глюкозилцерамидов с различной длиной углеродной цепи проводили на НРЬС системе \Уа1егк аШапсе НРЬС (8ерата!юп Моби1е 2695), соединенной с системой Мютотакк СнаИго Мюто, снабженной ионным источником для электрораспыления. 20 мкл образцов липидного экстракта вводили в колонку С8 (4 млх3 мм внутренний диаметр; РЬепотепех, Тоггапсе, СА) при 45 °С и элюировали с градиентом 50100% ацетонитрила (2 ммоль ацетата аммония, 0,1% муравьиной кислоты) при 0,5 мл/мин. Первые 0,5 мин поддерживали 50% органического вещества, а затем быстро переключали на 100% в течение последних 3,5 мин. Температуру источника поддерживали постоянной при 150°С, а в качестве осушающего газа использовали азот при скорости потока 670 л/ч. Напряжение капилляра поддерживали при 3,80 кВ с напряжением на конусе 23 В, тогда как время выдержки для каждого вида ионов составляло 100 мс. С помощью режима МРМ была получена спектральная функция для мониторинга восьми доминантных изоформ (С16:0, С18:0, С20:0, С22:1. С22:0. С22:1-ОН, С24:1, и С24:0). Количественное определение содержания глюкозилцерамида основывалось на суммировании содержаний этих восьми изоформ относительно внутреннего стандарта с калибровочной кривой в диапазоне от 0,1 до 10 мкг/мл.
Гистология.
Для гистологического анализа ткани фиксировали в цинк-формалине (Е1ес1гоп Мютоксору 8с1епсек, НаЛте1б, РА) при комнатной температуре в течение 24 ч, затем хранили в физиологическом растворе с фосфатным буфером при 4°С до готовности к последующей обработке. Все образцы дегидратировали в повышающихся концентрациях спирта, осветляли в ксилоле и инфильтрировали и заключали в парафин 8игщр;Ц11 Р (8итд1ра1Ь, РюЬтопб, [Ш). Гистологические срезы толщиной 5 мкм вырезали, используя ротационный микротом, и сушили в печи при 60°С перед окрашиванием. Гистологические срезы депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в понижающихся концентрациях спирта с последующим промыванием водой. После 1 мин промывания в 3%-ной уксусной кислоте, микроскопические препараты окрашивали в течение 40 мин в 1%-ном альциановом синем 8СХ (Е1ес!топ Мютоксору 8шепсек) в 3%-ной уксусной кислоте рН 2,0. После промывания в воде и окисления в 1%-ной йодной кислоте в течение 1 мин микроскопические препараты окрашивали реактивом Шиффа (8ит§1ра1Ь) в течение 12 мин. После промывания в течение 5 мин в горячей воде микроскопические препараты дегидратировали в спирте и осветляли в ксилоле перед заливкой покровной гистологической средой 8НИР/Моип1™ (ТВ8, ОнгНат, N0). Клетки Гоше, морфологически идентифицированные в печени, количественно анализировали с путем подсчета клеток вручную в 10 полях зрения под большим увеличением (НРРк, 400х).
Результаты.
Эффект от введения гемитартрата соединения формулы (I) мышам Э409У/пи11.
Определяли эффект от введения гемитартрата соединения формулы (I) мышам О409У/пи11. Мышам в возрасте примерно 7 месяцев вводили 150 мг/кг/сутки гемитартрата соединения формулы (I) (доза, показанная эффективной при ингибировании глюкозилцерамидсинтазы в предварительных исследованиях) посредством принудительного вспаивания в течение 10 недель. Это лечение не оказывало заметного воздействия на самочувствие или пищевые привычки мышей. Измерения их массы тела на протяжении всего исследования не показали существенного отклонения от массы тела мышей, не получавших лечения, давая основание полагать, что гемитартрат соединения формулы (I) хорошо переносился в дозе, которая была показана эффективной при ингибировании синтазы.
Эффективность гемитартрата соединения формулы (I) при лечении молодых мышей до появлений
- 22 029990
симптомов болезни Гоше.
Гемитартрат соединения формулы (I) оценивали в отношении уменьшения лизосомального накопления глюкозилцерамида и появления клеток Гоше у молодых мышей Э409У/пи11 (10-недельного возраста). У этих молодых мышей СаисЬег демонстрируются низкие содержания СЬ-1 в пораженных тканях. Животным десятинедельного возраста в течение 10 недель посредством принудительного вспаивания вводили 75 или 150 мг/кг/сутки гемитартрата соединения формулы (I). Измерение содержаний глюкозилцерамида показало дозозависимое снижение по сравнению с контрольными животными той же возрастной группы, которым вводили носитель. В когорте, получавшей лечение 150 мг/кг/сутки, содержание глюкозилцерамида составляло 60, 40 и 75% от содержания в контроле, в печени, легких и селезенке, соответственно (фиг. 6). Статистически значимое более низкое содержание глюкозилцерамида, наблюдаемое в печени и легких получавших лечение мышей Э409У/ш11, указывали на то, что гемитартрат соединения формулы (I) был эффективен при снижении накопления этого гликосфинголипида в этих тканях.
Гистопатологическая оценка печени мышей Э409У/пи11, не подвергавшихся лечению, в конце исследования (20 недельный возраст) показала наличие клеток Гоше по всей печени. У мышей, получавших лечение 150 мг/кг/сутки гемитартрата соединения формулы (I) в течение 10 недель, было показано только случайное наличие клеток Гоше, которые также были неизменно меньшего размера. Количественная оценка этих клеток в ряде различных срезов подтвердила, что частота встречаемости клеток Гоше была значительно ниже у мышей, получавших лечение гемитартратом соединения формулы (I). Вместе эти биохимические и гистологические сведения дают основания предположить, что ежедневное пероральное введение гемитартрата соединения формулы (I) мышам до появления симптомов болезни Гоше было эффективным в снижении накопления глюкозилцерамида в пораженных тканях и последующем образовании клеток Гоше в печени.
Эффективность гемитартрата соединения формулы (I) при лечении старых мышей СаисЬег с уже существующей патологией.
Также оценивали эффективность гемитартрата соединения формулы (I) в задержке или реверсии прогрессирования заболевания у старых мышей с симптомами болезни Гоше. Семимесячным мышам Э409У/пи11 вводили 150 мг/кг/сутки гемитартрата соединения формулы (I) посредством принудительного вспаивания в течение 10 недель. Анализы содержания глюкозилцерамида в печени, легких и селезенке получавших лечение мышей на 5 и 10 неделе после обработки показали отсутствие увеличения свыше того, что наблюдалось в начале исследования. После 10 недель лечения содержания глюкозилцерамида, которые были определены, были на 60% ниже в печени, на 50% ниже в легких и на 40% ниже в селезенке, чем у мышей, получавших лечение носителем. Эти результаты показали, что гемитартрат соединения формулы (I) был эффективен при ингибировании дальнейшего накопления глюкозилцерамида у мышей с существующей отягощенной патологией накопления.
Гистопатологическое исследование срезов тканей показало сниженное число клеток Гоше в печени мышей Э409У/пи11, получавших лечение, по сравнению с контрольными животными без лечения. Количественное определение числа клеток Гоше подтвердило биохимические данные у мышей Э409У/пи11, подвергавшихся лечению, было показано, что количество клеток Гоше, которое существенно не отличалось от этого количества в начале лечения как в момент времени на 5, так и на 10 неделе. Число клеток Гоше в оба эти момента времени было значительно ниже, чем число клеток у мышей Э409У/пи11, не подвергавшихся лечению. Взятые вместе эти данные демонстрируют, что гемитартрат соединения формулы (I) эффективно ингибировал дальнейшее накопление глюкозилцерамида и развитие клеток Гоше у животных с уже существующей патологией.
Обсуждение.
Гемитартрат соединения формулы (I) показал высокую степень специфичности в отношении фермента глюкозилцерамидсинтазы. Также не было измеримого ингибирования активности глюкоцереброзидазы в эффективной дозе, что является важной особенностью при лечении пациентов с болезнью Гоше 1 типа, у большинства из которых сохраняется остаточная глюкоцереброзидазная активность. В эффективной дозе 150 мг/мг/сутки не было наблюдаемых желудочно-кишечных проблем и не было отличия в массе тела между группами животных, получавших лечение и группами контрольных животных, не получавших лечения. Сывороточные концентрации в Κ.'50 (24-40 нмоль) и выше быстро достигались при использовании пероральных доз, которые были ниже максимально переносимого уровня. Гемитартрат соединения формулы (I) также быстро метаболизировался и выводился: как исходное соединение, так и метаболиты эффективно выводились в течение 24 ч, как показано в испытаниях ΑΌΜΕ с однократными и повторными дозами с соединением, радиоактивно-меченным 14С, у крыс и собак.
Используя неоптимизированный режим дозирования однократной суточной дозы пероральный препарат, вводимый принудительным вспаиванием, успешно предотвращал накопление глюкозилцерамида как у молодых мышей до появления симптомов заболевания, так и у старых мышей СаисЬег, у которых уже демонстрировалась патология аккумулирования. У молодых мышей в возрасте 10 недель, хотя и накапливалось повышенное содержание глюкозилцерамида по сравнению с контрольными животными дикого типа, еще не развивались характерные набухшие тканевые макрофаги, называемые клетка- 23 029990
ми Гоше. Лечение с использованием 150 мг/кг/сутки гемитартрата соединения формулы (I) останавливало любое значительное прогрессирование заболевания и ингибировало развитие клеток Гоше. У старых мышей, у которых наблюдалось более высокое содержание лизосомального глюкозилцерамида и числа клеток Гоше, не было дальнейшего повышения содержания глюкосфинголипида или числа накопленных клеток либо спустя 5 недель, либо спустя 10 недель лечения. Поскольку, как сообщалось, основной источник глюкозилцерамида в клетках ОаисИег является внеклеточного происхождения, эти результаты означали, что ингибирование глюкозилцерамидсинтазы под действием гемитартрата соединения формулы (I) было системным.
Наблюдение того, что гемитартрат соединения формулы (I) был эффективным для профилактики дальнейшего накопления глюкозилцерамида, предлагает терапевтическую стратегию, которая могла бы в дальнейшем улучшить лечение болезни Гоше.
Таким образом, данные, представленные в настоящем документе, показали, что гемитартрат соединения формулы (I) является активным и специфичным ингибитором глюкозилцерамидсинтазы, демонстрирующим отсутствие выраженных побочных эффектов в мышиной модели болезни Гоше. Это соединение с успехом предотвращало прогрессирование заболевания как у мышей Оаисйег до появления симптомов, так и у старых, пораженных болезнью, мышей Оаисйег, путем ингибирования накопления глюкозилцерамида и образования клеток Гоше. Эти данные дают возможность предположить, что гемитартрат соединения формулы (I) может представлять еще один возможный способ лечения болезни Гоше 1 типа как у детей, так и у взрослых, и, потенциально, других болезней накопления гликосфинголипидов.
Пример 9. 2-я фаза клинических испытаний гемитартрата соединения формулы (I).
Методы.
В этом клиническом испытании гемитартрата соединения формулы (I), вводимого 50 или 100 мг перорально два раза в сутки, лечили 26 взрослых людей с болезнью Гоше 1 типа (ΘΌ1) (16Ж:10М; средний возраст 34 года, диапазон 18-60; все лица белой расы) в 7 местах в 5 странах. Пациенты были со спленомегалией (объем 10 нормальных) и либо с тромбоцитопенией (тромбоциты 45000-100000/мм3), либо с анемией (гемоглобин 8-10 г/дл, женщины; 8-11 г/дл, мужчины). Ни один из них не получал заместительную ферментную или субстратснижающую терапию в предыдущие 12 месяцев. Основным совокупным показателем эффективности является содержание глобина (+0,5 г/дл) или количество тромбоцитов (+15%) после 52 недель лечения. Также оценивали объем печени, хитотриозидазу, глюкозилцерамид. Пациенты продолжали проходить лечение и находились под наблюдением врача длительное время.
Результаты.
Данные 52 недели были доступны для 20 пациентов; 4 других досрочно отказались от участия и 2 продолжали испытание. Совокупный основной показатель эффективности обеспечивался 19 из 20 пациентов. Средние (18Ό) изменения по сравнению с исходным содержания к 52 неделе представляли собой: гемоглобин +1,6 (11,35) г/дл; количество тромбоцитов +43,6% (137,59%); объем селезенки и печени (кратный нормальному) 40,2% (110,44%) и 15,8% (110,39%) соответственно; и хитотриозидаза 49,9% (120,75 %). Содержание глюкозилцерамида в плазме приходило в норму через 4 недели у всех пациентов, гемитартрат соединения формулы (I) хорошо переносился с приемлемыми показателями безопасности. Сообщалось о семи связанных с этим препаратом случаях побочных эффектов у шести пациентов; все были слабовыраженными и временными по характеру.
Пример 10. Фармацевтическая композиция гемитартрата соединения формулы (I), капсулы 100 мг.
Способ получения капсул 100 мг: гемитартрат соединения формулы (I), микрокристаллическую целлюлозу, моногидрат лактозы и гипромеллозу, Е15 отдельно пропускали через сито размером 20 меш. Количества просеянных ингредиентов, показанные в табл. 9, перемешивали в грануляторе с высоким усилием сдвига в течение 9-12 мин.
Таблица 9
Фармацевтическая композиция для капсул 100 мг
Единичное количество
Ингредиент Единичное количество капсулы 100 мг (мг) % на единичную дозу (% масс/масс) Номинальный размер партии: 71000 капсул общее количество 19,2 кг
Гемитартрат соединения формулы (I) 100,0 37,0 7,1
Микрокристаллическая целлюлоза 45,0 16,7 3,2
Моногидрат лактозы 111,5 41,3 7,9
Гипромеллоза, Е15 10,8 4,0 0,8
Г лицерил бегенат 2,7 1,0 0,2
Масса заполнения (мг) 270 248-292 мг
Общий % композиции 100,0 19,2 кг
Затем ингредиенты подвергали влажной грануляции путем добавления очищенной воды (2,2 кг;
- 24 029990
11,7% массы сухих ингредиентов) в чашу гранулятора пока не завершится процесс, что подтверждается визуально. Влажный гранулят выгружали из чаши и пропускали через вращающееся лопастное колесо, просеивающую дробилку. Затем влажный гранулят высушивали в стационарной монолитной сушильной печи с непосредственным обогревом с опорной плитой и поддоном при температуре 50±5°С до содержания влаги не более 3,5%, как подтверждено внутрипроизводственной проверкой. Сухие гранулы затем пропускали через просеивающую дробилку, и просеянные гранулы переносили в У-смеситель. Глицерилбегенат (0,2 кг) добавляли в У-смеситель, и конечную смесь перемешивали до однородности смеси, как определено с помощью теста однородности смеси в едином масштабе времени или автономно, обычно в течение 10-20 мин. Конечную смесь затем инкапсулировали в капсулы размером № 2, используя полуавтоматический наполнитель капсул, до соответствующей массы заполнения (270 мг в среднем), и заполненные капсулы обеспыливали перед упаковкой.
Пример 11А. Фармацевтическая композиция гемитартрата соединения формулы (I), капсулы 10 мг.
Способ получения капсул 10 мг.
Процесс, описанный в примере 10, осуществляли до стадии инкапсулирования. Для получения капсул 10 мг конечную смесь инкапсулировали, используя машину для заполнения капсул, в капсулы размером № 4 или 5 до соответствующей массы заполнения (27 мг в среднем), и заполненные капсулы обеспыливали перед упаковкой.
Пример 11В. Фармацевтическая композиция гемитартрата соединения формулы (I), капсулы 50 мг.
Способ получения капсул 50 мг.
Процесс, описанный в примере 10, осуществляли до стадии инкапсулирования. Для получения капсул 50 мг конечную смесь инкапсулировали, используя машину для заполнения капсул, в капсулы размером № 3 до соответствующей массы заполнения (135 мг в среднем), и заполненные капсулы обеспыливали перед упаковкой.
Пример 11С. Фармацевтическая композиция гемитартрата соединения формулы (I), капсулы 150 мг.
Способ получения капсул 150 мг.
Процесс, описанный в примере 10, осуществляли до стадии инкапсулирования. Для получения капсул 150 мг конечную смесь инкапсулировали, используя машину для заполнения капсул, в капсулы размером № 0 до соответствующей массы заполнения (405 мг в среднем), и заполненные капсулы обеспыливали перед упаковкой.
Пример 12. Фармацевтическая композиция гемитартрата соединения формулы (I), капсулы 25 мг.
Способ получения капсул 25 мг.
Процесс, описанный в примере 10, осуществляли до стадии инкапсулирования. Для получения капсул 25 мг конечную смесь инкапсулировали, используя машину для заполнения капсул, в капсулы размером #4 до соответствующей массы заполнения (67,5 мг в среднем), и заполненные капсулы обеспыливали перед упаковкой.
Пример 13. Лекарственные взаимодействия гемитартрата соединения формулы (I) - ингибиторы СУР2И6.
Исследование проводили для оценки фармакокинетических параметров, безопасности и переносимости многократных пероральных доз гемитартрата соединения формулы (I) (100 мг два раза в сутки), вводимых с пароксетином - мощным ингибитором СУР2И6 (30 мг один раз ежедневно) и без него. Это испытание представляло собой открытое испытание с фиксированной последовательностью действий на 36 здоровых людях (17 мужчин и 19 женщин). Дополнительными задачами было оценить РК пароксетина в сочетании с многократными дозами гемитартрата соединения формулы (I) (100 мг два раза в сутки) у здоровых людей, и дополнительно оценить РК гемитартрата соединения формулы (I) после многократных доз по сравнению с введением однократной дозы гемитартрата соединения формулы (I).
Средние значения РК параметров свободного основания гемитартрата соединения формулы (I), как он существует в плазме, были нелинейными и показали 2-кратное накопление в АИС и Стах с повторным введением (100 мг два раза в сутки) по сравнению с введением однократной дозы. Одновременное введение гемитартрата соединения формулы (I) и пароксетина в результате приводило к 7-кратному увеличению Стах и 9-кратному увеличению АИС по сравнению с многократным введением только гемитартрата соединения формулы (I). Эти результаты указывают на то, что пароксетин может ингибировать метаболизм гемитартрата соединения формулы (I) и повышает концентрации этого лекарственного средства в плазме крови. Аналогичные эффекты ожидались бы и с другими мощными ингибиторами СУР2И6 (например, флуоксетином и квинидином) и тщательное наблюдение за содержанием лекарственного средства в плазме и корректировки возможных доз необходимы в тех случаях, когда гемитартрат соединения формулы (I) вводят совместно с лекарственным средством, известным как мощный ингибитор СУР2И6. Концентрации пароксетина составляли примерно в 1,5-2 раза выше, чем ожидалось, что дает возможность предположить, что гемитартрат соединения формулы (I) или один из его метаболитов может являться легким ингибитором СУР2И6.
Пример 14. Лекарственные взаимодействия гемитартрата соединения формулы (I) - ингибиторов СУР3А4 и ингибиторов р-гликопротеина (РОР).
Исследование проводили для оценки фармакокинетических параметров, безопасности и переноси- 25 029990
мости многократных доз гемитартрата соединения формулы (I) (100 мг дважды в сутки) с многократными дозами кетоконазола (400 мг один раз ежедневно) или без него у здоровых лиц мужского и женского пола. Это исследование представляло собой открытое исследование с фиксированной последовательностью действий на 36 здоровых людях (18 мужчин и женщин), состоящее из 3 периодов, которые включали однократное введение 100 мг дозы гемитартрата соединения формулы (I), многократное введение дозы гемитартрата соединения формулы (I) и одновременное введение 100 мг гемитартрата соединения формулы (I) (два раза ежедневно) с 400 мг кетоконазола (один раз ежедневно). Повторное введение гемитартрата соединения формулы (I) и кетоконазола, сильного ингибитора цитохрома Р450 3А4 ("СУР 3А4") и р-гликопротеина, в результате приводило к 4-кратному увеличению времени воздействия свободного основания гемитартрата соединения формулы (I), как он существует в плазме в равновесной концентрации. Таким образом, пациенты, уже получающие гемитартрат соединения формулы (I), могут нуждаться во временном уменьшении дозы во время одновременного лечения сильными ингибиторами СУР 3А4 или р-гликопротеина.
Пример 15. Исследования стабильности для композиции гемитартрата соединения формулы (I). Смеси готовили путем перемешивания гемитартрата соединения формулы (I) и эксципиентов (моногидрата лактозы капсулирующей степени чистоты, Ау1се1 РН 301 (микрокристаллической целлюлозы) и Ме1йосе1 Е15 Ргет ЬУ (гидроксипропилметилцеллюлозы)) в сцинтилляционном флаконе со шкалой примерно два грамма. 15,6% воды добавляли в смесь и перемешивали для получения влажных гранул. Влажные гранулы просеивали, используя сито №10 (отверстия 2000 мкм). Просеянные гранулы затем высушивали в печи при 50°С в течение 2 ч. Высушенные гранулы просеивали, используя сито №18 (отверстия 1000 мкм). Смазывающее вещество, глицерилбегенат, добавляли в смесь и перемешивали для получения конечной смеси. Полученные смеси показаны в табл. 10, приведенной ниже
Таблица 10
№ серии АР Моногидрат лактозы Ανΐοβΐ РН 101 Композиция 50 мг/100 мг Комментарии
1 1 2,1 2,1 50 контроль
2 1 2,1 0 50 Без Α νί се1
3 1 0 2,1 50 Без лактозы
4 1 2,1 1,1 50 Меньшее количество Аысе!
5 1 1,1 2,1 50 Меньшее количество лактозы
6 1 2,1 0,8 50 Соотношение Аысе! и лактозы аналогично 100 мг
7 1 1,1 0,4 100 контроль
Метилцеллюлозу (НРМС) использовали в диапазоне от 2 до 4%.
Компритол АТО 88 использовали в диапазоне от 1 до 1,6%.
Семь композиций смесей, которые имели различные соотношения АФИ:лактоза:Ауюе1, перечисленные выше, подвергали воздействию высокой температуры при 85°С в течение 3 суток (исследование в условиях форсированной деградации), чтобы узнать скорость деградации и стабильность каждой композиции. Это условие ускоренного испытания было выбрано исходя из результатов исследования, что степень продуктов деградации 50 мг готовой лекарственной формы через 24 месяца была сравнимой с таковой, полученной при 85°С в течение 3 суток.
Исследование форсированной деградации проводили, используя метод градиентной НРЬС с обращенной фазой, в котором использовали колонку С18 (Аа!егз Т3, 3 мкм, 100x4,6 мм), подвижные фазы, состоящие из воды и ацетонитрила с 0,1%-ной трифторуксусной кислотой (ТРА), УФ-обнаружение при 280 нм, при температуре колонки 40°С, и скорости потока 2 мл/мин. Градиент начинался при поддерживании на уровне 5% В (ацетонитрил и 0,1% ТРА) в течение 0,5 мин, а затем увеличивался органический компонент при 4,83% В в минуту вплоть до 15 мин.
Общие продукты деградации каждой смеси композиции суммировали и наносили на график в зависимости от соотношения АФИ:лактоза:Ауюе1, и результаты показаны на фиг. 15. Результаты этого исследования дают основания полагать, что при поддержании постоянным соотношения АФИ и лактозы уменьшение количества Ау1се1 улучшает стабильность композиции. В тех случаях, когда Ауюе1 удален, композиция имеет соотношение АФИ:лактоза:Ауюе1 1:2,1:0, это является наиболее стабильной композицией. В тех случаях, когда удалена лактоза, композиция имеет соотношение АФИ:лактоза:Ауюе1 1:0:2,1, и эта композиция не является наиболее нестабильной по сравнению с другими соотношениями. Объединенная информация дает основания полагать, что лактоза стабилизирует эту композицию, тогда как авицел дестабилизирует эту композицию. Однако в тех случаях, когда присутствуют оба эксципиента, они взаимодействуют друг с другом. Это соотношение должно быть скорректировано для получения стабильной композиции.
Для активных фармацевтических ингредиентов наподобие гемитартрата соединения формулы (I), которые являются водорастворимыми, микрокристаллическая целлюлоза помогает формировать гранулы
- 26 029990
во время влажной грануляции, поскольку она нерастворима в воде. Если микрокристаллическая целлюлоза не используется, происходит резкое изменение от состояния гранул до пастообразой формы. Пастообразую форму было трудно обрабатывать, и полученные в результате частицы после высушивания не имели подходящей механической прочности и распределения по размеру частиц. Фармацевтическая композиция, которая содержит 37 мас.% гемитартрата соединения формулы (I), 41,0 мас.% растворимого в воде наполнителя; 16,7 мас.% нерастворимого в воде наполнителя, от 2 мас.% до примерно 6 мас.% связующего вещества и примерно от 0,1 мас.% до примерно 2 мас.% смазывающего вещества, все в пересчете на сухое вещество, обладает наилучшим профилем стабильности в отношении количества образованных продуктов деградации.
Сведения, представленные во всех патентах, опубликованных патентных заявках и ссылках, процитированных в настоящем документе, включены посредством ссылки в полном объеме.
Хотя настоящее изобретение было, в частности, показано и описано со ссылкой на его варианты воплощения, приводимые в качестве примера, специалистам в данной области будет понятно, что в настоящем изобретении могут быть сделаны различные изменения в форме и в частностях, не отклоняясь от объема, заключенного в прилагаемой формуле изобретения.

Claims (18)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения субъекта, страдающего болезнью Гоше, который был определен как характеризующийся слабым, средним или быстрым метаболизмом посредством Р450, включающий введение субъекту соединения, представленного следующей структурной формулой:
    или его фармацевтически приемлемой соли, где если субъект характеризуется слабым метаболизмом, то соединение вводится в эффективном количестве, и если субъект характеризуется средним или быстрым метаболизмом, то соединение вводится в уточненном эффективном количестве, где указанное уточненное эффективное количество больше указанного эффективного количества.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Р450 представляет собой СУР2И6 или СУР3А4.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что субъект определен как характеризующийся слабым, средним или быстрым метаболизмом посредством генотипирования.
  4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что субъект определен как характеризующийся слабым метаболизмом, имея два мутантных аллеля гена СУР2И6, которые в результате дают полную потерю ферментной активности.
  5. 5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что субъект определен как характеризующийся слабым метаболизмом в результате низкой экспрессии Р450.
  6. 6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что субъект определен как характеризующийся слабым метаболизмом в результате получения лечения лекарственным средством, являющимся ингибитором Р450.
  7. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что субъект имеет один аллель со сниженной активностью и один нулевой аллель СУР2И6 или субъект имеет по меньшей мере один и не более чем два нормальных функциональных аллеля СУР2И6.
  8. 8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой пароксетин, флуоксетин или квинидин.
  9. 9. Способ по любому из пп.4-8, отличающийся тем, что соединение вводят в ежедневной дозе от 25 до 150 мг.
  10. 10. Способ по любому из пп.4-8, отличающийся тем, что соединение вводят в ежедневной дозе от 50 до 100 мг.
  11. 11. Способ по п.3, отличающийся тем, что субъект определен как характеризующийся средним метаболизмом, имея один аллель со сниженной активностью и один нулевой аллель гена СУР2И6.
  12. 12. Способ по п.3, отличающийся тем, что субъект определен как характеризующийся быстрым метаболизмом, имея по меньшей мере один и не более чем два нормальных функциональных аллеля гена СУР2И6.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что соединение вводят в уточненном эффективном количестве, представляющем собой дозу более 100 мг в сутки.
  14. 14. Способ по любому из пп.11-13, отличающийся тем, что соединение вводят в ежедневной дозе от 100 до 300 мг.
  15. 15. Способ по любому из пп.11-14, отличающийся тем, что соединение вводят в ежедневной дозе от 150 до 200 мг.
    - 27 029990
  16. 16. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что субъект представляет собой человека.
  17. 17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что указанная болезнь Гоше представляет собой болезнь Гоше типа 1.
  18. 18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что соединение представлено гемитартратной солью соединения указанной структурной формулы.
    - 28 029990
EA201592195A 2009-11-27 2010-11-24 Способы лечения ингибиторами глюкозилцерамидсинтазы EA029990B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26474809P 2009-11-27 2009-11-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201592195A1 EA201592195A1 (ru) 2016-04-29
EA029990B1 true EA029990B1 (ru) 2018-06-29

Family

ID=43431870

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201890254A EA201890254A3 (ru) 2009-11-27 2010-11-24 Ингибиторы глюкозилцерамидсинтазы
EA201270646A EA023923B1 (ru) 2009-11-27 2010-11-24 Ингибиторы глюкозилцерамидсинтазы
EA201592195A EA029990B1 (ru) 2009-11-27 2010-11-24 Способы лечения ингибиторами глюкозилцерамидсинтазы

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201890254A EA201890254A3 (ru) 2009-11-27 2010-11-24 Ингибиторы глюкозилцерамидсинтазы
EA201270646A EA023923B1 (ru) 2009-11-27 2010-11-24 Ингибиторы глюкозилцерамидсинтазы

Country Status (41)

Country Link
US (6) US11458119B2 (ru)
EP (5) EP3599237B1 (ru)
JP (6) JP2013512252A (ru)
KR (5) KR20180049255A (ru)
CN (5) CN112521367B (ru)
AR (3) AR079152A1 (ru)
AU (3) AU2010324810B2 (ru)
BR (1) BR112012012947B8 (ru)
CA (3) CA3075788C (ru)
CL (2) CL2012001348A1 (ru)
CR (1) CR20120277A (ru)
CY (3) CY1115880T1 (ru)
DK (3) DK3133070T3 (ru)
DO (2) DOP2012000141A (ru)
EA (3) EA201890254A3 (ru)
EC (2) ECSP12011926A (ru)
ES (4) ES2586947T3 (ru)
GT (1) GT201200161A (ru)
HK (2) HK1172031A1 (ru)
HR (3) HRP20140780T4 (ru)
HU (2) HUE029371T2 (ru)
IL (4) IL310635A (ru)
LT (2) LT3133070T (ru)
MA (1) MA33838B1 (ru)
ME (1) ME02477B (ru)
MX (1) MX358345B (ru)
MY (2) MY192644A (ru)
NI (1) NI201200096A (ru)
NZ (3) NZ715108A (ru)
PE (2) PE20171255A1 (ru)
PH (1) PH12015502514A1 (ru)
PL (4) PL3599237T3 (ru)
PT (4) PT3599237T (ru)
RS (3) RS53503B2 (ru)
SG (2) SG10201800136QA (ru)
SI (3) SI2504332T2 (ru)
SM (1) SMT201600273B (ru)
TN (1) TN2012000237A1 (ru)
TW (3) TWI586663B (ru)
UA (1) UA113491C2 (ru)
WO (1) WO2011066352A1 (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8889127B2 (en) 2004-07-01 2014-11-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Targeted protein replacement for the treatment of lysosomal storage disorders
HUE029371T2 (en) 2009-11-27 2017-02-28 Genzyme Corp GENZ 112638 For treatment of Gaucher or Fabry disease in combination therapy
CN103764824B (zh) * 2011-06-20 2018-04-24 西奈山医学院 粘多糖贮积症和其它溶酶体病症的抗TNF-α疗法
HUE051021T2 (hu) 2011-09-07 2021-01-28 Sinai School Medicine Ceramidáz és sejtek differenciálódása
WO2013078413A1 (en) * 2011-11-22 2013-05-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modulators of lipid storage
DK2854910T3 (da) 2012-06-01 2020-05-04 Icahn School Med Mount Sinai Ceramidniveauer i behandling og forebyggelse af infektioner
CA2905449A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Therapeutic acid ceramidase compositions and methods of making and using them
AU2014321397C1 (en) * 2013-09-20 2019-08-01 Biomarin Pharmaceutical Inc. Glucosylceramide synthase inhibitors for the treatment of diseases
CA2954030A1 (en) * 2014-07-03 2016-01-07 Dr. Reddy's Laboratories Limited Amorphous form of eliglustat hemitartarate
WO2016166170A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Sandoz Ag Crystalline eliglustat hydrochloride
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
MX2018006250A (es) 2015-11-18 2018-09-05 Genzyme Corp Biomarcador de enfermedad poliquistica renal y usos del mismo.
CN107445938B (zh) * 2016-05-31 2020-04-03 北京启慧生物医药有限公司 依利格鲁司他半酒石酸盐的结晶形式、制备方法和含有所述结晶形式的药用组合物
CN106349210A (zh) * 2016-08-24 2017-01-25 北京阳光诺和药物研究有限公司 一种制备酒石酸艾力骨司坦的方法
EP3318277A1 (en) 2016-11-04 2018-05-09 Institut du Cerveau et de la Moelle Epiniere-ICM Inhibitors of glucosylceramide synthase for the treatment of motor neuron diseases
WO2018193090A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Amneal Pharmaceuticals Company Gmbh Process for preparation of eliglustat hemitartrate and intermediates thereof
WO2018225085A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Cipla Limited Stable solid dispersions of eliglustat hemitartrate
JP7045726B2 (ja) * 2017-06-16 2022-04-01 ベータ ファーマ，インコーポレイテッド Ｎ－（２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）－４－メトキシ－５－（（４－（１－メチル－１ｈ－インドール－３－イル）ピリミジン－２－イル）アミノ）フェニル）アクリルアミドおよびその塩の医薬品製剤
US20200222310A1 (en) * 2017-08-08 2020-07-16 Kashiv Biosciences, Llc Pharmaceutical composition comprising eliglustat
EP3664798A4 (en) * 2017-08-08 2021-05-05 Kashiv Biosciences, LLC PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH ELIGLUSTAT
MX2020006272A (es) * 2017-12-15 2020-09-14 Genzyme Corp Metodos para tratar la enfermedad de gaucher.
WO2019123476A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Sarudbhava Formulations Private Limited Stable amorphous eliglustat premix and process for the preparation thereof
US11760741B2 (en) 2018-05-02 2023-09-19 Kashiv Biosciences, Llc Pro-drugs of eliglustat
AU2019276882A1 (en) * 2018-05-27 2021-01-14 Bioasis Technolgies Inc. Treatment of gaucher disease
CN110878079A (zh) * 2018-12-31 2020-03-13 北京启慧生物医药有限公司 一种高纯度依利格鲁司他的制备方法
CN116120274A (zh) * 2021-11-12 2023-05-16 曙方(上海)医药科技有限公司 依利格鲁司他可药用盐及其晶型

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006053043A2 (en) * 2004-11-10 2006-05-18 Genzyme Corporation Methods of treating diabetes mellitus

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8311286D0 (en) 1983-04-26 1983-06-02 Searle & Co Carboxyalkyl peptide derivatives
DE3522475A1 (de) 1985-06-22 1987-01-02 Kali Chemie Pharma Gmbh Neue aromatische verbindungen, ihre herstellung und verwendung
US5041441A (en) 1988-04-04 1991-08-20 The Regents Of The University Of Michigan Method of chemotherapy using 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol
ZA929008B (en) 1991-12-13 1993-05-21 Bristol Myers Squibb Co Piperazinyl- and piperidinyl-cyclohexanols.
US5302609A (en) 1992-12-16 1994-04-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diabetic nephropathy
US5399567A (en) 1993-05-13 1995-03-21 Monsanto Company Method of treating cholera
WO1995005177A1 (fr) 1993-08-13 1995-02-23 Seikagaku Corporation Remede contre les maladies nerveuses
US6309823B1 (en) 1993-10-26 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same
PT742789E (pt) 1994-02-02 2000-12-29 Liposome Co Inc Lipossomas e compostos farmaceuticamente activos e metodos para a sua utilizacao
CN1152907A (zh) 1994-06-10 1997-06-25 生化学工业株式会社 2-酰胺基丙醇化合物及其药物组合物
FR2734819B1 (fr) 1995-05-31 1997-07-04 Adir Nouveaux composes de la piperazine, de la piperidine et de la 1,2,5,6-tetrahydropyridine, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant
US5916911A (en) 1995-09-20 1999-06-29 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide--like compounds and therapeutic methods of use
US20030073680A1 (en) 1995-09-20 2003-04-17 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US6255336B1 (en) 1995-09-20 2001-07-03 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
WO2001004108A1 (en) 1999-07-09 2001-01-18 Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US6890949B1 (en) 1999-07-09 2005-05-10 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
NO965193L (no) 1995-12-08 1997-06-09 Seikagaku Kogyo Kk Seikagaku C Aminalkoholderivat og fremgangsmåte for fremstilling derav
JP3993908B2 (ja) 1995-12-08 2007-10-17 生化学工業株式会社 アミノアルコール誘導体及び該誘導体の製造方法
JP4140984B2 (ja) 1995-12-20 2008-08-27 生化学工業株式会社 分化誘導作用を有する薬剤
US5972928A (en) 1997-05-21 1999-10-26 Johns Hopkins University Methods for treatment of conditions associated with lactosylceramide
JP4036500B2 (ja) 1997-05-23 2008-01-23 生化学工業株式会社 アミノアルコール誘導体及びそれを含有する医薬
JP4176170B2 (ja) 1997-06-06 2008-11-05 生化学工業株式会社 アミノアルコール誘導体を含む医薬及び異常増殖性疾患治療薬
US6465488B1 (en) 1997-12-11 2002-10-15 Chancellor, Masters & Scholars Of The University Of Oxford Inhibition of glycolipid biosynthesis
AU756008B2 (en) 1998-07-27 2003-01-02 Johns Hopkins University, The Methods for treating conditions modulated by lactosylceramide
US6610703B1 (en) 1998-12-10 2003-08-26 G.D. Searle & Co. Method for treatment of glycolipid storage diseases
AU774960B2 (en) * 1999-07-09 2004-07-15 Regents Of The University Of Michigan, The Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
KR20020071931A (ko) * 2000-01-07 2002-09-13 트렌스폼 파마수티컬스 인코퍼레이티드 다양한 고체-형태들의 고도의 자료 처리 편성, 확인 및분석
US6977723B2 (en) 2000-01-07 2005-12-20 Transform Pharmaceuticals, Inc. Apparatus and method for high-throughput preparation and spectroscopic classification and characterization of compositions
ES2277301T3 (es) 2000-04-24 2007-07-01 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Solvato de hemitartrato de zolpidem.
US6436987B1 (en) 2000-06-08 2002-08-20 Pfizer Inc. Crystalline forms of (3S-trans)-2-[3,4-dihydro-4-hydroxy-3-(phenylmethyl)-2H-1-benzopyran-7-yl]-4-(trifluoromethyl)-benzoic acid
US7148251B2 (en) 2001-01-10 2006-12-12 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US20020198240A1 (en) 2001-01-10 2002-12-26 Shayman James A. Amino ceramide - like compounds and therapeutic methods of use
WO2002062777A2 (en) 2001-01-10 2002-08-15 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US20040260099A1 (en) 2001-01-10 2004-12-23 The Regents Of The University Of Michigan Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
EP1392826A2 (en) * 2001-01-18 2004-03-03 MERCK PATENT GmbH Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
PT2266968E (pt) 2001-07-16 2013-02-25 Genzyme Corp Síntese de udp-glucose: inibidores de n-acil esfingosinaglucosiltransferase
EP1281755A3 (en) 2001-07-31 2003-06-18 Pfizer Products Inc. Variants of the human cyp2d6 gene
JP4316203B2 (ja) 2001-08-08 2009-08-19 トビラ セラピューティクス インク 二環性化合物、その製造法および用途
US7893101B2 (en) 2002-03-20 2011-02-22 Celgene Corporation Solid forms comprising (+)-2-[1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-methylsulfonylethyl]-4-acetylaminoisoindoline-1,3-dione, compositions thereof, and uses thereof
US20060217560A1 (en) 2002-04-29 2006-09-28 Shayman James A Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
US6916802B2 (en) 2002-04-29 2005-07-12 Genzyme Corporation Amino ceramide-like compounds and therapeutic methods of use
WO2004004702A2 (en) 2002-07-09 2004-01-15 The Scripps Research Institute Method to inhibit ischemia and reperfusion injury
US20050032070A1 (en) 2003-08-05 2005-02-10 Sebastian Raimundo Polymorphisms in the human gene for CYP2D6 and their use in diagnostic and therapeutic applications
ATE504588T1 (de) * 2004-01-27 2011-04-15 Synthon Bv Stabile salze von olanzapin
CA3113166A1 (en) 2004-09-30 2006-04-13 Vanda Pharmaceuticals Inc. Methods for the administration of iloperidone
BRPI0516001A (pt) 2004-10-13 2008-08-19 Pharmacia & Upjohn Co Llc formas cristalinas de 3-[5-cloro-4-[(2, 4-difluorobenzil) óxi]-6-oxopirimidin-1(6h)-il]-n-(2-hidroxietil)-4-metilben zamida
WO2007038676A2 (en) * 2005-09-28 2007-04-05 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Polymorphic forms of ladostigil tartrate
AU2006297475A1 (en) * 2005-10-03 2007-04-12 Mallinckrodt Inc. Process for preparing zolpidem hemitartrate and tartrate polymorphs
MX2007016179A (es) 2006-04-17 2008-03-11 Teva Pharma Formas cristalinas de o-desmetilvenlafaxina.
PL2032134T3 (pl) 2006-05-09 2015-11-30 Genzyme Corp Sposoby leczenia stłuszczeniowej choroby wątroby obejmujące hamowanie syntezy glikosfingolipidów
KR101271225B1 (ko) 2006-10-31 2013-06-03 삼성디스플레이 주식회사 발광 다이오드 칩 및 발광 다이오드 광원 모듈의 제조 방법
TWI314226B (en) 2006-12-07 2009-09-01 Ind Tech Res Inst Piezoelectricity-driving optical lens module
EP1961765A1 (en) 2006-12-08 2008-08-27 Zealand Pharma A/S Truncated PTH peptides with a cyclic conformation
EP2142197A4 (en) 2007-03-30 2010-11-10 Amicus Therapeutics Inc PROCESS FOR THE TREATMENT OF FABRY DISEASE USING PHARMACOLOGICAL CHAPERONS
WO2008134628A2 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Amicus Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the treatment of lysosomal storage diseases using pharmacological chaperones
EP2594564B1 (en) * 2007-05-31 2016-09-28 Genzyme Corporation 2-acylaminopropanol-type glucosylceramide synthase inhibitors
DE102007029581B4 (de) 2007-06-26 2020-04-09 GM Global Technology Operations LLC (n. d. Ges. d. Staates Delaware) Kraftfahrzeugdach und Kraftfahrzeugkarosserie
US20090299645A1 (en) 2008-03-19 2009-12-03 Brandon Colby Genetic analysis
WO2009117150A2 (en) 2008-03-20 2009-09-24 Genzyme Corporation Method of treating lupus with ceramide derivatives
AU2010323068B2 (en) 2009-11-27 2015-09-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Treatment of genotyped diabetic patients with DPP-IV inhibitors such as linagliptin
FR2953139B1 (fr) 2009-11-27 2012-04-13 Servier Lab Composition pharmaceutique comprenant un sel de strontium, de la vitamine d et une cyclodextrine
TR201816146T4 (tr) 2009-11-27 2018-11-21 Adverio Pharma Gmbh Meti̇l-{4,6-di̇ami̇no-2-[1-(2-florobenzi̇l)-1h-pi̇razolo[3,4-b]pi̇ri̇di̇n-3-i̇l]pi̇ri̇mi̇di̇n-5-i̇lmeti̇l}karbamatin farmasöti̇k etken madde olarak kullanima yöneli̇k olarak üreti̇lmesi̇ne yöneli̇k yöntem.
HUE029371T2 (en) 2009-11-27 2017-02-28 Genzyme Corp GENZ 112638 For treatment of Gaucher or Fabry disease in combination therapy
EP2723733A1 (en) 2011-06-21 2014-04-30 Novartis AG Polymorphs of (s)-pyrrolidine-1,2-dicarboxylic acid 2-amide 1-({4-methyl-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimethyl-ethyl)-pyridin-4-yl]-thiazol-2-yl}-amide
JO3316B1 (ar) 2013-05-30 2019-03-13 Lilly Co Eli مركبات 3، 4-داي هيدرو أيزو كوينولين -2(1h)-يل
JP6728842B2 (ja) 2016-03-24 2020-07-22 オムロン株式会社 光学計測装置
CN107445938B (zh) 2016-05-31 2020-04-03 北京启慧生物医药有限公司 依利格鲁司他半酒石酸盐的结晶形式、制备方法和含有所述结晶形式的药用组合物
WO2018193090A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Amneal Pharmaceuticals Company Gmbh Process for preparation of eliglustat hemitartrate and intermediates thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006053043A2 (en) * 2004-11-10 2006-05-18 Genzyme Corporation Methods of treating diabetes mellitus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MCEACHERN KERRY ANNE ET AL: "A specific and potent inhibitor of glucosylceramide synthase for substrate inhibition therapy of Gaucher disease", MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM, ACADEMIC PRESS, AMSTERDAM, NL, vol. 91, no. 3, 1 July 2007 (2007-07-01), AMSTERDAM, NL, pages 259 - 267, XP002617211, ISSN: 1096-7192, DOI: 10.1016/J.YMGME.2007.04.001 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2493940T3 (es) 2014-09-12
HRP20161038T1 (hr) 2016-10-21
TWI586663B (zh) 2017-06-11
MX2012006083A (es) 2012-06-19
WO2011066352A8 (en) 2011-08-11
HRP20140780T1 (en) 2014-11-07
ES2875382T3 (es) 2021-11-10
TN2012000237A1 (en) 2013-12-12
PL2504332T5 (pl) 2021-08-23
PL3599237T3 (pl) 2021-09-27
AU2010324810A1 (en) 2012-06-07
KR20220162824A (ko) 2022-12-08
IL219892A0 (en) 2012-07-31
ES2493940T5 (es) 2021-11-23
CN105753846B (zh) 2019-11-15
CN112521367B (zh) 2024-01-02
EA201890254A2 (ru) 2018-10-31
MY160542A (en) 2017-03-15
US20160120842A1 (en) 2016-05-05
EA201890254A3 (ru) 2019-02-28
PT3599237T (pt) 2021-04-28
CN105777707B (zh) 2020-10-13
CA2781676C (en) 2020-05-05
KR20180049255A (ko) 2018-05-10
NZ625712A (en) 2016-02-26
PE20121337A1 (es) 2012-10-12
JP2015212291A (ja) 2015-11-26
EP3133070A1 (en) 2017-02-22
EP3599237A1 (en) 2020-01-29
SI2504332T2 (sl) 2021-08-31
RS54978B1 (sr) 2016-11-30
CN102712629A (zh) 2012-10-03
SI2796457T1 (sl) 2016-10-28
CY1122698T1 (el) 2021-03-12
EP2504332B1 (en) 2014-06-04
HRP20191647T1 (hr) 2019-12-13
BR112012012947A2 (pt) 2017-03-01
TWI606827B (zh) 2017-12-01
US20210393590A1 (en) 2021-12-23
CR20120277A (es) 2012-09-05
RS53503B2 (sr) 2021-07-30
SG10201407881WA (en) 2015-01-29
EP2504332A1 (en) 2012-10-03
MY192644A (en) 2022-08-29
HK1172031A1 (en) 2013-04-12
IL260299A (en) 2018-08-30
EP3896069A1 (en) 2021-10-20
US11458119B2 (en) 2022-10-04
IL310635A (en) 2024-04-01
CN112521366A (zh) 2021-03-19
AU2017265180A1 (en) 2017-12-14
CN112521367A (zh) 2021-03-19
JP2023116764A (ja) 2023-08-22
SG10201800136QA (en) 2018-02-27
NZ600155A (en) 2014-10-31
TW201737910A (zh) 2017-11-01
HRP20140780T4 (hr) 2021-08-06
CA2781676A1 (en) 2011-06-03
SI2504332T1 (sl) 2014-09-30
AU2016202591B2 (en) 2017-11-30
PT3133070T (pt) 2019-11-11
PL2504332T3 (pl) 2014-10-31
AU2016202591A1 (en) 2016-05-19
DK2504332T3 (da) 2014-08-25
EP2796457A1 (en) 2014-10-29
EA201592195A1 (ru) 2016-04-29
PT2504332E (pt) 2014-09-02
BR112012012947B8 (pt) 2021-05-25
CY1115880T1 (el) 2017-01-25
PE20171255A1 (es) 2017-08-28
JP2020189873A (ja) 2020-11-26
DK2504332T4 (da) 2021-06-07
KR20200013105A (ko) 2020-02-05
DOP2012000141A (es) 2012-09-30
TWI656873B (zh) 2019-04-21
JP2019001809A (ja) 2019-01-10
BR112012012947B1 (pt) 2021-04-06
AR121611A2 (es) 2022-06-22
CN105777707A (zh) 2016-07-20
CA3075788C (en) 2021-12-21
MA33838B1 (fr) 2012-12-03
TW201639562A (zh) 2016-11-16
EA023923B1 (ru) 2016-07-29
AR079152A1 (es) 2011-12-28
EP3599237B1 (en) 2021-03-24
JP6452635B2 (ja) 2019-01-16
PL2796457T3 (pl) 2017-04-28
AR121612A2 (es) 2022-06-22
PH12015502514A1 (en) 2016-08-15
AU2017265180B2 (en) 2019-08-01
CL2016002589A1 (es) 2017-05-19
SMT201600273B (it) 2016-08-31
JP7150528B2 (ja) 2022-10-11
PT2796457T (pt) 2016-07-14
US20230172903A1 (en) 2023-06-08
EP2796457B1 (en) 2016-05-18
RS53503B1 (en) 2015-02-27
WO2011066352A1 (en) 2011-06-03
NI201200096A (es) 2012-10-30
US20160166542A1 (en) 2016-06-16
HK1203485A1 (zh) 2015-10-30
JP6370264B2 (ja) 2018-08-08
KR20150125734A (ko) 2015-11-09
AU2010324810B2 (en) 2016-05-12
CN105753846A (zh) 2016-07-13
CA3075788A1 (en) 2011-06-03
JP2013512252A (ja) 2013-04-11
ME02477B (me) 2017-02-20
ECSP12011926A (es) 2012-07-31
HUE029371T2 (en) 2017-02-28
IL283935A (en) 2021-07-29
ECSP18063798A (es) 2020-02-28
DOP2016000250A (es) 2017-02-15
EP3133070B1 (en) 2019-08-14
SI3133070T1 (sl) 2019-11-29
RS59543B1 (sr) 2019-12-31
PL3133070T3 (pl) 2020-01-31
HUE045784T2 (hu) 2020-01-28
CA3140959A1 (en) 2011-06-03
TW201130822A (en) 2011-09-16
LT3133070T (lt) 2019-11-11
ES2754398T3 (es) 2020-04-17
NZ715108A (en) 2017-06-30
US10888547B2 (en) 2021-01-12
US20130137743A1 (en) 2013-05-30
DK2796457T3 (en) 2016-08-29
KR20120115972A (ko) 2012-10-19
GT201200161A (es) 2014-01-27
US20210369672A1 (en) 2021-12-02
CN102712629B (zh) 2016-10-12
JP2016138124A (ja) 2016-08-04
DK3133070T3 (da) 2019-11-11
KR102073207B1 (ko) 2020-02-05
MX358345B (es) 2018-08-14
CL2012001348A1 (es) 2012-08-24
UA113491C2 (xx) 2017-02-10
EP2504332B2 (en) 2021-03-17
CY1117996T1 (el) 2017-05-17
ES2586947T3 (es) 2016-10-19
EA201270646A1 (ru) 2013-01-30
LT2796457T (lt) 2016-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7150528B2 (ja) グルコシルセラミドシンターゼの阻害剤としての非晶質及び結晶型のｇｅｎｚ１１２６３８ヘミ酒石酸塩

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ